FR2893328A1 - Procede pour depister des marqueurs impliques dans la resistance de keratinocytes a des deformations mecaniques. - Google Patents

Procede pour depister des marqueurs impliques dans la resistance de keratinocytes a des deformations mecaniques. Download PDF

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Abstract

L'invention concerne un procédé pour dépister des marqueurs impliqués dans la résistance de kératinocytes à des déformations mécaniques, dans lequel :a) des cellules de kératinocytes humains sont en culture sur une surface flexible,b) une partie des cellules obtenues au cours de l'étape a) est soumise à un étirement cyclique,c) des ARN sont isolés, à différents moments, des cellules obtenues au cours de l'étape a) comme cellules témoins, et au cours de l'étape b) comme cellules mécaniquement contraintes,d) des ARN obtenus au cours de l'étape c) sont amplifiés et marqués avec différents fluorochromes,e) des transcriptomes desdites cellules témoins et desdites cellules mécaniquement contraintes sont obtenus en soumettant les ARN obtenus au cours de l'étape d), à une analyse de biopuces (ou microarrays) et à une analyse bioinformatique,f) la comparaison du transcriptome obtenu à partir des cellules témoins et des cellules étirées au cours de l'étape e) permet de dépister des marqueurs impliqués dans la résistance de kératinocytes, à des déformations mécaniques.

Description

INTRODUCTION Tous les tissus sont soumis à des déformations mécaniques, de
différentes natures et d'intensité, qui peuvent être constantes ou se produire occasionnellement. Ces déformations peuvent être soit le résultat de forces dues à la gravité et aux mouvements du corps, soit être dues à des forces internes. La nature de la déformation subie par le tissu peut être un effort d'étirement, de compression ou de cisaillement. A des doses physiologiques, ces phénomènes peuvent être essentiels pour l'homéostasie du tissu. Toutefois, une modification concernant l'intensité des déformations ou bien concernant la capacité du tissu à supporter les déformations peut conduire à des situations pathologiques.
Les principaux modèles étudiés dans le domaine de la mécanobiologie sont évidemment des organes supportant des déformations élevées et constantes : les vaisseaux sanguins (cellules endothéliales et cellules de muscles lisses), les muscles du squelette, le cartilage, les os. Plusieurs des études réalisées ont permis d'identifier des éléments qui sont importants dans la détection de déformations par les cellules (mécanodétection) : les intégrines, le cytosquelette (tenségrité) et les canaux ioniques. La peau est l'organe le plus important en dimension, couvrant toute la surface du corps. La peau est une matière composite constituée d'un épithélium stratifié, de l'épiderme (couche supérieure) et d'une couche contenant des cellules et une matrice extracellulaire (ECM), du derme (couche inférieure). La peau est constamment soumise à des déformations mécaniques de toutes sortes (effort de tension, de compression et de cisaillement), de façon non homogène en fonction de la partie du corps. Tous les compartiments de la peau sont exposés, directement ou indirectement, à des forces. Des forces externes affectant directement l'épiderme sont transmises au derme sous-jacent, tandis que des forces internes subies par le derme sont transmises à l'épiderme.
Les propriétés biomécaniques de la peau, considérées d'un point de vue physique, au niveau macroscopique, ont été étudiées de manière approfondie (Edwards et Marks 1995). Les changements se produisant dans la structure du derme normal, en réponse à un étirement, sont également bien documentés. L'étirement du derme conduit à une augmentation du nombre et du diamètre des fibres collagènes (Wang et Sanders 2003). Au niveau cellulaire, de nombreuses études ont été consacrées à l'analyse de la réponse de fibroblastes à une contrainte mécanique (Chiquet et coll. 2003 ; Silver et coll. 2003). La plupart de ces études ont été effectuées sur des fibroblastes en culture dans des réseaux collagènes. Lorsque l'on ensemence et que l'on fait pousser des fibroblastes dans un réseau étiré (fixé sur un support), des tensions isométriques sont établies entre les cellules et la matrice extracellulaire (ECM). D'autre part, lorsque le réseau collagène est détendu (flottant), ces tensions n'existent plus entre les cellules et la matrice extracellulaire (ECM). Les résultats les plus importants découlant de ce type d'expériences concernent les changements se produisant dans la modification de la matrice extracellulaire (ECM) selon les fibroblastes soumis ou non à des forces. Les premières études effectuées dans ce domaine ont montré que la transition pour passer d'un réseau collagène étiré à un réseau collagène détendu est suivie d'une importante régulation à la baisse de l'expression du collagène de type I (Eckes et coll. 1993 ; Lambert et coll. 1992), tandis que l'expression de la métalloprotéase matricielle MMP-1 est régulée à la hausse (Lambert et coll. 1992 ; Mauch et coll. 1989). Le même traitement provoque une modulation plus légère du sous-ensemble constitué de fibronectine (Eckes et coll. 1993 ; Lambert et coll. 1992) et d'intégrine (31 (Chan et coll. 1992). Ultérieurement, Chiquet et ses collaborateurs ont montré que l'expression de la ténascine Cet du collagène de type XII était modulée dans des fibroblastes en culture dans des gels de collagène. Des fibroblastes en culture dans un
réseau étiré expriment des niveaux élevés de ces deux marqueurs, tandis que le relâchement de la matrice conduit à une diminution de ces niveaux (Chiquet et coll. 1996 ; Chiquet - Ehrismann et coll. 1994). La ténascine C et le collagène de type XII sont deux composants de la matrice extracellulaire (ECM) associés à un collagène fibrillaire dans des tissus supportant un important effort de traction (tendons, ligaments, périoste, etc.). Ces composants ne sont pas exprimés dans des fibroblastes dermiques normaux. Une région d'amplificateur "mécano-sensible" a été identifiée dans les promoteurs de la ténascine C et du collagène XII (Chiquet et coll. 1998 ; Trachslin et coll. 1999). Ces régions contiennent une séquence GAGAAC également présente dans l'élément sensible à l'effort de cisaillement (SSRE) identifié précédemment dans des cellules endothéliales dans le promoteur du gène PDGF-B (Resnick et coll. 1993). Toutefois, le facteur de transcription ayant une interaction avec ces régions reste à identifier. De plus, la régulation de l'expression de la ténascine C, par l'effort mécanique, est susceptible de dépendre d'autres voies, telles que la voie NF - kB (Yamamoto et coll. 1999). Une analyse transcriptomale de gènes induits par des fibroblastes ayant poussé dans des réseaux collagènes suggère qu'une stimulation mécanique conduise à un phénotype "synthétique" de fibroblastes caractérisé par l'induction d'une synthèse de tissu conjonctif, tout en empêchant simultanément une dégradation de la matrice (Kessler et coll. 2001). Même si l'épiderme est le compartiment de la peau qui est directement exposé à des forces externes, la réponse transcriptionnelle de kératinocytes, à un effort mécanique, est documentée pauvrement. En 1990, Gormar et ses collaborateurs ont démontré que le fait de soumettre des kératinocytes, à une pression cyclique, conduisait à une activation d'une différenciation terminale caractérisée par une inhibition d'une prolifération de cellules, par une activation d'une stratification et par une accumulation de
kératines (Gormar et coll. 1990). Ultérieurement, Takei et ses collaborateurs, qui étaient intéressés dans des méthodes de dilatation de la peau, ont étudié les effets d'un étirement cyclique, sur la prolifération de kératinocytes (Takei et coll. 1997b). Ils ont démontré qu'un étirement cyclique augmentait la prolifération de kératinocytes et la synthèse de l'ADN. Ce phénomène semble être dépendant de la protéine kinase C (PKC) (Takei et coll. 1997a) et de l'interleukine 1 (IL-1) (Takei et coll. 1998). Un étirement cyclique a également comme résultat des changements morphologiques et une activation globale de la synthèse de protéines (Takei et coll. 1997b). Récemment, un étirement continu a montré une activation de la prolifération des kératinocytes et une inhibition de la différenciation. En fait, des kératinocytes soumis à ce type de déformation ont augmenté leur production de kératine 6 (K6) qui est associée à des kératinocytes activés (cicatrisation) et ont réduit leur production de kératine 10 (K10) associée à des kératinocytes se différenciant finalement. Cet effet dépend de voies ERK1/2 et PI3-K, du récepteur du facteur de croissance épidermique (EGF) et de canaux de calcium (Yano et coll. 2004). Ainsi, jusqu'à présent, les données concernant la réponse de kératinocytes, à un effort mécanique, sont essentiellement liées à l'effet de déformations sur la prolifération et sur la différenciation. Ici, nous avons analysé la réponse de kératinocytes, à un étirement cyclique, en utilisant la technologie des biopuces (ou microarrays) d'ADN. Nous avons placé des cellules HaCaT en culture sur des membranes flexibles recouvertes de collagène de type IV qui est abondant dans la membrane basale et a une interaction, in vivo, avec des kératinocytes de base, et nous les avons soumis à un étirement cyclique. Nous avons soumis des kératinocytes à un étirement cyclique avec un allongement de 15 % et à une fréquence de 0,3 Hz, conditions qui sont dans la même plage que celles utilisées dans des études antérieures sur des
fibroblastes et des kératinocytes. Nous avons réalisé cette analyse à différents moments, après le début du traitement, afin d'identifier précocement et tardivement des marqueurs de la réponse cellulaire, et d'avoir une vue cinétique des événements moléculaires. La présente invention traite d'un procédé pour dépister des marqueurs impliqués dans la résistance de kératinocytes à des déformations mécaniques, procédé dans lequel : a) des cellules de kératinocytes humains sont en culture sur une surface flexible, b) une partie des cellules obtenues au cours de l'étape a) est soumise à un étirement cyclique, c) des ARN sont isolés, à différents moments, des cellules obtenues au cours de l'étape a) comme cellules témoins, et au cours de l'étape b) comme cellules mécaniquement contraintes, d) des ARN obtenus au cours de l'étape c) sont amplifiés et marqués avec différents fluorochromes, e) des transcriptomes desdites cellules témoins et desdites cellules mécaniquement contraintes sont obtenus en soumettant les ARN obtenus au cours de l'étape d), à une analyse de biopuces (ou microarrays) et à une analyse bioinformatique, f) la comparaison du transcriptome obtenu à partir des cellules témoins et des cellules étirées au cours de l'étape e) permet de dépister des marqueurs impliqués dans la résistance de kératinocytes, à des déformations mécaniques. Dans un mode de réalisation préféré, les cellules utilisées au cours du processus selon la présente invention sont des lignes de cellules de kératinocytes humains (cellules HaCaT). Dans un autre mode de réalisation préféré du procédé selon la présente invention, l'étirement cyclique est réalisé avec un dispositif du typeFlexerce11 Tension plus.
Encore dans un autre mode de réalisation préféré du procédé selon la présente invention, l'étirement cyclique est
réalisé avec un allongement de 15 % et à une fréquence de 0,3 Hz, pendant 2, 8, 24, 48 et 120 heures. Dans un mode de réalisation - le plus préféré - du procédé selon la présente invention, l'analyse des biopuces (ou microarrays) est réalisée sur une biopuce (ou microarray) de la peau, de type PIQORe. Les marqueurs obtenus d'après le procédé selon la présente invention sont montrés sur le tableau 1. 5 Tableau 1 Sélection de gènes induits dans des kératinocytes soumis à un étirement analysé par une analyse de biopuces (ou microarrays) d'ADN complémentaire Type de gène transcript UniGène Rapport temps d'in- (N ) d'in- ductiona duction Pré-Tar- maxi- coce dif muma A) marqueurs KRT14 355214 2,5 1 épidermiques (cytokératine 14) SPPR1 (protéine 1 40320 3,6 1 faiblement riche en proline) SPPR2 35542 6,9 1 SPRR3 139322 4,0 1 S100A7 (protéine 112408 3,7 1 S100A7 de liaison du calcium)* S100A8* 416073 3,6 1 S100A9* 112405 3,0 1 B) molécules Protéine ZO-2 à jonction 75608 2,0 1 d'adhérence serrée intégrine alpha 2 387725 2,1 1 intégrine bêta 7 1741 2,3 glycoprotéine 4 des 443120 2,3 plaquettes (CD36)* PTK7 (tyrosine protéine 90572 2,3 kinase 7) C) composants de MMP1 (métalloprotéase 1 83169 3,4 matrice matricielle) extracellulaire et LAMAS (chaîne de 11669 2,0 1 modulateurs laminine alpha 5) PAI-1 (inhibiteur 1 414795 2,4 d'activateur de plasminogène) PAI-2 (inhibiteur 2 75716 2,4 1 d'activateur de plasminogène) D) facteurs de BMP9 (protéine 9 279463 7,8 1 croissance morphogénétique de l'os) CYR61 (CCN1) 8867 3,0 1 homologue de la protéine 235935 2,3 NOV (CCN3) E) gènes M1S1 (transducteur 2 de 23582 2,1 1 impliqués dans la signal de calcium associé transduction de à la tumeur) signaux ESP15 (substrat 15 du 79095 2,0 récepteur des facteurs de croissance épidermique) F) facteurs et co-NR4A1 (récepteur 1119 6,9 1 facteurs de nucléaire orphelin) transcription EGR1 (protéine 1 de 326035 3,3 1 réponse de croissance précoce) ZF9 (protéine de liaison 285313 2,5 1 de l'élément promoteur du noyau JUNB 400124 2,2 1 G) kinases TK1 (thymidine kinase) 164457 2,1 1 PIM1 (sérine / thréonine 81170 2,2 1 protéine kinase proto- oncogène) H) gènes impli-CYP1B1 (cytochrome 154654 3,7 1 qués dans le P450 1B1) métabolisme TIP47 (protéine 1 de 140452 2,0 1 liaison du récepteur de phosphate de mannose 6) GLUT1 (transporteur de 169902 2,0 1 glucose de type 1) CD36 (translocase d'aci- de gras)* [voir molécules d'adhé- rence] ALDH8 (aldéhyde déshy- 87539 2,4 1 drogénase 8) I) réponse gènes S100A* inflammatoire [voir marqueurs épider- miques] CCL22 (cytokine A22 97203 3,3 1 faiblement induite) IL6 (interleukine 6) 512234 4,6 1 IL8 (interleukine 8) 624 2,9 1 J) autres CDKNIA (inhibiteur de 370771 2,4 1 kinase dépendant de la cycline) NAT2 (N-acétyltrans- 2 2,2 1 férase de type 2) NA-K-ATPASE-B3 76941 2,2 (chaîne bêta 3 ATPase de transport du sodium / potassium) galectine 1 407909 2,1 EMP1 (protéine 1 de 306692 2,3 1 membrane épithéliale) ENIGMA 436339 2,1 PORC 386453 2,3 1
arapport d'induction > 2,0 fois. Rtemps d'induction : induction précoce < 24 H, induction tardive >_ 24 H. *gènes classifiés dans deux familles différentes.
Dans un mode de réalisation préféré, les marqueurs dépistés avec le procédé selon la présente invention sont sélectionnés parmi une protéine faiblement riche en proline (SPRR) 1, 2 et 3, une protéine S100, la métalloprotéase matricielle 1 (MMP1), la laminine 5, le facteur de croissance Cyr6l, la protéine de liaison du calcium (S100A) 7, 8 et 9, la protéine morphogénétique de l'os (BMP) 9 et le récepteur nucléaire orphelin (NR4Al). Un autre objet de la présente invention traite de l'utilisation d'un marqueur identifié selon le procédé de la présente invention, pour dépister des molécules qui modulent l'expression dudit marqueur. Dans la présente invention, l'expression "molécules qui modulent l'expression du marqueur" signifie toute molécule, biologique ou synthétique, qui contrebalance l'effet de la déformation mécanique dans des kératinocytes. Encore un autre objet de la présente invention est une composition cosmétique comprenant des molécules qui modulent l'expression d'au moins un marqueur impliqué dans la résistance de kératinocytes à des déformations mécaniques. MATERIELS ET METHODES Conditions de culture des cellules Pour l'amplification, des cellules HaCaT ont été placées en culture dans un milieu Eagle modifié de Dulbeco (D-MEM) contenant 1 g de glucose par litre, du glutamax et du pyruvate de sodium (GIBCOTM), supplémentés avec 10 % de sérum de veau fétal (Biowest). Des fioles de culture (TPP ) ont été incubées à 37 C dans une atmosphère saturée d'eau à 5 % de CO2. Pour l'application d'une déformation, on a d'abord ensemencé et fait pousser des cellules HaCaT dans un milieu de culture standard. 40 heures avant de commencer des
étirements, et pendant toute la durée de l'expérience, les cellules ont été incubées à 37 C dans une atmosphère saturée d'eau, sans ajouter de CO2. Pour compenser l'absence de CO2, le milieu de culture standard a été régulé avec 50 mm de solution tampon de type HEPES ayant un pH de 7,4. Culture sur des membranes flexibles et application d'une déformation Le dispositif de type Flexercell Tension plus (Dunn Labortechnk GmbH) a été utilisé pour appliquer une déformation équibiaxiale à des kératinocytes humains. On a ensemencé des cellules HaCaT (2,105 cellules / rainure) dans des lames de culture de type Bioflex à 6 rainures dont le fond est constitué par une membrane en silicone recouverte de collagène de type IV (Dunn Labortechnik GmbH). Les cellules ont été mises en culture pendant 9 jours (sous-confluence) avant d'être étirées. Six cylindres plans (25 mm de diamètre) ont servi de support de chargement pour les lames de culture qui étaient centrées au-dessous de chaque rainure de 35 mm. Par l'application de vide, une contrainte équibiaxiale cyclique a été appliquée aux kératinocytes (15 % d'allongement à une fréquence de 0,3 Hz, à des moments différents). Les cellules en culture dans des lames de culture de type Bioflex à 6 rainures, qui n'ont pas été étirées, ont été utilisées comme cellules témoins.
Extraction des ARN Au total, 10 ARN ont été isolés, soit des cellules témoins, soit de cellules mécaniquement contraintes, à 5 moments différents dans le temps. Les ARN ont été isolés en utilisant un système d'isolation de tous les ARN, par vectorisation SV (Promega), conformément aux instructions du fabricant. Des ARN congelés ont été expédiés, sur de la neige carbonique, à Miltenyi Biotec GmbH, pour analyse des biopuces (ou microarrays). Cinq expériences de biopuces (ou microarrays) ont été réalisées en utilisant la biopuce (ou microarray) de la peau, de type PIQOR (Miltenyi, Cologne, Allemagne) contenant des gènes codant pour des protéines en
phase aiguë, pour des protéines de formation d'enveloppes kératinisées, pour des protéines de surface et de signalisation de la cytokine concernant des leucocytes humains, pour d'importantes protéines de réparation et de métabolisme de l'ADN, pour la matrice extracellulaire, pour des facteurs de différenciation de croissance et pour des protéines de kératine, pour une dégradation des protéines et pour des protéines liées aux contraintes. Une liste complète de tous les gènes présents sur la biopuce (ou microarray) peut être trouvée à l'adresse Internet suivante . http://www.miltenyibiotec.com/index.php?site=pp-pigor-ma-kit. La qualité des ARN a été contrôlée par le système Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Waldbronn, Allemagne). Production de biopuces (ou microarrays) Une quantité définie de 200 à 400 bp fragments d'ADN complémentaires sélectionnés (Tomiuk et Hofmann 2001) a été générée par une réaction de type RT-PCR (Super.script II, Invitrogen, Groningue, Pays-Bas), lesdits fragments ayant été clonés dans un vecteur pGEM -T (Promega, Mannheim, Allemagne), et des inserts vérifiés par séquence ont été amplifiés en utilisant des amorces dérivées de séquences de vecteurs, avec l'amorce de sensibilité supportant une modification amine 5'. Des inserts amplifiés ont été purifiés (Qiaquick 96 PCR BioRobot Kit, Qiagen), vérifiés sur un gel d'agarose, dilués à une concentration de 100 ng/pl et finalement sondés, en quatre exemplaires, sur des lames de verre traité. Analyse de biopuces (ou microarrays) L'hybridation, le balayage et l'analyse des données ont été effectués comme décrit en détail par ailleurs (Bosio et coll. 2002), conformément aux instructions MIAME (Brazma et coll. 2001). En bref, des échantillons de tissu ont été marqués avec différents fluorochromes (Cy3 ou CyS), ce qui a comme résultat de donner différents signaux fluorescents, respectivement pour des kératinocytes témoins et pour des kératinocytes soumis mécaniquement à des contraintes. La
capture d'image et la quantification de signaux de biopuces (ou microarrays) PIQOR hybridés ont été effectuées avec l'équipement de type ScanArray 4000 Lite (Perkin Elmer Life Sciences, Rodgau, Allemagne) et avec la version 4.1 du logiciel ImaGene (BioDiscovery, Los Angeles, Californie). Pour chaque sonde (ou spot), le signal local a été mesuré à l'intérieur d'un cercle fixe de 250 pm de diamètre, et le fond a été mesuré à l'extérieur du cercle, à l'intérieur d'anneaux spécifiés, à une distance de 30 pm du signal, et ayant une largeur de 100 pm. Le signal et le fond ont été pris comme étant la moyenne de pixels entre des pourcentages définis, faibles et élevés, d'intensité maximum, les réglages de paramètres de pourcentage pour des valeurs faibles / élevés étant de 2/97 % pour le signal et de 0/97 % pour le fond. Le fond local a été soustrait du signal, pour obtenir l'intensité nette de signal et le rapport de Cy5/Cy3. Les rapports ont été normalisés en utilisant la méthode d'analyse des données de type LOWESS (régression linéaire pondérée localement), en prenant seulement en compte les sondes (ou spots) pour lesquelles l'intensité fluorescente dans l'un des deux canaux a été au moins égale à deux fois le témoin négatif (représentant les intensités moyennes de signaux du fond de toutes les sondes (ou spots) non signalées). Seulement les gènes affichant, dans l'échantillon témoin ou de traitement, une intensité nette de signal 2 fois supérieure à celle dans le témoin négatif, ont été utilisés pour une analyse plus poussée. Ensuite, la moyenne des rapports de quatre sondes (ou spots) correspondantes représentant le même ADN complémentaire a été calculée par ordinateur et on a calculé le coefficient de variation. Analyse bioinformatique On a rejeté les gènes qui n'ont pas atteint un nombre minimum d'observations dans 60 % des expériences, à l'intérieur d'un ensemble d'échantillons. Après filtrage, les ensembles de données comprennent 734 gènes, sur 1301. Pour une analyse plus poussée, on a utilisé des logarithmes
(base 2) des rapports d'expression. L'analyse générale des données de biopuces (ou microarrays), englobant un groupage hiérarchique, a été réalisée par un dispositif TIGR TMEV (Dudoit et coll 2003). Des groupes de gènes coexprimés ont été recherchés pour des affectations de voies d'accès communes et pour d'autres propriétés biologiques, ces recherches ayant été effectuées par Miltenyi propriétaire de l'ensemble de programmes TreeRanker. Validations par une réaction quantitative en temps réel, de type RT-PCR Les variations de l'expression des ARN messagers ont été concernées pour un ensemble de gènes sélectionnés, en utilisant une réaction quantitative en temps réel de type RT-PCR. Tous les ARN ont été isolés des cellules étirées et des cellules témoins HaCaT après différents moments de traitement, en utilisant un kit d'isolement des ARN (Promega, Charbonnières, France), la réaction inverse ayant été transcrite par des méthodes standard. Les amorces de la réaction PCR ont été conçues en utilisant la version 4.0 du logiciel OLIGO (National Biosciences, Plymouth, Minnesota, USA). Ces amorces de réaction ont été : SPRR2-S: 5'-TATTTGGCTCACCTCGTTCC-3', SPRR2-AS: 5'- CCAGGACTTCCTTTGCTCAG-3', S 100A7-S: 5'- TGCTGACGATGATGAAGGAG-3', S 100A7-AS: 5'ATGTCTCCCAGCAAGGACAG-3', MMP1-S: 5'- ATGCTGAAACCCTGAAGGTG-3', MMP 1-AS: 5'-CTGCTTGACCCTCAGAGACC-3', CYR61-S: 5'- CYR61-AS: 5'- CTCCCTG1-1'1-11 GGAATGGA-3', TGGTCTTGCTGCATTTCTTG-3', EGR1-S: 5'-TGACCGCAGAGTCTTTTCCT-3', EGR1-AS: 5 ' -TGGGTTGGTCATGCTCACTA- 3 ', JUNB-S: 5'-TGGAACAGCCCTTCTACCAC-3', JUNB-AS: 5'- GAAGAGGCGAGCTTGAGAGA- 3', IL8-S: 5'-CTGCGCCAACACAGAAATTA-3', 1L8-AS: 5 '-ATTGCATCTGGCAACCCTAC-3 ' .
Des quantités équivalentes d'ADN complémentaire ont été testées par une réaction quantitative en temps réel, de type PCR, en utilisant un kit d'amplification des ARN, du type SYBR Green (Roche Diagnostics, Mannheim, Allemagne), pour chacun des gènes analysés. L'analyse des courbes de fusion de produits PCR distingue le produit PCR spécifique, à point de fusion supérieur par rapport à d'éventuels produits non spécifiques. La qualité des produits PCR analysés a été visualisée après migration électrophorétique sur un gel d'agarose à 1 % (w/v) dans 0,4 M de triacétate, dans 0,01 M d'acide éthylène diamine tétraacétique (EDTA), à un pH de 8,3, par un colorant de bromure d'éthidium et par transillumination par ultraviolets. Pour une quantification suivant l'étape d'allongement dans chaque cycle PCR, et juste avant la lecture de la fluorescence, la température de réaction a été augmentée jusqu'à la température nécessaire pour faire fondre des produits PCR non spécifiques. Pour
normaliser chaque quantification d'ARN messager, nous avons utilisé 3 gènes domestiques différents comme témoins endogènes pour une réaction PCR : la protéine ribosomale S26, la (32-microglobuline (02M) et la (3-actine. Les amorces prévues étaient : S26-S : 5'-CGCAGCAGTCAGGGACAT-3', S26-AS : 5'- AGCACCCGCAGGTCTAAATC-3', (32M-S: 5'-TTTCATCCATCCGACATTGA-3', 32M-AS: 5'-CCTCCATGATGCTGCTTACA-3', J3ACT-S: 5'- GGACTTCGAGCAAGAGATGG-3', 13ACT-AS: 5'-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3'. Toutes les expériences ont été effectuées en triple exemplaire sur un dispositif léger, à cycles, de type Roche (Roche Diagnostics).
RESULTATS L'étirement cyclique induit l'expression de différents types de gènes avec une cinétique d'induction différente, par des kératinocytes Afin d'identifier un grand nombre de gènes impliqués dans la réponse des kératinocytes, à la contrainte mécanique, nous avons soumis des cellules HaCaT à un étirement cyclique et analysé leur transcriptome à différents moments dans le temps, après le commencement du traitement. Des cellules HaCaT ont été mises en culture sur une membrane flexible en silicone comportant une couche de collagène de type IV et étirées en réalisant un allongement de 15 % et à une fréquence de 0,3 Hz pendant 2 (2 H), 8 (8 H), 24 (24 H), 48 (48 H) et 120 (120 H) heures. Pour chaque moment de la cinétique, le transcriptome des cellules étirées était comparé à celui de cellules en culture dans les mêmes conditions, sans être étirées, en utilisant la technologie
des biopuces (ou microarrays) d'ADN complémentaire. Les biopuces (ou microarrays) de la peau, de type PIQOR (Miltenyi Biotec GmbH), contenant une grande quantité de gènes liés à une peau normale et pathologique, ont été utilisées pour cette analyse. Considérant la cinétique dans sa totalité, parmi les 1308 gènes sondés sur des biopuces (ou microarrays) de la peau, de type PIQOR , 85 gènes sont apparus comme étant induits de manière significative et 48 répressés.
L'augmentation de la transcription de gènes a varié de 1,7 fois à 7,75 fois plus, et parmi les 85 gènes présentant une expression supérieure, 41 gènes ont été induits de plus du double. La plupart des gènes montrant un rapport d'induction relativement élevé (> 3 fois) ont été induits de façon précoce, avant le délai de 24 H (au bout de 2 H et de 8 H). Nous avons classifié tous ces gènes dans différentes familles de gènes marqueurs épidermiques, molécules d'adhérence, composants de matrice extracellulaire et régulateurs, facteurs de croissance, gènes impliqués dans la transduction de signaux, facteurs et co-facteurs de transcription, kinases, gènes impliqués dans le métabolisme et gènes impliqués dans la réponse inflammatoire. Certains des gènes induits n'ont pas pu être classifiés dans l'une quelconque de ces familles. Le tableau I fait apparaître la liste des gènes montrant un rapport d'induction supérieur à 2 fois, avec leur classification, leur nombre d'accession Unigène, leur rapport d'induction maximum dans toute la cinétique et la synchronisation de leur induction (précoce ou tardive). L'expression de marqueurs présentant un rapport d'induction inférieur à 2 fois peut toutefois être discuté dans les sections suivantes. La liste complète des gènes induits de façon significative peut, sur demande, être communiquée au lecteur. Ces résultats obtenus avec la technologie des biopuces (ou microarrays) d'ADN complémentaire ont été validés par une réaction en temps réel, de type RT-PCR, pour un sous-ensemble de marqueurs dont
la cinétique d'induction est décrite plus en détail dans tout ce document. L'expression de marqueurs épidermiques est modulée par une déformation mécanique L'épiderme est constitué de plusieurs couches caractérisées par l'expression de marqueurs de différenciation spécifique. Les kératinocytes de la couche basale sont les seules cellules prolifératives de l'épiderme. Les kératinocytes sont caractérisés par l'expression de la kératine K5 et de la kératine K14. Etant donné qu'ils quittent la couchebasale, pour commencer une différenciation terminale, ils arrêtent de produire de la kératine K5 et de la kératine K14 et commencent à produire de la kératine K1 et de la kératine K10, marqueurs de toutes les couches suprabasales. Etant donné qu'ils s'éloignent de la couche basale, des kératinocytes commencent à exprimer des marqueurs de différenciation tardive tels que la filaggrine, la loricrine et de la transglutaminase. Selon l'analyse des biopuces (ou microarrays) d'ADN complémentaires, la kératine K14 est la seule de ces principales cytokératines à être induite de façon significative, en réponse à une déformation cyclique. Le niveau de l'ARN messager à kératine K14 a augmenté dès les deux heures qui ont suivi le commencement du traitement, a presque atteint une augmentation égale à deux fois au bout de 8 heures d'étirement, et est resté à ce niveau pendant toute la cinétique, avec un maximum (2,5 fois) mesuré au bout de 48 H (figure 1A). Le niveau de l'ARN messager à kératine K5 a semblé montrer également une légère augmentation (autour de 50 au-dessus de son niveau de base) entre 8 H et 48 H, mais cette augmentation n'a pas pu être considérée comme étant significative d'après l'analyse des biopuces (ou microarrays) d'ADN complémentaires (données non montrées). Les kératines des couches suprabasales, Kl et K10, n'ont pas été modulées dans des kératinocytes étirés. D'autre part, la kératine K6, qui n'est pas exprimée dans un épiderme normal mais induite
dans des kératinocytes activés au cours d'une cicatrisation, a été induite de façon significative, par un étirement cyclique. Elle montre approximativement la même cinétique d'induction que la kératine K14, sauf au niveau de phases tardives où le rapport d'induction de la kératine K6 est inférieur à celui de la kératine K14 (figure 1A). Bien que des marqueurs précoces de différenciation terminale (Kl et K10) n'aient pas été induits par un étirement cyclique, plusieurs marqueurs de différenciation tardive ont été régulés à la hausse, par le traitement. En fait, selon l'analyse de biopuces (ou microarrays) d'ADN complémentaires, le fait de soumettre des kératinocytes à une déformation cyclique conduit à une augmentation rapide et transitoire dans l'expression des 3 familles de gènes codant pour des protéines faiblement riches en proline (SPRR) (figure 1B-a). Ces protéines sont des précurseurs de l'enveloppe kératinisée, comme la loricrine et l'involucrine. Ces protéines s'accumulent au-dessous de la membrane de plasma des kératinocytes, dans la couche granuleuse de l'épiderme où elles sont réticulées par des transglutaminases. Elles constituent une enveloppe non soluble au-dessous de la membrane de plasma des kératinocytes. Les 3 familles de protéines SPRR. scnt : SPRR1 (2 gènes : sprrlA et sprrlB), SPRR2 (7 gènes : sprr2A-G) et SPRR3 (1 gène). Dans des épithéliums stratifiés, chaque famille affiche une distribution spécifique qui sera détaillée dans la partie concernant la discussion. La famille SPRR1 montre une augmentation de 3,5 fois concernant son niveau de transcription, déjà au bout de 8 heures. Ensuite, ce niveau a diminué lentement jusqu'à atteindre un rapport d'induction égal à 2 fois (entre 24 heures et 48 heures), et est resté à ce niveau. La famille SPRR2 affiche également un rapport d'induction maximum au bout de 8 heures de traitement. Toutefois, cette induction est presque deux fois plus forte que celle de la famille SPRR1 (6,9 fois plus), et l'expression de la famille SPRR2 revient à son niveau de
base, déjà au bout de 24 heures. L'induction de la famille SPRR3 est légèrement retardée par rapport aux familles SPRR1 et SPRR2. Une augmentation supérieure à 4 fois dans le niveau d'ARN messager de la famille SPRR3 se produit entre 8 heures et 24 heures. La cinétique de l'induction de la famille SPRR2 a été confirmée par une réaction en temps réel, de type RT-PCR, en utilisant trois gènes domestiques différents. En fait, la mesure du niveau de l'ARN messager de la famille SPRR2, normalisé par rapport à l'ARN messager de la protéine ribosomale S26, par rapport à l'ARN messager de la (32-microglobuline ((32M) et par rapport à l'ARN messager de la (3-actine, a révélé les mêmes courbes d'induction, avec un maximum au bout de 8 heures, variant entre 5 fois et 8 fois plus. L'induction de transglutaminase 1 a été révélée également par l'analyse de biopuces (ou microarrays) d'ADN complémentaires. L'augmentation du niveau d'ARN messager de la transglutaminase 1 se produit rapidement (1,8 fois plus au bout de 8 heures) et se maintient autour de 2 fois plus pendant toute la durée de l'expérience (figure 1C).
Plusieurs membres de la famille S100A ont été fortement induits dans des kératinocytes soumis à une déformation cyclique. Des gènes S100A codent pour des protéines de liaison du calcium. Ils forment des homodimères et des hétérodimères antiparallèles capables d'avoir une interaction avec deux protéines cibles. Ils sont souvent impliqués dans une réponse inflammatoire. Les expressions des marqueurs S100A7, S100A8 et S100A9 ont été activées rapidement et de façon transitoire, avec une induction maximum se produisant entre 8 heures et 24 heures et variant entre 3 fois et 4 fois plus (figure 1D-a). La cinétique de l'induction du marqueur S100A7 a été confirmée par une réaction du type RT-PCR, en temps réel, en utilisant trois gènes domestiques différents. En fait, la mesure du niveau de l'ARN messager du marqueur S100A7, normalisé par rapport à la protéine S26, à la protéine (32M et à la (3-actine, a révélé les mêmes courbes d'induction, avec une induction maximum approximativement de fois plus se produisant entre 8 heures et 24 heures. Un membre supplémentaire de la famille S100A, à savoir le membre S100Al2 a été induit également mais avec un rapport d'induction inférieur (76 % d'augmentation au bout de 8 5 heures), bien que les membres S100A6 et S100A10, également sondés sur des biopuces (ou microarrays) de la peau, de type PIQOR , n'aient pas été modulés dans des kératinocytes étirés (données non montrées). Des déformations mécaniques font que des kératinocytes modifient leur matrice extracellulaire et changent leurs propriétés d'adhérence Plusieurs gènes codant pour des enzymes modulant la structure et la composition de la matrice extracellulaire (ECM) ont été induits en réponse à un étirement cyclique. Des kératinocytes étirés ont montré une induction rapide et transitoire de l'inhibiteur TIMP2 de la métalloprotéase, avec un rapport d'induction relativement faible. Le niveau de l'expression de l'ARN messager de l'inhibiteur TIMP2 a augmenté à peu près de 70 % après 8 heures de traitement, avant de revenir au niveau de base (figure 2A-a). D'autre part, au cours de la période comprise entre 24 heures et 48 heures, des cellules HaCaT ont commencé à exprimer des niveaux élevés de la métalloprotéase matricielle MMP1. Alors que le niveau de l'ARN messager du marqueur MMP1 est resté inchangé au cours des premières 24 heures d'étirement cyclique, ce niveau a augmenté au cours de la période comprise entre 24 heures et 48 heures et est resté élevé (3,4 fois plus) pendant toute la durée restante de l'expérience (figure 2A-a). La cinétique de l'induction du marqueur MMP1 a été confirmée par la réaction de type RT-PCR, en temps réel, en utilisant trois gènes domestiques différents. En fait, la mesure du niveau de l'ARN messager du marqueur MMP1, normalisé par rapport à la protéine S26, à la protéine 02M et à la 13-actine, a révélé les mêmes courbes d'induction, avec un maximum compris entre 3,5 fois et 5 fois plus (figure 2A-b).
La transcription des deux inhibiteurs d'activateurs de plasminogènes, PAI-1 et PAI-2, a été modulée également par une déformation mécanique, avec une cinétique d'induction rigoureusement différente. En fait, tandis que l'inhibiteur PAI-2 a été induit (2,4 fois plus) dès les deux premières heures après le début du traitement, le niveau de l'ARN messager à inhibiteur PAT-1 a commencé à augmenter entre la période comprise entre 24 heures et 48 heures et a été maximum (2,3 fois plus) au bout de 120 heures (figure 2B).
L'étirement cyclique fait également que des kératinocytes changent la composition, en soi, de leur matrice extracellulaire (ECM). L'analyse de biopuces (ou microarrays) d'ADN complémentaires a révélé également que des expressions de plusieurs sous-ensembles de laminines ont augmenté en réponse à un étirement cyclique. Toutes les laminines sont constituées par 3 sous-ensembles (a, a, y). La laminine a5 a présenté une augmentation égale à 2 fois au bout de 2 heures et a diminué progressivement (figure 2C-a). Trois autres sous-ensembles de laminines ont montré avoir été induits : la laminine a3, la laminine R3 et la laminine y2. De façon intéressante, ces 3 sous-ensembles sont connus comme étant ceux constituant la laminine 5. Toutefois, conformément à l'analyse de biopuces (ou microarrays) d'ADN complémentaires, ces 3 sous-ensembles ont été induits de façon non coordonnée (figure 2C-b). Le niveau de l'ARN messager de la laminine a3 a augmenté lentement dans la période de temps comprise entre 2 heures et 24 heures, a atteint un maximum (80 % d'augmentation) dans la période de temps comprise entre 24 heures et 48 heures et est revenu lentement à un niveau de base. Le niveau de l'ARN messager de la laminine y2 a augmenté plus rapidement (90 % d'augmentation au bout de 8 heures) et, ensuite, a rapidement diminué (niveau de base au bout de 24 heures). Le niveau de l'ARN messager de la laminine (33 a augmenté très rapidement (90 % d'augmentation au bout de 2 heures), puis a diminué de façon transitoire, avant de suivre la même courbe que celle
de la laminine a3. Parmi les composants de la matrice extracellulaire (ECM), la fibuline 1, le collagène alpha 1 de type VII (Co17A1) et l'ostéopontine ont été induits également de façon importante (données non montrées).
En plus de la structure et de la composition de la matrice extracellulaire, l'ensemble des protéines de la membrane ayant une interaction avec la matrice extracellulaire (ECM) a été également changé. Deux sous-ensembles d'intégrine ont montré avoir été induits en réponse à un étirement cyclique, l'intégrine a2 et l'intégrine (37. Toutefois, alors que l'intégrine a2 a été induite rapidement et de façon transitoire (2 fois plus au bout de 2 heures), le niveau de l'ARN messager de intégrine (37 a augmenté dans la période de temps comprise entre 24 heures et 48 heures (figure 3A). Les protéines syndécane 1 et syndécane 4 ont été également induites par étirement cyclique. Leur expression a augmenté après 8 heures de traitement puis a diminué et a tendu à augmenter à nouveau dans la période de temps comprise entre 48 heures et 120 heures, notamment pour la protéine syndécane 1 (figure 3B). Parmi les gènes codant pour des protéines de transmembrane potentiellement impliquées dans l'interaction cellulaire avec la matrice extracellulaire (ECM), des protéines FAT, Co17A1, PTK7 et CD36 ont été induites également de façon importante (données non montrées). En réponse à une déformation cyclique, des kératinocytes ont semblé également réguler leur interaction et leur communication de cellule à cellule. Le gène codant la protéine de jonction étroite ZO-2 a été induit 2 fois plus après 8 heures de traitement, puis le niveau de l'ARN messager de la protéine ZO-2 a progressivement diminué (figure 3C). La connexine GJB5 a été induite au bout de 8 heures de traitement (augmentation de 2 fois), est restée à ce niveau au bout de 48 heures et, ensuite, a progressivement diminué (figure 3C).
Différents modulateurs, directs et indirects, de l'expression de gènes, sont impliqués dans la réponse de kératinocytes à une contrainte mécanique L'expression de plusieurs facteurs de transcription a été augmentée dans des kératinocytes soumis à une contrainte mécanique. La plupart d'entre eux montrent une expression rapide et transitoire, avec un pic important après deux heures de traitement, comme cela est le cas pour des facteurs du type NR4A1 (6,9 fois plus), EGR1 (3,3 fois plus), ZF9 (2, 5 fois plus), JUNB (2,1 fois plus) et FOSB (1,7 fois plus) (figure 4). Le facteur de transcription DEC1 a été induit également (70 % d'augmentation) au bout de 2 heures (données non montrées). L'induction du facteur nucléaire MAZ ne présentait pas la même cinétique. Le niveau de l'ARN messager du facteur nucléaire MAZ n'a pas augmenté de façon importante au bout de 24 heures d'étirement cyclique, mais a augmenté (80 %) dans la période de temps comprise entre 24 heures et 48 heures (données non montrées). La transcription du facteur nucléaire MSP58, modulateur de l'activité DAXX, a été modifiée également par une déformation cyclique. Le niveau de l'ARN messager du facteur nucléaire MSP58 augmente rapidement et reste, entre 50 % et 80 %, au-dessus du niveau de base au bout de 48 heures (données non montrées). Les inductions des facteurs de transcription EGR1 et JUNB, au bout de 2 heures, ont été confirmées par une réaction RT-PCR en temps réel, en utilisant trois gènes domestiques différents (figure 4D). En fait, la mesure de l'ARN messager du facteur de transcription EGR1, normalisé par rapport à la protéine S26, à la protéine Ç32M et à la (3-actine, a montré que ce dernier niveau a augmenté entre 4 fois et 5 fois plus après 2 heures d'étirement. Pour le facteur de transcription JUNB, la même mesure a révélé une augmentation, à peu près égale à 2 fois, du niveau de l'ARN messager. Un couple de facteurs de croissance produit par des kératinocytes soumis à une déformation cyclique pouvait être détecté par l'analyse de biopuces (ou microarrays) d'ADN
complémentaires. Le facteur de croissance BMP9 est le plus fortement induit. Le niveau de l'ARN messager du facteur de croissance BMP9 commence à augmenter au bout de 2 heures, atteint des pics entre 8 heures et 24 heures, puis diminue (figure 4A). Deux membres de la famille CCN de facteurs de transcription, CYR61 et NOV, ont été induits également par le traitement. Tandis que le facteur de transcription CYR61 présente une induction rapide et transitoire (augmentation de 3 fois au bout de 2 heures), l'induction du facteur de transcription NOV (augmentation de 2,3 fois) se produit dans la période de temps comprise entre 24 heures et 48 heures (figure 4B). L'induction du facteur de transcription CYR61, au bout de 2 heures, a été confirmée par la réaction RT-PCR en temps réel, en utilisant trois gènes domestiques différents. En fait, la mesure du niveau de l'ARN messager du facteur de transcription CYR61, normalisé par rapport à la protéine S26, à la protéine (32M et à la (3-actir.e, a confirmé que ce dernier niveau a augmenté à peu près de 3 fois après 2 heures d'étirement (figure 6B).
Gènes impliqués dans l'inflammation En dehors des membres de la famille S100A (voir figure 1D), un couple de gènes impliqué dans la réponse inflammatoire a été induit dans des kératinocytes soumis à un étirement cyclique. Des interleukines 6 (IL6) et 8 (IL8) ont été exprimées rapidement et de façon transitoire (figure 6A). Après 2 heures de traitement, les niveaux d'expression d'interleukines IL6 et IL8, dans des kératinccytes étirés, étaient bien supérieurs (respectivement 4,6 fois et 2,9 fois d'augmentation) à ceux des cellules témoins. Six heures plus tard, les deux marqueurs étaient déjà revenus à un niveau de base. L'induction d'interleukine IL6, au bout de 2 heures, a été confirmée par une réaction RT-PCR en temps réel, en utilisant trois gènes domestiques différents. En fait, la mesure du niveau de l'ARN messager de l'interleukine IL8, normalisé par rapport à la protéine S26, à la protéine 132M et à la (3-actine, a confirmé que ce dernier niveau a augmenté
entre 2,5 fois et 3 fois après 2 heures d'étirement (figure 6B). La cytokine CCL22 a été induite également par une déformation mécanique (figure 6A). Toutefois, l'induction de ce marqueur a été retardée par rapport aux interleukines IL6 et IL8. Le niveau de l'ARN messager de la cytokine CCL22 a montré une légère augmentation après 2 heures d'étirement, un pic au bout de 8 heures avec une induction de 3,3 fois plus, et a lentement diminué pour atteindre un niveau de base au bout de 48 heures. Parmi les gènes codant des protéines avec activité de la cytokine, l'ostéopontine a été, aussi, légèrement régulée à la hausse (données non montrées). Etant donné que les interleukines IL-la et IL-1(3 ont été précédemment montrées comme ayant été induites dans des kératinocytes étirés de façon cyclique (Takei et coll. 1998), nous avons contrôlé, par une réaction RT-PCR en temps réel, que ces 2 interleukines n'avaient pas été régulées à la hausse, dans nos expériences. Ce test a confirmé que les expressions d'interleukines IL-la et IL-1(3 n'avaient pas été modulées par un étirement cyclique, comme cela avait été révélé par l'analyse de biopuces (ou microarrays) d'ADN complémentaires (données non montrées). DISCUSSIONS Impact d'un étirement cyclique sur l'état de différenciation de kératinocytes épidermiques L'épiderme est un tissu composite constitué par différentes couches de cellules, chaque couche étant caractérisée par l'expression de marqueurs spécifiques. La couche de l'épiderme, placée le plus à l'intérieur, est la couche basale. Les kératinocytes de base sont les seules cellules de l'épiderme à être en contact avec la membrane basilaire (jonction dermo-épidermique). Les kératinocytes sont mitotiquement actifs et expriment des niveaux élevés de la kératine K5 et de la kératine K14. Lorsque des kératinocytes commencent une différenciation terminale, ils quittent la couche de base, perdent leur contact avec la membrane basilaire, stoppent l'expression de la kératine K5
et de la kératine K14 et commencent à accumuler un autre ensemble de kératines : K1 et K10. En outre, au cours du processus de différenciation, des kératinocytes expriment un grand nombre de marqueurs de différenciation tardive comprenant de la filaggrine, de la loricrine, de la transglutaminase, etc. Ici, nous montrons que l'expression de kératines de base, notamment la kératine K14, est augmentée en réponse à un étirement cyclique. Cette observation peut refléter une augmentation du nombre de kératinocytes de base dans la population cellulaire et, donc, une activation de la prolifération cellulaire. Cela constitue le premier rapport montrant que la quantité de l'ARN messager de la kératine K14 augmente en réponse à une déformation cyclique. Toutefois, il a déjà été démontré que ce type de traitement résultait en une activation d'une prolifération cellulaire et en une synthèse de l'ADN (Takei et coll. 1997b). Parmi les kératines, la kératine K6 a été induite également en réponse à un étirement cyclique. Dans des conditions normales, cette kératine de type I n'est pas exprimée dans l'épiderme. On sait qu'elle est exprimée après blessure de l'épiderme, par des kératinocytes subissant une activation au niveau du bord de la plaie. Une étude effectuée en utilisant des kératinocytes à zéro kératine K6 a démontré le rôle de la kératine K6 comme élément crucial responsable du maintien de l'intégrité des kératinocytes dans un tissu de peau éprouvé, et dans une migration de kératinocytes trouvés aux endroits où le tissu est atteint (Wong et Coulombe, 2003). Dans le contexte d'une réparation d'une plaie, la kératine K6 est associée aux kératines K16 et K17. Conformément à nos résultats, ces deux kératines ne semblent pas avoir été induites par un étirement cyclique. Dans une étude récente, la kératine K6 a montré avoir été induite dans des kératinocytes soumis à un étirement continu (Yann et coll. 2004). Toutefois, des kératinocytes étirés de façon continue ont montré également une importante régulation, à la baisse,
de la kératine K10 qui se produit également sur des kératinocytes recouvrant le bord de la plaie (Paladini et coll. 1996). Ici, nous montrons que le niveau d'expression des kératines K1 et K10 n'est ni augmenté ni régulé à la baisse dans des kératinocytes soumis à un étirement cyclique. Bien que l'expression de marqueurs précoces d'une différenciation terminale des kératinocytes ne soit pas affectée par un étirement cyclique, plusieurs marqueurs liés à des étapes tardives du processus de différenciation ont été induits par le traitement. L'ARN messager de protéines faiblement riches en proline, à savoir les protéines SPRR1, 2 et 3, précurseurs de l'enveloppe kératinisée, montre une induction très rapide et transitoire, en réponse à un étirement cyclique. Ces protéines sont des protéines très spécialisées jouant un rôle essentiel dans la fonction de barrière des épithéliums stratifiés et dans les propriétés biomécaniques de la couche cornée (Cabral et coll. 2001 ; Steinert et coll. 1998a ; Steinert et coll. 1998b). L'induction de ces marqueurs reflète non seulement une activation de phases tardives de différenciation terminale, mais aussi une modification de la composition de la couche cornée. En fait, tandis que la protéine SPRR2 est exprimée dans de petites zones d'un épiderme normal (interfolliculaire et folliculaire), la protéine SPRR1 n'est pas produite dans des zones interfolliculaires d'un épiderme normal, mais seulement dans des appendices, et la protéine SPRR3 n'est pas exprimée du tout dans l'épiderme, mais seulement dans des épithéliums buccaux et oesophagiens. De façon intéressante, la protéine SPRR3 est normalement produite dans des épithéliums buccaux et oesophagiens qui sont particulièrement exposés à une contrainte mécanique. Ainsi, l'induction de la protéine SPRR3, en réponse à un étirement cyclique, est comparable à l'induction de la ténascine C et du collagène de type XII dans des fibroblastes dermiques étirés. En fait, ces deux marqueurs ne sont pas exprimés dans des fibroblastes dermiques normaux, mais dans des tissus supportant une
importante contrainte de traction. L'augmentation de l'expression de transglutaminase 1, une protéine à liaison croisée, impliquée dans la formation de l'enveloppe kératinisée, reflète la nécessité de gérer l'organisation du nouveau réseau de protéines à accumuler dans l'enveloppe kératinisée. Nous montrons également que plusieurs membres de la famille des gènes S100A présentent une induction forte et rapide dans des kératinocytes soumis à un étirement cyclique. Ces membres forment des homodimères et des hétérodimères agissant en interaction avec deux protéines cibles, et leur fonction dépend du calcium. Des protéines S100A sont souvent impliquées dans la réponse inflammatoire. Même si la distribution spécifique des différents membres de la famille S100A est bien décrite et suggère une implication dans la différenciation terminale des kératinocytes, leur fonction dans la différenciation de l'épiderme est pauvrement documentée (Eckert et coll. 2004). Toutefois, une étude a démontré qu'une protéine S100A7 pouvait avoir une interaction avec une protéine de type E-FABP (protéine épidermique de liaison d'un acide gras). La protéine E--FABP a une interaction avec des acides gras libres et est nécessaire pour leur solubilité, leur afflux à travers la membrane du plasma, leur transport et leur stockage intracellulaires et leur métabolisme (Ruse et coll. 2003). Ainsi, le complexe S100A7 / E-FAPB pourrait fonctionner dans un métabolisme et dans un transport de lipides au cours de l'assemblage de la barrière épidermique. Comme d'autres protéines S100A, la protéine S100A7 est également connue pour être impliquée dans la réponse inflammatoire.
De façon intéressante, des protéines SPRR, de la transglutaminase et des gènes S100A sont placés dans une région particulière du génome appelée le complexe de différenciation épidermique (EDC) sur le chromosome lg2l, ainsi qu'avec d'autres marqueurs épidermiques tels que de la filaggrine et de l'involucrine. Ces gènes sont habituellement co-régulés. Toutefois, nos résultats démontrent une
spécificité relative dans l'induction de certains de ces marqueurs, en réponse à un étirement cyclique, étant donné que certains membres de la famille S100A n'ont pas été affectés, ni l'involucrine (données non montrées).
Remodelage de la matrice extracellulaire (ECM) et modification de l'adhérence et propriétés de communication de kératinocytes, en réponse à une déformation cyclique La plupart des études réalisées sur la réponse de fibroblastes, à une contrainte mécanique, démontrent que le remodelage de la matrice extracellulaire (ECM) est l'une des modifications importantes se produisant en réponse à un étirement (Chiquet et coll. 1996 ; Chiquet et coll. 1998 ; Chiquet - Ehrismann et coll. 1994 ; Eckes et coll. 1993 ; Kessler et coll. 2001 ; Lambert et coll. 1992 ; Mauch et coll. 1989 ; Trachslin et coll. 1999). Contrairement aux fibroblastes, des kératinocytes sont organisés dans un épithélium stratifié et ne poussent pas dans une matrice extracellulaire (ECM) abondante. Dans tout l'épiderme, les kératinocytes sont fixés les uns aux autres de manière serrée, et les espaces restant entre les cellules sont très limités. Toutefois, au niveau du fond de l'épiderme, des kératinocytes de base sont fixés à la membrane basilaire, une membrane complexe et très structurée, établissant la jonction entre l'épiderme et le derme sous-jacent. Sur le côté épidermique, la membrane basilaire contient principalement des laminines, de la fibronectine, du collagène de type IV, etc. Ici, nous montrons que l'inhibiteur TIMP2 - un inhibiteur de la métalloprotéase -présente une augmentation faible, rapide et transitoire des kératinocytes soumis à un étirement cyclique. Ultérieurement, après deux jours d'étirement cyclique, la métalloprotéase matricielle MMP1 est fortement induite et reste à un niveau élevé après 5 jours de traitement. Dans des conditions normales, la métalloprotéase matricielle MMP1 n'est pas produite par des kératinocytes.
Toutefois, lorsque des kératinocytes ont une interaction avec du collagène de type I, un collagène qui n'est pas présent sur le côté épidermique de la membrane basale, mais dans la matrice extracellulaire (ECM) dermique, la production de métalloprotéase matricielle MMP1 est activée. L'induction du marqueur MMP1, demandant la présence du site de clivage du collagène de type I, par le marqueur MMP1 et sur l'intégrine a2(31, est essentielle pour la migration de kératinocytes activés au cours de la cicatrisation (Pilcher et coll. 1997). Dans ce contexte, l'induction de la métalloprotéase matricielle MMP1 dépend de l'activation du récepteur du facteur de croissance épidermique (EGF), via un signal d'autocrine (Pilcher et coll. 1999). Une fois sécrétée, la métalloprotéase matricielle MMP1 agit directement sur le site d'interaction entre l'intégrine a2(31 et le collagène (Dumin et coll. 2001). Le fait d'inactiver la métalloprotéase matricielle MMP1, dans des kératinocytes, conduit à une régulation à la baisse d'une migration et d'une prolifération cellulaires, et à une augmentation d'apoptose (Nagavarapu et coll. 2002). L'expression du marqueur MMP1 par des kératinocytes est induite également par la présence d'un module de laminine a3. Ce procédé dépend de voies d'accès p38 et Erk, et d'une boucle d'autocrine impliquant de l'interleukine IL-la (Utani et coll. 2003). Cela constitue la première démonstration de l'induction de l'expression de métalloprotéase matricielle MMP1, en réponse à un étirement cyclique. La voie d'accès potentielle sensible à l'induction deMMP1, dans des kératinocytes étirés, sera discutée ultérieurement. Les inhibiteurs d'activateurs de plasminogènes, PAI-1 et PAI-2, sont également susceptibles d'influencer la structure de la matrice extracellulaire, en réponse à une contrainte mécanique. L'inhibiteur PAI-2 est induit de façon rapide et transitoire, tandis que l'activation de l'inhibiteur PAI-1 se produit plus tard. Les inhibiteurs PAI-1 et PAI-2 ont été montrés comme devant être induits dans des fibroblastes étirés (Kessler et coll. 2001).
Ces résultats suggèrent que des kératinocytes développent des processus à court terme et à long terme impliquant des modulateurs de la matrice extracellulaire (ECM), pour faire face à une déformation mécanique.
En plus des changements concernant la structure de la matrice extracellulaire suggérés par la production de protéines modulant les composants de la matrice extracellulaire (ECM), des kératinocytes étirés ont modifié également la composition de leur matrice extracellulaire (ECM), en soi. En fait, un couple de sous-ensembles de laminines a été induit. Les laminines jouent un rôle central dans la formation, dans l'organisation et dans la physiologie de membranes basales, où elles ont une interaction avec des récepteurs de surfaces cellulaires, ainsi qu'avec d'autres composants de la matrice extracellulaire (ECM). Les laminines sont constituées par 3 sous-ensembles (a, R et y). Dans la peau, comme dans d'autres épithéliums ayant des fonctions de sécrétion ou de protection, la membrane basale contient exclusivement des laminines 5 et 6. Conformément à l'analyse de biopuces (ou microarrays) d'ADN complémentaires, les 3 sous-ensembles de laminines contribuant à la formation de la laminine 5 (laminines a3, 02 et y3) ont été induits dans des kératinocytes soumis à une contrainte mécanique. De plus, la cinétique de ces inductions suggère une activation séquentielle de la transcription de ces gènes. L'expression de la laminine (33 se produit avant l'induction de la laminine y2, suivie de la transcription de la laminine a3. Il est important de noter que la laminine 5, après avoir été sécrétée, subit une série séquentielle de changements protéolytiques (Aumailley et coll. 2003). En fait, les sous-ensembles a3 et y2 sont traités après incorporation dans la membrane basale (Marinkovich et coll. 1992). Le domaine terminal C du sous-ensemble a3, qui a une interaction avec des récepteurs de surfaces cellulaires, est composé de 5 domaines repliés séparément (LG1 - LG5). Le traitement de la chaîne a3 consiste à procéder au clivage des domaines 4
et 5 (LG4/5) (Goldfinger et coll. 1998). D'autre part, le sous-ensemble y2 est traité dans le domaine terminal N qui n'a pas d'interaction avec des récepteurs de surfaces cellulaires, mais avec d'autres composants de la matrice extracellulaire (ECM). Dans une peau normale d'adulte, le domaine LG4/5 de la laminine a3 et le domaine terminal N de la chaîne y2 sont absents, tandis qu'ils sont conservés dans des situations pathologiques, telle qu'une cylindromatose caractérisée par des altérations structurales majeures de la membrane basale (Tunggal et coll. 2002). Ces résultats suggèrent que les domaines clivés ne participent pas à la stabilité de la jonction dermo-épidermique, mais ont plutôt tendance à empêcher une stabilisation. De la laminine 5 traitée induit une adhérence stable de kératinocytes, via l'interaction des domaines LG1-3 de son sous-ensemble a3, avec des intégrines a301 et a604 (Carter et coll. 1991 ; Rousselle et Aumailley 1994). D'autre part, de la laminine 5 non traitée, qui est présente seulement dans des kératinocytes de croissance et de migration, est capable d'induire une migration cellulaire et d'entraver un assemblage d'hémidesmosomes (Decline et Rousselle 2001 ; Goldfinger et coll. 1999 ; Ryan et coll. 1999). En réponse à un étirement cyclique, la laminine 5 est susceptible d'être accumulée dans sa forme non traitée. En fait, comme démontré dans des études antérieures (Takei et coll. 1997b) et comme cela est suggéré ici par l'augmentation de l'expression de kératine K14, des kératinocytes soumis à un étirement cyclique ont tendance à proliférer plus activement. De plus, le fait d'exprimer de la laminine 5 non traitée pourrait être une manière, pour des kératinocytes, de réduire leur fixation sur le substrat et, ainsi, d'atténuer les tensions auxquelles ils sont soumis. Cette hypothèse est solidement étayée par la simultanéité des protéoglycanes de la membrane intégrale, à savoir les syndécanes 1 et 4. En fait, une étude récente a démontré que des kératinocytes utilisaient du syndécane 1 et, dans une moindre mesure, du syndécane 4, pour l'adhérence sur
de la laminine 5, via les domaines LG4/5 de sa chaîne a3 (Okamoto et coll. 2003). Une étude convaincante a démontré le rôle essentiel du syndécane 1 en intervenant dans la prolifération cellulaire et dans la régulation de l'expression de l'intégrine dans des tissus épithéliaux normaux et lésés (Stepp et coll. 2002). Par conséquent, il est probable que des kératinocytes étirés produisent des syndécanes 1 et 4 qui ont une interaction avec de la laminine 5 non traitée et riéosynthétisée, afin de modifier leurs propriétés d'adhérence et la structure de la membrane basale. Toutefois, cette hypothèse reste à vérifier. Il doit être noté que bien que les interactions potentielles des domaines terminaux N du sous-ensemble y2, avec d'autres composants de la matrice extracellulaire, restent à aborder, le traitement de ce domaine est susceptible d'être impliqué également dans la régulation de la structure de la membrane basale. Comme suggéré précédemment par l'induction des syndécanes 1 et 4, des kératinocytes étirés ont non seulement tendance à modifier la structure et la composition de leur matrice extracellulaire (ECM), mais ont également tendance à modifier l'ensemble de molécules d'adhérence qu'ils présentent au niveau de la surface cellulaire et à travers laquelle ils ont une interaction avec la matrice extracellulaire. Nous montrons que 2 sous-ensembles d'intégrines sont induits dans des kératinocytes soumis à un étirement cyclique. Les intégrines sont des récepteurs de transmembranes constitués de 2 sous-ensembles (a et M. Alors que l'intégrine a2 est induite de façon rapide et transitoire après le début du traitement, l'expression de l'intégrine (37 commence à augmenter entre 1 et 2 jours après le début du traitement et reste à un niveau élevé au bout de 5 jours. Le sous-ensemble d'intégrine a2 est habituellement associé à un sous-ensemble d'intégrine (31. Toutefois, l'expression du sous-ensemble d'intégrine (31 n'a pas été modulée par un étirement cyclique. Deux intégrines partagent
le sous-ensemble (37 : a4(37 et aE(37. Bien que le sous-ensemble a4 n'ait pas été détecté par l'analyse de biopuces (ou microarrays) d'ADN complémentaires, il n'est pas exclu que le sous-ensemble aE (non sondé sur des biopuces (ou microarrays) de la peau, de type PIQOR ) soit induit dans des kératinocytes étirés. Des kératinocytes forment un épithélium stratifié dans lequel ils ont une interaction puissante les uns avec les autres. Ici, nous montrons que l'étirement cyclique fait que des kératinocytes changent leurs propriétés d'adhérence et de communication. L'expression de la protéine ZO-2 a été augmentée également de façon transitoire. La protéine ZO-2 est un membre de l'homologue de guanylate-kinase associé à une membrane (MAGUK), ainsi qu'avec une protéine ZO-1 et une protéine ZO-3. Ce membre a une interaction avec des occludines et des claudines, à savoir des protéines de transmembrane concentrées au niveau de jonctions serrées et d'adhérence (Itoh et coll. 1999a ; Itoh et coll. 1999b). Des études récentes ont démontré que la protéine ZO-2 est capable de se déplacer jusqu'au noyau, où elle est impliquée dans la régulation des processus de transcription (Betanzos et coll. 2004 ; Islas et coll. 2002 ; Jaramillo et coll. 2004 ; Traweger et coll. 2003). Ainsi, l'augmentation de l'expression de la protéine ZO-2, dans des kératinocytes étirés, peut être impliquée dans la régulation de jonctions serrées et d'adhérence, ainsi que dans la régulation de transcription de gènes. L'expression de la connexine GJB5 est également augmentée pendant tout le traitement. La protéine GJB5 est une protéine à jonction communicante formant des canaux intercellulaires permettant l'échange de petites molécules entre des cellules voisines. La protéine est exprimée de façon prédominante dans des kératinocytes proliférants et régulés fortement à la baisse au niveau de la postconfluence (Gibson et coll. 1997). Il semble que le rétablissement de jonctions communicantes impliquant la
protéine GJB5 soit nécessaire dans des kératinocytes postconfluents et soumis à un étirement cyclique. Facteurs de transcription et signaux d'autocrine / de paracrine impliqués dans la réponse de kératinocytes à une contrainte mécanique La réponse cellulaire à une contrainte mécanique implique l'induction de facteurs de transcription influençant la régulation de gènes en aval. Selon des études antérieures, la protéine 1 de réponse à une croissance précoce (EGR-1) est considérée comme un gène maître pour une mécano-régulation. En fait, l'ARN messager de ce facteur de transcription est induit plusieurs fois en quelques minutes (par une voie de passage ras / Erkl/2), après application d'un effort de cisaillement sur des cellules endothéliales et épithéliales (Houston et coll. 1999 ; Schwachtgen et coll. 1998), ou bien sur des cellules d'ostéoblastes (Ogata 2000). La protéine EGR-1 est également, de façon rapide et forte, régulée à la hausse par une déformation cyclique dans des cellules vasculaires de muscles lisses (Morawietz et coll. 1999). Nos résultats sont en accord avec cette idée, étant donné que la protéine EGR-1 est induite également dans des kératinocytes soumis à un étirement cyclique. Néanmoins, conformément à notre analyse transcriptomale, ce facteur de transcription n'est pas le seul à présenter une induction rapide et transitoire, en réponse au traitement. Le récepteur nucléaire orphelin NR4A1, le facteur de transcription Zf9, les facteurs nucléaires MSP58, MAZ et DEC1 sont également induits dans des kératinocytes étirés. Les deux facteurs de transcription JUNB et FOSB, deux membres de la famille de facteurs de transcription API, agissant ensemble pour activer un large éventail de gènes, sont activés de la même façon. Les cibles potentielles de certains de ces facteurs de transcription seront discutées ultérieurement.
Une façon plus indirecte, pour des cellules, de répondre à une contrainte mécanique, est de produire des
facteurs sécrétés qui, ensuite, ont une interaction avec des récepteurs de membrane, pour activer une voie de signalisation. Plusieurs études ont démontré l'importance de ce type de mécanisme dans la mécano-transduction.. L'induction de collagène al dans des cellules étirées de muscles lisses des intestins (Gutierrez et Perr 1999) et dans des fibroblastes (Lindahl et coll. 2002) a été montrée comme dépendant de la sécrétion du facteur de croissance TGF-0. Le facteur de croissance du tissu conjonctif (CTGF) est induit dans des fibroblastes étirés et peut être sensible au collagène de type I et à d'autres protéines matricielles (Schild et Trueb 2002). Le facteur de croissance des plaquettes (PDGF) est sécrété par des cellules de muscles lisses soumises à une déformation cyclique et active la croissance cellulaire (Wilson et coll. 1993). Une stimulation mécanique cyclique de chondrocytes articulaires humains conduit à une libération d'interleukine IL-4 provoquant une hyperpolarisation de la membrane (Millward - Sadler et coll. 1999).
Ici, nous montrons que l'ARN messager de la protéine 9 morphogénétique de l'os (BMP9) est fortement induit en réponse à un étirement cyclique, suggérant que ce facteur de croissance est sécrété par des kératinocytes étirés et déclenche une voie de signalisation par interaction avec son récepteur sur la même cellule ou sur des cellules voisines. Ce facteur de transcription est un membre de la super famille TGF-(3. En dehors de son rôle dans la régulation de l'induction, de l'entretien et de la réparation de l'os, qui est bien documenté (Blunk et coll. 2003 ; Peng et coll. 2004), la protéine BMP9 joue un rôle crucial dans la physiologie du foie (Miller et coll. 2000) et dans le développement du système nerveux central (Lopez - Coviella et coll. 2000). Toutefois, l'expression de la protéine BMP9, par des kératinocytes, n'a jamais été observée aussi loin. Les facteurs de croissance CYR61 et NOV, deux membres de la famille CCN de protéines de liaison du facteur de croissance
semblable à de l'insuline, sont également induits par un étirement cyclique. Les cibles potentielles de la protéine CYR61, dans le contexte d'une déformation mécanique, sont discutées dans la section suivante. En plus de ces facteurs de croissance, les deux cytokines IL-6 et IL-8 sont activées de façon rapide et transitoire dans des kératinocytes étirés dans lesquels elles sont susceptibles de déclencher l'activation de voies de transduction. Cette question sera discutée plus en détail pour la cytokine IL-6. Dans une étude antérieure, des kératinocytes étirés ont été montrés comme produisant des marqueurs IL-la et IL-lb (Takei et coll. 1998). Cette antinomie apparente entre des résultats antérieurs, et ceux que nous décrivons ici, peut être expliquée par le fait que bien que les deux études soient réalisées sur des membranes flexibles en silicone, avec les mêmes plages d'allongement et de fréquence, les membranes utilisées dans les deux études ont été recouvertes de différents types de collagène. En fait, dans notre étude, nous avons utilisé des lames de culture recouvertes de collagène de type IV qui est présent dans la membrane basale et, dans des conditions normales, a une interaction avec des kératinocytes, tandis que Takei et ses collaborateurs ont utilisé des lames de culture recouvertes de collagène de type I qui est abondant dans le derme mais n'a pas d'interaction avec des kératinocytes, sauf au cours de la cicatrisation. Plusieurs études ont démontré l'importance de la nature de la matrice extracellulaire (ECM), en réponse cellulaire à une contrainte mécanique (Morawietz et coll. 1999 ; Zhang et coll. 2003). Ainsi, il semble que des kératinocytes étirés produisent des interleukines IL-la et IL-lM lorsqu'ils sont en culture sur du collagène de type I, mais pas dans le cas où ils sont en culture sur du collagène de type IV.
De l'analyse de gènes individuels jusqu'à l'identification de voies signalisation Dans cette étude, nous choisissons de réaliser une analyse cinétique de la réponse de kératinocytes à une contrainte mécanique, en utilisant une distribution, presque exponentielle, des moments dans le temps. Cette distribution permet d'identifier de façon très précoce et transitoire des marqueurs exprimés (SPRR2, de nombreux facteurs de transcription, des interleukines, CYR61, etc.) et des marqueurs qui émergent très tardivement après le début du traitement (MMP1, PAI-1, ITGB7). Ces marqueurs auraient pu être omis si nous avions limité l'analyse à la réponse des cellules après 24 heures de traitement. De plus, concernant la validation des résultats obtenus à partir de l'analyse de biopuces (ou microarrays) d'ADN complémentaires par une réaction RT-PCR, en temps réel, la reproduction des mêmes courbes d'induction est beaucoup plus significative que pourrait l'être la validation d'un seul point. De ce point de vue, la présente étude valide fortement la fiabilité des résultats fournis par l'analyse de biopuces (ou microarrays) de la peau, de type PIQOR . Cette analyse cinétique permet également de mettre en évidence des voies de passage qui peuvent être impliquées dans la réponse des kératinocytes, à l'étirement cyclique. En fait, quelques liens potentiels pourraient être établis entre certains des gènes induits à différents moments du traitement. Par exemple, deux hypothèses pourraient être proposées concernant la voie de transmission des signaux, à l'origine de l'induction du marqueur MMP1. Comme nous l'avons mentionné précédemment, il est possible que le sous-ensemble a3 de la laminine 5 soit produit et accumulé dans la membrane basale, sans être traité, et a une interaction avec des syndécanes à travers son module LG4/5 (Okamoto et coll. 2003). Et aussi, une récente étude a démontré que le module LG4 de la laminine a3 et, plus précisément, le site d'interaction avec des syndécanes, active l'expression du
marqueur MMP1, via une boucle d'activation d'autocrine impliquant un marqueur IL-1R (Utani et coll. 2003). Ce mécanisme est à l'origine de l'induction du marqueur MMP1 au cours d'une cicatrisation. Toutefois, comme discuté précédemment et conformément à nos résultats, les marqueurs IL-la et IL-1(3 ne semblent pas devoir être impliqués dans la réponse de kératinocytes à un étirement cyclique, lorsque des cellules sont en culture sur des lames recouvertes de collagène de type IV. Le marqueur MMP1 peut être induit également via une boucle d'activation d'autocrine impliquant le marqueur Cyr6l. En fait, le marqueur purifié Cyr6l a été montré, activant l'expression du marqueur MMP1 dans des fibroblastes de peau humaine (Chen et coll. 2001). De plus, dans la même étude, le marqueur purifié Cyr6l a induit l'expression du marqueur PAI-1, avec une cinétique d'induction semblable à celle observée pour le marqueur MMP1. A partir de notre analyse de biopuces (ou microarrays) d'ADN complémentaires, les marqueurs MMP1 et PAI-1 présentent la même cinétique d'activation dans des kératinocytes étirés.
Ainsi, en réponse à un étirement cyclique, l'induction du marqueur MMP1 est plus susceptible d'impliquer le marqueur Cyr6l que le marqueur IL-la. Une étude récente a démontré que l'induction de l'expression du marqueur SPRR2, dans des cellules épithéliales biliaires, après ligature du canal biliaire, est dépendante de la signalisation IL-6/STAT3 (Nozaki et coll. 2005). Il est probable que l'expression du marqueur SPRR2, dans des kératinocytes étirés, est induite via une boucle d'autocrine IL-6. Un couple de liens potentiels pourrait également être formé entre des facteurs de transcription AB-1 dont font partie les facteurs de transcription FOsB et JunB, et d'autres gènes qui sont induits dans des kératinocytes étirés. Des études sur une différenciation squameuse de cellules épithéliales bronchiques ont démontré que l'expression du marqueur SPRR1 était activée par le facteur de transcription JunB (Vuong et coll. 2002). Dans l'épiderme, la régulation de l'expression
de kératines est complexe et conduit à une distribution différentielle de kératines au cours d'une différenciation épidermique normale, dans des maladies cutanées et au cours d'une cicatrisation. L'interaction des facteurs de transcription AP-1 et des protéines NF-kB est connue comme étant impliquée dans cette régulation (Ma et coll. 1997). Ainsi, les facteurs de transcription FosB et JunB peuvent jouer un rôle dans la spécificité de l'expression de kératines, dans des kératinocytes étirés. Les facteurs FosB et JunB sont également susceptibles de participer à l'induction du marqueur LAMA3. En fait, la région des promoteurs du gène humain de la laminine a3 contient des sites de facteurs de transcription AP-1 qui permettent une régulation - dépendant de la conformation - de l'expression du marqueur LAMA3, par des hétérodimères Jun - Fos (Virolle et coll. 2000). De façon intéressante, la protéine ZO- 2 a été récemment montrée comme étant capable d'empêcher, dans des cellules épithéliales, une transcription de gènes, par interaction avec les facteurs de transcription Fos, Jun et C/EBP (Betanzos et coll. 2004). Ainsi, dans des kératinocytes étirés, une protéine ZO-2 peut être impliquée dans la régulation d'activités des facteurs de transcription Fos et Jun. Dans cette étude, nous avons identifié plusieurs gènes qui sont impliqués dans la réponse de kératinocytes à une contrainte mécanique, et dirigés pour constituer une hypothèse sur des voies d'utilisation de signalisation qui peuvent être impliquées dans ce processus. Toutefois, ces hypothèses restent à tester. De plus, l'induction des gènes détectés doit être validée au niveau transcriptionnel, et la liste des gènes impliqués dans la réponse de kératinocytes, à une contrainte mécanique, s'élargit, étant donné que la liste des gènes que nous avons analysés, n'était pas exhaustive. Au-delà de la compréhension concernant la façon dont des kératinocytes et des fibroblastes dermiques répondent à une déformation mécanique, le défi entrepris consiste à faire la lumière sur les interférences qui ont lieu entre les différents types de cellules constituant la peau, lorsque l'organe est soumis à des forces internes et externes.
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Claims (8)

REVENDICATIONS
1. Procédé pour dépister des marqueurs impliqués dans la 5 résistance de kératinocytes à des déformations mécaniques, dans lequel a) des cellules de kératinocytes humains sont en culture sur une surface flexible, b) une partie des cellules obtenues au cours de l'étape 10 a) est soumise à un étirement cyclique, c) des ARN sont isolés, à différents moments, des cellules obtenues au cours de l'étape a) comme cellules témoins, et au cours de l'étape b) comme cellules mécaniquement contraintes, 15 d) des ARN obtenus au cours de l'étape c) sont amplifiés et marqués avec différents fluorochromes, e) des transcriptomes desdites cellules témoins et desdites cellules mécaniquement contraintes sont obtenus en soumettant les ARN obtenus au cours de l'étape d), à une analyse de biopuces (ou microarrays) et à une analyse bioinformatique, f) la comparaison du transcriptome obtenu à partir des cellules témoins et des cellules étirées au cours de l'étape e) permet de dépister des marqueurs impliqués dans la résistance de kératinocytes à des déformations mécaniques.
2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel les cellules de kératinocytes humains sont des lignes de 30 cellules de kératinocytes humains (cellules HaCaT).
3. Procédé selon la revendication 2, dans lequel l'étirement cyclique est réalisé avec un dispositif du type Flexercell Tension plus. 35
4. Procédé selon la revendication 3, dans lequel l'étirement cyclique est réalisé avec un allongement de 15 et à une fréquence de 0,3 Hz pendant 2, 8, 24, 48 et 120 heures.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'analyse de bicpuces (ou microarrays) est réalisée sur une biopuce (ou microarray) de la peau, de type PIQOR .
6. Procédé selon la revendication 1, dans lequel les marqueurs sont sélectionnés parmi une protéine faiblement riche en proline (SPRR) 1, 2 et 3, une protéine 5100 de liaison du calcium (S100A) 7, 8 et 9, la métalloprotéase matricielle 1 (MMP1), la laminine 5, le facteur de croissance Cyr6l, la protéine morphogénétique de l'os (BMP) 9 et le récepteur nucléaire orphelin (NR4A1).
7. Utilisation d'un marqueur identifié selon le procédé de la revendication 1, pour dépister des molécules qui modulent l'expression dudit marqueur.
8. Composition cosmétique comprenant des molécules qui modulent l'expression d'au moins un marqueur impliqué dans la résistance de kératinocytes, à des déformations mécaniques selon la revendication 1.
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