WO2018080191A1 - 자기구동 관절연골 재생 시스템 - Google Patents

자기구동 관절연골 재생 시스템 Download PDF

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cartilage regeneration
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박석호
박종오
한지원
강병전
고광준
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    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/06—Materials or treatment for tissue regeneration for cartilage reconstruction, e.g. meniscus

Definitions

  • the present invention relates to a self-driven articular cartilage regeneration system, and more particularly, to a self-driven articular cartilage regeneration system consisting of a composition for cartilage regeneration, an imaging unit and a magnetic field generation unit for non-surgically regenerating articular cartilage.
  • Osteoarthritis is the most common disease in the elderly over 70% of the population over 65 years of age and more than 24% of the population over 50 years of age in Korea. Along with the defect of the cartilage is accompanied by abnormal bone around the joint, leading to deterioration and loss of joint function. Joints have relatively low density of stem and progenitor cells in the tissues, and because of the lack of blood vessels, the migration of cartilage cells from the surrounding area after cartilage damage is limited, resulting in lower regeneration than other tissues. Stem cells involved in healing during cartilage damage are also regenerated or have limited regenerative capacity to fibrous cartilage with weak mechanical properties.
  • articular cartilage damage such as arthritis
  • the treatment of articular cartilage damage, such as arthritis was initially a conservative therapy such as drugs or physiotherapy, and in the absence of symptomatic improvement, the arthritis is performed by arthroscopy or artificial arthroplasty.
  • stem cell transplantation is performed by surgical methods such as microfracture using biomaterials, autologous chondrocytes or matrix-based chondrocyte transplantation.
  • Existing methods of transplanting (chondrocytes, stem cells) have a problem of exposing defects by surgical methods, or accurately placing a large amount of cells in joint cartilage defects and maintaining their number during the treatment period. .
  • the present invention has been made to solve various problems including the above problems, and an object thereof is to provide a self-driven articular cartilage regeneration system for efficiently and non-operatively regenerating articular cartilage.
  • these problems are exemplary, and the scope of the present invention is not limited thereby.
  • composition for cartilage regeneration comprising a microstructure of the magnetic body and chondrogenic cells.
  • the composition for cartilage regeneration comprising Imaging unit for imaging the cartilage regeneration composition and affected area after the X-ray irradiation to the cartilage defect site; And a magnetic field generating unit for moving the composition for cartilage regeneration to cartilage defects.
  • Figure 1a is a schematic diagram showing the manufacturing process of the microstructures for cartilage regeneration according to an embodiment of the present invention
  • Figure 1b is a photograph taken by the scanning electron microscope of the microstructures produced by the manufacturing process (upper scale unit 500 ⁇ m, the bottom is a scale unit 200 ⁇ m)
  • Figure 1c is a histogram showing the distribution of the diameter of the microstructure for cartilage regeneration prepared in accordance with an embodiment of the present invention
  • Figure 1d is prepared in accordance with an embodiment of the present invention It is a histogram showing the distribution of the size of the surface pores of the cartilage regeneration microstructures
  • Figure 1e is a histogram showing the distribution of the size of the internal pores of the microstructure for cartilage regeneration prepared in accordance with an embodiment of the present invention.
  • Figure 2a is a schematic diagram showing a magnetic drive joint cartilage regeneration system including a coil-type magnetic field generating portion according to an embodiment of the present invention
  • Figure 2b includes a wearable magnetic field generating mechanism according to an embodiment of the present invention
  • Wearable self-driven articular cartilage regeneration device is a schematic diagram showing.
  • Figure 3a is a block diagram showing the articular cartilage treatment process using the self-driven articular cartilage regeneration system 100 according to an embodiment of the present invention
  • Figure 3b is a wearable magnetic field generating mechanism according to one embodiment of the present invention cartilage This is a schematic diagram showing the appearance of wearing on the defective part.
  • Figure 4 is a schematic diagram showing the process of treating the affected area using the cartilage treatment agent, coil-type electromagnetic field generating device and wearable magnetic field generating device according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 5A is a confocal laser micrograph of a magnetic nanoparticle-coated micro-scaffold carrying stem cells according to an embodiment of the present invention (bottom is enlarged photo of the top), and FIG. 5B is a diagram showing the stem cells. It is a graph showing the results of analysis of stem cell proliferation in one micro-scaffold.
  • Figure 6 is a confocal laser micrograph showing the appearance of stem cells in the micro-scaffold in accordance with an embodiment of the present invention.
  • Figure 7a is an optical microscope photograph of the PLGA micro-scaffold
  • Figure 7b is a PLGA micro-scaffold loaded with mesenchymal stem cells of Figure 7a in the medium for chondrocyte differentiation 21 days after
  • Acian blue 7C is a photograph taken by optical microscope of a magnetic nanoparticle-coated PLGA micro-scaffold according to an embodiment of the present invention
  • FIG. 7D is a mesenchymal stem of FIG. 7C. 21 days after the magnetic nanoparticle-coated PLGA micro-scaffold loaded with the cells into the chondrocyte differentiation medium, the resultant was salted with Alcian Blue and photographed under an optical microscope
  • FIG. 7E shows the chondrocyte differentiation of FIG. Magnetic nanoparticle-coated PLGA micro-scaffolds were sliced and stained with Alcian Blue and photographed under an optical microscope
  • FIG. 7F is an enlarged portion of FIG. 7E.
  • chondrocyte differentiation-related markers AAG, COL2A1 and SOX-9
  • AAG chondrocyte differentiation-related markers
  • SOX-9 chondrocyte differentiation-related markers
  • FIG. 9A is a micrograph of a self-driving ability of a micro-scaffold for a target region by performing a 2D targetability test according to an embodiment of the present invention
  • FIG. 9B is a micro-scaffold mesenchymal stem of the present invention.
  • Figure 9c is a 2D target performance test according to an embodiment of the present invention by performing the micro-scaffold self-driving ability of the target region It is a photograph measured.
  • EMA magnetic drive
  • FIG. 10 is a diagram illustrating a knee phantom model for 3D targetability test according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 11 is a photograph showing the potential of the micro-scaffold targetability in the 3D targetability test using the knee phantom according to an embodiment of the present invention.
  • osteoarthritis is also referred to as degenerative arthritis and is characterized by the gradual damage to the cartilage that protects the joint with a progressive loss of articular cartilage and associated secondary changes and symptoms in the local joint. Degenerative changes cause damage to joints, bones and ligaments, and inflammation and pain.
  • magnetic field is also referred to as a magnetic field or magnetic field, and refers to a space in which lines of magnetic force are spread, that is, a space in which magnetic action is affected, such as a current, a magnet's surroundings, or the surface of the earth.
  • microbial fracture using biomaterials is an improvement of microfracture that was suitable for short-term clinical use, and it is damaged by collagen after leaking bone merrow mesenchymal stem cells to the damaged area. This refers to autologous matrix-induced chondrogenesis (AMIC), which seals the site, or autologous collagen induced chondrogenesis (ACIC), which fixes stem cells to defects using biomaterials in the form of gels.
  • AMIC autologous matrix-induced chondrogenesis
  • ACIC autologous collagen induced chondrogenesis
  • chondrocyte transplantation used in this document is difficult to apply autologous chondrocyte implantation (ACI) and membranes to prevent cartilage defects with collagen or periosteum and to induce cartilage regeneration by transplanting in vitro cultured autologous chondrocytes. It refers to matrix-induced autologous chondrocyte implantation (MACI), which includes autologous chondrocytes implanted into the biomaterial at the localized site.
  • ACI autologous chondrocyte implantation
  • MMI matrix-induced autologous chondrocyte implantation
  • composition for cartilage regeneration comprising a microstructure attached to the magnetic body and the chondrogenic cells.
  • the chondrogenic cells may be chondrocytes or stem cells
  • the stem cells may be bone marrow-derived stem cells, umbilical cord blood-derived stem cells or adipose-derived stem cells, but is not limited thereto. Cells, embryo-derived stem cells, and the like may also be used.
  • the magnetic body may be magnetic nanoparticles
  • the magnetic nanoparticles may be amine functionalized Fe 3 O 4 nanoparticles
  • the amine functionalization may be achieved by attaching PEI to the magnetic nanoparticles
  • the amine functionalized Fe 3 O 4 nanoparticles may be prepared by covalent bonding of the PEI and the carboxyl group of the microstructure.
  • the microstructures may be biocompatible polymer scaffolds, and the biocompatible polymer scaffolds may be porous scaffolds.
  • biocompatible polymer refers to a biodegradable polymer or a biodegradable polymer that does not cause adverse effects on a living body in vivo, and more preferably, but not limited to, a biodegradable polymer. It is not.
  • the polymer may form a porous structure to form a microstructure
  • the biodegradable polymer may be a natural polymer or a synthetic polymer
  • the natural polymer may be collagen, hyaluronic acid, gelatin, or chitosan
  • the synthesis Polymers include PLGA ⁇ poly (lactic-co-glycolic acid) ⁇ , PGA ⁇ poly (glycolic acid) ⁇ , PLA ⁇ poly (lactic acid) ⁇ , PEG (poyethylene glycol), polyvinyl alcohol (PVA), polyethylene glycol (PEG) ), Poly (N-2-hydroxypropyl methacrylamide), polyhydroxyalkanoic acid (PHA), polycaprolactone (PCL), poly (propylene fumarate), polyanhydride, polyacetal, or carbonate, Poly (ortho ester).
  • the hardly degradable polymer may be polyester, Teflon, PET, nylon, polypropylene, or polystyrene.
  • the porous scaffold can be manufactured by various methods, such as solvent evaporation method, polymerization method, seed swelling method, sinter method, synthesis method, Synthesis metho, Phase separation methods, spray drying methods and melt dispersion methods can be used (Cai et al ., Int . J. Nanomedicine ., 8: 1111-1120, 2013). ).
  • the porous spats were prepared using solvent vaporization.
  • the porous scaffold can be adjusted to 200-800 ⁇ m in diameter, surface and internal pores 20 200 ⁇ m.
  • the three-dimensional culture of the chondrogenic cells may be naturally formed when the target cartilage cells to be cultured in the culture vessel for three-dimensional culture cells having a conical groove not a conventional flat culture vessel.
  • the magnetic body may be uptake into the chondrogenic cells, and may be covalently or non-covalently attached to the surface of the chondrogenic cells or the polymer scaffold. Absorption of a magnetic substance into chondrogenic cells may be naturally achieved by phagocytosis of the chondrogenic cells when the chondrogenic cells are cultured in a medium containing the magnetic substance.
  • the composition for cartilage regeneration An imaging unit for irradiating the cartilage defect site with X-rays to contrast the composition for cartilage regeneration and affected areas; And a magnetic field generating unit for moving the composition for cartilage regeneration to cartilage defects.
  • the magnetic field generating portion may be coiled or worn, and the magnetic field generating portion may be generated by a soft magnet, a permanent magnet, or an electromagnet.
  • the permanent magnet may be ferrite, neodium (neodymium), alico, samarium cobalt (rubber magnet) or rubber magnet (rubber magnet).
  • the chondrogenic cells may be chondrocytes or stem cells
  • the stem cells may be bone marrow-derived stem cells, umbilical cord blood-derived stem cells or fat-derived stem cells.
  • first, second, etc. are used herein to describe various members, parts, regions, layers, and / or parts, these members, parts, regions, layers, and / or parts are defined by these terms. It is obvious that not. These terms are only used to distinguish one member, part, region, layer or portion from another region, layer or portion. Thus, the first member, part, region, layer or portion, which will be discussed below, may refer to the second member, component, region, layer or portion without departing from the teachings of the present invention.
  • top or “above” and “bottom” or “bottom” may be used herein to describe the relationship of certain elements to other elements as illustrated in the figures. It may be understood that relative terms are intended to include other directions of the device in addition to the direction depicted in the figures. For example, if the device is turned over in the figures, elements depicted as present on the face of the top of the other elements are oriented on the face of the bottom of the other elements. Thus, the exemplary term “top” may include both “bottom” and “top” directions depending on the particular direction of the figure. If the device faces in the other direction (rotated 90 degrees relative to the other direction), the relative descriptions used herein can be interpreted accordingly.
  • FIG. 1A schematically illustrates a process of manufacturing a microstructure in which magnetic particles and cartilage regeneration cells are attached according to an embodiment of the present invention.
  • PLGA was selected as a biocompatible polymer to form a WOW emulsion with gelatin beads to produce a PLGA micro-scaffold containing gelatin beads, followed by removal of gelatin to form PLGA micro-scaffolds.
  • the amine-functionalized magnetic nanoparticles with PEI were covalently bound to the PLGA micro-scaffold through an EDC / NHS reaction, and then the mesenchymal stem cells were subjected to stereoculture with the magnetic nano-entry PLGA micro-scaffold.
  • the method is exemplary and the microstructures to which the magnetic nanoparticles and cartilage regeneration cells are attached by attaching the magnetic nanoparticles and the cells for cartilage regeneration to the microstructures prepared by various methods such as electrospinning.
  • the present inventors prepared a PLGA-based microstructure in the same manner as described above.
  • the microstructure manufactured as described above has a spherical shape in which pores of various sizes are formed. It was confirmed to have.
  • the agate structure produced as described above had a diameter of 269.83 ⁇ 10.982 ⁇ m, a surface pore diameter of 37.68 ⁇ 7.55 ⁇ m, and an internal pore diameter of 40.12 ⁇ 7.45 ⁇ m, indicating the condition of the microstructure as a cell carrier. (100-500 ⁇ m in diameter and 20 ⁇ m or more in pore size) were satisfied (see FIGS. 1C-1E).
  • the microstructure attached to the tissue regeneration cells contains a large amount of magnetic material together with the cells for cartilage treatment, so it is much easier to accurately position the affected part of the patient as the ability to respond to the magnetic field and the therapeutic effect is also high. .
  • the cartilage therapeutic agent can be prepared by appropriately controlling the condition of the researcher or the affected area, but for optimal cartilage treatment, 100 ⁇ g / ml of magnetic substance is added to 1 ⁇ 10 5 cells / ml of cartilage regeneration cells. It is preferable to coculture.
  • the cells for cartilage regeneration may be used for stem cells capable of differentiating into chondrocytes or cartilage, and the stem cells may be adipose derived stem cells, umbilical cord blood derived stem cells or bone marrow derived stem cells.
  • Figure 2a is a schematic diagram showing a self-driven articular cartilage regeneration system 100 in accordance with an embodiment of the present invention.
  • an imaging unit 110 for irradiating X-rays to an affected part of a patient is configured at an upper portion thereof, and a detector 115 for detecting the X-rays as an image is configured at an upper portion thereof.
  • the coil-type magnetic field generating unit 150 is composed of eight coil-type electromagnetic field generating mechanism for accurately positioning the magnetic body contained in the cartilage treatment agent administered to the affected part.
  • the self-driven articular cartilage regeneration system 100 obtains three-dimensional images through X-rays in real time through the imaging unit 110 and the detector 115 after administering a cartilage treatment agent to the knee joint of the patient.
  • To determine the exact position of the magnetic body and the affected part included in the cartilage therapeutic agent prepared according to an embodiment of the cartilage treatment agent by accurately adjusting the magnetic field using the coil-type magnetic field generation unit 150 can be located in the cartilage defect site have.
  • each electromagnetic field generating mechanism has an electromagnetic coil in a core made of soft magnets.
  • the magnetic field generating mechanism can adjust the intensity and direction of the magnetic field by using the placement and position control of the external permanent magnet. Therefore, the treatment of articular cartilage can be maximized based on the imaging of the imaging unit 110 and the detector 115.
  • Coil-type magnetic field generating unit 150 of the present invention is characterized by the characteristics of the present invention and is composed of eight coil-type electromagnetic field generating mechanism for the optimal magnetic field generating effect for the treatment of articular cartilage, but also the purpose and location of the affected area The number and shape can be adjusted accordingly. After the treatment area and the location of the cartilage treatment agent by the coil-type magnetic field generating unit 150 are identified, as shown in FIG. 2B, the wearable magnetic field generating device 200 which is not coiled is worn to improve the efficiency of cartilage treatment.
  • Wearable magnetic field generating device 200 is composed of a wearable device 210 for wearing on the knee in consideration of the convenience therein a plurality of permanent to generate a magnetic field for the magnetic body of the cartilage treatment agent administered therein
  • the magnet 250 is configured.
  • the permanent magnet 250 may be ferrite, neodymium, alico, samarium cobalt, or rubber magnet.
  • Cartilage regeneration treatment process using the coil-type magnetic field generation unit 150 according to the administration of cartilage treatment (single cell or cell structure) according to an embodiment of the present invention will be described in detail with reference to FIGS. 3a and 3b.
  • Figure 3a is a block diagram showing a process for treating articular cartilage using the self-driven articular cartilage regeneration system 100 according to an embodiment of the present invention.
  • the cartilage therapeutic agent 130 in the form of a cell structure for cartilage regeneration in the form of a spherical form in which a magnetic material is three-dimensionally coupled to a single cell for cartilage regeneration or a plurality of cartilage regeneration cells in which a magnetic material is coupled to a single cartilage regeneration cell;
  • the patient's affected area is injected through a syringe, and the imaging unit 110 irradiates the X-ray to the affected area, which is implemented by three-dimensional real-time imaging through the detector 115, thereby positioning the administered single cell or cell structure.
  • the coil type magnetic field generating unit 150 is driven based on the photographed three-dimensional real-time imaging to adjust the strength of the magnetic field to move the single cell or cell structure closer to the cartilage defect of the patient.
  • the intensity of the magnetic field of some or all of the generation unit 150 may be adjusted to accurately position the cartilage affected part.
  • the strength of the magnetic field of the coil-type magnetic field generating unit 150 may be generated within about 1000 mT. It is preferable to use the coil-type magnetic field generating unit 150 to adjust the strength of the magnetic field by appropriately treating the cartilage.
  • Figure 3b shows a wearable magnetic field generating mechanism 200 according to an embodiment of the present invention worn on the cartilage defect site.
  • the wearable magnetic field generating mechanism 200 is based on the treatment region identified by controlling the magnetic field direction and the intensity of the coil-type magnetic field generating unit 150 using the magnetic drive joint cartilage regeneration system 100. It is worn to fix the magnetic field generating position with respect to the affected part.
  • the wearable magnetic field generating device 200 may be directly worn by the patient for the affected part without any additional device and may be conveniently carried.
  • the magnetic material contained in the administered cartilage treatment agent single cell or cell structure
  • the permanent magnet 250 configured inside the wearable device 210 is distributed in the most optimized position for treating the cartilage defect site. Therefore, the plurality of permanent magnets 250 installed in the wearable device 210 may be distributed in one place or distributed in consideration of treatment efficiency.
  • FIG. 4 is a schematic diagram illustrating a process of treating a defective cartilage using a self-driven articular cartilage regeneration system 100 according to an embodiment of the present invention.
  • the lesion is extracted and the treatment area is set.
  • the cartilage therapeutic agent combined with the cartilage regeneration cells (stem cells or chondrocytes) and the magnetic substance is administered using a syringe or the like around the treatment area, and the cartilage therapeutic agent in the form of a single cell or cell structure according to the extent and location of the affected part ( 130) can be administered.
  • the coil-type magnetic field generating unit 150 operates based on the real-time image information acquired through the image capturing unit 110 and the detector 115, and controls the direction and intensity of the generated magnetic field in real time. 130 is accurately delivered to the treatment area. Finally, by identifying the distribution in the treatment area of the delivered cartilage treatment 130, it is possible to fix the position and distribution of the permanent magnet 250 of the wearable magnetic field generating mechanism 200 and to increase the efficiency of long-term joint cartilage treatment do.
  • Example 1 PLGA Micro Scaffold Body Fabrication
  • PLGA micro-scaffold bodies were prepared via a double emulsion method using a fluidic device with a slightly modified process.
  • the fluidic device consists of a PVC tube (1/32 in id ⁇ 3/32 in od), a 21G needle and a syringe pump where a two-way flow channels device inserts the needle into the PVC tube. It was produced by.
  • the PLGA solution and the gelatin solution are prepared and then the solution is 100 ml PVA 5%, aqueous gelatin (0.1 g / ml) solution, 1 ml dichloromethane (DCM) / Span80 (100: PLGA (85 mg / ml) was dissolved in 1, v / v) solution and the WO emulsion was gelatin solution (0.55-0.85 ml, 0.1 ml interval, optimized value: 0.65 ml for 2 minutes 30 seconds at 2500 rpm in PLGA solution). ) was prepared by mixing.
  • the W-O emulsion was poured into a 26G needle syringe and inserted into the center of the 21G needle of the fluidic device formed of PVA 1% with a flow rate of 3 ml per minute continuously passing through the PVC tube of the fluidic device.
  • the W-O-W droplets formed in the fluid channel were then introduced along the 21G needle of the fluid device and collected into deionized water in which a 500 ml beaker of the ice bath was located.
  • the dichloromethane in the collected droplets was then evaporated with gentle stirring for 6 hours and, for gelatin removal of the droplets, soaked in deionized water of 37 ° C., 500 ml beaker and gently stirred for 4 hours.
  • the drops were washed three times with deionized water, and the gelatin leached PLGA scaffold body was stored in 25 ml vials of deionized water.
  • the present inventors analyzed the distribution of the diameter of the PLGA micro scaffold manufactured as described above, the size of the outer pores and the size of the inner pores, the result is a diameter of 269.83 ⁇ 10.982 ⁇ m, the diameter of the surface pores 37.68 ⁇ 7.55 It was confirmed that the diameter of the internal pores is 40.12 ⁇ 7.45 ⁇ m, as shown in Figures 1c to 1e, as shown in Figure 1c to 1e, more than 90% of the scaffold has a size of 250 to 290 ⁇ m diameter, 90% or more of the surface voids It was confirmed that a distribution of 23 to 50 ⁇ m was present, and at least 90% of the internal pores exhibited a normal distribution of 25 to 50 ⁇ m.
  • the PLGA micro scaffold of one embodiment of the present invention can be efficient as a cell carrier.
  • the result is to meet the conditions of microstructures as cell carriers (diameter 100-500 ⁇ m and pore size 20 ⁇ m or more) (Choi et al ., J. Mater. Chem. 22: 11442, 2012).
  • amine-functionalized Fe 3 O 4 MNPs were prepared for imparting electromagnetic drive capability to the scaffold body fabricated in Example 1 above.
  • PEI polyethylenimine
  • PEI (10 g) was added to the Fe 3 O 4 solution and the solution was heated to 90 ° C. and maintained for 1 hour.
  • the PEI precipitate coated with MNPs was washed 5 times with deionized water and dispersed in aqueous solution.
  • Coupling using amino bond formation to attach the Fe 3 O 4 MNP-coated PEI prepared in Example 2 to the surface of the PLGA micro-scaffold according to an embodiment of the present invention (coupling) process).
  • the PLGA scaffold was immersed in a 5 ml MES (0.1 M) solution with 1.5 mM NHS (N-hydroxysuccinimide) and EDC (1-Ethyl- (dimethylaminopropyl) carbodiimide) added at 33 ° C. and containing micro-scaffolds.
  • the solution was mechanically stirred for 6 hours to activate carboxyl groups at the surface of the PLGA micro-scaffold.
  • PEI dispersed MNPs (10 mg / ml) in 5 ml MES (0.1 M) was added to the solution and stirred at 33 ° C. for 12 hours. The solution was then filtered to remove unreactive MNPs and the MNPs of the immobilized micro-scaffolds collected in the filter and washed three times with deionized water.
  • MNP magnetic nanoparticles
  • MSC mouse bone marrow-derived mesenchymal stem cells
  • the micro-scaffold into which the mesenchymal stem cells were introduced was cultured at 36 ° C. 5% CO 2 , and the number of cells was measured using a Cell Titer 96 Cell Proliferation Assay Kit (Promega, USA).
  • the present inventors examined the chondrocyte differentiation ability whether the mesenchymal stem cells attached to the micro-scaffold structure into which the mesenchymal stem cells prepared in Example 4 can be differentiated into actual chondrocytes.
  • the present inventors analyzed the expression level of the chondrocyte differentiation-related marker genes Aggrecan (AGG), collagen 2A1 (COL2A1) and SOX9 using qRT-PCR to observe the degree of differentiation of chondrocytes (Fig. 8).
  • the chondrocyte differentiation medium was treated to the magnetic particle-coated micro-scaffold as described above, and after 21 days, the total RNA was extracted using an RNA extraction kit (TaKaRa MiniEST Universial RNA Extraction Kit, Takara, Japan) and reverse transcription.
  • a mold of the PDMS chamber was manufactured by attaching a dumbbell-type structure manufactured using a 3D printer to a glass substrate. Thereafter, the PDMS polymer was prepared by mixing a curing agent and a PDMS precursor in a 10: 1 ratio, cast into a mold, and then using a plasma, a PDMS block was attached to the slide glass, and the prepared chamber had three regions (control, Load and target area) (FIG. 8A).
  • Ten magnetic nanoparticle loading micro-scaffold MSC complexes prepared in Example 4 were then loaded into the loading area of the microfluidic chamber and optical and fluorescence images of the micro-scaffold MSC complexes in the microfluidic chamber were real-time. Observed after positioning on the workbench of the EMA system equipped with an inverted microscope that can be confirmed by.
  • the EMA system uses a magnetic drive system (FIG. 9b) consisting of permanent magnets consisting of four cylindrical neodymium magnets (diameter 10 mm x height 20 mm) with a magnetization value of 955 kA / m. Tested.
  • the micro-scaffold was loaded into a loading zone of a microfluidic chamber of PDMS material containing a glycerin (70 wt%) solution at room temperature, similar to a synovial fluid, and the microfluidic chamber was placed on a workbench of a self-driven A system.
  • the target ability of the self-driven micro-scaffold made in accordance with one embodiment of the present invention to the joint defect site was observed.
  • a knee phantom for 3D targetability test was produced using a 3D printer from a 3D CAD model of the knee (FIG. 10).
  • a hole 3 mm deep and 2 mm in diameter was then formed into the femur into the target area and the model prepared for 3D targetability testing was placed in an acrylic chamber filled with glycerin (70 wt%) solution.
  • Five micro-scaffolds were then injected between the joint defects of the knee model phantom via pipetting and observed movement to the target area.
  • the self-driven articular cartilage regeneration system 100 of the present invention controls the strength of the magnetic field based on real-time image information after administration of a cartilage treatment agent containing a magnetic substance, thereby accurately positioning and fixing the cartilage treatment agent in the affected part.
  • Non-surgical and more effective cartilage treatment can be achieved.
  • Cartilage regeneration composition according to an embodiment of the present invention can be usefully used for the treatment of diseases caused by cartilage damage, such as osteoarthritis.

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Abstract

본 발명은 효율적이고 비수술적으로 관절연골을 재생시키기 위한 자기구동 관절연골 재생 시스템을 제공한다.

Description

자기구동 관절연골 재생 시스템
본 발명은 자기구동 관절연골 재생 시스템에 관한 것으로서, 더 상세하게는 비수술적으로 관절연골을 재생시키기 위해 연골 재생용 조성물, 영상촬영부 및 자계생성부로 이루어진 자기구동 관절연골 재생 시스템에 관한 것이다.
최근 골관절염(osteoarthritis)은 전 세계적으로 65세 이상 인구 중 70% 이상 발병하고 있으며 우리나라 50세 이상 인구 중 24% 이상에서 발병하는 노인에서 가장 흔히 발병하는 질환으로 무릎, 골반, 손끝 관절 등에 호발하여 관절 연골의 결손과 함께 관절 주위의 골 이상을 동반하여 관절기능의 저하 및 상실을 야기한다. 관절은 조직 내 줄기세포와 전구세포의 밀도가 상대적으로 낮고, 혈관이 없어 연골 손상 후 주변으로부터 연골세포의 이동이 제한적이어서 재생력은 다른 조직에 비해 낮다. 연골 손상 시 치유에 관여하는 줄기세포들 또한 기계적 성질이 약한 섬유 연골로 재생되거나 재생 능력이 제한적이다. 이러한 이유로 관절염 등의 관절 연골의 손상 치료법은 초기에 약물 또는 물리치료 등의 보존요법이었으며 증상 호전이 없을 경우 관절경 수술 또는 인공 관절 치환술 등의 치료법에 의한다. 줄기세포를 이용한 관절연골 손상의 재생 치료법의 경우, 생체재료를 이용한 미세골절술, 자가 연골세포 또는 기질기반 연골세포 이식술 등의 수술적 방법에 의한 줄기세포 이식이 이루어지고 있는데 이러한 연골재생을 위한 세포(연골세포, 줄기세포)를 이식하는 기존의 방법은 결손부위를 수술적 방법에 의해 노출시켜 시술하거나 관절 연골 결손부위에 다량의 세포를 정확히 위치시키고 치료기간 동안 그 수를 유지시키는데 문제점을 가지고 있다. 이를 보완하기 위해 줄기세포에 자성입자(magnetic particles)을 삽입하고 이를 외부의 영구자석을 이용하여 원하는 방향으로 조종하여 지향해 주는 방법이 제안되었다(Goki Kamei et al., Am J. Sports Med ., Vol. 41, No. 6, 1255: 1264, 2013).
그러나, 상기 선행기술의 경우, 초전도체를 이용하므로 전력소모에 따른 비용이 많이 들고 결손 부위 내 위치한 세포를 장기간 유지하기 힘든 문제점이 있으며, 줄기세포내에 마그네틱 파티클을 직접 삽입하므로 줄기세포에 작용하여 증식, 분화 등에 영향을 미칠 수 있다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 효율적이고 비수술적으로 관절연골을 재생시키기 위한 자기구동 관절연골 재생 시스템을 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 자성체 및 연골생성 세포의 미세구조체를 포함하는 연골 재생용 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 상기 연골 재생용 조성물; 연골 결손 부위에 X-선을 조사한 후 상기 연골 재생용 조성물 및 환부를 이미징하기 위한 영상촬영부; 및 상기 연골 재생용 조성물을 연골 결손부위로 이동시키는 자계생성부를 포함하는, 자기구동 관절연골 재생 시스템이 제공된다.
상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 일 실시예에 따르면, 자기구동 관절연골 재생 시스템을 이용하여 비수술적이고 효율적인 관절연골 재생효과를 구현할 수 있다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
도 1a는 본 발명의 일 실시예에 따른 연골재생용 미세구조체의 제조공정을 나타내는 개요도이고, 도 1b는 상기 제조공정을 통해 제조된 미세구조체를 주사전자현미경으로 촬영한 사진(상단은 눈금단위 500 ㎛, 하단은 눈금단위 200 ㎛)이며, 도 1c는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 연골재생용 미세구조체의 직경의 분포를 나타내는 히스토그램이고, 도 1d는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 연골재생용 미세구조체의 표면 공극의 크기의 분포를 나타내는 히스토그램이며, 도 1e는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 연골재생용 미세구조체의 내부 공극의 크기의 분포를 나타내는 히스토그램이다.
도 2a는 본 발명의 일 실시예에 따른 코일형 자계생성부를 포함하는 자기구동 관절연골 재생 시스템을 개략적으로 나타낸 구성도이고, 도 2b는 본 발명의 일 실시예에 따른 착용형 자계 생성기구를 포함하는 착용형 자기구동 관절연골 재생장치를 개략적으로 나타낸 구성도이다.
도 3a는 본 발명의 일 실시예에 따른 자기구동 관절연골 재생 시스템(100)을 이용한 관절연골 치료과정을 나타내는 구성도이고, 도 3b는 본 발명의 일 실시예에 따른 착용형 자계 생성기구를 연골 결손부위에 착용한 모습을 나타내는 개요도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 연골치료제, 코일형 전자계 생성장치 및 착용형 자계 생성장치를 이용하여 환부를 치료하는 과정을 나타내는 개요도이다.
도 5a는 본 발명의 일 실시예에 따른 줄기세포를 담지한 자성 나노입자 코팅 마이크로-스캐폴드의 공초점 레이저 현미경 사진이고(하단은 상단을 확대한 사진임), 도 5b는 상기 줄기세포를 담지한 마이크로-스캐폴드 내의 줄기세포 증식력을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6는 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로-스캐폴드 내부의 줄기세포의 모습을 나타낸 공초점 레이저 현미경 사진이다.
도 7a는 PLGA 마이크로-스캐폴드를 광학현미경을 촬영한 사진이고, 도 7b는 상기 도 7a의 중간엽 줄기세포가 적재된 PLGA 마이크로-스캐폴드를 연골세포 분화용 배지에 넣고 21일 경과 후 Acian blue로 염색한 후 광학현미경으로 촬영한 사진이며, 도 7c는 본 발명의 일 실시예에 따른 자성 나노입자 코팅 PLGA 마이크로-스캐폴드를 광학현미경으로 촬영한 사진이고, 도 7d는 도 7c의 중간엽 줄기세포가 적재된 자성 나노입자 코팅 PLGA 마이크로-스캐폴드를 연골세포 분화용 배지에 넣고 21일 경과 후 Alcian Blue로 염석하여 광학현미경으로 촬영한 사진이며, 도 7e는 상기 도 7d의 연골세포 분화유도 후의 자성 나노입자 코팅 PLGA 마이크로-스캐폴드를 절편화한 후 Alcian Blue로 염색하여 광학현미경으로 촬영한 사진이고, 도 7f는 상기 도 7e의 일부를 확대한 사진이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로-스캐폴드 내에서 배양된 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도 이후 연골세포 분화 관련 표지인자(AGG, COL2A1 및 SOX-9)의 미분화 대조군 대비 상대적 발현정도를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 9a는 본 발명의 일 실시예에 따른 2D 표적능 테스트를 수행하여 표적영역에 대해 마이크로-스캐폴드의 자기구동 능력을 측정한 현미경 사진이고, 도 9b는 본 발명의 마이크로-스캐폴드 중간엽 줄기세포 복합체의 자기구동에 사용된 자기구동(EMA) 시스템을 촬영한 사진이며, 도 9c는 본 발명의 일 실시예에 따른 2D 표적능 테스트를 수행하여 표적영역에 대해 마이크로-스캐폴드의 자기구동 능력을 측정한 사진이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 3D 표적능 테스트를 위한 무릎 팬텀 모델을 도시하는 그림이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 무릎 팬텀을 이용한 3D 표적능 테스트에서 마이크로-스캐폴드의 표적능이 가능성을 나타내는 사진이다.
용어의 정의:
본 문서에서 사용되는 용어 "골관절염(osteoarthritis)"은 퇴행성관절염이라고도 하며 국소적인 관절에 점진적인 관절 연골의 소실 및 그와 관련된 이차적인 변화와 증상을 동반하는 질환으로 관절을 보호하고 있는 연골의 점진적인 손상이나 퇴행성 변화로 인해 관절을 이루는 뼈와 인대 등에 손상이 일어나서 염증과 통증이 생기는 질환이다.
본 문서에서 사용되는 용어 "자계(magnetic field)"는 자장 또는 자기장이라고도 하며 자기력선(lines of magnetic force)이 펼쳐진 공간 즉 전류나 자석의 주위, 지구의 표면 등과 같이 자기작용이 영향을 미치는 공간을 말한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "생체재료를 이용한 미세골절술"은 단기임상에 적합했던 미세골절술을 개선한 방법으로 손상부위에 골수 줄기세포(bone merrow mesenchymal stem cells)를 새어 나오게 한 후 콜라겐으로 손상부위를 봉합하는 AMIC(autologous matrix-induced chondrogenesis) 또는 겔 형태의 생체재료를 이용해 줄기세포를 결손부위에 고정하는 ACIC(autologous collagen induced chondrogenesis)를 의미한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "연골세포 이식술" 연골 결손부위를 콜라겐 또는 골막으로 막고 체외 배양한 자가 연골세포를 이식하여 연골재생을 유도하는 자가 연골세포 이식술(autologous chondrocyte implantation, ACI)과 막의 적용이 어려운 국소부위에 생체재료에 자가 연골세포를 포함하여 이식하는 기질 기반 연골세포 이식술(matrix-induced autologous chondrocyte implantation, MACI)을 의미한다.
발명의 상세한 설명:
본 발명의 일 관점에 따르면, 자성체 및 연골생성 세포가 부착된 미세구조체를 포함하는 연골 재생용 조성물이 제공된다.
상기 조성물에 있어서, 상기 연골생성 세포는 연골세포 또는 줄기세포일 수 있고, 상기 줄기세포는 골수 유래 줄기세포, 제대혈 유래 줄기세포 또는 지방 유래 줄기세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 역분화 줄기세포 및 배아 유래 줄기세포 등도 사용될 수도 있다.
상기 조성물에 있어서, 상기 자성체는 자성나노입자일 수 있고, 상기 자성나노입자는 아민 기능화 Fe3O4 나노입자일 수 있으며, 상기 아민 기능화는 상기 자성나노입자에 PEI를 부착킴으로써 달성될 수 있고, 상기 아민 기능화 Fe3O4 나노입자는 상기 PEI와 상기 미세구조체의 카르복실기와의 공유결합에 의해 제조될 수 있다.
상기 조성물에 있어서, 상기 미세구조체는 생적합성 폴리머 스캐폴드일 수 있고, 상기 생적합성 폴리머 스캐폴드는 다공성 스캐폴드일 수 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 “생적합성 폴리머”는 생분해성 폴리머 또는 난분해성 폴리머 중 생체 내에서 생체에 대하여 부작용을 유발하지 않는 생체적합성을 갖는 폴리머를 의미하며, 생분해성 폴리머가 더욱 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 폴리머는 미세구조체 형성을 위해 다공성의 구조체를 형성할 수 있고, 상기 생분해성 폴리머는 천연 폴리머 또는 합성 폴리머일 수 있는데, 상기 천연 폴리머는 콜라겐, 히알루론산, 젤라틴, 또는 키토산일 수 있고, 상기 합성 폴리머는 PLGA{poly(lactic-co-glycolic acid)}, PGA{poly(glycolic acid)}, PLA{poly(lactic acid)}, PEG(poyethylene glycol), 폴리비닐알코올(PVA), 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리(N-2-하이드록시프로필 메타크릴아마이드), 폴리하이드록시알카논산(PHA), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리(프로필렌 푸마레이트), 폴리안하라이드, 폴리아세탈, 또는 보네이트, 폴리(오르쏘 에스터)일 수 있다. 상기 난분해성 폴리머는 폴리에스터, 테플론, PET, 나일론, 폴리프로필렌, 또는 폴리스티렌일 수 있다.
상기 다공성 스캐폴드는 다양한 방법을 통해 제조가 가능한데, 용매 기화법(solvent evaporation method), 중합 방법(polymerization method), 시드 팽창 방법(seed swelling method), 소결법(sinter method), 합성법(Synthesis metho), 상분리 방법(phase separation method), 분무건조 방법(spray drying method) 및 용융분산 방법(melt dispersion method) 등이 사용될 수 있다(Cai et al., Int . J. Nanomedicine., 8: 1111-1120, 2013). 본 발명의 일 실시예에서 상기 다공성 스패폴드는 용매 기화법을 이용하여 제조되었다.
상기 다공성 스캐폴드는 직경 200-800 ㎛, 표면 및 내부 공극 20 200 ㎛으로 조절될 수 있다.
상기 조성물에 있어서, 상기 연골생성 세포의 3차원적 배양체는 통상의 평판 배양용기가 아닌 원추형 홈을 가진 세포 3차원 배양용 배양용기에서 배양 대상 연골생성 세포를 배양할 경우 자연스럽게 형성될 수 있다.
상기 조성물에 있어서, 상기 자성체는 연골생성 세포 내로 흡수(uptake)될 수 있고, 상기 연골생성 세포의 표면 또는 상기 폴리머 스캐폴드에 공유결합 또는 비공유결합에 의해 부착된 것일 수 있다. 연골생성 세포 내로 자성체의 흡수는 상기 연골생성 세포를 상기 자성체를 함유된 배지에서 배양 시 상기 연골생성 세포의 탐식작용(phagocytosis)에 의해 자연스럽게 이루어질 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 연골 재생용 조성물; 연골 결손 부위에 X-선을 조사한 후 상기 연골 재생용 조성물 및 환부를 조영하기 위한 영상촬영부; 및 상기 연골 재생용 조성물을 연골 결손부위로 이동시키는 자계생성부를 포함하는, 자기구동 관절연골 재생 시스템이 제공된다.
상기 자기구동 관절연골 재생 시스템에 있어서, 상기 자계생성부는 코일형 또는 착용형일 수 있고, 상기 자기생성부의 자계 생성은 연자석(soft magnet), 영구자석, 또는 전자석에 의한 것일 수 있다. 이 때, 상기 영구자석은 페라이트(ferrite), 네오듐(neodymium), 알리코, 사마륨코발트(samarium cobalt) 또는 고무자석(rubber magnet)일 수 있다.
상기 자기구동 관절연골 재생 시스템에 있어서, 상기 연골생성 세포는 연골세포 또는 줄기세포일 수 있고, 상기 줄기세포는 골수 유래 줄기세포, 제대혈 유래 줄기세포 또는 지방 유래 줄기세포일 수 있다.
본 발명의 실시예들은 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위하여 제공되는 것이며, 하기 실시예는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 오히려 이들 실시예들은 본 개시를 더욱 충실하고 완전하게 하고, 당업자에게 본 발명의 사상을 완전하게 전달하기 위하여 제공되는 것이다. 또한, 도면에서 각 층의 두께나 크기는 설명의 편의 및 명확성을 위하여 과장된 것이다.
명세서 전체에 걸쳐서, 막, 영역 또는 기판과 같은 하나의 구성요소가 다른 구성요소 "상에", "연결되어", “적층되어” 또는 "커플링되어" 위치한다고 언급할 때는, 상기 하나의 구성요소가 직접적으로 다른 구성요소 "상에", "연결되어", “적층되어” 또는 "커플링되어" 접촉하거나, 그 사이에 개재되는 또 다른 구성요소들이 존재할 수 있다고 해석될 수 있다. 반면에, 하나의 구성요소가 다른 구성요소 "직접적으로 상에", "직접 연결되어", 또는 "직접 커플링되어" 위치한다고 언급할 때는, 그 사이에 개재되는 다른 구성요소들이 존재하지 않는다고 해석된다. 균일한 부호는 균일한 요소를 지칭한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "및/또는"은 해당 열거된 항목 중 어느 하나 및 하나 이상의 모든 조합을 포함한다.
본 명세서에서 제 1, 제 2 등의 용어가 다양한 부재, 부품, 영역, 층들 및/또는 부분들을 설명하기 위하여 사용되지만, 이들 부재, 부품, 영역, 층들 및/또는 부분들은 이들 용어에 의해 한정되어서는 안됨은 자명하다. 이들 용어는 하나의 부재, 부품, 영역, 층 또는 부분을 다른 영역, 층 또는 부분과 구별하기 위하여만 사용된다. 따라서, 이하 상술할 제 1 부재, 부품, 영역, 층 또는 부분은 본 발명의 가르침으로부터 벗어나지 않고서도 제 2 부재, 부품, 영역, 층 또는 부분을 지칭할 수 있다.
또한, "상의" 또는 "위의" 및 "하의" 또는 "아래의"와 같은 상대적인 용어들은 도면들에서 도해되는 것처럼 다른 요소들에 대한 어떤 요소들의 관계를 기술하기 위해 여기에서 사용될 수 있다. 상대적 용어들은 도면들에서 묘사되는 방향에 추가하여 소자의 다른 방향들을 포함하는 것을 의도한다고 이해될 수 있다. 예를 들어, 도면들에서 소자가 뒤집어 진다면(turned over), 다른 요소들의 상부의 면 상에 존재하는 것으로 묘사되는 요소들은 상기 다른 요소들의 하부의 면 상에 방향을 가지게 된다. 그러므로, 예로써 든 "상의"라는 용어는, 도면의 특정한 방향에 의존하여 "하의" 및 "상의" 방향 모두를 포함할 수 있다. 소자가 다른 방향으로 향한다면(다른 방향에 대하여 90도 회전), 본 명세서에 사용되는 상대적인 설명들은 이에 따라 해석될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어는 특정 실시예를 설명하기 위하여 사용되며, 본 발명을 제한하기 위한 것이 아니다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥상 다른 경우를 분명히 지적하는 것이 아니라면, 복수의 형태를 포함할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 경우 "포함한다(comprise)" 및/또는 "포함하는(comprising)"은 언급한 형상들, 숫자, 단계, 동작, 부재, 요소 및/또는 이들 그룹의 존재를 특정하는 것이며, 하나 이상의 다른 형상, 숫자, 동작, 부재, 요소 및/또는 그룹들의 존재 또는 부가를 배제하는 것이 아니다.
이하, 본 발명의 실시예들은 본 발명의 이상적인 실시예들을 개략적으로 도시하는 도면들을 참조하여 설명한다. 도면들에 있어서, 예를 들면, 제조 기술 및/또는 공차(tolerance)에 따라, 도시된 형상의 변형들이 예상될 수 있다. 따라서, 본 발명 사상의 실시예는 본 명세서에 도시된 영역의 특정 형상에 제한된 것으로 해석되어서는 아니 되며, 예를 들면 제조상 초래되는 형상의 변화를 포함하여야 한다.
도 1a는 본 발명의 일 실시예에 따른 자성체(magnetic particles) 및 연골재생용 세포가 부착된 미세구조체를 제조하는 과정을 개략적으로 나타내고 있다. 도 1a에 도시한 바와 같이, 생체적합성 폴리머로 PLGA를 선택하여 젤라틴 비드와 함께 W-O-W 에멀젼을 형성시켜 젤라틴 비드가 함입된 PLGA 마이크로-스캐폴드를 제조한 후, 젤라틴을 제거함으로써 PLGA 마이크로-스캐폴드를 제조한 후, PEI으로 아민기능화된 자성 나노입자를 EDC/NHS 반응을 통해 상기 PLGA 마이크로-스캐폴드와 공유결합시킨 후, 중간엽 줄기세포를 상기 자성 나노입장 부착 PLGA 마이크로-스캐폴드와 함께 입체배양함으로써 상기 PLGA-마이크로-스캐폴드 내의 공극에 세포가 부착된 형태의 자성체 및 연골재생용 세포가 부착된 미세구조체를 제조할 수 있다. 그러나, 상기 방법은 예시적인 것으로서 다른 다양한 방식, 예컨대 전기방사 등의 방식을 통해 제조된 마이크로 구조체에 자성 나노입자 및 연골재생용 세포를 부착시킴으로써 상기 자성 나노입자 및 연골재생용 세포가 부착된 미세구조체를 제조할 수 있다. 본 발명자들은 상기와 같은 방법으로 PLGA 기반의 미세구조체를 제조하였으며, 이에 대하여 주사전자현미경 촬영을 한 결과, 도 1b에 나타난 바와 같이 상기와 같이 제조된 미세구조체는 다양한 크기의 공극이 형성된 구 형상을 갖는 것으로 확인되었다. 뿐만 아니라, 상기와 같이 생성된 마세구조체는 직경이 269.83±10.982 ㎛이고, 표면 공극의 직경은 37.68±7.55 ㎛였으며, 내부 공극의 직경은 40.12±7.45 ㎛인 것으로 나타나, 세포 운반체로서의 미세구조체의 조건(직경 100 내지 500 ㎛ 및 공극 크기 20 ㎛ 이상)을 충족하였다(도 1c 내지 1e 참조). 상기 조직재생용 세포가 부착된 미세구조체는 연골치료용 세포와 더불어 많은 양의 자성체를 포함하고 있으므로 자기장에 반응하는 능력이 뛰어남에 따라 환자의 환부에 정확하게 위치시키는 것이 훨씬 더 용이하며 치료 효과 또한 높다.
상기 연골치료제를 제조는 연구자의 목적 또는 환부의 상태에 따라 적절히 조절하여 제조하는 것이 가능하나 최적의 연골치료를 위해서는 1×105 cells/ml의 연골재생용 세포에 100 ㎍/ml의 자성체를 첨가하여 공배양하는 것이 바람직하다. 이때 상기 연골재생용 세포는 연골세포 또는 연골로 분화할 수 있는 줄기세포를 사용할 수 있고 상기 줄기세포는 지방 유래 줄기세포, 제대혈 유래 줄기세포 또는 골수 유래 줄기세포를 사용할 수 있다.
도 2a는 본 발명의 일 실시예에 따른 자기구동 관절연골 재생 시스템(100)을 개략적으로 나타낸 구성도이다. 도 2a에 도시된 바와 같이, 상부에는 X-선을 환자의 환부에 조사하는 영상촬영부(110)가 구성되어 있고 하부에는 상기 X-선을 이미지로 검출하는 검출기(115)가 구성되어 있으며 중앙부에는 환부에 투여된 연골치료제에 포함된 자성체를 환부에 정확하게 위치시키기 위한 8개의 코일형 전자계 생성기구로 구성된 코일형 자계생성부(150)이 구성되어 있다. 자기구동 관절연골 재생 시스템(100)은 환자의 무릎관절에 연골치료제를 투여한 후 영상촬영부(110) 및 검출기(115)를 통하여 실시간으로 X-선을 통해 3차원 이미지를 획득함에 따라서 본 발명의 일 실시예에 따라 제조한 연골치료제에 포함된 자성체의 위치와 환부의 정확한 위치를 파악하고 코일형 자계생성부(150)을 이용한 자기장 조절을 통해 상기 연골치료제를 연골 결손부위에 정확하게 위치시킬 수 있다. 종래 보다 정확하게 자성체가 포함된 연골치료제를 환부로 위치시키기 위하여 높은 세기의 자계를 생성하는 것이 중요한데 이를 위해서 각각의 전자계 생성기구는 연자석(soft magnet)으로 이루어진 코어(core)에 전자기 코일(coil)이 둘러싼 형태인 코일형으로 구성되어 있어 자계의 세기가 높고 자계의 세기와 방향을 자유자재로 조정 할 수 있다. 또한, 이러한 자계생성 기구는 외부의 영구자석(permanent magnet)의 배치와 위치조절을 이용하여 자계의 세기와 방향을 조정할 수 있다. 따라서 영상촬영부(110) 및 검출기(115)의 이미징을 바탕으로 관절연골의 치료를 극대화할 수 있다.
본 발명의 코일형 자계생성부(150)은 본 발명의 특징을 나타내고 관절연골 치료를 위한 최적의 자계생성 효과를 위해서 8개의 코일형 전자계 생성기구로 구성되어 있으나 이 또한, 연구자의 목적 및 환부의 위치에 따라 그 수와 형태가 적절히 조절될 수 있다. 코일형 자계생성부(150)에 의한 연골치료제의 치료영역 및 위치가 파악되고 난 후 도 2b에 도시한 바와 같이, 코일형이 아닌 착용형 자계 생성기구(200)를 착용하여 연골치료의 효율성을 도모하게 되는데 착용형 자계 생성기구(200)는 편의성을 고려하여 무릎에 착용하기 위한 착용형 기구(210)로 구성되어 있고 그 내부에는 투여된 연골치료제의 자성체에 대하여 자계를 생성하기 위한 복수의 영구자석(250)이 구성되어 있다. 이때 영구자석(250)은 페라이트(ferrite), 네오듐(neodymium), 알리코, 사마륨코발트(samarium cobalt) 또는 고무자석(rubber magnet)일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 연골치료제(단일세포 또는 세포구조체) 투여에 따른 코일형 자계생성부(150)을 이용한 연골재생 치료과정은 도 3a 및 3b에서 상세히 설명하기로 한다.
도 3a는 본 발명의 일 실시예에 따른 자기구동 관절연골 재생 시스템(100)을 이용한 관절연골 치료과정을 나타내는 구성도이다. 먼저, 단일 연골재생용 세포에 자성체가 결합된 연골재생용 단일세포 또는 복수의 연골재생용 세포에 자성체가 입체적으로 결합된 구(spheroid) 형태의 연골재생용 세포구조체 형태의 연골치료제(130)를 환자의 환부에 주사기를 통해 투여하고 영상촬영부(110)는 환부에 X-선을 조사하고 이는 검출기(115)를 통해 3차원 실시간 이미징으로 구현됨에 따라서 상기 투여된 단일세포 또는 세포구조체의 위치를 파악할 수 있게 된다. 이때 상기 촬영된 3차원 실시간 이미징을 바탕으로 코일형 자계생성부(150)을 구동하여 상기 단일세포 또는 세포구조체를 환자의 연골 결손부위에 가까이 이동하도록 자계의 세기를 조정하는데 각 8개의 코일형 자계생성부(150)의 일부 또는 전부의 자계의 세기를 조정하여 연골 환부에 정밀하게 위치시킬 수 있다. 상기 코일형 자계생성부(150)의 자계의 세기는 약 1000 mT 이내로 생성될 수 있는데 이를 이용하여 적절한 연골치료에 활용하여 자기의 세기를 조절하는 것이 바람직하다.
또한, 도 3b는 본 발명의 일 실시예에 따른 착용형 자계 생성기구(200)를 연골 결손부위에 착용한 모습을 나타내고 있다. 상술한 바와 같이, 착용형 자계 생성기구(200)는 앞서 자기구동 관절연골 재생 시스템(100)을 이용하여 코일형 자계생성부(150)의 자기장 방향 및 세기를 제어함에 따라 파악된 치료영역을 기초로 하여 환부에 대한 자계 생성위치를 고정하기 위하여 착용한다. 착용형 자계 생성기구(200)는 별도의 추가적인 장치 없이 환부에 대해 환자가 직접 착용이 가능하며 간편하게 휴대할 수도 있다. 투여한 연골치료제(단일세포 또는 세포구조체)에 포함된 자성체는 착용형 기구(210) 내부에 구성된 영구자석(250)은 연골 결손부위 치료를 위해 가장 최적화된 위치에 분포하게 된다. 따라서 착용형 기구(210) 내부에 설치되는 복수의 영구자석(250)은 치료의 효율성을 고려하여 환부 한곳에 집중적으로 분포할 수 도 있고 분산하여 분포할 수 도 있다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 자기구동 관절연골 재생 시스템(100)을 이용하여 결손연골을 치료하는 과정을 나타내는 개요도이다. 도시한 바와 같이, 먼저, 수술 전 획득된 환자의 관절 환부의 3D 영상(예컨대 CT, MRI 등)을 분석한 후 환부를 추출하고 치료영역을 설정한다. 이후, 연골재생용 세포(줄기세포 또는 연골세포)와 자성체가 결합된 연골치료제를 치료영역 근접 주위에 주사기 등을 이용하여 투여하는데 환부의 정도와 위치에 따라 단일세포 또는 세포구조체 형태의 연골치료제(130)가 투여될 수 있다. 이어서 영상촬영부(110) 및 검출기(115)를 통해서 획득한 실시간 영상정보를 기초로 하여 코일형 자계생성부(150)가 작동하게 되고 생성된 자기장의 방향 및 세기를 실시간으로 제어하여 상기 연골치료제(130)를 치료영역으로 정확하게 전달하게 된다. 마지막으로 상기 전달된 연골치료제(130)의 치료 영역 내 분포를 파악하여 착용형 자계 생성기구(200)의 영구자석(250)의 위치 및 분포를 고정하게 되고 장기간 관절 연골 치료의 효율을 높일 수 있게 된다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1: PLGA 마이크로 스캐폴드 바디 제작
본 발명의 일 실시예에 따라 PLGA 마이크로-스캐폴드 바디(micro-scaffold body)는 약간 변형된 프로세스를 가진 유체장치(fluidic device)를 이용한 이중 에멀전(double emulsion) 방법을 통하여 준비하였다.
구체적으로, 유체 장치는 PVC 튜브(1/32 in i.d. × 3/32 in o.d.), 21G 니들 및 시린지 펌프로 구성되어 있는데 양방향 흐름 채널(two-way flow channels) 장치는 상기 PVC 튜브에 니들을 삽입하여 제작하였다. 먼저, W-O 에멀전(emulsion)을 위해, PLGA 용액 및 젤라틴 용액을 준비한 후 상기 용액은 각각 100 ml PVA 5%, 수성 젤라틴(0.1 g/ml) 용액, 1 ml 디클로로메탄(DCM)/Span80(100:1, v/v) 용액에서 PLGA(85 mg/ml)를 용해하였고 W-O 에멀전은 PLGA 용액에서 2500 rpm으로 2분 30초 동안 젤라틴 용액(0.55-0.85 ml, 0.1 ml 인터벌, 최적화된 값: 0.65 ml)을 혼합하여 제조하였다. W-O 에멀전은 26G 니들 주사기에 붓고 이를 유체장치의 PVC 튜브를 통하여 연속적으로 분당 3 ml을 통과시키는 유량(flow rate)을 가진 PVA 1%로 형성된 유체장치의 21G 니들의 중앙에 삽입하였다. 그 후, 유체 채널에서 형성된 W-O-W 방울(droplets)은 유체 장치의 21G 니들을 따라 유입되었고 냉수조(ice bath)의 500 ml 비커가 위치한 탈 이온수(deionized water)로 수집되었다. 이어서 상기 수집된 방울내의 디클로로메탄은 6시간 동안 부드럽게 교반하면서 증발시켰고 방울의 젤라틴 제거를 위해, 37℃, 500 ml 비커의 탈 이온수(deionized water)에 침지하였으며 4시간동안 부드럽게 교반하였다. 마지막으로 상기 방울을 탈 이온수로 3회 세척한 후, 젤라틴이 침출된 PLGA 스캐폴드 바디를 25 ml 바이알의 탈 이온수에 보관하였다.
상기에서 제조된 PLGA 마이크로 스캐폴드를 주사전자현미경을 촬영한 결과, 도 1b에서 확인되는 바와 같이, 복수의 다양한 공극히 형성된 구체의 형상의 마이크로 스캐폴드가 정상적으로 형성되었음을 확인할 수 있었다.
아울러, 본 발명자들은 상기와 같이 제조된 PLGA 마이크로 스캐폴드의 직경,외부 공극의 크기 및 내부 공극의 크기의 분포를 분석하였는데, 그 결과 직경이 269.83±10.982 ㎛이고, 표면 공극의 직경은 37.68±7.55 ㎛였으며, 내부 공극의 직경은 40.12±7.45 ㎛인 것임을 확인하였고, 도 1c 내지 1e 나타난 바와 같이, 스캐폴드의 90% 이상이 직경 250 내지 290 ㎛의 크기를 갖고, 표면 공극의 90% 이상의 크기가 23 내지 50 ㎛의 분포를 나타내며, 내부 공극의 90% 이상의 크기가 25 내지 50 ㎛인 정규분포 양상을 나타냄을 확인하였다. 이러한 비교적 균일한 직경 및 표면 및 내부 공극의 크기의 분포는 본 발명의 일 실시예의 PLGA 마이크로 스캐폴드가 세포운반체로 효율적일 수 있음을 보여주는 것이다. 실제 상기 결과는 세포 운반체로서의 미세구조체의 조건(직경 100 내지 500 ㎛ 및 공극 크기 20 ㎛ 이상)을 충족하는 것이다(Choi et al., J. Mater. Chem. 22: 11442, 2012).
실시예 2: 아민 기능화 자성 나노입자의 준비
본 발명의 일 실시예에 따라 상기 실시예 1에서 제작된 스캐폴드 바디에 전자기 구동 능력을 부여하기 위한 아민 기능화 Fe3O4 MNPs를 제조하였다.
구체적으로, 아민기(amine group)를 가진 생체적합성 재료 중에서 양성자 스폰지 효과(proton sponge effect)에 의해 고효율로 유전자 전달을 위한 MNPs 표면을 수정하기 위해 PEI(polyethylenimine)를 선택하였다. 먼저, 10 mM 염화제2철 및 5 mM 염화제1철은 12 ml 염산(1 M) 용액에 용해시킨 후 상기 혼합 용액을 기계식 교반기를 갖춘 4개-목을 가진 둥근바닥 플라스크에서 50 ml 나트륨(1 M) 용액에 첨가하였다. 상기 반응 용액은 건조 질소하에서 80℃로 가열하고 2시간동안 격렬하게 교반하였고 상기 단계에서 Fe3O4 MNPs를 형성하였고 플라스크 바닥에서 침전하였다. 그 후, PEI(10 g)를 Fe3O4 용액에 첨가하였고 상기 용액을 90℃로 가열하였으며 1시간동안 유지하였다. 상기 MNPs로 코팅된 PEI 침전물은 탈이온수로 5회 동안 세척하였고 수용액에서 분산시켰다.
실시예 3: 자성 나노입자가 부착된 마이크로-스캐폴드의 제작
본 발명의 일 실시예에 따라 PLGA 마이크로-스캐폴드의 표면에 상기 실시예 2에 제작된 Fe3O4 MNP가 코팅된 PEI를 부착하기 위하여 아미노 결합 형성(amino bond formation)을 이용한 결합 공정(coupling process)을 이용하였다. 먼저, PLGA 스캐폴드는 33℃에서 1.5 mM NHS(N-hydroxysuccinimide) 및 EDC(1-Ethyl-(dimethylaminopropyl)carbodiimide)가 첨가된 5 ml MES (0.1 M) 용액에 침지하였고 마이크로-스캐폴드를 포함하는 용액은 PLGA 마이크로-스캐폴드의 표면에서 카복실기(carboxyl groups)를 활성화하기 위해 6시간동안 기계적으로 교반하였다. 마이크로-스캐폴드 표면의 활성 후에 5 ml MES(0.1 M)에서 변형된 MNPs(10 mg/ml)가 분산된 PEI를 상기 용액에 첨가하였고 33℃에서 12시간 동안 교반하였다. 그 후, 상기 용액은 무반응(unreactive) MNPs를 제거하기 위해 여과하였고 필터에서 고정화된 마이크로-스캐폴드의 MNPs를 수집하였고 탈이온수로 3회 세척하였다.
실시예 4: 줄기세포 적재된 마이크로-스캐폴드의 제작 및 배양
10% FBS 포함 DMEM 배지 내에 상기 실시예 3에서 제조된 자성 나노입자(MNP)가 부착된 마이크로-스캐폴드를 침지시킨 후, 현미경 하에서 마우스 골수유래 중간엽 줄기세포(MSC) 1×106 cells/scaffold를 상기 마이크로-스캐폴드 위에 주입한 후, 5% CO2 배양기에 37℃에서 배양하였고 매 2일마다 배양액을 교체하여, 상기 마이크로-스캐폴드 내에 상기 중간엽 줄기세포를 정착시켰다. 이 때, 대조군으로 자성 나노입자가 부착되지 않은 마이크로-스캐폴드에 동일한 농도의 중간엽 줄기세포를 주입하였다.
상기와 같이 중간엽 줄기세포가 도입된 마이크로-스캐폴드를 36℃ 5% CO2 조건에서 배양하면서 세포의 수를 Cell Titer 96 Cell Proliferation Assay 키트(Promega, USA)로 측정하였다.
그 결과 도 5a 및 5b에 나타난 것과 같이, 자성 나노입자를 도입하거나 도입하지 않은 마이크로-스캐폴드 모두 중간엽 줄기세포가 정상적으로 성장함을 확인할 수 있었으며, 현미경의 배율을 더 확대하여 상기 마이크로-스캐폴드의 상세 구조를 확인한 결과, 도 6에서 나타난 바와 같이, 상기 마이크로-스캐폴드 내부의 공극(pore)까지 줄기세포가 침투해 있음을 확인할 수 있었다. 흥미로운 점은 배양 초기인 3일째에는 자성 나노입자를 도입한 마이크로-스캐폴드에서의 중간엽 줄기세포의 성장률이 대조군인 일반 PLGA 마이크로-스캐폴드에서 배양시킨 경우보다 더 높음을 알 수 있었다.
실시예 5: 줄기세포 분화능 확인 실험
본 발명자들은 상기 실시예 4에서 제조된 중간엽 줄기세포가 도입된 마이크로-스캐폴드 구조체에 부착된 중간엽 줄기세포가 실제 연골세포로 분화될 수 있는지 연골세포 분화능을 조사하였다.
구체적으로, 상기 실시예 4에서 제조된 중간엽 줄기세포가 도입된 자성 나노입자 코팅 마이크로-스캐폴드 구조체가 담겨 있는 배양접시에 4.5 g/L 포도당, 1% ITS(insulin 25 ㎍/mL, transferrin 25 ㎍/mL, 및 sodium selenite 25 ng/mL), 0.1×10-6 M dexamethasone, 50 ㎍/mL L-ascorbic acid-2-phophosphate, 및 10 ㎍/mL TGF-β1을 포함하는 DMEM 배지로 구성된 연골세포 분화용 배지(StemPro Chondrocyte Differentiation Kit, Thermo Fisher Scientific, USA)를 처리하고, 21일 경과 후, Alcian Blue를 이용한 염색을 수행하여 연골세포로의 분화정도를 관찰하였고, 일부 마이크로-스캐폴드는 동결절편화한 후, Alcian Blue로 염색하였다.
그 결과, 도 7a 내지 7f에서 나타난 바와 같이, 마이크로-스캐폴드 내에 정착된 골수유래 중간엽 줄기세포가 연골세포 분화하였음을 확인할 수 있었다.
아울러, 본 발명자들은 연골세포의 분화정도를 관찰하기 위해 연골세포 분화 관련 표지유전자인 Aggrecan(AGG), 콜라겐2A1(COL2A1) 및 SOX9의 발현정도를 qRT-PCR을 이용하여 분석하였다(도 8). 구체적으로 상기와 같이 자성입자 코팅 마이크로-스캐폴드에 연골세포 분화용 배지를 처리하고 21일 경과 후 총 RNA를 RNA 추출키트(TaKaRa MiniEST Universial RNA Extraction Kit, Takara, Japan)를 이용하여 추출하고, 역전사 반응 키트(PrimeScript Master Mix, Takara, Japan)로 역전사 반응을 수행한 후, 5X FIREPol, EvaGreen 및 qPCR Supermix(Solis BioDyne, Estonia)를 이용하여 qRT-PCR 반응을 수행하였다. 그 결과, 도 8에서 나타난 바와 같이, 분화를 유도하지 않은 대조군 대비 분화유도 자성 나노입자 코팅 마이크로-스캐폴드 내에 적재된 중간엽 줄기세포에서의 연골분화 표지유전자의 고발현이 확인되었다. 따라서, 본 발명의 일 실시예에 따른 자성 나노입자 코팅 마이크로-스캐폴드는 중간엽 줄기세포의 연골세포로의 분화를 정상적으로 유도할 수 있음이 확인되었다.
실시예 6: 2D 자기 구동 실험
본 발명의 일 실시예에 따라 MNPs가 도입된 마이크로-스캐폴드 중간엽 줄기세포 복합체가 본 발명의 자기구동 시스템을 통해 이동 조절이 가능한지 확인하기 위해, 미세유체 챔버를 이용한 2D 자기구동 실험을 수행하였다.
구체적으로 PDMS 챔버의 몰드를 유리 기판(glass substrate)에 3D 프린터를 이용하여 제조한 아령형(dumbbell-type) 구조를 부착하여 제작하였다. 그 후, PDMS 폴리머를 10:1 비율의 경화제 및 PDMS 전구체를 혼합하여 준비하였고 몰드에 캐스팅한 후, 플라즈마를 이용하여 슬라이드 글래스에 대해 PDMS 블록을 부착하였고 상기 제조한 챔버는 3개 영역(대조, 적재 및 표적 영역)으로 구분하였다(도 8a). 이어 상기 실시예 4에서 제조된 자성 나노입자 적재 마이크로-스캐폴드 MSC 복합체 10개를 미세유체 챔버의 적재 영역에 적재하였고 상기 미세유체 챔버 내의 마이크로-스캐폴드 MSC 복합체에 대한 광학 이미지 및 형광 이미지를 실시간으로 확인할 수 있는 도립 현미경이 장착된 EMA 시스템의 작업대에 위치시킨 후 관찰하였다.
상기 EMA 시스템은 955 kA/m의 자화값(magnetization value)을 가진 4개 원통형 네오디뮴 자석(직경 10 mm × 높이 20 mm)으로 구성된 영구자석으로 구성된 자기구동 시스템(도 9b)을 이용하여 하기와 같이 테스트하였다. 마이크로-스캐폴드는 상온의 점도가 활액과 유사한 글리세린(70 wt%)용액이 담지된 PDMS 소재의 미세유체 챔버의 적재 구역에 적재한 후, 상기 미세유체 챔버를 자기구동A 시스템의 작업대에 위치하였으며 고정 균일 자장(30 mT) 및 가변 경사 자장(0.2-1.2 T/m, interval 0.2 T/m)은 각 x- 및 z-축을 따라 EMA 시스템에서 생성되었고 마이크로-스캐폴드는 경사 자장의 방향으로 추진하였다. 마지막으로 속도(velocity)를 획득하기 위하여 마이크로-스캐폴드의 기록된 이동운동(locomotion)을 분석하였다.
그 결과, 도 9c에서 나타난 바와 같이, 10개의 마이크로-스캐폴드 중에서 9개가 표적영역으로 이동하였고 마이크로-스캐폴드는 표적 영역에 대해 자계 조절을 통하여 유도되는 것을 확인하였다,
실시예 8: 3D 표적능 테스트
본 발명의 일 실시예에 따라 제작한 자기구동 마이크로-스캐폴드의 관절 결손 부위로의 표적능을 관찰하였다. 먼저, 3D 표적능 테스트를 위한 무릎 팬텀(knee phantom)은 무릎의 3D CAD 모델로부터 3D 프린터를 이용하여 제작하였다(도 10). 그 후, 표적영역으로 깊이 3 mm, 직경 2 mm의 구멍을 대퇴골(femur)의 내측에 형성하였고 3D 표적능 테스트를 위해 상기 제조된 모델은 글리세린(70 wt%) 용액을 채운 아크릴 챔버에 위치시켰다. 그 후, 5개의 마이크로-스캐폴드들은 피펫팅을 통해 무릎 모델 팬텀의 관절 결손부위 사이에 주입되었고 표적 영역으로의 이동을 관찰하였다.
그 결과, 비슷한 속도를 가진 5개의 마이크로-스캐폴드들이 주입 위치에서부터 표적 영역으로 이동하여 3D 표적능 테스트에서 마이크로-스캐폴드의 표적능이 가능하다는 것을 관찰하였다(도 11).
결론적으로 본발명의 자기구동 관절연골 재생 시스템(100)을 이용하면 자성체를 포함하는 연골치료제의 투여한 후 실시간 영상정보를 기초로 하여 자기장의 세기를 조절하며 연골치료제를 환부에 정확하게 위치시키고 고정함으로써 비수술적이고 보다 효율적인 연골 치료효과를 도모할 수 있다.
본 발명은 상술한 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따른 연골 재생용 조성물은 골관절염과 같은 연골손상에 따른 질환의 치료를 위해 유용하게 사용할 수 있다.

Claims (13)

  1. 자성체 및 연골생성 세포가 부착된 미세구조체를 포함하는 연골 재생용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기연골생성 세포는 연골세포 또는 줄기세포인, 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 줄기세포는 골수유래 줄기세포 또는 지방유래 줄기세포인, 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 자성체는 자성나노입자인, 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 자성나노입자는 아민 기능화 Fe3O4 나노입자인, 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 아민 기능화 Fe3O4 나노입자는 상기 미세구조체의 카르복실기와 공유결합되는, 조성물.
  7. 제1항에 있어서
    상기 미세구조체는 생적합성 폴리머 스캐폴드인, 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 생적합성 폴리머 스캐폴드는 다공성 스캐폴드인, 조성물.
  9. 제7항에 있어서.
    상기 생적합성 폴리머 스캐폴드는 폴리락트글리콜산(PLGA), 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리비닐알코올(PVA), 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리(N-2-하이드록시프로필 메타크릴아마이드), 폴리하이드록시알카논산(PHA), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리(프로필렌 푸마레이트), 폴리안하라이드, 폴리아세탈, 또는 보네이트, 폴리(오르쏘 에스터)로 제조되는, 조성물.
  10. 제1항의 연골 재생용 조성물;
    연골 결손 부위에 X-선을 조사한 후 상기 연골 재생용 조성물 및 환부를 이미징하기 위한 영상촬영부;
    상기 연골 재생용 조성물을 연골 결손부위로 이동시키는 자계생성부를 포함하는, 자기구동 관절연골 재생 시스템.
  11. 제10항에 있어서
    상기 자계생성부는 코일형 또는 착용형인, 자기구동 관절연골 재생 시스템.
  12. 제10항에 있어서
    상기 자계생성부의 자계 생성은 전자석(electromagnet) 또는 영구자석(permanent magnet)에 의한, 자기구동 관절연골 재생 시스템.
  13. 제12항에 있어서
    상기 영구자석은 페라이트(ferrite), 네오듐(neodymium), 알리코, 사마륨코발트(samarium cobalt) 또는 고무자석(rubber magnet)인, 자기구동 관절연골 재생 시스템.
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