WO2018124135A1 - ウロリチン類の製造方法 - Google Patents

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WO2018124135A1
WO2018124135A1 PCT/JP2017/046787 JP2017046787W WO2018124135A1 WO 2018124135 A1 WO2018124135 A1 WO 2018124135A1 JP 2017046787 W JP2017046787 W JP 2017046787W WO 2018124135 A1 WO2018124135 A1 WO 2018124135A1
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WO
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urolithin
microorganism
raw material
production method
clostridium
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PCT/JP2017/046787
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English (en)
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眞丈 工藤
賢則 中島
山本　浩明
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株式会社ダイセル
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
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    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
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    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
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    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
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    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/145—Clostridium

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing urolithins.
  • Urolithins represented by urolithin A and urolithin C are known as metabolites of ellagic acid derived from ellagitannins and the like contained in pomegranate, raspberry, blackberry, cloudberry, strawberry, walnut and the like.
  • ellagitannins are classified into hydrolyzable tannins, and when ingested, they are hydrolyzed and converted to ellagic acid. It is also present as ellagic acid in fruits and the like. So far, for example, regarding the production of urolithins in vivo, it has been clarified by analyzing urine urine in urine that urolithins are produced from ellagitannins such as geraniin in rats (non-patent literature). 1). In humans, urolithins are detected in urine after ingestion of pomegranate extract containing ellagitannin, mainly punicalagin, and urolithin A and urolithin C are reported to be major ellagic acid metabolites. (Non-patent document 2).
  • urolithins are known to have various physiological activities, and are expected to be used as raw materials for pharmaceuticals, cosmetics, and foods and drinks.
  • urolithin A has functions such as an antioxidant effect (Non-patent document 3), an anti-inflammatory effect (Non-patent document 4), an anti-glycation effect (Non-patent document 5), and a mitophagy promoting action (Non-patent document 6). It has been reported that the material has an anti-aging function and is expected to be developed.
  • An object of the present invention is to provide a method for producing other urolithins by removing the 9-position hydroxyl group of urolithins.
  • the present inventors have intensively studied. As a result, the present inventors have completed the present invention by finding a microorganism having the ability to eliminate the 9-position hydroxyl group of urolithins to produce other urolithins. .
  • the present invention is as follows.
  • a method for producing a second urolithin represented by the following general formula (2) comprising the following step (a).
  • R 1 to R 7 each represent a hydroxyl group, a hydrogen atom or a methoxy group, and one or more of R 1 to R 7 are a hydroxyl group.
  • R 1 through R 7 are respectively the same as R 1 to R 7 of the first Urorichin compound represented by the general formula (1).
  • the combination of the first urolithin and the second urolithin is a combination of urolithin M5 and urolithin E, a combination of urolithin M6 and urolithin M7, a combination of urolithin C and urolithin A, or isourolithin A and
  • the microorganisms belonging to the genus Clostridium are from microorganisms belonging to Clostridium bolteae, microorganisms belonging to Clostridium asparagiforme, and microorganisms belonging to Clostridium citroniae.
  • the microorganism belonging to Clostridium bolteae is one or more selected from the group consisting of Clostridium bolteae JCM 12243, DSM 15670, and DSM 29485. [4] The manufacturing method as described in.
  • the urolithin C is obtained by causing a microorganism having the ability to produce urolithin C from the urolithin C raw material to produce it from the urolithin C raw material in a solution containing the urolithin C raw material.
  • the manufacturing method of description [10] The production method according to [8], further including the following step (b1), wherein the step (a) and the step (b1) are performed in the same system.
  • Step (b1) A step of generating urolithin C from a raw material of urolithin C in a solution containing the raw material of urolithin C by a microorganism having an ability to generate urolithin C from the raw material of urolithin C.
  • the microorganism belonging to the genus Gordonibacter is a microorganism belonging to Gordonibacter pamelaeae and / or a microorganism belonging to Gordonibacter urolithinfaciens. 11].
  • the production method according to [12], wherein the microorganism belonging to Gordonibacter pamelaeae is Gordonibacter pamelaeae DSM 19378 strain.
  • the production according to [12] or [13], wherein the microorganism belonging to Gordonibacter urolithinfaciens is Gordonibacter urolithinfaciens DSM 27213 strain Method.
  • the solution containing urolithin C further comprises one or more selected from the group of inclusion compounds consisting of ⁇ -cyclodextrin, ⁇ -cyclodextrin and ⁇ -cyclodextrin, [8] The production method according to any one of [17]. [19] The production method according to [18], wherein the inclusion compound is 0.1 equivalent to 5.0 equivalent in terms of a total molar ratio with respect to the urolithin C.
  • the solution containing the raw material of urolithin C further includes at least one selected from the group of inclusion compounds consisting of ⁇ -cyclodextrin, ⁇ -cyclodextrin and ⁇ -cyclodextrin
  • the production method according to any one of [10] to [19].
  • a method for producing a food or drink containing urolithin A comprising the following steps (a1) and (c).
  • Step (a1) causing a microorganism having an ability to produce urolithin A from urolithin C to produce urolithin A from urolithin C in a solution containing urolithin C; and Step (c): A step of blending urolithin A produced in the step (a1) and a food / beverage material to make a food / beverage product.
  • the present invention it is possible to provide a method for producing other urolithins by removing the hydroxyl group at the 9-position from urolithins having a hydroxyl group at the 9-position.
  • the urolithins obtained by the production method of the present invention are used for cosmetics, quasi-drugs, medical supplies, hygiene products, pharmaceuticals, foods and drinks (including supplements), etc., thereby providing antioxidant, anti-inflammatory, anti-antioxidant and anti-inflammatory properties. Effects such as saccharification and mitophagy-promoting action can be expected.
  • accession number of the strain starting with the word “DSM” is the number assigned to the microorganism stored in DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH).
  • accession number of the strain starting with the word “JCM” is a number assigned to the microorganism stored in the RIKEN BioResource Center.
  • the present invention includes a method for producing urolithins (first invention) and a method for producing food and drink containing urolithins (second invention).
  • first invention a method for producing urolithins
  • second invention a method for producing food and drink containing urolithins
  • Table 1 lists specific examples of urolithins.
  • the method for producing urolithins according to the first aspect of the present invention includes the following step (a), but may include other steps.
  • Step (a) In the step (a), a second urolithin represented by the following general formula (2) is generated from the first urolithin in a solution containing the first urolithin represented by the following general formula (1). This is a step of causing a microorganism having the ability to produce the second urolithin from the first urolithin.
  • R 1 to R 7 each represent a hydroxyl group, a hydrogen atom or a methoxy group, and one or more of R 1 to R 7 are a hydroxyl group.
  • R 1 through R 7 are respectively the same as R 1 to R 7 of the first Urorichin compound represented by the general formula (1).
  • first urolithins include urolithin C, urolithin D, urolithin M4, urolithin M5, urolithin M6, and isouroritin A.
  • the second urolithins are the same as the first urolithins except that the 9-position hydroxyl group of the first urolithins is eliminated.
  • the first urolithins of the present invention are preferably urolithin M5, urolithin M6, urolithin C and isouroritin A.
  • the second urolithins of the present invention are urolithin E, urolithin M7 and urolithin A, respectively. , Urolithin B.
  • the microorganism having the ability to produce the second urolithin from the first urolithin is particularly a microorganism having the ability to produce the second urolithin from the first urolithin.
  • it does not restrict
  • specific examples thereof include microorganisms belonging to the genus Clostridium. More specifically, microorganisms belonging to Clostridium bolteae, microorganisms belonging to Clostridium asparagiforme, microorganisms belonging to Clostridium citroniae can be mentioned.
  • microorganisms belonging to Clostridium bolteae there are DSM 29485 strain, DSM 15670 strain, and JCM 12243 strain.
  • DSM 15981 strain can be mentioned.
  • DSM 19261 strain can be mentioned.
  • the above microorganisms may be used alone or in combination of two or more, regardless of genus, species and strain.
  • the microorganism having the ability to produce the second urolithin from the first urolithin in the first invention of the present invention is not limited to the same strain as the deposited strain, and DSM 29485 strain, DSM 15670 strain , JCM 12243 strain, DSM 15981 strain, and DSM 19261 strain may be substantially equivalent strains.
  • a substantially equivalent strain has a base sequence of 16S rRNA gene having a homology of 97.5% or more, preferably 98% or more, more preferably 99% with the base sequence of 16S rRNA gene of each of the above strains It has a microorganism.
  • the microorganism having the ability to produce the second urolithin from the first urolithin is a mutation treatment, gene from any strain or a strain substantially equivalent thereto, as long as the effect of the present invention is not impaired. It may be a strain bred by recombination, selection of a natural mutant, or the like. This applies to all the microorganisms described herein.
  • the microorganism having the ability to produce the second urolithin from the first urolithin includes the stationary cell.
  • a stationary cell is a cell that is removed from the cultured microorganisms by centrifugation or other operation, washed with a salt solution such as water or physiological saline, or a buffer solution, and suspended in the same solution as the washing solution.
  • a salt solution such as water or physiological saline, or a buffer solution
  • it refers to a cell having a metabolic system capable of producing at least a second urolithin from the first urolithin.
  • buffer solution phosphate buffer solution, Tris-HCl buffer solution, citrate-phosphate buffer solution, citrate buffer solution, MOPS buffer solution, acetate buffer solution, glycine buffer solution and the like are preferable.
  • the pH and concentration of the buffer solution can be appropriately adjusted according to conventional methods. All the microorganisms described in this specification contain a stationary cell, and the definition is the same as the above.
  • the solution containing the first urolithin refers to the microorganism having the ability to produce the second urolithin from the first urolithin in the solution from the first urolithin.
  • the second urolithins can be generated.
  • a medium is preferable, and a medium described in the column “Generation of second urolithin by culture and culture” described later is more preferable.
  • the salt solution and buffer solution which were mentioned above are preferable.
  • the “medium” described in this specification refers to a solution that can grow microorganisms, including a minimal medium, and includes solutions that cannot grow microorganisms, such as the salt solutions and buffer solutions described above. Make it not exist.
  • the first urolithins When the first urolithins are added to the solution, they may be added before or during the production of the second urolithins, or they may be added all at once, in a batch, sequentially, or continuously. .
  • the content of the first urolithin in the solution is usually 0.01 g / L or more, preferably 0.1 g / L or more, more preferably 1 g / L or more. On the other hand, it is usually 100 g / L or less, preferably 20 g / L or less, more preferably 10 g / L or less.
  • the solution is preferably a culture medium.
  • the medium is not particularly limited.
  • ANAEROBE BASAL BROTH ABB medium
  • CM0643 Wilkins-Chalgren Anaerobe Broth
  • GAM medium manufactured by Nissui Pharmaceutical, modified GAM medium, etc.
  • generates 2nd urolithin from 1st urolithin to these culture media.
  • the inducer include urolithins other than the first urolithin and the second urolithin, precursors thereof; ellagic acid; ellagitannins, which are precursors of ellagic acid, and the like. 1 type or 2 types or more may be sufficient.
  • a water-soluble organic substance can be added to a culture medium as a carbon source. The following compounds can be listed as water-soluble organic substances.
  • sugars such as glucose, arabinose, sorbitol, fructose, mannose, sucrose, trehalose, xylose; alcohols such as glycerol; organic acids such as valeric acid, butyric acid, propionic acid, acetic acid, formic acid, fumaric acid, etc. I can do it.
  • the concentration of organic matter added to the medium as a carbon source can be adjusted as appropriate for efficient growth. Generally, the addition amount can be selected from the range of 0.1 to 10 wt / vol%.
  • a nitrogen source can be added to the medium.
  • various nitrogen compounds that can be used for ordinary fermentation can be used.
  • Preferable inorganic nitrogen sources include ammonium salts and nitrates, and more preferably ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium hydrogen phosphate, potassium nitrate, and sodium nitrate.
  • examples of organic nitrogen sources include amino acids, yeast extracts, peptones (eg, polypeptone N), meat extracts (eg, Ehrlich skipjack extract, Lab-Remco powder, bouillon, etc.), liver extract, digested serum powder, etc. I can do it.
  • inorganic compounds such as cofactors such as vitamins and various salts
  • growth and activity may be enhanced.
  • microorganism growth cofactors derived from animals and plants such as inorganic compounds and vitamins include the following.
  • reducing agents such as cysteine, cystine, sodium sulfide, sulfite, ascorbic acid, glutathione, thioglycolic acid, rutin and enzymes that decompose reactive oxygen species such as catalase and superoxide mutase into the medium. Growth may be good.
  • the gas phase and aqueous phase during the culture preferably contain no air or oxygen.
  • nitrogen and / or hydrogen are contained in an arbitrary ratio
  • nitrogen and / or carbon dioxide are contained in an arbitrary ratio.
  • the proportion of hydrogen in the gas phase is usually 0.5% or more, preferably 1.0% or more, more preferably 2.0% or more, since the production of the second urolithin is promoted. Usually, it is 100% or less, preferably 20% or less, more preferably 10% or less.
  • the gas phase is replaced with the above gas before the culture, and in addition, during the culture, from the bottom of the incubator.
  • a method of supplying and / or supplying to the gas phase part of the incubator, a method of bubbling the aqueous phase with the above gas before culturing, and the like can be employed.
  • hydrogen gas may be used as it is.
  • a hydrogen raw material such as formic acid and / or a salt thereof may be added to the medium, and hydrogen may be generated during the culture by the action of microorganisms.
  • the air flow rate examples include 0.005 to 2 vvm, and 0.05 to 0.5 vvm is preferable.
  • the mixed gas can also be supplied as nanobubbles.
  • the culture temperature is preferably 20 ° C to 45 ° C, more preferably 25 ° C to 40 ° C, and still more preferably 30 ° C to 37 ° C.
  • the pressurizing condition of the incubator is not particularly limited as long as it is a condition that allows growth, but may be in the range of 0.001 to 1 MPa, preferably 0.01 to 0.5 MPa.
  • the culture time is usually 8 to 340 hours, preferably 12 to 170 hours, more preferably 16 to 120 hours.
  • generation of 2nd urolithins may be accelerated
  • the surfactant include Tween 80, and can be added in an amount of about 0.001 g / L to 10 g / L.
  • the adsorbent include cellulose and derivatives thereof; dextrin; Diaion HP series and Sepabeads series, which are hydrophobic adsorbents manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation; and Amberlite XAD series manufactured by Organo Corporation.
  • inclusion compound examples include ⁇ -cyclodextrin, ⁇ -cyclodextrin, ⁇ -cyclodextrin, cluster dextrin (highly branched cyclic dextrin), and the like. Of these, ⁇ -cyclodextrin may be most effective.
  • generation of 2nd urolithin may be further accelerated
  • the amount added is generally 0.1 equivalents or more, preferably 0.5 equivalents or more, more preferably 1.0 equivalents or more in terms of the total molar ratio with respect to the first urolithin. It is 0 equivalent or less, preferably 2.5 equivalent or less, more preferably 2.0 equivalent or less.
  • the first urolithin in the first invention of the present invention may be prepared by any method. For example, what was synthesize
  • the second urolithin produced in the first invention of the present invention is used as a food or drink
  • Examples of the chemical synthesis method include the method described in Non-Patent Document 7.
  • a fermentation method in a solution containing the raw material of the first urolithin, a microorganism having the ability to generate the first urolithin from the raw material of the first urolithin is generated from the raw material of the first urolithin. Can be obtained.
  • Steps that may be included before step (a) After producing the first urolithin by fermentation, the first urolithin can be separated and / or purified and applied to the step (a) as the first urolithin in the step (a). However, without separation and / or purification, the solution containing the first urolithin can be applied to the step (a) as the first urolithin of the step (a) as it is or after dilution or concentration. .
  • Step (pre-a1) In a solution containing the raw material of the first urolithin, the microorganism having the ability to generate the first urolithin from the raw material of the first urolithin is transferred from the raw material of the first urolithin. The process of producing
  • Step (pre-a2) The first urolithin produced in the step (pre-a1) is separated and / or purified, and the separated and / or purified first urolithin is used in the step (a).
  • Step (b) The method for producing urolithins according to the first invention of the present invention further includes the following step (b) in addition to the step (a), wherein the step (a) and the step (b) are the same system. Preferably, it is done.
  • step (a) and (b) are carried out in the same system in the step (b) in the solution containing the first urolithin raw material from the first urolithin raw material to the first urolithin.
  • the produced first urolithin is directly used as the first urolithin in step (a).
  • a series of flows until the second urolithins are produced in the step (a) is continuously performed in the same system. That is, it means that the step of separating and / or purifying the first urolithin produced in the step (b) is not included between the step (b) and the step (a).
  • a microorganism having the ability to produce the first urolithin from the raw material of the first urolithin and a microorganism having the ability to produce the second urolithin from the first urolithin are the same culture solution. Inoculating and cultivating the second urolithin, and the like. Both microorganisms may be the same microorganism or different microorganisms.
  • the step (b) is read as the step (b1).
  • the raw material for the first urolithin may be prepared by any method. The same applies to the raw material of the first urolithin, further to the raw material, and thereafter. For example, what was synthesize
  • the chemical synthesis method include the method described in Non-Patent Document 7.
  • the first urolithin is added to a microorganism having the ability to generate the raw material of the first urolithin from the raw material of the first urolithin.
  • generate from the raw material of the kind of raw material is mentioned.
  • the first invention of the present invention may include the following steps.
  • the first invention of the present invention may include, for example, a step of quantifying the obtained second urolithin.
  • the quantification method can follow a conventional method. For example, ethyl acetate to which an acid such as formic acid is added as necessary is added to the culture solution, and the mixture is vigorously stirred and then centrifuged to remove the ethyl acetate layer. The same operation is performed several times as necessary, and these ethyl acetate layers are combined to obtain a urolithin extract.
  • the extract is concentrated under reduced pressure using an evaporator or the like, dried to dryness, and dissolved in methanol.
  • a membrane such as a polytetrafluoroethylene (PTFE) membrane, and the insoluble matter is removed and subjected to high-performance liquid chromatography.
  • PTFE polytetrafluoroethylene
  • Examples of conditions for high performance liquid chromatography include, but are not limited to, the following.
  • 1st invention of this invention may also include the process of refine
  • purification treatment in the purification process sterilization of microorganisms by heat, etc .; sterilization by microfiltration (MF), ultrafiltration (UF), etc .; removal of solids and polymer substances; extraction by organic solvents and ionic liquids
  • a treatment such as adsorption or decolorization using a hydrophobic adsorbent, an ion exchange resin, an activated carbon column or the like can be performed.
  • the concentration treatment in the concentration step include concentration by an evaporator, a reverse osmosis membrane or the like.
  • the solution containing the second urolithin can be pulverized by freeze drying, spray drying, or the like. In pulverization, excipients such as lactose, dextrin and corn starch can be added.
  • the first urolithin is urolithin C
  • the second urolithin is urolithin A
  • the microorganism capable of generating the second urolithin from the first urolithin is Clostridium.
  • the microorganism belongs to the genus. That is, it is the manufacturing method of urolithin A including the following process (a1).
  • Step (a1) A step of producing urolithin A from urolithin C in a microorganism belonging to the genus Clostridium having the ability to produce urolithin A from urolithin C in a solution containing urolithin C.
  • Examples of the inclusion compound in this embodiment include ⁇ -cyclodextrin, ⁇ -cyclodextrin, ⁇ -cyclodextrin, cluster dextrin (highly branched cyclic dextrin), and the like.
  • ⁇ -cyclodextrin is most effective, and ⁇ -cyclodextrin and ⁇ -cyclodextrin are also effective.
  • generation of urolithin A may be further accelerated
  • urolithin C (Raw material of urolithin C)
  • the raw material of urolithin C include ellagic acid; ellagitannins such as punicalazine and geraniin, which are precursors of the ellagic acid; urolithin D and urolithin M6, which are precursors of urolithin M5 and urolithin C, and the like.
  • Ellagic acid and / or ellagitannin are preferred.
  • the plant that produces ellagic acid and ellagitannin is not particularly limited, and examples thereof include pomegranate, raspberry, blackberry, cloudberry, boysenberry, strawberry, walnut, and ginger.
  • the raw material of urolithin C may be any material as long as it can produce urolithin C from the raw material of urolithin C in a solution containing the raw material of urolithin C, and can generate urolithin C from the raw material of urolithin C. 1 type or 2 types or more may be sufficient.
  • the microorganism having the ability to produce urolithin C from the raw material of urolithin C is not particularly limited.
  • microorganisms belonging to the genus Gordonibacter and microorganisms belonging to the genus Eggerthella are preferred.
  • microorganisms belonging to the genus Gordonibacter microorganisms belonging to Gordonibacter pamelaeae and microorganisms belonging to Gordonibacter urolithinfaciens are more preferable.
  • the DSM 19378 strain is more preferable, and if it is a microorganism belonging to Gordonibacter urolithinfaciens, the DSM 27213 strain is more preferable.
  • microorganisms belonging to the genus Eggerthella microorganisms belonging to Eggerthella sp. are preferred, and DC 3563 (NITE BP-02376) strain is more preferred.
  • the above microorganisms may be used alone or in combination of two or more, regardless of genus, species and strain.
  • the DC 3563 (NITE BP-02376) strain was issued on November 11, 2016 at the National Institute of Technology and Evaluation (NITE Patent Microorganisms Depositary, National Institute of Technology and Evaluation). 292-0818 Room No. 2-5-8 Kazusa-Kamashita, Kisarazu City, Chiba Prefecture No. 122] was deposited based on the Budapest Treaty.
  • Microorganisms having the ability to produce urolithin C include its quiescent cells.
  • the stationary cell the description of “the stationary cell of a microorganism having the ability to produce the second urolithin from the first urolithin” is incorporated.
  • the solution containing the raw material of urolithin C is not particularly limited as long as it can produce urolithin C from the raw material of urolithin C to the microorganism having the ability to generate urolithin C from the raw material of urolithin C in the solution.
  • it is a medium, and more preferably the medium described in the above-mentioned section “Media and production of second urolithins by culture”.
  • the above-described salt solution and buffer solution are preferable.
  • the content of the raw material of urolithin C in the solution is usually 0.01 g / L or more, preferably 0.1 g / L or more, more preferably 1.0 g / L or more. On the other hand, it is usually 100 g / L or less, preferably 20 g / L or less, more preferably 10 g / L or less.
  • the solution containing the raw material of urolithin C when the microorganism having the ability to generate urolithin C from the raw material of urolithin C generates urolithin C from the raw material of urolithin C, the solution is preferably a medium.
  • the description in the above-mentioned column “Generation of second urolithins by culture and culture” is incorporated.
  • a surfactant such as sodium sulfate, sodium EDTA, sodium EDTA, sodium EDTA, sodium EDTA, sodium EDTA, sodium EDTA, sodium EDTA, sodium EDTA, sodium EDTA, sodium EDTA, sodium EDTA, sodium EDTA, sodium EDTA, sodium EDTA, sodium EDTA, sodium EDTA, sodium EDTA, sodium EDTA, sodium EDTA, sodium EDTA, sodium sulfate, sodium sulfate, sodium sulfate, sodium sulfate, sodium sulfate, sodium sulfate, sodium sulfate, sodium sulfate, sodium sulfate, sodium sulfate, sodium sulfate, sodium sulfate, sodium sulfate, sodium sulfate, sodium sulfate, sodium sulfate, sodium sulfate, sodium sulfate, sodium sulfate, sodium sulf
  • the amount added is generally 0.2 equivalents or more, preferably 1.0 equivalents or more, more preferably 2.0 equivalents or more, and usually 10 equivalents or more in terms of the total molar ratio with respect to the total amount of raw materials of urolithin C. 0.0 equivalent or less, preferably 5.0 equivalent or less, more preferably 4.0 equivalent or less.
  • the solution has the ability to produce the second urolithin from the first urolithin described above instead of the medium.
  • the salt solution and the buffer solution described in the column of “Still cell of microorganism” are preferable.
  • the description in the above-mentioned column “Generation of second urolithin by culture and culture” is incorporated.
  • the first urolithin is urolithin M5
  • the second urolithin is urolithin E
  • the microorganism capable of producing the second urolithin from the first urolithin is Clostridium.
  • the microorganism belongs to the genus. That is, it is a manufacturing method of urolithin E including the following process (a2).
  • Step (a2) A step of producing urolithin E from urolithin M5 in a microorganism belonging to the genus Clostridium having an ability to produce urolithin E from urolithin M5 in a solution containing urolithin M5.
  • urolithin M5 may be prepared by any method.
  • the aspect of the urolithin C in the manufacturing method of the urolithin A mentioned above including the process (a1) is used.
  • examples of the raw material of urolithin M5 include ellagic acid; ellagitannins such as punicalagin and geraniin, which are precursors of ellagic acid. Ellagic acid and / or ellagitannin are preferred.
  • the first urolithin is urolithin M6, the second urolithin is urolithin M7, and the microorganism having the ability to generate the second urolithin from the first urolithin is Clostridium.
  • the microorganism belongs to the genus. That is, it is a manufacturing method of urolithin M7 including the following process (a3).
  • Step (a3) A step of generating urolithin M7 from urolithin M6 in a microorganism belonging to the genus Clostridium having the ability to generate urolithin M7 from urolithin M6 in a solution containing urolithin M6.
  • the urolithin M6 may be prepared by any method. As the example, the aspect of the urolithin C in the manufacturing method of the urolithin A mentioned above including the process (a1) is used.
  • examples of the raw material of urolithin M6 include ellagic acid; ellagitannins such as punicalazine and geraniin, which are precursors of the ellagic acid; and urolithin M5, which is a precursor of urolithin M6.
  • the first urolithin is isouroritin A
  • the second urolithin is urolithin B
  • the microorganism capable of generating the second urolithin from the first urolithin is Clostridium.
  • the microorganism belongs to the genus. That is, it is a manufacturing method of urolithin B including the following process (a4).
  • Step (a4) A step of producing urolithin B from isouroritin A by a microorganism belonging to the genus Clostridium having an ability to produce urolithin B from isouroritin A in a solution containing isouroritin A.
  • the isouroritin A may be prepared by any method. Examples of the raw material of isouroritin A include ellagic acid; ellagitannins such as punicalazine and geraniin which are precursors of the ellagic acid; urolithin M5, urolithin M6 and urolithin C which is a precursor of isouroritin A.
  • the method includes the step of generating isouroritin A from urolithin C in a microorganism having an ability to generate isourolithin A from urolithin C in a solution containing urolithin C. What was obtained by the manufacturing method of A may be used.
  • the microorganism having the ability to produce isouroritin A from urolithin C is not particularly limited as long as it is a microorganism having the ability to produce isouroritin A from urolithin C, but is preferably an anaerobic microorganism. Specific examples thereof include microorganisms belonging to the genus Slackia.
  • microorganisms belonging to Slackia heliotrinireducens can be mentioned. More specifically, Slacchia heliotrinireducens DSM 20476 strain and the like can be mentioned. The above microorganisms may be used alone or in combination of two or more, regardless of genus, species and strain.
  • urolithin M5 as a raw material of isouroritin A
  • the aspect of urolithin M5 in the manufacturing method of urolithin E mentioned above including the process (a2) mentioned above is used.
  • urolithin M6 as a raw material of isouroritin A
  • the aspect of urolithin M6 in the manufacturing method of urolithin M7 mentioned above including the process (a3) mentioned above is used.
  • the aspect of the urolithin C in the manufacturing method of the urolithin A mentioned above including the process (a1) is used.
  • Step (c) is a step of blending the second urolithin produced in the step (a) and a food / beverage material to make a food / beverage product.
  • the food or drink is produced by blending a commonly used food or drink raw material and the second urolithin produced in the step (a) according to a conventional method, and the blending time is not particularly limited.
  • food additives include food additives.
  • it can be enclosed in appropriate containers, such as a bottle, a bag, a can, a box, and a pack, as needed.
  • the food or drink produced in the second invention of the present invention is mainly composed of water, protein, carbohydrates, lipids, vitamins, minerals, organic acids, organic bases, fruit juices, flavors and the like.
  • Examples of the protein include whole milk powder, skim milk powder, partially skim milk powder, casein, soybean protein, chicken egg protein, meat protein, and other animal and vegetable proteins, and their hydrolysates and butter.
  • Examples of the saccharide include saccharides, processed starch (in addition to dextrin, soluble starch, British starch, oxidized starch, starch ester, starch ether, etc.), dietary fiber, and the like.
  • Examples of lipids include lard, safflower oil, corn oil, rapeseed oil, coconut oil, fractionated oils thereof, hydrogenated oil, and vegetable oils such as transesterified oil.
  • vitamins include vitamin A, carotene, vitamin B group, vitamin C, vitamin D group, vitamin E, vitamin K group, vitamin P, vitamin Q, niacin, nicotinic acid, pantothenic acid, biotin, inositol, choline.
  • folic acid examples of the minerals include calcium, potassium, magnesium, sodium, copper, iron, manganese, zinc, selenium, and whey mineral.
  • Examples of the organic acid include malic acid, citric acid, lactic acid, and tartaric acid. These components may be used in combination of two or more, or may be a synthetic product.
  • generated at the said process (a) with respect to the whole quantity of the food / beverage products manufactured by 2nd invention of this invention is not restrict
  • this food / beverage product is ingested, it is antioxidant
  • the content is preferably such that the effects of the second urolithins such as anti-inflammatory, anti-glycation, and mitophagy-promoting action can be obtained.
  • the content of the second urolithin relative to the total amount of the food or drink is usually 0.0001% by mass or more, preferably 0.001% by mass or more, more preferably 0.01% by mass or more, and usually 10% by mass or less. , Preferably 1% by mass or less, more preferably 0.1% by mass or less.
  • the form thereof may be any form of a solid, a gel, and a liquid, for example, various processed foods, powders, tablets, pills, capsules, jellies, granules Or the like. Furthermore, it can be enclosed in appropriate containers, such as a bottle, a bag, a can, a box, and a pack, as needed.
  • Supplements include excipients such as dextrin, preservatives such as vitamin C, flavoring agents such as vanillin, pigments such as safflower pigment, monosaccharides, oligosaccharides and polysaccharides (eg, glucose, fructose, sucrose, Additives such as saccharose and saccharides containing these), acidulants, fragrances, fats and oils, emulsifiers, whole milk powder, or agar may be blended. These components may be used in combination of two or more, or may be a synthetic product.
  • urolithins were extracted with an equal amount of ethyl acetate with respect to 5 mL of the culture solution, and the resulting ethyl acetate phase was concentrated under reduced pressure and dried. The dried product thus obtained was redissolved in 0.5 mL of methanol, and quantitative analysis of urolithins was performed by HPLC. HPLC was performed under the conditions described below. A urolithin manufactured by DALTON PHARMA was used as a standard and dissolved in DMSO. The results are shown in Table 2. From the urolithins having a hydroxyl group at the 9-position, urolithins from which the 9-position hydroxyl group was eliminated were produced.
  • Example 2 After adding urolithin C as a precursor of urolithin A to ABB medium (manufactured by Oxoid), heat sterilization is performed and the gas phase is replaced with N 2 : CO 2 : H 2 (80% / 10% / 10%) gas. This was used as a basic medium.
  • Clostridium Borteae DSM 15670 strain or DSM 29485 strain was inoculated into a basic medium containing urolithin C at a final concentration of 1.0 g / L, and cultured anaerobically at 37 ° C.
  • urolithins were extracted with an equal amount of ethyl acetate with respect to 5 mL of the culture solution, and the resulting ethyl acetate phase was concentrated under reduced pressure and dried.
  • the dried product thus obtained was redissolved in 0.5 mL of methanol, and quantitative analysis of urolithins was performed by HPLC.
  • HPLC was performed under the same conditions as in Example 1.
  • a urolithin manufactured by DALTON PHARMA was used as a standard and dissolved in DMSO. As a result, 100% and 89% of the added urolithin C was converted to urolithin A in each of the cultures for 2 weeks.
  • Example 3 As a result of carrying out in the same manner as in Example 2 except that the culture was carried out for 5 days using Clostridium asparagiforme DSM 15981 strain, 95% of the added urolithin C was converted to urolithin A.
  • Example 4 As a result of carrying out similarly to Example 2 except having carried out culture
  • Example 5 Clostridium bortaeae JCM 12243 strain and Goldonibacter pamelaeae DSM 19378 strain were inoculated in ABB medium (Oxoid) containing 0.1% ellagic acid (manufactured by SIGMA) and cultured in the same manner as in Example 2. As a result, 67% of the added ellagic acid was converted to urolithin A by culturing for 2 weeks.
  • Example 6 As a result of culturing in the same manner as in Example 5 except that Clostridium bortaeae JCM 12243 strain and Gordonibacter urolithifaciens DSM 27213 strain were used. As a result of culturing for 2 weeks, 62% of the added ellagic acid was urolithin A. Converted to
  • Example 7 As a result of culturing in the same manner as in Example 5 except that the Clostridium asparagiforme DSM 15981 strain and Gordonibacter urolithifaciens DSM 27213 strain were used, 60% of the added ellagic acid was obtained by culturing for 5 days. Converted to urolithin A.
  • Example 8 As a result of culturing in the same manner as in Example 5 except that Clostridium citrononiae DSM 19261 strain and Gordonibacter urolithifaciens DSM 27213 strain were used, 60% of the added ellagic acid was urolithin A after 5 days of culture. Converted to
  • Example 9 Production of urolithin A by culturing in the same manner as in Example 2 under the condition that the addition amount of urolithin C is 0.81 g / L and the gas phase is only nitrogen or nitrogen: hydrogen (90% / 10%). The effects of hydrogen on the water were compared.
  • the urolithin A produced by the culturing for 3 days with respect to the added urolithin C is 86% when hydrogen is not present in the gas phase, compared with 73% when hydrogen is not present in the gas phase. The production of urolithin A was promoted.
  • Example 10 The amount of urolithin C added is 0.81 g / L, and 1.2 equivalents of ⁇ -cyclodextrin, ⁇ -cyclodextrin, or ⁇ -cyclodextrin in molar ratio to urolithin C is added or added.
  • the effects of various cyclodextrins on the production of urolithin A were compared. After 5 days of culturing, the yield is 47% when no cyclodextrin is added and 78% when ⁇ -cyclodextrin is added. The yield when ⁇ -cyclodextrin is added. Was 66%, and the yield when ⁇ -cyclodextrin was added was 98%.
  • urolithins from which the 9-position hydroxyl group is eliminated can be produced from urolithins having a hydroxyl group at the 9-position.
  • the manufactured urolithins are used for anti-oxidation, anti-inflammation, anti-glycation and the like in cosmetics, quasi-drugs, medical supplies, hygiene products, pharmaceuticals, foods and drinks (including supplements) and the like.

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Abstract

本発明は、ウロリチン類の９位の水酸基を脱離して他のウロリチン類を製造する方法の提供を課題とし、該課題を、工程（ａ）：第１のウロリチン類を含有する溶液において、第１のウロリチン類から第２のウロリチン類を生成する能力を有する微生物に、第１のウロリチン類から第２のウロリチン類を生成させる工程を含む、第２のウロリチン類の製造方法により解決する。

Description

ウロリチン類の製造方法
　本発明は、ウロリチン類の製造方法に関する。
　ウロリチンＡやウロリチンＣに代表されるウロリチン類は、ザクロ、ラズベリー、ブラックベリー、クラウドベリー、イチゴ、クルミなどに含まれるエラジタンニン等に由来するエラグ酸の代謝物として知られている。
　エラジタンニンは加水分解性タンニンに分類され、摂取されると体内で加水分解され、エラグ酸に変換されることが知られている。また、果実等にはエラグ酸としても存在している。
　これまでに、例えば、生体内におけるウロリチン類の生成については、ラットにおいて、ゲラニインなどのエラジタンニンからウロリチン類が生じることが、尿中のウロリチン類を分析することによって明らかにされている（非特許文献１）。
　また、ヒトにおいて、プニカラジンを主としたエラジタンニンを含むザクロ抽出物を摂取後、尿中においてウロリチン類が検出され、特にウロリチンＡ及びウロリチンＣが主要なエラグ酸代謝物であることが報告されている（非特許文献２）。
　これらのウロリチン類は、様々な生理活性を有することが知られており、医薬品、化粧品、飲食品の素材としての利用が期待されている。
　例えば、ウロリチンＡには抗酸化作用（非特許文献３）、抗炎症作用（非特許文献４）、抗糖化作用（非特許文献５）、マイトファジーの促進作用（非特許文献６）などの機能を有することが報告されており、抗老化機能を有する素材としての開発が期待されている。
　これらのウロリチン類を合成する方法としては、２‐ブロモ‐５‐メトキシ安息香酸を出発原料として脱メチル化によって２‐ブロモ‐５‐ヒドロキシ安息香酸とし、レゾルシノールと反応させることによってウロリチンＡを得る方法などが報告されている（非特許文献７）。しかし、ウロリチン類を機能性食品（飲料、サプリメントを含む。）の素材として利用するには、このような化学合成法は適さない。
　一方、エラジタンニンやエラグ酸は体内に摂取された後、腸内微生物叢によって代謝されてウロリチン類に変換されることが知られている。近年、ウロリチン類の一種であるウロリチンＣをエラグ酸から生成する腸内細菌としてゴルドニバクター・ウロリチファシエンス（Gordonibacter urolithinfaciens）に属する微生物が分離、同定され、この腸内細菌を用いたエラグ酸の発酵によりウロリチンＣを産生する方法が報告された（特許文献１、非特許文献８）。しかし、発酵液中のウロリチンＣの蓄積濃度は２ｍｇ／Ｌ程度であり、また、ヒトの主要なエラグ酸代謝物であるウロリチンＡは生産することができない。
　ゴルドニバクター属に属するゴルドニバクター・パメラエアエ(Gordonibacter pamelaeae)に属する微生物もエラグ酸からウロリチンＣを生産することが報告されているが、ウロリチンＡを生産することは報告されていない。また、同微生物を含め、ウロリチン類の９位の水酸基を脱離して他のウロリチン類を産生する微生物は報告されていない。
国際公開２０１４／１４７２８０号パンフレット
J. Agric. Food Chem. 56, 393-400 (2008) Mol. Nutr. Food Res. 58, 1199-1211 (2014) Biosci. Biotechnol. Biochem. 76, 395-399 (2012) J. Agric. Food Chem. 60, 8866-8876 (2012) Mol. Nutr. Food Res. 55, S35-S43 (2011) Nature Medicine, 22, 879-888 (2016) J. Agric. Food Chem.,56, 393-400 (2008) Food Func., 5, 8, 1779-1784 (2014)
　本発明は、ウロリチン類の９位の水酸基を脱離して他のウロリチン類を製造する方法の提供を課題とする。
　上記課題を解決するために、本発明者らは鋭意検討した結果、ウロリチン類の９位の水酸基を脱離して他のウロリチン類を生成する能力を有する微生物を見出して、本発明を完成させた。本発明は以下の通りである。
〔１〕下記工程（ａ）を含む、下記一般式（２）で表される第２のウロリチン類の製造方法。
　工程（ａ）：下記一般式（１）で表される第１のウロリチン類を含有する溶液において、第１のウロリチン類から下記一般式（２）で表される第２のウロリチン類を生成する能力を有する微生物に、第１のウロリチン類から第２のウロリチン類を生成させる工程。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
（式中、Ｒ１乃至Ｒ７は、それぞれ、水酸基、水素原子又はメトキシ基を表し、且つ、Ｒ１乃至Ｒ７のうち１つ以上は水酸基である。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
（式中、Ｒ１乃至Ｒ７は、それぞれ、前記一般式（１）で表される第１のウロリチン類のＲ１乃至Ｒ７と同一である。）
〔２〕前記第１のウロリチン類と前記第２のウロリチン類の組み合わせが、それぞれ、ウロリチンＭ５とウロリチンＥの組み合わせ、ウロリチンＭ６とウロリチンＭ７の組み合わせ、ウロリチンＣとウロリチンＡの組み合わせ、又はイソウロリチンＡとウロリチンＢの組み合わせである、〔１〕に記載の製造方法。
〔３〕前記微生物がクロストリジウム（Clostridium）属に属する微生物である、〔１〕又は〔２〕に記載の製造方法。
〔４〕前記クロストリジウム（Clostridium）属に属する微生物が、クロストリジウム・ボルテアエ（Clostridium bolteae）に属する微生物、クロストリジウム・アスパラギフォルメ（Clostridium asparagiforme）に属する微生物、及びクロストリジウム・シトロニアエ（Clostridium citroniae）に属する微生物から成る群から選択される１以上である、〔３〕に記載の製造方法。
〔５〕前記クロストリジウム・ボルテアエ（Clostridium bolteae）に属する微生物が、クロストリジウム・ボルテアエ（Clostridium bolteae）ＪＣＭ　１２２４３株、ＤＳＭ　１５６７０株、及びＤＳＭ　２９４８５株から成る群から選択される１以上である、〔４〕に記載の製造方法。
〔６〕前記クロストリジウム・アスパラギフォルメ（Clostridium asparagiforme）に属する微生物が、クロストリジウム・アスパラギフォルメ（Clostridium asparagiforme）ＤＳＭ　１５９８１株である、〔４〕又は〔５〕に記載の製造方法。
〔７〕前記クロストリジウム・シトロニアエ（Clostridium citroniae）に属する微生物が、クロストリジウム・シトロニアエ（Clostridium citroniae）ＤＳＭ　１９２６１株である、〔４〕～〔６〕のいずれかに記載の製造方法。
〔８〕前記第１のウロリチン類と前記第２のウロリチン類の組み合わせが、それぞれ、ウロリチンＣとウロリチンＡの組み合わせである、〔２〕～〔７〕のいずれかに記載の製造方法。
〔９〕前記ウロリチンＣが、ウロリチンＣの原料を含有する溶液において、ウロリチンＣの原料からウロリチンＣを生成する能力を有する微生物に、ウロリチンＣの原料から生成させて得られるものである、〔８〕に記載の製造方法。
〔１０〕さらに下記工程（ｂ１）を含み、前記工程（ａ）及び該工程（ｂ１）が同一の系で行われる、〔８〕に記載の製造方法。
　工程（ｂ１）：ウロリチンＣの原料を含有する溶液において、ウロリチンＣの原料からウロリチンＣを生成する能力を有する微生物に、ウロリチンＣの原料からウロリチンＣを生成させる工程。
〔１１〕前記ウロリチンＣの原料からウロリチンＣを生成する能力を有する微生物が、ゴルドニバクター（Gordonibacter）属に属する微生物である、〔９〕又は〔１０〕に記載の製造方法。
〔１２〕前記ゴルドニバクター（Gordonibacter）属に属する微生物が、ゴルドニバクター・パメラエアエ（Gordonibacter pamelaeae）に属する微生物及び／又はゴルドニバクター・ウロリチファシエンス（Gordonibacter urolithinfaciens）に属する微生物である、〔１１〕に記載の製造方法。
〔１３〕前記ゴルドニバクター・パメラエアエ（Gordonibacter pamelaeae）に属する微生物が、ゴルドニバクター・パメラエアエ（Gordonibacter pamelaeae）ＤＳＭ　１９３７８株である、〔１２〕に記載の製造方法。
〔１４〕前記ゴルドニバクター・ウロリチファシエンス（Gordonibacter urolithinfaciens）に属する微生物が、ゴルドニバクター・ウロリチファシエンス（Gordonibacter urolithinfaciens）ＤＳＭ　２７２１３株である、〔１２〕又は〔１３〕に記載の製造方法。
〔１５〕前記ウロリチンＣの原料が、エラグ酸及び／又はエラジタンニンである、〔９〕～〔１４〕のいずれかに記載の製造方法。
〔１６〕気相が水素を含む環境下で工程（ａ）が行われる、〔１〕～〔１５〕のいずれかに記載の製造方法。
〔１７〕前記気相における前記水素の割合が０．５％以上２０％以下である、〔１６〕に記載の製造方法。
〔１８〕前記工程（ａ）において、前記ウロリチンＣを含有する溶液が、α‐シクロデキストリン、β‐シクロデキストリン及びγ‐シクロデキストリンからなる包摂化合物の群から選択される１種以上をさらに含む、〔８〕～〔１７〕のいずれかに記載の製造方法。
〔１９〕前記包摂化合物が、前記ウロリチンＣに対してモル比の総量で０．１当量以上５．０当量以下である、〔１８〕に記載の製造方法。
〔２０〕前記工程（ｂ１）において、前記ウロリチンＣの原料を含有する溶液が、α‐シクロデキストリン、β‐シクロデキストリン及びγ‐シクロデキストリンからなる包摂化合物の群から選択される１種以上をさらに含む、〔１０〕～〔１９〕のいずれかに記載の製造方法。
〔２１〕前記包摂化合物が、前記エラグ酸及び／又はエラジタンニンの総量に対してモル比の総量で０．２当量以上１０．０当量以下である、〔２０〕に記載の製造方法。
〔２２〕下記工程（ａ１）及び（ｃ）を含むウロリチンＡを含む飲食品の製造方法。
　工程（ａ１）：ウロリチンＣを含有する溶液において、ウロリチンＣからウロリチンＡを生成する能力を有する微生物に、ウロリチンＣからウロリチンＡを生成させる工程；及び、
　工程（ｃ）：上記工程（ａ１）で生成したウロリチンＡと飲食品原料とを配合して飲食品とする工程。
　本発明によれば、９位に水酸基を有するウロリチン類から該９位の水酸基を脱離して他のウロリチン類を製造する方法が提供できる。そして、本発明の製造方法により得られるウロリチン類を、化粧品、医薬部外品、医療用品、衛生用品、医薬品、飲食品（サプリメントを含む。）等に用いることにより、抗酸化、抗炎症、抗糖化、マイトファジーの促進作用などの効果を得ることが期待できる。
　本明細書において、ＤＳＭとの文言から始まる菌株の受託番号は、DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) に保存されている微生物に付与された番号である。また、ＪＣＭとの文言から始まる菌株の受託番号は、理化学研究所バイオリソースセンターに保存されている微生物に付与された番号である。
　本発明は、ウロリチン類の製造方法（第一の発明）とウロリチン類を含む飲食品の製造方法（第二の発明）とを含む。
　表１に、ウロリチン類の具体例を掲げる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
＜１．ウロリチン類の製造方法＞
　本発明の第一の発明であるウロリチン類の製造方法は、下記工程（ａ）を含むが、その他の工程を含んでもよい。
（１）工程（ａ）
　工程（ａ）は、下記一般式（１）で表される第１のウロリチン類を含有する溶液において、第１のウロリチン類から下記一般式（２）で表される第２のウロリチン類を生成する能力を有する微生物に、第１のウロリチン類から第２のウロリチン類を生成させる工程である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
（式中、Ｒ１乃至Ｒ７は、それぞれ、水酸基、水素原子又はメトキシ基を表し、且つ、Ｒ１乃至Ｒ７のうち１つ以上は水酸基である。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
（式中、Ｒ１乃至Ｒ７は、それぞれ、前記一般式（１）で表される第１のウロリチン類のＲ１乃至Ｒ７と同一である。）
　第１のウロリチン類の具体例としては、ウロリチンＣ、ウロリチンＤ、ウロリチンＭ４、ウロリチンＭ５、ウロリチンＭ６、イソウロリチンＡ等が挙げられる。
　第２のウロリチン類としては、上記第１のウロリチン類の９位の水酸基が脱離されていること以外は上記第１のウロリチン類と同一のものである。
　本発明の第１のウロリチン類は、好ましくは、ウロリチンＭ５、ウロリチンＭ６、ウロリチンＣ、イソウロリチンＡであり、このとき、本発明の第２のウロリチン類は、それぞれ、ウロリチンＥ、ウロリチンＭ７、ウロリチンＡ、ウロリチンＢである。
（第１のウロリチン類から第２のウロリチン類を生成する能力を有する微生物）
　本発明の第一の発明における、第１のウロリチン類から第２のウロリチン類を生成する能力を有する微生物は、第１のウロリチン類から第２のウロリチン類を生成する能力を有する微生物ならば特に制限されないが、嫌気性の微生物であることが好ましい。
　その具体例としては、クロストリジウム（Clostridium）属に属する微生物が挙げられる。より具体的には、クロストリジウム・ボルテアエ（Clostridium bolteae）に属する微生物、クロストリジウム・アスパラギフォルメ（Clostridium asparagiforme）に属する微生物、クロストリジウム・シトロニアエ（Clostridium citroniae）に属する微生物が挙げられる。
　クロストリジウム・ボルテアエ（Clostridium bolteae）に属する微生物の中では、ＤＳＭ　２９４８５株、ＤＳＭ　１５６７０株、ＪＣＭ　１２２４３株が挙げられる。
　クロストリジウム・アスパラギフォルメ（Clostridium asparagiforme）に属する微生物の中では、ＤＳＭ　１５９８１株が挙げられる。
　クロストリジウム・シトロニアエ（Clostridium citroniae）に属する微生物の中では、ＤＳＭ　１９２６１株が挙げられる。
　以上の微生物は、属、種、株に拘らず、１種でも２種以上を用いてもよい。
　また、本発明の第一の発明における、第１のウロリチン類から第２のウロリチン類を生成する能力を有する微生物は、上記寄託菌株と同一の菌株に制限されず、ＤＳＭ　２９４８５株、ＤＳＭ　１５６７０株、ＪＣＭ　１２２４３株、ＤＳＭ　１５９８１株、ＤＳＭ　１９２６１株のそれぞれと実質的に同等の菌株であってもよい。実質的に同等の菌株とは、その16S rRNA遺伝子の塩基配列が、上記各菌株の16S rRNA遺伝子の塩基配列と９７．５％以上、好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％の相同性を有する微生物である。さらに、第１のウロリチン類から第２のウロリチン類を生成する能力を有する微生物は、本発明の効果が損なわれない限り、いずれの各菌株又はそれと実質的に同等の菌株から、変異処理、遺伝子組換え、自然変異株の選択等によって育種された菌株であってもよい。このことは、本明細書に記載されている微生物すべてに適用される。
（第１のウロリチン類から第２のウロリチン類を生成する能力を有する微生物の静止菌体）
　本発明の第一の発明における、第１のウロリチン類から第２のウロリチン類を生成する能力を有する微生物は、その静止菌体を含む。静止菌体とは、培養した微生物から遠心分離等の操作により培地成分を取り除き、水や生理食塩水等の塩溶液、あるいは緩衝液で洗浄し、洗浄液と同一の液に懸濁した菌体であって、増殖しない状態の菌体を指し、本発明の第一の発明においては、少なくとも、第１のウロリチン類から第２のウロリチン類を生成できる代謝系を有している菌体をいう。緩衝液としては、リン酸緩衝液、トリス‐塩酸緩衝液、クエン酸‐リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、MOPS緩衝液、酢酸緩衝液、グリシン緩衝液等が好ましい。緩衝液のｐＨや濃度は、常法に従い適宜調製したものを使用できる。
　本明細書に記載されている微生物はいずれも静止菌体を含み、その定義は上記と同一である。
（第１のウロリチン類を含有する溶液）
　本発明の第一の発明における第１のウロリチン類を含有する溶液とは、該溶液において、第１のウロリチン類から第２のウロリチン類を生成する能力を有する微生物に、第１のウロリチン類から第２のウロリチン類を生成させることができるものであれば特に制限されない。好ましくは培地であり、より好ましくは後述する「培地、及び培養による第２のウロリチン類の生成」欄に記載した培地である。また、第１のウロリチン類から第２のウロリチン類を生成する能力を有する微生物が静止菌体である場合には、前述した塩溶液や緩衝液が好ましい。
　尚、本明細書に記載されている「培地」とは、いずれも、最少培地を含む、微生物が増殖できる溶液をいい、微生物が増殖できない溶液、例えば、前述した塩溶液や緩衝液などを含まないものとする。
　該溶液へ第１のウロリチン類を添加する場合には、第２のウロリチン類の生成前に添加しても、その途中で添加してもよく、また、一括添加、逐次添加、連続添加でもよい。
　溶液中の第１のウロリチン類の含有量は、通常０．０１ｇ／Ｌ以上、好ましくは０．１ｇ／Ｌ以上、より好ましくは１ｇ／Ｌ以上である。一方、通常１００ｇ／Ｌ以下、好ましくは２０ｇ／Ｌ以下、より好ましくは１０ｇ／Ｌ以下である。
（培地、及び培養による第２のウロリチン類の生成）
　工程（ａ）では、前記溶液が培地であることが好ましい。該培地は特に限定されないが、例えば、Oxoid社製のANAEROBE BASAL BROTH（ABB培地）、Oxoid社製のWilkins-Chalgren Anaerobe Broth（CM0643）、日水製薬株式会社製のGAM培地、変法GAM培地等を使用することができる。
　また、これらの培地に第１のウロリチン類から第２のウロリチン類を生成する酵素を誘導する誘導物質を添加することが好ましい。誘導物質としては、第１のウロリチン類及び第２のウロリチン類以外のウロリチン類、その前駆体；エラグ酸；エラグ酸の前駆体であるエラジタンニン等が挙げられる。１種でも２種以上であってもよい。
　また、培地に水溶性の有機物を炭素源として加えることができる。水溶性の有機物として、以下の化合物を挙げることができる。すなわち、グルコース、アラビノース、ソルビトール、フラクトース、マンノース、スクロース、トレハロース、キシロースなどの糖類；グリセロールなどのアルコール類；吉草酸、酪酸、プロピオン酸、酢酸、ギ酸、フマル酸などの有機酸類などを挙げることが出来る。
　炭素源としての培地に加える有機物の濃度は、効率的に発育させるために適宜調節することができる。一般的には、０．１～１０ｗｔ／ｖｏｌ％の範囲から添加量を選択することができる。
　上記の炭素源に加えて、培地に窒素源が加えることができる。窒素源としては通常の発酵に用いうる各種の窒素化合物を用いることができる。
　好ましい無機窒素源として、アンモニウム塩、硝酸塩などを、より好ましくは、硫安、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、リン酸水素アンモニウム、硝酸カリウム及び硝酸ソーダなどを挙げることが出来る。
　また、有機窒素源としては、アミノ酸類、酵母エキス、ペプトン類（例えばポリペプトンＮなど）、肉エキス（例えばエールリッヒカツオエキス、ラブ‐レムコ末、ブイヨンなど）、肝臓エキス、消化血清末などを挙げることが出来る。
　さらに、炭素源や窒素源に加えて、例えば、ビタミンなどの補因子や各種の塩類等の無機化合物を培地に加えることによって、増殖や活性を増強できる場合もある。たとえば無機化合物、ビタミン類など、動植物由来の微生物増殖補助因子として以下のものを挙げることができる。
　　無機化合物　　　　　　　　　　　ビタミン類
　　リン酸二水素カリウム　　　　　　ビオチン
　　硫酸マグネシウム　　　　　　　　葉酸
　　硫酸マンガン　　　　　　　　　　ピリドキシン
　　塩化ナトリウム　　　　　　　　　チアミン
　　塩化コバルト　　　　　　　　　　リボフラビン
　　塩化カルシウム　　　　　　　　　ニコチン酸
　　硫酸亜鉛　　　　　　　　　　　　パントテン酸
　　硫酸銅　　　　　　　　　　　　　ビタミンＢ１２
　　明ばん　　　　　　　　　　　　　チオオクト酸
　　モリブデン酸ソーダ　　　　　　　ｐ‐アミノ安息香酸
　　塩化カリウム
　　ホウ酸等
　　塩化ニッケル
　　タングステン酸ナトリウム
　　セレン酸ナトリウム
　　硫酸第一鉄アンモニウム
　　酢酸ナトリウム三水和物
　　硫酸マグネシウム七水和物
　　硫酸マンガン四水和物
　また、培地中に、システイン、シスチン、硫化ナトリウム、亜硫酸塩、アスコルビン酸、グルタチオン、チオグリコール酸、ルチンなどの還元剤やカタラーゼ、スーパーオキシドムターゼなどの活性酸素種を分解する酵素を添加することにより生育が良好になる可能性がある。
　培養中の気相、水相としては、空気もしくは酸素を含まないことが好ましく、例えば、窒素及び／又は水素を任意の比率で含むことや、窒素及び／又は二酸化炭素を任意の比率で含むことが挙げられ、水素を含む気相や水相であることが好ましい。気相における水素の割合は、第２のウロリチン類の生成が促進されることから、通常０．５％以上、好ましくは１．０％以上、より好ましくは２．０％以上であり、一方、通常１００％以下、好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下である。
　培養中の気相や水相をこのような環境にする方法は特に制限されないが、例えば、培養前に上記ガスで気相を置換する方法、これに加えて、培養中も培養器の底部から供給する及び／又は培養器の気相部に供給する方法、培養前に上記ガスで水相をバブリングするなどの方法をとることが出来る。前記水素は、水素ガスをそのまま用いてもよい。また、培地にギ酸及び／又はその塩などの水素の原料を添加し、微生物の作用により培養中に水素を生成してもよい。
　通気量としては、０．００５～２ｖｖｍが挙げられ、０．０５～０．５ｖｖｍが好ましい。また、混合ガスはナノバブルとして供給することもできる。
　培養温度は、２０℃～４５℃、より好ましくは２５℃～４０℃、さらに好ましくは３０℃～３７℃が好ましい。
　培養器の加圧条件は、生育できる条件であれば特に限定されるものではないが、０．００１～１ＭＰａの範囲、好ましくは０．０１～０．５ＭＰａを挙げることができる。
　培養時間としては、通常８～３４０時間、好ましくは１２～１７０時間、より好ましくは１６～１２０時間を挙げることが出来る。
　また、培養液に界面活性剤、吸着剤、包摂化合物などを添加することにより、第２のウロリチン類の生成を促進できる場合がある。
　界面活性剤としては、例えば、Tween 80等が挙げられ、０．００１ｇ／Ｌ以上１０ｇ／Ｌ以下程度添加することが出来る。
　吸着剤としては、例えば、セルロース及びその誘導体；デキストリン；三菱化学株式会社製の疎水吸着剤であるダイアイオンHPシリーズやセパビーズシリーズ；オルガノ株式会社製のアンバーライトXADシリーズなどを挙げることができる。
　包摂化合物としては、例えば、α‐シクロデキストリン、β‐シクロデキストリン、γ‐シクロデキストリン、クラスターデキストリン（高度分岐環状デキストリン）などを挙げることができる。この中で、γ‐シクロデキストリンが最も効果的である場合がある。また、２種以上の包摂化合物を共存させることにより、第２ウロリチン類の生成を更に促進できる場合がある。
　添加量としては、第１のウロリチン類に対し、モル比の総量で、通常０．１当量以上、好ましくは０．５当量以上、より好ましくは１．０当量以上であり、一方、通常５．０当量以下、好ましくは２．５当量以下、より好ましくは２．０当量以下である。
（静止菌体による第２のウロリチン類の生成）
　第１のウロリチン類から第２のウロリチン類を生成する能力を有する微生物が静止菌体である場合の溶液は、前記培地の代わりに、前述した「第１のウロリチン類から第２のウロリチン類を生成する能力を有する微生物の静止菌体」欄に記載した塩溶液や緩衝液が好ましい。その他の条件については、上記「培地、及び培養による第２のウロリチン類の生成」欄の記載が援用される。
（第１のウロリチン類）
　本発明の第一の発明における第１のウロリチン類は、どのような方法により調製されたものでもよい。例えば、化学合成法や発酵法により合成したものが挙げられる。本発明の第一の発明で製造される第２のウロリチン類を飲食品として利用する場合には、飲食品もしくは飲食品素材を原料にして、発酵法や酵素法により調製した第１のウロリチン類を利用することが望ましい。
　化学合成法としては、非特許文献７の方法を挙げることができる。
　発酵法としては、第１のウロリチン類の原料を含有する溶液において、第１のウロリチン類の原料から第１のウロリチン類を生成する能力を有する微生物に、第１のウロリチン類の原料から生成させて得られるものが挙げられる。
（工程（ａ）の前に含んでもよい工程）
　発酵法により第１のウロリチン類を生成後、該第１のウロリチン類を分離及び／又は精製して、工程（ａ）の第１のウロリチン類として工程（ａ）に適用することも可能であるが、分離及び／又は精製せず、該第１のウロリチン類を含む溶液をそのまま、又は、希釈もしくは濃縮後に、工程（ａ）の第１のウロリチン類として工程（ａ）に適用することもできる。
　すなわち、本発明の第一の発明は、上記工程（ａ）の前に、該工程（ａ）が行われる系とは別の系で行われる、下記工程（ｐｒｅ‐ａ１）及び（ｐｒｅ‐ａ２）をこの順に含んでもよく、又は、下記工程（ｐｒｅ‐ａ１）及び（ｐｒｅ‐ａ３）をこの順に含んでもよい。
　工程（ｐｒｅ‐ａ１）：第１のウロリチン類の原料を含有する溶液において、第１のウロリチン類の原料から第１のウロリチン類を生成する能力を有する微生物に、第１のウロリチン類の原料から第１のウロリチン類を生成させる工程。
　工程（ｐｒｅ‐ａ２）：工程（ｐｒｅ‐ａ１）で生成した第１のウロリチン類を分離及び／又は精製し、該分離及び／又は精製された第１のウロリチン類を、工程（ａ）の第１のウロリチン類として、工程（ａ）に適用する工程。
　工程（ｐｒｅ‐ａ３）：工程（ｐｒｅ‐ａ１）で生成した第１のウロリチン類を含む溶液をそのまま又は希釈もしくは濃縮後に、工程（ａ）の第１のウロリチン類として、工程（ａ）に適用する工程。
（２）工程（ｂ）
　本発明の第一の発明であるウロリチン類の製造方法は、前記工程（ａ）に加えて、さらに下記工程（ｂ）を含み、前記工程（ａ）及び該工程（ｂ）が同一の系で行われることが好ましい。
　工程（ｂ）：第１のウロリチン類の原料を含有する溶液において、第１のウロリチン類の原料から第１のウロリチン類を生成する能力を有する微生物に、第１のウロリチン類の原料から第１のウロリチン類を生成させる工程。
（同一の系）
　工程（ａ）及び（ｂ）が同一の系で行われるとは、工程（ｂ）において、第１のウロリチン類の原料を含有する溶液において、第１のウロリチン類の原料から第１のウロリチン類を生成する能力を有する微生物により、第１のウロリチン類の原料から第１のウロリチン類が生成されてから、該生成された第１のウロリチン類が工程（ａ）の第１のウロリチン類としてそのまま用いられて、工程（ａ）において第２のウロリチン類が生成されるまでの一連の流れが、同一の系で連続して行われることをいう。すなわち、工程（ｂ）と工程（ａ）の間に、例えば、工程（ｂ）で生成した第１のウロリチン類を分離及び／又は精製する工程などを含まないことをいう。
　具体的には、第１のウロリチン類の原料から第１のウロリチン類を生成する能力を有する微生物と、第１のウロリチン類から第２のウロリチン類を生成する能力を有する微生物とを同じ培養液に植菌し、培養することにより、第２のウロリチン類を生成することなどが挙げられる。両微生物は同一の微生物でもよいし、異なる微生物でもよい。
　尚、第１のウロリチン類がウロリチンＣである場合、上記工程（ｂ）は工程（ｂ１）と読み替えるものとする。
（第１のウロリチン類の原料）
　第１のウロリチン類の原料は、どのような方法により調製されたものでもよい。また、第１のウロリチン類の原料の原料、さらにはその原料、それ以降についても同様である。
　例えば、化学合成法や発酵法により合成したものが挙げられる。本発明の第一の発明で製造される第２のウロリチン類を飲食品として利用する場合には、発酵法や酵素法により得られた第１のウロリチン類の原料を利用することが望ましい。
　化学合成法としては、非特許文献７の方法を挙げることができる。
　発酵法としては、第１のウロリチン類の原料の原料を含有する溶液において、第１のウロリチン類の原料の原料から第１のウロリチン類の原料を生成する能力を有する微生物に、第１のウロリチン類の原料の原料から生成させて得られる第１のウロリチン類の原料が挙げられる。
（その他の工程）
　本発明の第一の発明は、以下の工程を含んでもよい。
　本発明の第一の発明は、例えば、得られた第２のウロリチン類を定量する工程を含んでもよい。定量方法は常法に従うことができる。例えば、培養液に、必要に応じてギ酸などの酸を添加した酢酸エチルを加えて、激しく撹拌した後に遠心し、酢酸エチル層を取り出す。必要に応じて同様の操作を数回行い、それら酢酸エチル層を合わせてウロリチン類抽出液を得る。この抽出液をエバポレーターなどを用いて減圧下に濃縮、乾固し、メタノールに溶解させる。これをポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）膜などの膜を使用して濾過し、不溶物を除去したものを高速液体クロマトグラフィー定量する。高速液体クロマトグラフィーの条件としては、例えば以下が挙げられるが、これに限定されない。
［高速液体クロマトグラフィー条件］
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ　ＯＤＳ‐３（２５０×４．６ｍｍ）（ＧＬ　Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）
溶離液：水／アセトニトリル／酢酸＝７４／２５／１
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
検出：３０５ｎｍ
　また、本発明の第一の発明は、上記工程で得られた第２のウロリチン類を精製する工程や、濃縮する工程を含んでもよい。精製工程における精製処理としては、熱等による微生物の殺菌；精密濾過（ＭＦ）、限外濾過（ＵＦ）などによる除菌；固形物、高分子物質の除去；有機溶媒やイオン性液体などによる抽出；疎水性吸着剤、イオン交換樹脂、活性炭カラム等を用いた吸着、脱色といった処理を行うことができる。また、濃縮工程における濃縮処理としては、エバポレーター、逆浸透膜等による濃縮が挙げられる。
　さらに、第２のウロリチン類を含む溶液は、凍結乾燥、噴霧乾燥などにより粉末化することもできる。粉末化においては、ラクトース、デキストリン、コーンスターチ等の賦形剤を添加することもできる。
＜１－１．好ましい一実施態様＞
　以下では、本発明の好ましい一実施態様を記載する。
　本実施態様は、第１のウロリチン類がウロリチンＣであり、第２のウロリチン類がウロリチンＡであり、第１のウロリチン類から第２のウロリチン類を生成する能力を有する微生物がクロストリジウム（Clostridium）属に属する微生物である場合の態様である。
　すなわち、下記工程（ａ１）を含む、ウロリチンＡの製造方法である。
　工程（ａ１）：ウロリチンＣを含有する溶液において、ウロリチンＣからウロリチンＡを生成する能力を有するクロストリジウム（Clostridium）属に属する微生物に、ウロリチンＣからウロリチンＡを生成させる工程。
（培地、及び培養によるウロリチンＡの生成）
　本実施態様における包摂化合物としては、例えば、α‐シクロデキストリン、β‐シクロデキストリン、γ‐シクロデキストリン、クラスターデキストリン（高度分岐環状デキストリン）などを挙げることができる。特に、γ‐シクロデキストリンが最も効果的であり、α‐シクロデキストリン、β‐シクロデキストリンも効果を有している。また、２種以上の包摂化合物を共存させることにより、ウロリチンＡの生成を更に促進できる場合がある。
（ウロリチンＣの原料）
　ウロリチンＣの原料としては、例えば、エラグ酸；該エラグ酸の前駆体である、プニカラジン、ゲラニインなどのエラジタンニン；ウロリチンＭ５、ウロリチンＣの前駆体である、ウロリチンＤやウロリチンＭ６などが挙げられる。好ましくは、エラグ酸及び／又はエラジタンニンである。
　エラグ酸やエラジタンニンを生産する植物としては特に制限はないが、例えば、ザクロ、ラズベリー、ブラックベリー、クラウドベリー、ボイセンベリー、イチゴ、クルミ、ゲンノショウコ等が挙げられる。このうち、エラグ酸及び／又はエラジタンニンを高含有していることから、ザクロ、ボイセンベリー、ゲンノショウコが好ましく、ザクロがより好ましい。
　ウロリチンＣの原料は、ウロリチンＣの原料を含有する溶液において、ウロリチンＣの原料からウロリチンＣを生成する能力を有する微生物に、ウロリチンＣの原料からウロリチンＣを生成させられるならばいずれでもよく、また、１種でも２種以上でもよい。
（ウロリチンＣを生成する能力を有する微生物）
　本実施態様における、ウロリチンＣの原料からウロリチンＣを生成する能力を有する微生物は、特に制限されない。例えば、ゴルドニバクター（Gordonibacter）属に属する微生物や、エガセラ（Eggerthella）属に属する微生物が好ましい。
　ゴルドニバクター（Gordonibacter）属に属する微生物の中では、ゴルドニバクター・パメラエアエ（Gordonibacter pamelaeae）に属する微生物や、ゴルドニバクター・ウロリチファシエンス（Gordonibacter urolithinfaciens）に属する微生物がより好ましい。
　さらに、ゴルドニバクター・パメラエアエ（Gordonibacter pamelaeae）に属する微生物であれば、ＤＳＭ　１９３７８株がさらに好ましく、ゴルドニバクター・ウロリチファシエンス（Gordonibacter urolithinfaciens）に属する微生物であれば、ＤＳＭ　２７２１３株がさらに好ましい。
　エガセラ（Eggerthella）属に属する微生物の中では、エガセラ・エスピー（Eggerthella sp.）に属する微生物が好ましく、ＤＣ　３５６３（ＮＩＴＥ　ＢＰ－０２３７６）株がより好ましい。
　以上の微生物は、属、種、株に拘らず、１種でも２種以上を用いてもよい。
　尚、ＤＣ　３５６３（ＮＩＴＥ　ＢＰ－０２３７６）株は、2016年11月11日付で、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（NITE Patent Microorganisms Depositary, National Institute of Technology and Evaluation）［あて名：〒292-0818　千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 122号室］にブダペスト条約に基づく国際寄託がなされたものである。
（ウロリチンＣを生成する能力を有する微生物の静止菌体）
　ウロリチンＣを生成する能力を有する微生物は、その静止菌体を含む。静止菌体については、上記「第１のウロリチン類から第２のウロリチン類を生成する能力を有する微生物の静止菌体」の記載が援用される。
（ウロリチンＣの原料を含有する溶液）
　ウロリチンＣの原料を含有する溶液とは、該溶液において、ウロリチンＣの原料からウロリチンＣを生成する能力を有する微生物に、ウロリチンＣの原料からウロリチンＣを生成させることができるものであれば特に制限されない。好ましくは培地であり、より好ましくは前述した「培地、及び培養による第２のウロリチン類の生成」欄の培地である。静止菌体である場合には、前述した塩溶液や緩衝液が好ましい。
　溶液中のウロリチンＣの原料の含有量としては、通常０．０１ｇ／Ｌ以上、好ましくは０．１ｇ／Ｌ以上、より好ましくは１．０ｇ／Ｌ以上である。一方、通常１００ｇ／Ｌ以下、好ましくは２０ｇ／Ｌ以下、より好ましくは１０ｇ／Ｌ以下である。
（培地、及び培養によるウロリチンＣの生成）
　ウロリチンＣの原料を含有する溶液において、ウロリチンＣの原料からウロリチンＣを生成する能力を有する微生物に、ウロリチンＣの原料からウロリチンＣを生成させる場合、前記溶液は培地であることが好ましい。より好ましい培地や、培養条件等の詳細は、前述した「培地、及び培養による第２のウロリチン類の生成」欄の記載が援用される。
　上記同様、培養液に界面活性剤、吸着剤、包摂化合物などを添加することにより、ウロリチンＣの生成を促進できる場合がある。包摂化合物としては、例えば、α‐シクロデキストリン、β‐シクロデキストリン、γ‐シクロデキストリン、クラスターデキストリン（高度分岐環状デキストリン）などを挙げることができる。特に、γ‐シクロデキストリンが最も効果的であり、α‐シクロデキストリン、β‐シクロデキストリンも効果を有している。また、２種以上の包摂化合物を共存させることにより、ウロリチンＣの生成を更に促進できる場合がある。
　添加量としては、ウロリチンＣの原料の総量に対し、モル比の総量で、通常０．２当量以上、好ましくは１．０当量以上、より好ましくは２．０当量以上であり、一方、通常１０．０当量以下、好ましくは５．０当量以下、より好ましくは４．０当量以下である。
（静止菌体によるウロリチンＣの生成）
　ウロリチンＣの原料からウロリチンＣを生成する能力を有する微生物が静止菌体である場合の溶液は、培地の代わりに、前述した「第１のウロリチン類から第２のウロリチン類を生成する能力を有する微生物の静止菌体」欄に記載した塩溶液や緩衝液が好ましい。その他の条件については、上記「培地、及び培養による第２のウロリチン類の生成」欄の記載が援用される。
＜１－２．好ましい一実施態様＞
　次に、本発明の他の好ましい一実施態様を記載する。
　本実施態様は、第１のウロリチン類がウロリチンＭ５であり、第２のウロリチン類がウロリチンＥであり、第１のウロリチン類から第２のウロリチン類を生成する能力を有する微生物がクロストリジウム（Clostridium）属に属する微生物である場合の態様である。
　すなわち、下記工程（ａ２）を含む、ウロリチンＥの製造方法である。
　工程（ａ２）：ウロリチンＭ５を含有する溶液において、ウロリチンＭ５からウロリチンＥを生成する能力を有するクロストリジウム（Clostridium）属に属する微生物に、ウロリチンＭ５からウロリチンＥを生成させる工程。
　尚、ウロリチンＭ５は、どのような方法により調製されたものでもよい。その例として、上記した、工程（ａ１）を含む、ウロリチンＡの製造方法におけるウロリチンＣの態様を援用する。
　ただし、ウロリチンＭ５の原料としては、例えば、エラグ酸；該エラグ酸の前駆体である、プニカラジン、ゲラニインなどのエラジタンニンなどが挙げられる。好ましくは、エラグ酸及び／又はエラジタンニンである。
＜１－３．好ましい一実施態様＞
　次に、本発明の他の好ましい一実施態様を記載する。
　本実施態様は、第１のウロリチン類がウロリチンＭ６であり、第２のウロリチン類がウロリチンＭ７であり、第１のウロリチン類から第２のウロリチン類を生成する能力を有する微生物がクロストリジウム（Clostridium）属に属する微生物である場合の態様である。
　すなわち、下記工程（ａ３）を含む、ウロリチンＭ７の製造方法である。
　工程（ａ３）：ウロリチンＭ６を含有する溶液において、ウロリチンＭ６からウロリチンＭ７を生成する能力を有するクロストリジウム（Clostridium）属に属する微生物に、ウロリチンＭ６からウロリチンＭ７を生成させる工程。
　尚、ウロリチンＭ６は、どのような方法により調製されたものでもよい。その例として、上記した、工程（ａ１）を含む、ウロリチンＡの製造方法におけるウロリチンＣの態様を援用する。
　ただし、ウロリチンＭ６の原料としては、例えば、エラグ酸；該エラグ酸の前駆体である、プニカラジン、ゲラニインなどのエラジタンニン；ウロリチンＭ６の前駆体であるウロリチンＭ５などが挙げられる。
＜１－４．好ましい一実施態様＞
　次に、本発明の他の好ましい一実施態様を記載する。
　本実施態様は、第１のウロリチン類がイソウロリチンＡであり、第２のウロリチン類がウロリチンＢであり、第１のウロリチン類から第２のウロリチン類を生成する能力を有する微生物がクロストリジウム（Clostridium）属に属する微生物である場合の態様である。
　すなわち、下記工程（ａ４）を含む、ウロリチンＢの製造方法である。
　工程（ａ４）：イソウロリチンＡを含有する溶液において、イソウロリチンＡからウロリチンＢを生成する能力を有するクロストリジウム（Clostridium）属に属する微生物に、イソウロリチンＡからウロリチンＢを生成させる工程。
　尚、イソウロリチンＡは、どのような方法により調製されたものでもよい。
　イソウロリチンＡの原料としては、例えば、エラグ酸；該エラグ酸の前駆体である、プニカラジン、ゲラニインなどのエラジタンニン；ウロリチンＭ５、ウロリチンＭ６、イソウロリチンＡの前駆体であるウロリチンＣなどが挙げられる。
　例えば、イソウロリチンＡの原料としてウロリチンＣを用いる場合には、ウロリチンＣを含有する溶液において、ウロリチンＣからイソウロリチンＡを生成する能力を有する微生物に、ウロリチンＣからイソウロリチンＡを生成させる工程を含む、イソウロリチンＡの製造方法により得られたものを用いてもよい。
　ウロリチンＣからイソウロリチンＡを生成する能力を有する微生物は、ウロリチンＣからイソウロリチンＡを生成する能力を有する微生物ならば特に制限されないが、嫌気性の微生物であることが好ましい。
　その具体例としては、スラッキア（Slackia）属に属する微生物が挙げられる。より具体的には、スラッキア・ヘリオトリニレデュセンス（Slackia heliotrinireducens）に属する微生物が挙げられる。さらに具体的には、スラッキア・ヘリオトリニレデュセンス（Slackia heliotrinireducens）ＤＳＭ　２０４７６株等が挙げられる。
　以上の微生物は、属、種、株に拘らず、１種でも２種以上を用いてもよい。
　尚、イソウロリチンＡの原料としてウロリチンＭ５を用いる場合には、上記した、工程（ａ２）を含む、ウロリチンＥの製造方法におけるウロリチンＭ５の態様を援用する。
　また、イソウロリチンＡの原料としてウロリチンＭ６を用いる場合には、上記した、工程（ａ３）を含む、ウロリチンＭ７の製造方法におけるウロリチンＭ６の態様を援用する。
　その他については、上記した、工程（ａ１）を含む、ウロリチンＡの製造方法におけるウロリチンＣの態様を援用する。
＜２．第２のウロリチン類を含む飲食品の製造方法＞
　本発明の第二の発明である、第２のウロリチン類を含む飲食品の製造方法は、上記工程（ａ）及び下記工程（ｃ）を含むが、その他の工程を含んでもよい。尚、本発明の第二の発明で製造される飲食品は、サプリメントを含む。サプリメントとは、dietary supplementからなる飲食品区分の１つである。
（１）工程（ａ）
　工程（ａ）については、前述した本発明の第一の発明における工程（ａ）の記載が援用される。
（２）工程（ｃ）
　工程（ｃ）は、上記工程（ａ）で生成した第２のウロリチン類と飲食品原料とを配合して飲食品とする工程である。該飲食品は、常法に従い、通常用いられる飲食品原料と上記工程（ａ）で生成した第２のウロリチン類とを配合することにより製造され、その配合時期は特に制限されない。また、飲食品原料には食品添加物も含まれる。さらに、必要に応じて、瓶、袋、缶、箱、パック等の適宜の容器に封入することができる。
　本発明の第二の発明で製造される飲食品は、水、タンパク質、糖質、脂質、ビタミン類、ミネラル類、有機酸、有機塩基、果汁、フレーバー類等を主成分とするものであってよい。
　タンパク質としては、例えば、全脂粉乳、脱脂粉乳、部分脱脂粉乳、カゼイン、大豆タンパク質、鶏卵タンパク質、肉タンパク質等の動植物性タンパク質、及びこれらの加水分解物、バターなどが挙げられる。
　糖質としては、糖類、加工澱粉（デキストリンのほか、可溶性澱粉、ブリティッシュスターチ、酸化澱粉、澱粉エステル、澱粉エーテル等）、食物繊維などが挙げられる。
　脂質としては、例えば、ラード、サフラワー油、コーン油、ナタネ油、ヤシ油、これらの分別油、水素添加油、エステル交換油等の植物性油脂などが挙げられる。
　ビタミン類としては、例えば、ビタミンＡ、カロチン類、ビタミンＢ群、ビタミンＣ、ビタミンＤ群、ビタミンＥ、ビタミンＫ群、ビタミンＰ、ビタミンＱ、ナイアシン、ニコチン酸、パントテン酸、ビオチン、イノシトール、コリン、葉酸などが挙げられる。
　ミネラル類としては、例えば、カルシウム、カリウム、マグネシウム、ナトリウム、銅、鉄、マンガン、亜鉛、セレン、乳清ミネラルなどが挙げられる。
　有機酸としては、例えば、リンゴ酸、クエン酸、乳酸、酒石酸などが挙げられる。
　これらの成分は、２種以上を組み合わせて使用してもよく、合成品であってもよい。
　本発明の第二の発明で製造される飲食品の全量に対する上記工程（ａ）で生成した第２のウロリチン類の含有量は、特に制限されないが、該飲食品を摂取した場合に、抗酸化、抗炎症、抗糖化、マイトファジー促進作用などの第２のウロリチン類による効果を得ることできる含有量であることが好ましい。
　飲食品全量に対する第２のウロリチン類の含有量は、通常０．０００１質量％以上、好ましくは０．００１質量％以上、より好ましくは０．０１質量％以上であり、また、通常１０質量％以下、好ましくは１質量％以下、より好ましくは０．１質量％以下である。
　飲食品がサプリメントである場合、その形態は、固形物、ゲル状物、液状物の何れの形態であってもよく、例えば、各種加工飲食品、粉末、錠剤、丸剤、カプセル、ゼリー、顆粒等の形態にすることができる。さらに、必要に応じて、瓶、袋、缶、箱、パック等の適宜の容器に封入することができる。
　また、サプリメントには、デキストリン等の賦形剤、ビタミンＣ等の保存剤、バニリン等の嬌味剤、ベニバナ色素等の色素、単糖、オリゴ糖および多糖類（例、グルコース、フルクトース、スクロース、サッカロース、およびこれらを含有する糖質）、酸味料、香料、油脂、乳化剤、全脂粉乳、または寒天などの添加剤を配合していてもよい。これらの成分は、２種以上を組み合わせて使用してもよく、合成品であってもよい。
　以下、具体的な実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
　ＡＢＢ培地（Ｏｘｏｉｄ社製）に、基質としてウロリチン骨格の９位に水酸基を有するウロリチン類（表２）を添加した後、加熱滅菌し、気相をＮ２：ＣＯ２：Ｈ２（８０％／１０％／１０％）ガスで置換したものを基本培地とした。各基質を終濃度１．０ｇ／Ｌで含む基本培地に、クロストリジウム・ボルテアエＪＣＭ　１２２４３株を植菌し、３７℃で嫌気的に２週間培養した。培養終了後、培養液５ｍＬに対して等量の酢酸エチルでウロリチン類を抽出し、得られた酢酸エチル相を減圧濃縮し、乾固した。このようにして得た乾固物をメタノール０．５ｍＬに再溶解し、ＨＰＬＣによりウロリチン類の定量分析を行った。
　ＨＰＬＣは以下に記載の条件で行った。ＤＡＬＴＯＮ  ＰＨＡＲＭＡ社製のウロリチン類を標品として用い、ＤＭＳＯに溶解して用いた。
　結果を表２に示す。９位に水酸基を有するウロリチン類から９位の水酸基が脱離したウロリチン類が生成した。
＜ＨＰＬＣ分析条件＞
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ　ＯＤＳ‐３（２５０×４．６ｍｍ）（ＧＬ　Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）
溶離液：水／アセトニトリル／酢酸＝７４／２５／１
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
検出：３０５ｎｍ
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
［実施例２］
　ＡＢＢ培地（Ｏｘｏｉｄ社製）に、ウロリチンＡの前駆体としてウロリチンＣを添加した後、加熱滅菌し、気相をＮ２：ＣＯ２：Ｈ２（８０％／１０％／１０％）ガスで置換したものを基本培地とした。最終濃度１．０ｇ／ＬのウロリチンＣを含む基本培地に、クロストリジウム・ボルテアエＤＳＭ　１５６７０株、又は、ＤＳＭ　２９４８５株を植菌し、３７℃で嫌気的に培養した。培養終了後、培養液５ｍＬに対して等量の酢酸エチルでウロリチン類を抽出し、得られた酢酸エチル相を減圧濃縮し、乾固した。このようにして得た乾固物をメタノール０．５ｍＬに再溶解し、ＨＰＬＣによりウロリチン類の定量分析を行った。
　ＨＰＬＣは実施例１と同じ条件で行った。ＤＡＬＴＯＮ ＰＨＡＲＭＡ社製のウロリチン類を標品として用い、ＤＭＳＯに溶解して用いた。その結果、２週間の培養により、それぞれにおいて、添加したウロリチンＣの１００％、８９％がウロリチンＡに変換された。
［実施例３］
　クロストリジウム・アスパラギフォルメＤＳＭ　１５９８１株を用いて５日間の培養をしたこと以外は実施例２と同様にした結果、添加したウロリチンＣの９５％がウロリチンＡに変換された。
［実施例４］
　クロストリジウム・シトロニアエＤＳＭ　１９２６１株を用いて５日間の培養をしたこと以外は実施例２と同様にした結果、添加したウロリチンＣの８２％がウロリチンＡに変換された。
［実施例５］
　０．１％エラグ酸（ＳＩＧＭＡ社製）を含むＡＢＢ培地（Ｏｘｏｉｄ社製）に、クロストリジウム・ボルテアエＪＣＭ　１２２４３株及びゴルドニバクター・パメラエアエＤＳＭ　１９３７８株を植菌し、実施例２と同様に培養した結果、２週間の培養により、添加したエラグ酸の６７％がウロリチンＡに変換された。
［実施例６］
　クロストリジウム・ボルテアエＪＣＭ　１２２４３株及びゴルドニバクター・ウロリチファシエンスＤＳＭ　２７２１３株を用いたこと以外は実施例５と同様に培養した結果、２週間の培養により、添加したエラグ酸の６２％がウロリチンＡに変換された。
［実施例７］
　クロストリジウム・アスパラギフォルメＤＳＭ　１５９８１株及びゴルドニバクター・ウロリチファシエンスＤＳＭ　２７２１３株を用いたこと以外は実施例５と同様に培養した結果、５日間の培養により、添加したエラグ酸の６０％がウロリチンＡに変換された。
［実施例８］
　クロストリジウム・シトロニアエＤＳＭ　１９２６１株及びゴルドニバクター・ウロリチファシエンスＤＳＭ　２７２１３株を用いたこと以外は実施例５と同様に培養した結果、５日間の培養により、添加したエラグ酸の６０％がウロリチンＡに変換された。
［実施例９］
　ウロリチンＣの添加量を０．８１ｇ／Ｌとし、気相を窒素のみとする条件又は窒素：水素 （９０％／１０％）とする条件で実施例２と同様に培養して、ウロリチンＡの生成に及ぼす水素の影響を比較した。３日間の培養により、添加したウロリチンＣに対する生成したウロリチンＡは、気相に水素が存在しない場合の７３％に対して、存在する場合が８６％であり、気相に水素が存在することにより、ウロリチンＡの生成が促進された。
［実施例１０］
　ウロリチンＣの添加量を０．８１ｇ／Ｌとし、さらに、ウロリチンＣに対してモル比で１．２当量のα‐シクロデキストリン、β‐シクロデキストリン、もしくは、γ-シクロデキストリンを添加した場合又は添加しない場合で、実施例２と同様に培養して、ウロリチンＡの生成に及ぼす各種シクロデキストリンの影響を比較した。
　５日間の培養により、各種シクロデキストリンを添加しなかった場合の収率４７％に対して、α‐シクロデキストリンを添加した場合の収率が７８％、β‐シクロデキストリンを添加した場合の収率が６６％、γ‐シクロデキストリンを添加した場合の収率が９８％であり、シクロデキストリンを反応液に添加することにより、ウロリチンＡの生成が促進された。
　本発明によれば、９位に水酸基を有するウロリチン類から該９位の水酸基が脱離された他のウロリチン類を製造することができる。
　製造されたウロリチン類は、化粧品、医薬部外品、医療用品、衛生用品、医薬品、飲食品（サプリメントを含む。）等は、抗酸化、抗炎症、抗糖化等のために用いられる。
　本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。

Claims (22)

  1. 　下記工程（ａ）を含む、下記一般式（２）で表される第２のウロリチン類の製造方法。
    　工程（ａ）：下記一般式（１）で表される第１のウロリチン類を含有する溶液において、第１のウロリチン類から下記一般式（２）で表される第２のウロリチン類を生成する能力を有する微生物に、第１のウロリチン類から第２のウロリチン類を生成させる工程。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式中、Ｒ１乃至Ｒ７は、それぞれ、水酸基、水素原子又はメトキシ基を表し、且つ、Ｒ１乃至Ｒ７のうち１つ以上は水酸基である。）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （式中、Ｒ１乃至Ｒ７は、それぞれ、前記一般式（１）で表される第１のウロリチン類のＲ１乃至Ｒ７と同一である。）
  2. 　前記第１のウロリチン類と前記第２のウロリチン類の組み合わせが、それぞれ、ウロリチンＭ５とウロリチンＥの組み合わせ、ウロリチンＭ６とウロリチンＭ７の組み合わせ、ウロリチンＣとウロリチンＡの組み合わせ、又はイソウロリチンＡとウロリチンＢの組み合わせである、請求項１に記載の製造方法。
  3. 　前記微生物がクロストリジウム（Clostridium）属に属する微生物である、請求項１又は２に記載の製造方法。
  4. 　前記クロストリジウム（Clostridium）属に属する微生物が、クロストリジウム・ボルテアエ（Clostridium bolteae）に属する微生物、クロストリジウム・アスパラギフォルメ（Clostridium asparagiforme）に属する微生物、及びクロストリジウム・シトロニアエ（Clostridium citroniae）に属する微生物から成る群から選択される１以上である、請求項３に記載の製造方法。
  5. 　前記クロストリジウム・ボルテアエ（Clostridium bolteae）に属する微生物が、クロストリジウム・ボルテアエ（Clostridium bolteae）ＪＣＭ　１２２４３株、ＤＳＭ　１５６７０株、及びＤＳＭ　２９４８５株から成る群から選択される１以上である、請求項４に記載の製造方法。
  6. 　前記クロストリジウム・アスパラギフォルメ（Clostridium asparagiforme）に属する微生物が、クロストリジウム・アスパラギフォルメ（Clostridium asparagiforme）ＤＳＭ　１５９８１株である、請求項４又は５に記載の製造方法。
  7. 　前記クロストリジウム・シトロニアエ（Clostridium citroniae）に属する微生物が、クロストリジウム・シトロニアエ（Clostridium citroniae）ＤＳＭ　１９２６１株である、請求項４～６のいずれか１項に記載の製造方法。
  8. 　前記第１のウロリチン類と前記第２のウロリチン類の組み合わせが、それぞれ、ウロリチンＣとウロリチンＡの組み合わせである、請求項２～７のいずれか１項に記載の製造方法。
  9. 　前記ウロリチンＣが、ウロリチンＣの原料を含有する溶液において、ウロリチンＣの原料からウロリチンＣを生成する能力を有する微生物に、ウロリチンＣの原料から生成させて得られるものである、請求項８に記載の製造方法。
  10. 　さらに下記工程（ｂ１）を含み、前記工程（ａ）及び該工程（ｂ１）が同一の系で行われる、請求項８に記載の製造方法。
    　工程（ｂ１）：ウロリチンＣの原料を含有する溶液において、ウロリチンＣの原料からウロリチンＣを生成する能力を有する微生物に、ウロリチンＣの原料からウロリチンＣを生成させる工程。
  11. 　前記ウロリチンＣの原料からウロリチンＣを生成する能力を有する微生物が、ゴルドニバクター（Gordonibacter）属に属する微生物である、請求項９又は１０に記載の製造方法。
  12. 　前記ゴルドニバクター（Gordonibacter）属に属する微生物が、ゴルドニバクター・パメラエアエ（Gordonibacter pamelaeae）に属する微生物及び／又はゴルドニバクター・ウロリチファシエンス（Gordonibacter urolithinfaciens）に属する微生物である、請求項１１に記載の製造方法。
  13. 　前記ゴルドニバクター・パメラエアエ（Gordonibacter pamelaeae）に属する微生物が、ゴルドニバクター・パメラエアエ（Gordonibacter pamelaeae）ＤＳＭ　１９３７８株である、請求項１２に記載の製造方法。
  14. 　前記ゴルドニバクター・ウロリチファシエンス（Gordonibacter urolithinfaciens）に属する微生物が、ゴルドニバクター・ウロリチファシエンス（Gordonibacter urolithinfaciens）ＤＳＭ　２７２１３株である、請求項１２又は１３に記載の製造方法。
  15. 　前記ウロリチンＣの原料が、エラグ酸及び／又はエラジタンニンである、請求項９～１４のいずれか１項に記載の製造方法。
  16. 　気相が水素を含む環境下で工程（ａ）が行われる、請求項１～１５のいずれか１項に記載の製造方法。
  17. 　前記気相における前記水素の割合が０．５％以上２０％以下である、請求項１６に記載の製造方法。
  18. 　前記工程（ａ）において、前記ウロリチンＣを含有する溶液が、α‐シクロデキストリン、β‐シクロデキストリン及びγ‐シクロデキストリンからなる包摂化合物の群から選択される１種以上をさらに含む、請求項８～１７のいずれか１項に記載の製造方法。
  19. 　前記包摂化合物が、前記ウロリチンＣに対してモル比の総量で０．１当量以上５．０当量以下である、請求項１８に記載の製造方法。
  20. 　前記工程（ｂ１）において、前記ウロリチンＣの原料を含有する溶液が、α‐シクロデキストリン、β‐シクロデキストリン及びγ‐シクロデキストリンからなる包摂化合物の群から選択される１種以上をさらに含む、請求項１０～１９のいずれか１項に記載の製造方法。
  21. 　前記包摂化合物が、前記エラグ酸及び／又はエラジタンニンの総量に対してモル比の総量で０．２当量以上１０．０当量以下である、請求項２０に記載の製造方法。
  22. 　下記工程（ａ１）及び（ｃ）を含むウロリチンＡを含む飲食品の製造方法。
    　工程（ａ１）：ウロリチンＣを含有する溶液において、ウロリチンＣからウロリチンＡを生成する能力を有する微生物に、ウロリチンＣからウロリチンＡを生成させる工程；及び、
    　工程（ｃ）：上記工程（ａ１）で生成したウロリチンＡと飲食品原料とを配合して飲食品とする工程。
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