EP3665264A1 - Dispositif pouvant servir de modèle de barrière hémato-encéphalique - Google Patents

Dispositif pouvant servir de modèle de barrière hémato-encéphalique

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EP3665264A1
EP3665264A1 EP18756178.2A EP18756178A EP3665264A1 EP 3665264 A1 EP3665264 A1 EP 3665264A1 EP 18756178 A EP18756178 A EP 18756178A EP 3665264 A1 EP3665264 A1 EP 3665264A1
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EP
European Patent Office
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cells
astrocytes
bbb
porous synthetic
synthetic membrane
Prior art date
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Pending
Application number
EP18756178.2A
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German (de)
English (en)
Inventor
Guylène PAGE
Hanitriniaina RABEONY
Damien CHASSAING
Emilie DUGAST
Thierry Janet
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Universite de Poitiers
Centre Hospitalier Universitaire de Poitiers
Original Assignee
Universite de Poitiers
Centre Hospitalier Universitaire de Poitiers
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Filing date
Publication date
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Pending legal-status Critical Current

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    • C12M35/08Chemical, biochemical or biological means, e.g. plasma jet, co-culture
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    • G01N2500/10Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Definitions

  • the present invention relates to a device that can serve as a hematoencephalic (BBB) barrier model comprising two compartments in which certain cell types are arranged.
  • BBB hematoencephalic
  • the brain is isolated from the bloodstream by a particular structure, the blood-brain barrier (BBB).
  • BBB blood-brain barrier
  • This barrier is mainly composed of endothelial cells that interact with neighboring cells, particularly pericytes and astrocytes. These interact with microglia and neurons.
  • the BBB maintains an environment that allows neurons to function properly by performing various key functions: by finely controlling the passage of molecules and ions, instantly delivering nutrients and oxygen to the needs of neurons and protecting the brain from toxins and pathogens.
  • barrier models that are even closer to the BBB in vivo and can be used to carry out various studies such as the study of the physiopathology of certain degenerative diseases, the study of the aging of the BBB and the study of the passage of molecules in particular for therapeutic or diagnostic purposes, etc.
  • the inventors have sought and succeeded in putting pericytes and endothelial cells in direct contact, which has favored the appearance of structures organized in vessels, and has thus made it possible to obtain a tight model that is very close to the BBB in vivo.
  • An object of the invention is therefore a device comprising two compartments separated by a porous synthetic membrane: a so-called luminal compartment comprising endothelial cells and pericytes, and a so-called abluminal compartment comprising astrocytes and microglia.
  • a so-called luminal compartment comprising endothelial cells and pericytes
  • a so-called abluminal compartment comprising astrocytes and microglia.
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • the porous synthetic membrane may be tubular or planar.
  • luminal compartment it is understood the compartment formed by the light of a tubular device or the upper compartment in a planar device.
  • luminal compartment is meant the compartment outside the luminal compartment in a tubular device or the lower compartment in a planar device.
  • This device comprising the major cellular actors of the BBB reproduces the neurovascular microenvironment forming the BBB in vivo and makes it possible to take into account and reproduce the multiple cellular and molecular interactions that can occur in vivo.
  • the pericytes and the endothelial cells are arranged in superposed layers in the luminal compartment.
  • the pericytes are placed on or in contact with the porous synthetic membrane and the endothelial cells are placed above the pericytes, the latter therefore being in very close contact with the endothelial cells.
  • the pericyte / endothelial cell seeding ratio may vary, in particular it may be chosen so as to correspond to the ratio present in the BBB studied, for example the human BBB.
  • the pericyte / endothelial seeding ratio is between about 1/2 to 1/4 and is preferably about 1/3 (corresponding to the ratio of pericytes / endothelial cells of human BBB).
  • the luminal compartment further comprises blood cells, and preferably peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). These are then arranged above the endothelial cells.
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • porous synthetic membrane is meant a permeable support, which may be traversed by small molecules or ions or in a particular embodiment that may be traversed by cell extensions or cells depending on the size of the selected pores. This support allows the cells of each compartment to interact remotely.
  • a cellular structure similar to a BBB is gradually being put in place, under the combined action of the development of the seeded cells, and this once mature structure further comprises two extracellular matrices: the vascular basement membrane and the parenchymal basement membrane.
  • This porous synthetic membrane can be made of polyester (clear support allowing good visibility of the cells under the microscope) or polycarbonate (translucent support allowing low visibility of the cells under the microscope).
  • This membrane may be previously coated ("coating") with constituents of the extracellular matrix, and in particular with collagen, laminin, fibronectin or a mixture thereof according to the desired applications.
  • the size of the pores must be chosen according to the desired applications. If it is desired to conduct permeability, molecule transport, cell polarity, endocytosis of protein and receptor and / or cell interaction studies, it is preferable to take supports with a pore diameter of approximately 0.4 ⁇ and about 3 ⁇ in diameter and preferably about 0.4 ⁇ in diameter.
  • the support has a pore diameter of between about 0.4 and about 3 ⁇ , preferably about 0.4 ⁇ .
  • the support has a pore diameter of between about 3 ⁇ and about 8 ⁇ , preferably about 5 ⁇ about 8 ⁇ .
  • the abluminal compartment comprising astrocytes further comprises microglia.
  • the microglia / astrocyte seeding ratio may vary, in particular it may be chosen so as to correspond to the ratio present in the BBB studied, for example the human BBB.
  • the microglia / astrocyte seeding ratio is between about 1% and about 10% and is preferably about 5%.
  • the abluminal compartment comprising astrocytes is free of pericytes.
  • all the cells of the device according to the invention come from the same animal species, in particular from mammals.
  • the cells are rodent cells, preferably mouse cells.
  • the cells are primate cells, preferably human cells.
  • one or more cell types of the device according to the invention are derived from immortal cell cultures, in a particular embodiment all cell types are derived from immortal cells.
  • immortal cells immortal cells derived from tumors, spontaneously immortal cells and / or cells rendered immortal (“immortalized”) by introduction of at least one viral or cellular oncogene.
  • one or more cell types of the device according to the invention are derived from primary cultures of cells made immortal by introduction of at least one viral or cellular oncogene.
  • one or more cell types of the device according to the invention are derived from primary cultures, preferably all cell types are derived from primary cultures.
  • primary culture is meant a culture of cells directly from the tissue and / or cells of an individual.
  • one or more cell types of the device according to the invention are derived from primary cultures of tissues and / or cells taken from individuals of the same species and of the same age, preferably all cell types are derived from cultures. tissues and / or cells taken from individuals of the same species and age.
  • one or more and preferably all cell types are derived from adult individuals.
  • the device according to the invention also makes it possible to study the variations due to age or the impact on the BBB of diseases developing during the life of the individual.
  • Cells from primary cultures retain contact inhibition in contrast to immortalized cells, so the use of these cells limits cell proliferation in the device.
  • the use of primary cultures makes it possible to approach still more in vivo conditions.
  • is meant a subject of an animal species, in particular mammals.
  • the individual or individuals are rodents, preferably mice.
  • the individuals are primates, preferably humans.
  • the endothelial cells and the pericytes are derived from primary cultures of mouse cells and, preferably, from adult mice.
  • the endothelial cells and the pericytes are derived from primary cultures of mouse cells aged at least 3 months, more particularly at least 6 months and in a preferred mode of at least 12 months.
  • all cell types are derived from primary cultures of mouse cells and, preferably, from adult mice.
  • all cell types are derived from primary cultures of mouse cells at least 3 months old, more preferably at least 6 months old and in a preferred mode of at least 12 months.
  • one or more cell types of the device according to the invention are derived from primary cultures, then, according to a particular embodiment, one or more of these cell types are model cell types of pathologies.
  • Cellular model disease types means cell types derived from animal models reproducing pathologies occurring spontaneously or induced by genetic engineering methods (such as, for example, transgenesis) or with pharmacological tools to reproduce cell characteristics. individuals suffering from these particular pathologies.
  • the pathologies according to the invention are pathologies that have or are suspected of having an influence on the BBB, such as: neurodegenerative diseases (Alzheimer's, Parkinson's, Huntington's, ALS, etc.), cerebrovascular accident and cancers brain.
  • neurodegenerative diseases Alzheimer's, Parkinson's, Huntington's, ALS, etc.
  • cerebrovascular accident cerebrovascular accident and cancers brain.
  • the porous synthetic membrane is in the form of a tube, in which a fluid can be introduced, renewed, circulated.
  • the porous synthetic membrane is a plane membrane disposed horizontally.
  • the compartments are one above the other.
  • the device can be cryopreserved to facilitate its transport or to delay its use.
  • the invention also relates to a method for preparing the device according to the invention. According to one embodiment of the invention, this method comprises the following steps:
  • porous synthetic membrane b) insertion or deposition of the porous synthetic membrane on said surface, such that if the porous synthetic membrane comprises astrocytes, then the face comprising the astrocytes is opposite the surface, c) seeding the face of the synthetic membrane porous luminal with pericytes and endothelial cells.
  • Step b) thus creates the abluminal compartment between the surface and the porous synthetic membrane.
  • the surface is a support on which the device rests.
  • the surface may be for example the bottom of a culture box.
  • the method of preparation of the device according to the invention comprises an additional step of cryopreservation of the device.
  • the pericytes and the endothelial cells are arranged in superposed layers in the luminal compartment.
  • the pericytes are seeded before the endothelial cells.
  • the pericytes are placed on or in contact with the porous synthetic membrane and the endothelial cells are placed above the pericytes, the latter therefore being in close contact with the endothelial cells.
  • the pericyte / endothelial cell seeding ratio may vary, in particular it may be chosen so as to correspond to the ratio present in the BBB studied, for example the human BBB.
  • the pericyte / endothelial seeding ratio is about 1/2 to 1/4 and is preferably about 1/3 (corresponding to the ratio in human BBB).
  • the porous synthetic membrane is in contact with the cells of each compartment.
  • the step of seeding the porous synthetic membrane with pericytes and endothelial cells further comprises adding blood cells, and preferably peripheral blood mononuclear cells (PBMCs).
  • blood cells preferably peripheral blood mononuclear cells (PBMCs).
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • the addition of blood cells takes place after seeding the pericytes and the endothelial cells.
  • the one or more inoculation steps with astrocytes also include microglia seeding.
  • astrocytes and microglia are cultured together before being seeded in the device.
  • the microglia / astrocyte seeding ratio may vary, in particular it may be chosen so as to correspond to the ratio present in the BBB studied, for example the human BBB.
  • the microglia / astrocyte seeding ratio is about 5% (corresponding to the ratio in human BBB).
  • the seeding step (s) with astrocytes do not include seeding pericytes.
  • all the cells seeded according to the process of the invention come from the same animal species, in particular from mammals.
  • the cells are rodent cells, preferably mouse cells.
  • the cells are primate cells, preferably human cells.
  • one or more cell types of the process according to the invention are derived from immortal cell cultures.
  • all cell types are derived from immortal cells.
  • one or more cell types of the method according to the invention are derived from primary cultures, preferably all the cell types are derived from primary cultures.
  • one or more cell types of the process according to the invention are derived from primary cultures of tissues taken from individuals of the same age, preferably all cell types are derived from primary cultures of tissues taken from individuals of the same age.
  • one or more and preferably all cell types are derived from adult individuals.
  • endothelial cells and pericytes are derived from primary cultures of mouse cells and, preferably, from adult mice.
  • endothelial cells and pericytes are derived from primary mouse cell cultures at least 3 months old, more preferably at least 6 months old and in a preferred mode of at least 12 months.
  • all cell types are derived from primary cultures of mouse cells and, preferably, from adult mice.
  • all cell types are derived from primary cultures of mouse cells at least 3 months old, more preferably at least 6 months old and in a preferred mode of at least 12 months.
  • one or more cell types of the method according to the invention are derived from primary cultures, then, according to a particular embodiment, one or more of these cell types are model cell types of pathologies.
  • the invention also relates to the use of the device according to the invention and in particular its use as a model of the BBB.
  • the invention also relates to the use of the device according to the invention as a model of pathological BBB.
  • the device can be used to test the permeability of the model.
  • this device can be used to study its permeability to:
  • therapeutic molecules especially therapeutic molecules (in particular small biological or synthetic molecules, antibodies, psychotropic substances, etc.),
  • spores such as bacterial spores, fungal spores, plant spores, etc., for example for the study of fungal infections such as certain meningitis), or
  • naked or vectorized nucleic acids, cells in particular PBMCs, cancer cells, bacteria, etc.
  • the invention relates to the use of the device according to the invention for testing the permeability of the model to a compound comprising the steps:
  • step a) a known quantity of the compound is added and step c) makes it possible to measure the amount of compound or its metabolites in the compartment where the addition has not taken place. In addition it is also possible to detect and analyze the presence of said compound or its metabolites in the compartment where the addition took place, in particular to determine the remaining amount of this compound in said compartment.
  • the detection or analysis of the presence of the compound may be effected by various analytical chemistry techniques following the test compound whose HPLC coupled to one or even two mass spectrometry.
  • the compound may be labeled in order to facilitate its detection. Indeed, if we have fluorescent or radiolabeled compounds (in particular tracers that would be used in diagnosis and radiolabeled, for example Fluor 18 or Carbon 1 1), readers of the fluorescence intensity or radioactivity counters respectively, can be used to quantify the labeled compound or its labeled metabolites in the luminal and abluminal compartments.
  • the expression of proteins and / or the functionality of BBB transporters such as, for example, glycoprotein P (P-gp) or glucose transporter GLUT1 are compared in devices comprising at least one model cell type of the pathology studied and devices comprising no model cell type of this pathology.
  • Protein expression can be assayed by Western Blot, ELISA, or gene expression (RTqPCR).
  • testing preventive, therapeutic or diagnostic molecules targeting the cellular and molecular actors of the BBB we intend to study the impact of these molecules on the BBB and possibly their passage through the BBB.
  • at least one molecule to be tested is applied to the device according to the invention, and after a time of exposure or incubation, the device is analyzed in order to determine the changes that have been caused by said at least one a molecule tested.
  • These changes may in particular concern the permeability, the selectivity, the electrical resistance, the morphology of the cells, etc.
  • It is possible in particular to study the result of the addition of the molecule on the target by comparing the functionality and / or the expression of this target in devices in which the test molecule has been applied to devices in which it has not been applied.
  • test physical conditions By “testing physical conditions”, one intends to study the impact of these conditions on the BBB and possibly their influence on the passage of compounds through the BBB.
  • at least one physical condition is applied to the device according to the invention. After a time of exposure or incubation, the device is analyzed to determine the changes that have been caused by said at least one tested physical condition. These changes may in particular concern the permeability, the selectivity, the electrical resistance, the morphology of the cells, etc. One can notably study the result of the addition of the physical condition by comparing it with a device on which the physical condition has not been applied.
  • Physical condition refers in particular to the use of waves such as magnetic waves, electromagnetic waves or ultrasounds.
  • test protocols we intend to study the impact of a treatment at the level of the BBB.
  • at least one treatment i.e., a physical condition or a molecule
  • a compound as defined above which compound is then contacted with the BBB.
  • the device is analyzed to determine the changes that have been caused by said treatment. These changes may in particular relate to the permeability, the selectivity, the electrical resistance, the morphology of the cells, etc.
  • the treatment result can in particular be studied by comparing it with a device put in contact with a compound which has not been treated. .
  • Figure 1 Diagram of preparation of a device comprising primary cell cultures according to the invention.
  • astrocytes and microglia are thawed and endothelial cells and pericytes are purified from mouse brains.
  • PBMCs are extracted from the peripheral blood of mice.
  • astrocytes and microglia represented by dots ". are seeded in a culture dish. The culture media of the other cells are renewed. On D10, the microglia cells are observable.
  • astrocytes and microglia are seeded on the porous synthetic membrane.
  • the porous synthetic membrane is deposited in the culture dish so that the two astrocyte cultures are in contact, thus forming the abluminal compartment. Then pericytes and endothelial cells, represented by squares and rounds (" ⁇ ", "o") are seeded on the upper side of the membrane porous synthetic, thus forming the luminal compartment. The treatment of the hydrocortisone device begins.
  • PBMCs represented by "+" crosses, are seeded in the luminal compartment.
  • the model is ready to use.
  • Figure 2 Paracellular permeability of dextran-FITC on a device according to the invention comprising primary cell cultures derived from model mice for Alzheimer (AD) or wild mice (Wild Type, WT).
  • the permeability of the device AD remains higher compared to the WT device (46%), indicating a poorer sealing of the pathological device compared to the healthy device.
  • the statistical test used is the Kruskal-Wallis test followed by the Dunn test for multiple comparisons.
  • Figure 3 Paracellular permeability coefficient of dextran-FITC on a device according to the invention comprising primary cell cultures derived from wild-type (WT) mice.
  • dT incubation time (second)
  • A surface of the porous synthetic membrane (here 1, 12 cm 2 )
  • the fluorescence intensity is proportional to the amount of dextran-FITC present in each compartment (abluminal and luminal).
  • the coefficient of permeability is shown in Figure 3 and was calculated after one hour.
  • the results represent the mean ⁇ SEM (mean standard deviation) of the permeability coefficient of 3 to 4 devices in each group. * p ⁇ 0.01 compared to the control device which corresponds to a device without cell but covered with the same "coating" matrix as the WT device.
  • the statistical test used is the Mann Whitney test.
  • Figure 4 Functionality of the P glycoprotein in the device according to the invention.
  • This functionality test is carried out with rhodamine 123 because it is known that this molecule as a substrate of the glycoprotein P is expelled by the P-glycoprotein to the luminal compartment, which limits its passage through the device.
  • the culture media are renewed: 1 ml in the abluminal compartment and 250 ⁇ l in the luminal compartment containing or not the Zosuquidar inhibitor of the 5 ⁇ -glycoprotein P (Dantzig et al., 1996).
  • the devices are incubated for 2 hours in the incubator.
  • 250 ⁇ l of medium containing rhodamine 123 at 2 ⁇ l with or without Zosuquidar at 5 ⁇ l are added to the luminal compartment and incubated for 1 hour in the incubator.
  • Samples of 50 ⁇ in the luminal and abluminal compartments are made just after the addition of the medium containing Rhodamine 123 and after 1 hour of incubation at 37 ° C.
  • the samples are deposited in wells of a black plate of 96 wells.
  • the fluorescence intensity is read on the same apparatus as for the permeability test (previously described).
  • the Aex of rhodamine is 500nm and the Aem is 524nm.
  • the passage of rhodamine 123 through the WT decreases by 72.6% compared to the device without cell ( ** p ⁇ 0.01).
  • the statistical test used is the Kruskal-Wallis test followed by the Dunn test for multiple comparisons.
  • Figure 7 Functionality of the P-glycoprotein in the murine device according to the invention in 24 and 96 well format.
  • FIG. 8 Coefficient of permeability of 8 molecules on the murine devices according to the invention in 24 and 96 well format.
  • Figure 10 Functionality of P-glycoprotein in the commercial device.
  • the statistical test used is the Kruskal-Wallis test followed by a Dunn test for multiple comparisons: * p ⁇ 0.05.
  • FIG 11 Trans-endothelial electrical resistance (TEER) in 24-well formats after cryopreservation.
  • Figure 1 1 is shown the trans-endothelial electrical resistance (TEER)
  • the 24-well format devices were cryopreserved for 7, 15 or 30 days and then used 4, 5 or 6 days post-thawing.
  • the results represent the mean ⁇ SEM.
  • the statistical test used is the Mann Whitney test: * p ⁇ 0.05, ** p ⁇ 0.01.
  • Figure 12 Permeability coefficient of DEXTRAN-FITC in 24-well formats after cryopreservation.
  • FIG. 13 Trans-endothelial electrical resistance (TEER) in murine devices with immortalized cell lines according to the invention in the format 12 and 24 wells.
  • TEER Trans-endothelial electrical resistance
  • Figure 14 Coefficient of permeability of Dextran-FITC on murine devices with immortalized cell lines according to the invention in 12, 24 and 96 well format.
  • Figure 15 Functionality of P-glycoprotein on murine devices with immortalized cell lines according to the invention in 12, 24 and 96 well format.
  • the results represent the mean ⁇ SEM.
  • the statistical test used is the Kruskal-Wallis test followed by a Dunn test for multiple comparisons: * p ⁇ 0.05, ** p ⁇ 0.01, *** p ⁇ 0.001.
  • Example 1 Preparation of a device according to the invention This device comprises primary cultures of endothelial cells, pericytes, and PBMCs harvested from mouse brains. The realization of this device has gone through the following technical stages:
  • Endothelial cells and pericytes were purified using magnetic beads to exclude myelin and a Percoll gradient to dissociate endothelial cells from pericytes.
  • a primary co-culture stock of astrocytes and microglia was created as follows. Primary cultures of astrocytes and mouse microglia were obtained from brains of newborn mice between D1 and D3. Cell dissociation of brain tissue was mechanically performed. Astrocytes and microglia were selected by selective culture medium. One week after seeding a dissociated newborn brain and cultured in a 75 cm 2 flask coated (coated) with Poly-L-Lysine, the astrocytes forming a confluent mat were detached with trypsin and cryopreserved. Thawing of a cell cone was performed in a 25 cm 2 flask and 72 hr after the astrocytes can be used for mounting the device. These cells can be sub-cultured 3 times. The cells were cultured in selective media for each cell type until a cellular mat covering the entire surface of the chosen culture dish was obtained.
  • astrocytes and microglia were also seeded under a porous synthetic membrane incubated for 24 hours (see Figure 1).
  • the membrane was deposited in the culture dish comprising the astrocytes and microglia so that the two astrocyte cultures were in contact, thus forming the abluminal compartment. These cells model the glial parenchyma.
  • the device was incubated for 72 h in the presence of hydrocortisone to promote the expression of P-glycoprotein in the endothelial cells.
  • the glycoprotein P is an important efflux pump in the functionality of the BBB.
  • the model is ready. It can in particular receive PBMCs.
  • EXAMPLE 2 Immunolabel Observation of Devices Made According to Example 1
  • the porous synthetic membranes of the devices made according to example 1 are washed twice for 5 min with 500 ⁇ l of PBS.
  • 500 ⁇ l of a paraformaldehyde solution (4% PFA) are then added to the abluminal and luminal compartments for 15 min at room temperature.
  • Two new washes of 5 min are carried out with 500 ⁇ of PBS.
  • the cells are then blocked and permeabilized with 500 ⁇ l 0.5% PBS / Triton / 5% BSA in the abluminal and luminal compartments for 1 hour at room temperature.
  • the antibodies used are anti-ZO-1 antibodies (1: 50 dilution, tight junction marker, used as endothelial cell marker), anti-aSMA (1/50 dilution, pericyte marker), anti-vWF (dilution 1 / 50, endothelial cell marker) and anti-GFAP (1/100 dilution, astrocyte marker).
  • the incubation lasts one night at 4 ° C in a humid chamber.
  • each membrane is gently deposited in a well of a 12-well box with the face of the cells studied above and washed twice for 5 min in PBS without stirring.
  • 30 ⁇ l of Ac II are deposited on a new paraffin plastic film before being incubated for 1 hour at room temperature with the membranes.
  • the Ac II solution contains fluorochrome RRX-coupled anti-mouse antibodies II (red fluorescence) and Alexa 488 fluorochrome-conjugated anti-rabbit II antibodies (green fluorescence) all diluted 1:50.
  • the washes are carried out under the same conditions as above then the membranes are incubated with 30 ⁇ l of DAPI solution (4,6-Diamino-2-phenylindole) for 15 min at room temperature, under cover. of light, on paraffin plastic film in a humid chamber to mark the nuclei of the cells.
  • the membranes are again recovered to undergo three washes for 5 min with H 2 0 UHQ to remove the salts.
  • the membranes are then glued on a glass slide with DAPI glue so that the glued side matches that of the non-immunolabeled cells. A glass slide is then glued to the membrane. The slides are observed under an epifluorescence microscope (Olympus BX 51).
  • Immunostarisms highlight the cell types that make up the BBB model.
  • endothelial cells organize into vessels and form tight junctions between them (ZO-1 labeling), thus spontaneously reproducing important characteristics of the BBB in vivo.
  • Pericytes are organized around endothelial cells by establishing points of contact.
  • Example 3 Use of a Device According to the Invention as a Model of the BBB in the Case of Cells Derived from Model Alzheimer's Mice (AD)
  • a device was prepared according to Example 1, in which endothelial cells and pericytes were prepared from Alzheimer's mice (APPswePS1 dE9, AD) aged 4 to 8 weeks and astrocytes and microglia from wild mice. (WT), here called Alzheimer device (AD device).
  • WT Alzheimer device
  • This device has been compared to a similar device formed completely from wild-type mouse (WT) cells, here called wild-type device and to a similar device devoid of cells, here called control device.
  • a device was prepared according to Example 1, and dextran-FITC was added in the luminal compartment of the device. The presence of dextran-FITC was detected and analyzed by fluorescence.
  • FIG. 3 it can be seen that the coefficient of permeability is higher with the control device. There is a significant decrease in the permeability coefficient of 98% respectively for the WT device. This difference is statistically significant. It demonstrates the relative permeability of the device according to the invention.
  • a device was prepared according to Example 1, and rhodamine 123 was added to the luminal compartment of said device in the presence or absence of Zosuquidar.
  • rhodamine 123 as a substrate of the glycoprotein P is expelled by the glycoprotein P to the luminal compartment, which limits its passage through the device.
  • Zosuquidar is an inhibitor of P-glycoprotein, so its use should limit the efflux of rhodamine 123 to the luminal compartment.
  • TEER trans-endothelial electrical resistance
  • P-gp G-glycoprotein
  • Trans-endothelial electrical resistance was only measured on 12- and 24-well BBBs because the electrode is not suitable for the 96-well format. It is expressed in ohm.cm 2 taking into account the surface of the insert: 1 .12 and 0.33 cm 2 for the inserts of 12 and 24 wells, respectively. It was measured using an ohmeter (Millicell Electrical Resistance System-2, Millipore - [Molsheim] France) using two electrodes STX01: the largest is placed in the abluminal compartment and the smallest in the luminal compartment. The system carrying the two electrodes is connected to the ohmeter to measure the electrical resistance between the two compartments. The value displayed on the device is expressed in ohm, then it is multiplied by the surface of the insert to obtain the results in ohm.cm 2 .
  • TEER Trans-endothelial electrical resistance
  • Figure 5 shows that the TEER is significantly increased in the devices according to the invention compared to control (i.e., a device without a cell).
  • DA Dopamine
  • L-DOPA Bromazepam
  • BROMO Bromazepam
  • CAF caffeine
  • SUC sucrose
  • SUC sucrose
  • CYCLA cyclosporine A
  • ZOSU Zosuquidar
  • MISO Mitotane
  • the molecules were added to the luminal compartment at the indicated concentration and incubated for 48 hours. The luminal and abluminal media were then taken for the determination of the molecules.
  • Example 6 Comparison of the Device According to the Invention to a Commercial Device
  • the device according to Example 1 in 24-well format was compared with a commercial model (BBB Kit TM (RBT-24H) of Pharmaco-Cell®) which corresponds to a model of Primary BBB prepared from rat brain cells.
  • BBB Kit TM RBT-24H
  • Pharmaco-Cell® a commercial model of Primary BBB prepared from rat brain cells.
  • the endothelial cells are seeded on the insert, the pericytes under the insert and rat astrocytes at the bottom of the well.
  • Rhodamine123 is as much effluent on the luminal as on the luminal side when it is deposited either in the luminal compartment or in the abluminal compartment (% efflux of 97% whatever the side of the deposit).
  • Cryopreservation of the device would allow on-demand preparation and delivery of the frozen device to the customer.
  • the 24-well device was cryopreserved with a solution
  • the coefficients of permeability are also of the same order of magnitude after 7 days of freezing as those obtained on the non-cryreserved BBBs (3,278 ⁇ 0.925 versus 3,867 ⁇ 0.333 10 ⁇ 6 cm / s, respectively) .
  • the permeability coefficient is between 6 and 20.10 "6 cm / s.
  • These lines have a replication time of 48 hours. These lines can be cryopreserved.
  • the culture media used are the same as those used for primary cultures. Their immortal character leads to a very high cell adhesion.
  • the TEER was measured (see Figure 13) and on all formats the paracellular permeability (see Figure 14) and the functionality of the P-gp efflux pump (see Figure 15) were evaluated.
  • VWF vonWillebrand factor
  • pericytes do not express markers of pericytes ⁇ -SMA, NG2, PDGF3R, indicating that the culture is pure. In contrast pericytes express these 3 markers well, and LRP-1 and do not express GFAP and vWF factor, indicating a pure culture of pericytes uncontaminated by endothelial cells and astrocytes.
  • Figure 13 shows the TEER results for 12 and 24-well formats.
  • the TEER on the 12-well format is quite comparable to that obtained on the device with primary cultures (see Figure 5: 12 well TEER average 218 ⁇ 7.17 n.cm 2 and here for the model with immortal cell lines the average TEER is of 184.60 ⁇ 6.65 Q.cm 2 ).
  • the average is 63.30 ⁇ 1 .35 Q.cm 2 whereas the model of BHE with primary cultures had an average ERER of 125.50 ⁇ 2.34 Q.crn 2 .
  • the 12, 24 and 96 well formats are functional because they significantly limit the passage of Rhodamine 123 on the abluminal side by more than 60% (see Figure 15). Unlike the BBBs with primary cultures, the specific inhibitor of Glycoprotein P shows no effect on all formats, this may be related to a different efflux pump type "Muiti drug resistance" very often encountered in cell lines.

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Abstract

Dispositif pouvant servir de modèle de barrière hémato-encéphalique La présente invention concerne un dispositif pouvant servir de modèle de barrière hémato-encéphalique (BHE) comprenant deux compartiments dans lesquels certains types cellulaires sont disposés. L'invention concerne également le procédé de préparation dudit dispositif et son utilisation comme modèle de la BHE.

Description

Dispositif pouvant servir de modèle de barrière hémato-encéphalique
La présente invention concerne un dispositif pouvant servir de modèle de barrière hémato-encéphalique (BHE) comprenant deux compartiments dans lesquels certains types cellulaires sont disposés.
Le cerveau est isolé de la circulation sanguine par une structure particulière, la barrière hémato-encéphalique (BHE). Cette barrière est principalement composée de cellules endothéliales qui interagissent avec les cellules voisines, en particulier les péricytes et les astrocytes. Ces derniers interagissent avec la microglie et les neurones. La BHE maintient un environnement permettant aux neurones de fonctionner correctement en assurant différentes fonctions principales : en contrôlant finement le passage de molécules et d'ions, en délivrant instantanément les nutriments et l'oxygène selon les besoins des neurones et en protégeant le cerveau des toxines et des pathogènes.
Afin que les médicaments destinés à agir sur le cerveau soient efficaces, ceux-ci doivent pouvoir passer facilement la BHE. Pour étudier le passage de molécules à travers la BHE et optimiser celui-ci, plusieurs modèles in vitro de cette barrière ont été développés à ce jour. Ces modèles comprennent le plus souvent la culture de plusieurs types cellulaires dans lesquels les cellules endothéliales sont séparées des autres types cellulaires par une membrane synthétique poreuse.
Il y a toutefois encore le besoin de modèles de barrière encore plus proches de la BHE in vivo et pouvant être utilisés pour effectuer des études diverses comme l'étude de la physiopathologie de certaines maladies dégénératives, l'étude du vieillissement de la BHE et l'étude du passage de molécules notamment à visée thérapeutique ou diagnostique, etc.
Les inventeurs ont cherché et réussi à mettre en contact direct des péricytes et des cellules endothéliales, ce qui a favorisé l'apparition de structures organisées en vaisseaux, et a donc permis d'obtenir un modèle étanche et très proche de la BHE in vivo.
Un objet de l'invention est donc un dispositif comprenant deux compartiments séparés par une membrane synthétique poreuse : un compartiment dit luminal comprenant des cellules endothéliales et des péricytes, et un compartiment dit abluminal comprenant des astrocytes et de la microglie. Par ailleurs, du côté luminal, des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMCs) peuvent être déposées. Ce type de dispositif permet d'obtenir des modèles de BHE ayant une étanchéité et une fonctionnalité très similaires à ce qui est observé in vivo. Les inventeurs ont même observé que les cellules endothéliales s'organisent en vaisseaux dans ce dispositif.
La membrane synthétique poreuse peut être tubulaire ou plane.
Par « compartiment luminal », on comprend le compartiment formé par la lumière d'un dispositif tubulaire ou le compartiment supérieur dans un dispositif plan.
Par « compartiment abluminal », on comprend le compartiment à l'extérieur du compartiment luminal dans un dispositif tubulaire ou le compartiment inférieur dans un dispositif plan.
Ce dispositif comprenant les acteurs cellulaires majeurs de la BHE reproduit le microenvironnement neurovasculaire formant la BHE in vivo et permet de prendre en compte et de reproduire les multiples interactions cellulaires et moléculaires qui peuvent se produire in vivo.
Selon un mode de réalisation, les péricytes et les cellules endothéliales sont disposés en couches superposées dans le compartiment luminal. De manière préférée alors, les péricytes sont disposés sur ou au contact de la membrane synthétique poreuse et les cellules endothéliales sont disposées au-dessus des péricytes, ces derniers étant donc en contact très étroit avec les cellules endothéliales. Le ratio d'ensemencement péricytes/cellules endothéliales peut varier, il peut notamment être choisi de manière à correspondre au ratio présent dans la BHE étudiée, par exemple la BHE humaine. De préférence, le ratio d'ensemencement péricytes/cellules endothéliales est compris environ entre 1/2 et 1/4 et est de manière préférée environ 1/3 (correspondant au ratio péricytes/cellules endothéliales de la BHE humaine).
Dans un mode de réalisation spécifique, le compartiment luminal comprend en outre des cellules sanguines, et de manière préférée des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMCs). Celles-ci sont alors disposées au-dessus des cellules endothéliales.
Par « membrane synthétique poreuse », on entend un support perméable, pouvant être traversé par des petites molécules ou des ions voire dans un mode de réalisation particulier pouvant être traversé par des extensions cellulaires ou des cellules suivant la taille des pores choisis. Ce support permet ainsi aux cellules de chaque compartiment d'interagir à distance. Autour de la membrane, une structure cellulaire similaire à une BHE se met progressivement en place, sous l'action combinée du développement des cellules ensemencées, et cette structure une fois mature comprend en outre deux matrices extracellulaires : la membrane basale vasculaire et la membrane basale parenchymale.
Cette membrane synthétique poreuse peut être en polyester (support clair permettant une bonne visibilité des cellules au microscope) ou en polycarbonate (support translucide permettant une faible visibilité des cellules au microscope). Cette membrane peut être préalablement revêtue (« coating ») avec des constituants de la matrice extracellulaire, et en particulier par du collagène, de la laminine, de la fibronectine ou un mélange de ceux-ci suivant les applications souhaitées. La taille des pores doit être choisie suivant les applications souhaitées. Si on souhaite mener des études de perméabilité, de transport de molécules, de polarité cellulaire, d'endocytose de protéines et de récepteurs et/ou d'interactions cellulaires, il est préférable de prendre des supports dont le diamètre des pores est compris entre environ 0,4 μηι et environ 3 μηι de diamètre et de préférence de 0,4 μηι environ de diamètre. Donc, dans un mode de réalisation, le support a un diamètre de pores compris entre environ 0,4 et environ 3 μηι, de préférence environ 0,4 μηι. Pour des études visant à étudier le passage de cellules à travers le support, comme les PBMCs par exemple, il sera préférable de prendre des supports de diamètre de pores compris entre environ 3 μηι et environ 8 μηι, de préférence entre environ 5 μηι et environ 8 μηι. Donc, dans un mode de réalisation, le support a un diamètre de pores compris entre environ 3 μηι et environ 8 μηι, de préférence environ 5 μηι à environ 8 μηι.
Dans un mode de réalisation spécifique, le compartiment abluminal comprenant des astrocytes comprend en outre de la microglie. Le ratio d'ensemencement microglie/astrocytes peut varier, il peut notamment être choisi de manière à correspondre au ratio présent dans la BHE étudiée, par exemple la BHE humaine. Dans le mode de réalisation dans lequel les astrocytes et la microglie sont utilisés, de manière préférée le ratio d'ensemencement microglie/astrocyte est compris entre environ 1 % et environ 10% et est de préférence d'environ 5%. De préférence, le compartiment abluminal comprenant des astrocytes est exempt de péricytes.
De manière préférée toutes les cellules du dispositif selon l'invention proviennent d'une même espèce animale, en particulier de mammifères. Selon un mode de l'invention, les cellules sont des cellules de rongeurs, de manière préférée des cellules de souris. Selon un autre mode de l'invention, les cellules sont des cellules de primates, de manière préférée des cellules humaines. Suivant un mode de réalisation, un ou plusieurs types cellulaires du dispositif selon l'invention sont issus de cultures de cellules immortelles, dans un mode de réalisation particulier tous les types cellulaires sont issus de cellules immortelles.
Par « cellules immortelles » on entend des cellules immortelles issues de tumeurs, des cellules spontanément immortelles et/ou des cellules rendues immortelles (« immortalisées ») par introduction d'au moins un oncogène viral ou cellulaire. Selon un mode de réalisation spécifique, un ou plusieurs types cellulaires du dispositif selon l'invention sont issus de cultures primaires de cellules rendues immortelles par introduction d'au moins un oncogène viral ou cellulaire.
Dans un mode préférentiel, un ou plusieurs types cellulaires du dispositif selon l'invention sont issus de cultures primaires, de manière préférée tous les types cellulaires sont issus de cultures primaires.
Par « culture primaire » on entend une culture de cellules issue directement du tissu et/ou de cellules d'un individu. Dans une variante, un ou plusieurs types cellulaires du dispositif selon l'invention sont issus de cultures primaires de tissus et/ou de cellules prélevées sur des individus de même espèce et de même âge, de manière préférée tous les types cellulaires sont issus de cultures primaires de tissus et/ou de cellules prélevés sur des individus de même espèce et de même âge. Selon un mode de réalisation de l'invention, un ou plusieurs et de préférence tous les types cellulaires sont issus d'individus adultes. De cette manière le dispositif selon l'invention permet aussi d'étudier les variations dues à l'âge ou l'impact sur la BHE de maladies se développant au cours de la vie de l'individu. Les cellules issues de cultures primaires conservent l'inhibition de contact contrairement aux cellules immortalisées, ainsi l'utilisation de ces cellules permet de limiter la prolifération cellulaire dans le dispositif. De plus l'utilisation de cultures primaires permet de se rapprocher davantage encore des conditions in vivo.
Par « individu » on entend un sujet d'une espèce animale, en particulier de mammifères. Selon un mode de l'invention, le ou les individus sont des rongeurs, de manière préférée des souris. Selon un autre mode de l'invention, les individus sont des primates, de manière préférée des humains.
Dans une variante du dispositif selon l'invention les cellules endothéliales et les péricytes sont issus de cultures primaires de cellules de souris et de manière préférée de souris adultes. De manière particulièrement préférée, les cellules endothéliales et les péricytes sont issus de cultures primaires de cellules de souris âgées d'au moins 3 mois, plus particulièrement d'au moins 6 mois et dans un mode préféré d'au moins 12 mois.
Ainsi selon une variante du procédé selon l'invention tous les types cellulaires sont issus de cultures primaires de cellules de souris et de manière préférée de souris adultes. De manière particulièrement préférée, tous les types cellulaires sont issus de cultures primaires de cellules de souris âgées d'au moins 3 mois, plus particulièrement d'au moins 6 mois et dans un mode préféré d'au moins 12 mois.
Lorsqu'un ou plusieurs types cellulaires du dispositif selon l'invention sont issus de cultures primaires, alors, selon un mode de réalisation particulier, un ou plusieurs de ces types cellulaires sont des types cellulaires modèles de pathologies.
Par « types cellulaires modèles de pathologies», on entend des types cellulaires issues de modèles animaux reproduisant des pathologies apparaissant spontanément ou induites par des méthodes de génie génétique (comme par exemple la transgenèse) ou avec des outils pharmacologiques afin de reproduire les caractéristiques de cellules des individus atteints par ces pathologies particulières. On peut à titre d'exemple citer des types cellulaires issues des modèles murins APPswePS1 dE9 pour la maladie d'Alzheimer, des modèles hémi-parkinsoniens ou parkinsoniens (injections toxiques MPTP, 6-OHDA) ou de souris transgéniques mutées pour Γα-synucléine pour la maladie de Parkinson, des modèles de souris transgéniques mutées pour le gène huntingtine pour la maladie de Huntington, de la mutation du gène C90RF72 pour la sclérose latérale amyoptrophique (SLA). De préférence les pathologies selon l'invention sont des pathologies ayant ou étant suspectées d'avoir une influence sur la BHE telles que : les maladies neurodégénératives (Alzheimer, Parkinson, Huntington, SLA...), l'accident vasculaire cérébral et les cancers cérébraux.
Selon un mode de réalisation possible, la membrane synthétique poreuse est en forme de tube, dans lequel un fluide peut être introduit, renouvelé, mis en circulation.
Selon un mode de réalisation préféré la membrane synthétique poreuse est une membrane plane disposée horizontalement. Dans ce mode de réalisation les compartiments sont l'un au-dessus de l'autre.
Selon un mode de réalisation le dispositif peut être cryopréservé pour faciliter son transport ou pour retarder son utilisation.
L'invention a aussi pour objet un procédé de préparation du dispositif selon l'invention. Selon un mode de réalisation de l'invention, ce procédé comprend les étapes suivantes :
a) ensemencement d'astrocytes sur une surface et/ou sur une face de la membrane synthétique poreuse (face qui deviendra la face abluminale),
b) insertion ou dépôt de la membrane synthétique poreuse sur ladite surface, de telle sorte que si la membrane synthétique poreuse comprend des astrocytes, alors la face comprenant les astrocytes est en regard de la surface, c) ensemencement de la face de la membrane synthétique poreuse luminale avec des péricytes et des cellules endothéliales.
L'étape b) permet de créer ainsi le compartiment abluminal entre la surface et la membrane synthétique poreuse.
Dans ce mode de réalisation de l'invention, la surface est un support sur lequel repose le dispositif. Lorsque la membrane synthétique poreuse est plane, la surface peut être par exemple le fond d'une boite de culture.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, ce procédé comprend les étapes suivantes :
a) ensemencement d'astrocytes sur une face de la membrane synthétique poreuse,
b) ensemencement de l'autre face de la membrane synthétique poreuse avec des cellules endothéliales et des péricytes et éventuellement,
c) dépôt de la membrane synthétique poreuse sur une surface de telle sorte que la face comprenant des astrocytes soit en regard de la surface.
Selon un mode de réalisation, le procédé de préparation du dispositif selon l'invention comprend une étape supplémentaire de cryopréservation du dispositif.
Selon un mode de réalisation, les péricytes et les cellules endothéliales sont disposées en couches superposées dans le compartiment luminal. De préférence dans les procédés selon l'invention les péricytes sont ensemencées avant les cellules endothéliales. De manière préférée alors, les péricytes sont disposés sur ou au contact de la membrane synthétique poreuse et les cellules endothéliales sont disposées au-dessus des péricytes, ces derniers étant donc en contact étroit avec les cellules endothéliales. Le ratio d'ensemencement péricytes/cellules endothéliales peut varier, il peut notamment être choisi de manière à correspondre au ratio présent dans la BHE étudiée, par exemple la BHE humaine. De préférence, le ratio d'ensemencement péricytes/cellules endothéliales est compris environ entre 1/2 et 1/4 et est de manière préférée environ 1/3 (correspondant au ratio dans la BHE humaine). De préférence la membrane synthétique poreuse est en contact avec les cellules de chaque compartiment.
Dans un mode de réalisation spécifique, l'étape d'ensemencement de la membrane synthétique poreuse avec des péricytes et des cellules endothéliales comprend en outre l'ajout de cellules sanguines, et de manière préférée des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMCs). De manière préférée l'ajout de cellules sanguines a lieu après l'ensemencement des péricytes et des cellules endothéliales.
Dans un mode de réalisation spécifique, la ou les étapes d'ensemencement avec des astrocytes comprennent aussi l'ensemencement de microglie. De préférence les astrocytes et la microglie sont cultivés ensemble avant d'être ensemencés dans le dispositif. Le ratio d'ensemencement microglie/astrocytes peut varier, il peut notamment être choisi de manière à correspondre au ratio présent dans la BHE étudiée, par exemple la BHE humaine. De préférence, le ratio d'ensemencement microglie/astrocytes est d'environ 5% (correspondant au ratio dans la BHE humaine).
De préférence, la ou les étapes d'ensemencement avec des astrocytes ne comprennent pas d'ensemencement de péricytes.
De manière préférée, toutes les cellules ensemencées selon le procédé de l'invention proviennent d'une même espèce animale, en particulier de mammifères. Selon un mode de l'invention, les cellules sont des cellules de rongeurs, de manière préférée des cellules de souris. Selon un autre mode de l'invention, les cellules sont des cellules de primates, de manière préférée des cellules humaines.
Suivant un mode de réalisation, un ou plusieurs types cellulaires du procédé selon l'invention sont issus de cultures de cellules immortelles. Dans un mode de réalisation particulier, tous les types cellulaires sont issus de cellules immortelles.
Dans un mode préférentiel, un ou plusieurs types cellulaires du procédé selon l'invention sont issus de cultures primaires de manière préférée tous les types cellulaires sont issus de cultures primaires. Dans une variante un ou plusieurs types cellulaires du procédé selon l'invention sont issus de cultures primaires de tissus prélevés sur des individus de même âge, de manière préférée tous les types cellulaires sont issus de cultures primaires de tissus prélevés sur des individus de même âge. Selon un mode de réalisation de l'invention, un ou plusieurs et de préférence tous les types cellulaires sont issus d'individus adultes.
Ainsi selon une variante du procédé selon l'invention les cellules endothéliales et les péricytes sont issus de cultures primaires de cellules de souris et de manière préférée de souris adultes. De manière particulièrement préférée, les cellules endothéliales et les péricytes sont issus de cultures primaires de cellules de souris âgées d'au moins 3 mois, plus particulièrement d'au moins 6 mois et dans un mode préféré d'au moins 12 mois.
Ainsi selon une variante du procédé selon l'invention tous les types cellulaires sont issus de cultures primaires de cellules de souris et de manière préférée de souris adultes. De manière particulièrement préférée, tous les types cellulaires sont issus de cultures primaires de cellules de souris âgées d'au moins 3 mois, plus particulièrement d'au moins 6 mois et dans un mode préféré d'au moins 12 mois.
Lorsqu'un ou plusieurs types cellulaires du procédé selon l'invention sont issus de cultures primaires, alors, selon un mode de réalisation particulier, un ou plusieurs de ces types cellulaires sont des types cellulaires modèles de pathologies.
L'invention a aussi pour objet l'utilisation du dispositif selon l'invention et en particulier son utilisation comme modèle de la BHE. L'invention a aussi pour objet l'utilisation du dispositif selon l'invention comme modèle de BHE pathologique.
En particulier le dispositif peut être utilisé pour tester la perméabilité du modèle. En effet, ce dispositif peut être utilisé pour étudier sa perméabilité à :
- des molécules, notamment thérapeutiques (notamment des petites molécules biologiques ou de synthèse, des anticorps, des psychotropes, etc.),
- des virus (notamment VIH),
- des spores (comme les spores bactériens, les spores de champignons, les spores de végétaux, etc ., par exemple pour l'étude des infections fongiques telle que certaines méningites), ou encore
- des exosomes (notamment pour l'étude de la propagation des cancers),
- des liposomes ou des nanoparticules,
- des acides nucléiques nus ou vectorisés, - des cellules (notamment PBMCs, cellules cancéreuses, bactéries etc ..) ;
ci-après dénommés « composés ».
Ainsi l'invention concerne l'utilisation du dispositif selon l'invention pour tester la perméabilité du modèle à un composé comprenant les étapes :
a) ajout dudit composé dans un des compartiments du dispositif,
b) incubation du dispositif,
c) détection et analyse de la présence du dit composé et/ou de ses métabolites dans le compartiment où l'ajout dudit composé n'a pas eu lieu, et éventuellement
d) en déduire la perméabilité du modèle vis-à-vis de ce composé.
Avantageusement, lors de l'étape a), une quantité connue du composé est ajoutée et l'étape c) permet de mesurer la quantité de composé ou de ses métabolites dans le compartiment où l'ajout n'a pas eu lieu. En outre il est également possible de détecter et analyser la présence du dit composé ou de ses métabolites dans le compartiment où l'ajout a eu lieu, notamment afin de déterminer la quantité restante de ce composé dans ledit compartiment.
Des techniques de détection et d'analyse de la présence du composé (ou de ses métabolites) mentionné ci-dessus sont bien connues dans la technique. Par exemple, la détection ou l'analyse de la présence de composé peut être effectuée par diverses techniques de chimie analytique suivant le composé étudié dont l'HPLC couplée à une, voire deux spectrométries de masse. Avantageusement le composé pourra être marqué afin de faciliter sa détection. En effet si on dispose de composés fluorescents ou radiomarqués (en particulier des traceurs qui seraient utilisés en diagnostic et radiomarqués, par exemple au Fluor 18 ou Carbone 1 1 ), des lecteurs de l'intensité de fluorescence ou des compteurs de la radioactivité respectivement, peuvent être utilisés pour quantifier le composé marqué ou ses métabolites marqués dans les compartiments luminal et abluminal.
L'invention concerne en outre l'utilisation du dispositif selon l'invention pour étudier la physiopathologie d'une maladie, tester des molécules à visée préventive, thérapeutique ou diagnostique ciblant les acteurs cellulaires et moléculaires de la BHE ou tester des conditions physiques ou tester des protocoles. Par « étudier la physiopathologie d'une maladie » on entend étudier l'impact de maladies sur les caractéristiques la BHE, telles que la perméabilité, la sélectivité, la résistance électrique, la morphologie des cellules etc.... Dans ce mode de réalisation, le dispositif comprend alors au moins un type cellulaire modèle de la pathologie étudiée. Dans un mode de réalisation l'expression de protéines et/ou la fonctionnalité de transporteurs de la BHE comme par exemple de la Glycoprotéine P (P-gp) ou du transporteur au glucose GLUT1 sont comparées dans des dispositifs comprenant au moins un type cellulaire modèle de la pathologie étudiée et des dispositifs ne comprenant aucun type cellulaire modèle de cette pathologie. L'expression de protéines peut être évaluée par Western Blot, ELISA, ou expression de gènes (RTqPCR).
Par « tester des molécules à visée préventive, thérapeutique ou diagnostique ciblant les acteurs cellulaires et moléculaires de la BHE » on entend étudier l'impact de ces molécules sur la BHE et éventuellement leur passage à travers la BHE. Dans ce mode de réalisation, au moins une molécule à tester est appliquée au dispositif selon l'invention, et après un temps d'exposition ou d'incubation, le dispositif est analysé afin de déterminer les changements qui ont été provoqués par ladite au moins une molécule testée. Ces changements peuvent en particulier concerner la perméabilité, la sélectivité, la résistance électrique, la morphologie des cellules etc .. On peut notamment étudier le résultat de l'ajout de la molécule sur la cible en comparant la fonctionnalité et/ou l'expression de cette cible dans des dispositifs dans lesquels la molécule à tester a été appliquée à des dispositifs dans lesquels elle n'a pas été appliquée. On peut également étudier le passage à travers la BHE de la molécule dans un dispositif selon l'invention et en particulier en ajoutant en outre au moins un inhibiteur de transporteurs de la BHE ou une condition physique.
Par « tester des conditions physiques », on entend étudier l'impact de ces conditions sur la BHE et éventuellement leur influence sur le passage de composés à travers la BHE. Dans ce mode de réalisation, au moins une condition physique est appliquée au dispositif selon l'invention. Après un temps d'exposition ou d'incubation, le dispositif est analysé afin de déterminer les changements qui ont été provoqués par ladite au moins une condition physique testée. Ces changements peuvent en particulier concerner la perméabilité, la sélectivité, la résistance électrique, la morphologie des cellules etc .. On peut notamment étudier le résultat de l'ajout de la condition physique en la comparant à un dispositif sur lequel la condition physique n'a pas été appliquée. Par « condition physique », on entend en particulier l'utilisation d'ondes telles que des ondes magnétiques, électromagnétiques ou encore des ultrasons.
Par « tester des protocoles » on entend étudier l'impact d'un traitement au niveau de la BHE. Dans ce mode de réalisation, au moins un traitement, c'est-à-dire une condition physique ou une molécule, est appliqué à un composé tel que définis ci-dessus, ce composé est ensuite mis en contact avec la BHE. Après un temps d'exposition ou d'incubation, le dispositif est analysé afin de déterminer les changements qui ont été provoqués par ledit traitement. Ces changements peuvent en particulier concerner la perméabilité, la sélectivité, la résistance électrique, la morphologie des cellules etc .. On peut notamment étudier le résultat du traitement en le comparant à un dispositif mis en contact avec un composé qui n'a pas été traité.
L'invention va être maintenant décrite plus en détail à l'aide d'exemples pris à titre non limitatif.
Figures :
Figure 1 : Schéma de préparation d'un dispositif comprenant des cultures de cellules primaires selon l'invention.
À J1 , les astrocytes et la microglie sont décongelés et les cellules endothéliales et les péricytes sont purifiés à partir de cerveaux de souris. Les PBMCs sont extraits du sang périphérique de souris.
À J3, le milieu de culture des cellules est renouvelé avec arrêt de l'effet de la puromycine dans le milieu des cellules endothéliales.
À J5, le milieu de culture des cellules est à nouveau renouvelé.
À J8, des astrocytes et de la microglie, représentés par des points « . », sont ensemencés dans une boîte de culture. Les milieux de culture des autres cellules sont renouvelés. À J10, les cellules de microglie sont observables.
À J1 1 , des astrocytes et de la microglie sont ensemencés sur la membrane synthétique poreuse.
À J12, la membrane synthétique poreuse est déposée dans la boite de culture de sorte que les deux cultures d'astrocytes soient en contact, formant ainsi le compartiment abluminal. Puis les péricytes et les cellules endothéliales, représentés par des carrés et des ronds («□ », « o ») sont ensemencés sur la face supérieure de la membrane synthétique poreuse, formant ainsi le compartiment luminal. Le traitement du dispositif à l'hydrocortisone débute.
À J15, le traitement du dispositif à l'hydrocortisone est terminé, les PBMCs, représentés par des croix « + », sont ensemencés dans le compartiment luminal. Le modèle est prêt à être utilisé.
Figure 2 : Perméabilité paracellulaire du dextran-FITC sur un dispositif selon l'invention comprenant des cultures de cellules primaires issues de souris modèles pour Alzheimer (AD) ou de souris sauvages (Wild Type, WT).
Le test de perméabilité des dispositifs est réalisé avec du dextran-FITC 4kD. Les milieux de culture sont remplacés par 1 mL d'HBSS Ca27Mg2+ dans le compartiment abluminal et 500 μί de dextran-FITC dans le compartiment luminal (soit 2.10"6 moles). Des prélèvements de 50 μί dans les compartiments luminal et abluminal sont réalisés à 0 min, 10 min, 20 min, 30 min, 1 h et 1 h30 et déposés dans des puits d'une plaque noire de 96 puits, lue sur le lecteur Varioskan (Thermo Scientific). La longueur d'onde d'excitation (Aex) du dextran-FITC est de 485 nm et la longueur d'émission (Aem) est de 515 nm. La figure 2 représente les résultats obtenus pour le compartiment abluminal sous forme de courbe. *p<0,05, **p<0,01 par rapport au dispositif contrôle qui correspond à un dispositif sans cellule mais recouvert de la même matrice de « coating » que les autres dispositifs étudiés (AD versus WJ).
La perméabilité du dispositif AD reste plus élevée comparativement au dispositif WT (46%), indiquant une moins bonne étanchéité du dispositif pathologique par rapport au dispositif sain. Le test statistique utilisé est le test de Kruskal-Wallis suivi du test de Dunn pour des comparaisons multiples.
Figure 3 : Coefficient de perméabilité paracellulaire du dextran-FITC sur un dispositif selon l'invention comprenant des cultures de cellules primaires issues de souris sauvages (WT).
Le calcul du coefficient de perméabilité Pe se fait grâce à cette formule :
Pe = dQ/(dT*A*Co)
Pe : coefficient de perméabilité (cm/s)
dQ: quantité transportée (mol)
dT : temps d'incubation (seconde) A : surface de la membrane synthétique poreuse (ici 1 ,12 cm2)
Co : concentration initiale (4.10 6 mol/cm3)
La détermination de dQ est réalisée selon le calcul suivant :
(Intensité de fluorescence abluminale à 1 h)*2.10~6/(lntensité de fluorescence luminale à T0)
L'intensité de fluorescence est proportionnelle à la quantité de dextran-FITC présente dans chaque compartiment (abluminal et luminal).
Le coefficient de perméabilité est représenté en figure 3 et a été calculé au bout d'une heure. Les résultats représentent la moyenne ± SEM (écart standard moyen) du coefficient de perméabilité de 3 à 4 dispositifs dans chaque groupe.*p<0.01 par rapport au dispositif contrôle qui correspond à un dispositif sans cellule mais recouvert de la même matrice de « coating » que le dispositif WT. Le test statistique utilisé est le test de Mann Whitney.
Figure 4 : Fonctionnalité de la glycoprotéine P dans le dispositif selon l'invention.
Ce test de fonctionnalité est réalisé avec la rhodamine 123, car il est connu que cette molécule en tant que substrat de la glycoprotéine P est expulsée par la glycoprotéine P vers le compartiment luminal, ce qui limite son passage à travers le dispositif. Les milieux de culture sont renouvelés : 1 mL dans le compartiment abluminal et 250 μ\- dans le compartiment luminal contenant ou pas l'inhibiteur Zosuquidar de la glycoprotéine P à 5 μΜ (Dantzig et al. 1996). Les dispositifs sont incubés 2h dans l'incubateur. Puis, 250 μ\- de milieu contenant de la rhodamine 123 à 2 μΜ avec ou sans Zosuquidar à 5 μΜ sont ajoutés dans le compartiment luminal et incubés 1 h dans l'incubateur. Des prélèvements de 50 μί dans les compartiments luminal et abluminal sont effectués juste après l'ajout du milieu contenant la rhodamine 123 et après 1 heure d'incubation à 37°C. Les prélèvements sont déposés dans des puits d'une plaque noire de 96 puits. La lecture de l'intensité de fluorescence se fait sur le même appareil que pour le test de perméabilité (décrit précédemment). La Aex de la rhodamine est de 500nm et la Aem est de 524nm.
Sur la Figure 4, les résultats représentent la moyenne ± SEM de l'intensité de fluorescence après 1 h d'incubation des cellules avec la rhodamine 123 (n = 4 à 8 dans chaque groupe). Le passage de la rhodamine 123 à travers le dispositif WT diminue de 72.6% par rapport au dispositif sans cellule (**p<0,01 ). La présence de l'inhibiteur spécifique de la glycoprotéine P inhibe l'efflux de 57.3%. Le test statistique utilisé est le test de Kruskal-Wallis suivi du test de Dunn pour des comparaisons multiples.
Figure 5 : Résistance électrique trans-endothéliale (TEER) dans les dispositifs murins selon l'invention de 12 et 24 puits.
Sur la Figure 5, les résultats représentent la moyenne ± SEM. Pour le format 12 puits (figure 5A), n = 16 contrôles et n = 18 dispositifs au fomat 12 puits. Pour le format 24 puits (figure 5B), n = 12 contrôles et n = 74 dispositifs au format 24 puits. Le test statistique utilisé est le test de Mann Whitney : ****p<0.0001 .
Figure 6 : Coefficient de perméabilité du Dextran-FITC sur les dispositifs murins selon l'invention en format 24 et 96 puits. Le coefficient de perméabilité est représenté en figure 6 et de la même manière que pour la figure 3 au bout d'une heure. Sur la Figure 6, les résultats représentent la moyenne ± SEM. Pour le format 24 puits (figure 6 A), n = 12 contrôles et n = 50 dispositifs. Pour le format 96 puits (figure 6B), n = 8 contrôles et n = 54 dispositifs. Le test statistique utilisé est le test de Mann Whitney : ****p<0.0001 .
Figure 7 : Fonctionnalité de la glycoprotéine P dans le dispositif murins selon l'invention en format 24 et 96 puits.
Sur la Figure 7, les résultats représentent la moyenne ± SEM. Pour le format 24 puits (figure 7A), n = 12 contrôles et n = 9 dispositifs au format 24 puits sans Zosuquidar et n= 10 dispositifs au format 24 puits avec Zosuquidar. Pour le format 96 puits (figure 7 B), n = 7 contrôles et n = 6 dispositifs au format 96 puits sans Zosuquidar et 9 dispositifs au format 96 puits avec Zosuquidar. Le test statistique utilisé est le test de Kruskal-Wallis suivi d'un test de Dunn pour comparaisons multiples : *p<0.05, **p<0.01 , ***p<0.001 .
Figure 8 : Coefficient de perméabilité de 8 molécules sur les dispositifs murins selon l'invention au format 24 et 96 puits.
Les molécules ont été ajoutées dans le compartiment luminal et incubées pendant 48 heures. Les milieux luminal et abluminal ont été ensuite prélevés pour le dosage des molécules. Sur la figure 8 les différents coefficients de perméabilité calculés sont représentés (les résultats représentent la moyenne ± SEM). Les résultats obtenus pour le format 24 puits sont représentés figure 8A, et les résultats obtenus pour le format 96 puits en figure 8B. Figure 9 : Résistance électrique trans-endothéliale (TEER) et coefficient de perméabilité du DEXTRAN-FITC dans le dispositif du commerce.
Sur la Figure 9A est représenté la résistance électrique trans-endothéliale (TEER) (n = 14 contrôles et n=36 dispositifs 24 puits). Sur la figure 9B est représenté le coefficient de perméabilité du DEXTRAN-FITC (n = 8 contrôles et n=23 dispositifs 24 puits). Les résultats représentent la moyenne ± SEM. Le test statistique utilisé est le test de Mann Whitney : ****p<0.0001 .
Figure 10 : Fonctionnalité de la glycoprotéine P dans le dispositif du commerce.
Sur la Figure 10, les résultats représentent la moyenne ± SEM de l'intensité de fluorescence après 1 h d'incubation des cellules avec la rhodamine 123 (n = 4 à 8 dans chaque groupe), n = 3 contrôles et n = 4 dispositifs du commerce 24 puits sans ou avec Zosuquidar. Le test statistique utilisé est le test de Kruskal-Wallis suivi d'un test de Dunn pour comparaisons multiples : *p<0.05.
Figure 11 : Résistance électrique trans-endothéliale (TEER) dans les formats 24 puits après cryoconservation. Sur la Figure 1 1 est représenté la résistance électrique trans-endothéliale (TEER)
(n = 3-4 contrôles et n=2-15 dispositifs au format 24 puits). Les dispositifs aux formats 24 puits ont été cryoconservés 7, 15 ou 30 jours, puis utilisés 4, 5 ou 6 jours postdécongélation. Les résultats représentent la moyenne ± SEM. Le test statistique utilisé est le test de Mann Whitney : *p<0.05, **p<0.01 .
Figure 12 : Coefficient de perméabilité du DEXTRAN-FITC dans les formats 24 puits après cryoconservation.
Sur la figure 8 les différents coefficients de perméabilité calculés sont représentés (n = 8 contrôles et n=2-5 dispositifs au format 24 puits). Les résultats représentent la moyenne ± SEM). Les dispositifs aux formats 24 puits ont été cryoconservés 7, 15 ou 30 jours, puis utilisés 4, 5 ou 6 jours post-décongélation. Le test statistique utilisé est le test de Mann Whitney : *p<0.05, **p<0.01 .
Figure 13 : Résistance électrique trans-endothéliale (TEER) dans les dispositifs murins avec lignées cellulaires immortalisées selon l'invention au format 12 et 24 puits.
Sur la Figure 13, les résultats représentent la moyenne ± SEM. Pour le format 12 puits (figure 13A), n = 20 contrôles et n = 20 dispositifs au format 12 puits. Pour le format 24 puits (figure 13B), n = 10 contrôles et n = 97 dispositifs au format 24 puits. Le test statistique utilisé est le test de Mann Whitney : ****p<0.0001 .
Figure 14 : Coefficient de perméabilité du Dextran-FITC sur les dispositifs murins avec lignées cellulaires immortalisées selon l'invention en format 12, 24 et 96 puits.
Sur la Figure 14, les résultats représentent la moyenne ± SEM. Pour le format 12 puits (figure 14A), n = 10 contrôles et n = 6 dispositifs au format 12 puits. Pour le format 24 puits (figure 14B), n = 17 contrôles et n = 92 dispositifs au format 24 puits. Pour le format 96 puits (figure 14C), n = 12 contrôles et n = 63 dispositifs au format 96 puits. Le test statistique utilisé est le test de Mann Whitney : **p<0.01 , ****p<0.0001 .
Figure 15 : Fonctionnalité de la glycoprotéine P sur les dispositifs murins avec lignées cellulaires immortalisées selon l'invention en format 12, 24 et 96 puits. Sur la Figure 15, les résultats représentent la moyenne ± SEM. Pour le format 12 puits (figure 15 A), n = 4 contrôles et n =2 dispositif au format 12 puits sans ou avec Zosuquidar. Pour le format 24 puits (figure 15B), n = 7 contrôles et n = 9 et 12 dispositif au format 24 puits sans ou avec Zosuquidar. Pour le format 96 puits (figure 15C), n = 12 contrôles et n = 13 et 14 dispositif au format 96 puits sans ou avec Zosuquidar.
Le test statistique utilisé est le test de Kruskal-Wallis suivi d'un test de Dunn pour comparaisons multiples : *p<0.05, **p<0.01 , ***p<0.001 .
Exemple 1 : Préparation d'un dispositif selon l'invention Ce dispositif comprend des cultures primaires de cellules endothéliales, de péricytes, et de PBMCs récoltés à partir de cerveaux de souris. La réalisation de ce dispositif est passée par les différentes étapes techniques suivantes :
Les cellules endothéliales et les péricytes ont été purifiés en utilisant des billes magnétiques pour exclure la myéline et un gradient de Percoll pour dissocier les cellules endothéliales des péricytes.
Les PBMCs ont été extraits à partir du sang périphérique des mêmes souris sur un gradient de Ficoll identique à celui utilisé en hématologie médicale humaine, puis récupérés par centrifugation.
Un stock de co-culture primaire d'astrocytes et microglie a été créé comme suit. Des cultures primaires d'astrocytes et de microglie de souris ont été obtenues à partir de cerveaux de souris nouveaux-nés entre J1 et J3. La dissociation cellulaire du tissu cérébral a été réalisée mécaniquement. Les astrocytes et la microglie ont été sélectionnés par un milieu de culture sélectif. Une semaine après l'ensemencement d'un cerveau de nouveau-né dissocié et cultivé dans un Flacon de 75 cm2 revêtu (coaté) avec de la Poly-L-Lysine, les astrocytes formant un tapis confluent ont été détachés par la trypsine et cryopréservés. La décongélation d'un cône de cellules a été réalisée dans un Flacon de 25 cm2 et 72 h après les astrocytes peuvent être utilisés pour le montage du dispositif. Ces cellules peuvent être subcultivées 3 fois. Les cellules ont été cultivées dans des milieux sélectifs pour chaque type cellulaire jusqu'à l'obtention d'un tapis cellulaire recouvrant toute la surface de la boîte de culture choisie.
Les astrocytes et la microglie ont été ensemencés dans une boîte de culture
(30000 cellules par puits pour une boîte 12 puits).
Puis les astrocytes et la microglie ont également été ensemencés sous une membrane synthétique poreuse incubés pendant 24 heures (voir figure 1 ).
La membrane a été déposée dans la boîte de culture comprenant les astrocytes et de la microglie de sorte que les deux cultures d'astrocytes soient en contact, formant ainsi le compartiment abluminal. Ces cellules modélisent le parenchyme cérébral glial.
Les cellules endothéliales et les péricytes ont été ensemencés sur la membrane
(cellules endothéliales = 106 cellules/membrane et péricytes = 350 000 cellules/membrane dans un puits de boîte 12 puits).
Le dispositif a été incubé 72 h en présence d'hydrocortisone pour favoriser l'expression de la glycoprotéine P au niveau des cellules endothéliales. En effet la glycoprotéine P est une pompe d'efflux importante dans la fonctionnalité de la BHE. Après incubation, le modèle est prêt. Il peut notamment recevoir les PBMCs.
Exemple 2 : Observation par immunomarquage de dispositifs réalisés selon l'exemple 1 Après les tests de perméabilité et de fonctionnalité, les membranes synthétiques poreuses des dispositifs réalisés suivant l'exemple 1 sont lavées deux fois pendant 5 min avec 500 μΙ_ de PBS. 500 μΙ_ d'une solution de paraformaldéhyde (PFA 4 %) sont alors ajoutés dans les compartiments abluminal et luminal durant 15 min à température ambiante. Deux nouveaux lavages de 5 min sont réalisés avec 500 μΙ_ de PBS. Les cellules sont alors bloquées et perméabilisées avec 500 μί de PBS/Triton 0,5 %/BSA 5 % dans les compartiments abluminal et luminal pendant 1 heure à température ambiante. Sur du film plastique de paraffine (parafilm) étiré sur une boîte de pétri, 30 μί d'anticorps primaires (Acl) sont déposés. Les membranes sont alors découpées puis déposées de façon à ce que les cellules soient en contact avec les Acl. Les anticorps utilisés sont les anticorps anti-ZO-1 (dilution 1 /50, marqueur des jonctions serrées, utilisé comme marqueur des cellules endothéliales), anti-aSMA (dilution 1/50, marqueur des péricytes), anti-vWF (dilution 1/50, marqueur des cellules endothéliales) et anti-GFAP (dilution 1/100, marqueur des astrocytes). L'incubation dure une nuit à 4°C en chambre humide. Le lendemain, chaque membrane est délicatement déposée dans un puits d'une boîte 12 puits avec la face des cellules étudiées en haut et lavée deux fois 5 min au PBS sans agitation. 30μί d'Ac II sont déposés sur un nouveau film plastique de paraffine avant d'être incubés pendant 1 heure à température ambiante avec les membranes. La solution d'Ac II contient des anticorps II anti-souris couplés au fluorochrome RRX (fluorescence rouge) et des anticorps II anti-lapin couplés au fluorochrome Alexa 488 (fluorescence verte) dilués tous à 1/50. Après 1 h d'incubation, les lavages se font dans les mêmes conditions que précédemment puis les membranes sont incubées avec 30μί de solution de DAPI (4,6-Diamino-2-Phenylindole) pendant 15 min à température ambiante, à l'abri de la lumière, sur du film plastique de paraffine en chambre humide pour marquer les noyaux des cellules. Les membranes sont de nouveau récupérées pour subir trois lavages de 5 min avec de l'H20 UHQ pour éliminer les sels. Les membranes sont ensuite collées sur une lame de verre avec de la colle au DAPI de façon à ce que le côté collé corresponde à celui des cellules non immunomarquées. Une lamelle de verre est ensuite collée sur la membrane. Les lames sont observées au microscope à épifluorescence (Olympus BX 51 ). Les immunomarquages mettent en évidence les types cellulaires qui composent le modèle de BHE. De plus, nous avons observé que les cellules endothéliales s'organisent en vaisseaux et forment des jonctions serrées entre elles (marquage ZO-1 ), reproduisant ainsi spontanément des caractéristiques importantes de la BHE in vivo. Les péricytes s'organisent autour des cellules endothéliales en établissant des points de contact.
Exemple 3 : Utilisation d'un dispositif selon l'invention comme modèle de la BHE dans le cas de cellules issues de souris modèles d'Alzheimer (AD)
Un dispositif a été préparé selon l'exemple 1 , dans lesquels les cellules endothéliales et les péricytes ont été préparés à partir de souris Alzheimer (APPswePS1 dE9, AD) âgées de 4 à 8 semaines et les astrocytes et la microglie à partir de souriceaux sauvages (WT), appelé ici dispositif Alzheimer (dispositif AD). Ce dispositif a été comparé à un dispositif semblable formé complètement à partir de cellules de souris sauvages (WT), appelé ici dispositif sauvage et à un dispositif semblable dépourvu de cellules, appelé ici dispositif contrôle.
Les résultats sont présentés sur la figure 2.
La présence de cellules permet de diminuer le passage du dextran-FITC (Figure
2). En effet, on observe une diminution significative de 82% du passage du dextran-FITC à travers le dispositif sauvage à 1 heure, puis une diminution de 78% à 1 heure 30 par comparaison au dispositif contrôle sans cellules.
Cette différence de perméabilité, est aussi observée avec le dispositif AD où on obtient une diminution de 60% à 1 heure et 1 heure 30 par comparaison avec le contrôle.
Cependant ces résultats ne sont pas statistiquement significatifs.
De plus, même si la différence observée de la perméabilité entre les dispositifs AD et sauvage n'atteint pas une valeur considérée comme significative par le test statistique, on observe une diminution de 47% du passage du dextran-FITC à travers le dispositif sauvage par comparaison au dispositif AD à 1 heure 30.
Exemple 4 : Test de perméabilité et de fonctionnalité d'un dispositif selon l'invention
Pour tester la perméabilité du dispositif selon l'invention, un dispositif a été préparé selon l'exemple 1 , et du dextran-FITC a été ajouté dans le compartiment luminal du dispositif. La présence du dextran-FITC a été détectée et analysée par fluorescence. Sur la figure 3, on constate que le coefficient de perméabilité est plus élevé avec le dispositif contrôle. On observe une diminution significative du coefficient de perméabilité de 98% respectivement pour le dispositif WT. Cette différence est statistiquement significative. Elle démontre la relative perméabilité du dispositif selon l'invention.
Pour tester la fonctionnalité du dispositif selon l'invention, un dispositif a été préparé selon l'exemple 1 , et de la rhodamine 123 a été ajoutée dans le compartiment luminal dudit dispositif en présence ou non de Zosuquidar. En effet il est connu que la rhodamine 123 en tant que substrat de la glycoprotéine P est expulsée par la glycoprotéine P vers le compartiment luminal, ce qui limite son passage à travers le dispositif. Le Zosuquidar est un inhibiteur de la glycoprotéine P, donc son utilisation devrait limiter l'efflux de rhodamine 123 vers le compartiment luminal.
Sur la figure 4, on observe que le passage de la Rhodamine 123 vers le compartiment abluminal diminue de 72.6% pour le dispositif sauvage par rapport au dispositif contrôle (insert sans cellules). Ces résultats sont statistiquement significatifs. La présence de l'inhibiteur spécifique de la glycoprotéine P inhibe l'efflux de 57.3%. Ces résultats démontrent la fonctionnalité du dispositif selon l'invention. Exemple 5 : Validation d'un dispositif selon l'invention en format de plaque 24 et 96 puits
Le procédé de préparation du dispositif suivi sur ces deux nouveaux formats de BHE est identique à celui décrit dans l'exemple 1 . Seules les densités de chaque type cellulaire ont dû être adaptées.
La pertinence de ces formats a été validée grâce à quatre tests : la résistance électrique trans-endothéliale (TEER), la perméabilité paracellulaire, la fonctionnalité de la Glycoprotéine G (P-gp) et la sélectivité vis-à-vis de 8 molécules.
1 - Résistance électrique trans-endothéliale (TEER) La Résistance électrique trans-endothéliale n'a été mesurée que sur les BHE aux formats 12 et 24 puits car l'électrode n'est pas adaptée au format 96 puits. Elle est exprimée en ohm.cm2 en tenant compte de la surface de l'insert : 1 .12 et 0.33 cm2 pour les inserts de 12 et 24 puits, respectivement. Elle a été mesurée grâce à un ohmètre (Millicell Electrical Résistance System-2, Millipore - [Molsheim] France) en utilisant deux électrodes STX01 : la plus grande est placée dans le compartiment abluminal et la plus petite dans le compartiment luminal. Le système portant les deux électrodes est relié à l'ohmètre pour mesurer la résistance électrique entre les deux compartiments. La valeur affichée sur l'appareil est exprimée en ohm, puis elle est multipliée par la surface de l'insert pour obtenir les résultats en ohm.cm2.
La figure 5 montre que la TEER est significativement augmentée dans les dispositifs selon l'invention par rapport contrôle (c'est-à-dire un dispositif sans cellule).
2- Perméabilité paracellulaire
Comme dans l'exemple 4, le passage du Dextran-FITC a été étudié et le coefficient de perméabilité (Pe) de cette molécule comme témoin de la perméabilité paracellulaire a été calculé (Figure 6).
Les résultats obtenus aussi bien sur le format 24 puits que sur le format 96 puits montrent un coefficient de perméabilité inférieur à 4.10"6 cm/s comme pour le format 12 puits (voir figure 3). 3- Fonctionnalité de la glycoprotéine P (P-gp)
Comme dans l'exemple 4, le passage de la rhodamine 123 en présence ou non de Zosuquidar a été étudié. Les pompes P-gp sont fonctionnelles dans les deux dispositifs au format 24 et 96 puits car la Rhodamine123 est significativement effluée vers le côté luminal et passe donc très peu du côté abluminal. Cette fonctionnalité est bien inhibée par le Zosuquidar connu comme inhibiteur spécifique de la P-gp. Ceci montre que comme pour le format 12 puits, les cellules endothéliales qui expriment la pompe P-gp sont bien polarisées, l'ajout de Rhodamine123 dans le compartiment abluminal entraîne un passage vers le côté luminal comparable à des BHE sans cellule. Les résultats sont présentés sur la figure 7.
4- Sélectivité vis-à-vis de 8 molécules Sur les dispositifs aux formats 24 et 96 puits, le passage de 8 molécules connues pour être capables ou non de traverser la BHE a été étudié.
La Dopamine (DA), la Levodopa (L-DOPA), le Bromazepam (BROMO), la caféine (CAF), le sucrose (SUC), la cyclosporine A (CYCLA), le Zosuquidar (ZOSU), et le Mitotane (MITO) ont été testées à une concentration physiologique et/ou thérapeutique connue dans la littérature chez l'homme.
Dans le tableau 2 ci-dessous sont indiquées les concentrations choisies pour chaque molécule, ainsi que si elles sont connues pour leur capacité à traverser la BHE (+) ou à ne pas traverser la BHE (-).
Tableau 2 : Concentration des molécules utilisées pour le test et capacité de passer à travers la BHE
Les molécules ont été ajoutées dans le compartiment luminal à la concentration indiquée et incubées pendant 48 heures. Les milieux luminal et abluminal ont été ensuite prélevés pour le dosage des molécules.
Pour chaque molécule, le coefficient de perméabilité a été calculé. Les résultats sont présentés dans la figure 8. Les résultats valident le passage de ces molécules à travers les dispositifs de l'invention qui servent ici de modèle de BHE murine, à savoir les 4 premières molécules passent à travers et les 4 dernières ne passent pas (d'où un coefficient de perméabilité très faible pour ces quatre dernières).
Exemple 6 : Comparaison du dispositif selon l'invention à un dispositif du commerce Le dispositif selon l'exemple 1 en format 24 puits a été comparé avec un modèle du commerce (BBB Kit™ (RBT-24H) de Pharmaco-Cell ®) qui correspond à un modèle de BHE primaire préparé à partir de cellules issues de cerveau de rat. Dans ce dispositif du commerce les cellules endothéliales sont ensemencées sur l'insert, les péricytes sous l'insert et les astrocytes de rat au fond du puits.
La mesure de la TEER dans ce modèle montre une bonne résistance électrique transendothéliale en moyenne de 247 ± 17.76 Q.cm2 (voir figure 9 A). Cependant le coefficient de perméabilité du Dextran-FITC est plus élevé que celui du dispositif selon l'invention (voir figure 9 B) (25.850 ± 2.308 x10"6 cm/s versus dispositif de l'invention 3.867 ± 0.333 x10"6 cm/s). L'étanchéité serait donc meilleure sur le dispositif de l'invention d'un facteur 6.7 par rapport à celle du modèle du commerce.
Ici encore la fonctionnalité du modèle du commerce a été évaluée en étudiant le passage de la Rhodamine 123 en présence ou non de l'inhibiteur spécifique de la glycoprotéine P-gp, le Zosuquidar.
Les résultats montrent que la pompe est présente aussi bien du côté luminal qu'abluminal donc les cellules ne sont pas correctement polarisées. Ainsi la Rhodamine123 est autant effluée du côté luminal qu'abluminal quand elle est déposée soit dans le compartiment luminal soit dans le compartiment abluminal (% d'efflux de 97 % quelque soit le côté du dépôt).
Ainsi, aucun effet n'est observé lors de l'inhibition par le Zosuquidar de la pompe P-gp dans le modèle du commerce comme le montre la figure 10 contrairement au dispositif selon l'invention (voir figure 7). Ainsi le dispositif selon l'invention permet d'obtenir un modèle plus similaire à la BHE que le modèle du commerce qui a été testé ici. Exemple 7 : Cryoconservation du dispositif selon l'invention au format 24 puits
La cryoconservation du dispositif permettrait une préparation à la demande et la livraison du dispositif congelé chez le client. Le dispositif en format 24 puits a été cryoconservé avec une solution
CRYOSTOR® commercialisé chez Sigma® (REF : C2874-100ML). Une mesure de la TEER a été effectuée avant la cryoconservation à J15 du montage du dispositif. Les volumes de 100 et 200 μ\- de CRYOSTOR ont été choisis pour la cryoconservation des cellules dans le compartiment luminal et abluminal, respectivement. Une décongélation a été réalisée à J7, à J15 et à J30 post-cryoconservation selon le protocole suivant et l'étanchéité des dispositifs décongelés a été étudiée 4, 5 et 6 jours après décongélation (TEER et coefficient de perméabilité du Dextran-FITC).
- Le jour de la décongélation, préchauffer le milieu de culture EndogroTM complet avec sérum à 37°C,
- Durant tout le processus de décongélation, ne pas toucher la membrane de l'insert avec les pointes ou pipettes pasteur. Ne pas déplacer les inserts. Traiter dispositif par dispositif,
- Une fois le milieu de culture réchauffé, ajouter immédiatement 150 et 300 μΙ_ de milieu de culture EndogroTM complet avec sérum, du côté luminal et abluminal, respectivement,
- Incuber 3 heures à 37°C sous 5% de C02.
- Au bout de 3h, aspirer délicatement les milieux de culture (MC) du côté luminal et abluminal et ajouter 200 et 500 μΙ_ de MC du côté luminal et abluminal, respectivement,
- Incuber à 37°C sous 5% de C02,
- Le lendemain de la décongélation, renouveler le milieu de culture,
- A J4, J5 et J6 des tests de mesure de la TEER et du coefficient de la perméabilité paracellulaire ont été réalisés. Les résultats sont présentés sur les figures 1 1 et 12 respectivement.
Comparativement au dispositif en format 24 puits non cryopréservé, nous observons que la résistance TEER après 7 jours de congélation est du même ordre de grandeur que celle mesurée juste avant la congélation. Pour 15 et 30 jours de congélation, une baisse en moyenne de 26% est observée mais reste non significative.
Quant à la perméabilité paracellulaire, nous constatons que les coefficients de perméabilité sont aussi du même ordre de grandeur après 7 jours de congélation que ceux obtenus sur les BHE non cryconservées (3.278 ± 0.925 versus 3.867 ± 0.333 10~6 cm/s, respectivement). Pour 15 et 30 jours de congélation, le coefficient de perméabilité est compris entre 6 et 20.10"6 cm/s.
Exemple 8 : Dispositif de BHE murine avec lignées cellulaires immortalisées
Des lignée de cellules endothéliales murines et de péricytes murins après immortalisation des cellules primaires en utilisant un procédé déjà publié dans la littérature (Burek et al. 2012) ont été obtenues. Le caractère immortel de ces lignées a été vérifié en réalisant un caryotype montrant une modification du nombre de chromosomes. En temps normal, chez la souris, 2n = 40 chromosomes. Dans les lignées immortelles, la lecture de 16 plaques métaphasiques montre plusieurs anomalies du nombre de chromosomes validant l'immortalisation avec 2n = 39 à 77 chromosomes suivant les plaques lues.
Ces lignées ont un temps de réplication de 48 heures. Ces lignées peuvent être cryoconservées. Les milieux de culture utilisés sont les mêmes que ceux utilisés pour les cultures primaires. Leur caractère immortel conduit à une adhérence cellulaire très élevée.
Le montage du dispositif avec ces cellules suit la cinétique suivante :
- J1 ensemencement des astrocytes/microglie I sous l'insert et au fond du puits
- J2 ensemencement des cellules endothéliales et péricytes sur l'insert
- J3-J4 incubation du modèle 48 heures dans l'incubateur
- A J4 le dispositif est prêt pour toute expérimentation.
Dans le tableau 3 ci-dessous, sont indiquées les densités cellulaires utilisées pour chaque type cellulaire et pour chaque format du dispositif (12, 24 et 96 puits).
Sur les formats 12 et 24 puits, la TEER a été mesurée (voir figure 13) et sur tous les formats la perméabilité paracellulaire (voir figure 14) et la fonctionnalité de la pompe d'efflux P-gp (voir figure 15) ont été évaluées.
Pour ce modèle de BHE, des co-immunomarquages ont été réalisés pour mettre en évidence l'expression de marqueurs moléculaires spécifiques de chaque type cellulaire. Les inventeurs ont ainsi observés que les cellules endothéliales immortalisées expriment dans le dispositif: - la glycoprotéine P,
- les protéines de jonctions serrées : ZO-1 , Claudine-5,
- le facteur vonWillebrand (vWF),
- le récepteur LRP-1 , et
- le récepteur à la transferrine.
Elles n'expriment pas les marqueurs des péricytes α-SMA, NG2, PDGF3R, indiquant que la culture est pure. A contrario les péricytes expriment bien ces 3 marqueurs, et LRP-1 et n'expriment pas la GFAP et le facteur vWF, indiquant une culture pure de péricytes non contaminée par les cellules endothéliales et les astrocytes.
Etanchéité des BHE
Dans la figure 13, sont représentés les résultats de la TEER pour les formats 12 et 24 puits.
La TEER sur le format 12 puits est tout à fait comparable à celle obtenue sur le dispositif avec cultures primaires (voir figure 5 : 12 puits TEER moyenne 218 ± 7.17 n.cm2 et ici pour le modèle avec lignées cellulaires immortelles la TEER moyenne est de 184.60 ± 6.65 Q.cm2). Pour le format 24 puits, la moyenne est de 63.30 ± 1 .35 Q.cm2 alors que le modèle de BHE avec cultures primaires avait une TEER moyenne de 125.50 ± 2.34 Q.crn2.
Pour la perméabilité paracellulaire, les valeurs du coefficient de perméabilité du Dextran-FITC sont représentées dans la figure 14 pour chacun des 3 formats (12, 24 et 96 puits, figure 14 A, B et C respectivement). Quelque soit le format utilisé avec les lignées de cellules endothéliales et péricytes immortalisés à la place des cultures primaires, les résultats montrent que les dispositifs sont étanches et le coefficient de perméabilité moyen est de 12.15 ± 0.92, 10.19 ± 0.44, 9.66 ± 0.50 .10~6 cm/s pour les formats 12, 24 et 96 puits, respectivement. Fonctionnalité des BHE
Les formats 12, 24 et 96 puits sont fonctionnels car ils limitent significativement le passage de la Rhodamine123 du côté abluminal de plus de 60% (voir figure 15). Contrairement aux BHE réalisées avec des cultures primaires, l'inhibiteur spécifique de la Glycoprotéine P ne montre aucun effet sur tous les formats, cela peut être lié à une pompe d'efflux différente de type "Muiti drug résistance" très souvent rencontrée dans les lignées cellulaires.
Référence :
Burek M, Salvador E, Fôrster CY. Génération of an immortalized murine brain microvascular endothelial cell line as an in vitro blood brain barrier model. J Vis Exp. 2012 Aug 29;(66):e4022. doi: 10.3791/4022
Dantzig AH, Shepard RL, Cao J, Law KL, Ehlhardt WJ, Baughman TM, Bumol TF, Starling JJ. Reversai of P-glycoprotein-mediated muitidrug résistance by a potent cyclopropyldibenzosuberane modulator, LY335979. Cancer Res. 1996 Sep 15;56(18):4171 -9.

Claims

REVENDICATIONS
1 . - Dispositif comprenant deux compartiments séparés par une membrane synthétique poreuse, un compartiment luminal comprenant des cellules endothéliales et des péricytes, et un compartiment abluminal comprenant des astrocytes.
2. - Dispositif selon la revendication 1 , dans lequel le compartiment comprenant des astrocytes comprend en outre de la microglie.
3.- Dispositif selon l'une des revendications 1 à 2, dans lequel toutes les cellules proviennent d'une même espèce animale.
4. - Dispositif selon l'une des revendications 1 à 3, dans lequel un ou plusieurs types cellulaires sont issus de cultures primaires.
5. - Dispositif selon l'une des revendications 1 à 3, dans lequel un ou plusieurs types cellulaires sont issus de cultures de cellules immortelles.
6. - Dispositif selon la revendication 4, dans lequel les cellules endothéliales et les péricytes sont issus de cultures primaires d'individu du même âge.
7. - Dispositif selon l'une des revendications 4 et 6, dans lequel un ou plusieurs dudit ou desdits type(s) cellulaire(s) issus de cultures primaires sont des types cellulaires modèles de pathologies.
8. - Procédé de préparation d'un dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, comprenant les étapes suivantes :
a) ensemencement d'astrocytes sur une surface et/ou sur une face de la membrane synthétique poreuse,
b) insertion ou dépôt de la membrane synthétique poreuse sur ladite surface, de telle sorte que si la membrane synthétique poreuse comprend des astrocytes alors la face comprenant les astrocytes est en regard de la surface, c) ensemencement de la face de la membrane synthétique poreuse luminale avec des cellules endothéliales et des péricytes.
9.- Procédé de préparation d'un dispositif selon la revendication 1 , comprenant les étapes suivantes :
a) ensemencement d'astrocytes sur une face de la membrane synthétique poreuse,
b) ensemencement de l'autre face de la membrane synthétique poreuse avec des cellules endothéliales et des péricytes, et éventuellement
c) dépôt de la membrane synthétique poreuse sur une surface de telle sorte que la face comprenant des astrocytes soit en regard de la surface.
10.- Utilisation du dispositif selon l'une des revendications 1 à 7 comme modèle de la barrière hémato-encéphalique (BHE).
1 1 .- Utilisation selon la revendication 10 pour tester la perméabilité du modèle.
12.- Utilisation selon la revendication 10 pour tester la perméabilité du modèle à un composé comprenant les étapes :
a) ajout dudit composé dans un des compartiments du dispositif,
b) incubation du dispositif,
c) détection et analyse de la présence du dit composé et/ou de ses métabolites dans le compartiment où l'ajout dudit composé n'a pas eu lieu.
13 - Utilisation selon la revendication 10 pour étudier la physiopathologie d'une maladie ou tester des molécules à visée préventive, thérapeutique ou diagnostique ciblant les acteurs cellulaires et moléculaires de la BHE ou tester des conditions physiques ou tester des protocoles.
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