WO2018062191A1

WO2018062191A1 - 検出キット、検出方法

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Publication number: WO2018062191A1
Application number: PCT/JP2017/034764
Authority: WO
Inventors: 達夫竹内; 賢杉田; 圭吾水澤; 東　隆司; 鈴木　幸一
Original assignee: Canon Inc
Current assignee: Canon Inc
Priority date: 2016-09-30
Filing date: 2017-09-26
Publication date: 2018-04-05
Anticipated expiration: 2019-03-30
Also published as: JP2018054549A; US20190302111A1

Abstract

検出対象物を含む試料が導入される導入部（１０２）と、導入部に導入され、分配された試料と、信号を発信可能な信号発信物質との混合物を得る複数の混合部（１０５）と、複数の混合部（１０５）で得られた各々の混合物中の、検出対象物及び信号発信物質に対して、選択的に結合可能な結合物質が設けられた結合部（１０８）と、が支持体（１０１）上に設けられた、検出対象物の検出キットであって、複数の混合部（１０５）に設けられた信号発信物質の量または濃度が互いに異なる。

Description

検出キット、検出方法

　本発明は検出対象物の検出キット、検出対象物の検出方法を提供するものである。

　これまで、血液、尿、涙などに含まれる生体代謝物としてのバイオマーカーの有無や、その量を計測することで、生体のバイタルサインを得るための方法や装置の開発が行われてきた。従来、このようなバイタルサインを得るために、生体より採取されたさまざまな試験試料に対して化学分析を行い、その組成並びに量を計測することが一般的であり、液体クロマトグラフィー等の手法が用いられてきた。しかし、これらの装置は非常に大型であり、簡便に検出する手法や装置が求められていた。

　特開２００８－３２４９４号公報（特許文献１）では、被験試料に含まれる標的物質を簡便に測定する測定用キットが開示されている。特許文献１に開示の測定用キットは、標的物質を含む被試験試料に競合物質を混合させた混合液を、キットに固定された競合的捕捉物質、キットに固定された判定物質の順に接触させる。そして、判定物質に結合・捕捉された競合物質から得られる反応物の量を測定することで、標的物質の量を測定している。すなわち、競合物質を標的物質に結合しうる抗体、競合的捕捉物質を標的物質もしくはその類似物質とすると、標的物質が少ない場合、競合物質は固定された競合的捕捉物質に結合・捕捉されて、判定物質に到達する競合物質の量は少ない。その結果、判定物質に結合・捕捉される競合物質から得られる反応物の量は少ない。一方、標的物質の量が増えるにつれ、固定された競合的捕捉物質に結合せずに標的物質に結合する競合物質が増えるため、判定物質に到達する競合物質の量が増える。その結果、判定物質に結合・捕捉される競合物質から得られる反応物の量は増える。したがって、標的物質の量に関する定性的な情報を得ることが可能である。

　しかし、特許文献１に開示の測定用キットには競合的捕捉物質だけでなく、判定物質も固定しなくてはならず構成が複雑である。また、競合物質は、標的物質と判定物質の両方と結合しうるものに限られるため、キットの設計自由度に関する制約が多くなる。したがって、従来より構成がより単純で、設計自由度がより高い、検出対象物の検出キットが求められていた。

特開２００８－３２４９４号公報

　本発明は上記従来例に鑑みなされたものであり、従来に比べて、構成がより単純で、設計自由度がより高い検出対象物の検出キットを提供することを目的とする。

　本発明に係る検出キットは、検出対象物を含む試料が導入される導入部と、前記導入部に導入され、分配された前記試料と、信号を発信可能な信号発信物質との混合物を得る複数の混合部と、前記複数の混合部で得られた各々の前記混合物中の、前記検出対象物及び前記信号発信物質に対して、選択的に結合可能な結合物質が設けられた結合部と、が支持体上に設けられた、前記検出対象物の検出キットであって、前記複数の混合部に設けられた前記信号発信物質の量または濃度が互いに異なる検出キット。

本発明の実施形態及び実施例１に係る検出キットを説明するための上面図。本発明の実施形態及び実施例１に係る検出キットを説明するための断面図（図１の上面図の断面）。本発明の実施例２に係る検出キットを説明するための断面図。本発明の実施例１、２における検出対象物の分子構造の一例。本発明の実施例１、２における信号発信物質の分子構造の一例。

　（検出キット）
　本発明の実施形態に係る検出キットについて説明するが、本発明はこれらに限られない。

　本実施形態に係る検出キットの一例について図１、２を用いて説明する。図１は本実施形態に係る検出キットの上面図、図２は図１の断面図を示す。

　本実施形態に係る検出キットは、支持体１０１上に導入部１０２、混合部１０５、結合部１０８を少なくとも有する。導入部１０２には半定量を行う対象となる検出対象物を含む試料が導入される。混合部１０５は、導入部１０２に導入されて、分配された各々の試料と、信号を発信可能な信号発信物質との混合物を得るために、支持体１０１上に複数設けられる。複数の結合部１０８には、各々、検出対象物及び信号発信物質に対して、選択的に結合可能な結合物質が設けられている。複数の結合部１０８は、各々に結合物質が固定して設けられ、各々の結合物質が、複数の混合部１０５で得られた各々の混合物と、接触するような構成となっている。

　このように本実施形態に係る検出キットは、少なくとも結合物質が支持体上に固定されていればよく、構成が単純である。また、結合物質は、検出対象物や信号発信物質に結合可能なものであればよく、設計自由度も高い。

　本実施形態に係る検出キットについてより詳細に説明する。導入部１０２を上流、確認部１０９を下流とし、上流から下流に向けて試料が移動していく。

　導入部１０２に導入された試料は、吸収部１０３に吸収され、複数の第一の搬送部１０４に分配される。導入部１０２に導入された試料は複数の第一の搬送部１０４に等量ずつ分配される構成が好ましい。但し、複数の第一の搬送部１０４に互いに同じ量だけ分配されていなくても、複数の混合部１０５に到達する試料の量が互いに同じであればよい。吸収部１０３は、複数の第一の搬送部１０４に分配される試料の量が互いに同一にしやすくするのみならず、導入部からあふれた試料を吸収して拡散を抑制する役割を担う。ここで、試料の量が互いに同一とは、完全同一の場合だけでなく、一方の試料の量の０．９５倍から１．０５倍の範囲に、他方の試料の量の値が入る場合も含む。好ましくは、一方の試料の量の値の０．９９倍から１．０１倍の範囲に、他方の試料の量の値が入る場合である。

　複数の第一の搬送部１０４を経た各々の試料は、複数の混合部１０５に到達する。複数の混合部１０５に設けられた信号発信物質と試料とが混合され、混合物が得られる。

　ここで、複数の混合部１０５の各々に設けられた信号発信物質は互いにその量または濃度が異なる。以下では量が異なる場合について説明するが、信号発信物質が溶媒に含まれる形で設けられる場合等は、濃度を調整する方が便利である。

　信号発信物質の量が互いに異なるため、複数の混合部１０５で得られる各々の混合物における、検出対象物と信号発信物質との比率が異なる。例えば、後述の結合部１０８のＡにつながる混合部１０５に設けられた信号発信物質が最も多く、Ｂにつながる混合部１０５に設けられた信号発信物質が次に多く、Ｃにつながる混合部１０５に設けられた信号発信物質が最も少ない、とする。

　混合部１０５から展開部１０６を経て第二の搬送部１０７に移動する中で、混合物中の検出対象物と信号発信物質とが、分散するように混じり合う。複数の展開部１０６を経た各々の混合物は、複数の第二の搬送部を経て、結合部１０８に到達する。複数の結合部１０８（Ａ、Ｂ、Ｃ）の各々に設けられた結合物質に、混合物中の検出対象物と信号発信物質とが選択的に結合される。複数の結合部１０８のＡ、Ｂ、Ｃに到達する混合物における、検出対象物と信号発信物質との比率が異なる。本例では、結合部１０８に到達する試料のうち、検出対象物に対する信号発信物質の比率が多い順にＡ、Ｂ、Ｃとなる。そのため、結合部１０８の各々における信号発信物質から発信される信号の大きさは、信号が大きい順に、Ａ、Ｂ、Ｃとなる。検出対象物が少ない場合、結合部１０８に設けられた結合物質には多くの信号発信物質が結合するため、発信される信号は大きい。一方、結合物質に対する結合のしやすさ（結合定数）が、検出対象物と信号発信物質とで同一の場合、検出対象物が多くなるにつれて、結合物質に結合する検出対象物が増えるため、発信される信号は小さくなる。ここで、結合定数が同一とは、完全同一の場合だけでなく、一方の結合定数の値の０．９５倍から１．０５倍の範囲に、他方の結合定数の値が入る場合も含む。好ましくは、一方の結合定数の値の０．９９倍から１．０１倍の範囲に、他方の結合定数の値が入る場合である。

　このようにして、導入部１０２に導入された試料に含まれる、検出対象物の量の定性的な情報が得られる。なお、結合定数が同じとは、本発明の効果を得られる程度、すなわち、結合物質に対して、検出対象物と信号発信物質とが競合して結合するものであれば良い。

　次に、本実施形態に係る検出キットが、試料中の検出対象物を半定量的に検出できる理由について、一例を挙げて説明する。ここで挙げる各数値は本実施形態を理解しやすくするために、わかりやすい数値を挙げている。また、信号の大きさは定性的な関係を示すための一例であるため、単位は示していない。

　結合部１０８のＡ、Ｂ、Ｃにつながる混合部１０５に設けられた信号発信物質を、それぞれ、１０００個、１００個、１０個とする。そして、結合部１０８のＡ、Ｂ、Ｃにそれぞれ、１０個の結合物質が設けられているとする。また、結合物質に対する結合のしやすさ（結合定数）が、検出対象物と信号発信物質とで同じ、と仮定する。

　まず、検出対象物が１０個の場合、結合部１０８のＡ、Ｂ、Ｃの結合物質にはそれぞれ、約１０個、約１０個、約５個の信号発信物質が結合するため、信号の大きさは概ね、Ａは１００、Ｂは１０、Ｃは５という比率となる。

　次に、検出対象物が１００個の場合、結合部１０８のＡ、Ｂ、Ｃの結合物質にはそれぞれ、約１０個、５個、０～１個の信号発信物質が結合するため、信号の大きさは概ね、Ａは１０、Ｂは５、Ｃは０～１、という比率となる。

　最後に、検出対象物が１０００個の場合、結合部１０８のＡ、Ｂ、Ｃの結合物質にはそれぞれ、５個、０～１個、０～１個の信号発信物質が結合するため、信号の大きさは概ね、Ａは５、Ｂは０～１、Ｃは０～１、という比率となる。

　したがって、検出対象物が少ない場合は、Ａ、Ｂ、Ｃのいずれからも信号が発信される。検出対象物が多くなると、結合部１０８のＣからの信号がほとんど発信されなくなり、次いで、結合部１０８のＢからの信号が発信されなくなる。検出対象物が非常に多くなると、結合物質に結合するものは、ほとんどが検出対象物となり、結合部１０８のＡからの信号も発信されなくなる。検出対象物が多いことが生体の疾病の兆候である場合や、ストレスが大きい可能性が高いことを意味する場合、本実施形態に係る検出キットからの信号が大きいほど、疾病に罹患していることやストレスが大きい可能性があることを示すことになる。

　さらに、混合部１０５のＡ、Ｂ、Ｃの各々に設ける信号発信物質の量や濃度を、例えば１０のべき乗で異なる（１桁ずつ異なる）ようにすれば、Ａ、Ｂ、Ｃから発信される信号の大きさの変化から、検出対象物の量の１桁程度の変化を、検出することができる。つまり、本実施形態に係る検出キットは、検出対象物が多い、少ないという定性的な情報だけでなく、ある程度の定量性を備えた、半定量のシステムと言える。なお、混合部１０５のＡ、Ｂ、Ｃの各々に設ける信号発信物質の量や濃度が互いに１桁以上異なるようにすることで、測定できる検出対象物の量の範囲を広げることができる。結合部１０８を経た、余りの混合物（試料）は、確認部１０９に到達する。確認部１０９は、試料が検出キット内の各部位を経由したことを確認するとともに、余った試料が外に漏れないようにすることができる。

　なお、本実施形態に係る検出キットにおいて、第一の搬送部、混合部、展開部、第二の搬送部、結合部は３つ設けられているが、３つに限らず２個の形態や、４個以上の形態であっても良い。

　次に、本実施形態に係る検出キットを構成する各部位、及びそれらを構成する各部材の材料等の具体例について説明する。

　（検出対象物）
　本実施形態における検出対象物の例として、生体の疾病、体調、生体にかかっているストレスの程度などに関わるバイオマーカーを挙げることが出来る。例えば、生体内より代謝されるホルモン系物質の内、分子量が１０００以下の低分子物質がその対象となる。具体的には、ステロイド系ホルモン類、アミン系ホルモン類、ヌクレオシド、及びこれらの類縁体等が挙げられる。また、抗原や抗体であってもよい。この場合、検出対象物と結合物質とはいずれか一方が抗原であり、いずれか他方が抗体となる。

　さらに人工的に合成される低分子化合物の内、生体から代謝されるうるものも挙げられる。また、貝毒の代表されるテトロドトキシンなどの低分子毒物のように生体外部からの取り込みにより重大な疾患を引き起こす物質も挙げられる。

　検出対象物は後述する尿、血液、汗、涙等に含まれるものであることが好ましい。

　本実施形態に係る検出対象物の例として、図４に示される構造をもつ、８－Ｏｘｏ－２’－ｄｅｏｘｙｇｕａｎｏｓｉｎｅ（８オキソ２’デオキシグアノシン、以下８ＯＨｄＧと略すことがある）が挙げられる。

　（試料）
　検出対象物を含有する試料としては尿、血液、汗、涙およびこれらをもとにする、液体状の試料が挙げられる。これらの試料には、バイオマーカーが含まれその量を計測することで、生体のバイタルサインを得る。

　また、低分子毒物であればこれらを含むと考えられる粘膜、粘液、海水とこれらの内、含有する水の量を増減させた希釈、濃縮液が挙げられる。

　（支持体）
　支持体１０１の材質は、プラスチック、ガラス、フィルム等が用いられ、試料の種類、検出対象物の種類等により適宜選択できる。支持体１０１の寸法や形状については、取り扱いの簡便さからは試料が移動する方向の長さ３ｃｍ～５ｃｍ、幅２ｃｍ～３ｃｍの方形が好ましいが、検出対象物の種類、信号発信物質の量や濃度や、第一の搬送部１０４の本数により幅を広くしてもよい。すなわち、支持体は、使いやすさの観点から、手に平サイズのスティック形状であることが好ましい。

　（導入部）
　試料の導入部１０２を構成する部材の材質は、セルロース濾紙、ガラス繊維、ポリウレタン、ポリアセテート、酢酸セルロース、ナイロン、綿布等の均一な特性を有するものが挙げられる。特に連泡ポリウレタンフォームは親水性、疎水性の調整が容易であり、試料の溶媒に合わせて適宜選択することが可能である。なお、水系の試料の場合、親水性が強い導入部を用いるとこれらに吸着してしまい後段の結合部１０８への試料の移動がスムーズに行われない可能性がある。試料が親水性の場合は、疎水性の導入部、試料が疎水性の場合は、親水性の導入部、のように、試料が親水性か疎水性かを見極めて、導入部の材料を選択することが好ましい。また、導入部１０８に、検出対象物に含まれる構造と、水素結合可能な部位を有する場合、非特異的な吸着を抑制する処理をすることが特に好ましい。非特異的な吸着を抑制する処理の例として、界面活性剤を設ける場合、不活性蛋白を設ける場合等があげられるが、試料中の検出対象物の特性に合わせて処理方法を選択すればよい。

　（吸収部）
　吸収部１０３は、導入部１０２に導入された試料が、第一の搬送部１０４に等量分配されやすくするために、導入部１０２の周囲に設けられる。但し、導入部１０２そのものが第一の搬送部１０４に等量ずつ分配されやすいものであれば、吸収部１０３は必ずしも必要ない。

　（第一の搬送部、第二の搬送部）
　第一の搬送部１０４は、試料を導入部１０２、または吸収部１０３から混合部１０５へ搬送するために、第二の搬送部１０７は、混合物を混合部１０５または展開部１０６から結合部１０８へと搬送するための部位である。第一の搬送部１０４と第二の搬送部１０７とは互いに同じ材料や構成であっても、異なっていてもよい。以下では、第一の搬送部１０４と第二の搬送部１０７とを単に搬送部と称して説明することがある。

　搬送部は多孔性ニトロセルロース膜、多孔性セルロース膜、ナイロン膜、ガラス繊維、不織布、布等を用いることができ、好適であるものはいわゆる濾紙である。この搬送部の表面も前述した導入部１０２と同様に、試料が親水性であるか疎水性であるか、を見極めて適宜選択することができる。さらに、搬送部が、検出対象物に含まれる構造と水素結合可能な部位を有する場合、非特異的な吸着を防止する処理をすることが特に好ましい。非特異的な吸着を防止する処理の例として、界面活性剤を設ける場合、不活性蛋白を設ける場合等があげられるが、試料中の検出対象物の特性に合わせて選択すればよい。

　本実施形態では、この搬送部を複数持つことからそれぞれの搬送部に対応するストリップを導入部の下部に等間隔に並べるとともに、それぞれのストリップ間をポリエチレン、フッ素樹脂等の疎水性樹脂で仕切る。あるいは一本のストリップに前述の樹脂からなる溶液を線上に塗布する。それにより、等間隔でかつ隣接するストリップ間での試料である液体の干渉を防止することができる。

　（混合部）
　複数の混合部１０５には、各々、互いに量の異なる信号発信物質が設けられる。混合部１０５は、流入してくる試料と信号発信物質とが均一に分散されるような構成であることが好ましい。

　（信号発信物質）
　信号発信物質はそれ自体が後述の結合物質に選択的に結合され、かつ、信号を発信することができるのであれば、そのような材料を用いることができる。それ自体が信号を発信することが出来ない場合、本実施形態における信号発信物質は前述した検出対象物あるいはこの類型物に、外部からの刺激に対して信号を発信可能な標識化材料を付加されたものを用いることが出来る。具体的に、信号発信物質は、結合物質との水素結合部位を損なうことなく、あるいは、結合物質に対する結合部位のみを最小限残した化合物であることが好ましい。さらに信号発信物質が、検出対象物が溶解あるいは分散している溶媒に同程度の溶解性、分散性をもつことが好ましく、かつ検出対象物と会合性をもたないような材料を選択することが好ましい。

　（標識化材料）
　本実施形態における標識化材料は電気的、光学的に信号発信物質の存在が計測、観測可能であればよい。標識化材料それ自体がこの電気的あるいは光学的に計測、観測できる特性をもっているだけでなく、必要に応じて後段に標識化工程を付加する場合、標識化が可能な反応基を付加するだけでもその目的を達することが可能となる。

　信号発信物質を光学的に検出する場合、金属コロイド、染料、顔料、蛍光物質等の発光物質を標識化材料として用いることが可能である。電気的に計測する場合、同様の金属コロイド、カーボン系材料等の導電性が変化するもの、あるいは磁気的性質が付与可能なものであっても良い。

　（展開部）
　展開部１０６は、混合部１０５から流入した混合物が第二の搬送部１０７へと移動する間に、混合物中の検出対象物と信号発信物質とが、均一に分散するように混じり合わせるために設けられる。

　展開部１０６は、第一の搬送部１０４で使用する濾材よりも目を粗くすることが好ましい。さらに、第一の搬送部１０４＜混合部１０５＜展開部１０６の順に濾材の目の粗さが大きいことが好ましい。濾材の目の粗さについてはＪＩＳ　Ｐ－３８１０で示す濾水時間を基準に選択すれば良く、例えば第一の搬送部１０４の濾水度が２５０秒であるとした場合、混合部１０５が１６０秒、展開部１０６が１００秒以下の素材を選択すればよい。これは前述の展開部１０６において試料中の検出対象物と信号発信物質が均一に混ざる為に、一旦試料の流速を落とし、混合度合を適正化するためである。

　また、均一に混合された混合物を速やかに結合部１０８へ搬送するために、第二の搬送部１０７に用いる濾材は反対に、展開部１０６よりも濾水時間が大きい材料を選択することが好ましい。

　（結合部）
　結合部１０８は、結合物質が結合部から他の部位に流出しないよう強固に接着できる材質であれば良く、かつ、結合物質が検出対象物や信号発信物質を捕捉するための補足部位に対する吸着性をもたない材料から選択することが好ましい。例えば結合物質が分子認識可能な樹脂である場合この樹脂に対して接着性を有しかつ、溶融しない接着剤を用いることが必要で、カゼイン系の接着剤を用いることが好適である。

　（結合物質）
　本実施形態における結合物質は、少なくとも検出対象物と信号発信物質とに選択的に結合可能な物質である。本明細書において結合とは、水素結合、共有結合、イオン結合等の化学結合だけでなく、化学結合よりは結合力の弱い物理的な吸着を含む概念である。具体的には、合成ポリマー、抗原、抗体、タンパク質等が挙げられる。

　本実施形態にかかる結合物質は、その分子構造に検出対象物や信号発信物質である低分子物質と水素結合が可能な部位を有し、それぞれの持つ部位が水素結合を補完しあうように、原子の配列と空間的配置が少なくとも２か所以上で一致しているものが好ましい。また、結合物質が検出対象物や信号発信物質を空間的に取り囲む形状であれば、検出対象物や信号発信物質を捕捉する能力をより向上させることが可能である。

　水素結合が可能な部位としては、電気陰性度が大きいフッ素，酸素，窒素と、これらの原子に共有結合した水素等が挙げられる。また、検出対象物や信号発信物質と、結合物質との両者が水素結合を補完しあうとは、検出対象物と結合物質の部位のいずれか一方が、電気陰性度が大きい原子をもつ場合、他方がそれらの原子に共有結合した水素をもつ状態を示している。

　以上では、結合物質については水素結合を中心に説明したがこの水素結合を共有結合、イオン結合に部分的にあるいは全部置き換えても説明することができる。

　（確認部）
　本実施形態において確認部１０９は、導入部に導入された試料が結合部に達したか否かを確認可能なように構成されている。

　確認部１０９は、導入部１０２に導入された試料が、クロマト移動により物理的に吸収されると共に結合部１０８に吸着されない未反応の信号発信物質を吸収除去する部位である。確認部１０９の材料として、セルロース濾紙、不織布、布、セルロースアセテート等の吸水性材料が用いられる。

　なお、試料の流路が確認部まで別れている構成であれば、確認部において、検出対象物の半定量を行っても良い。

　（添加物質）
　また、信号発信物質に加えて、界面活性剤やｐＨ調整剤、有機溶剤、バッファー塩などが合わせて塗布または予め添加されていてもよい。検出対象物と信号発信物質の結合を調整する材料であれば、信号発信物質と合わせて塗布していてもよい。

　（検出方法）
　本実施形態に係る検出方法は、以下の（１）から（４）の工程を少なくとも有する。
（１）検出対象物を含む試料を互いに等量に分配する工程。
（２）互いに等量に分配された試料と、信号発信物質とを混合して混合物を得る工程。
（３）得られた混合物と、検出対象物と信号発信物質に選択的に結合可能な結合物質とを接触させる工程。
（４）結合物質に結合した信号発信物質から発信される信号を測定する工程。

　本実施形態にかかる検出方法を用いれば、簡便に検出対象物を検出できる。

　（実施例１）
　本実施例は、試料の導入部にはウレタン製の連泡スポンジを用い、その大きさは１８ｍｍ×１０ｍｍの方形で厚さが３ｍｍのものを用い、その底面に幅５ｍｍでニトロセルロースからなる３本の濾紙ストリップ（第一に搬送部）１０４を並列に配置している。このストリップに用いた濾紙はＪＩＳ　Ｐ－３８１０で計測できる濾水度をもとに選択する。本実施例では濾水時間２００秒の濾紙を用いた。この濾紙の繊維表面は試験液の染み込みによる検出対象物の付着を防止するために、界面活性剤に依る撥水処理を行う。また、本実施例では第一の搬送を３本設け、それぞれの搬送部間は、試料が導入される導入部のスポンジ下部から確認部までポリエチレンワックスを用いて埋められている。次に、標識剤が付与された試料中の検出対象物の信号発信物質を濾水時間１８０秒のメンブレンに含浸させたパッド（混合部）１０５を第一の搬送部１０４のストリップに重なるように設置する。さらに濾水時間１００秒のメンブレン（展開部）１０６をこれに重ねる。次に、第一の搬送部１０４と同様の濾水時間２００秒のメンブレン１０６をさらに下方に敷く、これら第一の搬送部１０４、混合部１０５、展開部１０６、第二の搬送部１０７のメンブレンは接着することなく重ね合わせる。その後、上部からテープなどによって密着性がたもたれるように固定する。

　各部位の濾水時間は、第一の搬送部１０４＞混合部１０５＞展開部１０６かつ第二に搬送部１０７＞展開部１０６のように設定する。特に展開部１０６に比べて、第二に搬送部１０７の濾水時間が長いことで、信号発信物質と検出対象物が均一に混合されることを促進し、後段における結合部における、検出対象物と信号発信物質との競合的な吸着を正確に行うことができる。

　次に混合された検出対象物と信号発信物質を含む試料は、毛細管現象によってストリップ（第二の搬送部）１０７に運ばれ、結合部１０８に到達する。結合部１０８は検出対象物並びに信号発信物質と特異的に吸着可能な水素結合部位を含む樹脂粒子あるいは薄膜が担持されており、これに検出対象物並びに信号発信物質がその混合比率によって結合することになる。信号発信物質の標識化材料として後述する水溶性染料を用いると、検出対象物の量が少ない場合、信号発信物質の付着が多くなり、結合部は着色し、逆の場合は着色が見られないまたは見づらくなる。

　ここで、検出対象物が生体内から排出される場合、その濃度の範囲が生体の状態によってどの程度変化することは既知である。そこで、複数の混合物１０５の各々に設ける信号発信物質は、正常濃度を基準として２倍、４倍のようにべき乗でその量や濃度を変えておくことが良く、好ましくは１０倍、１００倍というように１０のべき乗で増加させておく。

　また、試料が人の尿でありこれに含まれる低分子化合物としてＤＮＡの酸化代謝物である図４に示す８ＯＨｄＧ（８－Ｏｘｏ－２’－ｄｅｏｘｙｇｕａｎｏｓｉｎｅ）を検出する場合、信号発信物質にこの８ＯＨｄＧに水溶性染料を結合したものが用いられる。これをパッド（混合部）１０５に浸漬させ、乾燥したものを用いる。本実施形態では着色材として直径４０ｎｍの金ナノコロイド粒子を用い前述８ＯＨｄＧに通常の方法で結合させたものを用いる。次に用意した前述３本のストリップに対応するように前述した信号発信物質のモル濃度が３μＭ、３００ｎＭ、３０ｎＭになるように調整しそれぞれ信号発信物質の溶液０．１８ｍｌをそれぞれ用意する。そして、Ａ，Ｂ，Ｃのライン毎にそれぞれのパッド（混合物）１０５に浸漬させ、乾燥したものを用意する。

　次に結合部に設ける結合物質として、図５に示すフェノキサジンの誘導体をアクリル酸モノマーと共重合したポリマーを用いる。このポリマーをニトロセルロースベースで濾水時間２００秒のメンブレンにカゼインを用いて固定し結合部１０８を形成する。この結合部における前記吸着可能な分子の数は使用する信号発信物質に含まれる標識化材料のカバーリングパワーによって決められる。本実施例では直径４０ｎｍの金コロイド粒子を用いるので、結合部１０８の単位面積当たり１０^７（個／μｍ^２）の結合物質を設ければ良い。本実施例では単位面積当たり２×１０^９（個／μｍ^２）になるように調整したポリマーを用いる。このポリマーは第二の搬送部１０７のストリップの途中に含浸させる形で設定する。さらにこの結合部１０８の下流に結合部以上の結合物質が設けられたポリマーを用意し確認部９とする。

　このように低分子化合物の半定量計測システム（検出キット）にＰＨ６．８に調整した人工尿に８ＯＨｄＨの濃度が１０ｎＭ，２００ｎＭ，１５００ｎＭになるように試料を作成し、導入部に総量０．６ｍｌ投入し、検出キットを水平に保つ。水平に保ったままで、数分後に、この時、１０ｎＭの試料を投入した場合Ｃのラインの結合部のみ着色せず、Ａ，Ｂのラインの結合部のみが青色に着色し、試料が１０ｎＭの濃度であることがわかる。次に２００ｎＭの試料の場合はＡラインのみが着色し、１５００ｎＭではＢラインがわずかに着色する。次に１０００ｎＭの試料を投入したところ、１５００ｎＭの場合よりＡラインのみが濃く染色し、濃度の桁が同じ場合、検出対象物の量が少ないほど濃く染色することが確認できた。

　（実施例２）
　導入部１０２のスポンジ層の内部に透過面積が同等になるように仕切り１１０を設けた以外は実施例１と同様にシステムを作成した。また、導入部１０２の周囲にはスポンジからあふれた試料を吸収可能な部材（吸収部）１０３を設置した。この部材は公知の高分子吸収体などからなり導入部１０２に投入される試料が多い場合、あるいは導入部の縁に残留している場合これを素早く吸収し、導入部１０２の定量性を確保できる。導入部１０２の内部に設けられた仕切り板１１０は、検出対象部の検出のためのラインを３つ設ける場合、２枚設置され上部のスポンジと同様の材料で３区分された空間を埋めている。

　さらに実施例１において用いた信号発信物質、捕捉ポリマーを同様に設ける。次に実施例１と同様に３種の試料を用意し計測を行う。

　この場合、検出精度としては同様の結果が得られるが、さらに検出キットを水平から傾けても、その結果に差異はなく、キットの操作に多少の差異が発生しても、等量分配されていることが確認できる。

　図３において、仕切り板１１０は導入部１０２スポンジ層の高さに対して低くなっているが、スポンジの高さまで設けても何ら問題はない。あるいは仕切り板ではなく、等量となるように設けられた矩形の枠を用意しこれを第の搬送部１０４の上部に設けることも可能である。

　本発明に係る検出キットによれば、従来に比べて固定すべきものが少なく、用いられる材料の選択の自由度が上がるため、構成がより単純で、測定対象のキットの設計自由度がより高い。

　本発明は上記実施の形態に制限されるものではなく、本発明の精神及び範囲から離脱することなく、様々な変更及び変形が可能である。従って、本発明の範囲を公にするために以下の請求項を添付する。

　本願は、２０１６年９月３０日提出の日本国特許出願特願２０１６－１９３５５４を基礎として優先権を主張するものであり、その記載内容の全てをここに援用する。

Claims

　検出対象物を含む試料が導入される導入部と、
　前記導入部に導入され、分配された前記試料と、信号を発信可能な信号発信物質との混合物を得る複数の混合部と、
　前記複数の混合部で得られた各々の前記混合物中の、前記検出対象物及び前記信号発信物質に対して、選択的に結合可能な結合物質が設けられた結合部と、が支持体上に設けられた、前記検出対象物の検出キットであって、
　前記複数の混合部に設けられた前記信号発信物質の量または濃度が互いに異なる検出キット。
　前記信号発信物質は、前記検出対象物に、信号を発信可能な標識化材料が付加されたものである請求項１に記載の検出キット。
　前記結合物質に対する前記検出対象物と前記信号発信物質の結合定数が同一である請求項１または２に記載の検出キット。
　前記導入部の周囲に、前記導入部に導入された試料を吸収する吸収部が設けられている請求項１乃至３のいずれか一項に記載の検出キット。
　前記導入部と前記混合部との間に、前記試料を搬送するための複数の第一の搬送部が設けられている請求項１乃至４のいずれか一項に記載の検出キット。
　前記導入部から前記複数の第一の搬送部に分配される前記試料の量が互いに同一である請求項４に記載の検出キット。
　前記混合部と前記結合部との間に、前記混合物を搬送するための複数の第二の搬送部が設けられている請求項１乃至６のいずれか一項に記載の検出キット。
　前記混合部と前記第二の搬送部との間に、前記混合部で得られた混合物における前記検出対象物と前記信号発信物質とを均一に分散させるための展開部が設けられている請求項１乃至７のいずれか一項に記載の検出キット。
　前記結合部で結合しなかった、前記検出対象物及び前記信号発信物質を含む試料を検出することで、前記導入部に導入された前記試料が前記結合部に達したか否かを確認可能な確認部を有する請求項１乃至８のいずれか一項に記載の検出キット。
　前記検出対象物および前記信号発信物質が水素結合可能な部位を有し、前記結合物質は、前記水素結合可能な部位と水素結合可能な部位を有する請求項１乃至９のいずれか一項に記載の検出キット。
　前記結合物質は合成ポリマーである請求項１乃至１０のいずれか一項に記載の検出キット。
　前記検出対象物は、ステロイド系ホルモン類、アミン系ホルモン類、ヌクレオシド、及びこれらの類縁体の少なくともいずれか１つである請求項１乃至１１のいずれか一項に記載の検出キット。
　前記検出対象物は８オキソ２’デオキシグアノシンである請求項１乃至１２のいずれか一項に記載の検出キット。
　前記検出対象物と前記結合物質とは、いずれか一方が抗原であり、いずれか他方が抗体である請求項１乃至１２のいずれか一項に記載の検出キット。
　前記複数の混合部に設けられた前記信号発信物質の量または濃度が互いに１０のべき乗で異なっている請求項１乃至１４のいずれか一項に記載の検出キット。
　検出対象物の検出方法であって、
　前記検出対象物を含む試料を分配する工程と、
　分配された前記試料と、信号を発信可能な信号発信物質とを混合して複数の混合物を得る工程と、
　前記複数の混合物と、前記検出対象物と前記信号発信物質に選択的に結合可能な結合物質と、を接触させる工程と、
　前記結合物質に結合した前記信号発信物質から発信される信号を測定する工程と、
　を有する検出方法。