WO2018055823A1 - 試料容器の位置ずれ検出方法およびそれを用いた撮像方法、ならびに試料容器の位置ずれ検出装置 - Google Patents

試料容器の位置ずれ検出方法およびそれを用いた撮像方法、ならびに試料容器の位置ずれ検出装置 Download PDF

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WO2018055823A1
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imaging
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sample
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疋田　雄一郎
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株式会社Ｓｃｒｅｅｎホールディングス
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    • G06T2207/30004—Biomedical image processing
    • G06T2207/30072—Microarray; Biochip, DNA array; Well plate

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting a displacement when a sample container such as a well plate is placed on a stage.
  • sample containers called “well plates”, “microplates”, and the like are used as samples.
  • a sample container a plurality of hollow sample storage portions called wells are formed.
  • a sample is injected into a well together with a liquid medium.
  • imaging device equipped with a CCD camera or the like, and the sample is observed using image data obtained by imaging.
  • cancer drug discovery research cancer cells are observed and analyzed by imaging cancer cells injected into a well together with a liquid (culture solution) as a medium using an imaging device.
  • FIG. 23 is a perspective view showing an example of the well plate 20.
  • 24 wells 21 are provided in the well plate 20.
  • a well plate 20 is placed (set) at a predetermined position on the stage by an operator. More specifically, for example, as shown in FIG. 24, a holder 121 for holding the well plate 20 is formed on the stage 12, and the well plate 20 is placed on the holder 121 by an operator.
  • the operator usually places the well plate 20 so that the corners of the well plate 20 are aligned with the corners of the holder 121 as indicated by reference numeral 90 in FIG. Accordingly, the well plate 20 is held in the holder 121 in an ideal state, and a desired captured image is obtained.
  • the well plate 20 is in an ideal state in the holder 121 at the start of imaging, such as when the operator places the well plate 20 on a random basis or when some external force is applied to the well plate 20 before the imaging starts. May not be retained.
  • the well plate 20 may be in an obliquely distorted state (rotated from the ideal state) at the start of imaging. If imaging is performed in a state where such a positional shift has occurred, a desired captured image cannot be obtained, for example, an image in a range different from the desired range can be obtained.
  • first conventional technique a technique using pattern matching
  • second conventional technique each of the binarized images obtained by binarizing the captured image and the template image is used.
  • the center of gravity of the characteristic portion is obtained, and the angle and parallel displacement amount between the captured image and the template image are obtained based on the respective regression lines obtained from the alignment of the center of gravity.
  • the captured image of the well changes due to the proliferation of cells in culture, or the brightness of the captured image varies depending on the amount of the culture solution. .
  • a stable captured image cannot be obtained, and the robustness is low, so that it is impossible to detect the positional deviation with high accuracy.
  • the resolution of imaging devices used in fields such as medicine and drug discovery is increasing, the amount of image data obtained by imaging wells is increasing. For this reason, when a method using a template image is employed as in the first conventional method and the second conventional method, there is a concern that the storage capacity will be compressed or insufficient and the processing time will increase.
  • an object of the present invention is to provide a method for accurately detecting a positional deviation of a sample container placed on an imaging apparatus at high speed without increasing the amount of data necessary for processing.
  • a displacement amount from an ideal placement state of the sample container when a sample container having a plurality of sample storage portions is placed on a sample container holding portion of an imaging device is detected.
  • a method for detecting a displacement of a sample container A sample storage unit selection step for selecting two sample storage units from among the plurality of sample storage units as sample displacement detection sample storage units;
  • a logical edge coordinate calculation step for calculating logical edge coordinates that are coordinates of the upper end, the lower end, the left end, and the right end in an ideal placement state for each misregistration detection sample storage unit;
  • the degree of separation for obtaining the degree of separation between the two regions for each of the captured images on the upper end side, the lower end side, the left end side, and the right end side obtained by imaging in the imaging step for each misalignment detection sample storage unit
  • the sample container has a rectangular shape
  • a group of sample storage units arranged in a line along the longitudinal direction of the sample container is defined as a row
  • the sample storage unit selection step 2 belonging to the same row and arranged at the most distant positions
  • One sample storage part is selected as the sample storage part for misregistration detection.
  • a rectangular separability filter for obtaining a separability between two rectangular areas is used as the separability filter.
  • the temporary edge coordinate detection step When temporary edge coordinates are detected for the upper end side or the lower end side of the misregistration detection sample storage unit, the logical edge coordinates on the upper end side of the misregistration detection sample storage unit and the misregistration detection sample The degree of separation is obtained while moving the center position of the rectangular degree of separation filter on a straight line connecting the logical edge coordinates on the lower end side of the storage unit, When temporary edge coordinates are detected on the left end side or the right end side of the misregistration detection sample storage unit, the logical edge coordinates on the left end side of the misregistration detection sample storage unit and the misregistration detection sample are detected. The separation degree is obtained while moving the center position of the rectangular separation degree filter on a straight line connecting the logical edge coordinates on the right end side of the storage unit.
  • misregistration amount calculating step as the misregistration amount, a predetermined reference position of the sample container in an ideal placement state and the reference of the sample container in a state actually placed on the sample container holding portion.
  • a parallel displacement amount representing the magnitude of the displacement between the position and an angle representing an inclination from an ideal placement state of the sample container in the state actually placed on the sample container holding portion. It is characterized by that.
  • a sixth aspect of the present invention is the fifth aspect of the present invention,
  • One of the two sample storage units selected in the sample storage unit selection step is defined as a first misregistration detection sample storage unit, and the other is defined as a second misregistration detection sample storage unit.
  • the center coordinates of the first misregistration detection sample storage unit and the center coordinate of the second misregistration detection sample storage unit calculated in the center coordinate calculation step are respectively set as the first actual center coordinate and the second center coordinate.
  • a parallel displacement amount representing the magnitude of displacement between the first ideal center coordinates and the first real center coordinates as the misalignment amount.
  • the first ideal Characterized in that the angle formed between the straight line connecting the straight line connecting the said heart and coordinate second ideal central coordinates and the first real center coordinates and the second real center coordinates are calculated.
  • the imaging device displays a warning.
  • the eighth aspect of the present invention is An imaging method for imaging a sample container having a plurality of sample storage portions by an imaging device, An adjustment step of adjusting the state of the imaging device to a state for starting imaging based on a positional deviation amount obtained by using the positional deviation detection method according to the first aspect of the present invention; And a sample container imaging step for imaging the sample container.
  • a ninth aspect of the present invention is the eighth aspect of the present invention,
  • the imaging unit provided in the imaging device is configured to be movable, In the misregistration amount calculating step, as the misregistration amount, a predetermined reference position of the sample container in an ideal placement state and the reference of the sample container in a state actually placed on the sample container holding portion.
  • a parallel displacement amount representing the magnitude of the displacement between the position and an angle representing an inclination from an ideal placement state of the sample container in the state actually placed on the sample container holding portion.
  • the imaging start position of the imaging unit is adjusted based on the parallel displacement amount calculated in the positional deviation amount calculation step
  • imaging of the sample container is performed while moving the imaging unit according to the angle calculated in the positional deviation amount calculating step.
  • a tenth aspect of the present invention is the eighth aspect of the present invention,
  • the sample container holding part is configured to be movable and rotatable,
  • the misregistration amount calculating step as the misregistration amount, a predetermined reference position of the sample container in an ideal placement state and the reference of the sample container in a state actually placed on the sample container holding portion.
  • a parallel displacement amount representing the magnitude of the displacement between the position and an angle representing an inclination from an ideal placement state of the sample container in the state actually placed on the sample container holding portion.
  • the sample container holding unit is rotated based on the angle calculated in the positional deviation amount calculating step, and the sample container holding is based on the parallel displacement amount calculated in the positional deviation amount calculating step.
  • Part movement In the sample container imaging step, imaging of the sample container is performed while moving the sample container holding unit relative to an imaging unit provided in the imaging device.
  • An eleventh aspect of the present invention is the eighth aspect of the present invention,
  • the imaging unit provided in the imaging device is configured to be movable,
  • the sample container holding part is configured to be movable and rotatable,
  • the misregistration amount calculating step as the misregistration amount, a predetermined reference position of the sample container in an ideal placement state and the reference of the sample container in a state actually placed on the sample container holding portion.
  • a parallel displacement amount representing the magnitude of the displacement between the position and an angle representing an inclination from an ideal placement state of the sample container in the state actually placed on the sample container holding portion.
  • the sample container holding unit is rotated based on the angle calculated in the positional deviation amount calculating step, and the sample container holding is based on the parallel displacement amount calculated in the positional deviation amount calculating step.
  • the sample container imaging step imaging of the sample container is performed while moving the imaging unit.
  • a sample for detecting a positional deviation amount from an ideal placement state of the sample container when a sample container having a plurality of sample storage portions is placed on the sample container holding portion.
  • a container misalignment detection device A sample storage unit selecting means for selecting two sample storage units from among the plurality of sample storage units as a sample storage unit for detecting displacement; Logical edge coordinate calculation means for calculating the logical edge coordinates that are the coordinates of the upper end, the lower end, the left end, and the right end in an ideal placement state for each misregistration detection sample storage unit; Imaging means for imaging a predetermined range with each logical edge coordinate calculated by the logical edge coordinate calculating means as a center position; A degree of separation filter for obtaining a degree of separation between two regions for each of the upper end side, lower end side, left end side, and right end side captured images obtained by imaging by the imaging means for each misregistration detection sample storage unit Is applied while shifting the center position of the separability filter,
  • Center coordinate calculation means for calculating actual center coordinates based on temporary edge coordinates on the upper end side, lower end side, left end side, and right end side detected by the temporary edge coordinate detection means for each sample for detecting displacement.
  • a positional deviation amount calculating means for calculating a positional deviation amount from the ideal placement state of the sample container based on the central coordinates of each positional deviation detection sample storage unit calculated by the central coordinate calculating means; It is characterized by that.
  • the actual central coordinates of the two sample storage units (position shift detection sample storage units) used for detecting the positional deviation of the sample container are the captured images of the region near the edge. Is calculated based on provisional edge coordinates detected by applying a separability filter.
  • the coordinates of the center position of the separability filter when the separability peak value is obtained by the process using the separability filter are set as the temporary edge coordinates. Regardless of the state of the cells or culture medium in the sample storage unit, the degree of separation is maximized when the center position of the resolution filter is near the edge of the sample storage unit.
  • a fixed coordinate is detected as the temporary edge coordinate regardless of the state of the cell or the culture solution in the sample storage unit. That is, even if a stable captured image cannot be obtained due to a difference in the amount of the culture solution for each imaging target or cell proliferation, the temporary edge coordinates can be detected with high accuracy. Since the actual center coordinates of the two sample storage units are obtained based on such provisional edge coordinates, the amount of positional deviation can be calculated with high accuracy.
  • the captured images required for detecting the displacement are only the captured images in the vicinity of the eight edges, and the process using the template image is not performed. For this reason, it is possible to detect misalignment at high speed without increasing the amount of data necessary for processing. As described above, it is possible to accurately detect the positional deviation of the sample container placed on the sample container holding unit of the imaging apparatus at high speed without increasing the amount of data necessary for processing.
  • the detection accuracy of misalignment is improved.
  • provisional edge coordinates are detected without requiring complicated processing.
  • the detection accuracy of the temporary edge coordinates is increased.
  • the imaging device since the parallel displacement amount and the angle are calculated as the positional deviation amount, the imaging device can be operated so that a desired captured image is obtained based on the calculation result.
  • the degree of displacement of the sample container is large, for example, it is possible to prompt the operator to redo the placement of the sample container on the sample container holding part.
  • imaging of the sample container is performed in consideration of the positional deviation of the sample container. For this reason, even when the sample container is misaligned when the sample container is imaged, a desired captured image can be obtained without being wasted.
  • the imaging unit performs imaging without moving the sample container, so that a desired captured image can be obtained without damaging cells or the like.
  • the operator needs to place the sample container on the sample container holding portion again.
  • a desired captured image can be obtained without any problem.
  • the same effect as in the tenth aspect of the present invention can be obtained.
  • FIG. 5 is a flowchart illustrating a procedure of misregistration detection processing in the embodiment.
  • it is a figure for demonstrating selection of the misalignment detection well.
  • it is a figure for demonstrating the calculation of a logical edge coordinate in case the round shape well is employ
  • it is a figure for demonstrating calculation of a logical edge coordinate in case the rounded square type well is employ
  • it is a figure for demonstrating a rectangle separability filter.
  • FIG. 5 is a diagram for describing detection of temporary edge coordinates on the lower edge side of the well indicated by reference numeral A1 in FIG. 4 in the embodiment.
  • it is a figure for demonstrating the detection of a temporary edge coordinate.
  • it is a figure for demonstrating the detection of a temporary edge coordinate.
  • it is a figure for demonstrating the detection of a temporary edge coordinate.
  • FIG. 5 is a flowchart illustrating an imaging procedure after detecting a displacement amount in the embodiment. It is a perspective view which shows an example of a well plate. It is a figure for demonstrating the holder for hold
  • edge portion with the smallest Y coordinate is called “upper edge”
  • edge portion with the largest Y coordinate is called “lower edge”
  • edge with the smallest X coordinate is shown in FIG.
  • the portion is called “left edge”
  • edge portion having the largest X coordinate is called “right edge”.
  • end edge is collectively referred to as “end edge” for convenience.
  • FIG. 2 is a diagram illustrating a configuration of the imaging apparatus 10 according to an embodiment of the present invention.
  • the imaging device 10 is a sample of cells, cell colonies, bacteria, etc. (hereinafter collectively referred to as “cells”) that are cultured in a well 21 formed in a well plate 20 as a sample container. It is an apparatus for imaging.
  • the well plate 20 has a flat plate shape.
  • a plurality of wells 21 for example, 6, 24, 96, 384, etc.
  • sample storage portions having openings on the upper surface side and transparent bottom surfaces on the lower surface side are arranged.
  • the shape of the well 21 is typically circular in cross section and flat on the bottom.
  • Each well 21 is injected with a predetermined amount of liquid (culture solution) as a medium that provides a growth environment for cells and the like.
  • the amount of liquid injected into each well 21 is generally about 50 to 200 microliters.
  • the imaging apparatus 10 is configured to capture an image of a light source 11 that emits imaging light, a stage 12 on which a well plate 20 is placed, and a sample (such as a cell) in the well 21.
  • a unit 13, a camera driving mechanism 14 that moves the imaging unit 13 during imaging, and a control unit 15 that controls operations of the light source 11, the imaging unit 13, and the camera driving mechanism 14 are provided.
  • the stage 12 is formed with a holder 121 for holding the well plate 20 during imaging.
  • the holder 121 implements a sample container holding unit.
  • the light source 11 is disposed on the upper part of the imaging device 10.
  • the stage 12 is disposed below the light source 11, and the imaging unit 13 is disposed below the stage 12.
  • the light source 11 irradiates the well 21 with light L from above the well plate 20 held by the holder 121 based on a control command given from the light source control unit 152 in the control unit 15.
  • the light L to be irradiated is visible light, typically white light. Note that imaging may be performed in a state in which red, green, and blue light sources are individually turned on and irradiated with light of a specific color.
  • a well plate 20 including a plurality of wells 21 that hold a sample (cells, etc.) and a medium is held in a holder 121 formed on the stage 12.
  • the holder 121 is in contact with the peripheral edge of the lower surface of the well plate 20 and holds the well plate 20 in a substantially horizontal posture.
  • the imaging unit 13 captures an image of the well plate 20 by receiving the transmitted light Lt emitted from the light source 11 and transmitted below the well plate 20 held by the holder 121.
  • the imaging unit 13 is connected to the camera driving mechanism 14, and the imaging unit 13 moves horizontally along the lower surface of the well plate 20 by the operation of the camera driving mechanism 14. That is, the imaging unit 13 can be scanned and moved along the lower surface of the well plate 20. However, it is sufficient that the relative movement between the imaging unit 13 and the well plate 20 is realized, and the well plate 20 may be moved during imaging by adopting a configuration using the movable stage 12. Good.
  • FIG. 1 In FIG.
  • the light source 11 is illustrated as irradiating light on the entire surface of the well plate 20, but there is also a light source that irradiates only the well 21 to be imaged by the imaging unit 13. In some cases, the light source 11 moves in synchronization with the imaging unit 13.
  • the camera drive mechanism 14 moves the imaging unit 13 in the horizontal direction based on a control command given from the imaging control unit 153 in the control unit 15.
  • the control unit 15 includes a CPU 151, a light source control unit 152, an imaging control unit 153, an AD converter (A / D) 154, a storage unit 155, and an interface unit 156.
  • the CPU 151 controls the operation of each component in the control unit 15 and performs various arithmetic processes.
  • the light source control unit 152 controls the lighting state of the light source 11.
  • the imaging control unit 153 controls the operations of the imaging unit 13 and the camera driving mechanism 14 so that an imaging target is imaged according to a predetermined scanning movement recipe.
  • the AD converter (A / D) 154 receives an image signal (analog data) obtained by imaging by the imaging unit 13 and converts it into digital image data.
  • the storage unit 155 holds the digital image data.
  • the interface unit 156 has a function of receiving an operation input from an operator, a function of displaying information such as a processing result to the worker, and a function of performing data communication with another device via a communication line. is doing.
  • the interface unit 156 is connected to an input receiving unit (such as a keyboard and a mouse) that receives operation inputs, a display unit that displays information, a communication line, and the like.
  • Misalignment detection processing In the imaging apparatus 10 according to the present embodiment, a position for detecting how much the well plate 20 is held in the holder 121 in a state shifted from an ideal placement state (detecting a parallel displacement amount and an angle). A deviation detection process is performed. Then, taking into account the parallel displacement amount and the angle detected in the positional deviation detection process, the image pickup for obtaining the target picked-up image is performed.
  • the misregistration detection process is performed, for example, when the CPU 151 executes a misregistration detection process program held in the storage unit 155 of the control unit 15.
  • FIG. 3 is a flowchart showing a procedure of misregistration detection processing in the present embodiment.
  • the selection of the two wells 21 used in this misregistration detection process is performed (step S10).
  • three or more wells 21 may be selected, and the amount of displacement (parallel displacement amount and angle) may be obtained based on the information of the wells 21 whose center coordinates are normally calculated in the steps described later.
  • the most probable result may be adopted as the detection result of the positional deviation amount (parallel displacement amount and angle) from the calculation results of the numerous positional deviation amounts based on the center coordinates of the plurality of wells 21.
  • the well 21 selected in step S10 is referred to as a “positional deviation detection well”.
  • the shape of the well plate 20 is rectangular as shown in FIG.
  • a group of wells 21 arranged in a line along the longitudinal direction is defined as “row”
  • a group of wells 21 arranged in a line along the short direction is defined as “column”.
  • any two wells 21 in the well plate 20 can be selected as misregistration detection wells. However, from the viewpoint of improving misregistration detection accuracy, they belong to the same row and are farthest away. It is preferable to select the two wells 21 arranged at different positions as the misalignment detection wells.
  • a well plate 20 having 24 wells 21 is assigned a row number and a column number as shown in FIG.
  • a code combining a row number and a column number is given to the well.
  • the well A1 and the well A6 may be selected as the misalignment detection well, or the well B1 and the well B6 are selected.
  • the well C1 and the well C6 may be selected, or the well D1 and the well D6 may be selected.
  • information such as the number of wells 21, the size of the wells 21, and the interval between two adjacent wells 21 is stored in the storage unit 155 in the control unit 15 of the imaging device 10 for each type (model number) of the well plate 20.
  • the described definition file is retained. Based on this definition file, for each type of well plate 20, it can be determined in advance which two wells 21 should be selected as misalignment detection wells. Therefore, when this misregistration detection process is actually performed, according to the type of the well plate 20 held in the holder 121 (type information is input to the control unit 15 at the start of work) in advance.
  • the two wells 21 that have been determined may be selected as the misalignment detection wells. However, when this misalignment detection process is actually performed, the misalignment detection well may be selected by the operator.
  • steps S20 to S60 described below the same processing is performed on the two misalignment detection wells. Therefore, in the following, the processing will be described focusing on one of the misalignment detection wells.
  • the logical edge coordinates of the misregistration detection well are calculated (step S20).
  • the logical edge coordinates are the coordinates (X coordinate and Y coordinate) of the end edge of the well 21 when the well plate 20 is placed on the holder 121 in an ideal state. That is, in step S20, the coordinates of the upper edge, the lower edge, the left edge, and the right edge (see FIG. 1) in an ideal placement state are obtained for each misalignment detection well. For example, when a round well is employed, the coordinates of four edge portions (upper edge 31, lower edge 32, left edge 33, and right edge 34) as shown in FIG. 5 are obtained.
  • edge portions (upper edge 35) as shown in FIG. , Lower edge 36, left edge 37, and right edge 38) are determined.
  • the logical edge coordinates can be calculated based on the information in the definition file described above.
  • imaging of a predetermined range is performed with each logical edge coordinate calculated in step S20 as the center position (step S30).
  • the coordinates of the center position of the captured image obtained in step S30 coincide with the logical edge coordinates.
  • the imaging range in step S30 it sets to an appropriate magnitude
  • step S20 four logical edge coordinates are obtained for each misregistration detection well. Therefore, in this step S30, imaging is performed at four locations for each misregistration detection well. That is, for each misalignment detection well, a captured image in the vicinity of the upper edge, a captured image in the vicinity of the lower edge, a captured image in the vicinity of the left edge, and a captured image in the vicinity of the right edge are obtained.
  • step S40 processing for detecting coordinates necessary for calculating the center coordinates of the misregistration detection well using the rectangular separability filter 40 (see FIG. 7) is performed (step S40).
  • the coordinates detected in step S40 are coordinates on the edge of the actual misalignment detection well or coordinates in the vicinity thereof, as will be described later. Therefore, the coordinates detected in step S40 are referred to as “provisional edge coordinates” for convenience.
  • the process for detecting the temporary edge coordinates is performed for each of the upper edge side, the lower edge side, the left edge side, and the right edge side. Here, the process will be described with attention paid to the upper edge side.
  • the rectangular separability filter 40 is a filter for obtaining the separability between two regions in the image.
  • two rectangular areas a first area 41 and a second area 42
  • the separability ⁇ between the two regions (the first region 41 and the second region 42) at the position is expressed by the following equation (1).
  • Equation (1) Calculated using (3).
  • N represents the total number of pixels in the two regions (the first region 41 and the second region 42)
  • n 1 represents the number of pixels in the first region 41.
  • N 2 represents the number of pixels in the second area 42
  • ⁇ T represents the total variance value of the two areas
  • P i represents the luminance value at position i
  • P 1 bar represents the first area 41.
  • the P 2 bar represents the average luminance value of the second region 42
  • the P m bar represents the average luminance value of the two regions.
  • the rectangular separability filter 40 for example, by arranging the rectangular separability filter 40 as shown in FIG. 8 with respect to the captured image 50 (the image obtained by the imaging in step S30), the rectangular separability filter 40 is thus configured. The degree of separation ⁇ in the arranged state is obtained.
  • the degree of separation ⁇ at each position is obtained, and as shown in FIG. 9, a rectangle is formed little by little on a straight line 55 connecting the logical edge coordinates for the upper edge and the logical edge coordinates for the lower edge.
  • the center position of the separability filter 40 is moved.
  • the degree of separation ⁇ at the position on the straight line 55 is obtained according to the movement interval of the rectangular degree of separation filter 40.
  • the calculation result of the degree of separation ⁇ is schematically represented by a graph as shown in FIG. 10 in which the horizontal axis is the Y coordinate and the vertical axis is the degree of separation ⁇ .
  • the Y coordinate of the position where the calculation of the degree of separation ⁇ is started is represented by Ya
  • the Y coordinate of the position where the calculation of the degree of separation ⁇ is finished is represented by Yb.
  • the value of the degree of separation ⁇ obtained is represented by a continuous line, but what is actually obtained is a discrete value corresponding to the movement interval of the rectangular degree of separation filter 40.
  • the separation ⁇ is maximized when the Y coordinate is Yk.
  • the peak value of the degree of separation is a value when the Y coordinate is Yk. Therefore, in this example, the Y coordinate of the temporary edge coordinates is Yk.
  • the center position of the rectangular separability filter 40 moves on the straight line 55 that connects the logical edge coordinates for the upper edge and the logical edge coordinates for the lower edge. Is the same as the X coordinate of the logical edge coordinate for. In this way, the coordinates of the center position of the rectangular separability filter 40 when the peak value of the separability ⁇ is obtained are detected as temporary edge coordinates.
  • the temporary edge coordinates detected in this step S40 are the coordinates on the edge of the actual misregistration detection well or the coordinates in the vicinity thereof.
  • step S40 provisional edge coordinates for each of the upper edge side, the lower edge side, the left edge side, and the right edge side are obtained as described above.
  • the X coordinate of the temporary edge coordinates is obtained by processing using the rectangular separability filter 40.
  • the Y coordinate of the temporary edge coordinates is the same as the Y coordinate of the logical edge coordinates for the left edge and the right edge.
  • the temporary edge coordinates may not be detected properly depending on the interval between two adjacent wells 21.
  • the temporary edge coordinates on the lower edge side and the right edge side may not be suitably detected when the well indicated by the symbol A1 in FIG. 4 is selected as the misalignment detection well.
  • step S40 it is determined whether or not all the temporary edge coordinates necessary for calculating the actual center coordinates of the two misregistration detection wells selected in step S10 have been detected (step S40). S50). That is, it is determined whether or not all of the four provisional edge coordinates for one misregistration detection well and the four provisional edge coordinates for the other misregistration detection well have been successfully detected in step S40. Done. As a result of the determination, if there is any temporary edge coordinate that could not be detected, the process proceeds to step S80. On the other hand, when all the temporary edge coordinates necessary for calculating the actual center coordinates of the two misregistration detection wells can be detected in step S40, the process proceeds to step S60.
  • the process using the rectangular separation filter 40 provides a result that can be represented by a graph as shown in FIG. 10 as the calculation result of the separation ⁇ at each position. .
  • a peak having a value of separation ⁇ exists at a position where the Y coordinate is Yk.
  • the peak of the value of the separation degree ⁇ cannot be detected. That is, there may be a captured image (image obtained by imaging in step S30) where the peak value of the degree of separation ⁇ cannot be normally obtained.
  • step S50 in such a case, it is determined that “there are temporary edge coordinates that could not be detected”.
  • step S80 a warning message (for example, a message prompting the user to remount the well plate 20 on the holder 121) is displayed on a display unit (not shown) connected to the interface unit 156 in the control unit 15 of the imaging apparatus 10. ) Is displayed. Then, this misregistration detection process ends. At this time, imaging in consideration of positional deviation is not performed.
  • step S60 the actual center coordinates of the misregistration detection well are calculated using the temporary edge coordinates detected in step S40. Specifically, the X coordinate of the midpoint coordinate between the temporary edge coordinate on the left edge side and the temporary edge coordinate on the right edge side is determined as the X coordinate of the actual center coordinate, and the temporary edge on the upper edge side The Y coordinate of the center point of the coordinate and the temporary edge coordinate on the lower edge side is determined as the Y coordinate of the actual center coordinate. In this way, in step S60, the actual center coordinate (X coordinate, Y coordinate) of one misregistration detection well and the actual center coordinate (X coordinate, Y coordinate) of the other misregistration detection well are obtained. Desired.
  • step S40 and step S60 will be specifically described with reference to FIGS. 12 to 17, the ideal placement state of the misregistration detection well is indicated by a dotted line, and the actual placement state of the misregistration detection well is indicated by a solid line.
  • the four logical edge coordinates are represented by reference numerals 61 to 64.
  • the degree of separation ⁇ is maximized on the upper edge side from the coordinates on the straight line 65 connecting the logical edge coordinates 61 for the upper edge and the logical edge coordinates 63 for the lower edge.
  • Provisional edge coordinates 71 which are coordinates are obtained.
  • FIG. 13 the degree of separation ⁇ is maximized on the upper edge side from the coordinates on the straight line 65 connecting the logical edge coordinates 61 for the upper edge and the logical edge coordinates 63 for the lower edge.
  • provisional edge coordinates 72 that are coordinates that maximize the degree of separation ⁇ on the lower edge side are obtained. Further, as shown in FIG. 14, from the coordinates on the straight line 66 connecting the logical edge coordinates 63 for the left edge and the logical edge coordinates 64 for the right edge, the coordinates that maximize the degree of separation ⁇ on the left edge side. A temporary edge coordinate 73 and a temporary edge coordinate 74 that is a coordinate that maximizes the degree of separation ⁇ on the right edge side are obtained. As described above, the four temporary edge coordinates 71 to 74 are obtained.
  • the coordinates 81 of the midpoint of the line segment 75 connecting the temporary edge coordinates 71 on the upper edge side and the temporary edge coordinates 72 on the lower edge side are obtained.
  • the coordinates 82 of the midpoint of the line segment 76 connecting the temporary edge coordinates 73 on the left edge side and the temporary edge coordinates 74 on the right edge side are obtained.
  • the coordinate 80 of the intersection of the straight line 85 passing through the coordinate 81 and parallel to the X axis and the straight line 86 passing through the coordinate 82 and parallel to the Y axis is the actual center coordinate of the misregistration detection well. Determined.
  • the X coordinate of the actual center coordinate is obtained based on the X coordinate of the temporary edge coordinate 73 on the left edge side and the X coordinate of the temporary edge coordinate 74 on the right edge side. Based on the Y coordinate of the edge coordinate 71 and the Y coordinate of the temporary edge coordinate 72 on the lower edge side, the actual Y coordinate of the center coordinate is obtained.
  • the vicinity of the end edge (for example, the vicinity of the upper edge) is arcuate.
  • the straight line connecting the logical edge coordinates for the upper edge and the logical edge coordinates for the lower edge does not pass through the upper edge of the actual positional deviation detection well.
  • the provisional edge coordinates for the upper edge side for example, are calculated using the rectangular separation filter 40, the straight line 65 connecting the logical edge coordinates for the upper edge and the logical edge coordinates for the lower edge.
  • the degree of separation ⁇ does not take a peak value at the coordinate 78 (see FIG.
  • the coordinate 79 at a position different from the position on the edge of the actual misregistration detection well may be a temporary edge coordinate (see FIG. 19).
  • the temporary edge coordinates on the upper edge side become the coordinates inside the edge of the actual misalignment detection well
  • the temporary edge coordinates on the lower edge side are also the actual misalignment detection well edge. If the temporary edge coordinates on the upper edge side become the coordinates outside the edge of the actual misalignment detection well, the temporary edge coordinates on the lower edge side are also used for actual misalignment detection. Coordinates outside the edge of the well.
  • the actual center coordinate Y of the misregistration detection well is Y. Coordinates are detected correctly. Similarly, even if the temporary edge coordinates on the left edge side and the right edge side are different from the actual position on the edge of the misregistration detection well, the actual center coordinate of the misregistration detection well The X coordinate is detected correctly.
  • the orientations of the rectangular separability filters 40 are opposite to each other (rotated 180 degrees), and the left edge side
  • the directions of the rectangular separability filter 40 are reversed (in a state rotated by 180 degrees).
  • the parallel displacement amount and angle representing the degree of misregistration are calculated (step S70). More specifically, in step S70, the displacement between the reference position of the well plate 20 in an ideal placement state and the reference position of the well plate 20 in the state of being actually placed on the holder 121 is determined as the amount of displacement. A parallel displacement amount representing the size and an angle representing an inclination from the ideal placement state of the well plate 20 in the state actually placed on the holder 121 are calculated.
  • the parallel displacement amount includes a displacement amount with respect to the X coordinate and a displacement amount with respect to the Y coordinate.
  • the positional deviation amount (parallel displacement amount and angle) will be described more specifically.
  • a solid line in FIG. 20 a case where the well plate 20 is placed on the holder 121 in an obliquely distorted state from an ideal placement state (state shown by a broken line) is taken as an example.
  • the position deviation detection well closer to the reference point is referred to as a “first position deviation detection well”, and the position deviation farther from the reference point.
  • the detection well is referred to as a “second misalignment detection well”.
  • the parallel displacement amount is obtained for only one of the first misalignment detection well and the second misalignment detection well.
  • the parallel displacement amount is obtained only for the first misalignment detection well.
  • the parallel displacement amount for both the first misregistration detection well and the second misregistration detection well may be obtained. Focusing on the first misalignment detection well, the center coordinates 70a when the well plate 20 is ideally placed can be obtained from the definition file described above. Further, the actual center coordinates 80a of the first misalignment detection well are calculated in step S60. Based on these two center coordinates 70a and 80a, the displacement amount for the X coordinate and the displacement amount for the Y coordinate are obtained.
  • step S70 the parallel displacement amount and angle representing the degree of positional deviation from the ideal mounting state of the well plate 20 are calculated.
  • the sample storage unit selection step is realized in step S10
  • the logical edge coordinate calculation step is realized in step S20
  • the imaging step is realized in step S30
  • the temporary edge coordinate detection step is executed in step S40.
  • the center coordinate calculating step is realized by step S60
  • the positional deviation amount calculating step is realized by step S70.
  • FIG. 22 is a flowchart showing an imaging procedure after the positional deviation amount is detected.
  • processing for adjusting the state of the imaging device 10 to a state for starting imaging is performed (step S110).
  • the imaging start position is adjusted.
  • the stage 12 is fixed (that is, the holder 121 is fixed), and the imaging unit 13 is configured to be movable (see FIG. 2). Since the imaging device 10 having such a configuration is employed, in step S110, the position of the imaging unit 13 is adjusted based on the parallel displacement amount calculated in step S70 by the operation of the camera driving mechanism 14 (imaging). The position of the unit 13 moves).
  • the imaging of the well plate 20 is performed by the imaging unit 13 so that desired image data for observing a sample such as a cell can be obtained (step S120).
  • the imaging unit 13 performs imaging while moving in the direction of the angle calculated in step S70 with respect to the X axis.
  • the imaging unit 13 is moved in a direction oblique to the original scanning movement direction according to the angle calculated in step S70. Imaging is performed while moving to.
  • the adjustment step is realized by step S110, and the sample container imaging step is realized by step S120.
  • the actual center coordinates of the two wells (the misalignment detection wells) 21 used for detecting the misalignment of the well plate 20 are rectangular separation degrees with respect to the captured image in the region near the edge. It is calculated based on the temporary edge coordinates detected by applying the filter 40.
  • the coordinates of the center position of the rectangular separability filter 40 when the separability peak value is obtained by the processing using the rectangular separability filter 40 are set as temporary edge coordinates. Regardless of the state of the cells in the well 21 or the culture medium, the degree of separation is maximized when the center position of the rectangular separation filter 40 is near the edge of the well 21.
  • a fixed coordinate is detected as the temporary edge coordinate regardless of the state of the cells in the well 21 or the culture solution. That is, even if a stable captured image cannot be obtained due to a difference in the amount of the culture solution for each imaging target or cell proliferation, the temporary edge coordinates can be detected with high accuracy. Since the actual center coordinates of the two misregistration detection wells are obtained based on such temporary edge coordinates, the misregistration amount can be calculated with high accuracy. In addition, only a total of eight captured images in the vicinity of the edge are necessary for detecting misalignment, and no processing using a template image is performed in misalignment detection processing.
  • the original imaging for observing a sample such as a cell is performed in consideration of the position deviation of the well plate 20. For this reason, even if a position shift occurs when the well plate 20 is placed on the holder 121 by an operator, a desired captured image can be obtained without wasteful imaging.
  • the positional deviation occurs.
  • imaging by the imaging unit 13 is performed without moving the well plate 20. Therefore, even if a position shift occurs when the well plate 20 is placed on the holder 121 by an operator, a desired captured image can be obtained without damaging cells or the like.
  • the stage 12 is in a fixed state (that is, the holder 121 is fixed), and the imaging unit 13 is configured to be movable. For this reason, imaging in consideration of positional deviation has been performed by moving the imaging unit 13 in a direction oblique to the original scanning movement direction after adjusting the position of the imaging unit 13 (imaging start position).
  • the present invention is not limited to this.
  • a modified example related to imaging in consideration of positional deviation will be described with reference to FIG.
  • the stage 12 on which the well plate 20 is placed is configured to be movable and rotatable (in other words, the holder 121 is configured to be movable and rotatable).
  • the imaging unit 13 is fixed.
  • a process of adjusting the state of the imaging device 10 to a state for starting imaging is performed (step S110). Specifically, the stage 12 is rotated (the holder 121 is rotated) based on the angle calculated in the positional deviation detection process, and the stage 12 is moved based on the parallel displacement amount calculated in the positional deviation detection process ( The holder 121 is moved).
  • step S120 the well plate 20 is imaged by the imaging unit 13 (step S120).
  • the stage 12 (holder 121) moves in the X-axis direction or the Y-axis direction. In this way, imaging is performed while the stage 12 (holder 121) is moved relative to the imaging unit 13.
  • the stage 12 on which the well plate 20 is placed is configured to be movable and rotatable (in other words, the holder 121 is configured to be movable and rotatable).
  • the imaging unit 13 is configured to be movable.
  • the stage 12 is rotated and moved (the holder 121 is rotated and moved) in the same manner as in the first modified example (step S110).
  • the well plate 20 is imaged by the imaging unit 13 (step S120).
  • the imaging unit 13 moves in the X-axis direction or the Y-axis direction.

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Abstract

撮像装置に載置された試料容器の位置ずれを処理に必要なデータ量を増大させることなく高速に精度良く検出する方法を提供する。　２つのウェルを選択し（ステップＳ１０）、それらの上下左右の論理エッジ座標を算出する（ステップＳ２０）。各論理エッジ座標近傍の撮像を行い（ステップＳ３０）、各撮像画像に対して矩形分離度フィルタを適用し、各撮像画像について分離度のピーク値が得られたときの矩形分離度フィルタの中心位置の座標を仮エッジ座標として検出する（ステップＳ４０）。その後、ステップＳ１０で選択された各ウェルにつき、上下左右の仮エッジ座標に基づいて実際の中心座標を算出する（ステップＳ６０）。最後に、ステップＳ１０で選択された２つのウェルの中心座標に基づいてウェルプレートの理想的な載置状態からの位置ずれ量を算出する（ステップＳ７０）。

Description

試料容器の位置ずれ検出方法およびそれを用いた撮像方法、ならびに試料容器の位置ずれ検出装置
　本発明は、ウェルプレート等の試料容器がステージ上に載置された際の位置ずれを検出する方法に関する。
　従来より、医療・創薬などの分野において、「ウェルプレート」，「マイクロプレート」などと呼ばれる試料容器で培養された細胞等を試料として観察することが行われている。そのような試料容器にはウェルと呼ばれるくぼみ状の複数の試料収納部が形成されており、一般に試料は液体状の培地とともにウェルに注入されている。近年、そのような試料をＣＣＤカメラ等を搭載した撮像装置によって撮像し、撮像によって得られた画像データを用いて試料を観察することが行われている。例えば、がんの創薬研究において、培地としての液体（培養液）とともにウェルに注入されたがん細胞を撮像装置で撮像することによって、がん細胞の観察や分析がなされている。
　図２３は、ウェルプレート２０の一例を示す斜視図である。図２３に示す例では、２４個のウェル２１がウェルプレート２０に設けられている。撮像装置による撮像が行われる際、このようなウェルプレート２０が、作業者によってステージ上の所定の位置に載置（セット）される。より詳しくは、例えば図２４に示すようにステージ１２にはウェルプレート２０を保持するためのホルダ１２１が形成されており、作業者によってウェルプレート２０がホルダ１２１に載置される。
　ところで、通常、作業者は、図２５で符号９０で示す部分のようにウェルプレート２０の角をホルダ１２１の角に合わせるようにしてウェルプレート２０の載置を行う。これにより、ウェルプレート２０は理想的な状態でホルダ１２１内に保持され、所望の撮像画像が得られる。ところが、作業者がウェルプレート２０の載置を雑に行った場合や撮像開始までに何らかの外力がウェルプレート２０に加わった場合など、撮像開始時にウェルプレート２０がホルダ１２１内で理想的な状態で保持されていないことがある。例えば、図２６に示すように、撮像開始時にウェルプレート２０が理想的な状態から斜めに歪んだ状態（理想的な状態から回転した状態）になっていることがある。このような位置ずれが生じた状態で撮像が行われると、例えば所望の範囲とは異なる範囲の画像が得られるなど所望の撮像画像が得られない。
　上述のような位置ずれに対処する手法としては、例えば、パターンマッチングを用いる手法（以下、「第１の従来手法」という。）が知られている。第１の従来手法では、位置ずれが生じた状態での撮像画像と予め登録されたテンプレート画像とを用いて正規化相関などのパターンマッチングを行うことによって実際のウェルの中心位置が求められる。また、日本の特開平１０－２７２４６号公報に開示された手法（以下、「第２の従来手法」という。）によれば、撮像画像およびテンプレート画像を２値化したそれぞれの２値化画像の特徴箇所の重心が求められ、重心の並びから求められるそれぞれの回帰直線に基づいて撮像画像とテンプレート画像との間の角度や並行変位量が求められる。
日本の特開平１０－２７２４６号公報
　ところが、第１の従来手法や第２の従来手法によれば、例えば、培養中の細胞の増殖によってウェルの撮像画像が変化したり、培養液の量によって撮像画像の明るさが変動したりする。このように安定した撮像画像が得られず、ロバスト性が低いため、精度良く位置ずれを検出することができない。また、医療・創薬などの分野で使用される撮像装置については高解像度化が進んでいるため、ウェルの撮像で得られる画像のデータ量は増大傾向にある。このため、第１の従来手法や第２の従来手法のようにテンプレート画像を用いた手法を採用した場合、今後、記憶容量の圧迫・不足や処理時間の増大が懸念される。
　そこで、本発明は、撮像装置に載置された試料容器の位置ずれを処理に必要なデータ量を増大させることなく高速に精度良く検出する方法を提供することを目的とする。
　本発明の第１の局面は、複数の試料収納部を有する試料容器が撮像装置の試料容器保持部に載置された際の前記試料容器の理想的な載置状態からの位置ずれ量を検出する、試料容器の位置ずれ検出方法であって、
　前記複数の試料収納部の中から２つの試料収納部を位置ずれ検出用試料収納部として選択する試料収納部選択ステップと、
　各位置ずれ検出用試料収納部につき、理想的な載置状態における上端、下端、左端、および右端の座標である論理エッジ座標を算出する論理エッジ座標算出ステップと、
　前記論理エッジ座標算出ステップで算出された各論理エッジ座標を中心位置として所定範囲の撮像を行う撮像ステップと、
　各位置ずれ検出用試料収納部につき、前記撮像ステップでの撮像で得られた上端側、下端側、左端側、および右端側の各撮像画像に対して２つの領域間の分離度を求める分離度フィルタを当該分離度フィルタの中心位置をずらしつつ適用し、各撮像画像について分離度のピーク値が得られたときの当該分離度フィルタの中心位置の座標を仮エッジ座標として検出する仮エッジ座標検出ステップと、
　各位置ずれ検出用試料収納部につき、前記仮エッジ座標検出ステップで検出された上端側、下端側、左端側、および右端側の仮エッジ座標に基づいて実際の中心座標を算出する中心座標算出ステップと、
　前記中心座標算出ステップで算出された各位置ずれ検出用試料収納部の中心座標に基づいて、前記試料容器の理想的な載置状態からの位置ずれ量を算出する位置ずれ量算出ステップと
を含むことを特徴とする。
　本発明の第２の局面は、本発明の第１の局面において、
　前記試料容器の形状は矩形であって、
　前記試料容器の長手方向に沿って一列に配置された一群の試料収納部を行と定義したとき、前記試料収納部選択ステップでは、同じ行に属し、かつ、最も離れた位置に配置された２つの試料収納部が前記位置ずれ検出用試料収納部として選択されることを特徴とする。
　本発明の第３の局面は、本発明の第１または第２の局面において、
　前記仮エッジ座標検出ステップでは、前記分離度フィルタとして、２つの矩形領域間の分離度を求める矩形分離度フィルタが用いられることを特徴とする。
　本発明の第４の局面は、本発明の第３の局面において、
　前記仮エッジ座標検出ステップでは、
　　前記位置ずれ検出用試料収納部の上端側または下端側についての仮エッジ座標の検出が行われる際には、当該位置ずれ検出用試料収納部の上端側の論理エッジ座標と当該位置ずれ検出用試料収納部の下端側の論理エッジ座標とを結ぶ直線上で前記矩形分離度フィルタの中心位置を移動させつつ分離度が求められ、
　　前記位置ずれ検出用試料収納部の左端側または右端側についての仮エッジ座標の検出が行われる際には、当該位置ずれ検出用試料収納部の左端側の論理エッジ座標と当該位置ずれ検出用試料収納部の右端側の論理エッジ座標とを結ぶ直線上で前記矩形分離度フィルタの中心位置を移動させつつ分離度が求められることを特徴とする。
　本発明の第５の局面は、本発明の第１から第４までのいずれかの局面において、
　前記位置ずれ量算出ステップでは、前記位置ずれ量として、理想的な載置状態における前記試料容器の所定の基準位置と前記試料容器保持部に実際に載置された状態における前記試料容器の前記基準位置との間の変位の大きさを表す並行変位量と、前記試料容器保持部に実際に載置された状態における前記試料容器の理想的な載置状態からの傾きを表す角度とが算出されることを特徴とする。
　本発明の第６の局面は、本発明の第５の局面において、
　前記試料収納部選択ステップで選択された２つの試料収納部の一方を第１の位置ずれ検出用試料収納部，他方を第２の位置ずれ検出用試料収納部と定義し、理想的な載置状態における前記第１の位置ずれ検出用試料収納部の中心座標および前記第２の位置ずれ検出用試料収納部の中心座標をそれぞれ第１の理想中心座標および第２の理想中心座標と定義し、前記中心座標算出ステップで算出された前記第１の位置ずれ検出用試料収納部の中心座標および前記第２の位置ずれ検出用試料収納部の中心座標をそれぞれ第１の実中心座標および第２の実中心座標と定義したとき、前記位置ずれ量算出ステップでは、前記位置ずれ量として、前記第１の理想中心座標と前記第１の実中心座標との間の変位の大きさを表す並行変位量と、前記第１の理想中心座標と前記第２の理想中心座標とを結ぶ直線と前記第１の実中心座標と前記第２の実中心座標とを結ぶ直線とのなす角度とが算出されることを特徴とする。
　本発明の第７の局面は、本発明の第１から第６までのいずれかの局面において、
　前記仮エッジ座標検出ステップにおいて分離度のピーク値が正常に得られない撮像画像が存在したとき、前記撮像装置が警告の表示を行うことを特徴とする。
　本発明の第８の局面は、
　複数の試料収納部を有する試料容器を撮像装置によって撮像する撮像方法であって、
　本発明の第１の局面に係る位置ずれ検出方法を用いて得られた位置ずれ量に基づいて、前記撮像装置の状態を撮像を開始するための状態に調整する調整ステップと、
　前記試料容器の撮像を行う試料容器撮像ステップと
を含むことを特徴とする。
　本発明の第９の局面は、本発明の第８の局面において、
　前記撮像装置に設けられた撮像部は、移動可能に構成され、
　前記位置ずれ量算出ステップでは、前記位置ずれ量として、理想的な載置状態における前記試料容器の所定の基準位置と前記試料容器保持部に実際に載置された状態における前記試料容器の前記基準位置との間の変位の大きさを表す並行変位量と、前記試料容器保持部に実際に載置された状態における前記試料容器の理想的な載置状態からの傾きを表す角度とが算出され、
　前記調整ステップでは、前記位置ずれ量算出ステップで算出された並行変位量に基づいて、前記撮像部の撮像開始位置の調整が行われ、
　前記試料容器撮像ステップでは、前記位置ずれ量算出ステップで算出された角度に従って前記撮像部を移動させながら前記試料容器の撮像が行われることを特徴とする。
　本発明の第１０の局面は、本発明の第８の局面において、
　前記試料容器保持部は、移動可能かつ回転可能に構成され、
　前記位置ずれ量算出ステップでは、前記位置ずれ量として、理想的な載置状態における前記試料容器の所定の基準位置と前記試料容器保持部に実際に載置された状態における前記試料容器の前記基準位置との間の変位の大きさを表す並行変位量と、前記試料容器保持部に実際に載置された状態における前記試料容器の理想的な載置状態からの傾きを表す角度とが算出され、
　前記調整ステップでは、前記位置ずれ量算出ステップで算出された角度に基づいて前記試料容器保持部の回転が行われるとともに前記位置ずれ量算出ステップで算出された並行変位量に基づいて前記試料容器保持部の移動が行われ、
　前記試料容器撮像ステップでは、前記撮像装置に設けられた撮像部に対して前記試料容器保持部を相対的に移動させながら前記試料容器の撮像が行われることを特徴とする。
　本発明の第１１の局面は、本発明の第８の局面において、
　前記撮像装置に設けられた撮像部は、移動可能に構成され、
　前記試料容器保持部は、移動可能かつ回転可能に構成され、
　前記位置ずれ量算出ステップでは、前記位置ずれ量として、理想的な載置状態における前記試料容器の所定の基準位置と前記試料容器保持部に実際に載置された状態における前記試料容器の前記基準位置との間の変位の大きさを表す並行変位量と、前記試料容器保持部に実際に載置された状態における前記試料容器の理想的な載置状態からの傾きを表す角度とが算出され、
　前記調整ステップでは、前記位置ずれ量算出ステップで算出された角度に基づいて前記試料容器保持部の回転が行われるとともに前記位置ずれ量算出ステップで算出された並行変位量に基づいて前記試料容器保持部の移動が行われ、
　前記試料容器撮像ステップでは、前記撮像部を移動させながら前記試料容器の撮像が行われることを特徴とする。
　本発明の第１２の局面は、複数の試料収納部を有する試料容器が試料容器保持部に載置された際の前記試料容器の理想的な載置状態からの位置ずれ量を検出する、試料容器の位置ずれ検出装置であって、
　前記複数の試料収納部の中から２つの試料収納部を位置ずれ検出用試料収納部として選択する試料収納部選択手段と、
　各位置ずれ検出用試料収納部につき、理想的な載置状態における上端、下端、左端、および右端の座標である論理エッジ座標を算出する論理エッジ座標算出手段と、
　前記論理エッジ座標算出手段によって算出された各論理エッジ座標を中心位置として所定範囲の撮像を行う撮像手段と、
　各位置ずれ検出用試料収納部につき、前記撮像手段による撮像で得られた上端側、下端側、左端側、および右端側の各撮像画像に対して２つの領域間の分離度を求める分離度フィルタを当該分離度フィルタの中心位置をずらしつつ適用し、各撮像画像について分離度のピーク値が得られたときの当該分離度フィルタの中心位置の座標を仮エッジ座標として検出する仮エッジ座標検出手段と、
　各位置ずれ検出用試料収納部につき、前記仮エッジ座標検出手段によって検出された上端側、下端側、左端側、および右端側の仮エッジ座標に基づいて実際の中心座標を算出する中心座標算出手段と、
　前記中心座標算出手段によって算出された各位置ずれ検出用試料収納部の中心座標に基づいて、前記試料容器の理想的な載置状態からの位置ずれ量を算出する位置ずれ量算出手段と
を備えることを特徴とする。
　本発明の第１の局面によれば、試料容器の位置ずれを検出するために用いられる２つの試料収納部（位置ずれ検出用試料収納部）の実際の中心座標は、エッジ近傍領域の撮像画像に対して分離度フィルタを適用することによって検出される仮エッジ座標に基づいて算出される。ここで、分離度フィルタを用いた処理で分離度のピーク値が得られたときの分離度フィルタの中心位置の座標が仮エッジ座標とされる。試料収納部内の細胞や培養液の状態に関わらず、分離度フィルタの中心位置が試料収納部のエッジ近傍にある時に分離度は最大となる。従って、同じような位置ずれが生じている場合、試料収納部内の細胞や培養液の状態に関わらず、一定の座標が仮エッジ座標として検出される。すなわち、たとえ撮像対象毎の培養液の量の違いや細胞増殖などに起因して安定した撮像画像が得られなくても、精度良く仮エッジ座標が検出される。このような仮エッジ座標に基づいて２つの試料収納部の実際の中心座標が求められるので、位置ずれ量の算出が精度良く行われる。また、位置ずれの検出に必要とされる撮像画像は合計８箇所のエッジ近傍領域の撮像画像だけであり、テンプレート画像を用いた処理は行われない。このため、処理に必要なデータ量を増大させることなく高速に位置ずれを検出することができる。以上のように、撮像装置の試料容器保持部に載置された試料容器の位置ずれを処理に必要なデータ量を増大させることなく高速に精度良く検出することが可能となる。
　本発明の第２の局面によれば、位置ずれの検出精度が高められる。
　本発明の第３の局面によれば、複雑な処理を要することなく仮エッジ座標が検出される。
　本発明の第４の局面によれば、仮エッジ座標の検出精度が高められる。
　本発明の第５の局面によれば、位置ずれ量として並行変位量および角度が算出されるので、算出結果に基づいて所望の撮像画像が得られるよう撮像装置を動作させることが可能となる。
　本発明の第６の局面によれば、本発明の第５の局面と同様の効果が得られる。
　本発明の第７の局面によれば、試料容器の位置ずれの程度が大きい場合に例えば作業者に試料容器保持部への試料容器の載置のやり直しを促すことが可能となる。
　本発明の第８の局面によれば、試料容器の位置ずれを考慮して当該試料容器の撮像が行われる。このため、試料容器の撮像が行われる際に当該試料容器に位置ずれが生じていても、無駄な撮像が行われることなく、所望の撮像画像が得られる。
　本発明の第９の局面によれば、試料容器の撮像が行われる際に当該試料容器に位置ずれが生じていても、作業者による試料容器保持部への試料容器の載置のやり直しを要することなく、所望の撮像画像が得られる。また、試料容器に位置ずれが生じているときに、当該試料容器を移動させることなく撮像部による撮像が行われるので、細胞等にダメージを及ぼすことなく所望の撮像画像が得られる。
　本発明の第１０の局面によれば、試料容器の撮像が行われる際に当該試料容器に位置ずれが生じていても、作業者による試料容器保持部への試料容器の載置のやり直しを要することなく、所望の撮像画像が得られる。
　本発明の第１１の局面によれば、本発明の第１０の局面と同様の効果が得られる。
　本発明の第１２の局面によれば、本発明の第１の局面と同様の効果が得られる。
ウェルのエッジについて説明するための図である。 本発明の一実施形態に係る撮像装置の構成を示す図である。 上記実施形態において、位置ずれ検出処理の手順を示すフローチャートである。 上記実施形態において、位置ずれ検出用ウェルの選択について説明するための図である。 上記実施形態において、丸型ウェルが採用されている場合における論理エッジ座標の算出について説明するための図である。 上記実施形態において、角丸正方形型ウェルが採用されている場合における論理エッジ座標の算出について説明するための図である。 上記実施形態において、矩形分離度フィルタについて説明するための図である。 上記実施形態において、矩形分離度フィルタを用いた分離度の算出について説明するための図である。 上記実施形態において、仮エッジ座標を検出する際の矩形分離度フィルタの移動について説明するための図である。 上記実施形態において、分離度の算出結果をグラフで表した図である。 上記実施形態において、図４において符号Ａ１で示すウェルの下エッジ側の仮エッジ座標の検出について説明するための図である。 上記実施形態において、仮エッジ座標の検出について説明するための図である。 上記実施形態において、仮エッジ座標の検出について説明するための図である。 上記実施形態において、仮エッジ座標の検出について説明するための図である。 上記実施形態において、位置ずれ検出用ウェルの実際の中心座標の算出について説明するための図である。 上記実施形態において、位置ずれ検出用ウェルの実際の中心座標の算出について説明するための図である。 上記実施形態において、位置ずれ検出用ウェルの実際の中心座標の算出について説明するための図である。 上記実施形態において、仮エッジ座標が実際の位置ずれ検出用ウェルのエッジ上の位置とは異なる位置の座標となっても位置ずれ検出用ウェルの実際の中心座標が正しく検出されることを説明するための図である。 上記実施形態において、仮エッジ座標が実際の位置ずれ検出用ウェルのエッジ上の位置とは異なる位置の座標となっても位置ずれ検出用ウェルの実際の中心座標が正しく検出されることを説明するための図である。 上記実施形態において、位置ずれの程度を表す並行変位量および角度の算出について説明するための図である。 上記実施形態において、位置ずれの程度を表す並行変位量および角度の算出について説明するための図である。 上記実施形態において、位置ずれ量検出後の撮像手順を示すフローチャートである。 ウェルプレートの一例を示す斜視図である。 ウェルプレートを保持するためのホルダについて説明するための図である。 ウェルプレートの理想的な載置状態について説明するための図である。 ウェルプレートが理想的な載置状態から斜めに歪んだ状態になっている様子を示す図である。
　以下、添付図面を参照しつつ本発明の一実施形態について説明する。なお、以下の説明では、「左上隅に座標系の原点があり、ウェルプレート２０がホルダ１２１に理想的に載置された場合に、当該ウェルプレート２０の長手方向がＸ軸と平行になり、当該ウェルプレート２０の短手方向がＹ軸と平行になる」と仮定する。また、一般的にはウェル２１の端部（周縁部）全体（例えば、丸型ウェルの場合、外形を形成する円全体）が「エッジ」と呼ばれているが、以下の説明では、各ウェル２１に関し、図１に示すように、Ｙ座標が最も小さいエッジ部分のことを「上エッジ」といい、Ｙ座標が最も大きいエッジ部分のことを「下エッジ」といい、Ｘ座標が最も小さいエッジ部分のことを「左エッジ」といい、Ｘ座標が最も大きいエッジ部分のことを「右エッジ」という。また、「上エッジ」、「下エッジ」、「左エッジ」、および「右エッジ」を総称して便宜上「エンドエッジ」という。
＜１．撮像装置の構成＞
　図２は、本発明の一実施形態に係る撮像装置１０の構成を示す図である。この撮像装置１０は、試料容器としてのウェルプレート２０に形成されているウェル２１内で培養されている細胞、細胞コロニー、細菌等（以下、これらをまとめて「細胞等」という。）の試料を撮像するための装置である。ウェルプレート２０は、平板状の形状を有している。ウェルプレート２０には、上面側に開口を有し下面側に透明の底面を有する試料収納部としての複数個（例えば、６個、２４個、９６個、３８４個など）のウェル２１が配列されている。ウェル２１の形状については、典型的には、断面は円形状であって、底面は平坦状になっている。但し、ウェル２１の断面および底面の形状はこれには限定されない。各ウェル２１には、細胞等に生育環境を提供する培地としての液体（培養液）が所定量注入される。各ウェル２１に注入される液体の量は、一般的には５０～２００マイクロリットル程度である。
　図２に示すように、この撮像装置１０は、撮像用の光を出射する光源１１と、ウェルプレート２０が載置されるステージ１２と、ウェル２１内の試料（細胞等）の撮像を行う撮像ユニット１３と、撮像の際に撮像ユニット１３を移動させるカメラ駆動機構１４と、光源１１，撮像ユニット１３，およびカメラ駆動機構１４の動作を制御する制御部１５とを備えている。図２４に示したように、ステージ１２には、撮像の際にウェルプレート２０を保持するためのホルダ１２１が形成されている。なお、このホルダ１２１によって試料容器保持部が実現されている。光源１１は、この撮像装置１０の上部に配置されている。ステージ１２は光源１１の下方に配置され、撮像ユニット１３はステージ１２の下方に配置されている。
　光源１１は、制御部１５内の光源制御部１５２から与えられる制御指令に基づき、ホルダ１２１に保持されているウェルプレート２０の上方からウェル２１に対して光Ｌを照射する。照射される光Ｌは可視光であって、典型的には白色光である。なお、赤色，緑色，および青色の光源を個別に点灯させ特定の色の光を照射した状態で撮像が行われることもある。
　撮像装置１０による撮像が行われる際、試料（細胞等）および培地を保持する複数のウェル２１からなるウェルプレート２０は、ステージ１２に形成されているホルダ１２１内に保持される。ホルダ１２１は、ウェルプレート２０の下面周縁部に当接してウェルプレート２０を略水平姿勢に保持する。
　撮像ユニット１３は、光源１１から出射されてホルダ１２１に保持されたウェルプレート２０の下方に透過してくる透過光Ｌｔを受光することによって、ウェルプレート２０の画像を撮像する。撮像ユニット１３はカメラ駆動機構１４に連結されており、カメラ駆動機構１４の動作によって撮像ユニット１３はウェルプレート２０の下面に沿って水平移動する。すなわち、撮像ユニット１３がウェルプレート２０の下面に沿って走査移動可能となっている。但し、撮像ユニット１３とウェルプレート２０との間の相対移動が実現されれば良く、移動可能なステージ１２を用いた構成を採用することにより撮像の際にウェルプレート２０を移動させるようにしてもよい。なお、図２では光源１１がウェルプレート２０の全面に光を照射しているように図示しているが、撮像ユニット１３による撮像対象のウェル２１だけに光を照射するものもある。また、撮像ユニット１３と同期して光源１１が移動するものもある。
　カメラ駆動機構１４は、制御部１５内の撮像制御部１５３から与えられる制御指令に基づき、撮像ユニット１３を水平方向に移動させる。
　制御部１５は、ＣＰＵ１５１、光源制御部１５２、撮像制御部１５３、ＡＤコンバータ（Ａ／Ｄ）１５４、記憶部１５５、およびインタフェース部１５６を備えている。ＣＰＵ１５１は、制御部１５内の各構成要素の動作の制御や各種演算処理を行う。光源制御部１５２は、光源１１の点灯状態を制御する。撮像制御部１５３は、所定の走査移動レシピに従って撮像対象物の撮像が行われるよう、撮像ユニット１３およびカメラ駆動機構１４の動作を制御する。ＡＤコンバータ（Ａ／Ｄ）１５４は、撮像ユニット１３による撮像で得られた画像信号（アナログデータ）を受け取り、それをデジタル画像データに変換する。記憶部１５５は、そのデジタル画像データを保持する。そのデジタル画像データに基づき、ＣＰＵ１５１は適宜の画像処理を実行する。インタフェース部１５６は、作業者からの操作入力を受け付ける機能、作業者への処理結果等の情報表示を行う機能、通信回線を介して他の装置との間でのデータ通信を行う機能などを有している。なお、インタフェース部１５６には、操作入力を受け付ける入力受付部（キーボードやマウスなど）、情報表示を行う表示部、通信回線などが接続されている。
＜２．位置ずれ検出処理＞
　本実施形態に係る撮像装置１０では、ウェルプレート２０がホルダ１２１内で理想的な載置状態からどれだけずれた状態で保持されているのかを検出する（並行変位量および角度を検出する）位置ずれ検出処理が行われる。そして、位置ずれ検出処理で検出された並行変位量および角度を考慮して、目的とする撮像画像を得るための撮像が行われる。なお、位置ずれ検出処理は、例えば、制御部１５の記憶部１５５内に保持された位置ずれ検出処理用のプログラムをＣＰＵ１５１が実行することによって行われる。
　図３は、本実施形態における位置ずれ検出処理の手順を示すフローチャートである。まず、この位置ずれ検出処理で用いる２つのウェル２１の選択が行われる（ステップＳ１０）。但し、３つ以上のウェル２１を選択して後述するステップで正常に中心座標が算出されたウェル２１の情報に基づいて位置ずれ量（並行変位量および角度）を求めるようにしても良いし、また、複数のウェル２１の中心座標に基づく多数の位置ずれ量の算出結果の中から最も確からしい結果を位置ずれ量（並行変位量および角度）の検出結果として採用するようにしても良い。以下、このステップＳ１０で選択されるウェル２１のことを「位置ずれ検出用ウェル」という。一般に、ウェルプレート２０の形状は、図２３に示したように矩形である。ここで、長手方向に沿って一列に配置された一群のウェル２１を「行」と定義し、短手方向に沿って一列に配置された一群のウェル２１を「列」と定義する。ステップＳ１０では、ウェルプレート２０内の任意の２つのウェル２１を位置ずれ検出用ウェルとして選択することができるが、位置ずれの検出精度を高めるという観点からは、同じ行に属し、かつ、最も離れた位置に配置された２つのウェル２１を位置ずれ検出用ウェルとして選択することが好ましい。
　例えば、２４個のウェル２１を有するウェルプレート２０に関し、図４に示すように行番号および列番号が割り当てられていると仮定する。なお、図４では、行番号と列番号とを組み合わせた符号をウェルに付している。図４に示す例の場合、位置ずれの検出精度を高めるという観点から、位置ずれ検出用ウェルとして、ウェルＡ１とウェルＡ６とが選択されても良いし、ウェルＢ１とウェルＢ６とが選択されても良いし、ウェルＣ１とウェルＣ６とが選択されても良いし、ウェルＤ１とウェルＤ６とが選択されても良い。
　ところで、撮像装置１０の制御部１５内の記憶部１５５には、ウェルプレート２０の種類（型番）毎に、ウェル２１の個数、ウェル２１のサイズ、隣接する２つのウェル２１の間隔などの情報を記述した定義ファイルが保持されている。この定義ファイルに基づき、ウェルプレート２０の種類毎に、どの２つのウェル２１を位置ずれ検出用ウェルとして選択すれば良いのかを予め定めておくことができる。従って、この位置ずれ検出処理が実際に行われる際には、ホルダ１２１に保持されているウェルプレート２０の種類（種類の情報は、作業開始時に制御部１５に入力される）に応じて、予め定められた２つのウェル２１が位置ずれ検出用ウェルとして選択されるようにすれば良い。但し、この位置ずれ検出処理が実際に行われる際に作業者による位置ずれ検出用ウェルの選択が行われるようにしても良い。
　なお、以下に説明するステップＳ２０～Ｓ６０では、２つの位置ずれ検出用ウェルに対して同様の処理が行われる。従って、以下では、一方の位置ずれ検出用ウェルに着目して処理の説明を行う。
　位置ずれ検出用ウェルが選択された後、当該位置ずれ検出用ウェルの論理エッジ座標が算出される（ステップＳ２０）。なお、論理エッジ座標とは、ウェルプレート２０がホルダ１２１に理想的な状態で載置されているときのウェル２１のエンドエッジの座標（Ｘ座標およびＹ座標）のことである。すなわち、ステップＳ２０では、各位置ずれ検出用ウェルにつき、理想的な載置状態における上エッジ、下エッジ、左エッジ、および右エッジ（図１参照）のそれぞれの座標が求められる。例えば、丸型ウェルが採用されている場合には、図５に示すような４箇所のエッジ部分（上エッジ３１、下エッジ３２、左エッジ３３、および右エッジ３４）の座標が求められる。また、例えば、角丸正方形型ウェル（概形は正方形であって四隅が弧状になっているウェル）が採用されている場合には、図６に示すような４箇所のエッジ部分（上エッジ３５、下エッジ３６、左エッジ３７、および右エッジ３８）の座標が求められる。なお、論理エッジ座標については、上述した定義ファイル内の情報に基づいて算出することができる。
　次に、ステップＳ２０で算出された各論理エッジ座標を中心位置として所定範囲の撮像が行われる（ステップＳ３０）。このように論理エッジ座標を中心位置とする撮像が行われるので、ステップＳ３０で得られる撮像画像の中心位置の座標は当該論理エッジ座標に一致する。ステップＳ３０での撮像範囲については、後述するステップＳ４０において仮エッジ座標が好適に求められるよう、適宜の大きさに設定される。なお、ステップＳ２０では各位置ずれ検出用ウェルにつき４つの論理エッジ座標が求められるので、このステップＳ３０では各位置ずれ検出用ウェルにつき４箇所での撮像が行われる。すなわち、各位置ずれ検出用ウェルにつき、上エッジ近傍領域の撮像画像、下エッジ近傍領域の撮像画像、左エッジ近傍領域の撮像画像、および右エッジ近傍領域の撮像画像が得られる。
　次に、後述するステップＳ６０で位置ずれ検出用ウェルの中心座標を算出するために必要な座標を矩形分離度フィルタ４０（図７参照）を用いて検出する処理が行われる（ステップＳ４０）。なお、このステップＳ４０で検出される座標は、後述するように、実際の位置ずれ検出用ウェルのエッジ上の座標もしくはそのごく近傍の座標となる。従って、このステップＳ４０で検出される座標のことを便宜上「仮エッジ座標」という。なお、仮エッジ座標を検出する処理は上エッジ側、下エッジ側、左エッジ側、および右エッジ側のそれぞれについて行われるが、ここでは、上エッジ側に着目して処理の説明を行う。
　矩形分離度フィルタ４０は、画像内の２つの領域間の分離度を求めるためのフィルタである。矩形分離度フィルタ４０を用いた分離度の算出の際には、図７に示すような２つの矩形領域（第１の領域４１および第２の領域４２）を考える。そして、画像内の所望の位置に矩形分離度フィルタ４０を配置した状態で、当該位置における２つの領域（第１の領域４１および第２の領域４２）間の分離度μが次式（１）～（３）を用いて算出される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000003
 　上式（１）～（３）に関し、Ｎは２つの領域（第１の領域４１および第２の領域４２）の全画素数を表し、ｎ1は第１の領域４１内の画素数を表し、ｎ2は第２の領域４２内の画素数を表し、σTは上記２つの領域の全分散値を表し、Ｐiは位置ｉの輝度値を表し、Ｐ1バーは第１の領域４１の平均輝度値を表し、Ｐ2バーは第２の領域４２の平均輝度値を表し、Ｐmバーは上記２つの領域の平均輝度値を表している。
　本実施形態では、撮像画像（ステップＳ３０での撮像で得られた画像）５０に対して例えば図８に示すように矩形分離度フィルタ４０を配置することによって、そのように矩形分離度フィルタ４０が配置された状態での分離度μが求められる。
　仮エッジ座標を検出するに際して、各位置における分離度μを求めつつ、図９に示すように、上エッジについての論理エッジ座標と下エッジについての論理エッジ座標とを結ぶ直線５５上で少しずつ矩形分離度フィルタ４０の中心位置を移動させる。これにより、矩形分離度フィルタ４０の移動間隔に応じて、上記直線５５上の位置における分離度μが得られる。分離度μの算出結果は、模式的には、横軸をＹ座標として縦軸を分離度μとする図１０に示すようなグラフで表される。図１０では、分離度μの算出を開始した位置のＹ座標をＹａで表し、分離度μの算出を終了した位置のＹ座標をＹｂで表している。なお、図１０では得られた分離度μの値を連続的な線で表しているが、実際に得られるのは矩形分離度フィルタ４０の移動間隔に応じた離散的な値である。
　図１０に示す例では、Ｙ座標がＹｋであるときに分離度μが最大になっている。換言すれば、分離度のピーク値は、Ｙ座標がＹｋであるときの値である。そこで、この例では、仮エッジ座標のＹ座標はＹｋとされる。上述したように矩形分離度フィルタ４０の中心位置は上エッジについての論理エッジ座標と下エッジについての論理エッジ座標とを結ぶ直線５５上を移動するので、仮エッジ座標のＸ座標については、上エッジについての論理エッジ座標のＸ座標と同じになる。このようにして、分離度μのピーク値が得られたときの矩形分離度フィルタ４０の中心位置の座標が仮エッジ座標として検出される。なお、分離度μのピーク値が得られる座標を仮エッジ座標とする理由は、ウェル２１の内部とウェル２１の外部とでは輝度値が大きく異なっており、分離度μが最大となる位置もしくはそのごく近傍の位置に実際のエッジが存在すると考えられるからである。以上のことから、このステップＳ４０で検出される仮エッジ座標は、実際の位置ずれ検出用ウェルのエッジ上の座標もしくはそのごく近傍の座標となる。
　ステップＳ４０では、以上のようにして、上エッジ側、下エッジ側、左エッジ側、および右エッジ側のそれぞれについての仮エッジ座標が求められる。なお、左エッジ側あるいは右エッジ側についての仮エッジ座標の検出の際には、矩形分離度フィルタ４０を用いた処理によって、仮エッジ座標のＸ座標が求められる。このとき、仮エッジ座標のＹ座標は、左エッジ・右エッジについての論理エッジ座標のＹ座標と同じになる。
　ところで、隣接する２つのウェル２１の間隔によっては仮エッジ座標の検出が好適に行われないことが懸念される。例えば、図４において符号Ａ１で示すウェルが位置ずれ検出用ウェルとして選択された場合の下エッジ側および右エッジ側についての仮エッジ座標の検出が好適に行われないことが懸念される。しかしながら、通常、２つのウェル２１間には充分な間隔が設けられており、例えば図１１に示すように矩形分離度フィルタ４０の大きさを適宜の大きさに設定することにより、仮エッジ座標の検出が好適に行われる。
　ステップＳ４０の終了後、ステップＳ１０で選択された２つの位置ずれ検出用ウェルの実際の中心座標の算出に必要な全ての仮エッジ座標を検出することができたか否かの判定が行われる（ステップＳ５０）。すなわち、一方の位置ずれ検出用ウェルについての４つの仮エッジ座標および他方の位置ずれ検出用ウェルについての４つの仮エッジ座標の全てをステップＳ４０で正常に検出することができたか否かの判定が行われる。判定の結果、１つでも検出することができなかった仮エッジ座標があれば、処理はステップＳ８０に進む。一方、２つの位置ずれ検出用ウェルの実際の中心座標の算出に必要な全ての仮エッジ座標をステップＳ４０で検出することができた場合には、処理はステップＳ６０に進む。
　ところで、上述したように、矩形分離度フィルタ４０を用いた処理（ステップＳ４０の処理）によって、各位置における分離度μの算出結果として、図１０に示したようなグラフで表し得る結果が得られる。これに関し、図１０に示す例では、Ｙ座標がＹｋである位置に分離度μの値のピークが存在している。しかしながら、例えば位置ずれの程度が極めて大きいときなど、分離度μの値のピークを検出することができない場合もある。すなわち、分離度μのピーク値が正常に得られない撮像画像（ステップＳ３０での撮像で得られた画像）が存在する場合もある。上記ステップＳ５０では、このような場合に「検出することができなかった仮エッジ座標が存在する」旨の判定が行われる。
　ステップＳ８０では、撮像装置１０の制御部１５内のインタフェース部１５６に接続された表示部（不図示）に警告のメッセージ（例えば、ホルダ１２１へのウェルプレート２０の載置のやり直しを促す旨のメッセージ）が表示される。そして、この位置ずれ検出処理は終了する。このとき、位置ずれを考慮した撮像は行われない。
　ステップＳ６０では、ステップＳ４０で検出された仮エッジ座標を用いて位置ずれ検出用ウェルの実際の中心座標が算出される。具体的には、左エッジ側についての仮エッジ座標と右エッジ側についての仮エッジ座標との中点の座標のＸ座標が実際の中心座標のＸ座標に定められ、上エッジ側についての仮エッジ座標と下エッジ側についての仮エッジ座標との中点の座標のＹ座標が実際の中心座標のＹ座標に定められる。このようにして、ステップＳ６０では、一方の位置ずれ検出用ウェルの実際の中心座標（Ｘ座標，Ｙ座標）と他方の位置ずれ検出用ウェルの実際の中心座標（Ｘ座標，Ｙ座標）とが求められる。
　ここで、図１２～図１７を参照しつつ、ステップＳ４０およびステップＳ６０の処理について具体的に説明する。図１２～図１７では、位置ずれ検出用ウェルの理想的な載置状態を点線で表し、位置ずれ検出用ウェルの実際の載置状態を実線で表している。また、図１２～図１４では、４つの論理エッジ座標を符号６１～６４で表している。この例においては、図１３に示すように、上エッジについての論理エッジ座標６１と下エッジについての論理エッジ座標６３とを結ぶ直線６５上の座標から、上エッジ側において分離度μを最大にする座標である仮エッジ座標７１が求められる。同様にして、図１４に示すように、下エッジ側において分離度μを最大にする座標である仮エッジ座標７２が求められる。また、図１４に示すように、左エッジについての論理エッジ座標６３と右エッジについての論理エッジ座標６４とを結ぶ直線６６上の座標から、左エッジ側において分離度μを最大にする座標である仮エッジ座標７３と右エッジ側において分離度μを最大にする座標である仮エッジ座標７４とが求められる。以上のようにして、４つの仮エッジ座標７１～７４が求められる。
　次に、図１５に示すように、上エッジ側についての仮エッジ座標７１と下エッジ側についての仮エッジ座標７２とを結ぶ線分７５の中点の座標８１が求められる。また、図１６に示すように、左エッジ側についての仮エッジ座標７３と右エッジ側についての仮エッジ座標７４とを結ぶ線分７６の中点の座標８２が求められる。そして、図１７に示すように、座標８１を通りＸ軸に平行な直線８５と座標８２を通りＹ軸に平行な直線８６との交点の座標８０が位置ずれ検出用ウェルの実際の中心座標に定められる。このように、左エッジ側についての仮エッジ座標７３のＸ座標と右エッジ側についての仮エッジ座標７４のＸ座標とに基づいて実際の中心座標のＸ座標が求められ、上エッジ側についての仮エッジ座標７１のＹ座標と下エッジ側についての仮エッジ座標７２のＹ座標とに基づいて実際の中心座標のＹ座標が求められる。
　ところで、例えば丸型ウェルが採用されている場合、エンドエッジ近傍（例えば、上エッジ近傍）は弧状になっている。また、Ｘ軸方向の位置ずれがある場合、上エッジについての論理エッジ座標と下エッジについての論理エッジ座標とを結ぶ直線は実際の位置ずれ検出用ウェルの上エッジを通らない。以上のことから、矩形分離度フィルタ４０を用いて例えば上エッジ側についての仮エッジ座標の算出が行われる際に、上エッジについての論理エッジ座標と下エッジについての論理エッジ座標とを結ぶ直線６５と実際の位置ずれ検出用ウェルのエッジとの交点の座標７８（図１８参照）で分離度μがピーク値を取らないことがある。すなわち、実際の位置ずれ検出用ウェルのエッジ上の位置とは異なる位置の座標７９が仮エッジ座標となることがある（図１９参照）。これに関し、上エッジ側についての仮エッジ座標が実際の位置ずれ検出用ウェルのエッジの内部の座標となった場合には、下エッジ側についての仮エッジ座標も実際の位置ずれ検出用ウェルのエッジの内部の座標となり、上エッジ側についての仮エッジ座標が実際の位置ずれ検出用ウェルのエッジの外部の座標となった場合には、下エッジ側についての仮エッジ座標も実際の位置ずれ検出用ウェルのエッジの外部の座標となる。従って、上エッジ側および下エッジ側についての仮エッジ座標が実際の位置ずれ検出用ウェルのエッジ上の位置とは異なる位置の座標となっても、位置ずれ検出用ウェルの実際の中心座標のＹ座標が正しく検出される。同様に、左エッジ側および右エッジ側についての仮エッジ座標が実際の位置ずれ検出用ウェルのエッジ上の位置とは異なる位置の座標となっても、位置ずれ検出用ウェルの実際の中心座標のＸ座標が正しく検出される。なお、上エッジ側についての仮エッジ座標を求める際と下エッジ側についての仮エッジ座標を求める際とでは矩形分離度フィルタ４０の向きを互いに逆（１８０度回転させた状態）にし、左エッジ側についての仮エッジ座標を求める際と右エッジ側についての仮エッジ座標を求める際とでは矩形分離度フィルタ４０の向きを互いに逆（１８０度回転させた状態）にする。
　位置ずれ検出用ウェルの実際の中心座標の算出が行われた後、位置ずれの程度を表す並行変位量および角度の算出が行われる（ステップＳ７０）。より詳しくは、ステップＳ７０では、位置ずれ量として、理想的な載置状態におけるウェルプレート２０の基準位置とホルダ１２１に実際に載置された状態におけるウェルプレート２０の基準位置との間の変位の大きさを表す並行変位量と、ホルダ１２１に実際に載置された状態におけるウェルプレート２０の理想的な載置状態からの傾きを表す角度とが算出される。なお、並行変位量は、Ｘ座標についての変位量とＹ座標についての変位量とからなる。
　図２０および図２１を参照しつつ、位置ずれ量（並行変位量および角度）の算出について、より具体的に説明する。ここでは、図２０において実線で示すように、ウェルプレート２０が理想的な載置状態（破線で示す状態）から斜めに歪んだ状態でホルダ１２１に載置された場合を例に挙げる。また、ここでは、図２１に示すように、基準点（図１参照）に近い方の位置ずれ検出用ウェルを「第１の位置ずれ検出用ウェル」といい、基準点から遠い方の位置ずれ検出用ウェルを「第２の位置ずれ検出用ウェル」という。
　並行変位量は、第１の位置ずれ検出用ウェルおよび第２の位置ずれ検出用ウェルのうちの一方のみについて求められる。例えば、第１の位置ずれ検出用ウェルについてのみ、並行変位量が求められる。但し、第１の位置ずれ検出用ウェルおよび第２の位置ずれ検出用ウェルの双方についての並行変位量が求められても良い。第１の位置ずれ検出用ウェルに着目すると、ウェルプレート２０が理想的に載置された場合の中心座標７０ａについては、上述した定義ファイルから求めることができる。また、第１の位置ずれ検出用ウェルの実際の中心座標８０ａについては、ステップＳ６０で算出されている。これら２つの中心座標７０ａ，８０ａに基づいて、Ｘ座標についての変位量とＹ座標についての変位量とが求められる。
　角度については、ウェルプレート２０が理想的に載置された場合における２つの位置ずれ検出用ウェルの中心座標７０ａ，７０ｂを結ぶ直線７を表す式と２つの位置ずれ検出用ウェルの実際の中心座標８０ａ，８０ｂを結ぶ直線８を表す式とを用いて算出される。ここで、直線７が次式（４）で表され、直線８が次式（５）で表されると仮定する。
ｙ＝ａ1ｘ＋ｂ1　　　・・・（４）
ｙ＝ａ2ｘ＋ｂ2　　　・・・（５）
このとき、直線７と直線８とがなす角度θは、次式（６）に基づいて算出される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000004
 但し、直線７に関しては、上式（４）のａ1が０であることが想定される。この場合、直線７と直線８とがなす角度θに関し、次式（７）が成立する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000005
　以上のようにして、ステップＳ７０では、ウェルプレート２０の理想的な載置状態からの位置ずれの程度を表す並行変位量および角度が算出される。
　なお、本実施形態においては、ステップＳ１０によって試料収納部選択ステップが実現され、ステップＳ２０によって論理エッジ座標算出ステップが実現され、ステップＳ３０によって撮像ステップが実現され、ステップＳ４０によって仮エッジ座標検出ステップが実現され、ステップＳ６０によって中心座標算出ステップが実現され、ステップＳ７０によって位置ずれ量算出ステップが実現されている。
＜３．位置ずれを考慮した撮像＞
　以上のような位置ずれ検出処理の終了後、位置ずれを考慮した撮像が行われる。図２２は、位置ずれ量検出後の撮像手順を示すフローチャートである。位置ずれ検出処理によって位置ずれ量（並行変位量および角度）が検出された後、まず、撮像装置１０の状態を撮像を開始するための状態に調整する処理が行われる（ステップＳ１１０）。具体的には、撮像開始位置の調整が行われる。本実施形態に係る撮像装置１０では、ステージ１２は固定された状態（すなわち、ホルダ１２１は固定された状態）になっており、撮像ユニット１３が移動可能に構成されている（図２参照）。このような構成の撮像装置１０が採用されているので、ステップＳ１１０では、カメラ駆動機構１４の動作により、ステップＳ７０で算出された並行変位量に基づいて撮像ユニット１３の位置が調整される（撮像ユニット１３の位置が移動する）。
　撮像開始位置の調整が行われた後、細胞等の試料を観察するための所望の画像データが得られるよう、撮像ユニット１３によるウェルプレート２０の撮像が行われる（ステップＳ１２０）。本実施形態においては、カメラ駆動機構１４の動作により、撮像ユニット１３は、Ｘ軸に対してステップＳ７０で算出された角度の方向に移動しながら撮像を行う。
　以上のように、ステップＳ７０で算出された並行変位量に基づいて撮像開始位置の調整が行われた後、ステップＳ７０で算出された角度に従い撮像ユニット１３を本来の走査移動方向とは斜めの方向に移動させながら撮像が行われる。
　なお、本実施形態においては、ステップＳ１１０によって調整ステップが実現され、ステップＳ１２０によって試料容器撮像ステップが実現されている。
＜４．効果＞
　本実施形態によれば、ウェルプレート２０の位置ずれを検出するために用いられる２つのウェル（位置ずれ検出用ウェル）２１の実際の中心座標は、エッジ近傍領域の撮像画像に対して矩形分離度フィルタ４０を適用することによって検出される仮エッジ座標に基づいて算出される。ここで、矩形分離度フィルタ４０を用いた処理で分離度のピーク値が得られたときの矩形分離度フィルタ４０の中心位置の座標が仮エッジ座標とされる。ウェル２１内の細胞や培養液の状態に関わらず、矩形分離度フィルタ４０の中心位置がウェル２１のエッジ近傍にある時に分離度は最大となる。従って、同じような位置ずれが生じている場合、ウェル２１内の細胞や培養液の状態に関わらず、一定の座標が仮エッジ座標として検出される。すなわち、たとえ撮像対象毎の培養液の量の違いや細胞増殖などに起因して安定した撮像画像が得られなくても、精度良く仮エッジ座標が検出される。このような仮エッジ座標に基づいて２つの位置ずれ検出用ウェルの実際の中心座標が求められるので、位置ずれ量の算出が精度良く行われる。また、位置ずれの検出に必要とされる撮像画像は合計８箇所のエッジ近傍領域の撮像画像だけであり、位置ずれ検出処理ではテンプレート画像を用いた処理は行われない。このため、処理に必要なデータ量を増大させることなく高速に位置ずれを検出することができる。以上のように、本実施形態によれば、撮像装置１０のホルダ１２１に載置されたウェルプレート２０の位置ずれを処理に必要なデータ量を増大させることなく高速に精度良く検出することが可能となる。
　また、位置ずれ検出処理の終了後には、ウェルプレート２０の位置ずれを考慮して、細胞等の試料を観察するための本来の撮像が行われる。このため、作業者によってウェルプレート２０がホルダ１２１に載置された際に位置ずれが生じていても、無駄な撮像が行われることなく、所望の撮像画像が得られる。
　また、位置ずれが生じているときにホルダ１２１へのウェルプレート２０の載置のやり直しが行われると細胞等にダメージを及ぼすおそれがあるが、本実施形態によれば、位置ずれが生じているときに、ウェルプレート２０を移動させることなく撮像ユニット１３による撮像が行われる。従って、作業者によってウェルプレート２０がホルダ１２１に載置された際に位置ずれが生じていても、細胞等にダメージを及ぼすことなく所望の撮像画像を得ることが可能となる。
＜５．変形例＞
　上記実施形態においては、ステージ１２は固定された状態（すなわち、ホルダ１２１は固定された状態）であって、撮像ユニット１３が移動可能に構成されていた。このため、位置ずれを考慮した撮像は、撮像ユニット１３の位置（撮像開始位置）を調整した後に撮像ユニット１３を本来の走査移動方向とは斜めの方向に移動させることによって行われていた。しかしながら、本発明はこれに限定されない。そこで、以下、図２２を参照しつつ、位置ずれを考慮した撮像に関する変形例について説明する。
＜５．１　第１の変形例＞
　本変形例に係る撮像装置では、ウェルプレート２０が載置されるステージ１２が移動可能かつ回転可能に構成されており（換言すれば、ホルダ１２１が移動可能かつ回転可能に構成されており）、撮像ユニット１３が固定された状態となっている。このような構成において、位置ずれ検出処理の終了後、まず、撮像装置１０の状態を撮像を開始するための状態に調整する処理が行われる（ステップＳ１１０）。具体的には、位置ずれ検出処理で算出された角度に基づいてステージ１２の回転（ホルダ１２１の回転）が行われるとともに位置ずれ検出処理で算出された並行変位量に基づいてステージ１２の移動（ホルダ１２１の移動）が行われる。その後、撮像ユニット１３によるウェルプレート２０の撮像が行われる（ステップＳ１２０）。その際、ステージ１２（ホルダ１２１）がＸ軸方向あるいはＹ軸方向に移動する。このようにして、撮像ユニット１３に対してステージ１２（ホルダ１２１）を相対的に移動させながら撮像が行われる。
＜５．２　第２の変形例＞
　本変形例に係る撮像装置では、ウェルプレート２０が載置されるステージ１２が移動可能かつ回転可能に構成されており（換言すれば、ホルダ１２１が移動可能かつ回転可能に構成されており）、また、撮像ユニット１３が移動可能に構成されている。このような構成において、位置ずれ検出処理の終了後、まず、上記第１の変形例と同様にして、ステージ１２の回転および移動（ホルダ１２１の回転および移動）が行われる（ステップＳ１１０）。その後、撮像ユニット１３によるウェルプレート２０の撮像が行われる（ステップＳ１２０）。その際、本変形例においては、撮像ユニット１３がＸ軸方向あるいはＹ軸方向に移動する。
　１０…撮像装置
　１１…光源
　１２…ステージ
　１３…撮像ユニット
　１４…カメラ駆動機構
　１５…制御部
　２０…ウェルプレート
　２１…ウェル
　４０…矩形分離度フィルタ
　１２１…ホルダ
　μ…分離度

Claims (12)

  1. 　複数の試料収納部を有する試料容器が撮像装置の試料容器保持部に載置された際の前記試料容器の理想的な載置状態からの位置ずれ量を検出する、試料容器の位置ずれ検出方法であって、
    　前記複数の試料収納部の中から２つの試料収納部を位置ずれ検出用試料収納部として選択する試料収納部選択ステップと、
    　各位置ずれ検出用試料収納部につき、理想的な載置状態における上端、下端、左端、および右端の座標である論理エッジ座標を算出する論理エッジ座標算出ステップと、
    　前記論理エッジ座標算出ステップで算出された各論理エッジ座標を中心位置として所定範囲の撮像を行う撮像ステップと、
    　各位置ずれ検出用試料収納部につき、前記撮像ステップでの撮像で得られた上端側、下端側、左端側、および右端側の各撮像画像に対して２つの領域間の分離度を求める分離度フィルタを当該分離度フィルタの中心位置をずらしつつ適用し、各撮像画像について分離度のピーク値が得られたときの当該分離度フィルタの中心位置の座標を仮エッジ座標として検出する仮エッジ座標検出ステップと、
    　各位置ずれ検出用試料収納部につき、前記仮エッジ座標検出ステップで検出された上端側、下端側、左端側、および右端側の仮エッジ座標に基づいて実際の中心座標を算出する中心座標算出ステップと、
    　前記中心座標算出ステップで算出された各位置ずれ検出用試料収納部の中心座標に基づいて、前記試料容器の理想的な載置状態からの位置ずれ量を算出する位置ずれ量算出ステップと
    を含むことを特徴とする、試料容器の位置ずれ検出方法。
  2. 　前記試料容器の形状は矩形であって、
    　前記試料容器の長手方向に沿って一列に配置された一群の試料収納部を行と定義したとき、前記試料収納部選択ステップでは、同じ行に属し、かつ、最も離れた位置に配置された２つの試料収納部が前記位置ずれ検出用試料収納部として選択されることを特徴とする、請求項１に記載の位置ずれ検出方法。
  3. 　前記仮エッジ座標検出ステップでは、前記分離度フィルタとして、２つの矩形領域間の分離度を求める矩形分離度フィルタが用いられることを特徴とする、請求項１または２に記載の位置ずれ検出方法。
  4. 　前記仮エッジ座標検出ステップでは、
    　　前記位置ずれ検出用試料収納部の上端側または下端側についての仮エッジ座標の検出が行われる際には、当該位置ずれ検出用試料収納部の上端側の論理エッジ座標と当該位置ずれ検出用試料収納部の下端側の論理エッジ座標とを結ぶ直線上で前記矩形分離度フィルタの中心位置を移動させつつ分離度が求められ、
    　　前記位置ずれ検出用試料収納部の左端側または右端側についての仮エッジ座標の検出が行われる際には、当該位置ずれ検出用試料収納部の左端側の論理エッジ座標と当該位置ずれ検出用試料収納部の右端側の論理エッジ座標とを結ぶ直線上で前記矩形分離度フィルタの中心位置を移動させつつ分離度が求められることを特徴とする、請求項３に記載の位置ずれ検出方法。
  5. 　前記位置ずれ量算出ステップでは、前記位置ずれ量として、理想的な載置状態における前記試料容器の所定の基準位置と前記試料容器保持部に実際に載置された状態における前記試料容器の前記基準位置との間の変位の大きさを表す並行変位量と、前記試料容器保持部に実際に載置された状態における前記試料容器の理想的な載置状態からの傾きを表す角度とが算出されることを特徴とする、請求項１から４までのいずれか１項に記載の位置ずれ検出方法。
  6. 　前記試料収納部選択ステップで選択された２つの試料収納部の一方を第１の位置ずれ検出用試料収納部，他方を第２の位置ずれ検出用試料収納部と定義し、理想的な載置状態における前記第１の位置ずれ検出用試料収納部の中心座標および前記第２の位置ずれ検出用試料収納部の中心座標をそれぞれ第１の理想中心座標および第２の理想中心座標と定義し、前記中心座標算出ステップで算出された前記第１の位置ずれ検出用試料収納部の中心座標および前記第２の位置ずれ検出用試料収納部の中心座標をそれぞれ第１の実中心座標および第２の実中心座標と定義したとき、前記位置ずれ量算出ステップでは、前記位置ずれ量として、前記第１の理想中心座標と前記第１の実中心座標との間の変位の大きさを表す並行変位量と、前記第１の理想中心座標と前記第２の理想中心座標とを結ぶ直線と前記第１の実中心座標と前記第２の実中心座標とを結ぶ直線とのなす角度とが算出されることを特徴とする、請求項５に記載の位置ずれ検出方法。
  7. 　前記仮エッジ座標検出ステップにおいて分離度のピーク値が正常に得られない撮像画像が存在したとき、前記撮像装置が警告の表示を行うことを特徴とする、請求項１から６までのいずれか１項に記載の位置ずれ検出方法。
  8. 　複数の試料収納部を有する試料容器を撮像装置によって撮像する撮像方法であって、
    　請求項１に記載の位置ずれ検出方法を用いて得られた位置ずれ量に基づいて、前記撮像装置の状態を撮像を開始するための状態に調整する調整ステップと、
    　前記試料容器の撮像を行う試料容器撮像ステップと
    を含むことを特徴とする、撮像方法。
  9. 　前記撮像装置に設けられた撮像部は、移動可能に構成され、
    　前記位置ずれ量算出ステップでは、前記位置ずれ量として、理想的な載置状態における前記試料容器の所定の基準位置と前記試料容器保持部に実際に載置された状態における前記試料容器の前記基準位置との間の変位の大きさを表す並行変位量と、前記試料容器保持部に実際に載置された状態における前記試料容器の理想的な載置状態からの傾きを表す角度とが算出され、
    　前記調整ステップでは、前記位置ずれ量算出ステップで算出された並行変位量に基づいて、前記撮像部の撮像開始位置の調整が行われ、
    　前記試料容器撮像ステップでは、前記位置ずれ量算出ステップで算出された角度に従って前記撮像部を移動させながら前記試料容器の撮像が行われることを特徴とする、請求項８に記載の撮像方法。
  10. 　前記試料容器保持部は、移動可能かつ回転可能に構成され、
    　前記位置ずれ量算出ステップでは、前記位置ずれ量として、理想的な載置状態における前記試料容器の所定の基準位置と前記試料容器保持部に実際に載置された状態における前記試料容器の前記基準位置との間の変位の大きさを表す並行変位量と、前記試料容器保持部に実際に載置された状態における前記試料容器の理想的な載置状態からの傾きを表す角度とが算出され、
    　前記調整ステップでは、前記位置ずれ量算出ステップで算出された角度に基づいて前記試料容器保持部の回転が行われるとともに前記位置ずれ量算出ステップで算出された並行変位量に基づいて前記試料容器保持部の移動が行われ、
    　前記試料容器撮像ステップでは、前記撮像装置に設けられた撮像部に対して前記試料容器保持部を相対的に移動させながら前記試料容器の撮像が行われることを特徴とする、請求項８に記載の撮像方法。
  11. 　前記撮像装置に設けられた撮像部は、移動可能に構成され、
    　前記試料容器保持部は、移動可能かつ回転可能に構成され、
    　前記位置ずれ量算出ステップでは、前記位置ずれ量として、理想的な載置状態における前記試料容器の所定の基準位置と前記試料容器保持部に実際に載置された状態における前記試料容器の前記基準位置との間の変位の大きさを表す並行変位量と、前記試料容器保持部に実際に載置された状態における前記試料容器の理想的な載置状態からの傾きを表す角度とが算出され、
    　前記調整ステップでは、前記位置ずれ量算出ステップで算出された角度に基づいて前記試料容器保持部の回転が行われるとともに前記位置ずれ量算出ステップで算出された並行変位量に基づいて前記試料容器保持部の移動が行われ、
    　前記試料容器撮像ステップでは、前記撮像部を移動させながら前記試料容器の撮像が行われることを特徴とする、請求項８に記載の撮像方法。
  12. 　複数の試料収納部を有する試料容器が試料容器保持部に載置された際の前記試料容器の理想的な載置状態からの位置ずれ量を検出する、試料容器の位置ずれ検出装置であって、
    　前記複数の試料収納部の中から２つの試料収納部を位置ずれ検出用試料収納部として選択する試料収納部選択手段と、
    　各位置ずれ検出用試料収納部につき、理想的な載置状態における上端、下端、左端、および右端の座標である論理エッジ座標を算出する論理エッジ座標算出手段と、
    　前記論理エッジ座標算出手段によって算出された各論理エッジ座標を中心位置として所定範囲の撮像を行う撮像手段と、
    　各位置ずれ検出用試料収納部につき、前記撮像手段による撮像で得られた上端側、下端側、左端側、および右端側の各撮像画像に対して２つの領域間の分離度を求める分離度フィルタを当該分離度フィルタの中心位置をずらしつつ適用し、各撮像画像について分離度のピーク値が得られたときの当該分離度フィルタの中心位置の座標を仮エッジ座標として検出する仮エッジ座標検出手段と、
    　各位置ずれ検出用試料収納部につき、前記仮エッジ座標検出手段によって検出された上端側、下端側、左端側、および右端側の仮エッジ座標に基づいて実際の中心座標を算出する中心座標算出手段と、
    　前記中心座標算出手段によって算出された各位置ずれ検出用試料収納部の中心座標に基づいて、前記試料容器の理想的な載置状態からの位置ずれ量を算出する位置ずれ量算出手段と
    を備えることを特徴とする、試料容器の位置ずれ検出装置。
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