WO2018134452A1 - Equipo y procedimientos de detección de protozoos - Google Patents

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WO2018134452A1
WO2018134452A1 PCT/ES2017/070625 ES2017070625W WO2018134452A1 WO 2018134452 A1 WO2018134452 A1 WO 2018134452A1 ES 2017070625 W ES2017070625 W ES 2017070625W WO 2018134452 A1 WO2018134452 A1 WO 2018134452A1
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WO
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protozoa
water
sample
dna
sampling device
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PCT/ES2017/070625
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Inventor
Javier ORÓS MONGE
Ignacio Dominguez Ubieto
Original Assignee
Ox-Compañia De Tratamiento De Aguas, S.L.
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6809—Methods for determination or identification of nucleic acids involving differential detection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
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    • C12M23/54—Constructional details, e.g. recesses, hinges hand portable
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C02—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
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    • C02F1/00—Treatment of water, waste water, or sewage
    • C02F1/001—Processes for the treatment of water whereby the filtration technique is of importance
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    • C02F9/20—Portable or detachable small-scale multistage treatment devices, e.g. point of use or laboratory water purification systems
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    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6893—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for protozoa

Definitions

  • the present specification refers, as its title indicates, to a device and procedure for detecting protozoa of the type used in a discontinuous and portable way for water analysis.
  • the invention relates to the field of analysis and measurement equipment and procedures for the optimal use of water resources, especially water for human / animal consumption, aquaculture, cooling water, as well as water for other industrial uses.
  • the equipment is integrated into an effective, ecological and economically viable biocidal procedure that guarantees the complete sanitation of the water, that is, the elimination of bacteria, fungi, viruses, algae and also protozoa and the bacteria that they can lodge inside.
  • Water is essential for our daily life. Water quality, whether used for drinking, household use, food production or recreational purposes has a significant impact on health. Poor quality water can cause disease outbreaks at different scales: 80% of gastrointestinal infectious and parasitic diseases and one third of deaths caused by these infections are due to the use and consumption of contaminated water.
  • amoebas protozoa capable of coionizing water networks that pose a serious health risk
  • Acanthamoeba is the most frequent amoeba, (representing more than 90% of the iota! of the amoebas present in the water) having a great capacity to house an important variety of pathogenic microorganisms, such as viruses (adenovirus, polio virus, enterovirus, etc.), bacteria (Campylobacter, E. cois, Legionella, Listeria, Staphylococcus , Salmonella, etc.) and fungi (Cryptococcus, Blastomyces, Sporothrix, Histoplasma, etc.).
  • Some methods are known for detecting organisms such as protozoa in water, tai and as we find claimed in patents ES2158854 "Oiigonucleotides derived from the family of SQD genes" and ES2331645 “Procedure for controlling the growth of aquatic plants and zoological organisms", but they are complicated processes, which require very specific and delicate equipment that can only be carried out in the laboratory, not being capable of being carried out on-site or portable.
  • Some sampling equipment is also known, such as the one described in ES2348630 "Continuous monitoring device for species suspended in water", but they are intended for fixed use in a location and for continuous, non-discontinuous sampling, not incorporating any type of specific protozoan detection element.
  • the protozoan detection equipment and procedure object of the present invention has been devised, which integrates in a single set, a sampling device and a protozoan detection kit, which is stuck well in a single portable enclosure, either in two portable enclosures, one for the sampling device and another for the detection kit for protozoa
  • the sampling device is provided in two variants, one of them, more complete, for sampling for a longer time, on the order of days or weeks, while the other, more simple, is indicated for sampling in short time, of the order of minutes or hours,
  • the protozoan detection kit includes test strips together with portable equipment and reagents to perform in-situ DNA extraction processes (deoxyribonucleic acid), PCR amplification (polymerase chain reaction), and hybridization. revealed. These test strips present the result of the analysis by means of specific markings of the amplified products, in the form of colored bands that react to the presence of the protozoa sought.
  • the equipment has a main filter through which the water passes, with a passing light chosen so that the cysts of the protozoa or the individuals who are free in the water are left in it. Filtered the water, the filter material is left with the protozoa, if any.
  • This material the result of filtering, is the one that is subsequently used to perform the PCR and study the presence of the species or species through its DNA.
  • This equipment and procedure of detection of protozoa provides multiple advantages over the systems currently available, being the most important that allows to be integrated into an effective, ecological and economically viable biocidal procedure that allows to guarantee the complete sanitation of water, that is, elimination of bacteria, fungi, viruses, algae and also protozoa and the bacteria that they can harbor inside.
  • Another important advantage is that it is a portable system, which can be used anywhere, including customer installation, and in much less time than is required by laboratory processes. It is important to note that this equipment is specifically designed for discontinuous use, allowing to obtain results with days or weeks in e! in the case of the preferred embodiment, or with minute or hour displays in the case of the alternative embodiment, allowing technical personnel to perform measurements in a wide variety of sites with the same equipment.
  • PCR polymerase chain reaction
  • figure -1 - shows a general block diagram of the equipment.
  • FIG -2- shows a general block diagram of the sampling device in its preferred embodiment.
  • Figure -3- shows a general block diagram of the sampling device in its alternative embodiment.
  • Figure -4- shows a general block diagram of the protozoan detection kit
  • Figure -5- shows a test strip and its main areas.
  • the protozoan defection equipment object of the present invention allows the presence of protozoa to be detected in a sample that is obtained by passing water at least through a main filter in which the protozoa are retained, if any.
  • the equipment basically comprises, as can be seen in the annex piano, a sampling device (1) and a protozoan defection kit (2), preferably integrated into a single portable enclosure (23), although it is provided that in a way Alternatively, they can be housed in two portable enclosures, one for the sampling device (1) and another for the protozoan detection kit (2).
  • the sampling device (1 a) in turn comprises a water inlet from the distribution line (3), a water inlet without pressure (4), associated with a pump (5) and a safety valve (6), a prefilter (7) followed by a main filter (8), with a sample filter (9) arranged behind the main filter (8), a flow meter (10) associated with an outlet of water (1 1), and a control programmer (12).
  • the prefilter (7) cleans the water of the largest impurities and prevents the main filter (8) from being clogged.
  • the control programmer (12) controls the sampling period, which can be from days to weeks, and regulates with the pump the filtering parameters: flow and frequency, commanding the start-up and stop of the equipment.
  • sampling device (1 b) comprises a water inlet from the distribution line (3), a water inlet without pressure (4), associated with a pump (5) and a safety valve (6), a main filter (8), and a flow meter (10) associated with a water outlet (1 1).
  • the equipment has a main filter (8) through which the water passes, with a minimum passing light, chosen so that the cysts of the protozoa or the individuals who are free in the water remain in the filter .
  • the filter material with the protozoa remains, if any. This is what is called “sample” throughout the report and claims.
  • This material, the result of filtering, is the one that is subsequently used to make DNA extraction and amplification by PCR to study the presence of the species or species through its DNA.
  • the sample inlet in the equipment can be by direct connection to the water inlet coming from the distribution line (3) or without that connection, to a water inlet without pressure (4).
  • the pump (5) is responsible for boosting the flow of water to allow water to be processed when the equipment has not been able to connect directly to the customer's supply line.
  • a flow meter (10) that allows you to check the volume of processed water.
  • the protozoan detection kit (2) comprises a plurality of test strips (13), PCR reagents (14), hybridization / development reagents (15), a portable thermoblock (16) powered by a thermoblock battery ( 17) and a portable thermal cycler (18) powered by a thermal cycler battery (19).
  • the portable thermoblock (16) is configured to maintain a constant temperature for those stages of the process in which an exact temperature is required over a certain period of time.
  • the portable thermoblock (16) controls the temperature of the sample in the steps of DNA extraction from the sample and development, which require controlled temperature conditions.
  • the portable thermal cycler (18) is a device configured to perform the DNA expansion of the sample, which in a preferred embodiment is carried out by PCR technique.
  • the test strips (13) are nitrocellulose strips, preferably rectangular, on which the antibodies that detect the specific tides of the amplified DNA have been anchored, each of the strips being divided into three bands (20, 21, 22 ) that recognize the different tides used.
  • the test strips (13) comprise an absorption area (24), which corresponds to the lower part of the strip, and which is intended to come into contact with the sample, a test area (25) formed by a protected chromatographic membrane with a transparent plastic, and a handling area (26) corresponding to the final part of the strip, formed of an absorbent material protected by a rotulabie colored plastic.
  • the test area (25) of the test strips (13) has up to three different bands. They are three immunochromatographic bands.
  • a first band (22), arranged at the bottom, indicates the presence or not of protozoa, a second band (21) that acts as a control during the DNA extraction and amplification steps of the sample, and a third band (20 ) that acts as a control of the development step to determine the presence or not of protozoa in the analyzed water.
  • the protozoan detection equipment object of the present invention is directed to carry out a water protozoan detection method comprising:
  • the first sampling phase has slight differences depending on whether the sampling device (1) of the equipment used is the one described as a preferred embodiment (1 a) or the one described as a simplified embodiment (1 b).
  • This first phase of water sampling comprises passing the water through the main filter (8) and collecting a retained sample in the main filter (8).
  • the protozoan detection phase in the samples obtained is carried out by the protozoan detection kit (2), and is based on the amplification of DNA, previously extracted from the sample, by polymerase chain reaction (PCR) of a certain region of! DNA corresponding to the target protozoan species or species. Subsequently it comprises a detection by hybridization to a specific probe and by developing by means of an immunochromatographic test strip (13).
  • the kit (2) allows the detection and identification of! Protozoan with great sensitivity and specificity.
  • the phase of detection of protozoa in the samples comprises:
  • PCR polymerase chain reaction
  • a fifth development step comprising determining the presence or absence of protozoa.
  • the bands (20, 21, 22) are shown or not, of different colors, along the test area (25 ) (the membrane of the test strips (13)), depending on the presence or absence of protozoa in the sample, the color and whether the extraction and enlargement and development steps have been performed correctly.
  • the DNA extraction step is based on the binding of the DNA to silica-coated magnetic particles, performing the DNA extraction directly from the sample retained in the filter.
  • the amplification step is carried out by PCR. Simultaneous amplification of a fragment of the DNA polymerase gene of the target species or species and a fragment of a human control gene (preferably beta-globin) is used, which is used as an indicator of the absence of PCR inhibitors in the amplified DNA sample.
  • the test strips (13) comprise antibodies and in the migration step the DNA + coioid complex binds to said antibodies. In the development step, the DNA + coioid complex gives rise to three bands (20, 21, 22) along the test area (25) of the test strips (13), which allow to determine the presence or absence of Protozoa in the sample.
  • all test strips (13) include a third band (20) or preferably green development control line, whose appearance (always present but only displayed under certain conditions) is indicative that the immunochromatography has developed correctly, a second band or process control line (21) (which allows to determine if the extraction and amplification steps have been performed correctly), preferably blue, which is visualized if the DNA extraction and amplification process has developed correctly, and a third band (22) or line associated with the presence of protozoa, preferably red.
  • a third band (20) or preferably green development control line whose appearance (always present but only displayed under certain conditions) is indicative that the immunochromatography has developed correctly
  • a second band or process control line (21) which allows to determine if the extraction and amplification steps have been performed correctly
  • a third band (22) or line associated with the presence of protozoa preferably red.
  • a device in its preferred embodiment (1 a), it comprises:
  • the protozoan detection procedure can comprise a reassembly stage in which the connections are left as they were initially, and which comprises disinfecting the sampling device (1) by means of the biocide step Likewise, the ducts of the equipment through which the water circulates are emptied. In this case, the process may comprise a homogenization step, in which a certain amount of water is allowed to pass through the equipment to remove biocide residues from the last operation.
  • the procedure may also include a backwash stage. Said stage is carried out, in this case, after the necessary time has elapsed, controlled by the control programmer (12).
  • This step is performed when the equipment used comprises a sampling device (1) with sample filter (9) and comprises a step of moving the retained protozoa in the main filter (8) to the sample filter (9).
  • the backwash is performed after a predetermined time, controlled by the control programmer (12), and comprises:
  • a first inversion step which includes introducing water into the sampling device (1) towards the main filter (8) in the opposite direction to that of the water inlet (3, 4), causing the protozoa adhered to the main filter (8) peel off and get caught in the sample filter (9), and
  • the sampling phase is performed by said sampling device (1 b) and may comprise: a first homogenization step, in which a few liters of water are allowed to pass biocide residues from the last operation,
  • a second filtering step in which the water is allowed to pass, coming from the water inlet coming from the distribution line (3) or from the inlet of water without pressure (4), through the main filter (8 ), controlling by means of the flow meter (10) that the water flow is adequate, ending with a third filter separation step for your next exam.

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Abstract

Equipo y procedimiento de detección de protozoos que integra un dispositivo de muestreo (1) y un kit de detección de protozoos (2), alojados preferentemente en una caja envolvente portátil (23), admitiendo el dispositivo de muestreo dos variantes (1a, 1b), una de ellas, más completa, para toma de muestras durante un tiempo más largo, del orden de días o semanas, mientras que la otra, más sencilla, está indicada para la toma de muestras en poco tiempo, del orden de horas como mucho. El kit de detección de protozoos incluye unas tiras reactivas (13) junto con los equipos portátiles y reactivos para poder realizar in-situ los procesos de extracción de ADN (ácido desoxirribonucleico), amplificación mediante PCR (reacción en cadena de la polimerasa), e hibridación/revelado. Estas tiras reactivas (13) presentan el resultado del análisis mediante unos marcajes específicos del ADN amplificado.

Description

EQUIPO Y PROCEDIMIENTO DE DETECCIÓN DE PROTOZOOS
La presente memoria descriptiva se refiere, como su título indica, a un equipo y procedimiento de detección de protozoos del tipo de los utilizados de forma discontinua y portable para el análisis de agua.
Campo de la invención
La invención se refiere al campo de los equipamientos y procedimientos de análisis y medida para el aprovechamiento óptimo de ios recursos hídricos, especialmente agua de consumo humano/animal, acuicultura, agua de refrigeración, así como en agua de otros usos industriales. El equipo se integra en un procedimiento biocida eficaz, ecológico y económicamente viable que permita garantizar la higienización completa del agua, es decir, eliminación de bacterias, hongos, virus, algas y también protozoos y las bacterias que éstos puedan albergar en su interior.
Estado actual de la técnica
El agua es esencial para nuestra vida diaria. La calidad del agua, tanto si se utiliza para beber, usos domésticos, la producción de alimentos o fines recreativos tiene un impacto importante en la salud. El agua de mala calidad puede causar brotes de enfermedades en diferentes escalas: el 80% de las enfermedades infecciosas y parasitarias gastrointestinales y un tercio de las muertes causadas por estas infecciones se deben ai uso y consumo de agua contaminada.
En la actualidad, la legislación europea establece límites microbiológicos para el consumo de agua con respecto a algunas bacterias. Sin embargo, el control de las bacterias no es suficiente para asegurar la calidad del agua.
Los estudios han demostrado que no sólo las bacterias pueden causar enfermedades; en efecto, también se pueden encontrar en el agua amebas de vida libre (protozoos capaces de coionizar las redes de agua que representan un grave riesgo para la salud). La Acanthamoeba es la ameba más frecuente, (representando más del 90% del iota! de las amebas presentes en el agua) teniendo una gran capacidad para albergar una importante variedad de microorganismos patógenos, como virus (adenovirus, virus de la polio, enterovirus, etc.), bacterias (Campylobacter, E. cois, Legionella, Listeria, Staphylococcus, Salmonella, etc.) y hongos (Cryptococcus, Blastomyces, Sporothrix, Histoplasma, etc.).
Ello hace que exista una elevada necesidad de equipos para la detección de protozoos, con vista a su posterior eliminación. Existen varias patentes y documentos científicos publicados, relacionados con este tipo de problemática. La mayor parte de las soluciones, como las recogidas en las patentes ES2177380 ''Procedimiento para ¡a eliminación de contaminantes biológicos de! agua" y WO2015015027 "Method for eüminating micro-organisms in water by filtratiori" , se limitan a un filtrado general, tratando de eliminar microorganismos, pero sin ser capaces de detectar específicamente protozoos.
Son conocidos algunos procedimientos para detectar organismos como los protozoos en el agua, tai y como encontramos reivindicado en las patentes ES2158854 "Oiigonucleóotidos derivados de ia familia de genes SQD" y ES2331645 "Procedimiento para controlar el crecimiento de plantas acuáticas y de organismos zoológicos", pero son procesos complicados, que requieren de equipamientos muy específicos y delicados que únicamente pueden realizarse en laboratorio, no siendo susceptibles de realizarse in-situ ni de forma portátil. Asimismo se conocen algunos equipos muestreadores, como el descrito en ES2348630 "Dispositivo de monitorización en continuo de especies en suspensión en el agua", pero están previstos para una utilización fija en una ubicación y para el muestreado continuo, no discontinuo, no incorporando ningún tipo de elemento de detección específica de protozoos.
Descripción de la invención
Para solventar ia problemática existente en la actualidad en la detección de protozoos en el agua de una manera discontinua y portable se ha ideado el equipo y procedimiento de detección de protozoos objeto de ia presente invención, el cual integra en un único conjunto, un dispositivo de muestreo y un kit de detección de protozoos, que va atojado bien en una única caja envolvente portátil, bien en dos cajas envolventes portátiles, una para el dispositivo de muestreo y otra para el kit de detección de protozoos.
El dispositivo de muestreo está previsto en dos variantes, una de ellas, más completa, para toma de muestras durante un tiempo más largo, del orden de días o semanas, mientras que la otra, más sencilla, está indicada para la toma de muestras en poco tiempo, del orden de minutos u horas,
El kit de detección de protozoos incluye unas tiras reactivas junto con los equipos portátiles y reactivos para poder realizar in-situ ¡os procesos de extracción de ADN (ácido desoxirribonucleico), amplificación mediante PCR (reacción en cadena de la polimerasa), e hibridación/revelado. Estas tiras reactivas presentan el resultado del análisis mediante unos mareajes específicos de ios productos amplificados, en forma de bandas de color que reaccionan ante la presencia de los protozoos buscados.
En ambos casos el equipo dispone de un filtro principal por el que pasa el agua, con una luz de paso elegida para que queden en el mismo los quistes de los protozoos o ios propios individuos que se encuentren libres en el agua. Filtrada el agua, queda en el filtro el material de filtrado con los protozoos, si ios hubiera. Este material, resultado del filtrado, es el que se utiliza posteriormente para hacer la PCR y estudiar la presencia de la especie o especies a través de su ADN. Ventajas de la invención
Este equipo y procedimiento de detección de protozoos que se presenta aporta múltiples ventajas sobre ios sistemas disponibles en la actualidad siendo la más importante que permite integrarse en un procedimiento biocida eficaz, ecológico y económicamente viable que permita garantizar la higienización completa del agua, es decir, eliminación de bacterias, hongos, virus, algas y también protozoos y las bacterias que éstos puedan albergar en su interior.
Otra importante ventaja es que es un sistema portátil, que se puede utilizar en cualquier sitio, incluida la instalación del cliente, y en tiempo muy inferior al requerido por los procesos de laboratorio. Es importante destacar que este equipo está específicamente concebido para un uso discontinuo, permitiendo obtener resultados con muéstreos de días o semanas en e! caso de la realización preferente, o con muéstreos de minutos u horas en el caso de la realización alternativa, propiciando que el personal técnico pueda realizar medidas en una gran variedad de sitios con el mismo equipo.
Otra de las más importantes ventajas a destacar es que se basa en la amplificación mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de una región determinada del ADN correspondiente a la especie o especies de protozoo objetivo, y su posterior detección por hibridación a una sonda específica y revelado mediante una tira de inmunocromatografía, permitiendo de esta manera la detección e identificación del protozoo con una gran sensibilidad y especificidad, superior a otros sistemas.
Es importante destacar asimismo que es un sistema de extracción de ADN rápido y fácil, y no hay mucha dependencia de los equipos instrumentales, lo cual propicia un equipo de detección completa de Acanthamoeba en el agua que puede aplicarse fuera del laboratorio, in situ donde lo requiera el cliente final, con una sensibilidad extraordinaria.
Descripción de las figuras
Para comprender mejor el objeto de la presente invención, en el piano anexo se ha representado una realización práctica preferencia! de un equipo de detección de protozoos.
En dicho plano la figura -1 - muestra un diagrama general de bloques del equipo.
La figura -2- muestra un diagrama general de bloques del dispositivo de muestreo en su realización preferente.
La figura -3- muestra un diagrama general de bloques del dispositivo de muestreo en su realización alternativa. La figura -4- muestra un diagrama general de bloques del kit de detección de protozoos
La figura -5- muestra una tira reactiva y sus principales zonas.
Realización preferente de ia invención
El equipo de defección de protozoos objeto de la presente invención permite detectar ia presencia de protozoos en una muestra que se obtiene haciendo pasar agua al menos a través de un filtro principal en el que quedan retenidos ios protozoos, si ios hay. El equipo comprende básicamente, como puede apreciarse en el piano anexo, un dispositivo de muestreo (1 ) y un kit de defección de protozoos (2), integrados preferentemente dentro de una única caja envolvente (23) portátil, aunque está previsto que de forma alternativa pueden ir alojado en dos cajas envolventes portátiles, una para el dispositivo de muestreo (1 ) y otra para el kit de detección de protozoos (2).
En una realización preferente, el dispositivo de muestreo (1 a) comprende a su vez una entrada de agua proveniente de la línea de distribución (3), una entrada de agua sin presión (4), asociada con una bomba (5) y una válvula de seguridad (6), un prefiltro (7) seguido de un filtro principal (8), con un filtro de muestra (9) dispuesto tras el filtro principal (8), un contador de caudal (10) asociado a una salida de agua (1 1 ), y un programador (12) de control. El prefiltro (7) limpia el agua de las impurezas más grandes y evita que se cólmate el filtro principal (8).
El programador (12) de control controla el periodo de toma de muestra, que puede ser de días a semanas, y regula con la bomba los parámetros de filtrado: caudal y frecuencia, comandando la puesta en marcha y parada del equipo.
Está prevista una realización alternativa de la invención, más simplificada, en la que el dispositivo de muestreo (1 b) comprende una entrada de agua proveniente de ia línea de distribución (3), una entrada de agua sin presión (4), asociada con una bomba (5) y una válvula de seguridad (6), un filtro principal (8), y un contador de caudal (10) asociado a una salida de agua (1 1 ).
En ambos casos el equipo dispone de un filtro principal (8) por el que pasa el agua, con una luz de paso mínima, elegida para que queden en el filtro los quistes de los protozoos o los propios individuos que se encuentren libres en el agua. Filtrada el agua, queda en el filtro el material de filtrado con los protozoos, si los hubiera. Esto es lo que se denomina "muestra" a lo largo de la memoria y reivindicaciones. Este material, resultado del filtrado, es el que se utiliza posteriormente para hacer la extracción y amplificación de ADN mediante PCR para estudiar la presencia de la especie o especies a través de su ADN.
La entrada de la muestra en el equipo puede ser por conexión directa a la entrada de agua proveniente de la línea de distribución (3) o sin esa conexión, a una entrada de agua sin presión (4). En el primer caso es la misma instalación la que impulsa el agua a través del equipo (incluyéndose para evitar posibles problemas de sobrepresión una válvula reguladora). La bomba (5) es la responsable de impulsar el flujo de agua para permitir procesar el agua cuando el equipo no se ha podido conectar directamente a la línea de abastecimiento del cliente. Al final del equipo existe un contador de caudal (10) que permite comprobar el volumen de agua procesado.
El kit de detección de protozoos (2) comprende una pluralidad de tiras reactivas (13), unos reactivos de PCR (14), unos reactivos de hibridación/revelado (15), un termobloque portátil (16) alimentado con una batería del termobloque (17) y un termociciador portátil (18) alimentado con una batería del termociclador (19).
El termobloque portátil (16) está configurado para mantener una temperatura constante para aquellas etapas del procedimiento en las que se requiere una temperatura exacta a lo largo de un determinado periodo de tiempo. El termobloque portátil (16) controla la temperatura de la muestra en los pasos de la extracción de ADN de la muestra y de revelado, que requieren unas condiciones de temperatura controlada. El termociclador portátil (18) es un equipo configurado para realizar la ampliación de ADN de la muestra, que en una realización preferente se realiza mediante técnica de PCR. Las tiras reactivas (13) son unas tiras de nitrocelulosa, de forma preferentemente rectangular, sobre la que se han anclado los anticuerpos que detectan los mareajes específicos del ADN amplificado, estando divididas cada una de las tiras en tres bandas (20, 21 ,22) que reconocen ios diferentes mareajes empleados.
Las tiras reactivas (13) comprenden un área de absorción (24), que corresponde a la parte inferior de la tira, y que está destinada a entrar en contacto con la muestra, un área de test (25) conformada por una membrana cromatográfica protegida con un plástico transparente, y un área de manipulación (26) correspondiente a la parte final de la tira, conformada de un material absorbente protegido por un plástico de color rotulabie.
El área de test (25) de las tiras reactivas (13) presenta hasta tres bandas diferentes. Son tres bandas inmunocromatograficas. Una primera banda (22), dispuesta en la parte inferior, indica la presencia o no de protozoos, una segunda banda (21 ) que actúa como control durante los pasos de extracción y amplificación de ADN de la muestra, y una tercera banda (20) que actúa como control del paso de revelado para determinación de la presencia o no de protozoos en el agua analizada. El equipo de detección de protozoos objeto de la presente invención está dirigido a llevar a cabo un procedimiento de detección de protozoos en agua que comprende:
- una primera fase de muestreo mediante el dispositivo de muestreo (1 ),
- y una segunda fase de detección de protozoos en las muestras obtenidas mediante el kit de detección de protozoos (2).
La primera fase de muestreo presenta ligeras diferencias dependiendo de si el dispositivo de muestreo (1 ) del equipo empleado es el descrito como realización preferente (1 a) o el descrito como realización simplificada (1 b). Esta primera fase de muestreo del agua comprende hacer pasar al agua a través del filtro principal (8) y recoger una muestra retenida en el filtro principal (8).
La fase de detección de protozoos en las muestras obtenidas se realiza mediante el kit de detección de protozoos (2), y se basa en la amplificación de ADN, previamente extraído de la muestra, mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de una región determinada de! ADN correspondiente a la especie o especies de protozoo objetivo. Posteriormente comprende una detección por hibridación a una sonda específica y por revelado mediante una tira reactiva (13) de inmunocromatografía. De esta manera, el kit (2) permite la detección e identificación de! protozoo con una gran sensibilidad y especificidad.
La fase de detección de protozoos en las muestras comprende:
- un primer paso de extracción de ADN (ácido desoxirribonucleico) de la muestra obtenida,
- un segundo paso de amplificación de ADN, que preferentemente se realiza mediante PCR (reacción en cadena de la polimerasa);
- un tercer paso de hibridación en el que se produce la unión específica de ios fragmentos de ADN amplificados a sondas ancladas a partículas de látex coloreadas dando lugar a un complejo ADN+coloide,
- un cuarto paso de migración en el que se produce la movilidad del complejo de ADN + coloide sobre el área de test (25) de las tiras reactivas (13),
- un quinto paso de revelado que comprende la determinación de la presencia o ausencia de protozoos, Ai final del procedimiento, las bandas (20, 21 , 22) se muestran o no, de diferentes colores, a lo largo del área de test (25) (la membrana de las tiras reactivas (13)), dependiendo de la presencia o ausencia de protozoos en la muestra el color y si se han realizado correctamente ios pasos de extracción y ampliación y de revelado. El paso de extracción de ADN está basado en la unión del ADN a partículas magnéticas recubiertas de sílice, realizando la extracción del ADN directamente de la muestra retenida en el filtro.
El paso de amplificación se lleva a cabo mediante PCR. Se realiza la amplificación simultánea de un fragmento del gen de la DNA polimerasa de la especie o especies objetivo y de un fragmento de un gen control humano (beta-globina preferentemente), que se utiliza como indicador de la ausencia de inhibidores de la PCR en la muestra de ADN amplificada. Las tiras reactivas (13) comprenden anticuerpos y en el paso de migración el complejo ADN+coioide se une a dichos anticuerpos. En el paso de revelado, el complejo ADN+coioide da lugar a tres bandas (20, 21 , 22) a lo largo del área de test (25) de ¡as tiras reactivas (13), que permiten determinar la presencia o ausencia de protozoos en la muestra.
Es decir, en el procedimiento se produce ¡a unión específica de los fragmentos de ADN amplificados a una serie de sondas ancladas a partículas de látex coloreadas, migrando este complejo de ADN + coloide a lo largo de una membrana sobre ¡a que se han depositado anticuerpos específicos, reconociendo los anticuerpos unas marcas añadidas a los productos de la amplificación durante la PCR, de modo que el complejo PCR+coioide se une a la membrana dando lugar a la aparición de una banda coloreada. Cada uno de ios productos generados durante la PCR (amplificado del gen control, amplificado de la especie o especies objetivo) lleva un mareaje específico por lo que, al final del proceso, se visualizarán las bandas (20, 21 , 22) de diferentes colores a lo largo del área de test (25) de las tiras reactivas (13). El color y número de bandas (20, 21 , 22) que se ven dependerá de la presencia o ausencia de protozoos en la muestra. Así, todas las tiras reactivas (13) incluyen una tercera banda (20) o línea de control de revelado preferentemente verde, cuya aparición (siempre está presente pero solo se visualiza bajo ciertas condiciones) es indicativa de que la inmunocromatografia se ha desarrollado correctamente, una segunda banda o línea de control de proceso (21 ) (que permite determinar si se han realizado correctamente los pasos de extracción y amplificación), preferentemente azul, que se visualiza si el proceso de extracción y amplificación del ADN se ha desarrollado correctamente, y una tercera banda (22) o línea asociada a la presencia de protozoos, preferentemente roja.
En un ejemplo de realización en la que se emplea un equipo con el dispositivo de muestreo en su realización preferente (1 a), comprende:
- un etapa de filtrado, en el que el anaiito queda retenido en el filtro principal (8), y
una etapa de confraiavado, en el que los organismos buscados son movidos del filtro principal (8) al filtro de muestra (9). Cuando el equipo ya ha sido empleado pero quiere volver a utilizarse, el procedimiento de detección de protozoos puede comprender una etapa de rearmado en ¡a que se dejan las conexiones como estaban inicialmente, y que comprende desinfectar el dispositivo de muestreo (1 ) mediante el paso de biocida. Asimismo se vacían ios conductos del equipo por los que circula el agua. En este caso el procedimiento puede comprender un paso de homogeneización, en el que se deja pasar una determinada cantidad de agua por el equipo para eliminar restos de biocida de la última operación.
En los casos en los que se quiere reutilizar el equipo, el procedimiento puede comprender también una etapa de contralavado. Dicha etapa se realiza, en este caso, una vez transcurrido el tiempo necesario, controlado por el programador (12) de control. Esta etapa se realiza cuando el equipo empleado comprende un dispositivo de muestreo (1 ) con filtro de muestra (9) y comprende un paso de mover ios protozoos retenidos en el filtro principal (8) al filtro de muestra (9).
En este caso, el contralavado se realiza una vez transcurrido un tiempo predeterminado, controlado por el programador (12) de control, y comprende:
- un primer paso de inversión, que comprende introducir agua en el dispositivo de muestreo ( 1 ) hacia el filtro principal (8) en dirección opuesta a la de la entrada de agua (3, 4), provocando que los protozoos adheridos al filtro principal (8) se despeguen y queden atrapadas en el filtro de muestra (9), y
- un segundo paso de retirada de muestras que comprende desmontar el filtro de muestra (9). En otro ejemplo de realización en el que el procedimiento se realiza en un equipo con un dispositivo de muestreo en su realización más simplificada (1 b), la fase de muestreo se realiza mediante dicho dispositivo de muestreo (1 b) y puede comprender: un primer paso de homogeneización, en el que se dejan pasar unos litros de agua para eliminar restos de biocida de la última operación,
- un segundo paso de filtrado, en el que se deja pasar el agua, procedente de la entrada de agua proveniente de la línea de distribución (3) o de la entrada de agua sin presión (4), a través del filtro principal (8), controlando mediante el contador de caudal (10) que el flujo de agua es el adecuado, finalizando con un tercer paso de separación del filtro para su examen siguiente.
La persona experta en la técnica comprenderá fácilmente que puede combinar características de diferentes realizaciones con características de otras posibles realizaciones, siempre que esa combinación sea técnicamente posible.
Toda la información referida a ejemplos o modos de realización forma parte de la descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES
1 . - Equipo de detección de protozoos, del tipo de los utilizados de forma discontinua y portable para el análisis de agua mediante el análisis de una muestra, caracterizado por que comprende:
- un dispositivo de muestreo (1 ) que comprende al menos una entrada de agua (3, 4) y un filtro principal (8) dispuesto tras la entrada de agua (3, 4} y que está configurado para retener una muestra con protozoos presentes en el agua, y
-un kit de detección de protozoos (2), que comprende una pluralidad de tiras reactivas (13) con anticuerpos para la detección de los protozoos atrapados en la muestra, unos reactivos de ampliación de ADN (14), unos reactivos de hibridación y revelado (15), un termociclador portátil (18) configurado para realizar la ampliación de ADN de los protozoos de la muestra alimentado con una batería del termociclador (19), y un termobloque portátil (16) configurado para controlar la temperatura de la muestra y una batería del termobloque (17), y estando el dispositivo de muestreo (1 ) y el kit de detección de protozoos (2) dispuestos dentro de una o dos cajas envolventes (23) portátiles.
2. - Equipo de detección de protozoos, según la reivindicación 1 , caracterizado por que el dispositivo de muestreo (1 ) comprende una bomba (5) y una válvula de seguridad (6), dispuestos tras la entrada de agua (4) configurados para impulsar agua a través del filtro principal (8).
3. - Equipo de detección de protozoos, según la reivindicación 1 , caracterizado por que el dispositivo de muestreo (1 ) comprende adicionalmente una salida de agua (1 1 ) y un contador de caudal (10) asociado a dicha salida de agua (1 1 ),
4. - Equipo de detección de protozoos, según la reivindicación 1 , caracterizado por que el dispositivo de muestreo (1 ) comprende adicionalmente un prefiltro (7) dispuesto antes del filtro principal (8),
5. - Equipo de detección de protozoos, según la reivindicación 1 caracterizado por que comprende adicionalmente un filtro de muestra (9) dispuesto tras el filtro principal (8).
6.- Equipo de detección de protozoos, según la reivindicación 1 , caracterizado por que comprende adicionalmente un programador de control (12) configurado para controlar el periodo de funcionamiento del dispositivo de muestreo (1 ).
7. - Equipo de detección de protozoos, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que las tiras reactivas (13) son unas tiras de nitrocelulosa, que comprenden un área de absorción (24), que corresponde a la parte inferior de la tira reactiva (13), y que está destinada a entrar en contacto con la muestra, un área de test (25) conformada por una membrana cromatográfica, y un área de manipulación (26) correspondiente a la parte superior de la tira, conformada de un material absorbente.
8. - Equipo de detección de protozoos, según la reivindicación 7, caracterizado por que el área de test (25) de las tiras reactivas (13) presenta tres bandas diferentes, una primera banda (22), una segunda banda (21 ) y una tercera banda (20), y son tres bandas inmunocromatográficas.
9. - Procedimiento de detección de protozoos en el agua utilizando un equipo como el descrito en las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que comprende:
- una primera fase de muestreo del agua mediante el dispositivo de muestreo (1 ) que comprende hacer pasar al agua a través del filtro principal (8) y recoger una muestra retenida en el filtro principal (8),
- una segunda fase de detección de protozoos en las muestras mediante el kit de detección de protozoos (2) que comprende:
- un primer paso de extracción de ADN de la muestra retenida,
- un segundo paso de amplificación de ADN, y
- un tercer paso de hibridación en el que se produce la unión específica de los fragmentos de ADN amplificados a sondas ancladas a partículas de látex coloreadas dando lugar a un complejo ADN+coloide,
- un cuarto paso de migración en el que se produce la movilidad del complejo de ADN + coloide sobre el área de test (25) de las tiras reactivas (13),
- un quinto paso de revelado que comprende la determinación de la presencia o ausencia de protozoos.
10. - Procedimiento de detección de protozoos en el agua, según la reivindicación 9, caracterizado por que el paso de extracción de ADN está basado en la unión del ADN a partículas magnéticas recubiertas de sílice, realizando la extracción del ADN directamente de las muestras de filtro.
1 1 . - Procedimiento de detección de protozoos en el agua, según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 10, caracterizado por que el paso de amplificación de ADN se lleva a cabo mediante PCR para obtención de ADN amplificado.
12. - Procedimiento de detección de protozoos en el agua, según la reivindicación 1 1 , caracterizado por que en el paso de amplificación mediante PCR se realiza la amplificación simultánea de un fragmento del gen de la DNA polimerasa de la especie o especies objetivo y de un fragmento de un gen control humano.
13.- Procedimiento de detección de protozoos en el agua, según la reivindicación 12 caracterizado por que el gen control humano es beta-globina, que se utiliza como indicador de la ausencia de inhibidores de la PCR en la muestra de ADN amplificada.
14. - Procedimiento de detección de protozoos en el agua, según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, caracterizado por que en el paso de migración, las tiras reactivas (13) comprenden anticuerpos a los que se une el complejo ADN+coioide.
15. - Procedimiento de detección de protozoos en el agua, según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14, caracterizado por que en el paso de revelado, el complejo ADN+coioide da lugar a tres bandas (20, 21 , 22) a lo largo del área de test (25) de las tiras reactivas (13), que permiten determinar la presencia o ausencia de protozoos en la muestra.
16. - Procedimiento de detección de protozoos en el agua, según la reivindicación 15, caracterizado por que la primera banda (22) determina la presencia o ausencia de protozoos, la segunda banda (21 ) actúa como control de los pasos de extracción y amplificación, y la tercera banda (20) actúa como control del paso de revelado.
1 7. - Procedimiento de detección de protozoos en el agua, según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 1 6, caracterizado por que comprende una etapa de rearmado que comprende desinfectar el dispositivo de muestreo (1 ) mediante el paso de biocida.
1 8. - Procedimiento de detección de protozoos en el agua, según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 17, caracterizado por que comprende una etapa de contraiavado que se realiza en un dispositivo de muestreo ( 1 ) que comprende un filtro de muestra (9), y el procedimiento comprende mover los protozoos retenidos en el filtro principal (8) al filtro de muestra (9).
1 9. - Procedimiento de detección de protozoos en el agua, según la reivindicación 18, caracterizado porque la etapa de contralavado se realiza una vez transcurrido un tiempo predeterminado, controlado por el programador (1 2) de control, y comprende:
- un primer paso de inversión, que comprende introducir agua en el dispositivo de muestreo (1 ) hacia el filtro principal (8) en dirección opuesta a la de la entrada de agua (3, 4), provocando que los protozoos adheridos al filtro principal (8) se despeguen y queden atrapadas en el filtro de muestra (9), y
- un segundo paso de retirada de muestras que comprende desmontar el filtro de muestra (9).
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