WO2018134359A1 - Plaque pour la biologie cellulaire - Google Patents

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WO2018134359A1
WO2018134359A1 PCT/EP2018/051324 EP2018051324W WO2018134359A1 WO 2018134359 A1 WO2018134359 A1 WO 2018134359A1 EP 2018051324 W EP2018051324 W EP 2018051324W WO 2018134359 A1 WO2018134359 A1 WO 2018134359A1
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films
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PCT/EP2018/051324
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Virgile Viasnoff
Bakya ARASI
Original Assignee
National University Of Singapore
Centre National De La Recherche Scientifique
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N2015/1006—Investigating individual particles for cytology

Definitions

  • the invention relates to the field of supports for biology and in particular the field of biocompatible plates comprising holes called wells, in which living cells are deposited to put them in culture, to practice on them analyzes and measurements, in particular involving their culture. and their growth in numbers.
  • Migration and wound healing tests or tests are a popular tool in cell biology for both laboratory and diagnostic cell characterization.
  • This type of test or test consists of creating a gap or ditch or trench or wound or wound in a monolayer of cells and to characterize by imaging the speed and mode of movement of the cells.
  • primary cells such as cell lines show large variations in their rate of migration that arise from large variations in their protein expression, gene expression or epigenetic factors.
  • single-cell assays may be considered, but they are delicate, expensive, and require a radically different approach compared to routine migration or scarring assays.
  • the prior art also commonly uses the "Boyden" chambers to study the stimulated migration of cells through an epithelial layer, but these chambers do not are not selective in terms of migration speed and the migration must be induced by a chemoattractant.
  • PDMS the material called polydimethylsiloxane- [O-Si (CH3) 2] n.
  • Peeling or peeling a mode of deleting a mechanical connection between a film and another film or between the film and a support, making it possible to take or separate the film from the other film or from the support, this connection is therefore a type removable connection between two surfaces obtained for example by rolling or gluing between two surfaces with an adhesive that does not solidify or reversible.
  • Cell-impermeable the property for a material that can not be crossed by living cells.
  • the invention relates to a plate for cell biology, comprising a biocompatible support, a stack on the support of biocompatible flexible films, the stack comprising a well passing through the stack to the support, in which the films of the stack are engaged with each other and with the support in a mechanical connection allowing the peeling.
  • a plate for cell biology comprising a biocompatible support, a stack on the support of biocompatible flexible films, the stack comprising a well passing through the stack to the support, in which the films of the stack are engaged with each other and with the support in a mechanical connection allowing the peeling.
  • the stack comprises a sampling film and a buffer film, the buffer film being placed between the sampling film and the support.
  • the stack comprises a sacrificial film, the sampling film being placed between the sacrificial film and the buffer film.
  • the sample film, the buffer film and the support are made of polydimethylsiloxane (PDMS).
  • the sacrificial film is made of plastic impermeable to living cells.
  • the invention also relates to a method for obtaining a plate for cell biology comprising the following steps:
  • the invention also relates to a method for cell biology comprising the following steps: depositing a mixture of first cells and second cells, on a plate for cell biology comprising a biocompatible support and a stack of flexible biocompatible films and comprising a well traversing the stack to the support, in which the films of the stack are engaged, with each other and with the support, in a mechanical connection allowing the peeling; - Then, clean the plate to remove the cells of the mixture, outside the surface of the well;
  • the method comprises the following subsequent step of peeling the films from the stack remaining on the support, to obtain, with respect to the mixture, on the support, a purified population of second cells.
  • the cleaning is obtained by rinsing the film of the stack furthest from the support at this stage of the process.
  • the cleaning is obtained by peeling the film from the stack furthest from the support at this stage of the process.
  • the first cells and the second cells have heterogeneous migratory properties in the sense that the first cells of the initial population move or migrate faster than the second cells of the initial population, on the one hand on the surface of the well , both on the bottom of the well and on its walls, and on the other hand on the surface of the sampling film, which is supposed to be unobstructed for this migration of the first cells.
  • the subsequent collection of the cells present on the support, the sampling film and the other films of the stack, such as the buffer film, is obtained by their detachment of the various films and the support, by conventional cell dissociation techniques (for example by trypsinization).
  • the present application relates to a device which adopts the same approach as migration tests but which allows the collection or sorting of cells that have migrated at different speeds, allowing the sorting or purification of cell populations according to the criterion of the migration speed.
  • the present application therefore provides a chromatography or sorting or cell separation tool based on the speed of cell migration on a surface.
  • Cells are seeded at the bottom of a cavity or well, comprising several layers stacked on a support and traversed by a hole to the support. Each layer has a thickness that can be variable and the number of layers can be variable without departing from the teaching of the present application.
  • the cells are first seeded at the bottom of the cavity. As the cells migrate and divide, they "climb" the walls of the cavity from the bottom, first on the edge of the first film and then on the following until the last film, farthest from the substrate, located at the top of the cavity, until they overflow from the top of the cavity (typically after 1 to 4 days) and then invade the surface of the last film that is exposed to the atmosphere surrounding the plate, consisting of the support and its stacking.
  • the cells are collected according to their migration distance by peeling the different layers of the stack one by one. Each layer containing at a given moment the cells for which the migration distance is equal to the migration rate multiplied by the time.
  • the selected or sorted cells can be detached from each layer by means known from the prior art, such as a trypsin bath and treated by other means (culture, lysis for screening their RNA, Western Blot, ...)
  • the last layer of the stack or sampling layer it will be possible for a population comprising two types of cells having two distinct migration speeds, to collect, at the end of a given time, only cells of a single type, provided that, as a separation condition, the product of the difference in speed multiplied by the time elapsed since seeding is greater than the thickness of the sampling layer.
  • peeling is a mechanical separation operation allowing, for example, to detach without last destruction the last film of the stack of others, without destroying it, for example by scraping the film and pulling it with tweezers.
  • the films of the stack may have been laminated on the support to remove the air bubbles and cause adhesion in the form of a mechanical link allowing the subsequent peeling of the films, this bond existing between the films of the stack and between the film in contact with the support and the support.
  • the support will preferably be rigid and the films will be flexible in the extent to allow their peeling without breaking them.
  • a support in the form of a film, a layer or a flexible sheet is however also in the teaching of the present application.
  • the rolling of the films together and their drilling could be carried out in a first step, the films then being pierced with holes passing through the stack from one side to the other, then in a second step the stacking could be laminated on the backing.
  • the drilling of the rolled films on the support can be performed by controlling the drilling depth to let the support constitute the bottom of the well or wells, whose walls are constituted by the stack.
  • 125 micron PDMS films are particularly suitable for carrying out the stacking. A dozen films will thus make it possible to reach a buffer thickness of 1.25 mm for stacking, this ten films being then composed of nine films functionally forming a "buffer" layer for migration and a last film used for sampling, which is structurally the film further away from the support.
  • a support several millimeters thick is possible.
  • the diameter of the wells it is set by drilling technology and can be adapted to the migration characteristics of the cells to be sorted.
  • the present application therefore makes it possible routinely, without heavy equipment or highly qualified personnel, to sort cells according to their migration rate on a well surface, with a number of cells sorted compatible with "omic" studies such as including genomics.
  • it may be placed on the stack a sacrificial film, intended to protect the film located beneath him.
  • this film may be of a material such as PDMS or a plastic material impermeable to living cells and cheaper than PDMS, provided that it is like all materials of the present application biocompatible or compatible with living cells. Indeed, once the cells seeded on the bottom of the well, with an aqueous solution containing the cells, it will be necessary to clean the outer surface of the stack, surface of the last film exposed to the cell solution.
  • the sacrificial film that is to say either the last layer of PDMS or the last layer of plastic. This will leave an outer face of the stack at this stage of the process, that is to say after peeling of the sacrificial film, virgin living cell.
  • FIG. 1 represents a support layer, or support layer, of PDMS covered with a buffer layer, or buffer, itself covered with a sampling layer.
  • the buffer layer extends between the support and the sampling layer.
  • the buffer layer and the sampling layer are pierced with a hole which leads to the support layer without passing through it.
  • a plate for the biology according to the invention is produced by a 125 micron thick PDMS support layer 1 and a buffer layer 2 or thickness buffer made from three layers of 125 microns thick PDMS or an equivalent layer of 375 microns, whose layer separations of 125 microns are not shown, and a sampling layer 3 PDMS of 125 microns thick.
  • the buffer layer 2 is thicker than the support layer 1 and the sampling layer 3 is of thickness substantially equal to the support layer.
  • teaching of the present application also applies, from the first mode described, to: a buffer layer thickness which is different from the thickness of the sampling layer or a multiple of the thickness of the the sampling layer; a buffer layer thickness which is different from the thickness of the support or a multiple of the thickness of the support; a thickness of the sampling layer which is different from the thickness of the support or a multiple of the thickness of the support; a buffer layer more or less thick or of the same thickness as the sampling layer; a buffer layer more or less thick or of the same thickness as the support or support layer; a sampling layer more or less thick or the same thickness as the support layer or support.
  • the buffer layer 2 is disposed between the sampling layer 3 and the support layer 1.
  • the buffer layer 2 and the sampling layer 3 are pierced with a hole which passes through them to the support layer 1.
  • a well is thus formed for its walls by the sampling layer 3 and the buffer layer 2 and for its bottom by the support layer 1 here flexible. In this case, it will be sufficient to peel the sampling layer 3 and then the other side of the buffer layer 2, the support layer 1, to obtain two populations of cells, for a so-called binary operation of the invention.
  • the support 1 may be thicker, therefore more rigid, and consists of several PDMS sub-layers of the same thickness, ie 125 microns for each of the sub-layers.
  • the buffer layer 2 will be peeled after the sampling layer until a peeled layer without a hole appears, which will be the first underlayer of the support corresponding to the bottom of the well. On this underlayer, we will obtain a population of cells lining the bottom of the well on the support layer.
  • a second embodiment is described below for the device and method according to the invention.
  • PDMS sheets For manufacturing purposes, 250 micron thick PDMS sheets (of SMI origin) stacked on top of each other (2 to 5 sheets or A4 size films) are used for this mode.
  • the sheets are then cut by a commercial laser cutting device (for example, from a sticker design company) to drill a network of holes (typically 500 microns in diameter spaced 1.5mm apart) through the hole. stacking.
  • the chopped system piece is thoroughly rinsed and sonicated in ethanol to remove dust from the cut and sterilize it.
  • ECM proteins in English "extra cellular matrix proteins”
  • cells are then seeded in each well with a drop of two microliters of medium containing cells at a density of 3,000,000 cells per ml, giving 6,000 cells per well.
  • the cells fall into the wells and attach to the bottom exclusively, the vertical walls do not allow easy adhesion of the cells.
  • a weak angle preserving this property of non-adhesion would be in the teaching of the present application, by equivalence.
  • the medium is removed and replaced with a cell-free culture medium to remove the cells. floating in the middle.
  • the medium can also be rinsed but in this mode, the furthest layer of the bottom of the well is peeled, in the presence of the culture medium, with tweezers to remove all the cells that would not have fallen into the cavities but would have adhered to the surface of the stack outside the wells.
  • This procedure is very similar to the standard seeding procedure used for a petri dish.
  • the system is left in culture in a suitable medium containing ECM proteins for the time required for the cells to exit the cavities (typically 1, 5 to 3 days).
  • a suitable medium containing ECM proteins for the time required for the cells to exit the cavities (typically 1, 5 to 3 days).
  • Each useful layer is treated once detached with medium to detach the cells (for example, containing trypsin) for subsequent conventional culture for lysis for RNA / DNA sequencing. No specific tool or additional particular detection apparatus is required to obtain purified cells on the criterion of their migration rate.
  • the process described above can be repeated to further purify by differential migration the cell populations obtained.
  • petri dishes one thus easily obtains 400,000 cells per dish, i.e. 1 to 2 micrograms of RNA.
  • the separation efficiency is 90% per cycle.
  • a separation efficiency of 90% of the mesenchymal phenotype with respect to the epithelial phenotype is obtained.
  • the invention is a system consisting of membranes that can be peeled to remove from these membranes cells that have migrated to a certain distance in greater or lesser amounts, due to differences in their migration rate. on a surface.
  • the teaching of the present application also applies from the first mode described, to: changes in material, size or shape of wells, layer thickness or density or number of wells;
  • the invention is susceptible of industrial application or useful in the field of cell biology.

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Abstract

Plaque pour la biologie cellulaire, comprenant un support (1) biocompatible, un empilement sur le support (1) de films souples biocompatibles, l'empilement comprenant un puits traversant l'empilement jusqu'au support, dans laquelle les films de l'empilement sont engagés, entre eux et avec le support, dans une liaison mécanique permettant le pelage.

Description

PLAQUE POUR LA BIOLOGIE CELLULAIRE
DOMAINE TECHNIQUE
L'invention concerne le domaine des supports pour la biologie et notamment le domaine des plaques biocompatibles comprenant des trous appelés puits, dans lesquelles des cellules vivantes sont déposées pour les mettre en culture, pratiquer sur elles des analyses et des mesures, notamment impliquant leur culture et leur croissance en nombre.
ARRIERE PLAN
Les tests ou essais de migration et de cicatrisation de plaie sont un outil répandu en biologie cellulaire pour la caractérisation de cellules à la fois au laboratoire et pour le diagnostic. Ce type de test ou essai consiste à créer un écart ou fossé ou tranchée ou blessure ou plaie dans une monocouche de cellules et à caractériser par imagerie la vitesse et le mode de déplacement des cellules.
C'est une approche très simple qui est par exemple utilisée pour caractériser des cellules épithéliales et/ou mésenchymateuses dans le diagnostic du cancer ainsi que pour estimer les effets des médicaments.
Des essais de migration typiques requièrent quelques dizaines de millier de cellules fermant la plaie.
Toutefois, les cellules primaires comme les lignées de cellules montrent de grandes variations de leur vitesse de migration qui proviennent de grandes variations dans leur expression des protéines, dans leur expression des gènes ou de facteurs épi-génétiques.
Des essais courants ne permettent cependant pas dans l'art antérieur de prélever des populations de cellules sur le critère de leurs propriétés de migration pour appliquer une approche « omique » et tester la variabilité cellulaire et les différentes façons dont les médicaments influencent les propriétés de migration à l'intérieur d'une population donnée de cellules.
Dans l'art antérieur, des essais impliquant une seule cellule peuvent être envisagés, mais ils sont délicats, onéreux, et nécessitent une approche radicalement différente par rapport à des essais routiniers de migration ou de cicatrisation. L'art antérieur utilise aussi couramment les chambres de «Boyden» pour étudier la migration stimulée de cellules à travers une couche épithéliale, mais ces chambres ne sont pas sélectives en termes de vitesse de migration et la migration doit être induite par un chemoattractant.
En conséquence, dans l'art antérieur, l'isolement de populations de cellules triées selon le critère de leur vitesse de migration est un problème difficile. PRESENTATION GENERALE
Dans la présente demande, on entendra par :
PDMS : le matériau dit polydiméthylsiloxane— [0-Si(CH3)2]n.
Pelage ou décollement : un mode de suppression d'une liaison mécanique entre un film et un autre film ou entre le film et un support, permettant de prélever ou séparer le film de l'autre film ou du support, cette liaison est donc un type de liaison démontable entre deux surfaces obtenue par exemple par un laminage ou un encollage entre deux surfaces avec une colle ne se solidifiant pas ou réversible.
Imperméable aux cellules : la propriété pour un matériau de ne pouvoir être traversé par les cellules vivantes. Dans ce contexte, l'invention concerne une plaque pour la biologie cellulaire, comprenant un support biocompatible, un empilement sur le support de films souples biocompatibles, l'empilement comprenant un puits traversant l'empilement jusqu'au support, dans laquelle les films de l'empilement sont engagés, entre eux et avec le support, dans une liaison mécanique permettant le pelage. Dans des variantes de la plaque :
- l'empilement comprend un film de prélèvement et un film tampon, le film tampon étant disposé entre le film de prélèvement et le support.
- l'empilement comprend un film sacrificiel, le film de prélèvement étant disposé entre le film sacrificiel et le film tampon. - le film de prélèvement, le film tampon et le support sont en polydiméthylsiloxane(PDMS).
- le film sacrificiel est en plastique imperméable aux cellules vivantes.
L'invention concerne aussi un procédé pour obtenir une plaque pour la biologie cellulaire comprenant les étapes suivantes:
- disposer sur un support biocompatible un empilement de films souples biocompatibles ; - laminer les films sur le support pour engager les films, entre eux et avec le support, dans une liaison mécanique permettant le pelage.
L'invention concerne aussi un procédé pour la biologie cellulaire comprenant les étapes suivantes: - déposer un mélange de premières cellules et de secondes cellules, sur une plaque pour la biologie cellulaire comprenant un support biocompatible et un empilement de films biocompatibles souples et comprenant un puits traversant l'empilement jusqu'au support, dans laquelle les films de l'empilement sont engagés, entre eux et avec le support, dans une liaison mécanique permettant le pelage; - puis, nettoyer la plaque pour en enlever les cellules du mélange, en dehors de la surface du puits;
- puis, laisser migrer les premières cellules du mélange, via la surface du puits, sur un film de prélèvement, le plus éloigné du support à ce stade du procédé;
- puis, peler le film de prélèvement, pour obtenir, par rapport au mélange, sur le film de prélèvement, une population purifiée de premières cellules.
Dans des variantes du procédé:
- le procédé comprend l'étape ultérieure suivante de peler les films de l'empilement restant sur le support, pour obtenir, par rapport au mélange, sur le support, une population purifiée de secondes cellules. - le nettoyage est obtenu par rinçage du film de l'empilement le plus éloigné du support à ce stade du procédé.
- le nettoyage est obtenu par pelage du film de l'empilement le plus éloigné du support à ce stade du procédé.
Ci-dessus, les premières cellules et les secondes cellules présentent des propriétés migratoires hétérogènes au sens que les premières cellules de la population initiale se déplacent ou migrent plus vite que les secondes cellules de la population initiale, d'une part sur la surface du puits, aussi bien sur le fonds du puits que sur ses parois, et d'autre part sur la surface du film de prélèvement, qui est supposée sans obstacle pour cette migration des premières cellules. On obtient ainsi sur le film de prélèvement, d'abord les premières cellules, supposées à forte capacité migratoire comparées aux secondes cellules, puis les secondes cellules. En adaptant, pour une population initiale de cellules l'intervalle de temps après lequel est enlevé le film de prélèvement, on obtient donc d'une part une population finale de cellules sur le film de prélèvement qui est plus riche en premières cellules qu'en secondes cellules et d'autre part une population finale de cellules sur le fonds du puits, s'étendant donc sur le film support, qui est plus riche en secondes cellules qu'en premières cellules.
La collecte ultérieure des cellules présentes sur le support, le film de prélèvement et les autres films de l'empilement comme le film tampon, est obtenue par leur détachement des différents films et du support, par des techniques classiques de dissociation cellulaire (par exemple par trypsinisation). La présente demande concerne un dispositif qui adopte la même approche que des essais de migration mais qui permet la collecte ou le tri aisé de cellules qui ont migré à des vitesses différentes, permettant le tri ou la purification de populations de cellules selon le critère de la vitesse de migration.
Plus de 100 000 cellules peuvent être collectées pour chaque utilisation du dispositif selon la présente demande, ce qui permet d'appliquer subséquemment des caractérisations «omiques» des cellules triées. La présente demande fournit donc un outil de chromatographie ou de tri ou de séparation cellulaire fondé sur la vitesse de migration des cellules sur une surface.
Les principes à la base de l'invention sont exposés ci-dessous. Des cellules sont ensemencées au fond d'une cavité ou puits, comprenant plusieurs couches empilées sur un support et traversées par un trou jusqu'au support. Chaque couche a une épaisseur qui peut être variable et le nombre de couches peut être variable sans sortir de l'enseignement de la présente demande.
Les cellules sont tout d'abord ensemencées au fond de la cavité. Comme les cellules migrent et se divisent, elles « grimpent » aux murs de la cavité à partir du fond, d'abord sur la tranche du premier film puis sur les suivants jusqu'au dernier film, le plus éloigné du substrat, situé au sommet de la cavité, jusqu'à ce qu'elles débordent du sommet de la cavité (typiquement après 1 à 4 jours) et qu'elles envahissent ensuite la surface du dernier film qui est exposé à l'atmosphère environnant la plaque, constituée du support et de son empilement.
Quand la distance de migration ou profondeur de la cavité est suffisante, les cellules sont collectées en fonction de leur distance de migration en pelant les différentes couches de l'empilement une par une. Chaque couche contenant à un instant donné les cellules pour lesquelles la distance de migration est égale à la vitesse de migration multipliée par le temps.
Une fois les couches ou films prélevés, les cellules sélectionnées ou triées peuvent être détachées de chaque couche par des moyens connus de l'art antérieur, comme un bain de trypsine et traitées par d'autres moyens (culture, lyse pour un criblage de leur ARN, Western Blot , ... )
De façon alternative, sur la dernière couche de l'empilement ou couche de prélèvement, on pourra pour une population comprenant deux types de cellules possédant deux vitesses de migration distinctes, recueillir au bout d'un temps donné, uniquement des cellules d'un seul type, pourvu que, comme condition de séparation, le produit de la différence de vitesse multipliée par le temps écoulé depuis l'ensemencement soit supérieur à l'épaisseur de la couche de prélèvement. A cette fin, on pourra épaissir les autres couches de l'empilement qui constituent fonctionnellement une couche « tampon » pour augmenter le temps de débordement jusqu'à satisfaire la condition de séparation des deux types de cellules.
L'enseignement de la présente demande porte sur une plaque comprenant un support et un empilement de films, « pelable » du support. Par « pelable », on entend que les couches ou films constituant l'empilement, hormis le fait qu'elles sont traversées par un trou jusqu'au support pour former un puits, sont engagées entre elles et avec le support dans une liaison mécanique permettant le pelage ou le prélèvement par décollement, soit notamment de chaque film individuellement pour laisser les autres , soit d'un groupe de films pour laisser un autre groupe de films, soit encore de l'ensemble des films pour ne conserver que le support. Le pelage étant une opération de séparation mécanique permettant, par exemple, de détacher sans destruction le dernier film de l'empilement des autres, sans le détruire, par exemple en grattant le film et en le tirant avec une pince à épiler.
On conçoit donc que si une couche est extraite par pelage et que des cellules d'un type sont présentes sur les bords du trou appartenant à la couche, elles pourront être prélevées en même temps que la couche. On pourra notamment enlever la dernière couche de l'empilement, c'est-à-dire la plus éloignée du substrat ou support pour emporter préférentiellement des cellules rapides ayant la plus grande vitesse de migration puis peler tous les autres films en ne conservant que le support recouvert préférentiellement des cellules lentes ayant la plus faible vitesse de migration. On remarque aussi que si l'on laisse déborder sur le pourtour du puits, les cellules les plus rapides sur une surface de pourtour égale à celle de la surface du fonds du puits, on disposera facilement de populations de cellules rapides et lentes en nombre comparables, possiblement élevé et pouvant notamment atteindre aisément 100 000 cellules pour les deux populations. Ce mode est le mode préféré pour l'invention.
Pour réaliser la plaque ci-dessus, les films de l'empilement peuvent avoir notamment été laminés sur le support pour en faire disparaître les bulles d'air et provoquer une adhésion sous forme d'une liaison mécanique permettant le pelage ultérieur des films, cette liaison existant aussi bien entre les films de l'empilement qu'entre le film au contact du support et le support.
Pour obtenir cette liaison mécanique, on n'a pas écrasé les films avec une force trop grande pour les faire devenir un film homogène unique, mais on ne les a pas non plus simplement pressés avec une force insuffisante pour les faire tenir les uns sur les autres et sur le support. Un laminage contrôlé permet par exemple un tel résultat en ajustant la force perpendiculaire aux films lors de leur laminage, ou pressage contre le support, par de simples opérations d'exécution pour chaque combinaison de films choisie pour constituer l'empilement.
Le support sera préférentiellement rigide et les films seront souples dans la mesure à permettre leur pelage sans les casser. Un support sous forme d'un film, d'une couche ou d'une feuille souple est cependant aussi dans l'enseignement de la présente demande.
On peut noter pour la réalisation de la plaque, que le laminage des films ensemble et leur perçage pourrait être effectué dans une première étape, les films étant alors percés de trous traversant l'empilement de part en part, puis dans une seconde étape l'empilement pourrait être laminé sur le support. De façon alternative, le perçage des films laminés sur le support peut être effectué en contrôlant la profondeur de perçage pour laisser le support constituer le fond du puits ou des puits, dont les parois sont constituées par l'empilement.
Un perçage par poinçon ou par laser est envisageable dans les deux méthodes de réalisation. Des films de PDMS de 125 microns sont particulièrement adaptés à la réalisation de l'empilement. Une dizaine de films permettra ainsi d'atteindre une épaisseur tampon de 1 ,25 mm pour l'empilement, cette dizaine de films étant alors constituée de neuf films formant fonctionnellement une couche « tampon » pour la migration et d'un dernier film utilisé pour le prélèvement, qui est structurellement le film plus éloigné du support.
Un support de plusieurs millimètres d'épaisseur est envisageable.
Pour le diamètre des puits, il est fixé par la technologie de perçage et peut être adapté aux caractéristiques de migration des cellules à trier.
La présente demande permet donc de réaliser de façon routinière, sans équipement lourd ni personnel hautement qualifié, un tri de cellules en fonction de leur vitesse de migration sur une surface de puits, avec un nombre de cellule triées compatible avec des études « omiques » comme notamment la génomique. Dans l'utilisation de l'invention, il pourra être disposé sur l'empilement un film sacrificiel, destiné à protéger le film situé sous lui. Par exemple ce film pourra être en un matériau comme le PDMS ou en un matériau plastique imperméable aux cellules vivantes et meilleur marché que le PDMS, pourvu qu'il soit comme tous les matériaux de la présente demande biocompatible ou compatible avec les cellules vivantes. En effet, une fois les cellules ensemencées sur le fonds du puits, par une solution aqueuse contenant les cellules, il faudra nettoyer la surface extérieure de l'empilement, surface du dernier film exposée à la solution cellulaire.
Pour ce faire ce nettoyage, on peut rincer la surface au moyen d'une solution aqueuse contenant de la trypsine, la solution ne pénétrant pas dans les puits si elle est écoulée parallèlement à la surface extérieure de l'empilement, i.e. parallèlement au substrat pour des couches planes et à faces parallèles et un support plan et à faces parallèle. On laissera ainsi une face extérieure de l'empilement à ce stade du procédé, c'est-à-dire après rinçage de la plaque, vierge de cellule vivante.
Pour faire ce nettoyage, on peut aussi peler le film sacrificiel, c'est-à-dire soit la dernière couche de PDMS soit la dernière couche en plastique. On laissera ainsi une face extérieure de l'empilement à ce stade du procédé, c'est-à-dire après pelage du film sacrificiel, vierge de cellule vivante.
Il est évidemment intéressant de multiplier le nombre de puits, par exemple 12 ou 24 pour paralléliser et multiplier les expériences ou tests, avec une seule plaque. Les caractéristiques et avantages précités, ainsi que d'autres, apparaîtront à la lecture de la description détaillée qui suit, d'exemples de réalisation de l'invention. Cette description détaillée fait référence aux dessins annexés. BREVE DESCRIPTION DES DESSINS
Les dessins annexés sont schématiques et ne sont pas à l'échelle, ils visent avant tout à illustrer les principes de l'invention.
La figure 1 représente une couche support, ou support, de PDMS recouverte d'une couche tampon, ou tampon, elle-même recouverte d'une couche de prélèvement. La couche tampon s'étend entre le support et la couche de prélèvement. La couche tampon et la couche de prélèvement sont percées d'un trou qui aboutit à la couche support sans la traverser.
DESCRIPTION DETAILLEE D'EXEMPLE(S) Dans un premier mode de réalisation, en lien avec la figure 1 , une plaque pour la biologie selon l'invention est réalisée par une couche support 1 en PDMS de 125 microns d'épaisseur et une couche tampon 2 ou tampon d'épaisseur réalisée à partir de trois couches de 125 microns d'épaisseur en PDMS soit une couche équivalente de 375 microns, dont les séparations en couches de 125 microns ne sont pas représentées, et une couche de prélèvement 3 en PDMS de 125 microns d'épaisseur.
Dans ce premier mode de réalisation, la couche tampon 2 est plus épaisse que la couche support 1 et la couche de prélèvement 3 est d'épaisseur sensiblement égale à la couche support. Cependant, l'enseignement de la présente demande s'applique aussi, à partir du premier mode décrit, à: une épaisseur de couche tampon qui est différente de l'épaisseur de la couche de prélèvement ou d'un multiple de l'épaisseur de la couche de prélèvement; une épaisseur de couche tampon qui est différente de l'épaisseur du support ou d'un multiple de l'épaisseur du support; une épaisseur de la couche de prélèvement qui est différente de l'épaisseur du support ou d'un multiple de l'épaisseur du support; une couche tampon plus ou moins épaisse ou de même épaisseur que la couche de prélèvement ; une couche tampon plus ou moins épaisse ou de même épaisseur que le support ou couche support; une couche de prélèvement plus ou moins épaisse ou de même épaisseur que la couche support ou support.
La couche tampon 2 est disposée entre la couche de prélèvement 3 et la couche support 1 . La couche tampon 2 et la couche de prélèvement 3 sont percées d'un trou qui les traverse jusqu'à la couche support 1. Un puits est ainsi formé pour ses parois par la couche de prélèvement 3 et la couche tampon 2 et pour son fond par la couche support 1 ici souple. Dans ce cas, il suffira de peler la couche de prélèvement 3 puis de l'autre côté de la couche tampon 2, la couche support 1 , pour obtenir deux populations de cellules, pour un fonctionnement dit binaire de l'invention.
Le support 1 pourra être plus épais, donc plus rigide, et constitué de plusieurs sous- couches en PDMS de même épaisseur soit 125 microns pour chacune des sous-couches. Dans ce cas, on pèlera la couche tampon 2 après la couche de prélèvement, jusqu'à voir apparaître une couche pelée sans trou, ce qui sera la première sous-couche du support correspondant au fond du puits. Sur cette sous-couche, on obtiendra une population de cellules tapissant le fond du puits sur la couche support. Un second mode de réalisation est décrit ci-dessous pour le dispositif et le procédé selon l'invention.
Pour la fabrication, on utilise pour ce mode des feuilles de PDMS (d'origine SMI) de 250 microns d'épaisseur empilées les unes sur les autres (2 à 5 feuilles ou films de format A4). Les feuilles sont ensuite découpées par un dispositif commercial de découpe au laser (par exemple celui d'une compagnie de conception de d'autocollants) pour percer un réseau de trous (typiquement de 500 microns de diamètre espacés de 1 ,5mm) à travers l'empilement.
On obtient ainsi un réseau au format A4 qui est ensuite découpé en morceaux. On prendra par exemple des morceaux de 1 cm par 1 cm, ce qui pour des puits de 500 microns permet d'obtenir 30 à 40 puits pour être adapté à une boîte de Pétri d'un pouce soit 21 ,5mm ou à des boîtes prévues pour six puits de l'art antérieur.
Le morceau de système découpé est soigneusement rincé et passé aux ultrasons dans de l'éthanol pour retirer la poussière provoquée par la découpe et pour le stériliser.
Il est ensuite placé dans une boîte de Pétri ou sur une boîte pour multi-puits de l'art antérieur, recouvertes de protéines ECM (en anglais « extra cellular matrix proteins ») pour empêcher l'adhésion des cellules vivantes.
Pour l'ensemencement, des cellules sont alors ensemencées dans chaque puits par une goutte de deux microlitres de milieu contenant des cellules à une densité de 3 000 000 de cellules par ml, ce qui donne 6000 cellules par puits. Les cellules tombent dans les puits et s'attachent au fond exclusivement, les parois verticales ne permettant pas l'adhésion aisée des cellules. Un angle faible préservant cette propriété de non-adhésion serait dans l'enseignement de la présente demande, par équivalence. Après une heure, le milieu est retiré et remplacé par un milieu de culture dépourvu de cellules, pour enlever les cellules flottant dans le milieu. Le milieu peut aussi être rincé mais dans ce mode, on pèle la couche la plus éloignée du fonds du puits, en présence du milieu de culture, avec une pince à épiler pour retirer toutes les cellules qui ne seraient pas tombées dans les cavités mais auraient adhéré à la surface de l'empilement en dehors des puits. Cette procédure est très similaire à la procédure standard d'ensemencement utilisée pour une boîte de Pétri.
Pour la migration, le système est laissé en culture dans un milieu adaptée contenant des protéines ECM pour le temps nécessaire aux cellules pour sortir des cavités (typiquement 1 ,5 à 3 jours). Pour la récolte ou collecte, on utilise une pince à épiler pour soit peler les différentes couches de l'empilement une à une, soit peler la dernière couche puis peler d'un seul coup toutes les autres et ne laisser que le support ou la dernière couche. Chaque couche utile est traitée une fois détachée avec un milieu pour détacher les cellules (contenant par exemple de la trypsine) pour une culture ultérieure classique, pour une lyse en vue d'un séquençage ARN/ADN. Aucun outil spécifique ou appareil de détection particulier additionnel n'est nécessaire pour obtenir des cellules purifiées sur le critère de leur vitesse de migration.
Le processus décrit ci-dessus peut être répété pour purifier encore par migration différentielle, les populations de cellules obtenues. Avec des boîtes de Pétri on obtient ainsi aisément 400 000 cellules par boîte, i.e. 1 à 2 microgrammes d'ARN.
Pour une population de cellules mélangée à dans une proportion de 50%-50% de cellules MDA-MB et MCF7 (qui possèdent une large différence de vitesse de migration) , l'efficacité de séparation est de 90% par cycle. Pour une population de cellules de lignée A549, on obtient une efficacité de séparation de 90% du phénotype mésenchymateux par rapport au phénotype épithélial.
On comprendra de la présente demande que l'invention est un système constitué de membranes qui peuvent être pelées pour prélever sur ces membranes des cellules qui ont migré à une certaine distance en plus ou moins grande quantité, du fait de différences dans leur vitesse de migration sur une surface.
L'enseignement de la présente demande s'applique aussi à partir du premier mode décrit, à : des changements de matériau, de dimensions ou de forme des puits, d'épaisseur des couches ou de densité ou de nombre de puits ;
une inclinaison des parois des puits autre que perpendiculaire au plan des couches, pour permettre une meilleure visualisation du processus de migration ; - un usage en tant que tel, plutôt que à des fins «omiques» ;
à l'automatisation du procédé à l'aide de robots ;
une préparation adaptée à une plaque multi-puits, une boîte de Pétri, ou une lame de microscope ;
une utilisation avec des populations de cellules ayant des scores mésenchymateux/épithélial différents des cellules citées dans la demande.
L'invention est susceptible d'application industrielle ou utile dans le domaine de la biologie cellulaire.
Il est entendu, au sens de la présente demande, que les mots "efficacité de séparation" sont synonymes des mots "efficacité de purification" ou des mots "efficacité d'enrichissement".
Enfin, les différentes caractéristiques des modes ou exemples de réalisation décrits dans le présent exposé peuvent être considérées isolément ou être combinées entre elles. Lorsqu'elles sont combinées, ces caractéristiques peuvent l'être comme décrit ci-dessus ou différemment, l'invention ne se limitant pas aux combinaisons spécifiques précédemment décrites. En particulier, sauf précision contraire ou incompatibilité technique, une caractéristique décrite en relation avec un mode ou exemple de réalisation peut être appliquée de manière analogue à un autre mode ou exemple de réalisation.

Claims

REVENDICATIONS
1 . Plaque pour la biologie cellulaire, comprenant un support (1 ) biocompatible, un empilement sur le support de films souples biocompatibles, l'empilement comprenant un puits traversant l'empilement jusqu'au support, dans laquelle les films de l'empilement sont engagés, entre eux et avec le support, dans une liaison mécanique permettant le pelage.
2. Plaque selon la revendication 1 , dans laquelle l'empilement comprend un film de prélèvement (3) et un film tampon (2), le film tampon étant disposé entre le film de prélèvement et le support (1 ).
3. Plaque selon la revendication 2, dans laquelle l'empilement comprend un film sacrificiel, le film de prélèvement (3) étant disposé entre le film sacrificiel et le film tampon (2).
4. Plaque selon la revendication 2 ou 3, dans laquelle le film de prélèvement (3), le film tampon (2) et le support (1 ) sont en polydiméthylsiloxane (PDMS).
5. Plaque selon la revendication 3, dans laquelle le film sacrificiel est en plastique imperméable aux cellules vivantes.
6. Procédé pour obtenir une plaque pour la biologie cellulaire comprenant les étapes suivantes :
- disposer sur un support biocompatible un empilement de films souples biocompatibles; - laminer les films sur le support pour engager les films, entre eux et avec le support, dans une liaison mécanique permettant le pelage.
7. Procédé pour la biologie cellulaire comprenant les étapes suivantes:
- déposer un mélange de premières cellules et de secondes cellules, sur une plaque pour la biologie cellulaire comprenant un support (1 ) biocompatible et un empilement de films biocompatibles souples et comprenant un puits traversant l'empilement jusqu'au support, dans laquelle les films de l'empilement sont engagés, entre eux et avec le support, dans une liaison mécanique permettant le pelage;
- puis, nettoyer la plaque pour en enlever les cellules du mélange, en dehors de la surface du puits; - puis, laisser migrer les premières cellules du mélange, via la surface du puits, sur un film de prélèvement (3), le plus éloigné du support (1 ) à ce stade du procédé;
- puis, peler le film de prélèvement, pour obtenir, par rapport au mélange, sur le film de prélèvement (3), une population purifiée de premières cellules.
8. Procédé pour la biologie cellulaire selon la revendication 7, comprenant l'étape ultérieure suivante:
- peler les films de l'empilement restant sur le support (1 ), pour obtenir, par rapport au mélange, sur le support, une population purifiée de secondes cellules.
9. Procédé selon la revendication 7 ou 8, dans lequel le nettoyage est obtenu par rinçage du film de l'empilement le plus éloigné du support à ce stade du procédé.
10. Procédé selon la revendication 7 ou 8, dans lequel le nettoyage est obtenu par pelage du film de l'empilement le plus éloigné du support à ce stade du procédé.
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Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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C-L CHEN ET AL: "Multilayer parylene-C stencils for dynamically controlling cell interactions", IEEE 21ST INTERNATIONAL CONFERENCE ON MICRO ELECTRO MECHANICAL SYSTEMS, 2008 : MEMS 2008 ; 13 - 17 JAN. 2008, TUCSON, ARIZONA, USA, PISCATAWAY, NJ : IEEE OPERATIONS CENTER, 1 January 2008 (2008-01-01), pages 276 - 279, XP031210736, ISBN: 978-1-4244-1792-6, DOI: 10.1109/MEMSYS.2008.4443646 *
R. DERDA: "Multizone Paper Platform for 3D Cell Cultures", 1 January 2011 (2011-01-01), pages 1 - 13, XP055065792, Retrieved from the Internet <URL:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3089608/pdf/pone.0018940.pdf> [retrieved on 20130607], DOI: 10.1371/journal.pone.0018940 *

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