FR2971791A1 - Procede et systeme de culture cellulaire destines a l'etablissement d'un modele in vitro de barriere intestinale - Google Patents

Abstract

Procédé de culture cellulaire consistant à : - ensemencer un milieu de culture adapté à l'aide de cellules d'absorption, puis - ensemencer de manière différée le milieu contenant les cellules d'absorption ayant débuté leur multiplication, à l'aide de cellules productrices de mucus.

Description

PROCEDE ET SYSTEME DE CULTURE CELLULAIRE DESTINES A L'ETABLISSEMENT D'UN MODELE IN VITRO DE BARRIERE INTESTINALE DOMAINE TECHNIQUE

La présente invention se focalise sur le développement d'un modèle de co-culture, basé sur des cellules d'absorption Caco-2 et des cellules caliciformes HT29, pour tester le transport de substances actives et de nutriments au niveau intestinal. La finalité du modèle de co-culture proposé est de créer des modèles de culture cellulaire les plus réalistes possibles par rapport à l'épithélium intestinal humain.

ETAT ANTERIEUR DE LA TECHNIQUE La lignée cellulaire Caco-2 a été isolée à partir d'un cancer colorectal humain. Les cellules Caco-2 se différencient spontanément en monocouches polarisées de cellules d'absorption colonnaires bien développées exprimant une bordure en brosse avec des enzymes typiques (par exemple la phosphatase alcaline, la sucrase-isomaltase, l'aminopeptidase) sur leur face apicale. Les transporteurs actifs pour les acides aminés, les nucléosides, l'acide biliaire, les vitamines, les oligopeptides et les acides monocarboxyliques sont exprimés du côté apical. Les cellules dans ces monocouches sont jointes par des jonctions intercellulaires serrées qui limitent le passage paracellulaire des molécules de médicaments et d'ionsi'2. Toutefois, le resserrement des entérocytes de ces monocouches ressemble plus à celui du colon qu'aux tissus de l'intestin grêle, ce qui a pour conséquence une trop faible perméabilité paracellulaire de ces monocouches vis-à-vis des molécules hydrophiles13. De manière additionnelle, la glycoprotéine-P ou P-gp (codée par le gène «multidrug resistance gene-1 ») est exprimée fortement dans les cellules Caco-2.

La lignée cellulaire HT29 est dérivée d'un adénocarcinome humain du colon. Des cultures post-confluentes de cellules HT29 forment une multicouche hétérogène dans laquelle la majorité des cellules sont indifférenciées. Une sous-population de cellules caliciformes productrices de mucus (HT29-MTX) a été obtenue à partir de la lignée cellulaire parentale HT29 par une adaptation progressive au méthotrexate (MTX).

Plusieurs passages de cellules HT29 en croissance exponentielle ont été incubés avec des quantités croissantes de MTX (10', Io', 10.5 mol). Ceci cause initialement une forte mortalité, mais conduit à des sous-populations avec des taux de croissance stables. Ces cellules n'ont pas besoin d'être maintenues dans un milieu contenant du MTX pour se différencier en cellules caliciformes productrices de mucus après confluence3,as La couche de mucus qui s'étale sur toute la surface apicale présente en moyenne une épaisseur de 50 à 150 µm. Les cellules HT29-MTX au passage 13 sont par exemple disponibles auprès de Thécla Lesuffleur de l'INSERM U 938.

Les cultures de cellules Caco-2 ont été intensivement étudiées pour prévoir l'absorption de médicaments au niveau gastro-intestinal, malgré des conditions non optimales. En effet, l'activité P-gp dans les monocouches de Caco-2 dans des conditions standard de culture est beaucoup plus élevée que dans le colon humain in vivo'''. De plus, les valeurs TEER (Trans E&ithelial Electric Resistance), supérieures à 250 ohm.cm2, sont très élevées en comparaison avec l'intestin humain (12 à 69 ohm.cm2)', ce qui a pour conséquence une perméabilité paracellulaire des substances actives hydrophiles trop faible. En outre, le rôle de la couche de mucus naturellement située du côté luminal de la barrière intestinale n'est pas pris en considération pour évaluer la perméabilité des substances actives8'9'10 Il a été proposé de modifier les cellules Caco-2 pour tenter de se rapprocher de la réalité in vivo. Ainsi, le document EP1 158 045 décrit une souche dérivée de Caco-2 présentant une expression augmentée du cytochrome CYP3A4.

Par ailleurs, il a été proposé de réaliser des co-cultures associant des cellules d'absorption et des cellules caliciformes. Les premières études ont été réalisées par Wikman-Larhed et Arturssonn concernant des co-cocultures Caco-2/HT29-H, en utilisant en mélange au moment de l'ensemencement différentes proportions entre les cellules. Walter et al.12 (Caco-2/HT29-MTX) et Meaney et a1.9 (Caco-2/HT29G1ucH) ont utilisé un ratio unique.

Hilgendorf et a1.13 ont sélectionné trois rapports cellulaires différents entre Caco-2 et HT29-MTX, dans des expériences à facteur unique. Une co-culture en l'absence de sérum dans un ratio unique de cellules Caco-2/HT29-5M21 a été développée par Nollevaux et a1.14. Poquet et al.ls ont développé un modèle de co-culture avec un ratio cellulaire unique Caco-2/HT29-MTX pour analyser le transport de l'acide férulique. Les dernières études ont mis en oeuvre différents rapports entre cellules Caco-2/HT29-MTX pour prédire la biodisponibilité en ferl'. Un travail récent de Chen et al. de 201018 a étudié différents facteurs qui affectent la perméabilité des substances actives dans des modèles de coculture Caco-2/HT29-MTX. Les auteurs ont montré que le temps de culture et le milieu de culture jouent un rôle important sur les valeurs de TEER et les coefficients de perméabilité. Toutefois, pour toutes ces études, l'ensemencement des cellules HT29-MTX a été réalisé de manière simultanée avec l'ensemencement des cellules Caco-2.

Il existe donc un besoin évident de développer de nouveaux systèmes in vitro de barrière intestinale, à la fois plus flexibles et plus réalistes.

OBJET DE L'INVENTION

Dans le cadre de l'invention, le Demandeur a mis en évidence qu'il était possible de moduler les caractéristiques des cellules d'absorption, en particulier les cellules Caco-2, en jouant sur le moment de l'ensemencement des cellules productrices de mucus. Ainsi et de manière astucieuse, il est possible de contrôler les paramètres importants de la culture cellulaire obtenue, notamment transport et métabolisme des composés, de manière à obtenir un système in vitro aussi proche que possible de la réalité de la barrière intestinale in vivo.

De manière plus précise, le procédé de culture cellulaire selon l'invention consiste à : - ensemencer un milieu de culture adapté à l'aide de cellules d'absorption, puis - ensemencer de manière différée le milieu contenant les cellules d'absorption ayant débuté leur multiplication, à l'aide de cellules productrices de mucus.

De manière caractéristique selon l'invention et contrairement à l'art antérieur, l'ensemencement des deux types de cellules n'est donc jamais simultané.

Les cellules d'absorption sont caractérisées par leur capacité à présenter des propriétés de l'intestin grêle in vitro, notamment en termes de transport pour des études et analyses biopharmaceutiques. De manière privilégiée, les cellules d'absorption sont des cellules Caco-2. Il s'agit par exemple du clone CBBel au passage 47, référencé par l'American Type Culture Collection (ATCC) sous le numéro CRL-2102, qui dérive lui-même d'un clone de Caco-2 référencé ATCC HTB-37. En pratique, celui-ci peut être utilisé à un passage compris entre le passage 55 et le passage 65.

Les cellules productrices de mucus sont caractérisées par leur capacité à sécréter une couche de mucus et sont également appelées cellules en gobelet (goblet cell) ou cellules caliciformes. Concernant les cellules productrices de mucus, il s'agit avantageusement des cellules HT29-MTX, dont le procédé d'obtention a été décrit dans les publications de Lessufleur et a1.3,4,5Il s'agit par exemple de la lignée cellulaire HT29-MTX10-6 M au passage 13, disponible auprès du Dr. Thécla Lesuffleur de l'INSERM UMR S 938 à Paris, France. Cette lignée peut être utilisée préférentiellement à un passage compris entre le passage 14 et le passage 22. Alternativement, il peut s'agir des clones E12 et Dl décrits dans la publication Behrens et al. (Behrens I, Stenberg P., Artursson P., Kissel T. (2001) Transport of liphophilic drug molecules in a new mucus-secreting cell culture model based on HT29-MTX cells. Pharmaceutical Research 18, 1138-1145) ou bien de HT29G1ucH décrit dans la publication de Meaney et a1.9. 3 Ainsi, dans le cadre de la présente demande, il a été montré qu'il était possible de moduler les caractéristiques de la culture cellulaire obtenue, en jouant uniquement sur la chronologie d'ensemencement des deux types cellulaires en présence.

Contrairement à l'art antérieur qui préconisait l'ensemencement simultané des deux espèces cellulaires, le procédé selon l'invention propose un ensemencement décalé dans le temps, en d'autres termes différé, de ces deux types de cellules.

Plus précisément, le milieu de culture en présence est en premier lieu ensemencé à l'aide 10 des cellules d'absorption, avantageusement des cellules de type Caco-2.

De manière avantageuse, le milieu de culture est donc adapté à une croissance optimale des cellules d'absorption. Dans le cas des cellules Caco-2 et comme déjà décrit dans l'art antérieur, il s'agit avantageusement d'un milieu nutritif complet de type DMEM 15 (Dulbecco's Modified Eagle Medium). De manière encore plus avantageuse, il est additionné d'un facteur de croissance, comme par exemple du sérum de bovin foetal (FBS) inactivé à la chaleur et à une concentration avantageuse de 15% (v/v).

Le milieu de culture peut en outre contenir : 20 - de la L-glutamine, par exemple sous forme de Gluta-MaxTM ; - du D-glucose, avantageusement à hauteur de 4500 mg/L ; - du rouge phénol, avantageusement à hauteur de 15 mg/L ; - du pyruvate de sodium, avantageusement à hauteur de 110 mg/L ; - des acides aminés non essentiels, avantageusement à hauteur de 1% (v/v) ; 25 - les antibiotiques nécessaires au maintien des caractéristiques des souches en présence, par exemple 100µg/mL de streptomycine et 100UI/mL de pénicilline.

La culture cellulaire est avantageusement réalisée à 37°C dans une atmosphère humidifiée à 5% en COz Le milieu de culture est avantageusement changé deux fois par semaine, 30 voire chaque jour en fin de culture.

Dans le cadre de l'invention et de manière classique, le temps total de la culture cellulaire est avantageusement compris entre 21 et 35 jours, encore plus avantageusement entre 21 et 30 jours, après ensemencement à l'aide des cellules d'absorption. Le second type de cellules, à savoir les cellules productrices de mucus, ne sont donc pas ensemencées de manière simultanée, mais au contraire de manière différée avec le premier type cellulaire, à savoir les cellules d'absorption. En pratique, les cellules productrices de mucus sont ensemencées après les cellules d'absorption. 35 De manière plus précise et avantageuse, il faut au moins attendre que les cellules d'absorption aient entamé leur cycle de division cellulaire. En d'autres termes, les cellules d'absorption doivent avoir débuté leur multiplication.

De manière encore plus avantageuse dans le cas du milieu considéré, pour constater une différence avec le co-ensemencement, le deuxième type cellulaire est ensemencé au moins 1 jour (24 heures) après le premier type cellulaire.

Comme déjà dit, les cellules productrices sont ensemencées dans le milieu contenant les cellules d'absorption ayant débuté leur multiplication. De manière préférentielle, l'ensemencement des cellules productrices de mucus est réalisé à la surface des cellules d'absorption. De manière adaptée, l'ensemencement a donc lieu lorsque les cellules d'absorption forment déjà une monocouche, ce qui en pratique est observé 5 à 6 jours après ensemencement. Dans ce cas, les cellules productrices de mucus sont ensemencées directement sur la monocouche.

L'ensemencement du second type cellulaire ne doit pas non plus être trop tardif et doit en particulier aboutir à la production de mucus.

Dans les conditions de la présente demande, il a été observé qu'un ensemencement des cellules productrices de mucus entre les jours 4 et 8 après l'ensemencement des cellules d'absorption était particulièrement adapté. Ainsi, la co-culture obtenue, qui produit du mucus, présente des caractéristiques intermédiaires entre les deux types cellulaires notamment en termes de transport et de métabolisme des composés, et tend donc à refléter la réalité in vivo.

Par ailleurs, l'ensemencement des deux types cellulaires est réalisé de manière contrôlée.

Ainsi et comme déjà décrit dans l'art antérieur, d'autres conditions de la culture sont susceptibles d'affecter les propriétés et caractéristiques de la co-culture obtenue. De manière avantageuse, ces autres conditions sont celles décrites comme optimales dans l'art antérieur, en particulier : - ensemencement avec un ratio cellules d'absorption / cellules productrices de mucus compris entre 90/10 et 75/25 et avantageusement égal à 75/25 ; - densité d'ensemencement de 3.104 cellules sur une surface de culture de 0,33 cm', soit 9.104 cellules/cm pour les cellules d'absorption. Dans ces conditions cumulatives, les cellules productrices de mucus sont avantageusement ensemencées à hauteur de 104 cellules sur une surface de 0,33 cm2 soit 3.104 cellules/cm (dans le cas d'un rapport 75/25).

A noter que ces données sont relatives aux conditions initiales d'ensemencement pour chaque type cellulaire.

Par ailleurs et de manière classique, l'ensemencement des cellules et notamment des cellules d'absorption est réalisé sur un insert de culture perméable, par exemple sur un filtre en polycarbonate. Le dispositif TranswellTM est particulièrement adapté à la mise en oeuvre du procédé selon l'invention.

Selon un autre aspect, la présente invention concerne également la culture cellulaire susceptible d'être obtenue à l'aide du procédé précédemment décrit, notamment au terme des 21 à 35 jours, voire 21 à 30 jours après ensemencement des cellules d'absorption. Les cocultures ainsi mises à disposition sont nouvelles, puisqu'il a été montré dans le cadre de la présente demande que la séquence d'ensemencement impactait différentes caractéristiques (notamment efflux, transport paracellulaire,...) qui les différencient ainsi des cultures avec un seul type cellulaire ou même avec une co-culture obtenue après ensemencement simultané.

De manière avantageuse, la culture cellulaire ainsi obtenue présente au moins une des caractéristiques suivantes : - présence de cellules d'absorption et de cellules productrices de mucus ; - production de mucus ; - une valeur de TEER (Trans E&ithelial Electrical Resistance) comprise entre celle des cellules d'absorption et celle des cellules productrices de mucus, ce qui a pour conséquence une capacité à assurer le transport paracellulaire comprise entre celle des cellules d'absorption et celle des cellules productrices de mucus ; - une activité P-gp (P-glycoprotein - multidrug resistance gene-1) comprise entre celle des cellules d'absorption et celle des cellules productrices de mucus, ce qui a pour conséquence une capacité à assurer le transport transcellulaire des molécules substrat de la P-gp comprise entre celle des cellules d'absorption et celle des cellules productrices de mucus; - une activité du cytochrome CYP3A4 comprise entre celle des cellules d'absorption et celle des cellules productrices de mucus.

De manière avantageuse, la culture cellulaire se différencie par sa valeur de TEER et/ou son activité P-gp et/ou son activité cytochrome CYP3A4, avantageusement son activité P-gp. Comme démontré dans la présente demande, ceci est particulièrement marqué lorsque l'ensemencement des cellules productrices de mucus est réalisé de 4 à 8 jours après l'ensemencement des cellules d'absorption.

En conclusion, le modèle in vitro qui a été développé dans le cadre de la présente demande présente deux intérêts majeurs. Tout d'abord, il permet la modulation de la capacité fonctionnelle des monocouches, en particulier l'expression de P-gp (P-glycoprotein - multidrug résistance gene-1) et le transport paracellulaire, à être aussi proche que possible des conditions in vivo. En outre, la monocouche est couverte par une couche de mucus comme dans la barrière intestinale naturelle.

Ainsi, une telle culture cellulaire peut être utilisée comme modèle in vitro de barrière intestinale. En particulier, cette culture cellulaire peut permettre d'évaluer la biodisponibilité, notamment le transport et/ou le métabolisme d'un composé d'intérêt, en particulier une substance active ou un nutriment.

15 Comme il ressort de la présente description, le procédé selon l'invention permet donc de moduler dans une co-culture constituée de cellules d'absorption et de cellules productrices de mucus : - la production de mucus ; - la résistance transépithéliale électrique (TEER) et donc le transport paracellulaire; 20 - l'expression et l'activité de P-gp (P-glycoprotein - multidrug résistance gene-1) et donc l'efflux et le transport transcellulaire des molécules actives substrats de la P- gP - l'expression et l'activité du cytochrome CYP3A4 et donc le métabolisme cellulaire des substances actives qui subissent un métabolisme intestinal. 25 BREVE DESCRIPTION DES FIGURES

La manière dont l'invention peut être réalisée et les avantages qui en découlent ressortiront mieux des exemples de réalisation qui suivent, donnés à titre indicatif et non 30 limitatif, à l'appui des figures annexées parmi lesquelles :

La figure 1 représente les valeurs de TEER en fonction du temps pour Caco-2, HT29-MTX et différentes co-cultures. Chaque graphique correspond à une expérience. La figure 2 représente les valeurs de Papp pour le Jaune Lucifer (LY) dans différentes 35 monocouches. Chaque graphique correspond à une expérience. La figure 3 représente les valeurs de Papp pour la Rhodamine 123 (Rho123) dans la direction basolatérale-apicale. La figure 4 représente l'influence du vérapamil, un inhibiteur de P-gp, sur la Rhodamine 123 (Rhol23) dans la direction basolatérale-apicale.10 Un astérisque (*) indique des valeurs obtenues pour les cocultures, statistiquement différentes des valeurs obtenues avec chaque souche.

EXEMPLES DE RÉALISATION DE L'INVENTION I) Méthode

1) Ensemencement de Caco-2/HT29-MTX dans un dispositif transwell®.

Deux types de cellules ont été utilisés pour ce travail. Le clone CBBel des cellules Caco-2 a été obtenu auprès de l'American Type Culture Collection (ATCC) au passage 47 et a été utilisé dans des expériences aux passages 55 à 65. La lignée cellulaire HT29-MTX10-6 M a été fournie par le Dr. Thécla Lesuffleur de l'INSERM UMR S 938 à Paris, France, au passage 13 et a été utilisé dans des expériences aux passages 14 à 22.

Les deux types cellulaires ont été cultivés en routine dans des flacons de culture de 25 ou 75 cm3 et maintenus à 37°C dans une atmosphère humidifiée à 5% en COz dans un milieu de culture complet constitué du milieu D-MEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) contenant du G1utaMAXTM, du D-glucose (4500 mg/L), du pyruvate de sodium (110 mg/L) et du rouge de phénol (15mg/L). 15% de sérum de bovin foetal (FBS, inactivé à la chaleur), 1 % d'acides aminés non essentiels et 1% d'antibiotiques (100µg/mL de streptomycine et 100UI/mL de pénicilline) ont été ajoutés au D-MEM. Le milieu a été changé deux fois par semaine. Les cellules ont été soumises à une sous-culture lorsqu'une confluence à environ 70-80% a été atteinte. Un mélange Trypsine-EDTA a été utilisé pour détacher les cellules à une concentration de 0,125 et 0,25 % pour HT29-MTX et Caco-2, respectivement.

Le dispositif TranswellTM (TV), qui a été utilisé pour la co-culture, est constitué d'une plaque à 24 puits avec des inserts de membranes filtrantes en polycarbonate (diamètre : 6,5 mm ; surface membranaire : 0,33 cm2 ; taille des pores : 0,4 µm ; 10g pores/cm2, épaisseur de la membrane : 10µm). Avant l'ensemencement, les inserts du TranswellTM ont été équilibrés à 37°C, 5% COz avec du milieu de culture (compartiment supérieur : 100µL, compartiment inférieur : 600µL) pour au moins 1 heure. Ensuite, le milieu a été aspiré et les cellules ont été ensemencées.

Le jour de l'ensemencement des Caco-2 a été considéré comme le jour 0 (DO). Les Caco-2 ont été ensemencées à une densité de 3.105 cellules/mL dans le compartiment supérieur (3.104 cellules/0,33 cm2 ou 9.104 cellules/cm2). Ensuite, le compartiment inférieur a été rempli avec du milieu de culture. Pour la co-culture, les cellules HT29-MTX ont été ensemencées à différents temps compris entre les jours 0 et 18 (DO à D18) suivant l'ensemencement des Caco-2. Pour le jour 0 (DO), les Caco-2 et HT29-MTX ont été ensemencés de manière simultanée en prenant 100µL d'une suspension cellulaire avec des concentrations de 3.105 cellules/mL et 1.105 cellules/mL pour Caco-2 et HT29-MTX respectivement. Pour les autres points (D4, D6, D8, D10, D12, D14 et D18), les cellules HT29-MTX ont été ensemencées directement sur les monocouches de Caco-2 à une concentration de 1.105 cellules/mL (100µL/insert), après avoir retiré le milieu de culture du compartiment supérieur. Ainsi, le rapport Caco-2/HT29-MTX a été de 75/25 pour chaque co-culture. L'ensemencement a été réalisé en quatre exemplaires. Des contrôles ont été réalisés avec des monocouches de Caco-2 et HT29-MTX seules. Le milieu de culture a été changé chaque deux jours pour les deux premières semaines de culture. A partir de la troisième semaine de culture et jusqu'aux expériences de transport, le milieu de croissance a été changé tous les jours. Des monocouches ont été utilisées pour des expériences de transport entre les jours 21 et 30 après ensemencement des Caco-2. 2) Contrôle de la capacité fonctionnelle des monocouches

2-1) Mesure de la TEER : La détermination de la résistance transépithéliale électrique (TEER) a été réalisée en utilisant le système Millicell-ERS (Electrical Resistance System), qui est un volt-ohmmètre particulier pour mesurer la résistance des monocouches de cellules en culture. Ce dispositif mesure qualitativement la santé des monocouches de cellules et mesure quantitativement la confluence des cellules. Pour la mesure, des électrodes « chopstick » (Ag/AgCI) de différentes longueurs ont été immergées dans un milieu de culture préalablement chauffé (incubateur à 37°C, 5 % COz) des deux compartiments de l'insert TranswellTM. La TEER a été suivie chaque deux jours après le sixième jour de culture ainsi qu'avant et après chaque expérience de transport. La résistance finale de la monocouche de cellules a été calculée en introduisant la valeur nette TEER dans l'équation suivante : TEER [12*cm2] _ (RTr.,eIl - Rblank) * A Rblank a été déterminée avant chaque mesure dans un insert du TranswellTM sans cellules, maintenu dans les mêmes conditions que les inserts contenant des cellules. La valeur RTrans,il est la résistance de gross de la monocouche cellulaire et de la membrane de polycarbonate. A représente la surface du filtre (0,33 cm2). -2) Etudes de perméabilité :

La perméabilité apparente Papp (10-6cm/s) décrit la perméabilité d'absorptions'. Le calcul de Papp est basé sur l'équation suivante : Papp [10-6cm/s] = dQ/dt * 1/(A*Co) * 106 dQ/dt [µmol/sec] est le flux de substance active traversant la monocouche de cellules par rapport au temps. A est la surface de la membrane en cm2. Co est la concentration initiale de substance active du compartiment donneur (µmol). 10 Le tampon de transport (TB) utilisé pour toutes les expériences de perméabilité est composé de 25mM D-(+)- glucose et 10mM HEPES (acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazine éthane sulfonique) dans une solution Hank's Balanced Salt Solution, ajustée à pH=7,4 avec de l'hydroxyde de sodium (1M). La solution a alors été filtrée avec un filtre 15 à 0,20 µm. La TEER des monocouches a été mesurée avant et après chaque étude de transport pour vérifier l'intégrité de la monocouche.

Pour les études de transport, des marqueurs de perméabilité incluant le jaune Lucifer (Lucifer Yellow ou LY), le propranolol et la Rhodamine123 (Rho123) ont été utilisés 20 comme suit :

a) Le jaune Lucifer a été utilisé en tant que marqueur de la perméabilité paracellulaire. Le transport de LY a été testé dans la direction apicale vers basolatérale. 100 µL de la solution test à 50µg/mL a été ajouté dans la chambre apicale. La chambre 25 basolatérale a été remplie avec 600µL de TB. Après une incubation de 120 min à 37°C, 5%CO2, tous les échantillons apicaux et basolatéraux ont été collectés pour mesure. L'analyse quantitative du marqueur paracellulaire LY a été réalisée par analyse de fluorescence. Les échantillons apicaux ont été dilués au 1/100è' dans du TB, alors que les échantillons basolatéraux n'ont pas été modifiés. Une plaque noire à 96 puits a été 30 complétée avec 100µL de chaque échantillon et mesurée en utilisant un lecteur de plaque par fluorescence (Perkin Elmer) avec des longueurs d'onde de 405nm pour l'excitation et 535 nm pour l'émission. Les standards correspondants pour LY pour le domaine 0,0156-8µg/mL (R2>0,99) ont été analysés simultanément.

35 b) La Rhodamine 123, un substrat du P-gp, a été incubé simultanément avec le propranolol à une concentration de 5µM. Les études de transport ont été réalisées dans les deux directions. Rho123 a été quantifié par analyse fluorimétrique. Les échantillons et les séries de dilution ont été remplis dans une plaque noire à 96 puits (100µL) qui a été analysée grâce à un lecteur de plaque par fluorescence (Perkin Elmer) à des longueurs10 d'ondes de 485 nm pour l'excitation et 535 nm pour l'émission. Les échantillons du compartiment donneur ont été dilués (1/10) dans du TB, alors que des échantillons du compartiment accepteur ne l'ont pas été. Des standards dans le domaine 0,008-1µM (R2>0,99) de Rho123 ont été réalisés pour obtenir une courbe de calibration. Des études avec Rho123 ont été réalisées en présence de vérapamil, un inhibiteur de P-gp. Des expériences ont été réalisées uniquement dans la direction basolatérale-apicale. En bref, 5µM de Rho123 et 100µM de vérapamil ont été ajoutés à la chambre basolatérale. Dans le même temps, la chambre apicale a été remplie avec 100µM de vérapamil. L'étude de transport a été réalisée exactement dans les mêmes conditions que pour les expériences avec Rho123 seul.

II) Résultats

1) Valeurs de TEER Les résultats obtenus dans cette série d'expériences apparaissent à la figure 1. La figure 1 montre que la majorité des monocouches de Caco-2 ont des valeurs TEER supérieure à 250 ohm.cm2 après 21 jours post-ensemencement, alors que des valeurs TEER inférieures ont été observées avec HT29-MTX seul. La valeur de 250 ohm.cm2 représente une valeur seuil qui prouve la présence de jonctions serrées. Le même niveau de TEER a également été obtenu avec des co-cultures au jour 14 (D14) et 18 (D18), suggérant la densité très faible des cellules HT29-MTX dans les co-cultures. Au contraire, pour des temps d'ensemencement plus précoces de HT29-MTX (D6 et D8), les valeurs de TEER sont intermédiaires entre les monocouches de Caco-2 et de HT29-MTX seules. ) Transport paracellulaire

Les données relatives à ces expériences apparaissent à la figure 2.

En accord avec la littérature, la Papp de LY inférieure à 0,4 (10-6 cm/s) est considérée comme acceptable pour une monocouche de Caco-2. La perméabilité paracellulaire est expliquée par la présence de jonctions serrées entre les cellules. Au contraire, la Papp de HT29-MTX est beaucoup plus élevée avec des valeurs autour de 2-3 (10-6 cm/s). L'ajout de HT29-MTX à des cellules Caco-2 augmente drastiquement la Papp. Une relation directe entre les valeurs de Papp et les temps d'ensemencement de HT29-MTX peut être observée. Ainsi, les cellules HT29-MTX pourraient faciliter le transport paracellulaire des molécules qui devient ajustable en fonction du jour d'ensemencement de HT29-MTX. Ces résultats sont en accord parfait avec les valeurs de TEER. ) Rhodamine 123

Les résultats relatifs à ces expériences sont illustrés à la figure 3.

Dans la figure 3, la Papp de Rho123 d'une monocouche de Caco-2 est beaucoup plus élevée que HT29-MTX, avec des valeurs de 19 et 3.10-6 cm/s, respectivement. Au contraire des HT29-MTX, la P-gp est surrégulée dans les cellules Caco-2, expliquant la forte activité d'efflux. Comme pour l'étude de perméabilité paracellulaire, le niveau de transport d'efflux dépend du jour d'ensemencement de HT29-MTX. Plus l'ensemencement de HT29-MTX est précoce, plus la Papp diminue.

L'effet du vérapamil, un inhibiteur du P-gp est illustré à la figure 4.

Dans cette figure, lorsque le vérapamil est ajouté aux monocouches, les valeurs de Papp pour toutes les monocouches sont similaires, démontrant ainsi l'absence d'efflux. De manière additionnelle, aucune différence significative n'est observée avec HT29-MTX avec ou sans vérapamil, suggérant l'inexistence d'expression de P-gp dans cette souche. Ceci explique que la présence de HT29-MTX dans la co-culture réduit considérablement l' efflux, dû à un niveau inférieur de l'expression de P-gp. 1220

13 REFERENCES 1- LJ. Hidalgo, J. Li (1996) Carrier-mediated transport and efflux mechanisms in Caco-2 cells. Adv. Drug Del. Rev., Vol. 22, Issues 1-2, 53-66

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30 8- R.A. Cone (2009) Barrier properties of mucus. Adv. Drug Del. Rev., Vol 61, Issue 75-85

9- C. Meaney, C. O`Driscoll (1999) Mucus as a barrier to the permeability of hydrophilic and lipophilic compounds in the absence and presence of sodium taurocholate micellar 35 systems using cell culture models. European Journal of Pharm. Sciences, Vol. 8, 167-175

10- A. Wikman-Larhed, P. Artursson, E. Bjdrk (1998) The Influence of Intestinal Mucus Components on the Diffusion of Drugs. Pharm. Res., Vol. 15, No. 1, 660-665

40 11- A. Wikman-Larhed, P. Artursson (1995) Co-cultures of human intestinal goblet (HT29-H) and absorptive (Caco-2) cells for studies of drug and peptide absorption. Eur. J. Pharm. Sci., Vol. 3, 171-183

12- E. Walter et al. (1996) HT29-MTX/Caco-2 Cocultures as an in Vitro Model for the 45 Intestinal Epithelium: In Vitro-in Vivo Correlation with Permeability Data from Rats and Humans. Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 85, No. 10, 1070-1076

13- C. Hilgendorf et al. (2000) Caco-2 versus Caco-2/HT29-MTX co-cultured cell lines: Permeabilities via diffusion, inside- and outside-directed carrier-mediated transport. J.

50 Pharm. Sci., Vo189, Issue 1, 63-75 14- G. Nollevaux et al. (2006) Development of a serum-free co-culture of human intestinal epithelium cell-lines (Caco-2/HT29-5M21). BMC Cell Biology, 7:20, 1-11 15- L. Poquet, M.N. Clifford, G. Williamson (2008) Transport and Metabolism of Ferulic 5 Acid through the Colonic Epithelium. Drug Metabolism and Disposition, Vol. 36, No. 1, 190-197 16- G.J. Mahler, M.L. Shulter, R.P. Glahn (2009) Characterization of Caco-2 and HT29-MTX cocultures in an in vitro digestion/cell culture model used to predict iron 10 bioavailability. Journal of Nutritional Biochem., Vol 20, 494-502 17- P. Artursson, J. Karlsson (1991) Correlation between oral drug absorption in humans and apparent drug permeability coefficients in human intestinal epithelial (Caco-2) cells. Biochem Biophys Res Commun, Vol. 175, No. 3, 880-885 18- X.M Chen, I. Elisia, D.D. Kitts (2010) Defining conditions for the co-culture of Caco-2 and HT29-MTX cells using Taguchi design. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods, Vol. 61, 334-342 15 20

Claims (1)

1. REVENDICATIONS1/ Procédé de culture cellulaire consistant à : - ensemencer un milieu de culture adapté à l'aide de cellules d'absorption, puis - ensemencer de manière différée le milieu contenant les cellules d'absorption ayant débuté leur multiplication, à l'aide de cellules productrices de mucus. 2/ Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les cellules d'absorption sont des cellules Caco-2. 3/ Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que les cellules productrices de mucus sont des cellules HT29-MTX. 4/ Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que 15 l'ensemencement des cellules productrices de mucus est réalisé au moins 1 jour après celui des cellules d'absorption, avantageusement entre 4 et 8 jours. 5/ Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la culture cellulaire est réalisée pendant 21 à 35 jours. 6/ Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le milieu de culture adapté est de type DMEM. 7/ Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les 25 ensemencements sont réalisés selon un ratio cellules d'absorption / cellules productrices de mucus compris entre 90/10 et 75/25, avantageusement égal à 75/25. 8/ Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les cellules d'absorption sont ensemencées à hauteur de 9.104 cellules/cm, les cellules productrices 30 de mucus étant avantageusement ensemencées à hauteur de 3.104 cellules/cm. 9/ Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'ensemencement des cellules d'absorption est réalisé sur un insert de culture perméable. 2010/ Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'ensemencement des cellules productrices de mucus est réalisé à la surface des cellules d'absorption. 11/ Culture cellulaire susceptible d'être obtenue à l'aide du procédé selon l'une des revendications 1 à 10. 12/ Culture cellulaire selon la revendication 11 caractérisée en ce qu'elle présente au moins une des caractéristiques suivantes : - présence de cellules d'absorption et de cellules productrices de mucus ; - production de mucus ; - une valeur de TEER (TransEpithelial Electrical Resistance) comprise entre celle des cellules d'absorption et celle des cellules productrices de mucus, avec pour conséquence une capacité à assurer le transport paracellulaire comprise entre celle des cellules d'absorption et celle des cellules productrices de mucus ; - une activité P-gp (P-glycoprotein - multidrug resistance gene-1) comprise entre celle des cellules d'absorption et celle des cellules productrices de mucus, avec pour conséquence une capacité à assurer le transport transcellulaire des molécules substrat de la P-gp comprise entre celle des cellules d'absorption et celle des cellules productrices de mucus ; - une activité du cytochrome CYP3A4 comprise entre celle des cellules d'absorption et celle des cellules productrices de mucus. 13/ Utilisation de la culture cellulaire selon la revendication 11 ou 12 comme modèle in vitro de barrière intestinale. 14/ Utilisation de la culture cellulaire selon la revendication 11 ou 12 pour évaluer la biodisponibilité (transport et/ou métabolisme) d'un composé d'intérêt.30