WO2012062945A1 - Derivados funcionalizados de boscalid - Google Patents

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Josep Vicent Mercader Badia
Antonio Abad Fuentes
Antonio Abad Somovilla
Consuelo AGULLÓ BLANES
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Consejo Superior De Investigaciones Científicas (Csic)
Universitat De Valencia
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    • G01N33/534—Production of labelled immunochemicals with radioactive label

Definitions

  • the present invention relates to new chemically functionalized derivatives of boscalid.
  • the present invention relates to boscalid immunogens, conjugated or labeled derivatives and antibodies that are obtained from the immunogens of the present invention.
  • Fungicides are the group of pesticides that most frequently appear in surveillance and control programs. This is so not only because of its high use, but mainly because these plant protection products are used to fight fungal infections at times very close to harvest or even afterwards ⁇ postharvest fungicides). This fact considerably increases the likelihood that residues from such treatments will remain when the food reaches the consumer, forcing regulatory and control bodies to be more vigilant and ideally to increase controls. Fungal attacks on stored fruits are one of the main reasons for economic losses in agriculture. The intensive use of conventional fungicides, such as thiabendazole or imazalil, has led in recent years to the emergence of resistant strains and therefore to a less effective treatment with these products.
  • Boscalid (2-chloro-W- (4- chlorobiphenyl-2-yl) nicotinamide) is a phytosanitary product developed by BASF and launched in the 2003/2004 season.
  • Boscalid It is the only fungicide developed to date of the carboxamide family. Currently, it has already been registered to combat more than 80 diseases that affect more than 100 crops in approximately 50 countries. Boscalid has been included very recently (2008) in Annex I of European Union Directive 91/414 / EEC on the introduction of phytosanitary products into the market. Boscalid fights fungi by inhibiting the enzyme succinate-ubiquinone reductase, also known as complex II of the mytochondrial electronic transport chain.
  • This enzyme in addition to channeling the transport of electrons through the ubiquinol cosustrate (QH 2 ), occupies a central place in the fungus metabolism, as it also catalyzes the oxidation of succinate to fumarate as part of the tricarboxylic acid cycle. In this way, both energy production and the biosynthesis of amino acids and lipids essential for the development of fungal cells are blocked at the same time. Therefore, boscalid has a double activity, and is extraordinarily effective against Botryris cinerea and Penicillium spp.
  • the analytical methodologies used for the analysis of these fungicides are fundamentally instrumental, especially gas chromatography (GC) and high performance liquid chromatography (HPLC), coupled to different detectors according to the type of compound to be analyzed and the required sensitivity [ JL Tadeo, Analysis heard Pesticides in Food and Environmental Samples, CRC Press, Boca Raton, 2008].
  • GC gas chromatography
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • These techniques are characterized by their ability to simultaneously analyze several residues with high precision and accuracy.
  • they are essential in many circumstances, they often involve the use of laborious and high-cost methodologies, which must be carried out by highly qualified personnel in well-equipped centralized laboratories and usually away from production areas.
  • These limitations condition the suitability of these techniques to undertake the analysis of large numbers of samples and to obtain results in the short term, two aspects that would contribute to guaranteeing the safety of commercialized foods and conducting more exhaustive studies on consumer exposure. to these fungicides through food.
  • Immunoassays are bioanalytical techniques based on the interaction of an antigen (the analyte) with an antibody that specifically recognizes it.
  • a pesticide is a small organic molecule that constitutes a single antibody binding site.
  • the interaction between the analyte and the antibody is performed by displacement of the junction between the antibody and a labeled analyte analog.
  • a competition is established between it and the analog marked by antibody binding.
  • the marking is carried out with an enzymatic activity, thus giving rise to enzyme immunoassays.
  • the first enzymatic immunoassays for pesticides developed during the first half of the 1980s [F. Jung et al., Pest.
  • Immunoassays allow the analyte to be specifically detected target in very complex mixtures, greatly simplifying the laborious procedures of sample preparation, which in turn results in an increase in sampling capacity.
  • immunoassays can be performed in portable formats, which makes them independent of centralized laboratories and makes them ideal for analysis at production points.
  • the analytical excellencies attributed to immunoassays have already been demonstrated in many practical applications, where they have competed favorably with chromatographic techniques [MC Hennion, Analysis 1998, 26, 149-155; A. Abad et al., J. Chromatogr. A 1999, 833, 3-12; A. Abad et al., J. Agrie. Food Chem. 2001, 49, 707-1712; NA Lee and IR Kennedy, J. AOAC Int. 2001, 84, 1393-1406].
  • boscalid derivatives have been synthesized nor are there antibodies against said pesticide.
  • the reagents described in the present invention are the first functionalized and conjugated boscalid derivatives, produced for obtaining antibodies and developing immunoassays against this fungicide.
  • the synthesis of functionalized hapcal of boscalid by different positions is described.
  • conjugates were prepared to transport proteins necessary for obtaining antibodies and performing immunoassays.
  • antibodies with high affinity and selective boscalid are described.
  • a first aspect of the present invention describes functionalized boscalid haptens to generate immunogens, conjugates and antibodies against boscalid.
  • Said activated haptens are represented by the compounds of general formula (i):
  • B is selected from a 2- (nicotinamide) biphenyl (Rl) radical, a 2- (2-chloronicotinamide) biphenyl (R-yl) radical, a 4'-chloro-2- (nicotinamide) biphenyl -lll) radical and a 4'-Chloro-2- (2-chloronicotinamide) biphenyl (R-IV) radical;
  • X may be present or not and is selected from O, S, NH and a saturated or unsaturated carbon atom.
  • the union of X with the radicals R-1 to R-IV is carried out by any of the positions that remain free therein;
  • L represents a spacer of 0 to 40 carbon atoms arranged in a linear chain or in a branched, saturated or unsaturated chain, and which can comprise up to two ring structures and between 0 and 20 heteroatoms, the heteroatoms being selected from S, O and N, with the proviso that no more than two heteroatoms can join in sequence;
  • X is selected from S and a saturated C atom.
  • L represents a spacer of 0 to 8 carbon atoms arranged in a linear chain.
  • Y is a functional group selected from -COOH, -CHO, -NH 2 and -SH.
  • boscalid activated haptens are selected from:
  • a second aspect of the present invention describes boscalid conjugates of general formula ⁇ II):
  • P is selected from a peptide, a polypeptide, a polysaccharide and a synthetic polymer; n is an integer selected from 1 to 50 for every 50 kilodaltons of molecular weight of P.
  • X is selected from S and a saturated carbon atom.
  • L represents a spacer of 0 to 8 carbon atoms arranged in a linear chain.
  • Z is selected from a group -CONH-, - -, -NH-, -S- and
  • P is selected from albumin (egg or serum), thyroglobulin, hemocyanin, beta-galactosidase, peroxidase, phosphatase, and oxidase.
  • a third aspect of the present invention describes labeled derivatives of general formula (III):
  • Q is an isotopic or non-isotopic chemical marker, such as 125 l, a fluorophore, or a luminescent substance, a marker coupled to an indirect detection system such as biotin, an electrochemical mediator, micro or nanoparticles or others; n is an integer between 1 and 50 for every 50 kilodaltons of molecular weight of Q.
  • X is selected from S and a saturated carbon atom.
  • L represents a spacer of 0 to 8 carbon atoms arranged in a linear chain.
  • Z is selected from a group -CONH-, - -, -NH-, -S- and
  • Q is selected from biotin, fluorescein and its derivatives, cyanine fluorophores (for example Cy-5), rhodamines or coumarins, ruthenium bipyridyls, derivatives of TEXAS RED and BODIPY, luciferin and derivatives, asters of acridinium, as well as colloidal gold, carbon or latex particles.
  • a fourth aspect of the present invention describes antibodies generated in response to the immunogen of general formula (II): [BXLZ] n -P
  • a fifth aspect of the present invention relates to a method of detecting boscalid in an isolated sample consisting of: a. contacting an isolated sample with the antibody described above;
  • step (b) incubate the isolated sample and the antibody of step (a) for a suitable period of time for an immunochemical reaction to occur and
  • step C. determine the existence of an immunochemical reaction after the incubation of step (b).
  • the determination of the immunochemical reaction in step c is performed by a competitive immunoassay, for example of the ELISA type.
  • a sixth aspect of the present invention relates to a boscalid detection kit that uses the antibodies described above.
  • analyte refers to a substance or group of substances whose presence or concentration is to be determined in the sample.
  • antibody refers to a receptor that exhibits specific binding affinity for the analyte, essentially excluding other unrelated substances.
  • the term includes polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, recombinant antibodies and antibody fragments.
  • antigen herein refers to a molecule capable of specifically interacting with an antibody. The interaction or reaction Immunochemistry consists of the non-covalent binding between an antibody and an antigen.
  • Haptens are partial or incomplete antigens. They are protein-free substances, mostly low molecular weight substances that are not capable of stimulating the formation of antibodies, but that react with them.
  • the antibodies against haptens are formed by coupling the hapten with a high molecular weight carrier and injecting this coupled or conjugated product into humans or animals.
  • haptens include therapeutic drugs such as digoxin and theophylline, antibiotics such as gentamicin and vancomycin, hormones such as estrogen and progesterone, mycotoxins such as aflatoxin and ochratoxin, pesticides such as chlorpyrifos, azoxystrobin and fenhexamid, etc.
  • spacer refers to a chemical group that connects a hapten to a carrier, immunogen, marker, tracer or other spacer.
  • the spacers can be linear or branched, saturated or unsaturated carbon chains. They can also include one or more heteroatoms within the chain or at the ends of the chains.
  • heteroatom refers to atoms other than carbon that are selected from the group consisting of oxygen, nitrogen and sulfur. The use of a spacer may or may not be advantageous or necessary, depending on the specific pairs of hapten and carrier.
  • activated hapten refers to a hapten derivative to which a chemical group capable of reacting has been introduced, so that through the reaction, or provision of an active group, it is possible to synthesize a hapten conjugate or its labeling.
  • carrier as used in the present invention, is a polymeric substance, commonly a protein, that can bind with a hapten. Carrier substances include peptides, proteins, glycoproteins, complex polysaccharides and nucleic acids.
  • immunogenic and immunogenic as used in the present invention refer to substances that are recognized as foreign to the living organism and therefore are capable of producing or generating an immune response in a host.
  • conjugate and derivative refer to a chemical compound or molecule prepared from a parent compound or molecule by one or more chemical reactions.
  • a detector, marker or tracer molecule is an identifier tag that, attached to a carrier substance or molecule, can be used to detect an analyte.
  • the label can be attached to the carrier substance thereof directly or indirectly by a linker or bridge group.
  • markers include enzymes such as beta-galactosidase, alkaline phosphatase and peroxidase, fluorescent compounds such as rhodamine and fluorescein isothiocyanate (FITC), luminescent compounds such as luciferin and radioactive isotopes such as 125 l.
  • the synthesis of the hapten BLa5 was completed as follows. First, the carboxylic group was transformed into the corresponding acid chloride 5, which was subsequently coupled to 4'-chlorobiphenyl-2-amine (11) [prepared in two stages with high overall yield from 1-iodo-2-nitrobenzene (8) and chlorophenylboronic acid (9), to provide the hapten methyl ester BLa5 (7) with an excellent overall yield (91%). Finally, the promoted hydrolysis based on the methyl ester of 6 provided the hapten BLa5 (7) with a yield of 89% after the corresponding chromatographic purification.
  • the C6 chain that constitutes the spacer arm in the appropriate position of the biaryl system is introduced through a Sonogashira regioselective coupling of the C4-iodized position, the most reactive in this type of coupling, with 5- hexinoate of ⁇ erc-butyl (14) [prepared according to G. Bartoli et al., Synthesis 2007, 3489-3496].
  • This palladium catalyzed coupling reaction provides iodine-alkyne 15, which is transformed into biphenyl 16, through a cross-coupling reaction with 4-chlorophenylboronic acid (9), with a moderate overall yield (50% ).
  • the last steps for the preparation of the BLc5 hapten (29) are relatively simple and involve the formation of the amide bond by reaction between 27 and 2-chloronicotinic acid chloride (19) followed by hydrolysis of the tert-butyl ester group with formic acid .
  • the overall yield of the last two stages is 85%.
  • a mixture of boronic acid 22 (152 mg, 0.99 mmol), ethylene glycol (62 mg, 1 mmol) and anhydrous MgSO 4 (240 mg) in ⁇ . 2 0 dry (4 mL) was stirred at room temperature for 1 h.
  • haptens presented herein contain a carboxyl group as a functional chemical group for protein immobilization. transporters, specifically by reaction with the free amino groups of the protein.
  • the carboxyl group was activated using A /, / V-disuccinimidyl carbonate (DSC) following previously published protocols [FA Esteve-Turrillas et al., Anal. Chim. Minutes do ⁇ : 10.1016 / j.aca.2010.09.042).
  • DSC V-disuccinimidyl carbonate
  • 96-well polystyrene plates were used. Each antiserum was evaluated in the two classic formats of competitive ELISA (that of antigen or conjugate immobilized with indirect detection and that of antibody immobilized with direct detection) using both homologous and heterologous conjugates. 8-channel electronic pipettes were used for rapid and accurate dispensing of immunoreactive agents. After each incubation step, the plates were washed four times with a wash solution, using a 96 channel ELx405 washer (Biotek Instruments, Winooski, USA).
  • the peroxidase activity used as a marker was revealed with 100 ⁇ per well of a 2 mg / ml solution of o-phenylenediamine in 25 mM citrate buffer, 62 mM phosphate, pH 5.4 containing 0.012% (v / v) H2O2. This development was developed for 10 min at room temperature and stopped using 100 ⁇ per well of H 2 S0 4 2.5 M. At the end of the tests, the absorbance of each well was read at 492 nm using a reference wavelength of 650 nm in a PowerWave HT microplate reader (Biotek Instruments, Winooski, USA).
  • the sigmoid standard curves obtained by representing absorbance versus analyte concentration were adjusted to a four-parameter logistic equation using the SPSS SigmaPlot software package (Chicago, USA).
  • the antiserum titer was defined as the reciprocal of the antiserum dilution which provides a maximum signal (A max ) about 1.0 in the absence of free analyte in competitive ELISA assay in the immobilized conjugate format homologous at 0.1 mg / ml with indirect detection.
  • the affinity of the antibody (IC50) was estimated as the concentration of free analyte capable of halving the maximum signal.
  • the immunochemical reaction was carried out for 1 h at room temperature and then the plates were washed. Each well then received 100 ⁇ of a 1 / 10,000 dilution of GAR-HRP (commercial peroxidase conjugate with goat antibodies against rabbit antibody) in PBST containing 10% fetal bovine serum. This reaction was left at room temperature for 1 h. After washing the plates, the retained peroxidase activity was revealed and the absorbance was read at 492 nm as described above.
  • GAR-HRP commercial peroxidase conjugate with goat antibodies against rabbit antibody
  • the plates were upholstered with 100 ⁇ per well of a dilution of antiserum in CB buffer by incubation overnight at room temperature.
  • Serial dilutions of the HRP-hapten enzyme conjugate with a dilution factor of 1/3 in PBST were prepared.
  • 50 ⁇ was dispensed per well of a complete standard analyte curve in PBS followed by 50 ⁇ per well of a specific dilution of an enzyme tracer determined in PBST.
  • the same reagent distribution was repeated for each plate with a different antiserum.
  • the immunochemical reaction was carried out for 1 h at room temperature and then the plates were washed. Finally, the retained peroxidase activity was revealed and the absorbance at 492 nm was read as described.
  • Each of the antisera obtained was tested against conjugates of all haptens (homologs and heterologists) using the competitive ELISA type assay, both in immobilized conjugate assay format with indirect detection and in the immobilized antibody format with direct detection.
  • Different concentrations of conjugate were tested against different concentrations of antiserum in a competitive assay using different concentrations of boscalid prepared by serial dilution as a competitor. From all haptens it was possible to generate antibodies capable of recognizing boscalid with high affinity. This result confirms the suitability of the proposed structures for the objective pursued.
  • the inhibition curves obtained with the BLb6 # 2 antiserum and the BLa5 conjugate are shown in Figure 5, both in immobilized conjugate format with indirect detection and with the immobilized antibody format with direct detection
  • 0.01 ⁇ g of conjugate was used per well and the dilution of the antiserum in the competition stage was 1/30000.
  • the well was upholstered with 100 ⁇ _ of a solution of the antiserum at 1/3000 and in the competitive stage 3 ng of heterologous enzymatic tracer was used.

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Abstract

La presente invención se refiere a nuevos derivados funcionalizados químicamente de boscalid. Además la presente invención se refiere a inmunogenos de boscalid, a los derivados conjugados o marcados y a los anticuerpos que se obtienen a partir de los inmunogenos de la presente invención.

Description

Derivados funcionaiizados de boscalid
La presente invención se refiere a nuevos derivados funcionalizados químicamente de boscalid. Además la presente invención se refiere a inmunógenos de boscalid, a los derivados conjugados o marcados y a los anticuerpos que se obtienen a partir de los inmunógenos de la presente invención.
ESTADO DE LA TÉCNICA
Los fungicidas son el grupo de plaguicidas que con mayor frecuencia aparece en los programas de vigilancia y control. Esto es así no sólo por su elevado uso, sino principalmente porque estos productos de protección vegetal se emplean para combatir las infecciones causadas por hongos en momentos muy próximos a la cosecha o incluso con posterioridad {fungicidas postcosecha). Este hecho incrementa considerablemente la probabilidad de que residuos de dichos tratamientos permanezcan cuando el alimento llegue al consumidor, lo que obliga a los organismos de regulación y control a estar más vigilantes e idealmente a aumentar los controles. Los ataques por hongos en frutos almacenados constituyen uno de los motivos principales de pérdidas económicas en agricultura. El uso intensivo de fungicidas convencionales, como el tiabendazol o el imazalil, ha llevado en los últimos años a la aparición de cepas resistentes y por tanto a una menor eficacia de los tratamientos con estos productos. Ante esta circunstancia, las empresas agroquímicas pusieron en marcha programas de l+D encaminados a desarrollar nuevos productos que presentaran mecanismos de acción innovadores y que permitieran combatir de forma eficaz las infecciones fúngicas, al tiempo que fueran seguros y compatibles con los programas de gestión integrada de plagas. Estos productos están comenzando a sustituir progresivamente a los productos más antiguos, que resultan menos aceptables desde un punto de vista toxicológico y medioambiental. Entre los fungicidas más relevantes desarrollados en la última década con aplicaciones en postcosecha destaca el boscalid [H.J. Rosslenbroich y D. Stuebler, Crop Protection 2000, 19, 557-561 ]. El boscalid (2-cloro-W-(4- clorobifenil-2-il)nicotinamida) es un producto fitosanitario desarrollado por BASF y lanzado al mercado en la temporada 2003/2004. Se trata del único fungicida desarrollado hasta la fecha de la familia de las carboxamidas. En la actualidad ha sido ya registrado para combatir más de 80 enfermedades que afectan a más de 100 cultivos en aproximadamente 50 países. El boscalid ha sido incluido muy recientemente (2008) en el Anexo I de la directiva 91 /414/EEC de la Unión Europea relativa a la introducción en el mercado de productos fitosanitaríos. El boscalid combate a los hongos mediante la inhibición de la enzima succinato-ubiquinona reductasa, también conocida como complejo II de la cadena de transporte electrónico mítocondríal. Esta enzima, además de canalizar el transporte de electrones a través del cosustrato ubiquinol (QH2), ocupa un lugar central en el metabolismo del hongo, ya que también cataliza la oxidación del succinato a fumarato como parte del ciclo de los ácidos tricarboxílicos. De este modo, se bloquean al mismo tiempo tanto la producción de energía como la biosíntesis de los aminoácidos y lípídos esenciales para el desarrollo de las células fúngicas. Por tanto, el boscalid presenta una doble actividad, y resulta extraordinariamente eficaz frente a Botryris cinérea y Penicillium spp. Entre los cultivos para los que la UE ha establecido Límites Máximos de Residuos de forma explícita para boscalid figuran la fruta de hueso y de pepita (2-3 ppm), uva y kiwi (5 ppm), fresa (10 ppm), patata (0.5 ppm), y tomate, pimiento y berenjena (1 -3 ppm).
Las metodologías analíticas empleadas para el análisis de estos fungicidas son fundamentalmente de tipo instrumental, en especial cromatografía de gases (GC) y cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), acopladas a diferentes detectores según el tipo de compuesto a analizar y la sensibilidad requerida [J.L. Tadeo, Analysis oí Pesticides in Food and Environmental Samples, CRC Press, Boca Ratón, 2008]. Estas técnicas se caracterizan por su capacidad para analizar simultáneamente varios residuos con una elevada precisión y exactitud. Sin embargo, pese a que resultan imprescindibles en muchas circunstancias, con frecuencia implican la utilización de metodologías laboriosas y de elevado coste, que deben realizarse por personal altamente cualificado en laboratorios centralizados bien equipados y habitualmente alejados de las zonas de producción. Estas limitaciones condicionan la idoneidad de estas técnicas para acometer el análisis de grandes números de muestras y para obtener resultados en breve plazo, dos aspectos que contribuirían a garantizar la seguridad de los alimentos comercializados y a la realización de estudios más exhaustivos sobre la exposición de los consumidores a estos fungicidas a través de los alimentos.
Los inmunoensayos son técnicas bioanalíticas basadas en la interacción de un antígeno (el analíto) con un anticuerpo que lo reconoce específicamente. No obstante, un plaguicida es una molécula orgánica pequeña que constituye un único sitio de unión al anticuerpo. Por esta razón, la interacción entre el analito y el anticuerpo se realiza por desplazamiento de la unión entre el anticuerpo y un análogo marcado del analito. De este modo, en presencia del analito se establece una competencia entre éste y el análogo marcado por la unión al anticuerpo. Habitualmente, el mareaje se realiza con una actividad enzimática, dando así lugar a los enzimoinmunoensayos. Los primeros inmunoensayos enzimáticos para plaguicidas se desarrollaron durante la primera mitad de los años 80 [F. Jung et al., Pest. Sci. 1989, 26, 303-317). Desde entonces hasta ia actualidad, el número de plaguicidas para los cuales se han desarrollado inmunoensayos ha aumentado espectacularmente, suponiendo varias decenas y cubriendo los principales grupos de compuestos: insecticidas, herbicidas y fungicidas [V.S. Morozova et al., J. Anal. Chem. 2005, 60, 202-217). Un gran número de estos ensayos están disponibles comercíalmente en forma de kits con diferentes formatos. La creciente aceptación de los inmunoensayos como técnicas complementarias a las cromatográfícas para el análisis de pequeñas moléculas orgánicas se debe a que se trata de una metodología sencilla, rápida y de bajo coste, exhibiendo al mismo tiempo una elevada sensibilidad y especificidad. Los inmunoensayos permiten detectar específicamente el analito diana en mezclas muy complejas, simplificando considerablemente los laboriosos procedimientos de preparación de la muestra, lo que a su vez redunda en un aumento en la capacidad de muestreo. Además, los inmunoensayos pueden realizarse en formatos portátiles, lo que los independiza de los laboratorios centralizados y los convierte en idóneos para el análisis en los puntos de producción. Las excelencias analíticas atribuidas a los inmunoensayos ya han sido demostradas en muchas aplicaciones prácticas, donde han competido favorablemente con las técnicas cromatográficas [M.C. Hennion, Analysis 1998, 26, 149-155; A. Abad et al., J. Chromatogr. A 1999, 833, 3-12; A. Abad et al., J. Agrie. Food Chem. 2001 , 49, 707-1712; N.A. Lee y I.R. Kennedy, J. AOAC Int. 2001 , 84, 1393-1406].
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Hasta la fecha no se han sintetizado derivados funcionalizados de boscalid ni existen anticuerpos contra dicho plaguicida. Los reactivos que se describen en la presente invención son los primeros derivados funcionalizados y conjugados de boscalid, producidos para la obtención de anticuerpos y el desarrollo de inmunoensayos contra este fungicida. En primer lugar, se describe la síntesis de haptenos funcionalizados de boscalid por diferentes posiciones. Con estos derivados se prepararon conjugados a proteínas transportadoras necesarias para la obtención de anticuerpos y la realización de inmunoensayos. Finalmente, se describen anticuerpos con elevada afinidad y selectivos de boscalid.
Un primer aspecto de la presente invención describe haptenos de boscalid funcionalizados para generar inmunogenos, conjugados y anticuerpos contra el boscalid. Dichos haptenos activados están representados por los compuestos de fórmula general (i):
B-X-L-Y
(i) donde
B se selecciona entre un radical 2-(nicotinamido)bifenilo (R-l), un radical 2-(2-cloronicotinamido)bifenilo (R-il), un radical 4'-cloro-2-(nicotinamido)bifenilo -lll) y un radical 4'-cloro-2-(2-cloronicotinamido)bifenilo (R-IV);
Figure imgf000007_0001
X puede estar presente o no y se selecciona entre O, S, NH y un átomo de carbono saturado o insaturado. La unión de X con los radicales R-l a R-IV se realiza por cualquiera de las posiciones que quedan libres en los mismos;
L representa un espaciador de 0 a 40 átomos de carbono dispuestos en una cadena lineal o en una cadena ramificada, saturada o insaturada, y que puede comprender hasta dos estructuras de anillo y entre 0 y 20 heteroátomos siendo los heteroátomos seleccionados entre S, O y N, con la condición de que no más de dos heteroátomos puedan unirse en secuencia; Y es un grupo funcional seleccionado entre -COOH, -OH, -NH2, -NH-, -N3, -CH2CI, -CHCI-, -CH2Br, -CHBr-, -CH2I, -CHI-, -CHO, -SH, -S-S-, -SO3H, -SO3H, -OSO2Ph, -OSO2Ar, -NH-NH2 y -C(=N-NH2)-. Según una realización preferida, X se selecciona entre S y un átomo de C saturado.
Según otra realización preferida, L representa un espaciador de 0 a 8 átomos de carbono dispuestos en una cadena lineal.
Según otra realización preferida, Y es un grupo funcional seleccionado entre -COOH, -CHO, -NH2 y -SH.
Según otra realización preferida, los haptenos activados de boscalid se seleccionan entre:
Figure imgf000008_0001
Un segundo aspecto de la presente invención describe conjugados de boscalid de fórmula general {II):
X-L-Z]
(ll)
donde
B, X y L se definen de la misma manera que anteriormente;
Z es un grupo funcional seleccionado entre -CONH-, -NHCO-, -NHCONH-, -NHCSNH-, -OCONH-, -NHOCO-, -OCSNH-, -SCONH-, -S-, -S-S-, -NH(C=NH)-, -CO-, -CHOH-, -N=N-, -NH- y
Figure imgf000009_0001
P se selecciona entre un péptido, un polipéptído, un polisacárído y un polímero sintético; n es un número entero seleccionado entre 1 y 50 por cada 50 kilodaltons de peso molecular de P.
Según una realización preferida, X se selecciona entre S y un átomo de carbono saturado.
Según otra realización preferida, L representa un espaciador de 0 a 8 átomos de carbono dispuestos en una cadena lineal.
Según otra realización preferida, Z se selecciona entre un grupo -CONH-, - -, -NH-, -S- y
Figure imgf000009_0002
Según otra realización preferida, P se selecciona de entre albúmina (de huevo o sérica), tiroglobulína, hemocianína, beta-galactosidasa, peroxidasa, fosfatasa, y oxidasa.
Un tercer aspecto de la presente invención describe derivados marcados de fórmula general (III):
X-L-Z]
(III) donde
B, X, L y Z se definen de la misma manera que anteriormente;
Q es un marcador químico isotópico o no isotópico, tal como 125l, un fluoróforo, o una sustancia luminiscente, un marcador acoplado a un sistema de detección indirecta tal como la biotina, un mediador electroquímico, micro o nanopartículas u otros; n es un número entero entre 1 y 50 por cada 50 kilodaltons de peso molecular de Q.
Según una realización preferida, X se selecciona entre S y un átomo de carbono saturado. Según otra realización preferida, L representa un espaciador de 0 a 8 átomos de carbono dispuestos en una cadena lineal.
Según otra realización preferida, Z se selecciona entre un grupo -CONH-, - -, -NH-, -S- y
Figure imgf000010_0001
Según otra realización preferida, Q se selecciona entre biotina, fluoresceína y sus derivados, fluoroforos de cianinas (por ejemplo Cy-5), de rodaminas o de cumarinas, bipiridílos de rutenio, derivados de TEXAS RED y de BODIPY, luciferina y derivados, ásteres de acridinio, así como partículas de oro coloidal, de carbón o de látex.
Un cuarto aspecto de la presente invención describe anticuerpos generados en respuesta al immunógeno de fórmula general (II): [B-X-L-Z]n-P
(II)
Un quinto aspecto de la presente invención se refiere a un método de detección de boscalid en una muestra aislada que consiste en: a. poner en contacto una muestra aislada con el anticuerpo descrito anteriormente;
b. incubar la muestra aislada y el anticuerpo del paso (a) durante un periodo de tiempo adecuado para que tenga lugar una reacción ínmunoquímica y
c. determinar la existencia de reacción ínmunoquímica tras la incubación del paso (b). Según una realización preferida, la determinación de la reacción ínmunoquímica en el paso c se realiza mediante un inmunoensayo competitivo, por ejemplo de tipo ELISA.
Un sexto aspecto de la presente invención se refiere a un kit de detección de boscalid que utiliza los anticuerpos descritos anteriormente.
El término analito se refiere a una sustancia o grupo de sustancias cuya presencia o concentración se quiere determinar en la muestra. El término anticuerpo se refiere a un receptor que presenta afinidad de unión específica para el analito, excluyendo esencialmente otras sustancias no relacionadas. El término incluye anticuerpos políclonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos recombinantes y fragmentos de anticuerpo. El término antígeno en esta memoria se refiere a una molécula capaz de interaccionar específicamente con un anticuerpo. La interacción o reacción inmunoquímica consiste en la unión no covalente entre un anticuerpo y un antígeno.
Los haptenos son antígenos parciales o incompletos. Son sustancias libres de proteínas, mayoritariamente sustancias de bajo peso molecular que no son capaces de estimular la formación de anticuerpos, pero que reaccionan con los mismos. Los anticuerpos contra haptenos se forman mediante acoplamiento del hapteno con un portador de elevado peso molecular e inyectando este producto acoplado o conjugado en seres humanos o en animales. Entre los ejemplos de haptenos se incluyen fármacos terapéuticos tales como digoxina y teofilína, antibióticos tales como gentamicina y vancomicina, hormonas tales como estrógeno y progesterona, micotoxinas tales como aflatoxina y ocratoxina, plaguicidas como clorpirifos, azoxístrobin y fenhexamid, etc. El término espaciador se refiere a un grupo químico que conecta un hapteno a un portador, inmunógeno, marcador, trazador o a otro espaciador. Los espaciadores pueden ser cadenas de carbono lineales o ramificadas, saturadas o insaturadas. También pueden incluir uno o más heteroátomos dentro de la cadena o en los extremos de las cadenas. El término heteroátomo se refiere a átomos diferentes del carbono que se seleccionan entre el grupo que consiste en oxígeno, nitrógeno y azufre. La utilización de un espaciador puede resultar o no ventajosa o necesaria, dependiendo de las parejas específicas de hapteno y portador. La expresión hapteno activado se refiere a un derivado de hapteno al que se ha introducido un grupo químico capaz de reaccionar, para que mediante la reacción, o provisión de un grupo activo, poder sintetizar un conjugado del hapteno o su mareaje. El término portador, tal como se utiliza en la presente invención, es una sustancia polimérica, comúnmente una proteína, que puede unirse con un hapteno. Entre las sustancias portadoras se incluyen péptidos, proteínas, glucoproteínas, polisacáridos complejos y ácidos nucleicos.
Los términos inmunógeno e inmunogénico tal como se utilizan en la presente invención se refieren a sustancias que son reconocidos como extraños al organismo vivo y por lo tanto son capaces de producir o de generar una respuesta inmune en un huésped.
Los términos conjugado y derivado se refieren a un compuesto o molécula química preparada a partir de un compuesto o molécula parental mediante una o más reacciones químicas.
Tal como se utiliza en la presente invención, una molécula detectora, marcadora o trazadora es una etiqueta identificadora que, unida a una sustancia o molécula portadora, puede utilizarse para detectar un analito. El marcador puede unirse a la sustancia portadora del mismo directa o indirectamente mediante un grupo enlazante o puente. Entre los ejemplos de marcadores se incluyen enzimas tales como la beta-galactosídasa, fosfatasa alcalina y peroxidasa, compuestos fluorescentes tales como rodamina e isotiocianato de fluoresceína (FITC), compuestos luminiscentes tal como luciferina e isótopos radioactivos tales como 125l.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención. DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Esquema de la síntesis del hapteno BLa5.
Figura 2. Esquema de la síntesis del hapteno BLb6.
Figura 3. Esquema de la síntesis del hapteno BLc5.
Figura 4. Título de los antisueros anti-boscalid determinado en ensayo homólogo con 0.01 pg de conjugado antigénico inmovilizado.
Figura 5. Curvas estándar para boscalid en diferentes formatos de ELISA competitivo.
EJEMPLOS
A continuación se ilustrará la invención medíante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la especificidad y efectividad de los compuestos de fórmula (I) como haptenos para la obtención de anticuerpos anti-boscalid. Los números en negrita hacen referencia a la correspondiente estructura que se muestra en los esquemas de las figuras 1 a 3. Estos ejemplos se presentan a modo de demostración pero de ningún modo pueden suponer un límite a la invención.
1 ) Síntesis de haptenos a) Síntesis del hapteno BLa5 (7): Este hapteno se obtiene en dos etapas a partir de ácido comercial 2- mercaptonicotínico (1 ). Así, la reacción de 1 con el ácido 5-bromopentanoico (2) en hidróxido potásico acuoso proporciona el ácido dícarboxílico 3 [A. Da Settimo et al., J. Heterocycüc Chem. 2000, 37, 379-382], cuyo grupo carboxilico libre se protege quimioselectivamente como su éster metílico por tratamiento con 2,2-dimethoxypropano en presencia de una cantidad catalítica de HCI anhidro, generado en sítu a partir de TMSCI [A. Rodríguez et al., Tetrahedron Lett. 1998, 39, 8563-8566], para obtener el éster metílico intermedio 4 con un rendimiento global para las dos etapas de aproximadamente el 76%. Con el compuesto 4 disponible, la síntesis del hapteno BLa5 se completó de la siguiente forma. Primero, el grupo carboxílico se transformó en el correspondiente cloruro de ácido 5, que fue subsecuentemente acoplado a 4'-clorobifenil-2-amina (11 ) [preparada en dos etapas con rendimiento global elevado a partir de 1 -iodo-2-nitrobenceno (8) y el ácido clorofenilborónico (9), para proporcionar el éster metílico del hapteno BLa5 (7) con un rendimiento global excelente (91 %). Finalmente, la hidrólisis promovida por base del éster metílico de 6 proporcionó el hapteno BLa5 (7) con un rendimiento del 89% después de la correspondiente purificación cromatográfica.
Preparación del ácido 2-(4-carboxibutiltio)nicotínico (3). Una disolución de la sal sódica del ácido 5-bromopentanoíco en H2O, preparada a partir del ácido (700.1 mg, 3.89 mmol) y NaHC03 (326.7 mg, 3.89 mmol) en 3 ml_ de H20, se añadió gota a gota sobre una disolución del ácido 2-mercaptonicotínico (1 ) (500 mg, 3.23 mmol) en KOH acuoso al 10% (5 ml_) a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se agitó a 60 QC por 4 h, se enfrió en un baño de hielo y se acidifico con HCI concentrado hasta pH 2-3. El producto sólido precipitado se recogió por filtración a vacío, se lavó con agua y se seco a vacío para proporcionar el diácido puro 3 (735.4 mg, 89%) como un sólido blanco. Pf. 145-148 °C (cristalizado de C6H6-MeOH); 1 H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 8.60 (1 H, dd, J = 4.6, 1 .8 Hz, H-6 Py), 8.18 (1 H, dd, J = 7.6, 1 .8 Hz, H-4 Py), 7.21 (1 H, dd, J = 7.6, 4.6 Hz, H-5 Py), 3.09 (2H, t, J = 6.3 Hz, H-1 ), 2.26 (2H, t, J = 6.6 Hz, H-4), 1 .62 (4H, m, H-2 y H-3); HRMS (El), calculado para C H13N04S 255.05603, encontrado 255.05661 .
Preparación del ácido 2-(5-metoxi-5-oxopentiltio)nicotfnico (4). Cloruro de trimetilsililo (20 μΙ_, 0.158 mmol) se añadió a una disolución agitada de MeOH anhidro. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante una semana, tras lo cual se vertió en agua y se proceso usando acetato de etilo para extraer. Las fases orgánicas combinadas se lavaron salmuera, se secaron sobre MgSO4 anhidro y se concentraron para dar el éster metílico 4 (338 mg, 85%) como un sólido blanco. Pf. 102-103 SC (cristalizado de C6H6); 1 H NMR (300 MHz, CDCI3) δ 8.59 (1 H, dd, J = 4.6, 1 .8 Hz, H-6), 8.31 (1 H, dd, J = 7.8, 1 .8 Hz, H-4), 7.08 (1 H, dd, J = 7.8, 4.6 Hz, H-5), 3.67 (3H, s, C02Me), 3.21 (2H, t, J = 6.9 Hz, H-1 ), 2.38 (2H, t, J = 7.2 Hz, H-4), 1 .80 (4H, m, H-2 y H-3); HRMS (El), calculado para Ci2H15N04S 269.07218, encontrado 269.07342.
Preparación de la 4 '-clorobifenil-2-amina (11): i) 4'-cloro-2-nitrobifenilo (10). Pd(Ph3)4 (50.4 mg, 0.0436 mmol) se añadió bajo nitrógeno a una mezcla del ácido 4-(clorofenil)borónico (9) (170.4 mg, 1 .09 mmol), 1 -íodo-2-nítrobenceno (8) (226.1 mg, 0.9 mmol) y K3P04 (577.9 mg, 2.72 mmol) en dioxano (4.5 mL) y H20 (0.91 mL). La mezcla se agitó a 85 QC por 48 h, se vertió sobre agua y se extrajo con éter. Los extractos orgánicos combinados se lavaron con salmuera, se secaron sobre MgS04 anhidro y se concentraron. Purificación cromatográfica del crudo obtenido con gel de sílice, usando hexano-AcOEt 9:1 como eluyente, proporcionó el bífenílo 10 (229.4 mg, 90%) como un sólido amarillo. Pf. 60-62 SC (cristalizado de MeOH) [61 SC según C. Shíh et al., J. Chem. Soc. 1958, 1885-1889]. Los datos espectroscópicos de 10 fueron idénticos a los descritos en la literatura para el 4'-cloro-2-nítrobifenilo.
\\) 4 '-clorobifeni¡-2-amina (11). Una disolución del nitro-bifenilo 10 (192 mg, 0.82 mmol) en 95% EtOH (3.2 mL) se añadió sobre una mezcla de NH4CI (21 .9 mg, 0.41 mmol) en agua (1 mL) y hierro en polvo (195 mg, 3.49 mmol). La mezcla se refluyó con agitación durante 1 h y se filtró para separar los sólidos. El filtrado se diluyó con agua y se extrajo con AcOEt. La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó sobre Na2S04 anhidro y se concentró. Tras la correspondiente purificación cromatográfica sobre gel de sílice, usando hexano-AcOEt 8:2 como eluyente, se obtuvo el amino-bifenilo 11 (151 mg, 90%) como un semisólido incoloro [41 -42 2C según C.K. Bradsher et al., J. Am. Chem. Soc. 1946, 68, 404-405). Los datos espectroscopios de 11 coinciden totalmente con los descritos en la literatura para el 4'-cloro-2-amínobifenilo.
Preparación del 5-(3-(4'-ciorobifenil-2-ilcarbamoil)piridin-2-iit ^ de metilo (6). Cloruro de oxalilo (35.8 xL, 0.715 mmol) se añadió gota a gota sobre una disolución agitada del ácido 4 (175 mg, 0.65 mmol) en CH2CI2 anhidro (4 mL) seguido de una cantidad catalítica de DMF (16 μί). La mezcla se agitó a temperatura ambiente por 24 h y el disolvente y exceso de reactivo se eliminaron a presión reducida. Se añadió benceno seco (10 mL) y se repitió la destilación, obteniéndose después de secar a vacío el 5-(3- (clorocarbonil)píridin-2-iltio)pentanoato de metilo (5) (186.8 mg) que fue utilizado en la siguiente etapa sin purificación posterior.
Una mezcla del cloruro anterior, 4'-clorobifenil-2-amina (11 ) (100 mg, 0.488 mmol), piridina (52.6 μί, 0.65 mmol) y una cantidad catalítica de DMAP (1 .61 mg) en CH2CI2 anhidro (8 mL) se agitó a temperatura ambiente durante tres días. Después de este tiempo la mezcla de reacción se vertió sobre agua y se extrajo con AcOEt. Los extractos orgánicos se lavaron con salmuera y se secaron sobre Na2SO4 anhidro. El residuo obtenido tras la evaporación del disolvente se purificó por cromatografía sobre gel de sílice, eluyendo con mezclas de hexano-AcOEt (desde 9:1 a 6:4) para proporcionar la amida 6 (202 mg, 91 %) como un sólido blanco. Pf. 105-107 SC (cristalizado de hexano-C6H6); H NMR (300 MHz, CDCI3) δ 8.45 (1 H, dd, J = 4.8, 1 .8 Hz, H-6 Py), 8.41 (1 H, br d, J = 8.1 Hz, H-3 PhPh), 8.12 (1 H, br s, NH), 7.79 (1 H, dd, J = 7.8, 1 .8 Hz, H-4 Py), 7.44-7.22 (7H, m, H-27H-6', H-37H-5', H-4, H-5 y H-6 PhPh), 7.04 (1 H, dd, J = 7.8, 4.8 Hz, H-5 Py), 3.66 (3H, s, CO2Me), 3.14 (2H, t, J = 6.9 Hz, H-5), 2.36 (2H, t, J = 7.2 Hz, H-2), 1 .68 (4H, m, H-3 y H-4); HRMS (El), calculado para C24H2335CIN2O3S 454.1 1 179, encontrado 454.1 1 181 . Preparación del ácido 5-(3-(4'-clorobifen^2-ilcarbamoil)piridin-2-iltio)penta^ (7, Hapteno BLa5). Una disolución del éster metílico 6 (1 12 mg, 0.246 mmol) en MeOH (5.1 mL) y 2M NaOH (1 .23 mL) se agitó a temperatura ambiente durante 4h. La mayor parte del disolvente se evaporó a presión reducida y el residuo resultante se diluyó con agua (2 mL) y se acidificó con ácido fórmico. El precipitado blanco formado se recogió por filtración, se lavó con agua y se secó a vacío para dar el hapteno BLa5 (7) (97 mg, 89%) como un sólido blanco. Pf. 172-175 °-C (cristalizado de MeOH frío); 1 H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 12.05 (1 H, br s, COOH), 10.03 (1 H, br s, NH), 8.50 (1 H, dd, J = 4.8, 1 .8 Hz, H-6 Py), 7.67 (1 H, br d, J = 6.9 Hz, H-3 PhPh), 3.39-7.35 (9H, m, H-27H-6', H-37H-5', H- 4, H-5 y H-6 PhPh), 7.19 (1 H, dd, J = 7.5, 4.8 Hz, H-5 Py), 3.10 (2H, t, J = 6.0 Hz, H-5), 2.25 (2H, t, J = 6.3 Hz, H-2), 1 .61 (4H, m, H-3 y H-4); HRMS (El), calculado para C23H2i 35CIN203S 440.09614, encontrado 440.09463. b) Síntesis del hapteno BLb6 (21):
La síntesis del hapteno BLb6 (Figura 2) requiere la preparación previa del sintón correspondiente a la agrupación bifenilo, el compuesto 18. Tal como se recoge la síntesis del compuesto 18 se inicia a partir del 2,4-diiodo-1 -nítrobenceno (13), fácilmente obtenible a partir de 1 ,3-diiodobenceno (12) a través de una reacción de nitración con nítrico fumante [Z. Zhang et al., J. Org. Chem. 2006, 71, 4339-4342], y se hace uso de la diferente reactividad de las dos posiciones iodadas frente a los procesos de acoplamiento cruzado catalizados por paladío. En primer lugar, se introduce la cadena C6 que constituye el brazo espaciador en la posición apropiada del sistema de biarilo a través de un acoplamiento regioselectivo de Sonogashira de la posición C4-íodada, la más reactiva en este tipo de acoplamiento, con 5- hexinoato de íerc-butilo (14) [preparado según G. Bartoli et al., Synthesis 2007, 3489-3496]. Esta reacción de acoplamiento catalizada por paladio proporciona el iodo-alquino 15, el cual es transformado en el bifenilo 16, a través de una reacción de de acoplamiento cruzado con el ácido 4-clorofenílborónico (9), con un rendimiento global moderado (50%). La reducción del triple enlace y del grupo nitro de 16, necesarias para completar la preparación del intermedio clave 18, se lleva a cabo de modo muy eficaz en dos etapas consecutivas. Así, hidrogenación del triple enlace acetílénico, usando el catalizador de Wilkinson, seguido de reducción del grupo nitro con hierro en condiciones acidas muy suaves proporciona la bifenilamina 18 con un rendimiento global excelente (94%). Una vez completada la preparación de este intermedio clave, la síntesis del hapteno BLb6 (21) se completa eficazmente a través del acoplamiento del mismo con el cloruro del ácido 2-cloronicotínico (19) y subsecuente hidrólisis ácida del grupo éster terc-butílico.
Preparación del 2,4-diiodo-l -nitrobenceno (13). 1 ,3-Diiodobenceno (12) (2.15 g, 6.55 mmol) se añadió en pequeñas porciones a HNO3 fumante (10 mL) enfriado a 0 SC. Una vez finalizada la adición, la mezcla de reacción se agitó durante 15 min a la misma temperatura y se vertió cuidadosamente en agua, extrayéndose a continuación con CH2CI2. Los extractos orgánicos se lavaron sucesivamente con disolución acuosa saturada de NaHC03, disolución acuosa de NaHSOs al 5% y salmuera. El secado sobre MgS04 anhidro y posterior eliminación del disolvente proporcionó un sólido amarillo que fue purificado por cromatografía sobre gel de sílice, usando hexano-AcOEt 95:5 como eluyente, para dar el derivado nitrado 13 (2.36 g, 94%) como un sólido amarillo cristalino. Pf. 95-97 eC (cristalizado de hexano) [93-95 SC según C. Álvarez-Toledano et al., J. Mol. Catal. A: Chem. 2000, 164, 85-89]. H NMR (300 MHz, CDCI3) δ 8.43 (1 H, d, J = 1 .8 Hz, H-3), 7.82 (1 H, dd, J = 8.5, 1 .8 Hz, H-5), 7.60 (1 H, d, J = 8.5 Hz, H-6); HRMS (El), calculado para C6H3I2NO2 374.82533, encontrado 374.82459.
Preparación del 6-(3-lodo-4-nitrofenil)hex-5-inoato de tere-butilo (15). Una disolución de 5-hexinoato de íerc-butilo (14) (295 mg, 1 .75 mmol) en DMF anhidra desgasificada (4 mL) se añadió bajo nitrógeno sobre una mezcla del diioduro 13 (438 mg, 1 .17 mol), Cul (2.2 mg, 0.01 mmol) y (Ph3P)2PdCI2 (24.6 mg, 0.03 mmol). A continuación se añadió Et3N seca (3.1 mL) y la mezcla de reacción, inicialmente amarilla y que se tornó naranja intenso después de unos pocos minutos, se agitó a temperatura ambiente durante 22 h. La mezcla de reacción se transfirió a un matraz de fondo redondo para la evaporación de la ET.3N en un evaporador rotativo, el residuo se disolvió en AcOEt, se lavó con agua y salmuera, se secó sobre Na2S04 anhidro y se concentró. Cromatografía del producto crudo obtenido, usando hexano-AcOEt 8:2 como eluyente, proporcionó el aril-alquino 15 (282 mg, 59%) como un aceite amarillo. 1 H NMR (300 MHz, CDCI3) δ 8.05 (1 H, d, J = 1.7 Hz, H-2 Ph), 7.81 (1 H, d, J = 8.4 Hz, H- 5 Ph), 7.44 (1 H, dd, J = 8.4, 1 .7 Hz, H-6 Ph), 2.49 (2H, t, J = 7.1 Hz, H-4), 2.39 (2H, t, J = 7.4 Hz, H-2), 1 .89 (2H, quint, J = 7.2 Hz, H-3), 1 .45 (9H, s, Me); HRMS (El), calculado para Ci6H18INde04415.02806, encontrado 415.02812.
Preparación del 6-(4'-cloro-6-nitrobifenil-3-il)hex-5-inoato de tere-butilo (16). Una mezcla del ioduro de arílo 15 (238 mg, 0.56 mmoi), ácido 4-clorofenilborónico (9) (107.4 mg, 0.68 mmol), K3P04 (364 mg, 1 .72 mmol) y Pd(PPh3)4 (26.4 mg, 0.024 mmoi) en previamente desgasificados dioxano (2.9 mL) y agua (0.6 ml_) se agitó a 85 9C por 20 h bajo nitrógeno. Después de este tiempo, la mezcla de reacción se enfrió, se diluyó con agua y se extrajo con AcOEt. Los extractos se lavaron con agua, se secaron sobre MgSO4 anhidro y se concentraron. Cromatografía sobre gel de sílice, eluyendo con hexano- AcOEt 98:2, proporcionó el bíarílo 16 (190 mg, 83%) como un aceite amarillo. 1 H NMR (300 MHz, CDCI3) δ 7.84 (1 H, d, J = 8.4 Hz, H-5 PhPh), 7.47 (1 H, dd, J = 8.4, 1 .8 Hz, H-4 PhPh), 7.40 (1 H, d, J = 1 .8 Hz, H-2 PhPh), 7.40 (2H, m, H- 27H-6' PhPh), 7.23 (2H, m, H-37H-5' PhPh), 2.50 (2H, t, J = 7.0 Hz, H-4), 2.39 (2H, t, J = 7.4 Hz, H-2), 1 .90 (2H, quint, J = 7.1 Hz, H-3), 1 .45 (9H, s, CMe3); HRMS (FAB), calculado para C22H2335CINO4 (M++1 ) 400.13156, encontrado 400.13013. Preparación del 6-(4'-cloro-6-nitrobifenil-3-il)hexanoato de tere-butilo (17). Una disolución del alquíno 16 (166.8 mg, 0.42 mmol) y del catalizador de Wilkinson (12 mg, 0.013 mmol, 3%) en THF (2.7 mL) se purgó con atmósfera de hidrógeno gas. La presión de hidrógeno se reguló a 4 atm y la mezcla de reacción se agitó a temperature ambiente por 18 horas. El disolvente se eliminó a presión reducida y el residuo obtenido se purificó por cromatografía, eluyendo con hexano-AcOEt 95:5, para dar el compuesto 17 (159.4 mg, 95%). H NMR (300 MHz, CDCI3) 5 7.84 (1 H, d, J = 8.3 Hz, H-5 PhPh), 7.40 (2H, H-2VH-6' PhPh), 7.30 (1 H, dd, J = 8.3, 1 .9 Hz, H-4 PhPh), 7.25 (2H, m, H-3/H-5' PhPh), 7.19 (1 H, d, J = 1 .8 Hz, H-2 PhPh), 2.72 <2H, t, J = 7.6 Hz, H-6), 2.22 (2H, t, J = 7.3 Hz, H-2), 1 .66 (4H, m, H-3 y H-5), 1 .42 (9H, s, CMe3), 1 .37 (2H, m, H-4); HRMS (ES), calculado para C22H2635CINNa04 [M+Na]+ 426.1448, encontrado 426.1454.
Preparación del 6-(6-amino-4'-clorobifenil-3-H)hexanoato de tere-butilo (18). Una disolución de nitro-bifenil 17 (164 mg, 0.40 mmol) en 95% EtOH (2.6 ml_) se añadió sobre una mezcla de NH4CI (17 mg, 0.32 mmol) y hierro en polvo en agua (0.8 ml_) (108.6 mg, 1 .94 mmol). La mezcla de reacción se agito a reflujo durante 1 h, después se dejó enfriar a temperatura ambiente y se filtró para separar los sólidos. El filtrado se diluyó con agua y se extrajo con AcOEt. Los extractos se lavaron con salmuera, se secaron sobre Na2SO4 anhidro y se concentraron para proporcionar amino-bifenilo 18 (149 mg, 98%) como un semisólido, que por espectroscopia de RMN mostró una pureza muy elevada y se utilizó en la siguiente etapa sin posterior purificación. H NMR (300 MHz, CDCI3) 5 7.40 (4H, br s, H-27H-6' y H-37H-5' PhPh,), 6.97 (1 H, dd, J = 8.0, 2.0 Hz, H-4 PhPh), 6.91 (1 H, d, J = 2.0 Hz, H-2 PhPh), 6.71 (1 H, d, J = 8.0 Hz, H-5 PhPh), 2.54 (2H, t, J = 7.7 Hz, H-2), 2.22 (2H, t, J = 7.5 Hz, H-6), 1 .62 (4H, m, H-3 y H-5), 1 .44 (9H, s, CMe3), 1 .38 (2H, m, H-4); HRMS (El), calculado para C22H28 35CINO2373. 18086, encontrado 373.17950.
Preparación del 6-(4'-cloro-6-(2-cloronicotinamido)bifenil-3-il)hexanoato de tere- butilo (20). Una disolución del amino-bifenilo 18 (67 mg, 0.18 mmol) y cloruro de nicotinoilo (19) (34.7 mg, 0.20 mmol) en THF anhidro (360 μί) se agitó a temperatura ambiente por 24 h. Después de este tiempo el disolvente se eliminó a presión reducida y el residuo obtenido se purificó por cromatografía, eluyendo con CHC- -hexano 1 :1 , para dar la amida 20 (87 mg, 95%) como un aceite viscoso. 1 H NMR (300 MHz, CDCI3) 5 8.44 (1 H, dd, J = 4.7, 1 .9 Hz, H-6 Py), 8.26 (1 H, d, J = 8.4 Hz, H-5 PhPh), 8.12 (1 H, dd, J = 7.8, 1 .9 Hz, H-4 Py), 8.06 (1 H, s, NH), 7.44-7.30 (5H, m, H-2VH-6', H-3VH-5' y H-5 Py), 7.26 (1 H, dd, J = 8.3, 1 .8 Hz, H-4 PhPh), 7.07 (1 H, d, J = 2.1 Hz, H-2 PhPh), 2.64 (2H, t, J = 7.7 Hz, H-6), 2.21 (2H, t, J = 7.3 Hz, H-2), 1 .63 (4H, m, H-3 y H-5), 1 .43 (9H, s, CMe3), 1 .32 (2H, m, H-4); HRMS (El), calculado para C28H3o35CI2N203 512.16335, encontrado 512.16444. Preparación del ácido 6-(4'-cloro-6-(2-cloronicotinamido)bifenil-3-il)hexanoico (21 , Hapteno BLb6). Una disolución del éster terc-butílico 20 (68 mg, 0.13 mmol) en HCOOH (2.7 mL) se agitó a temperatura ambiente por 2 h. La mezcla de reacción se diluyó con benceno y se lavó con agua y salmuera, se seco sobre Na2S04 anhidro y se concentró a sequedad, obteniéndose el hapteno BLb6 (21 ) (58 mg, 99%) como un sólido blanco. Pf. 137-139 SC (cristalizado de hexano-AcOEt); 1 H NMR (300 MHz, CDCI3) 58.33 (1 H, dd, J = 4.7, 1 .9 Hz, H-6 Py), 8.13 (1 H, d, J = 8.3 Hz, H-5 PhPh), 8.01 (1 H, dd, J = 7.6, 2.0 Hz, H-4 Py), 8.00 (1 H, s, NH), 7.35-7.12 (5H, m, H-27H-6', H-37H-5 y H-5 Py), 7.15 (1 H, dd, J = 8.3, 1 .8 Hz, H-4 PhPh), 6.98 (1 H, d, J = 1 .9 Hz, H-2 PhPh), 2.55 (2H, t, J = 7.5 Hz, H-6), 2.25 (2H, t, J = 7.4 Hz, H-2), 1 .57 (4H, m, H-3 y H-5), 1 .32 (2H, m, H-4); HRMS (El), calculado para C24H22 35CI2N203 456.10075, encontrado 456.10005. c) Síntesis del hapteno BLc5 (29):
La síntesis del hapteno BLc5 (Figura 3), en el que el brazo espaciador ocupa la posición C-4' de la agrupación bifenilo del boscalid, requiere la preparación previa del intermedio 2-amino-bifenilo (27). La síntesis de este intermedio se inicia en el producto comercial ácido 4-mercaptofenilborónico (22). Inicialmente este ácido se transforma en el correspondiente éster de etilenglicol (23) Esta transformación se lleva a cabo por tratamiento del ácido borónico con etilenglicol en condiciones ácidas muy suaves. La posterior alquilación de 23 con el 5-bromopentanoato de tere-butilo (24) [el compuesto 24 se preparó según J.V. Mercader et al., J. Agrie. Food Chem. 2008, 56, 7682-7690] en medio básico seguido de cromatografía sobre gel de sílice, que produce la rápida hidrólisis del éster borónico formado inicialmente, conduce a la formación del ácido borónico 25 con un rendimiento global del 85%. La síntesis del sistema de bifenilo requerido se completa eficazmente a través de un acoplamiento cruzado de Suzuki-Míyaura con el 1 -iodo-2-nitrobenceno (8) para obtener el derivado de 2-nitrobifenilo (26), que es posteriormente transformado en la bifenilamína 27 en condiciones reductoras. Las últimas etapas para la preparación del hapteno BLc5 (29) son relativamente sencillas e implican la formación del enlace amida por reacción entre 27 y el cloruro del ácido 2-cloronicotinico (19) seguido por hidrólisis de la agrupación éster terc-butílico con ácido fórmico. El rendimiento global de las dos últimas etapas es del 85%. Preparación del ácido 4-(5-terc-butoxi-5-oxopentiltio)fenilborónico (25). Una mezcla del ácido borónico 22 (152 mg, 0.99 mmol), etilenglicol (62 mg, 1 mmol) y MgS04 anhidro (240 mg) en Ετ.20 seco (4 mL) se agitó a temperatura ambiente durante 1 h. La mezcla de reacción se filtro y el filtrado se concentró a presión reducida para obtener el éster borónico 23 (168 mg, 93%) como un sólido blanco que mostró ser puro por espectroscopia de RMN de 1 H. 1 H NMR (300 MHz, CDCI3) δ 7.66 (2H, d, J = 8.4 Hz, H-3/H-5), 7.26 (2H, d, J = 8.4 Hz, H-2/H-6), 4.36 (4H, s, OCH2CH20).
Una mezcla del boronato obtenido arriba (168 mg, 0.93 mmol), K2CO3 (193.5 mg, 1 .4 mmol), Nal (40 mg, 0.27 mmol) y 5-bromopentanoato de tere-butilo (24) (332 mg, 1 .4 mmol) en CH3CN seco (3.4 mL) se agitó a temperatura ambiente por 5h. La mezcla de reacción se diluyó con Et20, se lavó con salmuera y se secó sobre MgS04 anhidro. La evaporación del disolvente a vacío dejó un residuo que se adsorbió sobre la cabeza de una columna de gel de sílice. Elución de la misma con CHCI3 proporcionó el ácido alquiltioaril borónico 25 (267 mg, 85%) como un sólido amorfo. 1 H NMR (300 MHz, CDCI3) δ 8.09 (2H, d, J = 8.1 Hz, H-2/H-6 Ph), 7.37 (2H, d, J = 8.1 Hz, H-3/ H-5 Ph), 3.02 (2H, t, J = 6.7 Hz, H-1 ), 2.26 (2H, t, J = 6.8 Hz, H-4), 1 .76 (4H, m, H-2 y H-3), 1 .43 (9H, s, CMe3).
Preparación del 5-(2'-nitrobifenil-4-iltio)pentanoato de tere-butilo (26). Pd(PPh3)4 (18 mg, 0.015 mmol) se añadió bajo nitrógeno a una mezcla del ácido borónico 25 (123 mg, 0.40 mmol), 1 -iodo-2-nitrobenceno (8) (1 18.5 mg, 0.47 mmol) y K3P04 (260 mg, 1 .22 mmol) en dioxano (2 ml_) y agua (0.4 mL). La mezcla resultante se agitó a reflujo por 18 h, se enfrió a temperatura ambiente y se diluyó con Et20. La mezcla diluida se lavó con agua y salmuera, se secó sobre MgS04 anhidro y se concentró a presión reducida para dar un aceite amarillento que fue posteriormente purificado por cromatografía sobre gel de sílice, con mezclas de hexano-Et20 (desde 9:1 a 8:2) como eluyente, para proporcionar el derivado de biarilo 26 (132 mg, 86%) como un aceite. 1 H NMR (300 MHz, CDC ) 5 7.84 (1 H, dd, J = 8.0, 1 .5 Hz, H-3' PhPh), 7.60 (1 H, ddd, J = 9.0, 8.0, 1 .5 Hz, H-5' PhPh), 7.47 (1 H, ddd, J = 9.0, 8.0, 1 .5 Hz, H-4' PhPh), 7.42 (1 H, dd, J = 8.0, 1 .5 Hz, H-6' PhPh), 7.34 (2H, m, H-2 y H-5 PhPh), 7.22 (2H, m, H-3 y H-5 PhPh), 2.97 (2H, t, J = 7.0 Hz, H-5), 2.26 (2H, t, J = 7.0 Hz, H-2), 1 .73 (4H, m, H-3 y H-4), 1 .44 (9H, s, CMe3); HRMS (El), calculado para C2iH25N04S 387.15043, encontrado 387.15015.
Preparación del 5-(2'-aminobifenil-4-iltio)pentanoato de tere-butilo (27). Una disolución de NH4CI (8.9, 0.17 mmol) en agua (0.4 mL) se añadió gota a gota sobre una disolución agitada del nitro-bifenilo 26 (130 mg, 0.33 mmol) en EtOH (1 .3 mL). Hierro en polvo (60 mg, 1 .0 mmol) se añadió en pequeñas porciones y la mezcla heterogénea obtenida se calentó a reflujo con agitación durante 1 h, se enfrió a temperatura ambiente y se filtró. El filtrado se diluyó con benceno y se concentró a sequedad. El residuo obtenido se purificó por cromatografía, usando hexano-Et20 6:4 como eluyente, para proporcionar el amino-bifenilo 27 (105 mg, 90%) como un aceite incoloro. 1 H NMR (300 MHz, CDCI3) 5 7.38 (4H, br s, H-2/H-6 y H-3/H-5 PhPh), 7.15 (1 H, ddd, J = 9.0, 7.9, 1 .5 Hz, H-4' PhPh), 7.10 (1 H, ddd, J = 7.5, 1 .5 Hz, H-6' PhPh), 6.82 (1 H, ddd, J = 9.0, 7.5, 1 .0 Hz, H-5' PhPh), 6.76 (1 H, ddd, J = 7.9, 1 .0 Hz, H-3' PhPh), 3.72 (2H, br s, NH2), 2.97 (2H, t, J = 6.9 Hz, H-5), 2.26 (2H, t, J = 6.9 Hz, H-2), 1 .74 (4H, m, H-3 y H- 4), 1 .44 (9H, s, CMe3); HRMS (El), calculado para C2i H27N02S 357.17625, encontrado 357.17558. Preparación del 5-(2'-(2-cloronicotinamido)bifenil-4-iltio)pentano de tere- butilo (28). Una disolución del amino-bifenilo 27 (100 mg, 0.28 mmol) y cloruro de nicotinoilo (19) (54 mg, 0.30 mmol) en THF anhidro (1 mL) se agitó a temperatura ambiente por 3 h. Seguidamente el disolvente se elimino a presión reducida y el residuo obtenido se purificó por cromatografía, eluyendo con mezclas de hexano-Et20 (desde 8:2 a 2:8), para dar la amida 28 (120.3 mg, 87%) como un aceite. 1 H NMR (300 MHz, CDCI3) 6 8.44 (1 H, d, J = 8.6 Hz, H-3' PhPh), 8.43 (1 H, dd, J = 4.7, 1 .9, H-6 Py), 8.22 (1 H, br s, NH), 8.12 (1 H, dd, J = 7.7, 1 .9 Hz, H-4 Py), 7.5-7.2 (8H, m, H-2/H-6, H-3/H-5, H-4', H-5', H-6' PhPh y H-5 Py), 2.96 (2H, t, J = 6.9 Hz, H-5), 2.24 (2H, t, J = 7.0 Hz, H-2), 1 .72 (4H, m, H-3 y H-4), 1 .43 (9H, s, CMe3); HRMS (El), calculado para C27H2935CIN203S 496.15874, encontrado 496.15887.
Preparación del ácido 5-(2'-(2-cloronicotinamido)bifenil-4-iltio)pentanoico (29, Hapteno BLc5). Una disolución del éster íerc-butílico 28 (120.2 mg, 0.24 mmol) en HCOOH (5 mL) se agitó a temperatura ambiente por 1 h. La mezcla de reacción se concentró a presión reducida, se añadió CHCI3 y se concentró de nuevo para dar un residuo sólido que se cristalizó de benceno-hexano para proporcionar el hapteno BLc5 (29) (103 mg, 97%) como cristales blancos. Pf. 1 17-1 18 SC (cristalizado de C6H6-hexano); 1 H NMR (300 MHz, CDCI3) δ 9.64 (1 H, br s, COOH), 8.44-8.41 (2H, m, H-6 Py y H-3' PhPh), 8.32 (1 H, br s, NH), 8.16 (1 H, dd, J = 7.7, 1 .7 Hz, H-4 Py), 7.42-7.23 (8H, m, H-2/H-6, H-3/H-5, H- 4', H-5', H-6' PhPh y H-5 Py), 2.95 (2H, t, J = 6.6 Hz, H-5), 2.37 (2H, t, J = 6.5 Hz, H-2), 1 .75 (4H, m, H-3 y H-4); HRMS (El), calculado para C23H2i35CIN203S 440.09614, encontrado 440.09557.
2) Ensayos biológicos con ios haptenos BLa5, BLb6 y BLc5. a) Activación de haptenos
Todos los ejemplos de haptenos aquí presentados contienen un grupo carboxilo como grupo químico funcional para su inmovilización a proteínas transportadoras, concretamente por reacción con los grupos amino libres de la proteína. El grupo carboxilo se activó utilizando A/,/V-disuccinimídíl carbonato (DSC) siguiendo protocolos previamente publicados [F.A. Esteve-Turrillas et al., Anal. Chim. Acta doí: 10.1016/j.aca.2010.09.042). En concreto, se disolvió 0.082 mmol de hapteno y 0.14 mmol de DSC en 0.8 mi de acetonitrilo seco en atmósfera de nitrógeno. A continuación, se añadió 0.31 mmol de trietilamina y se agitó a temperatura ambiente durante toda la noche. La disolución se diluyó en cloroformo, se lavó con una disolución saturada de NaHC03 y salmuera y se secó con Na2S04 anhidro. Después de evaporar el disolvente, el residuo restante se purificó por cromatografía en columna, usando cloroformo como eluyente, obteniéndose el éster de /V-hidroxisuccinimida del hapteno en forma pura como un aceite (hapteno activado). b) Tampones y disoluciones
PB, tampón fosfato sódico 100 mM, pH 7.4; PBS, tampón fosfato sódico 10 mM, pH 7.4 con NaCI 140 mM; PBST, PBS conteniendo 0.05% (v/v) de Tween 20; CB, tampón carbonato-bicarbonato 50 mM, pH 9.6; disolución de lavado, NaCI 150 mM conteniendo 0.05% (v/v) de Tween 20. Los analitos se disolvieron en A/,A/-dímetilformamida (DMF) anhidra y se almacenaron a -20 °C. c) Preparación de conjugados i) Inmunógeno
A 2.0 ml de una disolución de 15 mg/ml de proteína albúmina de suero bovino (BSA) en tampón CB se añadió gota a gota 200 μΙ de una disolución 50 mM de hapteno activado en DMF. La reacción se llevó a cabo durante 4 h a temperatura ambiente con agitación suave y a continuación, el conjugado se purificó por cromatografía de exclusión molecular en Sephadex G-25 usando tampón PB como eluyente. El grado de conjugación medido espectrofotométricamente fue de 1 1 , 14 y 14 moléculas de hapteno por molécula de proteína para BLa5, BLb6 y BLc5, respectivamente. ii) Conjugado o antígeno de ensayo
A 2.0 mi de una disolución de 15 mg/ml de proteína albúmina de huevo (OVA) en tampón CB se añadió gota a gota 100 μΙ de una disolución 100 mM de hapteno activado en DMF. La reacción se llevó a cabo durante 2.5 h a temperatura ambiente con agitación suave y a continuación, el conjugado se purificó por cromatografía de exclusión molecular en Sephadex G-25 usando tampón PB como eluyente. El grado de conjugación medido espectrofotométricamente fue de 8, 8 y 9 moléculas de hapteno por molécula de proteína para BLa5, BLb6 y BLc5, respectivamente. iü) Trazador o antígeno enzimático
A 1 .0 mi de una disolución de 2.2 mg/ml de proteína peroxidasa de rábano picante (HRP) en tampón CB se añadió gota a gota 100 μΙ de una disolución 10 mM (o 5 mM) de hapteno activado en DMF. La reacción se llevó a cabo durante 4 h a temperatura ambiente con agitación suave y a continuación, el conjugado se purificó por cromatografía de exclusión molecular en Sephadex G-25 usando tampón PB como eluyente. El grado de conjugación medido espectrofotométricamente fue de 6, 5 y 3 moléculas de hapteno por molécula de proteína para BLa5, BLb6 y BLc5, respectivamente. d) Inmunización de conejos
Se inmunizaron 2 hembras de conejo blancas de la raza New Zealand con cada conjugado BSA-hapteno siguiendo protocolos estandarizados [C. Suárez- Pantaleón et al., J. Agrie. Food Chem. 2010, 58, 8502-851 1 ]. Cada animal recibió 0.3 mg de uno de los conjugados disuelto en 1 mi de una mezcla 1 :1 de tampón PB y adyuvante de Freund completo. La inmunización prosiguió con la inoculación de una dosis de recuerdo cada 21 días con la misma cantidad de conjugado pero empleando adyuvante de Freund incompleto. Diez días después de la cuarta inyección, los animales fueron exsanguínados y la sangre obtenida se dejó coagular a 4 eC durante toda la noche. Al día siguiente, se recuperó el suero por centrifugación, se diluyó a ½ con PBS frió y se le añadió un volumen de sulfato amónico saturado. El precipitado proteico resultante se recogió por centrifugación y se redisolvió en tampón PBS frío. Finalmente, las proteínas se reprecipitaron como anteriormente y se almacenaron en este estado a 4 QC. Este precipitado contiene una mezcla indeterminada de proteínas que denominamos antísuero, anticuerpo policlonal o simplemente anticuerpo. e) Procedimiento ELISA
Se emplearon placas de poliestireno de 96 pocilios. Cada antisuero se evaluó en los dos formatos clásicos de ELISA competitivo (el de antígeno o conjugado inmovilizado con detección indirecta y el de anticuerpo inmovilizado con detección directa) usando tanto conjugados homólogos como heterologos. Se emplearon pipetas electrónicas de 8 canales para la dispensación rápida y precisa de los inmunorreactivos. Después de cada etapa de incubación, las placas se lavaron cuatro veces con una disolución de lavado, usando un lavador de 96 canales ELx405 (Biotek Instruments, Winooski, USA). La actividad peroxidasa usada como marcador se reveló con 100 μΙ por pocilio de una disolución 2 mg/ml de o-fenilendiamina en tampón 25 mM citrato, 62 mM fosfato, pH 5.4 conteniendo 0.012% (v/v) de H2O2. Este revelado se desarrolló durante 10 min a temperatura ambiente y se paró usando 100 μΙ por pocilio de H2S04 2.5 M. Al finalizar los ensayos, la absorbancia de cada pocilio se leyó a 492 nm usando una longitud de onda de referencia de 650 nm en un lector de microplacas PowerWave HT (Biotek Instruments, Winooski, USA). Las curvas patrón sigmoideas obtenidas al representar la absorbancia frente a la concentración de analito se ajustaron a una ecuación logística de cuatro parámetros usando el paquete informático SigmaPlot de SPSS (Chicago, USA). El título del antisuero se definió como el recíproco de la dilución del antisuero que proporciona una señal máxima (Amax) alrededor de 1 .0 en ausencia de analito libre en ensayo de ELISA competitivo en el formato de conjugado inmovilizado homólogo a 0.1 mg/ml con detección indirecta. La afinidad del anticuerpo (IC50) se estimó como la concentración de analito libre capaz de reducir a la mitad la señal máxima. i) Ensayos ELISA competitivos en formato de antígeno o conjugado inmovilizado con detección indirecta Las placas se tapizaron con 100 μΙ por pocilio de una disolución de conjugado OVA-hapteno a 1 .0 o a 0.1 μg/ml en tampón CB por incubación durante toda la noche a temperatura ambiente. Se prepararon diluciones seriadas de los antisueros con un factor de dilución de 1 /3 en PBST. En cada columna se dispensó 50 μΙ por pocilio de una curva estándar completa del analito en PBS seguido de 50 μΙ por pocilio de una dilución concreta de un determinado antisuero en PBST. La misma distribución de reactivos se repitió para cada placa con un conjugado diferente. La reacción inmunoquímica se llevó a cabo durante 1 h a temperatura ambiente y después se lavaron las placas. A continuación, cada pocilio recibió 100 μΙ de una dilución 1 /10000 de GAR-HRP (conjugado comercial de peroxidasa con anticuerpos de cabra contra anticuerpo de conejo) en PBST conteniendo 10% de suero bovino fetal. Esta reacción se dejó a temperatura ambiente durante 1 h. Después de lavar las placas, se reveló la actividad peroxidasa retenida y se leyó la absorbancía a 492 nm como se ha descrito anteriormente. ii) Ensayos ELISA competitivos en formato de anticuerpo inmovilizado con detección directa
Las placas se tapizaron con 100 μΙ por pocilio de una dilución de antisuero en tampón CB por incubación durante toda la noche a temperatura ambiente. Se prepararon diluciones seriadas del conjugado enzimático HRP-hapteno con un factor de dilución de 1 /3 en PBST. En cada columna se dispensó 50 μΙ por pocilio de una curva estándar completa del analito en PBS seguido de 50 μΙ por pocilio de una dilución concreta de un trazador enzimático determinado en PBST. La misma distribución de reactivos se repitió para cada placa con un antisuero diferente. La reacción inmunoquímica se llevó a cabo durante 1 h a temperatura ambiente y después se lavaron las placas. Finalmente, se reveló la actividad peroxidasa retenida y se leyó la absorbancia a 492 nm como se ha descrito.
3) Resultados i) Respuesta inmune
Los seis ínmunógenos produjeron respuestas inmunes semejantes y equivalentes con títulos entre 3x105 y 1 x106 (Figura 4). íi) Selección de las mejores combinaciones de ínmunorreactivos
Cada uno de los antisueros obtenidos se ensayó frente a conjugados de todos los haptenos (homólogos y heterólogos) usando el ensayo de tipo ELISA competitivo, tanto en formato de ensayo de conjugado inmovilizado con detección indirecta como en el formato de anticuerpo inmovilizado con detección directa. Se ensayaron diferentes concentraciones de conjugado frente a diferentes concentraciones de antísuero en ensayo competitivo utilizando como competidor diferentes concentraciones de boscalid preparadas por dilución seriada. A partir de todos los haptenos fue posible generar anticuerpos capaces de reconocer al boscalid con elevada afinidad. Este resultado confirma la idoneidad de las estructuras propuestas para el objetivo que se persigue. Los valores de IC50 y de la pendiente de la curva de inhibición resultante para cada combinación de ínmunorreactivos se han incluido en la Tabla 1 (a-c) (Resultado de los ensayos en formato ELISA competitivo de conjugado inmovilizado con detección indirecta) y la Tabla 2 (a-c) (Resultado de los ensayos en formato ELISA competitivo de anticuerpo inmovilizado con detección directa).
Tabla 1a
OVA- -BLa5
Conjugado Título As. IC50
Antisuero ( Q/mi) (x103) Arna Pend. (nM)
BLa5#1 0.01 30 0.91 0.82 3.8
0.1 300 1.05 0.67 2.5
BLa5#2 0.01 100 0.94 0.72 4.0
0.1 1000 0.97 0.55 2.7
BLb6#1 0.1 30 0.73 1.07 1.1
1 100 0.64 0.85 7.7
BLb6#2 0.1 30 0.74 1.09 0.3
1 30 1.39 0.79 1.5
BLc5#1 0.1 100 1.06 0.83 1.3
1 300 0.85 0.68 6.0
BLc5#2 0.1 30 1.05 0.70 14.9
1 100 1.24 0.33 33.3
Tabla 1b
OVA- -BLb6
Conjugado Título As. IC50
Antisuero (Mg/ml) (x103) Amax Pend. (nM)
BLa5#1 0.1 10 0.73 0.89 0.6
1 30 1.41 0.68 1.2
BLa5#2 0.1 30 1.22 1.19 2.1
1 100 0.96 0.52 1.5
BLb6#1 0.01 30 1.13 0.70 1.5
0.1 300 1.11 0.62 0.9
BLb6#2 0.01 30 1.18 0.75 1.3
0.1 300 0.91 0.60 1.1
BLc5#1 0.1 30 0.76 0.76 2.3
1 30 1.06 0.67 24.8
BLc5#2 0.1 10 0.81 1.12 3.1
1 30 1.29 0.96 5.1 Tabia 1c
OVA- -BLc5
Conjugado Título As. IC50
Antisuero (Mg/ml) (x103) Amax Pend. (nM)
BLa5#1 0.1 100 1.21 0.73 3.1
1 300 0.85 0.51 23.6
BLa5#2 0.1 300 0.78 0.71 5.0
1 300 1.27 0.56 78.0
BLb6#1 0.1 100 0.71 0.65 0.9
1 300 0.62 0.50 1.3
BLb6#2 0.1 100 0.88 0.81 1.6
1 100 1.11 0.62 26.8
BLc5#1 0.01 100 1.36 0.76 2.7
0.1 1000 0.69 0.71 4.7
BLc5#2 0.01 100 1.14 0.76 4.9
0.1 300 1.21 0.65 15.7
Tabla 2a
HRP- -BLa5
Trazador Dil. As. IC50
Antisuero (ng/ml) (x103) max Pend. (nM)
BLa5#1 3 60 0.79 0.52 1.1
3 30 1.03 0.71 4.3
BLa5#2 3 60 1.00 0.61 4.7
3 30 1.32 0.65 13.9
BLb6#1 30 10 0.96 0.96 1.5
30 3 1.33 0.89 2.8
BLb6#2 30 10 0.86 0.82 0.9
30 3 0.70 0.84 0.6
BLc5#1 10 10 1.25 0.94 2.5
10 3 1.92 0.93 2.6
BLc5#2 30 10 1.25 0.63 10.5
10 3 0.90 0.68 5.4 Tabla 2b
HRP- -BLb6
Trazador Dil. As. IC50
Antisuero (ng/ml) (x103) Amax Pend. (nM)
BLa5#1 30 10 0.61 0.99 0.8
30 3 0.67 1.55 2.7
BLa5#2 10 10 1.50 1.48 2.6
10 3 2.30 1.35 2.5
BLb6#1 3 60 0.73 0.66 1.7
3 30 0.91 0.68 6.0
BLb6#2 10 60 1.25 0.72 6.7
3 30 1.25 0.54 3.4
BLc5#1 10 10 1.20 1.05 4.7
10 3 1.70 0.91 4.7
BLc5#2 100 10 0.48 0.86 35.1
100 3 0.77 0.75 19.4
Tabla 2c
HRP- -BLc5
Trazador Dil. As. IC50
Antisuero (ng/ml) (x103) Amax Pend. (nM)
BLa5#1 10 10 1.04 0.76 2.8
10 3 1.24 0.82 2.8
BLa5#2 10 10 1.39 0.84 5.0
10 3 1.89 1.05 5.8
BLb6#1 10 10 0.92 0.78 2.6
10 3 1.51 0.75 3.1
BLb6#2 10 10 1.52 0.82 1.5
10 3 1.24 0.85 2.2
BLc5#1 3 60 1.17 0.54 2.4
3 30 1.56 0.69 5.8
BLc5#2 3 60 1.25 0.76 4.6
3 30 1.59 0.75 7.6
En la Figura 5 se muestran las curvas de inhibición obtenidas con el antisuero BLb6#2 y el conjugado de BLa5, tanto en formato de conjugado inmovilizado con detección indirecta como con el formato de anticuerpo inmovilizado con detección directa. Para el ensayo indirecto se empleó 0.01 μg de conjugado por pocilio y la dilución del antisuero en la etapa de competición fue de 1 /30000. En el caso del ensayo con formato directo, el pocilio se tapizó con 100 μΙ_ de una disolución del antisuero a 1 /3000 y en la etapa competitiva se usó 3 ng de trazador enzimátíco heterólogo.

Claims

REIVINDICACIONES
1 . Un compuesto de fórmula general (I): B-X-L-Y
(I)
donde
B se selecciona entre uno cualquiera de los siguientes radicales (R-l), (R-H), (R-lll) -IV):
Figure imgf000035_0001
X puede estar presente o no y se selecciona entre O, S, NH y un átomo de carbono saturado o insaturado;
L representa un espaciador de 0 a 40 átomos de carbono dispuestos en una cadena lineal o ramificada, saturada o insaturada y que puede comprender hasta dos estructuras de anillo y entre 0 y 20 heteroátomos siendo los heteroátomos seleccionados entre S, O y N, con la condición de que no más de dos heteroátomos puedan unirse en secuencia; e
Y es un grupo funcional seleccionado entre -COOH, -OH, -NH2, -NH-, -N3, -CH2CI, -CHCI-, -CH2Br, -CHBr-, -CH2I, -CHI-, -CHO, -SH, -S-S-, -SO3H, -SO3H, -OSO2Ph, -OSO2Ar, -NH-NH2 y -C(=N-NH2)-.
2. El compuesto según la reivindicación 1 , donde X se selecciona entre S y C.
3. El compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, donde L representa un espaciador de 0 a 8 átomos de carbono dispuestos en una cadena lineal.
4. El compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde Y es un grupo funcional conjugable seleccionado entre un -COOH, -CHO, -NH2 y -SH.
5. El compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que se selecciona entre:
Figure imgf000036_0001
y
6. Un compuesto de fórmula general (II):
[B-X-L-ZJn-P
(II)
donde B se selecciona entre uno cualquiera de los siguientes radicales (R-i), (R-íl),
Figure imgf000037_0001
X puede estar presente o no y se selecciona entre O, S, NH y un átomo de carbono saturado o insaturado; L representa un espaciador de 0 a 40 átomos de carbono dispuestos en una cadena lineal o ramificada, saturada o ínsaturada y que puede comprender hasta dos estructuras de anillo y entre 0 y 20 heteroátomos siendo los heteroátomos seleccionados entre S, O y N, con la condición de que no más de dos heteroátomos puedan unirse en secuencia; Z es un grupo funcional seleccionado entre -CONH-, -NHCO-, -NHCONH- -NHCSNH-, -OCONH- -NHOCO-, -OCSNH-, -SCONH-, -S-, -S-S- - =NH)-, -CO-, -CHOH-, -N=N-, -NH- y
Figure imgf000038_0001
P se selecciona del grupo formado por péptidos, polipéptidos, polisacáridos o polímeros sintéticos; y n es un número entero seleccionado entre 1 y 50 por cada 50 kilodaltons de peso molecular de P.
7. El compuesto según la reivindicación 6, donde X se selecciona entre S y C.
8. El compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 6 ó 7, donde L representa un espaciador de 0 a 8 átomos de carbono dispuestos en una cadena lineal.
9. El compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, donde Z se selecciona entre un grupo -CONH-, -NHCO-, -NH-, -S- y
Figure imgf000038_0002
10. El compuesto según las reivindicaciones 6 a 9, donde P se selecciona, del grupo formado por albúmina, tiroglobulina, hemocianina, beta-galactosidasa, peroxidasa, fosfatasa u oxidasa.
. Un compuesto de fórmula general (III):
[B-X-L-Z]n
(lll) donde
B se selecciona entre uno cualquiera de los siguientes radicales (R-l), (R-H), (R-I -IV):
Figure imgf000039_0001
(R-III) (R-IV)
X puede estar presente o no y se selecciona entre O, S, NH y un átomo de carbono saturado o insaturado;
L representa un espaciador de 0 a 40 átomos de carbono dispuestos en una cadena lineal o ramificada, saturada o insaturada y que puede comprender hasta dos estructuras de anillo y entre 0 y 20 heteroátomos siendo los heteroátomos seleccionados entre S, O y N, con la condición de que no más de dos heteroátomos puedan unirse en secuencia; Z es un grupo funcional seleccionado entre -CONH-, -NHCO-, -NHCONH-, -NHCSNH-, -OCONH- -NHOCO-, -OCSNH-, -SCONH-, -S-, -S-S- - =NH)-, -CO-, -CHOH-, -N=N-, -NH- y
Figure imgf000040_0001
Q es un marcador químico isotópico o no isotópico; y n es un número entero entre 1 y 50 por cada 50 kilodaltons de peso molecular de Q. 12. El compuesto según la reivindicación 1 1 , donde X se selecciona entre S y C.
13. El compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 1 ó 12, donde L representa un espaciador de 0 a 8 átomos de carbono dispuestos en una cadena lineal.
14. El compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 1 a 13, donde Z se selecciona entre un grupo -CONH-, -NHCO-, -NH-, -S- y
Figure imgf000040_0002
15. El compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 1 a 14, donde Q se selecciona, entre biotina, fluoresceína y sus derivados, fluoróforos de cianinas, de rodaminas o de cumarinas, bipiridilos de rutenio, derivados de TEXAS RED y de BODIPY, luciferina y derivados, ésteres de acridinío, así como partículas de oro coloidal, de carbón o de látex.
16. Un anticuerpo generado en respuesta a un inmunogeno de fórmula general (II):
[B-X-L-Z]n-P
OI)
tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10.
17. Método de detección de boscalid en una muestra aislada que comprende las siguientes etapas: a. poner en contacto una muestra aislada con el anticuerpo generado según la reivindicación 16;
b. incubar la muestra aislada y el anticuerpo del paso (a) durante un periodo de tiempo adecuado para que tenga lugar una reacción inmunoquímica y
c. determinar la existencia de reacción inmunoquímica tras la incubación del paso (b).
18. El método según la reivindicación 17, donde la determinación de la reacción inmunoquímica en el paso c se realiza mediante un inmunoensayo.
19. Kit de detección de boscalid, que comprende los anticuerpos según la reivindicación 16.
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