WO2018091756A1 - Preparación de nuevos bioconjugados y anticuerpos para la inmunodetección de ocratoxina a - Google Patents

Preparación de nuevos bioconjugados y anticuerpos para la inmunodetección de ocratoxina a Download PDF

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bioconjugate
antibody
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Antonio Abad Fuentes
Josep Vicent Mercader Badia
Antonio Abad Somovilla
Consuelo AGULLÓ BLANES
Daniel LÓPEZ PUERTOLLANO
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Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Universitat de Valencia
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    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies

Definitions

  • the present invention relates to bioconjugates and labeled derivatives of ocratoxin A by different positions of the molecule, suitable for the production of high affinity antibodies for ocratoxin A.
  • the present invention also relates to the use of bioconjugates of ocratoxin A and of labeled derivatives of ocratoxin A as test antigens.
  • the present invention also relates to methods of analysis, concentration and extraction of ocratoxin A using the antibodies obtained, sometimes together with test antigens that are bioconjugates or labeled derivatives.
  • This invention also provides a kit for analyzing ochratoxin A comprising antibodies against this mycotoxin, sometimes together with test antigens that are bioconjugates or labeled derivatives of ochratoxin A.
  • Biotoxins are a type of pollutant whose presence in food, water and feed represents a real problem for human health and animal welfare, causing significant economic losses to the agri-food, agriculture and fish farming sectors.
  • the most frequently detected class of biotoxins in foods are those produced by fungi, or mycotoxins. Although more than 400 different mycotoxins have been identified with a great structural diversity, it is about the most toxicologically relevant ones on which there is a more defined regulation regarding the maximum limits allowed in foods.
  • Ochratoxin A is the most important mycotoxin in the ochratoxin family. Structurally it consists of a molecule of L-phenylalanine linked, through an amide bridge, to a p-chlorophenolic group that contains a dihydroisocumarin group ( Figure 1). The main harmful effects of this mycotoxin are nephrotoxic, although hepatotoxic, neurotoxic, teratogenic, immunotoxic and carcinogenic activity has also been observed in different animal species. Ochratoxin A is suspected of being the cause of chronic fatal outcome diseases, such as endemic Balkan nephropathy (BEN) and Tunisian nephropathy (TCIN).
  • BEN Balkan nephropathy
  • TCIN Tunisian nephropathy
  • the analytical techniques for the determination of ochratoxin A in food are fundamentally of two types: chromatographic and molecular recognition. Among the former, the one with the most acceptance today is HPLC-MS / MS, while among the latter the majority employ antibodies as a detection element. Chromatographic techniques constitute the reference methodology, due to their high sensitivity, reproducibility and mainly because of their ability to determine several mycotoxins simultaneously (K. F. Nielsen et al., J. Agrie. Food Chem. 2015, 63, 1029-1034).
  • Immunoanalytical methods are based on selective, reversible and non-covalent binding between the substance to be detected (analyte) and an antibody that specifically recognizes it.
  • Ochratoxin A due to its low molecular weight, is not immunogenic, and therefore is unable to generate an immune response by itself. when injected into an experimental animal.
  • In order to generate antibodies for ochratoxin A it is necessary to covalently couple it to a protein, so that the conjugate obtained is immunogenic and allows the production of antibodies against mycotoxin.
  • the present invention provides bioconjugates and labeled derivatives of ocratoxin A, and the use of bioconjugates for obtaining antibodies to ocratoxin A.
  • a first aspect of the present invention relates to a bioconjugate of general formula (I): where:
  • T is selected from the group consisting of R-l and R-ll;
  • L is a hydrocarbon chain of 0 to 40 carbon atoms, where the chain is linear or branched, saturated or unsaturated, and said hydrocarbon chain comprises the substitution of 0 to 10 carbon atoms by heteroatoms, which are selected from the group consisting in S, O and N; preferably L is a linear hydrocarbon chain of 1 to 20 carbon atoms and said hydrocarbon chain comprises between 0 and 4 heteroatoms selected from the group consisting of O and N, and more preferably L is a saturated linear hydrocarbon chain of 1 to 10 atoms of carbon and optionally the hydrocarbon chain comprises between 1 and 4 heteroatoms selected from the group consisting of O and N; and Z is a functional group selected from:
  • peptide or polypeptide P is a natural or synthetic peptide or polypeptide of molecular weight greater than 2000 daltons.
  • the peptide or polypeptide P may or may not be linked, by covalent, electrostatic or other interaction, to a support.
  • Said support may be a synthetic polymer or not, or be composed of nanomaterials such as carbon nanotubes, zeolites or mesoporous silica.
  • the bioconjugate of formula (I) described in this patent application is characterized in that P is selected from the group consisting of albumin, thyroglobulin, hemocyanin, beta-galactosidase, peroxidase, phosphatase and oxidase. More preferably P is peroxidase or albumin, which can be egg albumin or serum albumin; and n is a number with a value between 1 and 500; preferably n is a value between 1 and 100.
  • n indicates the degree of conjugation, that is, the molar ratio between the fraction derived from the T-L-Z fragment and the P peptide or polypeptide, in the resulting bioconjugate of formula (I).
  • the bioconjugate of formula (I) is a bioconjugate of formula (la)
  • P and n have been defined above.
  • P is albumin or peroxidase and n is a value selected from 1 to 50.
  • bioconjugate of formula (I) is a bioconjugate of formula (Ib)
  • P and n have been defined above.
  • P is albumin or peroxidase and n is a value selected from 1 to 50.
  • the bioconjugate of formula (! of the present invention can be obtained by a method comprising reacting a functionalized derivative (hapten) of ochratoxin A with P, a natural or synthetic polypeptide of molecular weight greater than 2000 daltons, by methods widely known in the art.
  • the derivative when the carrier material is a detectable non-isotopic marker, the derivative is a compound of formula (II): where T, L and Z have the same meaning defined above for the bioconjugate of formula (I);
  • Q is a detectable non-isotopic marker
  • m is a number with a value between 1 and 1000; preferably m is a value selected from 1 to 100.
  • marker is understood as any molecule or fragment that gives rise to a signal measurable by any type of analytical technique.
  • Q identifies a fragment or a non-isotopic chemical detector, marker or tracer.
  • Q is an enzyme, biotin, a luminescent compound, a fluorophore, a marker coupled to an indirect detection system, micro or nanoparticles or others.
  • Q is selected from the group consisting of peroxidase, alkaline phosphatase, biotin, fluorescein or any of its derivatives, a cyanine fluorophore, a rhodamine fluorophore, a coumarin fluorophore, a ruthenium bipyryl, luciferin or any one of its derivatives, an acridinium ester, quantum nanoparticles (in English quantum dots), and micro- or nanoparticles of colloidal gold, carbon or latex.
  • L in the compound of formula (II), is a linear hydrocarbon chain of 1 to 20 carbon atoms and said hydrocarbon chain comprises between 0 and 4 heteroatoms selected from the group consisting of O and N, and more preferably L is a saturated linear hydrocarbon chain of 1 to 10 carbon atoms and optionally the hydrocarbon chain comprises between 1 and 4 heteroatoms selected from the group consisting of O and N;
  • This compound of formula (II) can be used with an ocratoxin A antibody to determine or detect this mycotoxin in a sample by immunoassay technology.
  • the derivative of formula (II) is a derivative of formula (lia)
  • Q is selected from the group consisting of peroxidase, biotin, fluorescein or nanoparticles, and m is a value selected between 1 and 10.
  • the derivative of formula (II) is a derivative of formula (llb)
  • Q is selected from the group consisting of peroxidase, biotin, fluorescein or nanoparticles, and m is a value selected between 1 and 10.
  • the labeled derivative of formula (II) of the present invention can be obtained by a method comprising reacting a functionalized derivative (hapten) of ochratoxin A with Q, a non-isotopic marker, by methods widely known in the art.
  • the bioconjugate of formula (I) of the present invention can be used for the production of antibodies, or together with an ocratoxin A antibody to determine or detect this mycotoxin in a sample by immunoassay technology.
  • the labeled derivatives of formula (II) can be used together with an ocratoxin A antibody to determine or detect this mycotoxin in a sample by immunoassay technology.
  • haptens In order to obtain antibodies against ocratoxin A, functionalized derivatives of said mycotoxin (haptens) have been prepared, that is, structural analogs of ocratoxin A that incorporate a functional group capable of being used for conjugation to a P carrier or Q marker. This functional group it is separated from the skeleton of the ochratoxin A molecule by a spacer L.
  • antibody refers to the immunoglobulin that an animal or a hybrid cell (such as a hybridoma) synthesizes specifically against the immunogen of the invention (bioconjugate of the invention).
  • a third aspect of the present invention relates to an antibody (hereinafter antibody of the invention) generated in response to a bioconjugate of the invention, in particular the bioconjugate of formula (I). More preferably the antibodies are generated in response to the bioconjugate of formula (la) or (Ib), more preferably to the bioconjugate of formula (la).
  • a fourth aspect of the invention relates to the use of the bioconjugate described above for obtaining antibodies.
  • the method of obtaining the antibodies of the invention from bioconjugates of the invention can be carried out by immunization methods widely known in the art, such as from the immunization of an animal.
  • Antibodies generated from a bioconjugate of the present The invention may be polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, recombinant antibodies or antibody fragments.
  • the antibodies of the invention have high affinity and specificity towards ochratoxin A.
  • antiserum of the invention Another aspect of the present invention relates to an antiserum (hereinafter antiserum of the invention) comprising the antibodies of the invention.
  • antiserum refers to a serum obtained after immunization of an animal with an immunogen.
  • the antiserum comprises antibodies specific to said immunogen generated after the immune response produced in the animal.
  • the immunogen is the bioconjugate of the invention and the antiserum comprises specific antibodies generated against the bioconjugate of the invention, the antibodies of the invention.
  • a fifth aspect of the present invention relates to a method of in vitro analysis of ocratoxin A in a sample comprising the use of the antibody described above.
  • this method comprises the following steps: a) contacting the sample with the antibody or antiserum of the invention;
  • step (a) incubating the sample and the antibody (or antiserum) of step (a) for a suitable period of time for an immunochemical reaction to take place;
  • step (b) determine the existence of immunochemical reaction after the incubation of step (b).
  • the method of the present invention allows quantitative determination or qualitative analysis of the content of mycotoxin ocratoxin A in a sample. Also, the method of the present invention allows analyzing the content of ocratoxin A in different types of samples, for example, food samples, such as cereals, fruits and wines, environmental samples such as water, soil or surface, and isolated biological samples such I eat urine
  • the present invention provides a method of in vitro analysis of ocratoxin-A in wines, beers and juices.
  • the determination of the immunochemical reaction in step (c) is performed by a competitive immunoassay, using as a competitor a bioconjugate of formula (I) or a labeled derivative of formula (II).
  • the competitive immunoassay is of the ELISA type.
  • immunoassay refers to an analytical assay in which an immunochemical reaction occurs for the detection or quantification of an analyte.
  • Competitive immunoassays are those in which the analyte competes with another molecule for binding with the antibody.
  • antigen in this patent application refers to a molecule capable of interacting specifically with an antibody.
  • the immunochemical interaction or reaction consists of the specific and non-covalent binding between an antibody and an antigen, which may be the analyte or a test antigen.
  • test antigen refers to a bioconjugate of formula (I) or a labeled derivative of formula (II) that is used in the competitive assay.
  • a sixth aspect of the present invention also relates to an ocratoxin A detection kit that uses at least one antibody of the invention. Additionally, the ocratoxin A detection kit may comprise a bioconjugate of formula (I) or a labeled derivative of formula (II) as described in the present patent application.
  • a seventh aspect of the present invention also relates to a method of purification and / or concentration of ochratoxin A from a sample comprising the use of the antibody described above.
  • this method is based on immobilizing at least one antibody of the invention on any support and passing a sample through said support to retain the ochratoxin A present in said sample.
  • Subsequent elution of the ochratoxin A retained in the support by methods widely known in the art (change of pH, modification of ionic strength, use of chaiotropic agents) will allow its purification and / or concentration, in a system known as immunoaffinity chromatography.
  • this method comprises the following steps:
  • immunogen and “immunogenic” as used in the present invention refer to a substance that is recognized as foreign to the living organism and is therefore capable of producing or generating an immune response in a host.
  • the immunogen is a bioconjugate of formula (I).
  • FIGURES Fig. 1 Structure of ochratoxin-A.
  • Fig. 2. Scheme of the synthesis of the active ester of hapten OTA-1 (NHS-OTA-1).
  • Fig. 3. Scheme of the synthesis of the active ester of hapten OTA-2 (NHS-OTA-2).
  • Fig. 5. Scheme of the preparation of a bioconjugate of formula (I) from the corresponding functionalized derivative (active ester) of ocratoxin A.
  • BSA bovine serum albumin
  • OVA ovalbumin
  • HRP horseradish peroxidase
  • reaction mixture was stirred for 2 hours at room temperature and then a solution of amine 6 (153 mg, 0.44 mmol, 2 equiv) and DIEA (80 ⁇ L, 0.44 mmol, 2 equiv) in DMF was added anhydrous and stirred at room temperature for 4 hours, after which the reaction was diluted with AcOEt and washed successively with aqueous solutions of HCI (1M), LiCI (1.5%), NaHC0 3 (5%) and brine, It was dried over anhydrous MgSO 4 and the solvent was evaporated on the rotary evaporator.
  • the obtained residue was purified by column chromatography, using as eluent mixtures of hexane-AcOEt-AcOH (100: 0: 0.3, 90: 10: 0.3 and 80: 20: 0.3) to obtain compound 7 (107 mg, 83%) as a yellowish oil.
  • the reaction mixture was stirred at room temperature for 21 hours, after which it was diluted with AcOEt and washed successively with aqueous HCl (1M), LiCl (1.5%), NaHC0 3 (5%) and brine.
  • the organic phase was dried over anhydrous MgSO 4 and concentrated under reduced pressure to obtain a residue that was purified by column chromatography on silica gel, using hexane-AcOEt mixtures as eluent (80:20, 70:30 and 50: 50), to obtain the alkyne 9 (22.5 mg, 62%) as a yellowish oil.
  • the combined organic phases were washed with brine, dried over anhydrous gS0 4 and concentrated to dryness under reduced pressure to obtain an oily residue which was purified by column chromatography on silica gel, using as eluent mixtures of CHCI 3 -MeOH ( 100: 0, 95: 5 and 90:10), to obtain acid 11 (9.9 mg, 75%) as a yellowish oil.
  • reaction mixture was diluted with AcOEt and washed successively with water, a 5% aqueous solution of NaHC0 3 and brine. After evaporating to dryness, the residue obtained was passed through a small column of silica gel, using CH 2 CI 2 as eluent, to obtain N-hydroxysuccinimidyl ester 12 (9.6 mg, 79%) as an oil yellowish.
  • Trifluoroacetic acid (370 ⁇ L, 4.8 mmol, 370 equiv) was added dropwise over a solution of the ferc-butyl ester 12 (9.0 mg, 0.013 mmol) in anhydrous CH 2 CI 2 (760 ⁇ L) and the mixture resulting was kept under stirring for 2 hours at room temperature. After this, the reaction mixture was concentrated to dryness under reduced pressure to provide the NHS-OTA-1 ester (7.9 mg, 99%) as a resinous oil and brownish color.
  • the bioconjugate was purified following the procedure previously described for the BSA and OVA bioconjugates, and was brought to a concentration of 400 Mg / mL in PBS buffer with 1% (w / v) BSA and 0.02% thimerosal (p / v) and stored at 4 ° C.
  • reaction mixture was stirred at -78 ° C for 15 minutes and then allowed to warm slowly to -5 ° C (approximately 3 hours). After this time, the reaction mixture was treated with a 1: 2 mixture of AcOH-Et 2 0 and stirred for 10 minutes at 0 ° C, diluted with AcOEt and washed with water, brine and dried over MgSO 4 anhydrous to obtain, after evaporating the solvent in vacuo, a residue that was purified by chromatography, using hexane-AcOEt-AcOH mixtures as eluent (100: 0: 0.3, 95: 5: 0.3 and 85:15: 0.3) to obtain compound 14 (109.0 mg, 67%) as yellowish oil.
  • reaction mixture was then cooled in an ice bath and treated with a 1M aqueous solution of HCI (5.80 mL, 5.80 mmol, 18 equiv), it was stirred at 0 ° C for 2 hours, diluted with water and extracted with AcOEt.
  • the combined organic phases were washed with brine, dried over anhydrous MgSO 4 and concentrated to dryness under reduced pressure to obtain acid 15 (130.5 mg, 97%) as a yellowish semisolid, whose 1 H NMR shows that it has a purity high enough to be used in the next step without further purification.
  • the obtained residue was purified by chromatography on silica gel, using hexane-AcOEt-AcOH mixtures (100: 0: 0.3, 90: 10: 0.3, and 80: 20: 0.3) as eluent.
  • Amide 17 as a yellowish oil (87 mg, 65%).
  • reaction mixture was filtered on a small silica gel column, using AcOEt to wash, and the filtrate and washings were concentrated to dryness to provide alcohol 18 (65 mg, 90%) as an oil, whose NMR. 1 H shows the presence of a small percentage (5-6%) of the hydrogenolysis product of the C-CI bond.
  • reaction mixture was stirred for 2 hours at room temperature and then a solution of hydrochloride 16 (82.5 mg, 0.32 mmol, 2 equiv) and DIEA (60 ⁇ _, 0.324 mmol, 2 equiv) in anhydrous DMF was added (1, 1 mL). It was stirred at room temperature for 4 hours, after which the reaction mixture was diluted with AcOEt and washed successively with aqueous solutions of HCI (1M), LiCI (1.5%), NaHC0 3 (5%) and brine, dried over anhydrous MgSO 4 and concentrated to dryness on the rotary evaporator.
  • OVA-OTA-3J Preparation of a OTA-3 hapten bioconjugate with OVA (OVA-OTA-3J.
  • OVA-OTA-1 bioconjugate preparedd as described above for the OVA-OTA-1 bioconjugate from 100 ⁇ L of a 50 mM DMF solution of the NHS-OTA activated hapten -3 and 1.9 mL of an OVA solution (15 mg / mL) in 50 mM carbonate buffer, pH 9.6
  • the collected fractions were brought to a final concentration of 1 mg / mL in elution buffer with 0.01% thimerosal (v / v) and stored at -20 ° C.
  • the number of OTA-3 molecules conjugated per OVA molecule, determined by MALDI-TOF-MS, was n 3.0 (see Table 3, entry 2).
  • the signal produced by the peroxidase used as a marker was revealed with 100 ⁇ L per well of a 2 mg / mL solution of o-phenylenediamine in 25 mM citrate buffer, 62 mM phosphate, pH 5.4, containing 0.012% (v / v) of H 2 0 2 .
  • This development was developed for 10 min at room temperature and stopped using 100 ⁇ L per well of 2.5 M sulfuric acid.
  • the absorbance of each well was read at 492 nm using a reference wavelength of 650 nm in a PowerWave HT microplate reader (Biotek Instruments, Winooski, USA).
  • the sigmoid standard curves obtained by representing absorbance versus analyte concentration were adjusted to a four-parameter logistic equation using the SPSS SigmaPlot software package (Chicago, USA).
  • the affinity of the antibody was estimated as the concentration of free analyte capable of halving the maximum signal (A max ).
  • test antigen solution which is a bioconjugate of formula (I) or comparative bioconjugate where P is OVA, at various concentrations in 50 mM carbonate buffer, pH 9.6, by incubation during overnight at room temperature.
  • 50 ⁇ L per well of a complete standard analyte curve in PBS was dispensed in each column followed by 50 ⁇ L per well of a given antibody diluted in PBST (0.05% Tween 20).
  • the immunochemical reaction was carried out for 1 h at room temperature and then the plates were washed.
  • bioconjugates of formula (la) and (ib) in which P is BSA (immunizing conjugates) obtained in the previous examples were used.
  • BALB / c mouse females were used, with an age at the beginning of the process between 6 and 8 weeks.
  • mice Mergers with immunized mice were basically carried out following previously described methodologies and well established in the state of the art. Immediately after the sacrifice of the mice, the spleen was removed, which was homogenized with the plunger of a sterile syringe. After lysing the red blood cells by osmotic shock with 1 mL of lysis buffer for a cold minute, the lymphocytes were washed twice with complete medium (with cold serum) and filtered to remove the formed clots.
  • the myeloma line P3-X63-Ag8.653 was cultured the days prior to fusion in supplemented DMEM medium [2 mM L-alanine-L-glutamine, 1 m non-essential amino acids, 25 Mg / mL gentamicin, fetal bovine serum ( SBF) 10% (v / v) J, keeping the cells in exponential growth phase, so that on the day of fusion a sufficient number of them were available.
  • DMEM medium 2 mM L-alanine-L-glutamine, 1 m non-essential amino acids, 25 Mg / mL gentamicin, fetal bovine serum ( SBF) 10% (v / v) J
  • both cell populations joined a lymphocyte: myeloma 4: 1 ratio.
  • the cells were centrifuged, to immediately then carry out cell fusion.
  • the chemical fusing agent PEG1500 (1 mL per spleen, 1 min) was used, which partially dissolves the membranes allows the fusion of the cells.
  • the cells were resuspended in DMEM supplemented medium [SBF 15% (v / v) J and seeded in 96-well culture plates (100 ⁇ L per well) at a cell density of 150x10 3 lymphocytes per well , and incubated at 37 ° C in an atmosphere with 5% C0 2 and 95% humidity.
  • the evaluation of supernatants from seeded wells was carried out, in order to identify which ones contained antibody-secreting hybridomas capable of recognizing ochratoxin A both in its conjugated and free form (competing clones) .
  • the fusion efficiency was determined by visual inspection, defined as the percentage of wells that had at least one clone clearly visible under a microscope.
  • the culture supernatants were analyzed by means of the differential ELISA technique, which consists of analyzing in parallel in adjacent wells each supernatant in the absence of analyte and in the presence of a predetermined concentration of analyte, usually 100 nM.
  • the plates were upholstered with the homologous conjugate, which is a bioconjugate of formula (I) in which P is OVA, at a concentration of 0.1 ⁇ g / mL, and the test was carried out out by adding 50 ⁇ L of the culture supernatant.
  • the conditions for the indirect ELISA format are detailed in section 2.1.
  • hybridomas producing antibodies capable of providing an absorbance signal equal to or greater than 0.5 in the assay in the absence of ochratoxin A and inhibition of the signal equal to or greater than 80% in the assay were selected presence of ochratoxin A.
  • a second more thorough screening was conducted in a competitive two-dimensional mode in order to select the best hybridomas with greater certainty. For this, the supernatant of each hybridoma was tested at 4 dilutions (1/8, 1/32, 1/128 and 1/512) on upholstered plates with the homologous bioconjugate at 0.01 and 0.1 Mg / mL, and using as a competitor ocratoxin A at 10 and 100 nM (in trial).
  • 200 ⁇ L of the culture supernatant was diluted in 600 ⁇ L ⁇ of PBST and the following dilutions were made serially from this first.
  • the test was carried out by adding 50 ⁇ - per well of the corresponding supernatant dilution and 50 ⁇ L of the ochratoxin A solution in PBS at the concentration of 100, 10 and 0 nM.
  • the cells of the finally selected wells were cloned by the limit dilution method, planting from each well a new 96-well plate at 2 cells per well in HT medium, of the same composition as the HAT but without aminopterin, and containing HFCS at 1% (v / v).
  • the wells containing a single clone were identified by visual inspection, the culture supernatant being reassessed in the same manner as previously described for fusion supernatants. This process was performed as many times as necessary (at least two) to ensure the monoclonality of the selected hybridomas, as well as their stability. Finally, the selected cell lines were expanded, progressively cultivating the hybridoma in larger containers. Once the clone was grown, the cells were frozen in liquid nitrogen at a concentration of 10 7 cells per vial (2-4 vials for each hybridoma) in a solution of SBF with 10% DIVISO (v / v) as a cryoprotective agent. The vials were kept at -80 ° C inside a polystyrene box for 24 h before passing them to the liquid nitrogen container. 4.4. Production and purification of monoclonal antibodies
  • mice were immunized with both conjugates of formula (la) and (Ib) in which P is BSA and cell fusions aimed at hybridoma generation were carried out. It was possible to obtain 4 monoclonal antibody producing cell lines with high affinity towards ochratoxin A from the bioconjugate of formula (la), and 7 lines Cells from the bioconjugate of formula (Ib).
  • Monoclonal antibodies obtained from said hybridomas have been named for the purposes of the present invention and the examples included herein: mAb # 39, mAb # 41, mAb # 310a and mAb # 310b (monoclonal antibodies from bioconjugate of formula la); and mAb lb # 16, mAb lb # 21, mAb lb # 27, mAb lb # 111, mAb lb # 114, mAb lb # 115 and mAb lb # 1 8 (monoclonal antibodies from the bioconjugate of formula Ib). These results show that the bioconjugates of formula (la) and (Ib) are suitable for obtaining very high affinity monoclonal antibodies against ocratoxin A.

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Abstract

La presente invención se refiere a bioconjugados y derivados marcados de ocratoxina A por posiciones diferentes de la molécula, adecuados para la producción de anticuerpos de elevada afinidad para ocratoxina A. Asimismo, la presente invención también se refiere al uso de bioconjugados de ocratoxina A y de derivados marcados de ocratoxina-A como antígenos de ensayo. Además, la presente invención también se refiere a métodos de análisis, concentración y extracción de ocratoxina A utilizando los anticuerpos obtenidos, en ocasiones junto con antígenos de ensayo que son bioconjugados o derivados marcados. Esta invención también proporciona un kit para analizar ocratoxina A que comprende anticuerpos frente a esta micotoxina, en ocasiones junto con antígenos de ensayo que son bioconjugados o derivados marcados de la ocratoxina A.

Description

PREPARACIÓN DE NUEVOS BIOCONJUGADOS Y ANTICUERPOS PARA LA INMUNODETECCIÓN DE OCRATOXINA A
DESCRIPCIÓN La presente invención se refiere a bioconjugados y derivados marcados de ocratoxina A por posiciones diferentes de la molécula, adecuados para la producción de anticuerpos de elevada afinidad para ocratoxina A. Asimismo, la presente invención también se refiere al uso de bioconjugados de ocratoxina A y de derivados marcados de ocratoxina A como antígenos de ensayo. Además, la presente invención también se refiere a métodos de análisis, concentración y extracción de ocratoxina A utilizando los anticuerpos obtenidos, en ocasiones junto con antígenos de ensayo que son bioconjugados o derivados marcados. Esta invención también proporciona un kit para analizar ocratoxina A que comprende anticuerpos frente a esta micotoxina, en ocasiones junto con antígenos de ensayo que son bioconjugados o derivados marcados de la ocratoxina A.
ESTADO DE LA TÉCNICA
Las biotoxinas son un tipo de contaminante cuya presencia en alimentos, aguas y piensos representa un verdadero problema para la salud humana y el bienestar animal, ocasionando importantes pérdidas económicas a los sectores agroalimentario, agropecuario y piscícola. La clase de biotoxinas más frecuentemente detectadas en alimentos son las producidas por hongos, o micotoxinas. Aunque se han identificado más de 400 diferentes micotoxinas con una gran diversidad estructural, es sobre las toxicológicamente más relevantes sobre las que existe una reglamentación más definida en cuanto a los límites máximos permitidos en alimentos.
La ocratoxina A es la micotoxina más importante de la familia de las ocratoxinas. Estructuralmente consiste en una molécula de L-fenilalanina unida, a través de un puente amida, a un grupo p-clorofenólico que contiene un grupo de dihidroisocumarina (Figura 1). Los principales efectos nocivos de esta micotoxina son nefrotóxicos, aunque también se ha observado actividad hepatotóxica, neurotóxica, teratogénica, inmunotóxica y carcinogénica en diferentes especies animales. La ocratoxina A es sospechosa de ser la causa de enfermedades crónicas de desenlace fatal, como la nefropatía endémica de los Balcanes (BEN) y la nefropatía de Túnez (TCIN). Además, dado que el consumo de alimentos contaminados con OTA está asociado con una mayor incidencia de tumores en el tracto urinario superior en el hombre, esta micotoxina ha sido clasificada como posible carcinógeno por la International Agency for Research on Cáncer (IARC). Dos especies del género Penicillium producen ocratoxina A: P. verrucosum, la principal fuente de contaminación en grano almacenado, y P. nordicum, el mayor productor encontrado en productos cárnicos. No obstante, la mayoría de los hongos ocratoxigénicos son del género Aspergillus, y particularmente uno de los principales productores es A. carbonarius, el cual se encuentra frecuentemente en viñedos. Por orden de aporte de ocratoxinas totales a la dieta encontramos los cereales (58%), el vino (21%), el zumo de uva (7%), el café (5%) y la carne de cerdo (3%).
Las técnicas analíticas para la determinación de ocratoxina A en alimentos son fundamentalmente de dos tipos: cromatográficas y de reconocimiento molecular. Entre las primeras, la que goza de más aceptación actualmente es HPLC-MS/MS, mientras que entre las segundas la mayoría emplea anticuerpos como elemento de detección. Las técnicas cromatográficas constituyen la metodología de referencia, debido a su elevada sensibilidad, reproducibilidad y fundamentalmente por su capacidad de determinar varias micotoxinas simultáneamente (K. F. Nielsen et al., J. Agrie. Food Chem. 2015, 63, 1029-1034). Por su parte, las técnicas basadas en la interacción anticuerpo-analito (inmunoensayos, cromatografía de afinidad, tiras inmunorreactivas) se consideran la mejor opción cuando es necesario realizar un elevado número de análisis en poco tiempo y/o en entornos poco dotados técnicamente. De hecho, las micotoxinas, y en particular la ocratoxina A, constituyen probablemente el grupo de contaminantes en donde estos métodos rápidos inmunoquímicos han alcanzado un mayor grado de aceptación e implantación, existiendo un gran número de empresas de inmunodiagnóstico que comercializan ensayos tipo kit para la detección de estos contaminantes (E. P. Meulenberg, Toxins 2012, 4, 244-266).
Los métodos inmunoanalíticos se basan en la unión selectiva, reversible y no covalente entre la sustancia a detectar (analito) y un anticuerpo que la reconoce específicamente. La ocratoxina A, debido a su bajo peso molecular, no es inmunogénica, y por tanto es incapaz de generar una respuesta inmune por sí misma cuando se inyecta en un animal de experimentación. Para poder generar anticuerpos para ocratoxina A es necesario acoplarla covalentemente a una proteína, de forma que el conjugado obtenido sí resulte inmunogénico y permita la producción de anticuerpos frente a la micotoxina. Para conseguir obtener estos conjugados, a menudo es necesario recurrir al diseño y síntesis ex novo de un derivado, a través de estrategias que permitan la incorporación, en la posición deseada de la molécula, de una cadena hidrocarbonada con un grupo funcional terminal, respetando su estructura y grupos químicos característicos. Esta estrategia posibilita presentar la molécula al sistema inmune de la manera más adecuada para lograr anticuerpos de gran afinidad y especificidad. Sin embargo, la ocratoxina A posee en su estructura un grupo carboxilato que posibilita el anclaje directo a la proteína, por lo que, debido a las dificultades sintéticas que conlleva la síntesis total de derivados potencialmente más adecuados desde el punto de vista estructural, todos los anticuerpos obtenidos hasta la fecha capaces de reconocer a ocratoxina A se han obtenido empleando dicho grupo carboxilato para la obtención de los conjugados. La efectividad de esta estrategia ha sido muy variable (X. Li et al., Food Anal. Methods 20~ 3, 6, 1433-1440). En todo caso, la generación de anticuerpos para ocratoxina A a partir de haptenos en los que el grupo carboxilato se encuentre libre y por tanto pueda interaccionar con el anticuerpo, constituye una vía no explorada que podría permitir la generación de anticuerpos con características diferentes a las de los actualmente disponibles, adecuados no sólo para el desarrollo de inmunoensayos más sensibles y específicos, sino también para su implementación en nuevas plataformas analíticas basadas en tecnologías avanzadas, tales como biosensores de diferente tipo, ensayos multiplex y métodos basados en transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET).
Existe por tanto la necesidad de obtener derivados funcionalizados de ocratoxina A no explorados anteriormente que permitan la generación de anticuerpos de mayor afinidad que los producidos hasta la fecha. Estos anticuerpos mejorados obtenidos a partir de haptenos innovadores constituirán la base para desarrollar nuevos métodos inmunoanalíticos para la determinación, detección, concentración o extracción de ocratoxina A, preferentemente mediante la utilización de un kit que pueda ser utilizado por la industria alimentaria, agrícola, clínica y/o medioambiental. DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención proporciona bioconjugados y derivados marcados de ocratoxina A, y el uso de los bioconjugados para la obtención de anticuerpos para ocratoxina A.
Por tanto, un primer aspecto de la presente invención se refiere a un bioconjugado de fórmula general (I):
Figure imgf000005_0001
donde:
T se selecciona del grupo que consiste en R-l y R-ll;
Figure imgf000005_0002
L es una cadena hidrocarbonada de 0 a 40 átomos de carbono, donde la cadena es lineal o ramificada, saturada o insaturada, y dicha cadena hidrocarbonada comprende la sustitución de entre 0 y 10 átomos de carbono por heteroátomos, que se seleccionan del grupo que consiste en S, O y N; preferiblemente L es una cadena hidrocarbonada lineal de 1 a 20 átomos de carbono y dicha cadena hidrocarbonada comprende entre 0 y 4 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O y N, y más preferiblemente L es una cadena hidrocarbonada lineal saturada de 1 a 10 átomos de carbono y opcionalmente la cadena hidrocarbonada comprende entre 1 y 4 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O y N; y Z es un grupo funcional seleccionado entre:
-(C=0)NH-, -NH(C=0)-, -(C=0)S- -S(C=0)-, -(C=0)0-, -0(C=0)-, -0(C=0)0-, -0(S=0)0-, -0(S02)0-, -NH(S=0)0-, -0(S=0)NH-, -NH(S02)O-,-0(S02)NH-, -(S02)NH-, -NH(S02)-, -0(C=0)NH-, -NH(C=0)0-, -NH(C=0)NH-, -NH(C=S)NH-, - H-, -N(alquilo C C6)-, -S-, -S-S-, -NH-NH-, -N=C-, -C=N-, -NH(C=NH)-, -N=N-, -O-, -CH=CH-
Figure imgf000006_0001
En una realización preferida, Z se selecciona del grupo que consiste en -(C=0)NH-, -NH(C=0)-, -0(C=0)NH-, -NH(C=0)0-, -NH(C=0)NH-, -NH-, -S-,
Figure imgf000006_0002
Más preferentemente, Z es -(C=0)NH-
P es un péptido o polipéptido, natural o sintético, de peso molecular mayor de 2000 daltons. El péptido o polipéptido P puede estar o no unido, mediante interacción covalente, electrostática o de otro tipo, a un soporte. Dicho soporte puede ser un polímero sintético o no, o estar compuesto por nanomateriales como nanotubos de carbono, zeolitas o sílice mesoporosa.
Según otra realización preferida de la presente invención, el bioconjugado de fórmula (I) descrito en esta solicitud de patente se caracteriza porque P se selecciona del grupo que consiste en albúmina, tiroglobulina, hemocianina, beta-galactosidasa, peroxidasa, fosfatasa y oxidasa. Más preferiblemente P es peroxidasa o albúmina, que puede ser albúmina de huevo o albúmina sérica; y n es un número con un valor entre 1 y 500; preferiblemente n es un valor entre 1 y 100.
El valor de n indica el grado de conjugación, es decir, la relación molar entre la fracción derivada del fragmento T-L-Z y el péptido o polipéptido P, en el bioconjugado de fórmula (I) resultante.
Según otra realización preferida de la presente invención, el bioconjugado de fórmula (I) es un bioconjugado de fórmula (la)
Figure imgf000007_0001
donde:
P y n se han definido anteriormente. Preferiblemente P es albúmina o peroxidasa y n es un valor seleccionado entre 1 y 50.
Según otra realización preferida, el bioconjugado de fórmula (I) es un bioconjugado de fórmula (Ib)
Figure imgf000007_0002
donde:
P y n se han definido anteriormente. Preferiblemente P es albúmina o peroxidasa y n es un valor seleccionado entre 1 y 50.
El bioconjugado de formula (!) de la presente invención se puede obtener por un procedimiento que comprende hacer reaccionar un derivado funcionalizado (hapteno) de la ocratoxina A con P, un polipéptido natural o sintético de peso molecular mayor a 2000 daltons, por métodos ampliamente conocidos en la técnica.
En otra realización de la presente invención, cuando el material portador es un marcador no isotópico detectable, el derivado es un compuesto de formula (II):
Figure imgf000007_0003
donde T, L y Z tienen el mismo significado definido anteriormente para el bioconjugado de formula (I);
Q es un marcador no isotópico detectable; y m es un número con un valor entre 1 y 1000; preferiblemente m es un valor seleccionado entre 1 y 100.
En la presente invención se entiende por "marcador" cualquier molécula o fragmento que dé lugar a una señal medible por cualquier tipo de técnica analítica. En la presente invención, Q identifica un fragmento o una molécula química detectara, marcadora o trazadora no isotópica.
En una realización preferida, Q es una enzima, biotina, un compuesto luminiscente, un fluoróforo, un marcador acoplado a un sistema de detección indirecta, micro o nanopartículas u otros. Preferentemente, Q se selecciona del grupo que consiste en peroxidasa, fosfatasa alcalina, biotina, fluoresceína o uno cualquiera de sus derivados, un fluoróforo de cianina, un fluoróforo de rodamina, un fluoróforo de cumarina, un bipirilo de rutenio, luciferina o uno cualquiera de sus derivados, un éster de acridinio, nanopartículas cuánticas (en inglés quantum dots), y micro- o nanopartículas de oro coloidal, de carbón o de látex.
Preferiblemente, en el compuesto de fórmula (II), Z se selecciona del grupo que consiste en -(C=0)NH-, -NH(C=0)-, -0(C=0)NH-, -NH(C=0)0-, -NH(C=0)NH-, -NH-, -S-,
Figure imgf000008_0001
Preferiblemente L, en el compuesto de fórmula (II), es una cadena hidrocarbonada lineal de 1 a 20 átomos de carbono y dicha cadena hidrocarbonada comprende entre 0 y 4 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O y N, y más preferiblemente L es una cadena hidrocarbonada lineal saturada de 1 a 10 átomos de carbono y opcionalmente la cadena hidrocarbonada comprende entre 1 y 4 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O y N; Este compuesto de formula (II) puede utilizarse con un anticuerpo de ocratoxina A para determinar o detectar esta micotoxina en una muestra mediante la tecnología de inmunoensayo. Según una realización preferida, el derivado de fórmula (II) es un derivado de fórmula (lia)
Figure imgf000009_0001
donde Q se selecciona del grupo que consiste en peroxidasa, biotina, fluoresceína o nanopartículas, y m es un valor seleccionado entre 1 y 10.
Según otra realización también más preferida, el derivado de fórmula (II) es un derivado de fórmula (llb)
Figure imgf000009_0002
donde Q se selecciona del grupo que consiste en peroxidasa, biotina, fluoresceína o nanopartículas, y m es un valor seleccionado entre 1 y 10.
El derivado marcado de formula (II) de la presente invención se puede obtener por un procedimiento que comprende hacer reaccionar un derivado funcionalizado (hapteno) de la ocratoxina A con Q, un marcador no isotópico, por métodos ampliamente conocidos en la técnica.
Figure imgf000009_0003
El bioconjugado de fórmula (I) de la presente invención puede utilizarse para la producción de anticuerpos, o junto con un anticuerpo de ocratoxina A para determinar o detectar esta micotoxina en una muestra mediante la tecnología de inmunoensayo. Además, los derivados marcados de formula (II) pueden utilizarse junto con un anticuerpo de ocratoxina A para determinar o detectar esta micotoxina en una muestra mediante la tecnología de inmunoensayo.
Para obtener anticuerpos frente a ocratoxina A se han preparado derivados funcionalizados de dicha micotoxina (haptenos), es decir, análogos estructurales de ocratoxina A que incorporan un grupo funcional susceptible de ser utilizado para la conjugación a un portador P o marcador Q. Este grupo funcional está separado del esqueleto de la molécula de ocratoxina A por un espaciador L. La posición de incorporación del grupo funcional a la estructura de ocratoxina A para la conjugación no es un aspecto obvio y puede ser determinante para la viabilidad de los bioconjugados de fórmula (I) como inductores de la producción de anticuerpos de afinidad y selectividad adecuadas frente a ocratoxina A, e incluso para la viabilidad de los bioconjugados de fórmula (I) o de derivados marcados de fórmula (II) para actuar como moléculas competidoras que permitan el desarrollo de un inmunoensayo sensible y específico para dicha micotoxina.
En el contexto de esta invención el término "anticuerpo" se refiere a la inmunoglobulina que un animal o una célula híbrida (como un hibridoma) sintetiza de forma específica contra el inmunógeno de la invención (bioconjugado de la invención).
Por tanto, un tercer aspecto de la presente invención se refiere a un anticuerpo (a partir de ahora anticuerpo de la invención) generado en respuesta a un bioconjugado de la invención, en particular al bioconjugado de fórmula (I). Más preferiblemente los anticuerpos son generados en respuesta al bioconjugado de fórmula (la) o (Ib), más preferiblemente al bioconjugado de fórmula (la).
Un cuarto aspecto de la invención se refiere al uso del bioconjugado anteriormente descrito para la obtención de anticuerpos.
El procedimiento de obtención de los anticuerpos de la invención a partir de bioconjugados de la invención se puede llevar a cabo por métodos de inmunización ampliamente conocidos en la técnica, como por ejemplo a partir de la inmunización de un animal. Los anticuerpos generados a partir de un bioconjugado de la presente invención pueden ser anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos recombinantes o fragmentos de anticuerpo. Los anticuerpos de la invención tienen alta afinidad y especificidad hacia ocratoxina A.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un antisuero (a partir de ahora antisuero de la invención) que comprende los anticuerpos de la invención.
El término "antisuero" se refiere a un suero obtenido tras la inmunización de un animal con un inmunógeno. El antisuero comprende anticuerpos específicos de dicho inmunógeno generados tras la respuesta inmune producida en el animal. En el contexto de la presente invención, el inmunógeno es el bioconjugado de la invención y el antisuero comprende anticuerpos específicos generados frente al bioconjugado de la invención, los anticuerpos de la invención.
Un quinto aspecto de la presente invención se refiere a un método de análisis in vitro de ocratoxina A en una muestra que comprende el uso del anticuerpo anteriormente descrito. Preferiblemente, este método comprende las siguientes etapas: a) poner en contacto la muestra con el anticuerpo o el antisuero de la invención;
b) incubar la muestra y el anticuerpo (o el antisuero) de la etapa (a) durante un periodo de tiempo adecuado para que tenga lugar una reacción inmunoquímica; y
c) determinar la existencia de reacción inmunoquímica tras la incubación de la etapa (b).
El método de la presente invención permite la determinación cuantitativa o análisis cualitativo del contenido de la micotoxina ocratoxina A en una muestra. Asimismo, el método de la presente invención permite analizar el contenido de ocratoxina A en diferentes tipos de muestras, por ejemplo, muestras de alimentos, como cereales, frutas y vinos, muestras medioambientales tales como agua, suelo o superficie, y muestras biológicas aisladas tales como orina. Preferentemente, la presente invención proporciona un método de análisis in vitro de ocratoxina-A en vinos, cervezas y zumos.
Según una realización preferida, la determinación de la reacción inmunoquímica en el paso (c) se realiza mediante un inmunoensayo competitivo, usando como competidor un bioconjugado de formula (I) o un derivado marcado de fórmula (II). Preferentemente, el inmunoensayo competitivo es de tipo ELISA. El término inmunoensayo hace referencia a un ensayo analítico en el que ocurre una reacción inmunoquímica para la detección o cuantificación de un analito. Los inmunoensayos competitivos son aquéllos en los que el analito compite con otra molécula por la unión con el anticuerpo.
El término "antígeno" en esta solicitud de patente se refiere a una molécula capaz de interaccionar específicamente con un anticuerpo. La interacción o reacción inmunoquímica consiste en la unión específica y no covalente entre un anticuerpo y un antígeno, pudiendo ser éste el analito o un antígeno de ensayo.
En la presente memoria el término "antígeno de ensayo", "antígeno enzimático" o "trazador" se refiere a un bioconjugado de formula (I) o a un derivado marcado de formula (II) que se utiliza en el ensayo competitivo. Un sexto aspecto de la presente invención también se refiere a un kit de detección de ocratoxina A que utiliza al menos un anticuerpo de la invención. Adicionalmente, el kit de detección de ocratoxina A puede comprender un bioconjugado de formula (I) o un derivado marcado de formula (II) tal como se describen en la presente solicitud de patente.
Un séptimo aspecto de la presente invención también se refiere a un método de purificación y/o concentración de ocratoxina A de una muestra que comprende el uso del anticuerpo anteriormente descrito. Particularmente, este método se basa en inmovilizar al menos un anticuerpo de la invención sobre un soporte cualquiera y hacer pasar una muestra a través de dicho soporte para que retenga la ocratoxina A presente en dicha muestra. La elución posterior de la ocratoxina A retenida en el soporte por métodos ampliamente conocidos en la técnica (cambio de pH, modificación de la fuerza iónica, utilización de agentes caiotrópicos) permitirá su purificación y/o concentración, en un sistema conocido como cromatografía de inmunoafinidad. En una realización preferida, este método comprende las siguientes etapas:
a) inmovilizar al menos un anticuerpo descrito en cualquiera de las reivindicaciones 12 o 13 sobre un soporte;
b) hacer pasar la muestra a través de dicho soporte para que retenga la ocratoxina A presente en dicha muestra; y c) eluir la ocratoxina A retenida en el soporte.
Los términos "inmunógeno" e "inmunogénico" tal como se utilizan en la presente invención se refieren a una sustancia que es reconocida como extraña al organismo vivo y por lo tanto es capaz de producir o de generar una respuesta inmune en un huésped. En la presente invención el inmunógeno es un bioconjugado de fórmula (I).
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones, la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención.
A continuación se ilustra con algunos ejemplos y figuras la forma en que puede efectuarse la preparación de varios derivados funcionalizados de ocratoxina A (haptenos) y los correspondientes bioconjugados de fórmula (I), que no pretenden que sean limitativos de la presente invención, y que sirven para mostrar no sólo la forma en que puede efectuarse la preparación de los mismos sino también la importancia que puede tener la naturaleza estructural del bioconjugado de fórmula (I) para la producción de anticuerpos de afinidad adecuada hacia el analito, aptos para el desarrollo de un eficaz método inmunoanalítico.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Fig. 1. Estructura de la ocratoxina-A.
Fig. 2. Esquema de la síntesis del éster activo del hapteno OTA-1 (NHS-OTA-1). Fig. 3. Esquema de la síntesis del éster activo del hapteno OTA-2 (NHS-OTA-2). Fig. 4. Esquema de la síntesis del éster activo del hapteno OTA-3 (NHS-OTA-3). Fig. 5. Esquema de la preparación de un bioconjugado de formula (I) a partir del correspondiente derivado funcionalizado (éster activo) de ocratoxina A.
Fig. 6. Curvas estándar para ocratoxina A en el formato de ELISA competitivo homólogo directo obtenidas con el mejor anticuerpo monoclonal producido a partir del bioconjugado BSA-OTA-1 (mAb la#310b; triángulos) y con el mejor anticuerpo monoclonal producido a partir del bioconjugado BSA-OTA-2 (mAb lb#115; círculos). EJEMPLOS
A continuación, se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que ponen de manifiesto la efectividad de los bioconjugados de fórmula (I) para la obtención de anticuerpos frente a ocratoxina A y el desarrollo de un inmunoensayo de elevada sensibilidad para la misma. Los números en negrita hacen referencia a la correspondiente estructura que se muestra en los esquemas. Estos ejemplos se presentan a modo de demostración, pero de ningún modo pueden suponer un límite a la invención. 1. Preparación de bioconjugados de fórmula (I)
Ejemplo 1 : Preparación de bioconjugados de fórmula (I) para T = R-l, L = CH2CH2CH2CH2CH2, Z = -(C=0)NH- y P = BSA (seroalbúmina bovina), OVA (ovalbúmina) y HRP (peroxidasa de rábano picante).
1.1. Preparación del éster de N-hidroxisuccinimidilo del hapteno OTA-1 {NHS-OTA- 1) .
Figure imgf000014_0001
Preparación de 4-cloro-2,6-diyodo-3-metilfenol (2). EtOH absoluto (31 mL) se añadió sobre una mezcla de 4-cloro-3-metilfenol (1) (1 ,78 g, 12,5 mmol), iodo (6,93 g, 27,3 mmol, 2,2 equiv) y AgS04 (7,76 g 24,9 mmol, 2 equiv) y la mezcla se mantuvo bajo agitación durante 3 horas a temperatura ambiente. Una vez finalizada la reacción, la mezcla se filtró para separar las sales, utilizando CHCI3 para lavar. El filtrado se lavó con una disolución acuosa al 10% de Na2S203 y salmuera. Tras secar sobre MgS04 anhidro y evaporar el disolvente a vacío, el residuo obtenido se purificó a través de una columna de gel de sílice, utilizando hexano como eluyente, para obtener el compuesto 2 como un sólido blanco (3,72 g, 75%). Pf. 91,0-92,0 °C (cristalizado de hexano en frío).
Datos espectroscópicos de 2 1H-RMN (CDCI3, 300 Hz): δ (ppm) 2.59 (s, 3H, e-3), 5.83 (s, 1 H, OH), 7.72 (s, 1H, H-5). 13C-RMN (CDCI3, 75 MHz): δ (ppm) 26.8 (Me-3), 77.6 (C-6), 90.5 (C-2), 125.2 (C-4), 137.9 (C-5), 140.3 (C-3), 152.6 (C-1). EMAR (TOF ESI"): calculado para C7H4CII2O [ -H]" 392.8046, encontrado 392.8042.
Figure imgf000015_0001
Preparación de 5-cloro-2-hidroxi-4-metilbenceno-1,3-dicarboxilato de dimetilo (3). Una mezcla del fenol 2 (300 mg, 0,76 mmol) y PdCI2(dppf) CH2CI2 (64,0 mg, 0,08 mmol, 0,1 equiv) en MeOH anhidro (9 mL) en un reactor tiny Büchi se purgó exhaustivamente por ciclos repetidos de vacío-purga con argón, enfriando a 0 ºC. Tras esto, y bajo una corriente de argón, se añadió rápidamente Et3N (0,53 mL, 3,8 mmol, 5 equiv) y se volvió a someter el sistema a ciclos de purga a 0 ºC, primero con argón y luego con CO. A continuación, se ajustó la presión de CO de 90 psi y la mezcla de reacción se agitó a 90 ºC durante 2,5 horas. Transcurrido este tiempo se enfrió el reactor y se venteó, la mezcla de reacción se transfierió a un matraz de fondo redondo con la ayuda de CH2CI2 y se concentró a sequedad a presión reducida. El residuo se suspendió en Et20 y se filtró, el filtrado se lavó con una disolución acuosa 1 M de HCI y salmuera, se secó sobre MgS04 anhidro y se evaporó el disolvente a vacío. El residuo obtenido se purificó por cromatografía sobre gel de sílice, empleando como eluyente mezclas de hexano-AcOEt (95:5 y 90:10), para obtener el compuesto 3 como un sólido de color blanco (158,4 mg, 82%). Pf. 66,1-67,1 ºC (cristalizado de hexano en frío).
Datos espectroscópicos de 3: 1H-RMN (CDCI3, 300 MHz): δ (ppm) 2.35 (s, 3H, Me-4), 3.96 (s, 6H, 2xOMe), 7.87 (s, 1 H, H-6), 10.96 (s, 1H, OH). 13C-RMN (CDCI3, 75 MHz): δ (ppm) 18.0 (Me-4), 52.7 (2xOCH3), 111.5 (C-3), 124.9 (C-5), 125.1 (C-1), 130.6 (C- 6), 141.5 (C-4), 156.8 (C-2), 166.8 (C02-3), 169.1 (C02-1). EMAR (TOF ESI+): calculado para CnHi2CI05 [M+H]+ 259.0368, encontrado 259.0356.
Figure imgf000015_0002
Preparación de 5-cloro-8-hidroxi-3-metil-1-oxoisocromano-7-carboxilato de metilo (4). Una disolución del dicarboxilato de dimetilo 3 (82,4 mg, 0,32 mmol) en THF anhidro (200 μΐ_) se adicionó gota a gota, a -78 °C bajo nitrógeno, sobre una disolución de diisopropilamiduro de litio (LDA) en THF, generada a partir de diisopropilamina (130 μL, 0,88 mmol, 2,75 equiv), BuLi (500 μL de una disolución 1 ,6 M en hexano, 0,8 mmol, 2,5 equiv) y THF anhidro (1,15 mL). La mezcla se mantuvo con agitación 30 minutos a -78 ºC y a continuación se añadió acetaldehído (150 μL, 2,55 mmol, 8 equiv). La mezcla de reacción se agitó a la misma temperatura durante 10 minutos y a 0 °C durante 1,5 horas. Una vez finalizado el tiempo de reacción se añadió 1 mL de una disolución 1:2 de AcOH en Et20 a 0 ºC, se diluyó con AcOEt y se lavó con agua y salmuera, se secó sobre MgS04 anhidro y se concentró a vacío para obtener un residuo que se purificó por cromatografía de columna, empleando como eluyente mezclas de hexano-AcOEt-AcOH (100:0:0,3 y 95:5:0,3) para obtener el compuesto 4 como un semisólido de color blanco (51,7 mg, 82%). Datos espectroscópicos de 4 (una mezcla racémica): 1H-RMN (CDCI3, 300 Hz): δ (ppm) 1.58 (d, J = 6.4 Hz, 3H, Me-3), 2.84 (dd, J = 17.4, 11.6 Hz, 1H, H-4), 3.27 (dd, J = 17.3, 3.2 Hz, 1H, H'-4), 3.95 (s, 3H, C02CH3), 4.42-4.92 (m, 1 H, H-3), 8.11 (s, 1H, H- 6), 12.19 (s, 1 H, OH). 13C-RMN (CDCI3, 75 MHz): δ (ppm) 20.6 (Me-3), 32.6 (C-4), 52.6 (OCH3), 75.1 (C-3), 111.2 (C-7), 118.4 (C-8a), 121.7 (C-5), 138.0 (C-6), 142.2 (C-4a), 161.1 (C-8), 165.0 (C-1), 167.9 (C02-7). EMAR (TOF ESI*): calculado para Ci2H12CIOs [M+H]+ 271.0368, encontrado 271.0371.
Figure imgf000016_0001
Preparación del ácido 5-cloro-8-hidroxi-3-metil-1-oxoisocromano-7-carboxílico (5). Una disolución de LiOH H20 (115,0 mg, 2,73 mmol, 10 equiv) en agua (1 ,20 mL) se adicionó sobre una suspensión de la dihidroisocumarina 4 (74,0 mg, 0,27 mmol) en THF anhidro (910 μL). La mezcla se calentó a reflujo durante 3,5 horas y a continuación se enfrió a 0 °C y se acidificó con una disolución acuosa 1M de HCI (4,91 mL, 4,91 mmol, 18 equiv). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas, se diluyó con agua y se extrajo con AcOEt. Las fases orgánicas reunidas se lavaron con salmuera, se secaron sobre MgS04 anhidro y se concentraron a presión reducida para obtener el ácido 5 (69,9 mg, 100%) como un sólido amorfo de color pardo claro.
Datos espectroscópicos de 5: H-R N (DMSO-cfe, 300 Hz): δ (ppm) 1.44 (d, J = 6.2 Hz, 3H, Me-3), 2.88 (dd, J = 17.3, 11.6 Hz, 1H, H-4), 3.20 (dd, J = 17.3, 3.2 Hz, 1H, H'-4), 4.75 (ddd, J= 11.7, 6.2, 3.2 Hz, 1 H, H-3), 7.99 (s, 1 H, H-6). 13C-RMN (DMSO-cfe, 75 MHz): δ (ppm) 20.1 (Me-3), 32.2 (C-4), 74.4 (C-3), 112.5 (C-7), 117.8 (C-8a), 120.6 (C-5), 136.0 (C-6), 143.4 (C-4a), 160.5 (C-8), 165.4 (C-1), 167.3 (C02H). EMAR (TOF ESI+): calculado para CnHi0CIO5 [M+H]+ 257.0211 , encontrado 257.0212.
Figure imgf000017_0001
Preparación de 2-(5-cloro-8-hidroxi-3-metil-1-oxoisocromano-7-ca^oxamido)-3-(4- yodofenil)propanoato de tere-butilo (7). A una disolución del ácido 5 (56,3 mg, 0,22 mmol) en DMF anhidra (1 ,5 mL) se añadieron sucesivamente una disolución de HATU (125,5 mg, 0,33 mmol, 1,5 equiv) en DMF anhidra (1 ,5 mL) y DIEA (80 μL, 0,44 mmol, 2 equiv). La mezcla de reacción se agitó durante 2 horas a temperatura ambiente y seguidamente se añadió una disolución de la amina 6 (153 mg, 0,44 mmol, 2 equiv) y DIEA (80 μL, 0,44 mmol, 2 equiv) en DMF anhidra y se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas, tras lo cual la reacción se diluyó con AcOEt y se lavó sucesivamente con disoluciones acuosas de HCI (1M), LiCI (1 ,5%), NaHC03 (5%) y salmuera, se secó sobre MgS04 anhidro y se evaporó el disolvente en el rotavapor. El residuo obtenido se purificó por cromatografía de columna, empleando como eluyente mezclas de hexano-AcOEt-AcOH (100:0:0,3, 90:10:0,3 y 80:20:0,3) para obtener el compuesto 7 (107 mg, 83%) como un aceite amarillento.
Datos espectroscópicos de 7 (una mezcla 1:1 de diastereoisómeros): 1H-RMN (CDCI3, 300 Hz): δ (ppm) 1.43 (dos s, 4.5H cada uno, CMe3 de cada diastereoisómero), 1.61 (dos d, J = 6.4, 1.5H cada uno, Me-3' de cada diastereoisómero), 2.84 y 2.89 (cada uno dd, J = 17.4, 11.6 Hz, 0.5H cada uno, H-4' de cada diastereoisómero), 3.07-3.24 (m, 2H, H2-3), 3.30 (dd, J = 17.4, 3.5 Hz, 1H, H'-4'), 4.77 (m, 1H, H-3'), 4.94 (dt, J = 7.3, 6.0 Hz, 1H, H-2), 6.96 (br d, J = 7.9 Hz, 2H, H-2" y H-6"), 7.56-7.62 (m, 2H, H-3" y H-5"), 8.44 (s, 1H, H-6'), 8.57 (m, 1H, NH), 12.78 (s ancho, 1H, OH). 13C-RMN (CDCI3, 75 MHz): δ (ppm) 20.7 (Me-3'), 28.0 (CMe3), 32.3 (C-4'), 37.6 (C-3), 54.3 (C-2), 75.9 (C-3'), 82.6 (CMe3), 92.4 (C-4"), 110.0 (C-8a), 120.7 (C-7'), 123.1 (C-5'), 131.5 (C-2" y C-6"), 136.1 (C-1"), 137.4 (C-3" y C-5"), 138.9 (C-6'), 140.7 (C-4a), 159.0 (C-8'), 162.1 (CONH), 169.7 (C-1'), 170.1 (C-1). EMAR (TOF ESI+): calculado para C24H26NCIIO6 [M+H]+ 586.0488, encontrado 586.0459.
Figure imgf000018_0001
Preparación de 6-(4-(3-(terc-butoxi)-2-(5-cloro-8-hidroxi-3-metil-1-oxoisocrom 7-carboxamido)-3-oxopropil)fenil)hex-5-inoato de metilo (9). Una mezcla del derivado yodado 7 (36,5 mg, 0,062 mmol), hex-5-ionato de metilo (8) (27,4 mg, 0,217 mmol, 3,5 equiv), PdCI2(Ph3P)2 (5,1 mg, 7,3-10"3 mmol, 0,12 equiv) y Cul (2,2 mg, 11, 5-10"3 mmol, 0,18 equiv) se purgó con ciclos repetidos de vacío-nitrógeno mientras se enfriaba a 0 ºC. A continuación, se añadió DMF anhidra (730 μL) y se volvió a purgar el sistema, se añadió Εt3Ν (540 μL, 3,87 mmol, 62 equiv) y se volvió a purgar el sistema a baja temperatura. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 21 horas, tras lo cual se diluyó con AcOEt y se lavó sucesivamente con disoluciones acuosas de HCI (1M), LiCI (1,5%), NaHC03 (5%) y salmuera. La fase orgánica se secó sobre MgS04 anhidro y se concentró a presión reducida para obtener un residuo que se purificó por cromatografía de columna sobre gel de sílice, empleando como eluyente mezclas de hexano-AcOEt (80:20, 70:30 y 50:50), para obtener el alquino 9 (22,5 mg, 62%) como un aceite de color amarillento.
Datos espectroscópicos de 9 (una mezcla 1:1 de diastereoisómeros): 1H-RMN (CDCI3, 300 MHz): δ (ppm) 1.43 (s ancho, 9H, CMe3 de los dos diastereoisómero), 1.60 (dos d, J = 6.3 Hz, 1.5H cada uno, Me-3"' de cada diastereoisómero), 1.87-1.98 (m, 2H, H2-3), 2.50 (m, 4H, H2-2 y H2-4), 2.84 y 2.89 (dos dd, J= 17.5, 11.5 Hz, 0.5H cada uno, H-4'" de cada diastereoisómero), 3.19 (m, 2H, H2-1"), 3.30 (dd, J = 17.4, 3.5 Hz, 1H, H'-4'"), 3.68 (s, 3H, CH30), 4.71 -4.82 (m, 1H, H-3'"), 4.96 (dt, J = 7.3, 6.0 Hz, 1H, H-2"), 7.14 (d, J = 7.9 Hz, 2H, H-3' y H-5'), 7.30 (dd, J = 8.2, 1.4 Hz, 2H, H-2' y H-6'), 8.45 (s, 1H, H-6'"), 8.56 (m, 1 H, NH), 12.76 (s, 1H, OH). 13C-RMN (CDCI3, 75 MHz): δ (ppm) 18.9 (C-4), 20.7 (Me-3'"), 23.9 (C-3), 28.0 (CMe3), 32.3 (C-4'"), 32.9 (C-2), 38.0 (C-1"), 51.6 (CH3O), 54.5 (C-2"), 75.8 (C-3'"), 81.3 (C-6), 82.5 (CMe3), 88.8 (C-5), 110.1 (C-8a), 120.8 (C-7'"), 122.3 (C-4'), 123.1 (C-5'"), 129.4 (C2' y C-6'), 131.5 (C-3' y C-5'), 136.0 (C-1'), 139.0 (C-6"'), 140.6 (C-4a), 159.1 (C-8'"), 162.1 (CONH), 169.7 (C-1'"), 170.2 (C-3"), 173.6 (C-1). EMAR (TOF ESI+): calculado para C31H35CIN08 [M+H]+ 584.2046, encontrado 584.2029.
Figure imgf000020_0001
Preparación de 6-(4-(3-(terc-butoxi)-2-(5-cloro-8-hidroxi-3-metil-1-oxoisocromano-7- carboxamido)-3-oxopropil)fenil)hexanoato de metilo (10). Una disolución del alquino 9 (17,6 mg, 0,03 mmol) y RhCI(PPh3)3 (4,2 mg, 4,5-10-3 mmol, 0,15 equiv) en THF anhidro (1 ,3 mL) contenida en un reactor tiny Büchi se purgó con hidrógeno. La presión de hidrógeno se ajustó a 4 atm y se mantuvo con agitación a temperatura durante 28 horas. A continuación, se venteó el reactor y la mezcla de reacción se concentró a sequedad a vacío para obtener un residuo que se purificó por cromatografía de columna, empleando como eluyente mezclas de hexano-AcOEt (90:10, 80:20 y 60:40) para obtener el compuesto 10 (13,4 mg, 76%) como un aceite amarillento.
Datos espectroscópicos de 10 (una mezcla 1 :1 de diastereoisómeros): 1H-RMN (CDCI3, 300 MHz): δ (ppm) 1.31 -1.38 (m, 2H, H2-4), 1.42 (s ancho, 9H, CMe3 de ambos diastereoisómeros), 1.54-1.71 (m, 4H, H2-3, H2-5), 1.60 (dos d, J= 6.2 Hz, 1.5H cada uno, Me-3'" de cada diastereoisómero), 2.30 (t, J = 7.5 Hz, 2H, H2-2), 2.57 (t, J = 7.6 Hz, 2H, H2-6), 2.83 y 2.88 (dos dd, J = 17.4, 11.6, 0.5H cada uno, H-4"' de cada diastereoisómero), 3.17 (d, J = 6.0 Hz, 2H, H2-1"), 3.29 (dd, J = 17.4, 3.5 Hz, 1 H, H - 4'"), 3.66 (s, 3H, OMe), 4.69A82 (m, 1H, H-3'"), 4.94 (dt, J = 7.3, 6.0 Hz, 1H, H-2"), 7.03-7.16 (m, 4H, H-2', H-3', H-5' y Η-β'). 8.46 (s, 1H, H-6'"), 8.54 (m, 1H, NH), 12.73 (s, 1H, OH). 13C-RMN (CDCI3, 75 MHz): δ (ppm) 20.7 (Me-3"'), 24.8 (C-5), 28.0 (CMe3), 28.7 (C-4), 31.0 (C-3), 32.3 (C-4'"), 34.0 (C-2), 35.3 (C-6), 37.8 (C-1"), 51.4 (OMe), 54.7 (C-2"), 75.8 (C-3'"), 82.2 (CMe3), 110.0 (C-8a), 121.0 (C-7'"), 123.0 (C- 5"*), 128.4 (C-2' y C-6'), 129.4 (C-3' y C-5'), 133.5 (C-1'), 139.0 (C-6'"), 140.5 (C-4a), 141.1 (C-4'), 159.1 (C-8'"), 162.1 (CONH), 169.8 (C-1"'), 170.5 (C-3"), 174.2 (C-1). EMAR (TOF ESI+): calculado para C3iH39CIN08 [M+H]+ 588.2359, encontrado 588.2358.
Figure imgf000021_0001
Preparación del ácido 6-(4-(3-(terc-butoxi)-2-(5-cloro-8-hidroxi-3-metil-1- oxoisocromano-7-carboxarnido)-3-oxopropil)fenil)hexarioico (11). Una suspensión del éster metílico 10 (13,4 mg, 0,023 mmol) y lipasa de Candida antárctica inmovilizada en resina acrílica macroporosa (Novozyme 435, 26,4 mg) en THF (160 μL) en una disolución tampón fosfato con pH=7,4 (630 μΐ_) se agitó suavemente a temperatura ambiente durante 7 horas, tras lo cual se filtró y la resina y el reactor se lavaron con agua y AcOEt. La fase acuosa se acidificó con una disolución acuosa 1M de HCI hasta pH=2 y se extrajo con AcOEt. Las fases orgánicas reunidas se lavaron con salmuera, se secaron sobre gS04 anhidro y se concentraron a sequedad a presión reducida para obtener un residuo aceitoso que se purificó por cromatografía de columna sobre gel de sílice, empleando como eluyente mezclas de CHCI3-MeOH (100:0, 95:5 y 90:10), para obtener el ácido 11 (9,9 mg, 75%) como un aceite amarillento.
Datos espectroscópicos de 11 (una mezcla 1 :1 de diastereoisómeros): 1H-RMN (CDCI3, 300 MHz): δ (ppm) 1.31 -1.37 (m, 2H, H2-4), 1.43 (s, 9H, CMe3), 1.54-1.70 (m, 4H, H2-3, H2-5), 1.60 (dos d, J = 6.2 Hz, 1.5H cada uno, Me-3"' de cada diastereoisómero), 2.32 (t, J = 7.3 Hz, 2H, H2-2), 2.57 (t, J = 7.5 Hz, 2H, H2-6), 2.78- 2.92 (m, 1 H, H-4'"), 3.17 (m, 2H, H2-1"), 3.29 (dd, J = 17.4, 3.3 Hz, 1 H, H'-4'"), 4.68- 4.82 (m, 1 H, H-3'"), 4.88-5.00 (m, 1 H, H-2"), 7.02-7.16 (m, 4H, Η-2', H-3', H-5' y Η-6'), 8.45 (s, 1 H, Η-6"·), 8.56 (m, 1 H, NH), 12.73 (s ancho, 1H, OH). 13C-RMN (CDCI3, 125 MHz): δ (ppm) 20.7 (Me-3"'), 24.5 (C-3), 28.0 (CM«¾), 28.4 (C-4), 30.9 (C-5), 32.3 (C- 4'"), 33.8 (C-2), 35.2 (C-6), 37.8 (C-1"), 54.7 (C-2"), 75.9 (C-3'"), 82.3 (CMe3), 110.0 (C-8a), 121.0 (C-7'"), 123.0 (C-5'"), 128.4 (C-2' y C-6'), 129.4 (C-3' y C-5'), 133.5 (C- 1'), 139.0 (C-6"'), 140.6 (C-4a), 141.1 (C-4'), 159.1 (C-8'"), 162.2 (CONH), 169.8 (C- 1'"), 170.5 (C-3"), 179.3 (C02H). EMAR (TOF ESI+): calculado para C30H37NCIO8 [M+H]+ 574.2202, encontrado 574.2220.
Figure imgf000022_0001
Preparación de 6-(4-(3-(terc-butoxi)-2-(5-cloro-8-hidroxi-3-metil-1-oxoisocromano-7- carboxam¡do)-3-oxopropil)fen¡l)hexanoato de 2,5-d¡oxopirrolidin-1 -ilo (12). Una disolución del ácido 11 (10,2 mg, 0,018 mmol), NHS (2,2 mg, 0,019 mmol, 1,1 equiv) y EDC HCI (3,7 mg, 0,019 mmol, 1,1 equiv) en CH3CN anhidro (1,0 mL) se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas bajo atmósfera de nitrógeno. Transcurrido este tiempo, la mezcla de reacción se diluyó con AcOEt y se lavó sucesivamente con agua, una disolución acuosa al 5% de NaHC03 y salmuera. Tras evaporar a sequedad, el residuo obtenido se pasó a través de una pequeña columna de gel de sílice, empleando CH2CI2 como eluyente, para obtener en éster de N- hidroxisuccinimidilo 12 (9,6 mg, 79%) como un aceite amarillento. Datos espectroscópicos de 12 (una mezcla 1 :1 de diastereoisómeros): 1H-RMN (CDCI3, 500 MHz): δ (ppm) 1.42 (s ancho, 9H, CMe3 de ambos diastereoisómeros), 1.43-1.49 (m, 2H, H2-5), 1.58-1.67 (m, 2H, H2-4), 1.60 (dos d, 1.5H cada uno, J = 6.4, Me-3'" de cada diastereoisómero), 1.77 (quint, J= 7.6 Hz, 2H, H2-3), 2.59 (m, 4H, H2-2 y H2-6), 2.79-2.90 (m, 5H, H-4'", COCH2CH2CO), 3.11 -3.22 (m, 2H, H2-1"), 3.29 (dd, J = 17.4, 3.5 Hz, 1 H, H-4'"), 4.69-4.81 (m, 1H, H-3'"), 4.89-4.97 (m, 1 H, H-2"), 7.06-7.16 (m, 4H, H-2', H-3', H-5' y H-6'), 8.45 (s, 1H, H-6'"), 8.54 (m, 1 H, NH), 12.73 (s ancho, 1 H, OH). 13C-RMN (CDCI3, 125 MHz): δ (ppm) 20.7 (Me-3"'), 24.4 (C-3), 25.6 (COCH2CH2CO), 28.0 (CMe3), 28.4 (C-4), 30.8 (C-5), 30.9 (C-2), 32.3 (C-4'"), 35.2 (C- 6), 37.8 (C-1"), 54.7 (C-2"), 75.9 (C-3'"), 82.2 (CMe3), 110.0 (C-8a), 121.0 (C-7'"), 123.0 (C-5'"), 128.4 (C-2' y C-6'), 129.5 (C-3' y C-5'), 133.6 (C-1'), 139.0 (C-6'"), 140.5 (C-4a), 140.9 (C-4'), 159.1 (C-8'"), 162.1 (CONH), 168.6 (C-1), 169.1 (COCH2CH2CO), 169.8 (C-1'"), 170.5 (C-3").
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Preparación del ácido 2-(5-cloro-8-hidroxi-3-metil-1-oxoisocromano-7-carboxamido)-3- (4-(6-((2,5-dioxopirrolidin-1-il)oxi)-6-oxohexil)fenil)propanoico (Ester de N- hidroxisuccimidilo del hapteno OTA-1, NHS-OTA-1). Ácido trifluoroacético (370 μL, 4,8 mmol, 370 equiv) se añadió gota a gota sobre una disolución del éster ferc-butílico 12 (9,0 mg, 0,013 mmol) en CH2CI2 anhidro (760 μL) y la mezcla resultante se mantuvo con agitación durante 2 horas a temperatura ambiente. Tras esto, la mezcla de reacción se concentró a sequedad a presión reducida para proporcionar el éster NHS- OTA-1 (7,9 mg, 99%) como un aceite de aspecto resinoso y color parduzco. Datos espectroscópicos de NHS-OTA-1 (una mezcla 1:1 de diastereoisómeros): 1H- RMN (CDCI3, 500 MHz): δ (ppm) 1.42 (m, 2H, H2-2"), 1.57-1.68 (m, 2H, H2-3"), 1.75 (m, 2H, H2-4"), 1.60 (dos d, 1.5H cada uno, J= 6.4, Me-3'" de cada diastereoisómero), 2.59 (m, 4H, H2-1" y H2-5"), 2.78-2.91 (m, 5H, H-4"\ COCH2CH2CO), 3.16-3.34 (m, 3H, H2-3 y Η'-4'"), 4.77 (m, 1 H, H-3"'), 5.00-5.04 (m, 1H, H-2), 7.06-7.18 (m, 4H, H-2', H-3', H-5' y Η-β'), 8.42 (m, 1H, Η-6'"), 8.51 y 8.58 (dos m, 0.5H cada uno, NH de cada diastereoisómero). EMAR (TOF ESI+): calculado para C30H32CIN2O10 [M+H]+ 615.1740, encontrado 615.1732.
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1.2. Preparación de un bioconjugado del hapteno OTA-1 con BSA (BSA-OTA-1). 100 μL de la disolución del éster activo NHS-OTA-1 (50 mM en DMF) obtenida en la reacción anterior se añadieron lentamente y con agitación constante sobre 0,9 mL de una disolución de BSA (15 mg/mL) en tampón carbonato 50 mM, pH 9,6. La reacción de conjugación se incubó durante 2 horas con agitación suave a temperatura ambiente. Transcurrido este tiempo, los conjugados se purificaron por exclusión molecular en 3 columnas cromatográficas HiTrap Desalting Columns de 5 mL cada una, acopladas en serie, utilizando como tampón de elución fosfato sódico 100 mM, pH 7,4. Finalmente, tras el proceso de purificación, las fracciones recogidas que contenían el bioconjugado de BSA se llevaron a una concentración final de 1 mg/mL con tampón de elución y se almacenaron a -20 °C.
Para determinar la carga hapténica (n) obtenida en el conjugado, una alícuota de 100 μL del bioconjugado BSA-OTA-1 purificado se dializó (diálisis contra 5 L de agua desionizada con al menos 2 a 3 cambios de agua cada 24 h a 4 °C); finalmente, el producto dializado se liofilizó y el número de moléculas de hapteno (OTA-1) conjugadas por molécula de BSA se determinó mediante MALDI-TOF-MS (n = 15,2, ver Tabla 1 , entrada 1).
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1.3. Preparación de un bioconjugado del hapteno OTA-1 con OVA (OVA-OTA-1 J. A partir de una disolución 50 mM del hapteno activado NHS-OTA-1 en DMF, se tomaron 90 μL y se añadieron lentamente y con agitación constante a un volumen de 1 ,7 mL de una disolución de OVA (15 mg/mL) en tampón carbonato 50 mM, pH 9,6. Después de 2 h de reacción en agitación suave y a temperatura ambiente, se procedió a la purificación del bioconjugado como se ha descrito anteriormente para el conjugado de BSA. Las fracciones recogidas se llevaron a una concentración final de 1 mg/mL en tampón de elución con timerosal al 0,01% (v/v) y, se almacenaron a -20 °C. Una alícuota del conjugado OVA-OTA-1 recién obtenido se dializó y liofilizó para calcular la eficiencia de la conjugación en términos del número de moléculas de hapteno (OTA-1) acoplados a la proteína mediante MALDI-TOF-MS (n = 9,6, ver Tabla 1 , entrada 2).
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1.4. Preparación de un bioconjugado del hapteno OTA-1 con HRP (HRP-OTA-1 ). A partir de una disolución 5 mM del hapteno activado NHS-OTA-1 en DMF, se tomaron 80 μL y se añadieron lentamente y con agitación constante y suave sobre 0,9 mL de una disolución de HRP a una concentración de 2,5 mg/mL en tampón carbonato 50 mM, pH 7,4. La reacción de conjugación se incubó durante 2 h a temperatura ambiente. Posteriormente, el bioconjugado se purificó siguiendo el procedimiento descrito previamente para los bioconjugados de BSA y OVA, y se llevó a una concentración de 400 Mg/mL en tampón PBS con BSA al 1% (p/v) y timerosal al 0,02% (p/v) y se almacenaron a 4 °C. Una alícuota del conjugado HRP-OTA-1 recién obtenido se dializó y liofilizó para calcular la eficiencia de la conjugación en términos del número de moléculas de hapteno (OTA-1) acoplados a la proteína mediante MALDI-TOF-MS (n = 1 ,1 , ver Tabla 1 , entrada 3).
TABLA 1. Valores de la carga hapténica de los conjugados proteicos del hapteno OTA-1 determinados por MALDI-TOF-MS
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Ejemplo 2: Preparación de bioconjugados de fórmula (I) para T = R-ll, L = -CH2CH2CH2CH2-, Z = -(C=0)NH- y P = BSA, OVA y HRP.
2.1. Preparación del éster de N-hidroxisuccinimidilo del hapteno OTA-2 (NHS-OTA-2).
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Preparación de 3-(5-(benziloxi)pentil)-5-cloro-8-hidroxi-1-oxoisoc
de metilo (14). Una disolución del diéster 3 (117,0 mg, 0,45 mmol) en THF anhidro (280 μL) se añadió gota a gota sobre una disolución de LDA en THF, generada a partir de diisopropilamina (185 μΐ_, 1,25 mmol, 2,75 equiv) y 1 ,6 M BuLi en hexano (710 μL, 0,14 mmol, 2,5 equiv) en THF (1 ,4 mL), a -78°C bajo nitrógeno. La mezcla se mantuvo a la misma temperatura durante 30 minutos y a continuación se añadió una disolución del aldehido 13 (150 mg, 0,73 mmol, 1,6 equiv) en THF anhidro (150 μL). La mezcla de reacción se agitó a -78 °C durante 15 minutos y luego se dejó que se calentara lentamente hasta -5°C (aproximadamente 3 horas). Transcurrido este tiempo, la mezcla de reacción se trató con una mezcla 1:2 de AcOH-Et20 y se agitó durante 10 minutos a 0°C, se diluyó con AcOEt y se lavó con agua, salmuera y se secó sobre MgS04 anhidro para obtener, tras evaporar el disolvente a vacío, un residuo que se purificó por cromatografía, empleando como eluyente mezclas de hexano-AcOEt- AcOH (100:0:0,3, 95:5:0,3 y 85:15:0,3) para obtener el compuesto 14 (109,0 mg, 67%) como aceite amarillento.
Datos espectroscópicos de 14 (una mezcla racémica): 1H-RMN (CDCI3, 300 MHz): δ (ppm) 1.30-1.93 (m, 8H, Η2-1', Η2-2', H2-3' y H2-4'), 2.77 (dd, J = 17.3, 11.7 Hz, 1H, H- 4), 3.16 (dd, J = 17.3, 3.4 Hz, 1H, H'-4), 3.43 (t, J = 6.3 Hz, 3H, H2-5'), 3.89 (s, 3H, OMe), 4.44 (s, 2H, OCH2), 4.45-4.58 (m, 1H, H-3), 6.98-7.46 (m, 5H, Ph), 8.05 (s, 1H, H-6), 12.14 (s, 1 H, OH). 13C-RMN (CDCI3, 75 MHz): δ (ppm) 24.5 (C-2'), 25.9 (C-3'), 29.5 (C-4'), 30.9 (C-4), 34.6 (C-1'), 52.5 (OMe), 70.0 (C-5'), 72.8 (OCH2), 78.5 (C-3), 111.4 (C-7), 118.2 (C-8a), 121.7 (C-5), 127.5 (C-4"), 127.6 (C-2'" y C-6'"), 128.3 (C-3"' y C-5'"), 137.9 (C-1"'), 138.5 (C-6), 142.3 (C-4a), 161.0 (C-8), 165.0 (C-1), 167.9 (C02). EMAR (TOF ESI+): calculado para C23H26CI 06 [M+H]+ 433.1412, encontrado 433.1415.
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Preparación del ácido 3-(5-(benziloxi)pentil)-5-cloro-8-hidroxi-1-oxoisocromano-7- carboxílico (15). Una disolución de LiOH H20 (135,0 mg, 3,21 mmol, 10 equiv) en agua (1 ,40 mL) se añadió sobre una disolución de la dihidroisocumarina 14 (139,0 mg, 0,32 mmol) en THF anhidro (1,30 mL) y la mezcla se calentó a reflujo durante 3,5 horas. A continuación la mezcla de reacción se enfrió en un baño de hielo y se trató con una disolución acuosa 1M de HCI (5,80 mL, 5,80 mmol, 18 equiv), se agitó a 0 °C durante 2 horas, se diluyó con agua y se extrajo con AcOEt. Las fases orgánicas reunidas se lavaron con salmuera, se secaron sobre MgS04 anhidro y se concentraron a sequedad a presión reducida para obtener el ácido 15 (130,5 mg, 97%) como un semisólido amarillento, cuyo RMN de 1H muestra que tiene una pureza suficientemente elevada para ser utilizado en la siguiente etapa sin purificación adicional.
Datos espectroscópicos de 15 (una mezcla racémica): 1H-RMN (MeOD, 300 MHz): δ (ppm) 1.42-1.91 (m, 8H, Η2-1', Η2-2', H2-3' y H2-4'), 2.87 (dd, J = 17.3, 11.7 Hz, 1H, H-4), 3.21-3.29 (m, 1H, H'-4), 3.52 (t, J = 6.4 Hz, 2H, H2-5'), 4.50 (s, 2H, OCH2), 4.56 (m, 1H, H-3), 7.21-7.37 (m, 5H, Ph), 8.12 (s, 1H, H-6). 13C-RMN (MeOD, 75 MHz): δ (ppm) 25.8 (C-2'), 27.2 (C-3'), 30.7 (C-4'), 32.5 (C-4), 35.7 (C-1'), 71.4 (C-5'), 74.0 (OCH2), 79.7 (C-3), 114.0 (C-7), 118.6 (C-8a), 122.8 (C-5), 128.8 (C-4"), 129.0 (C-2" y C-6"), 129.5 (C-3" y C-5"), 138.2 (C-1'"), 140.0 (C-6), 145.4 (C-4a), 163.0 (C-8), 167.5 C-1), 169.8 (C02H). EMAR (TOF ESI+): calculado para C22H24 CIOs [M+H]+ 419.1256, encontrado 419.1251.
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Preparación de 2-(3-(5-(benziloxi)pentil)-5-cloro-8-hidroxi- 1 -oxoisocromano-7-carboxa mido-3-fenilpropanoato de tere-butilo (17). Una disolución de HATU (123,5 mg, 0,33 mmol, 1 ,5 equiv) en DMF anhidra (1,5 mL) y DIEA (80 μΐ_, 0,44 mmol, 2 equiv) se añadieron sobre una disolución del ácido 15 (91,0 mg, 0,22 mmol) en DMF anhidra (1,5 mL) bajo nitrógeno y la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. A continuación, se añadió una disolución del clorhidrato 16 (108 mg, 0,44 mmol, 2 equiv) y DIEA (80 μL, 0,44 mmol, 2 equiv) en DMF anhidra (1 ,1 mL) y se agitó a la misma temperatura durante 4 horas, se diluyó la mezcla de reacción con AcOEt y se lavó sucesivamente con disoluciones acuosas de HCI (1M), LiCI (1,5%), NaHCO3 (5%) y salmuera, se secó sobre MgS04 anhidro y se concentró a sequedad a presión reducida. El residuo obtenido se purificó por cromatografía sobre gel de sílice, empleando como eluyente mezclas de hexano-AcOEt-AcOH (100:0:0,3, 90:10:0,3, y 80:20:0,3) para obtener la amida 17 como un aceite amarillento (87 mg, 65%).
Datos espectroscópicos de 17 (una mezcla 1 :1 de diasteroisómeros): 1H-RMN (CDCI3, 300 MHz): δ (ppm) 1.28-1.91 (m, 8H, H2-1", H2-2", H2-3", H2-4"), 1.36 (s, 9H, CMe3), 2.69-2.86 (m, 1H, H-4'), 3.08-3.23 (m, 3H, H'-4' y H2-3), 3.43 (t, J = 6.3 Hz, 2H, H2-5"), 4.44 (s, 2H, OCH2), 4.47-4.59 (m, 1 H, H-3'), 4.86-4.96 (m, 1H, H-2), 7.04-7.32 (m, 10H, Ph y PhBn), 8.39 (s, 1H, H-6'), 8.50 (d, J = 5.3 Hz, 1 H, NH), 12.66 (s, 1 H, OH). 13C- RMN (CDCI3, 75 MHz): δ (ppm) 24.5 (C-2"), 25.9 (C-3"), 27.9 (CMe3), 29.5 (C-4"), 30.6 (C-4'), 34.6 (C-1"), 38.1 (C-3), 54.6 (C-2), 70.0 (C-5"), 72.9 (OCH2), 79.2 (C-3'), 82.2 (CMe3), 110.2 (C-8a), 120.8 (C-7'), 123.0 (C-5'), 126.9 (C-4'"), 127.5 (C-4 PhBn), 127.6 (C-2 y C-6 PhBn), 128.3 (C-3'" y C-5'"), 129.0 (C-3 y C-5 PhBn), 129.5 (C-2'" y C-6'"), 136.3 (C-1'"), 138.5 (C-1 PhBn), 138.9 (C-6'), 140.6 (C-4a), 159.0 (C-8'), 162.1 (CONH), 169.7 (C-1'), 170.3 (C-1). EMAR (TOF ESI+): calculado para C35H41CINO7 [M+H]+ 622.2566, encontrado 622.2570.
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Preparación de 2-(5-cloro-8-hidroxi-3-(5-hidroxipentil)-1-oxoisocromano-7-carbox amido)-3-fenilpropanoato de tere-butilo (18). Una suspensión de Pd(OH)2 (44 mg, 0,04 mmol, 0,3 equiv) y del éter bencílico 17 (85 mg, 0,14 mmol) en AcOEt (4,8 mL) se purgó con repetidos ciclos de vacío-hidrógeno y posteriormente se agitó vigorosamente bajo una presión de H2 de 1 atm (globo) a temperatura ambiente durante 6 horas. La mezcla de reacción se filtró sobre una pequeña columna de gel de sílice, utilizando AcOEt para lavar, y el filtrado y las aguas de lavado se concentraron a sequedad para proporcionar el alcohol 18 (65 mg, 90%) como un aceite, cuyo RMN de 1H muestra la presencia de un pequeño porcentaje (5-6%) del producto de hidrogenolisis del enlace C-CI.
Datos espectroscópicos de 18 (una mezcla 1 :1 de diasteroisómeros): 1H-RMN (CDCI3, 300 MHz): δ (ppm) 1.40-1.98 (m, 8H, H2-1", H2-2", H2-3", H2-4"), 1.42 (s, 9H, CMe3), 2.78-2.94 (dos dd, J = 17.4, 11.8 Hz, 1 H, H-4' de cada diastereoisómero), 3.14-3.33 (m, 3H, H-4' y H2-3), 3.67 (t, J = 6.4 Hz, 2H, H2-5"), 4.51-4.69 (m, 1H, H-3'), 4.96 (m, 1 H, H-2), 7.10-7.35 (m, 5H, Ph), 8.44 (s, 1 H, H-6'), 8.50-8.63 (dos d, J = 7.4 Hz, 0.5H cada uno, NH de cada diasteroisómero), 12.72 (dos s, 0.5H cada uno, OH de cada diasteroisómero). 13C-RMN (CDCI3, 75 MHz): δ (ppm) 24.5 (C-2"), 25.5 (C-3"), 27.9 (CMe3), 30.6 (C-4'), 32.4 (C-4"), 34.6 (C-1"), 38.1 (C-3), 54.6 (C-2), 62.6 (C-5"), 79.3 (C-3'), 82.3 (CMe3), 110.1 (C-8a), 120.8 (C-7'), 123.1 (C-5'), 126.9 (C-4'"), 128.3 (C-2'" y C-6'"), 129.5 (C-3"' y C-5'"), 136.2 (C-1'"), 138.9 (C-6'), 140.6 (C-4a), 159.0 (C-8'), 162.1 (CONH), 169.7 (C-1'), 170.4 (C-1). EMAR (TOF ESI+): calculado para C28H35CIN07 [M+H]+ 532.2097, encontrado 532.2060.
Figure imgf000031_0001
Preparación de 2-(5-cloro-8-hidroxi-1-oxo-3-(5-oxopentil)isocroman
3-fenilpropanoato de tere-butilo (19). Una suspensión de Dess-Martin periodinano (DMP) (78,0 mg, 0,18 mmol, 1,5 equiv) y NaHCO3 (82 mg, 0,98 mmol, 8,0 equiv) en CH2CI2 (1 ,0 mL) se añadió sobre una mezcla del alcohol 18 (65,0 mg, 0,12 mmol) y NaHCC-3 (82 mg, 0,98 mmol, 8,0 equiv) en CH2CI2 (4 mL) enfriada a 0 ºC. La mezcla resultante se agitó 10 minutos a 0 °C y 1 hora a temperatura ambiente, se diluyó con AcOEt y se lavó sucesivamente con disoluciones acuosas de Na2S203 (10%), NaHC03 saturado y salmuera, se secó sobre MgS04 anhidro y se concentró a sequedad a presión reducida para obtener el aldehido 19 (59,6 mg, 92%) como un aceite amarillento.
Datos espectroscópicos de 19 (una mezcla 1 :1 de diasteroisómeros): 1H-RMN (CDCI3, 300 MHz): δ (ppm) 1.42 (s, 9H, CMe3), 1.48-1.99 (m, 6H, H2-1", H2-2" y H2-3"), 2.52 (dt, J = 7.0, 1.1 Hz, 2H, H2-4"), 2.87 (dos dd, J = 17.3, 11.7, 0.5H cada uno, H-4' de cada diasteroisómero), 3.14-3.31 (m, 3H, H'-4' y H2-3), 4.60 (ddt, J = 11.7, 7.7, 4.0 Hz, 1 H, H-3'), 4.92-5.01 (dt, J = 7.3, 6.1 Hz, 1H, H-2), 7.16-7.32 (m, 5H, Ph), 8.45 (s, 1H, H-6'), 8.56 (dos d, J= 7.3 Hz, 0.5H cada uno, NH de cada diastereoisómero), 9.80 (t, J = 1.4 Hz, 1H, CHO), 12.69 (s, 1H, OH). 13C-RMN (CDCI3, 75 MHz): δ (ppm) 21.6 (C- 3"), 24.3 (C-2"), 27.9 (CMe3), 30.6 (C-4'), 34.5 (C-1"), 38.1 (C-3), 43.6 (C-4"), 54.6 (C- 2), 79.0 (C-3'), 82.3 (CMe3), 110.1 (C-8a), 120.9 (C-7*), 123.1 (C-5'), 126.9 (C-4'"), 128.3 (C-2"' y C-6'"), 129.5 (C-3'" y C-5'"), 136.3 (C-1'"), 139.0 (C-6'), 140.5 (C-4a), 159.0 (C-8'), 162.3 (CONH), 169.6 (C-1'), 170.4 (C-1), 201.9 (C-5"). EMAR (TOF ESI+): calculado para C28H33CIN07 [M+H]+ 530.1940, encontrado 530.1920.
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Preparación del ácido 5-(7-((1-(terc-butoxi)-1-oxo-3-fenilpropan-2-il)carbamo
8-hidroxi-1-oxoisocromano-3-il)pentanóico (20). Una disolución de NaH2P04 (92,7 mg, 0,67 mmol, 6,0 equiv) y NaCI02 (40,5 mg, 0,45 mmol, 4 equiv) en agua (620 μL) se adicionó sobre una disolución del aldehido 19 (59,6 mg, 0,11 mmol) y 2-metilbut-2-eno (175 μΐ_, 1,57 mmol, 14 equiv) en 'BuOH (1,5 mL) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuación, se añadió una disolución acuosa 1M de HCI (1,5 mL) y se agitó durante 3 minutos a temperatura ambiente, se diluyó con AcOEt, se lavó con salmuera y se concentró a sequedad a vacío para obtener el ácido 20 (62,6 mg, 94%) como un aceite amarillento.
Datos espectroscópicos de 20 (una mezcla 1 :1 de diasteroisómeros): 1H-RMN (CDCI3, 300 MHz): δ (ppm) 1.41 (dos s, 4.5H cada uno, CMe3 de cada diastereoisómero), 1.53- 2.00 (m, 6H, H2-3, H2-4 y H2-5), 2.42 (t, J = 7.10 Hz, 2H, H2-2), 2.80-2.92 (m, 1H, H-4'), 3.13-3.31 (m, 3H, H'-4' y H2-3"), 4.55-4.65 (m, 1H, H-3'), 4.97 (dt, J = 7.3, 6.1 Hz, 1H, H-2"), 7.11-7.31 (m, 5H, Ph), 8.44 (s, 1 H, H-6'), 8.57-8.62 (m, 1 H, NH), 12.71 (s, 1H, OH). 13C-RMN (CDCI3, 75 MHz): δ (ppm) 24.2 (C-4), 27.9 (CMe3), 29.6 (C-3), 30.6 (C- 4'), 33.6 (C-2), 34.3 (C-5), 38.1 (C-3"), 54.6 (C-2"), 79.0 (C-3'), 82.4 (CMe3), 110.1 (C- 8a), 120.7 (C-7'), 123.1 (C-5'), 126.9 (C-4'"), 128.3 (C-2'" y C-6'"), 129.5 (C-3"' y C- 5'"), 136.2 (C-1"'), 139.0 (C-6'), 140.6 (C-4a), 159.0 (C-8'), 162.2 (CONH), 169.6 (C- 1'), 170.3 (C-1"), 178.6 (C-1). EMAR (TOF ESI+): calculado para C28H33CINO8 [M+H]+ 546.1889, encontrado 546.1867.
Figure imgf000033_0001
Preparación de 5-(7-(( 1 -(terc-butoxi)- 1 -oxo-3-fenilpropan-2-il)carbamoil)-5-cloro- 8-hidroxi-1-oxoisocromano-3-il)pentanoato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo (21). Una disolución del ácido 20 (31,8 mg, 0,058 mmol), NHS (7,3 mg, 0,064 mmol, 1,1 equiv) y EDC HCI (13,4 mg, 0,07 mmol, 1 ,2 equiv) en CH3CN seco (1 ,6 mL) se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas bajo nitrógeno, tras lo cual se diluyó con AcOEt y se lavó sucesivamente con agua, disolución acuosa del 5% de NaHC03 y salmuera. Tras secar sobre MgS04 anhidro y eliminar el disolvente a presión reducida se obtuvo el éster de N-hidroxisuccinimidilo 21 (33,0 mg, 90%) como un aceite.
Datos espectroscópicos de 21 (una mezcla 1 :1 de diasteroisómeros): 1H-RMN (CDCI3, 300 MHz): δ (ppm) 1.41 (s, 9H, CMe3), 1.50-1.91 (m, 6H, H2-3, H2-4 y H2-5), 2.67 (t, J = 7.0 Hz, 2H, H2-2), 2.83 (s, 4H, COCH2CH2CO), 2.88-2.94 (m, 1H, H-4'), 3.14-3.24 (m, 2H, H2-3"), 3.27 (dd, J= 17.2, 3.3 Hz, H'-4'), 4.54-4.68 (m, 1 H, H-3'), 4.90-5.01 (m, 1H, H-2"), 7.12-7.34 (m, 5H, Ph), 8.44 (s, 1H, H-6'), 8.55 (dos dd, J = 7.4 Hz, 0.5H cada uno, NH de cada diasteroisómero), 12.69 (s, 1 H, OH). 13C-RMN (CDCI3, 75 MHz): δ (ppm) 24.2 (C-4), 25.6 (COCH2CH2CO), 27.9 (CMe3), 29.6 (C-3), 30.6 (C-2), 30.7 (C- 4'), 34.1 (C-5), 38.1 (C-3"), 54.6 (C-2"), 78.9 (C-3'), 82.3 (CMe3), 110.1 (C-8a), 120.8 (C-7'), 123.1 (C-5'), 126.9 (C-4'"), 128.3 (C-2'" y C-6"'), 129.5 (C-3"' y C-5"'), 136.2 (C- 1"'), 138.9 (C-6'), 140.5 (C-4a), 159.0 (C-8'), 162.1 (CONH), 168.3 (C-1), 169.1 (COCH2CH2CO), 169.6 (C-1'), 170.3 (C-1"). EMAR (TOF ESI+): calculado para C32H36CIN2O10 [M+H]+ 643.2053, encontrado 643.2050.
Figure imgf000034_0001
Preparación del ácido 2-(5-doro-3-(5-((2,5-dioxopirrolidin-1-il)oxi)-5-oxopentil)-8- hidroxi-1-oxoisocroman-7-carboxamido)-3-fenilpropanoico (Éster de N- hidroxisuccimidilo del hapteno OTA-2, NHS-OTA-2). Una disolución del éster terc- butílico 21 (33,0 mg, 0,051 mmol) y CF3C02H (1,5 mL, 19,0 mmol, 370 equiv) en CH2CI2 anhidro (2,3 mL) se agitó durante 2 horas a temperatura ambiente bajo nitrógeno. A continuación, los disolventes se eliminaron a sequedad a presión reducida para obtener NHS-OTA-2 (29,8 mg, 99%) como un residuo de aspecto resinoso y color parduzco.
Datos espectroscópicos de NHS-OTA-2 (una mezcla 1 :1 de diasteroisómeros): 1H- RMN (CDCI3, 300 MHz): δ (ppm) 1.54-1.93 (m, 6H, H2-1", H2-2" y H2-3"), 2.68 (t, J = 6.69 Hz, 2H, H2-4"), 2.85 (s ancho, 4H, COCH2CH£0), 2.92 (m, 1H, H-4'), 3.17-3.43 (m, 3H, H2-3 y H'-4'), 4.61 (m, 1H, H-3'), 5.03 (m, 1H, H-2), 7.18-7.33 (m, 5H, Ph), 8.39 (s, 1H, H-6'), 8.56 (s ancho, 1 H, NH), 12.73 (s ancho, 1 H, OH). EMAR (TOF ESI+): calculado para C28H28CIN2Oi0 [M+H]+ 587.1427, encontrado 587.1425.
Figure imgf000035_0001
2.2. Preparación de un bioconjugado del hapteno OTA-2 con BSA (BSA-OTA-2J. Preparado como se ha descrito anteriormente para el bioconjugado BSA-OTA-1 a partir de 200 μL de una disolución 50 mM en DMF del hapteno activado NHS-OTA-2 y 1,8 mL de una disolución de BSA (15 mg/mL) en tampón carbonato 50 mM, pH 9,6. Tras la correspondiente purificación cromatográfica, las fracciones recogidas se llevaron a una concentración final de 1 mg/mL en tampón de elución y se almacenaron a -20 °C. El número de moléculas de OTA-2 conjugadas por cada molécula de BSA, determinado por MALDI-TOF-MS, fue de n = 11 ,8 (ver Tabla 2, entrada 1).
Figure imgf000036_0001
2.3. Preparación de un bioconjugado del hapteno OTA-2 con OVA OVA-OTA-2 . Preparado como se ha descrito anteriormente para el bioconjugado OVA-OTA-1 a partir 100 μΐ_ de una disolución 50 mM en DMF del hapteno activado NHS-OTA-2 y 1,9 mL de una disolución de OVA (15 mg/mL) en tampón carbonato 50 mM, pH 9,6. Tras la correspondiente purificación cromatográfica, las fracciones recogidas se llevaron a una concentración final de 1 mg/mL en tampón de elución con timerosal al 0,01% (v/v) y se almacenaron a -20 °C. El número de moléculas de OTA-2 conjugadas por cada molécula de OVA, determinado por MALDI-TOF-MS, fue de n = 3,1 (ver Tabla 2, entrada 2).
Figure imgf000037_0001
2.4. Preparación de un bioconjugado del hapteno OTA-2 con HRP (HRP-OTA-2 . Preparado a partir de 80 μL de una disolución 5 mM del hapteno activado NHS-OTA- 2 en DMF y 0,9 mL de una disolución de HRP (2,5 mg/mL) en tampón carbonato 50 mM, pH 7,4. Tras la purificación cromatográfica, las fracciones obtenidas conteniendo el bioconjugado se llevaron a una concentración de 460 Mg/mL en tampón PBS con BSA al 1% (p/v) y timerosal al 0,02% (p/v) y se almacenaron a 4 °C. El número de moléculas de OTA-2 conjugadas por cada molécula de HRP, determinado por MALDI- TOF-MS, fue de n = 0,6 (ver Tabla 2, entrada 3).
TABLA 2. Valores de la carga hapténica de los conjugados proteicos del hapteno OTA-2 determinados por MALDI-TOF-MS
Figure imgf000037_0002
Ejemplo 3: Preparación de bioconjugados comparativos basados en el anclaje de la proteína a través del grupo carboxilato de OTA donde L = CH2CH2CH2CH2CH2, Z = - (0=0)NH- y P = BSA, OVA y HRP.
3.1. Preparación del éster de N-hidroxisuccinimidilo del hapteno OTA-3 (NHS-OTA- 3).
Figure imgf000038_0001
Preparación de 2-(5-cloro-8-hidroxi-3-metil-1-oxoisocromano-7-carboxamido)-3- fenilpropanoato de tere-butilo (22). A una disolución del ácido 5 (40 mg, 0,16 mmol) en DMF anhidra (1 ,1 mL) se añadieron una disolución de HATU (91 ,3 mg, 0,24 mmol, 1,5 equiv) en DMF anhidra (1 ,1 mL) y DIEA (60 μL, 0,32 mmol, 2 equiv). La mezcla de reacción se agitó durante 2 horas a temperatura ambiente y a continuación se añadió una disolución del clorhidrato 16 (82,5 mg, 0,32 mmol, 2 equiv) y DIEA (60 μΐ_, 0,324 mmol, 2 equiv) en DMF anhidra (1 ,1 mL). Se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas, tras lo cual se diluyó la mezcla de reacción con AcOEt y se lavó sucesivamente con disoluciones acuosas de HCI (1M), LiCI (1 ,5%), NaHC03 (5%) y salmuera, se secó sobre MgS04 anhidro y se concentró a sequedad en el rotavapor. El residuo obtenido se purificó por cromatografía sobre gel de sílice, empleando como eluyente mezclas de hexano-AcOEt-AcOH (100:0:0,3, 90:10:0,3 y 80:20:0,3) para obtener el compuesto 22 (67 mg, 65%) como un aceite amarillento. Datos espectroscópicos de 22 (una mezcla 1 :1 de diastereoisómeros): 1H-RMN (CDCI3, 300 MHz): δ (ppm) 1.46 (s, 9H, CMe3), 1.62-1.64 y 1.63-1.65 (dos d, J = 6.3, 1.5H cada uno, Me-3' de cada diastereoisómero), 2.84-2.89 y 2.90-2.95 (dos dd, J = 11.7, 3.4 Hz, 0.5H cada uno, Η-4' de cada diastereoisómero), 3.25 (m, 2H, H2-3), 3.33 (dd, J = 17.3, 3.4 Hz, 1 H, H'-4'), 4.80 (m, 1H, H-3'), 5.01 (dt, J = 7.4, 6.0 Hz, 1H, H-2), 7.20-7.38 (m, 5H, Ph), 8.49 (s, 1 H, H-6'), 8.58-8.62 (dos d, J = 6.9 Hz, 0.5H cada uno, NH de cada diastereoisómero), 12.77 (s, 1 H, OH). 13C-RMN (CDCI3, 75 MHz): δ (ppm) 20.6 (Me-3'), 27.9 (C e3), 32.2 (C-4'), 38.1 (C-3), 54.5 (C-2), 75.8 (C-3'), 82.3 (CMe3), 110.0 (C-8a), 120.8 (C-7'), 123.0 (C-5'), 126.9 (C-4"), 128.3 (C-2" y C-6"), 129.5 (C-3" y C-5"), 136.2 (C-1"), 138.9 (C-6'), 140.5 (C-4a), 159.0 (C-8'), 162.1 (CONH), 169.7 (C-1'), 170.3 (C-1). EMAR (TOF ESI+): calculado para C24H27CIN06 [M+H]+ 460.1521, encontrado 460.1522.
Figure imgf000039_0001
Preparación del ácido 2-(5-cloro-8-hidroxi-3-metil-1-oxoisocromano-7-carboxamido)-3- fenilpropanóico (23, OTA). Ácido trifluoroacético (1,27 mL, 16,28 mmol, 370 equiv) se añadió sobre una disolución del éster 22 (20,5 mg, 0,045 mmol) en CH2CI2 anhidro (2 mL) y la mezcla se mantuvo bajo agitación durante 2h a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se concentró a sequedad a presión reducida para obtener 23 (17.6 mg, 99%) como un sólido de color crema.
Datos espectroscópicos de 23 (una mezcla 1 :1 de diastereoisómeros): 1H-RMN (CDCIs, 300 MHz): δ (ppm) 1.60 (d, J = 6.2 Hz, 3H, Me-3'), 2.82 y 2.88 (dos dd, J = 11.5, 3.2 Hz, 0.5H cada uno, H-4' de cada diastereoisómero), 3.16-3.40 (m, 3H, H2-3 y H'-4'), 4.75 (m, 1 H, H-3') 4.99-5.08 (m, 1 H, H-2) 7.10-7.37 (m, 5H, Ph) 8.42 (s, 1 H, H- 6'), 8.50 (dos d, J = 6.8 Hz, 0.5H cada uno, NH de cada diastereoisómero), 12.74 (s, 1 H, OH). 13C-RMN (CDCI3, 75 MHz): δ (ppm) 20.6 (Me-3'), 32.2 (C-4'), 37.3 (C-3), 54.3 (C-2), 75.9 (C-3'), 110.0 (C-8a), 120.2 (C-7'), 123.2 (C-5'), 127.3 (C-4"), 128.3 (C-2" y C-6"), 129.3 (C-3" y C-5"), 135.7 (C-1"), 138.9 (C-6'), 141.0 (C-4a), 159.0 (C-8'), 163.1 (CONH), 169.7 (C-1'), 175.1 (C-1). EMAR (TOF ESI+): calculado para C2oH19CIN06 [M+H]+ 404.0895, encontrado 404.0901.
Figure imgf000040_0001
Preparación de 6-(2-(5-cloro-8-hidroxi-3-metil- 1 -oxoisocromano-7-carboxamido)-3- fenilpropanamido)hexanoato de metilo (25). Sobre una disolución del ácido 23 (18 mg, 0,044 mmol) y cloruro de 6-metoxi-6-oxohexan-1 -amonio (24, 9,4 mg, 0,052 mmol, 1,1 equiv) en DMF anhidra (600 μL) bajo nitrógeno se añadió DIEA (25 μL, 0,143 mmol, 3,25 equiv), la mezcla resultante se agitó durante 10 minutos y seguidamente se añadió una disolución de PyAOP (34 mg, 0,065 mmol, 1,5 equiv) en DMF anhidra (600 μί.). Tras 4 horas de agitación a temperatura ambiente, la mezcla se diluyó con AcOEt y se lavó con disoluciones acuosas de LiCI (1 ,5%) y NaHC03 (5%) y salmuera, se secó sobre MgS04 anhidro. El residuo obtenido tras la evaporación del disolvente a presión reducida se purificó por cromatografía sobre gel de sílice, empleando como eluyente mezclas de CHCI3-MeOH (100:0 y 99:1) para obtener la amida 25 (16,8 mg, 72%) como un aceite amarillento.
Datos espectroscópicos de 25 (una mezcla 1 :1 de diastereoisómeros): 1H-RMN (CDCI3, 300 MHz): δ (ppm) 1.11-1.28 (m, 2H, H2-4), 1.31-1.44 (m, 2H, H2-5), 1.49-1.63 (m, 2H, H2-3), 1.61 (dos d, J = 6.4 Hz, 1.5H cada uno, Me-3'" de cada uno de los diastereoisómeros), 2.17-2.34 (t, J = 7.4 Hz, 2H, H2-2), 2.86 (dos dd, J = 11.6, 1.6 Hz, 0.5H cada uno, H-4'" de cada diastereoisómero), 3.04-3.37 (m, 5H, H2-6, H2-3' y H'- 4"'), 3.66 (s, 3H, OMe), 4.62-4.89 (m, 2H, H-3"' y NH), 5.83 (m, 1H, H-2'), 7.12-7.40 (m, 5H, Ph), 8.41 (s, 1H, H-6"'), 8.59 (d, J = 7.4 Hz, 1 H, NH), 12.81 (s, 1 H, OH). 13C-RMN (CDCI3, 75 MHz): δ (ppm) 20.7 (Me-3'"), 24.4 (C-3), 26.2 (C-4), 28.9 (C-5), 32.2 (C-4"'), 33.8 (C-2), 38.4 (C-3'), 39.2 (C-6), 51.5 (OMe), 55.7 (C-2'), 75.9 (C-3'"), 110.1 (C-8a), 120.6 (C-7'"), 123.1 (C-5'"),127.0 (C-4"), 128.6 (C-2" y C-6"), 129.3 (C-3" y C-5"), 136.8 (C-1"), 138.8 (C-6'"), 140.8 (C-4a), 159.0 (C-8'"), 162.7 (CONH), 169.7 (C-1"'), 170.4 (C-1'), 173.9 (C-1). EMAR (TOF ESI+): calculado para C27H32CIN207 [M+H]+ 531.1893, encontrado 531.1878.
Figure imgf000041_0001
Preparación del ácido 6-(2-(5-cloro-8-hidroxi-3-metil-1-oxoisocromano-7-carboxamido) 3-fenilpropanamido) hexanóico (26). Una disolución de LiOH H20 (13 mg, 0,31 mmol, 10 equiv) en agua (700 μL) se añadió sobre una disolución del éster metílico 25 (16,6 mg, 0,031 mmol) en THF (700 μL) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 40 minutos. A continuación, la mezcla de reacción se enfrió en un baño de hielo y se acidificó con una disolución acuosa 1M de KHS04 hasta pH=2, se diluyó con AcOEt, se lavó con salmuera y se secó sobre MgS04 anhidro para obtener, tras evaporar el disolvente a presión reducida, un residuo que se disolvió en THF anhidro (1,2 mL) sobre el que se añadió una gota de HCI 4M en dioxano. Tras 30 min de agitación a temperatura ambiente, el disolvente se eliminó a vacío hasta sequedad para obtener el ácido 26 (15,7 mg, 98%) como un semisólido amarillento.
Datos espectroscópicos de 26 (una mezcla 1 :1 de diastereoisómeros): 1H-RMN (DMSO-cfe, 500 MHz): δ (ppm) 1.18-1.28 (m, 2H, H2-4), 1.30-1.40 (m, 2H, H2-5), 1.42- 1.52 (m, 2H, H2-3), 1.46-1.47 (dos d, J = 6.4 Hz, 1.5H cada uno, Me-3"' de cada uno de los diastereoisómeros), 2.14-2.20 (t, J = 7.4 Hz, 2H, H2-2), 2.88-3.08 (m, 6H, H-4"\ H2-3\ H2-6 y NH), 3.22 (dd, J= 17.2, 3.1 Hz, 1 H, H'-4'"), 4.69-4.76 (m, 1H, H-3'"), 4.84 (m, 1H, Η-2'), 7.15-7.28 (m, 5H, Ph), 8.08 y 8.09 (dos s, 0.5H cada uno, Η-β'" de cada diastereoisómero), 8.14 y 8.60 (dos m, 0.5H cada uno, NH de cada diastereoisómero). 13C-RMN (DMSO-d6, 125 MHz): δ (ppm) 20.0 (Me-3'"), 24.2 (C-3), 25.9 (C-4), 28.6 (C-5), 31.6 (C-4'"), 33.56 (C-2), 38.1 (C-3'), 38.4 (C-6), 54.5 (C-2'), 75.4 (C-3'"), 111.3 (C-8a), 120.2 (C-7'"), 121.4 (C-5'"), 126.4 (C-4"), 128.1 (C-2" y C-6"), 129.2 (C-3" y C- 5"), 136.0 (C-1"), 139.2 (C-6'"), 141.6 (C-4a), 158.4 (C-8'"), 162.54 (CONH), 169.9 (C- 1'"), 169.9 (C-1'), 174.3 (C-1). EMAR (TOF ESI+): calculado para C26H30CIN2O7 [M+H]+ 517.1736, encontrado 517.1731.
Figure imgf000042_0001
Preparación de 6-(2-(5-cloro-8-hidroxi-3-metil-1-oxoisocromano-7-carboxamido)-3-fenil propanamido)hexanoato de 2,5-dioxopirrolidin-1 -ilo (Ester de AZ-hidroxisuccimidilo del hapteno OTA-3, NHS-OTA-3). Una disolución de EDC HCI (7,0 mg, 0,037 mmol, 1,2 equiv) en DMF anhidra (0,5 mL) se adicionó sobre una disolución del ácido 26 (16 mg, 0,031 mmol) y NHS (3,9 mg, 0,034 mmol, 1 ,1 equiv) en DMF anhidra (0,5 mL) bajo nitrógeno. La mezcla se mantuvo bajo agitación a temperatura ambiente durante 24 horas y a continuación se trató con una disolución saturada de NH4CI, se diluyó con AcOEt y se lavó con disoluciones acuosas de LiCI (1,5%), NaHC03 (5%) y salmuera. Tras secar sobre MgS04 anhidro y evaporar el disolvente a presión reducida se obtuvo un residuo que se purificó por cromatografía sobre gel de sílice, empleando como eluyente mezclas de CH2CI2-acetona (90:10, 85:15 y 80:20), para obtener el éster NHS-OTA-3 (8,5 mg, 45%) como aceite amarillento. Datos espectroscópicos de NHS-OTA-3 (una mezcla 1 :1 de diastereoisómeros): 1H- RMN (DMSO-d6, 500 MHz): δ (ppm) 1.29-1.37 (m, 2H, H2-4), 1.39-1.47 (m, 2H, H2-5), 1.60 (d, J= 6.4 Hz, 3H, Me-3'"), 1.64-1.78 (m, 2H, H2-3), 2.56 (t, J = 6.8 Hz, 2H, H2-2), 2.76-2.93 (m, 5H, H-4'", COCH2CH2CO), 3.06-3.37 (m, 5H, HT, H2-3' y H2-6), 4.68- 4.91 (m, 2H, H-3'" y NH), 6.04 (m, 1H, H-2'), 7.16-7.35 (m, 5H, Ph), 8.38 (s, 1H, H-6'"), 8.60 (d, J = 7.0 Hz, 1 H, NH), 12.79 (s, 1H, OH). EMAR (TOF ESI+): calculado para C30H33N3CIO9 [M+H]+ 614.1900, encontrado 614.1892.
Figure imgf000043_0001
3.2. Preparación de un bioconjugado del hapteno OTA-3 con BSA (BSA-OTA-3,). Preparado como se ha descrito anteriormente para el bioconjugado BSA-OTA-1 a partir de 178 μL de una disolución 50 mM en DMF del hapteno activado NHS-OTA-3 y 1,6 mL de una disolución de BSA (15 mg/mL) en tampón carbonato 50 mM, pH 9,6. Tras la correspondiente purificación cromatográfica, las fracciones recogidas se llevaron a una concentración final de 1 mg/mL en tampón de elución y se almacenaron a -20 °C. El número de moléculas de OTA-3 conjugadas por cada molécula de BSA, determinado por MALDI-TOF-MS, fue de n = 14,4 (ver Tabla 3, entrada 1).
Figure imgf000044_0001
3.3. Preparación de un bioconjugado del hapteno OTA-3 con OVA (OVA-OTA-3J. Preparado como se ha descrito anteriormente para el bioconjugado OVA-OTA-1 a partir de 100 μL de una disolución 50 mM en DMF del hapteno activado NHS-OTA-3 y 1,9 mL de una disolución de OVA (15 mg/mL) en tampón carbonato 50 mM, pH 9,6. Tras la correspondiente purificación cromatográfica, las fracciones recogidas se llevaron a una concentración final de 1 mg/mL en tampón de elución con timerosal al 0,01% (v/v) y se almacenaron a -20 °C. El número de moléculas de OTA-3 conjugadas por cada molécula de OVA, determinado por MALDI-TOF-MS, fue de n = 3,0 (ver Tabla 3, entrada 2).
Figure imgf000045_0001
3.4. Preparación de un bioconjugado del hapteno OTA-3 con HRP HRP-OTA-3J. Preparado a partir de 80 μL de una disolución 5 mM del hapteno activado NHS-OTA- 3 en DMF y 0,9 mL de una disolución de HRP (2,5 mg/mL) en tampón carbonato 50 mM, pH 7,4. Tras la purificación cromatográfica, las fracciones obtenidas conteniendo el bioconjugado se llevaron a una concentración de 470 g mL en tampón PBS con BSA al 1% (p/v) y timerosal al 0,02% (p/v) y se almacenaron a 4 °C. El número de moléculas de OTA-3 conjugadas por cada molécula de HRP, determinado por MALDI- TOF-MS, fue de n = 0,9 (ver Tabla 3, entrada 3).
TABLA 3. Valores de la carga hapténica de los conjugados proteicos del hapteno OTA-3 determinados por MALDI-TOF-MS
Figure imgf000045_0002
2. Procedimiento ELISA
Se emplearon placas de poliestireno de 96 pocilios. Cada anticuerpo se evaluó en los dos formatos clásicos de ELISA competitivo (el de antígeno o conjugado inmovilizado con detección indirecta y el de anticuerpo inmovilizado con detección directa y pretapizado) usando antígenos de ensayo homólogos, es decir, un antígeno de ensayo a partir del mismo bioconjugado de fórmula (I) o bioconjugado comparativo que el utilizado para obtener el inmunógeno pero en el que P = OVA o HRP. Después de cada etapa de incubación, las placas se lavaron cuatro veces con una disolución de lavado, usando un lavador de 96 canales ELx405 (Biotek Instruments, Winooski, EE.UU.). La señal producida por la peroxidasa utilizada como marcador se reveló con 100 μL por pocilio de una disolución 2 mg/mL de o-fenilendiamina en tampón citrato 25 mM, fosfato 62 mM, pH 5,4, conteniendo 0,012% (v/v) de H202. Este revelado se desarrolló durante 10 min a temperatura ambiente y se paró usando 100 μL por pocilio de ácido sulfúrico 2,5 M. Al finalizar los ensayos, la absorbancia de cada pocilio se leyó a 492 nm usando una longitud de onda de referencia de 650 nm en un lector de microplacas PowerWave HT (Biotek Instruments, Winooski, EE.UU.). Las curvas patrón sigmoideas obtenidas al representar la absorbancia frente a la concentración de analito se ajustaron a una ecuación logística de cuatro parámetros usando el paquete informático SigmaPlot de SPSS (Chicago, EE.UU.).
La afinidad del anticuerpo (IC50) se estimó como la concentración de analito libre capaz de reducir a la mitad la señal máxima (Amax). 2.1. Ensayos ELISA competitivos en formato de antígeno o conjugado inmovilizado con detección indirecta (ensayo indirecto)
Las placas se tapizaron con 100 μL por pocilio de una disolución de antígeno de ensayo que es un bioconjugado de formula (I) o bioconjugado comparativo donde P es OVA, a diversas concentraciones en tampón carbonato 50 mM, pH 9,6, mediante incubación durante toda la noche a temperatura ambiente. Después de lavar las placas, en cada columna se dispensó 50 μL por pocilio de una curva estándar completa del analito en PBS seguido de 50 μL por pocilio de un determinado anticuerpo diluido en PBST (0,05% Tween 20). La reacción inmunoquímica se llevó a cabo durante 1 h a temperatura ambiente y después se lavaron las placas. A continuación, cada pocilio recibió 100 μL de una dilución 1/2000 de RAM-HRP (inmunoglobulinas de conejo anti-ratón marcadas con peroxidasa) en PBST. Esta reacción se dejó a temperatura ambiente durante 1 h. Después de lavar las placas, se reveló la actividad peroxidasa retenida y se leyó la absorbancia a 492 nm como se ha descrito anteriormente.
2.2. Ensayos ELISA competitivos en formato de anticuerpo inmovilizado con detección directa (ensayo directo) Las placas se tapizaron con 100 μL por pocilio de una dilución de anticuerpo de captura en tampón carbonato 50 mM, pH 9,6, por incubación durante toda la noche a temperatura ambiente. Después de lavar las placas, se añadió 100 μL por pocilio de anticuerpo o antisuero en PBST a la concentración o dilución considerada como óptima, y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 h. Después de lavar de nuevo las placas, en cada columna se dispensó 50 μL por pocilio de una curva estándar completa del analito en PBS seguido de 50 μL por pocilio de una dilución concreta en PBST de bioconjugado enzimático que es un bioconjugado de formula (I) o bioconjugado comparativo donde P es HRP. La reacción inmunoquímica se llevó a cabo durante 1 h a temperatura ambiente y después se lavaron las placas. Finalmente, se reveló la actividad peroxidasa retenida y se leyó la absorbancia a 492 nm como se ha descrito.
3. Inmunización de conejos
Se inmunizaron, siguiendo protocolos estandarizados, 2 hembras de conejo de la raza New Zealand con cada bioconjugado de fórmula (I) o bioconjugado comparativo donde P es BSA. Cada animal recibió 0,3 mg de uno de los bioconjugados de fórmula (I) o el bioconjugado comparativo disuelto en 1 mL de una mezcla 1 :1 de tampón PB y adyuvante de Freund completo. La inmunización prosiguió con la inoculación de una dosis de recuerdo cada 21 días con la misma cantidad de conjugado pero empleando adyuvante de Freund incompleto. Diez días después de la cuarta inyección, los animales fueron desangrados y la sangre obtenida se dejó coagular a 4 °C durante toda la noche. Al día siguiente, se recuperaron los sueros por centrifugación, se diluyeron a ½ con PBS frío y se les añadió un volumen de una disolución saturada de sulfato amónico. El precipitado proteico resultante de cada suero se recogió por centrifugación y se redisolvió en tampón PBS frío. Finalmente, las proteínas se reprecipitaron como anteriormente y se almacenaron en este estado a 4 °C. Este precipitado contiene una mezcla indeterminada de proteínas que denominamos antisuero, anticuerpo policlonal o simplemente anticuerpo. Se obtuvieron dos anticuerpos de cada bioconjugado de fórmula (I) y del bioconjugado comparativo donde P es BSA, identificados como #1 y #2.
4. Producción de anticuerpos monoclonales de ratón
4.1. Inmunización de ratones
Para la inmunización se emplearon los bioconjugados de fórmula (la) y (ib) en los que P es BSA (conjugados inmunizantes) obtenidos en los ejemplos anteriores. Se utilizaron hembras de ratón BALB/c, con una edad al inicio del proceso comprendida entre 6 y 8 semanas.
En cada dosis se administraron por vía intraperitoneal 100 g de bioconjugado por ratón, siendo el volumen total administrado 200 μL. En la primera inmunización se suministró el bioconjugado en una emulsión preparada con adyuvante de Freund completo (1 :1, v/v). A intervalos de 3 semanas, los ratones recibieron dos inmunizaciones adicionales, en estos casos emulsionando los bioconjugados con adyuvante de Freund incompleto. Cuatro días antes de cada fusión celular, los ratones seleccionados recibieron una última dosis de 100 g del correspondiente bioconjugado diluido en PBS. 4.2. Fusiones celulares para la obtención de hibridomas
Las fusiones con los ratones inmunizados se llevaron a cabo básicamente siguiendo metodologías previamente descritas y bien establecidas en el estado de la técnica. Inmediatamente después del sacrificio de los ratones se extrajo el bazo, que se homogeneizó con el émbolo de una jeringa estéril. Tras lisar los glóbulos rojos por choque osmótico con 1 mL de tampón de lisis durante un minuto en frío, los linfocitos se lavaron 2 veces con medio completo (con suero) frío y se filtraron para eliminar los coágulos formados. La línea de mieloma P3-X63-Ag8.653 fue cultivada los días previos a la fusión en medio DMEM suplementado [2 mM L-alanina-L-glutamina, 1 m aminoácidos no esenciales, 25 Mg/mL gentamicina, suero bovino fetal (SBF) 10% (v/v)J, manteniendo las células en fase de crecimiento exponencial, de manera que el día de la fusión se dispuso de un número suficiente de las mismas.
Tras dos lavados con medio sin suero, ambas poblaciones celulares se juntaron a una relación linfocito: mieloma 4:1. A continuación, las células se centrifugaron, para inmediatamente después llevar a cabo la fusión celular. Para ello, se empleó el agente fusionante químico PEG1500 (1 mL por bazo, 1 min), que al disolver parcialmente las membranas permite la fusión de las células. Una vez fusionadas ambas poblaciones, las células se resuspendieron en medio DMEM suplementado [SBF 15% (v/v)J y se sembraron en placas de cultivo de 96 pocilios (100 μL por pocilio) a una densidad celular de 150x103 linfocitos por pocilio, y se incubaron a 37 ºC en una atmósfera con 5% de C02 y un 95% de humedad. 24 h después de la fusión, se añadió 100 μL por pocilio de medio HAT para selección de hibridomas [DMEM suplementado con 100 μΜ hipoxantina, 0,4 μΜ aminopterina, 16 μΜ timidina, y SBF 20% (v/v)] que contenía HFCS (High Fusión and Cloning Supplement) al 1% (v/v). 4.3. Selección, clonaje y conservación de hibridomas
Aproximadamente 10-12 días después de la fusión celular se llevó a cabo la evaluación de los sobrenadantes de los pocilios sembrados, con objeto de identificar cuáles contenían hibridomas secretores de anticuerpos capaces de reconocer ocratoxina A tanto en su forma conjugada como libre (clones competidores). Previamente, se determinó por inspección visual la eficiencia de la fusión, definida como el porcentaje de pocilios que presentaban al menos un clon claramente visible al microscopio. Para llevar a cabo la identificación de clones competidores, los sobrenadantes de cultivo se analizaron mediante la técnica ELISA diferencial, que consiste en analizar paralelamente en pocilios adyacentes cada sobrenadante en ausencia de analito y en presencia de una concentración prefijada de analito, habitualmente 100 nM. Para ello, las placas se tapizaron con el conjugado homólogo, que es un bioconjugado de fórmula (I) en el que P es OVA, a una concentración de 0,1 μg/mL, y el ensayo se llevó a cabo añadiendo 50 μL del sobrenadante de cultivo. Las condiciones para el formato de ELISA indirecto se detallan en el apartado 2.1.
A continuación, se seleccionaron aquellos pocilios que contenían hibridomas productores de anticuerpos capaces de proporcionar una señal de absorbancia igual o superior a 0,5 en el ensayo en ausencia de ocratoxina A e inhibición de la señal igual o superior al 80% en el ensayo en presencia de ocratoxina A. Adicionalmente, para todos los pocilios positivos se llevó a cabo un segundo cribado más exhaustivo en modo bidimensional competitivo con el fin de seleccionar con mayor seguridad los mejores hibridomas. Para ello, el sobrenadante de cada hibridoma se ensayó a 4 diluciones (1/8, 1/32, 1/128 y 1/512) en placas tapizadas con el bioconjugado homólogo a 0,01 y 0,1 Mg/mL, y utilizando como competidor ocratoxina A a 10 y 100 nM (en ensayo). Así, 200 μL del sobrenadante de cultivo se diluyeron en 600 μL· de PBST y las siguientes diluciones se hicieron de forma seriada a partir de esta primera. El ensayo se realizó añadiendo 50 μ\- por pocilio de la correspondiente dilución de sobrenadante y 50 μL· de la disolución de ocratoxina A en PBS a la concentración de 100, 10 y 0 nM.
Las células de los pocilios finalmente seleccionados se clonaron por el método de dilución límite, sembrando a partir de cada pocilio una nueva placa de 96 pocilios a 2 células por pocilio en medio HT, de igual composición que el HAT pero sin aminopterina, y conteniendo HFCS al 1% (v/v).
Generalmente, 7-10 días después del primer clonaje, se identificaron por inspección visual los pocilios que contenían un único clon, evaluándose de nuevo el sobrenadante de cultivo de la misma forma que se ha descrito previamente para los sobrenadantes de fusión. Este proceso se realizó tantas veces como fue necesario (al menos dos) para asegurar la monoclonalidad de los hibridomas seleccionados, así como su estabilidad. Finalmente, se procedió a la expansión de las líneas celulares seleccionadas, cultivando progresivamente el hibridoma en recipientes de mayor volumen. Una vez crecido el clon, las células se congelaron en nitrógeno líquido a una concentración de 107 células por vial (2-4 viales para cada hibridoma) en una disolución de SBF con DIVISO 10% (v/v) como agente crioprotector. Los viales se mantuvieron a -80 ºC en el interior de una caja de poliestireno durante 24 h antes de pasarlos al contenedor de nitrógeno líquido. 4.4. Producción y purificación de anticuerpos monoclonales
En la última fase de la expansión celular de los hibridomas, éstos se dividieron progresivamente en placas de cultivo hasta alcanzarse un volumen final comprendido entre 100 y 200 mL de sobrenadante. Se dejaron crecer las células hasta alcanzar la confluencia, y una vez agotados los nutrientes del medio de cultivo se procedió a recoger el contenido de las placas. El volumen recogido se centrifugó para eliminar los restos celulares y el sobrenadante se precipitó mediante la adición de un volumen de una disolución saturada de sulfato amónico, manteniéndose a 4 ºC hasta su purificación.
La purificación de los anticuerpos se realizó por cromatografía de afinidad con columnas de proteína G siguiendo las instrucciones del fabricante. Con este propósito, el anticuerpo precipitado se centrifugó durante 20 min a 5000 rpm (4000xg) y se descartó el sobrenadante. El precipitado que contenía los anticuerpos se redisolvió con tampón fosfato sódico 20 mM, pH 7,4 y se filtró con membranas de nitrocelulosa (diámetro de poro 0,45 μηη) para eliminar partículas en suspensión. La elución del anticuerpo de la columna se realizó con tampón citrato sódico 100 mM, pH 2,5. Las fracciones que contenían el anticuerpo se identificaron mediante espectrofotometría UV y se recogieron. La disolución se neutralizó adicionando Tris-HCI 1 M, pH 9,5. Finalmente, se determinó por espectrofotometría UV la concentración del anticuerpo purificado [A280 (1 mg/mL IgG) = 1,4] y se preparó una disolución de trabajo a una concentración de 500 g/mL en PBS con BSA al 1% (p/v) y timerosal al 0,01% (p/v), que se almacenó a 4 ºC. La disolución restante se precipitó con sulfato amónico saturado [1 :1 , (v/v)], lo cual garantiza su estabilidad a 4 ºC durante años.
5. Resultados
5.1. Respuesta inmune y determinación de la afinidad de los antisueros Cada uno de los antisueros obtenidos se ensayó frente a su antígeno de ensayo homólogo usando el ensayo de tipo ELISA competitivo en el formato de anticuerpo inmovilizado. Se ensayaron diferentes concentraciones de antígeno de ensayo frente a diferentes concentraciones de anticuerpo utilizando como competidor varias concentraciones de ocratoxina A preparadas por dilución seriada. Los tres inmunógenos produjeron respuestas inmunes adecuadas, con títulos elevados y habituales para este tipo de analitos. Sin embargo, mientras los antisueros procedentes de animales inmunizados con los inmunógenos de fórmula la y Ib presentaron una elevada afinidad hacia ocratoxina A, con valores de IC50 cercanos o inferiores a 1 nM, los antisueros obtenidos a partir del inmunógeno comparativo mostraron afinidades hacia ocratoxina A claramente inferiores (mayor IC50). Este resultado confirma que unas estructuras son más idóneas que otras para el objetivo que se persigue, y que los haptenos funcionalizados a través de posiciones alternativas al grupo carboxilato de la ocratoxina A, y que por tanto dejan dicho grupo libre, dan lugar a anticuerpos de mayor afinidad hacia la micotoxina diana. Los valores de la señal máxima, de la IC50 y de la pendiente de la curva de inhibición resultante para cada antisuero con antígeno de ensayo homólogo se han incluido en la Tabla 4.
TABLA 4 Resultado de los ensayos en formato ELISA competitivo de antisuero inmovilizado con detección directa
Figure imgf000052_0001
5.2. Generación de hibridomas productores de anticuerpos monoclonales frente a ocratoxina-A
Para demostrar de manera más concluyente la idoneidad de los bioconjugados de fórmula (la) y (Ib) para la obtención de anticuerpos anti-ocratoxina A, se inmunizaron ratones con ambos conjugados de fórmula (la) y (Ib) en los que P es BSA y se llevaron a cabo fusiones celulares encaminadas a la generación de hibridomas. Se consiguió obtener 4 líneas celulares productoras de anticuerpos monoclonales con elevada afinidad hacia ocratoxina A a partir del bioconjugado de fórmula (la), y 7 líneas celulares a partir del bioconjugado de fórmula (Ib). Los anticuerpos monoclonales obtenidos a partir de dichos hibridomas se han denominado a efectos de la presente invención y de los ejemplos aquí incluidos: mAb la#39, mAb la#41 , mAb la#310a y mAb la#310b (anticuerpos monoclonales a partir del bioconjugado de fórmula la); y mAb lb#16, mAb lb#21, mAb lb#27, mAb lb#111 , mAb lb#114, mAb lb#115 y mAb lb#1 8 (anticuerpos monoclonales a partir del bioconjugado de fórmula Ib). Estos resultados ponen de manifiesto que los bioconjugados de fórmula (la) y (Ib) son adecuados para obtener anticuerpos monoclonales de muy elevada afinidad frente a ocratoxina A.
5.3. Determinación de la afinidad de los anticuerpos Una vez purificados por cromatografía de inmunoafinidad los 11 anticuerpos monoclonales obtenidos, se determinó su afinidad hacia ocratoxina A mediante ELISA competitivo directo homólogo. Cada anticuerpo monoclonal se ensayó a varias concentraciones (100, 300 y 1000 ng/mL) frente a diferentes concentraciones de trazador enzimático (300, 100, 30 y 10 ng/mL), que es un derivado marcado de fórmula II donde Q es peroxidasa. Los valores de Amax, pendiente e IC50 para cada anticuerpo monoclonal que se muestran en la Tabla 5 corresponden a la combinación óptima, es decir, a la concentración de inmunorreactivos que generó la curva de calibración con un menor valor de IC50, y por tanto una afinidad mayor para ocratoxina A. En dicho formato de ensayo los anticuerpos mostraron valores de IC50 para ocratoxina A comprendidos entre 0,071 y 1,457 nM, siendo el anticuerpo con mayor afinidad de entre los producidos a partir del bioconjugado de fórmula la el mAb la#310b (IC50=0,071 nM), y el anticuerpo con mayor afinidad de entre los producidos a partir del bioconjugado de fórmula Ib el mAb lb#115 (IC50=0,169 nM). TABLA 5 Resultado de los ensayos en formato ELISA competitivo homólogo de anticuerpo inmovilizado con detección directa
Figure imgf000054_0001

Claims

REIVINDICACIONES
1. Un bioconjugado de fórmula (I):
Figure imgf000055_0003
donde
T se selecciona del grupo que consiste en R-l y R-ll;
Figure imgf000055_0001
L es una cadena hidrocarbonada de 0 a 40 átomos de carbono, donde la cadena es lineal o ramificada, saturada o insaturada, y dicha cadena hidrocarbonada comprende entre 0 y 10 heteroátomos que se seleccionan del grupo que consiste en S, O y N;
Z es un grupo funcional seleccionado entre -(C=0)NH-, -NH(C=0)-, -(C=0)S-, - S(C=0)-, -(C=0)0-, -0(C=0)-, -0{C=0)0-, -0(S=0)0-, -0(S02)0-, -NH(S=0)0-, -0{S=0)NH-, -NH(S02)0-,-0(S02)NH-, -{S02)NH-, -NH(S02)-, -0(C=0)NH-, -NH(C=0)0-, -NH(C=0)NH-, -NH(C=S)NH-, -NH-, -N(alquilo C C6)-, -S-, -S-S-, -NH-NH-, -N=C-, -C=N-, -NH(C=NH)-, -N=N-, -O-,
Figure imgf000055_0002
P es un péptido o polipéptido, natural o sintético, de peso molecular mayor de 2000 daltons donde el péptido o polipéptido P puede estar o no unido, mediante interacción covalente, electrostática o de otro tipo, a un soporte y donde dicho soporte puede ser un polímero sintético o no, o estar compuesto por nanomateriales como nanotubos de carbono, zeolitas o sílice mesoporosa; n es un número con un valor entre 1 y 500.
2. El bioconjugado de fórmula (I) según la reivindicación 1 caracterizado porque L es una cadena hidrocarbonada lineal de 1 a 20 átomos de carbono y dicha cadena hidrocarbonada comprende entre 0 y 4 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O y N.
3. El bioconjugado de fórmula (I) según una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 caracterizado porque Z se selecciona del grupo que consiste en -(C=0)NH-, - NH(C=0)-, -0(C=0)NH-, -NH(C=0)0- -NH(C=0)NH-, -NH-, -S-,
Figure imgf000056_0001
4. El bioconjugado de fórmula (I) según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque P se selecciona del grupo que consiste en albúmina, tiroglobulina, hemocianina, beta-galactosidasa, peroxidasa, fosfatasa y oxidasa.
5. El bioconjugado de fórmula (I) según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, con la fórmula (la)
Figure imgf000056_0002
donde P se selecciona del grupo que consiste en albúmina o peroxidasa, y n es un valor seleccionado entre 1 y 50.
6. El bioconjugado de fórmula (I) según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, la fórmula (Ib)
Figure imgf000057_0001
donde P se selecciona del grupo que consiste en albúmina o peroxidasa, y n es un valor seleccionado entre 1 y 50.
7. Un derivado marcado de formula (II):
Figure imgf000057_0003
donde
T, L y Z son según se han definido en la reivindicación 1 ; Q es un marcador no isotópico detectable y m es un número con un valor entre 1 y 1000.
8. El derivado marcado de fórmula (II) según la reivindicación 7, donde Q se selecciona del grupo que consiste en enzimas, biotina, fluoresceína o uno cualquiera de sus derivados, un fluoróforo de cianina, un fluoróforo de rodamina, un fluoróforo de cumarina, un bipirilo de rutenio, luciferina o uno cualquiera de sus derivados, un éster de acridinio, nanoparticulas cuánticas (en inglés quantum dots), y micro- o nanoparticulas de oro coloidal, de carbón o de látex.
9. El derivado marcado de fórmula (II) según una cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8 caracterizado porque Z se selecciona del grupo que consiste en -(C=0)NH-, - NH(C=0)-, -0(C=0)NH-, -NH(C=0)0-, -NH(C=0)NH-, -NH-, -S-,
Figure imgf000057_0002
10. El derivado marcado de fórmula (II) según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 caracterizado porque L es una cadena hidrocarbonada lineal de 1 a 20 átomos de carbono y dicha cadena hidrocarbonada comprende entre 0 y 4 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O y N.
1 1. El derivado marcado de formula (II) según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, con la fórmula (IIa)
Figure imgf000058_0001
donde Q se selecciona del grupo que consiste en peroxidasa, biotina, fluoresceína o nanopartículas, y m es un valor seleccionado entre 1 y 10.
12. El derivado marcado de formula (II) según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, con la fórmula (llb)
Figure imgf000058_0002
donde Q se selecciona del grupo que consiste en peroxidasa, biotina, fluoresceína o nanopartículas, y m es un valor seleccionado entre 1 y 10.
13. Un anticuerpo que reconoce específicamente un bioconjugado según se describe en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
14. El anticuerpo según la reivindicación 13, donde el anticuerpo se selecciona entre monoclonal, policlonal y recombinante.
15. Uso de un bioconjugado según se describe en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para la obtención de un anticuerpo según se describe en la reivindicación 14.
16. Método de análisis ¡n vitro de ocratoxina A en una muestra que comprende el uso de un anticuerpo según se describe en una cualquiera de las reivindicaciones 13 o 14.
17. Método según la reivindicación 16 que comprende las siguientes etapas:
a) poner en contacto la muestra con el anticuerpo descrito en cualquiera de las reivindicaciones 13 o 14;
b) incubar la muestra y el anticuerpo de la etapa (a) durante un periodo de tiempo adecuado para que tenga lugar una reacción inmunoquímica; y
c) determinar la existencia de reacción inmunoquímica tras la incubación de la etapa (b).
18. Método según la reivindicación 17, donde la determinación de la reacción inmunoquímica en el paso (c) se realiza mediante un ensayo competitivo, usando como competidor un bioconjugado según se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
19. Método según la reivindicación 17, donde la determinación de la reacción inmunoquímica en el paso (c) se realiza mediante un ensayo competitivo, usando como competidor un derivado marcado según se describe en cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12.
20. Kit de detección y/o determinación de ocratoxina A, que comprende al menos un anticuerpo según se describe en cualquiera de las reivindicaciones 13 o junto con un bioconjugado descrito en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o junto con un derivado marcado descrito en cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12.
21. Método de purificación y/o concentración de ocratoxina A de una muestra que comprende el uso de un anticuerpo según se describe en una cualquiera de las reivindicaciones 13 o 14.
22. Método según la reivindicación 21 realizado mediante cromatografía de afinidad que comprende las siguientes etapas:
a) inmovilizar al menos un anticuerpo descrito en cualquiera de las reivindicaciones 13 o 14 sobre un soporte;
b) hacer pasar la muestra a través de dicho soporte para que retenga la ocratoxina A presente en dicha muestra; y
c) eluir la ocratoxina A retenida en el soporte.
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