WO2018044018A1 - 사균 백신 제조용 펩타이드 및 이를 이용한 사균 백신 - Google Patents

사균 백신 제조용 펩타이드 및 이를 이용한 사균 백신 Download PDF

Info

Publication number
WO2018044018A1
WO2018044018A1 PCT/KR2017/009390 KR2017009390W WO2018044018A1 WO 2018044018 A1 WO2018044018 A1 WO 2018044018A1 KR 2017009390 W KR2017009390 W KR 2017009390W WO 2018044018 A1 WO2018044018 A1 WO 2018044018A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
mastoparan
peptide
vaccine
pathogenic bacteria
present
Prior art date
Application number
PCT/KR2017/009390
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
방우영
배창환
여주홍
허진
문성철
정호경
Original Assignee
대한민국(환경부 국립생물자원관장)
전북대학교산학협력단
주식회사 코미팜
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 대한민국(환경부 국립생물자원관장), 전북대학교산학협력단, 주식회사 코미팜 filed Critical 대한민국(환경부 국립생물자원관장)
Publication of WO2018044018A1 publication Critical patent/WO2018044018A1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/521—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells inactivated (killed)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to a peptide for producing a bactericidal vaccine and to a bactericidal vaccine using the same, and more particularly, to a mastoparan peptide for producing a bacteriostatic vaccine and a method for producing the bacteriostatic vaccine using the same.
  • antibiotic-resistant bacteria have arisen due to the administration of an excessive amount of antibiotics for the treatment of animal diseases including humans, and the problem of resistance to antibiotics is becoming increasingly serious.
  • new antibiotics to replace vancomycin have not yet been developed, and international organizations have been working to try to reduce their resistance by regulating the use of antibiotics.
  • Antimicrobial peptides isolated from various organisms are known to play a variety of functions, ranging from bacteria, fungi and viruses, and play an important role in host defense and the innate immune system. It is known to be responsible for.
  • the organism produces its own antimicrobial peptides (BeV1ns et al., Ann. Rev. Biochem., 59, 395-414, 1990), forming small peptides consisting of approximately 10 to 40 amino acids, largely depending on the structure. It can be divided into groups.
  • the first is a cysteine-rich ⁇ -sheet peptide molecule
  • the second is an amphiphilic peptide molecule of ⁇ -helix structure
  • the third is a proline-rich peptide molecule.
  • These antimicrobial peptides have various structures according to amino acid sequences. The most common of these structures is a structure that forms an amphiphilic alpha helical without cysteine residues such as cecropin, an antimicrobial peptide found in insects. . As such, many studies have been made on the antimicrobial activity of peptides isolated from living organisms.
  • the present inventors have made a thorough research to overcome the problems of the prior art as described above, after treating and killing mastoparan peptides among the antimicrobial peptides to the pathogenic bacteria, and recover them and apply them to the bactericidal vaccine, While retaining the ability to induce immunity such as a poisoned vaccine, it was confirmed that a safe vaccine such as a bactericidal vaccine produced by treating a conventional chemical such as formalin was completed, and the present invention was completed.
  • Korean Patent Registration No. 10-1456160 Korean Patent Registration No. 10-1481119, Korean Patent Registration No. 10-1478202 and Korean Patent Registration No. 10-1456160
  • the main object of the present invention is to provide a peptide mastoparan for producing a bactericidal vaccine, which produces a safe and excellent immuno-induction ability compared to chemicals such as formalin.
  • the present invention provides a mastoparan peptide for the production of Bacillus vaccine.
  • AMPs antimicrobial peptides
  • the inventors have studied and analyzed for many years for the discovery of antimicrobial peptides (AMPs) suitable for the production of bactericidal vaccines that produce safe and superior immuno-induction ability compared to chemicals such as formalin. Functionality with respect to manufacturing was verified. As a result, it was confirmed that by applying the mastoparan peptide, it is possible to prepare a bactericidal vaccine that generates a safe and excellent immuno-induced ability compared to chemicals such as formalin.
  • AMPs antimicrobial peptides
  • the term “mastoparan” refers to tetradecapeptide (Ile-Asn-Leu-Lys-Ala-Leu-Ala-Ala-Leu-Ala-Lys-Lys-Ile-Leu-NH2) contained in bee venom. ) And similar peptides, and in addition to the bee venom belonging to the bee family is a concept that includes all of the peptides of the sequence similar to the peptide sequence.
  • the mastoparan peptide may be defined collectively as a mastoparan group.
  • the mastoparan is rich in hydrophobic and basic amino acids, taking a random conformation in hydrophilic environments but having an amphiphilic ⁇ -helix structure in hydrophobic environments.
  • mastoparan peptides share a common biophysical characteristic for antimicrobial activity, and have net positive charge as a whole, and these positive charges electrostatically attract negative charges present on the surface of the microorganism. Mediate.
  • mastoparan forms an amphipathic ⁇ -helix structure, resulting in contact with hydrophobic residues located at hydrophobic sites on the surface of the microbial membrane. During interaction with the membrane, mastoparan causes membrane collapse through a mechanism known as carpet model, toroidal model, or barrel-stave model.
  • mastoparan forms an ⁇ -helix structure to optimize amphipathicity, and changes the structure of the intermediate site of the peptide to change to a more preferred state of energy. This makes the lipid layer bilayer structure of pathogenic microorganisms unstable.
  • the mastoparan peptide of the present invention when the mastoparan peptide of the present invention is treated to a pathogenic bacterium, cell membrane disruption of the pathogenic bacterium is induced, and cytoplasmic components are eluted out of the bacterium through the disrupted cell membrane. It will be lost.
  • the cell surface structures of the killed pathogenic bacteria become intact cellular morphology including cell surface structures, and thus, the dead bodies of pathogenic bacteria killed by treating the mastoparan of the present invention are attenuated vaccines. It possesses the same immune inducing ability.
  • peptide refers to a polymer consisting of amino acids linked by amide bonds (or peptide bonds).
  • amide bonds or peptide bonds
  • peptide structure of the present invention is characterized by having an ⁇ -helix structure.
  • the peptide is preferably an antimicrobial peptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the mastoparan peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is a mastoparan peptide isolated by analyzing the whole expression genome and protein of the native expression of Korean native bumblebee.
  • the peptide is a mastoparan (MP-V1) peptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 consisting of 15 amino acids of INWKKIKSIIKAAMN.
  • the mastoparan (MP-V1) peptide of SEQ ID NO: 1 shows excellent antimicrobial activity significantly improved compared to other mastoparans, and the antimicrobial activity mechanism of mastoparan is a cell membrane. Because of the antimicrobial activity caused by decay and cytoplasmic elution, the mastoparan peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 more effectively kills pathogenic bacteria than other mastoparan peptides, while at the same time the cell surface structure of the pathogenic bacteria is intact. There is an advantage to preserve (see FIGS. 4 and 5).
  • the average of the hydropathicity (GRAVY) calculation of the mastoparan (MP-V1) peptide of SEQ ID NO: 1 through the ProtParam ( http://web.expasy.org/protparam/ ) program is the mastoparan of the present invention.
  • MP-V1 has a lower hydrophobicity than other known mastoparans, and the low hydrophobicity is expected to further increase the affinity for lipid membranes of pathogenic bacteria.
  • the mastoparan (MP-V1) peptide of SEQ ID NO: 1 additionally contains asparagine as the 15th amino acid, to be clearly distinguished from typical mastoparans consisting of 14 amino acids.
  • Asparagine the 15th amino acid, acts as a C-terminal capping to stabilize the helix structure because the amide group of the side chain can form a hydrogen bond interacting with the peptide backbone, thereby inhibiting harmful pathogens. Increase activity. That is, the C-terminal amide capping present in the mastoparan (MP-V1) peptide of SEQ ID NO: 1 promotes stabilization of the ⁇ -helix structure, and mastoparan is strongly embedded in animal and bacterial cell membranes. It effectively promotes the death of pathogenic bacteria without damaging the cell surface structure.
  • the high antimicrobial activity of the mastoparan MP-V1 peptide of the present invention is due in part to the seventh amino acid lysine.
  • typical mastoparans have a hydrophobic amino acid in the middle of the peptide and are embedded in a hydrophobic site on the surface of the microbial membrane, causing the membrane to collapse.
  • the mastoparan MP-V1 of the present invention has a side chain moiety of lysine having a charge inserted into the hydrophobic portion of the microbial membrane, and thus structurally in the middle portion of the mastoparan MP-V1 peptide. Changes occur frequently, which promotes the breakdown of pathogenic harmful microbial membranes.
  • the vaccine is characterized in that the vaccine against gram-negative pathogenic bacteria and gram-positive pathogenic bacteria, which is mastoparan peptide perforated the cell membranes of the gram-negative and Gram-positive pathogenic bacteria to the cytoplasmic components outside the cell membrane This is due to the principle of flowing into the furnace (see FIGS. 4 to 8).
  • Gram-negative pathogenic bacteria examples include Salmonella spp., Vibrio spp., Mycobacterium spp., Shigella spp. And Escherichia coli.
  • S. typhimurium Salmonella Typhimurium
  • Salmonella gel rinah Room Salmonella gallinarum
  • Vibrio cholerae V1brio cholera
  • M. bovis mycobacterium boV1s
  • Shigella disen Terry Ke Shigella dysenteriae
  • Shigella flex Tenerife Shigella flexneri
  • enteric harmful Escherichia coli examples include Salmonella spp., Vibrio spp., Mycobacterium spp., Shigella spp. And Escherichia coli.
  • Gram-positive pathogenic bacteria include Staphylococcus strain, Streptococcus strain, Listeria spp., And more specifically Staphylococcus aureus and Streptococcus suis ( Streptococcus suis ), Listeria monocytogenes ( Listeria monocytogenesis ) strains.
  • the mastoparan peptide of the present invention is a cytoplasmic component is eluted out of the bacteria through the cell membrane perforation of the pathogenic bacteria, in the process it can be seen that the pathogenic bacteria are killed and the pathogenicity is lost, while the dead pathogenic bacteria
  • the cell surface structure of the cells becomes intact cellular morphology including cell surface structures, except for some perforations, and thus the gram-negative and gram-positive pathogenic bacteria It could be confirmed that the carcass can be used as a vaccine for killing bacteria.
  • the present invention provides a method for producing a bacteriostatic vaccine comprising the following steps:
  • the mastoparan peptide is characterized by having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the pathogenic bacteria are Gram-negative pathogenic bacteria, and Gram-positive pathogenic bacteria.
  • the present invention provides a bactericidal vaccine composition according to the method for producing the bacteriophage vaccine.
  • the bacterium vaccine of the present invention when the bacterium vaccine of the present invention is treated in a BALB / c male mouse animal model, expression of IgG and IgA proteins, which are indicative of humoral immunity, and IL, which is indicative of cellular immunity, Significant increase in the expression of -10 and TNF- ⁇ protein was observed, it was confirmed that there is a protective effect against pathogenic microorganisms in mice and chickens vaccinated with the bacterium vaccine of the present invention.
  • prevention of the present invention means any action that inhibits or delays the onset of a disease caused by a pathogenic bacterial infection by administration of the bactericidal vaccine composition of the present invention. Means any bacterial disease.
  • the bacteriophage vaccine of the present invention may be administered as a vaccine to induce immunity against diseases caused by infection by pathogenic bacteria, which may be suitably formulated with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Pharmaceutically acceptable carriers can be used as oral administration binders, lubricants, disintegrants, excipients, solubilizers, dispersants, stabilizers, suspending agents, pigments and flavors, and in the case of injections, physiological saline And non-aqueous solvents such as aqueous solvents such as ring gel solution, vegetable oils, higher fatty acid esters (e.g., oleic acid, etc.), and alcohols (e.g., ethanol, benzyl alcohol, propylene glycol, glycerin, etc.).
  • Buffers, preservatives, analgesic agents, solubilizers, isotonic agents, stabilizers and the like can be used in combination.
  • suitable propellants such as compressed air, nitrogen, carbon dioxide, or hydrocarbon-based low boiling point solvents, etc., may be conveniently delivered in the form of aerosol spray presentation from the pressurized pack or sprayer.
  • the formulation of the vaccine composition of the present invention can be prepared in various ways by mixing with a pharmaceutically acceptable carrier as described above.
  • a pharmaceutically acceptable carrier as described above.
  • it may be prepared in the form of tablets, troches, capsules, elesir, suspensions, syrups, wafers, and the like, in the case of injections, in the form of single-dose ampoules or multiple-dose forms.
  • the route of administration of the vaccine composition can be administered via any general route as long as it can reach the target tissue.
  • the term "administration" of the present invention means introducing any substance into a human or animal by any suitable method and is formulated for human or veterinary administration and administered by various routes.
  • the vaccine composition of the present invention may be administered by a parenteral route such as intravascular, intravenous, intraarterial, intramuscular or subcutaneous, and may be administered by inhalation via oral, nasal, rectal, transdermal or aerosol. It may be administered, or it may be administered by bolus or infused slowly. Specifically, it may be administered by sublingual, intramuscular or nasal route, more specifically intramuscular or nasal route, but is not limited thereto.
  • the vaccine composition comprising the bacterium vaccine of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to exhibit a vaccine effect and an amount not to cause side effects or severe or excessive immune responses, and an effective dose level refers to the disorder or disorder to be treated. Severity, activity of a particular compound, route of administration, rate of clearance, duration of treatment, drug used in combination with or concurrently with a bacteriophage vaccine containing a harmful bacterium that has been treated and killed by mastoparan, age, weight, sex, and diet of the subject , General health conditions, and factors known in the pharmaceutical and medical arts.
  • the number administered in a single dose is usually about 1 ⁇ 10 6 to 1 ⁇ 10 10 , more specifically 1 ⁇ 10 7 to 5 ⁇ 10 10 , more specifically 5 A range of x 10 7 to 1 x 10 9 germs.
  • the bactericidal vaccine composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents. And single or multiple administrations. Taking all of the above factors into consideration, it is important to administer an amount that can obtain the maximum effect in a minimum amount without side effects, and can be easily determined by those skilled in the art.
  • the mastoparan peptide of the present invention is capable of completely killing pathogenic bacteria by eluting cytoplasmic components through cell membrane perforation of pathogenic bacteria, and the cell surface structure of the killed pathogenic bacteria is intact except for some punctures. Morphologically.
  • the bacteriophage vaccine prepared by treating the mastoparan peptide of the present invention possesses superior immuno-induction ability as compared to the vaccine prepared by chemical treatment of formalin and the like, and has a humoral and cellular immune system. It shows good vaccine effect against pathogenic bacteria.
  • 1 is a diagram comparing the primary structure of mastoparan.
  • FIG. 2 is a diagram illustrating a mastoparan peptide lineage.
  • Figure 4 is an electron micrograph showing the cell membrane state and cytoplasmic deformation of the pathogenic bacterium Salmonella Typhimurium (Halmonella Typhimurium) HJL 491 bacteria.
  • FIG. 5 is an electron micrograph of the pathogenic bacterium Salmonella Typhimurium (Halmonella Typhimurium) HJL 491 bacteria treated with mastoparan V1 and observed cell membrane state and cytoplasmic deformation.
  • FIG. 6 is an electron micrograph showing treatment of mastoparan V1 to S. suis ( Streptococcus suis ), a pathogenic bacterium, and observation of cell membrane state and cytoplasmic transformation.
  • FIG. 7 is an electron micrograph showing treatment of mastoparan V1 to Salmonella gallinarum , a pathogenic bacterium, and cell state and cytoplasmic deformation.
  • FIG. 8 is an electron micrograph of Salmonella Typhimurium (Halmonella Typhimurium) HJL 491 bacteria treated with formalin and cell state and cytoplasmic deformation.
  • FIG. 9 is a graph showing the results of ELISA immune response against IgG and IgA proteins by orally inoculating BALB / c male mice prepared by treatment with mastoparan peptide.
  • Figure 10 is a graph showing the results of ELISA immune response to IgG proteins inoculated intramuscularly to the BALB / c male mice prepared via mastoparan peptide treatment.
  • FIG. 11 is a graph showing the results of ELISA immune response against IL-10 and TNF- ⁇ protein, inoculated with BALB / c male mice prepared by treatment with mastoparan peptide.
  • FIG. 12 is a graph demonstrating that oral inoculation of a bacterium vaccine prepared by treatment with mastoparan peptide in a mouse model has a prophylactic effect against Salmonella Typhimurium HJL 456, a pathogenic microorganism.
  • FIG. 13 is a graph demonstrating that the intramuscular inoculation of vaccinated vaccine prepared by mastoparan peptide treatment in a mouse model has a prophylactic effect against Salmonella Typhimurium HJL 456, which is a pathogenic microorganism.
  • FIG. 14 is a graph demonstrating that oral inoculation of a bacterium vaccine prepared by treatment with mastoparan peptide in the chicken model has a prophylactic effect against Salmonella Typhimurium HJL 456, which is a pathogenic microorganism.
  • Salmonella Typhimurium HJL 491 a malignant strain isolated from Korean chickens, was selected as a pathogenic bacterium. Pathogenic bacteria Salmonella typhimurium was prepared by incubating in LB broth and LB agar medium (Becton Dickinson, Sparks, MD, USA) at 37 °C.
  • the cocktail cut to precipitate the peptide, was mixed with cold ether and then centrifuged.
  • Preliminary reverse-phase HPLC (RP-HPLC) analysis was performed on a Vydac C 18 column using a water / acetonitrile gradient of 0% to 90% in the presence of 0.05% TPA. Final purity of peptides (> 95%) was assessed by RP-HPLC analysis on analytical Bidda C 18 column (4.6 mm ⁇ 250 mm, 300 A5 mm particle size).
  • mastoparan MP-L is typical mastoparans. They are classified and share a common motif.
  • bumblebee Vespula mascarfaran (MP-V1) peptide having a sequence of SEQ ID NO: 1 isolated from the poison of vulgaris
  • MP-V1 atypical mastoparan containing asparagine, the polar amino acid in an additional 15th sequence, consisting of 14 residues It is clearly distinguished from typical mastoparan (see FIGS. 1 and 2).
  • MP-V1 has a seventh lysine, which is a polar side chain in the middle of the peptide, whereas typical mastoparan contains hydrophobic amino acids.
  • the CD spectra of all the synthesized mastoparans showed a random coil (random-coil) form in aqueous solution (FIG. 1C). However, in the presence of 8 mM SDS and 40% TFE, the CD spectra of all mastoparans showed ⁇ -helical properties (FIG. 3).
  • Percent ⁇ -helix measured against mastoparan in other environments, is an aqueous solution, while mastoparan tends to form ⁇ -helix structures in the presence of 8 mM SDS or 40% TFE. Has been found to tend to form a random coil form (Table 1).
  • MP-X (V) showed the highest ⁇ -helix percentage at 8mM SDS or 40% TFE, while MP-V1 had slightly higher ⁇ -helix percentage compared to MP-L and MP-B. It was shown.
  • Salmonella Typhimurium prepared in Example 1-1, Staphylococcus aureus , Streptococcus suis , Salmonella G. alum , Salmonella gallinarum , and Enterotoxic Escherichia coli
  • a single colony of (Enterotoxigenic Escherichia col i) was independently injected into 200 mL of LB broth, incubated slowly at 37 ° C., and incubated at 600 nm until the optical density reached 0.3.
  • mastoparan V1 of SEQ ID NO: 1 prepared in Example 1-2 was inoculated into the pathogen culture medium and allowed to react. After 16 hours, the mastoparan-treated pathogenic bacteria were transferred to LB agar medium and cultured for 72 hours, and the killing of pathogenic bacteria was confirmed.
  • Example 2-1 the antimicrobial activity of the antimicrobial peptides was tested against Salmonella Enteritidis and Salmonella gallinarum strains, which are the most damaging and difficult to control in agricultural fields. .
  • Salmonella Enteritidis a Salmonella enteritidis and Salmonella gallinarum strain
  • synthetic antimicrobial peptides were prepared for stock and diluted for appropriate concentration and used for antimicrobial activity analysis.
  • Salmonella Enteritidis and Salmonella gallinarum strains precultured overnight (O / N) for MIC analysis were used for the study after diluting to 10 6 CFU / ml.
  • the concentrations of synthetic antimicrobial peptides used in the MIC analysis were 0, 25, 50, 100, 250, 500, and 1000 ug / ml, respectively.
  • the reaction solution was added to the microtiter plate, the reactive phase was observed while incubating O / N at 37 ° C.
  • Final MIC determination was determined by measuring the cultured Microtiter plate at 600 nm in the Microtiter reader to determine the MIC concentration, the results are shown in Table 3 below.
  • the minimum inhibitory concentration of mastoparan V1 for Salmonella typhimurium strain was determined to be 123 ug / ml, and the minimum inhibitory concentration of mastoparan V1 for Salmonella gelinaryum strain was 106.95 ug / ml.
  • Example 2-1 the LB agar medium containing the harmful bacteria killed by mastoparan was put in a 4000g centrifuge and centrifuged for 30 minutes to collect the lysed dead cells, and 5 ⁇ in PBS solution. Resuspended at a concentration of 10 10 cells / mL. The killed dead strain thus prepared was used as a ghost vaccine against pathogenic bacteria.
  • Electron microscopy was used to observe the change in the cytoplasmic properties of the harmful strains killed by the treatment of mastoparan V1 by the method of Example 2. Carcasses of the pathogenic bacteria were observed with an electron microscope (Hitachi H-7600, Japan).
  • the mastoparan peptide of the present invention elutes the cytoplasmic components out of the bacteria through the cell membrane perforation of the pathogenic bacteria, in this process the pathogenic bacteria are killed and the pathogenicity is lost. I could see.
  • the cell surface structure of the killed pathogenic bacteria becomes intact cellular morphology including cell surface structures, except for some perforations, thus killing the pathogenic bacteria killed by treating the mastoparan peptide of the present invention.
  • the carcass will have the same immune inducing ability as a live attenuated vaccine.
  • mice (Orient Bio, Inc., Sungnam, Korea) were divided into four groups, with 20 mice in each group. Mice in each group were divided in half and orally or intramuscularly inoculated with prime antigen at 6 weeks of age (0 WPPI) and orally with boost antigen (2 WPPI) at 8 weeks of age, 2 weeks later.
  • mice in group A were divided into 10 mice and used as a control group by oral or intramuscular injection of sterilized PBS solution.
  • Groups B to D were Salmonella typhimu prepared by treating mastoparan V1 by the method of Example 2.
  • the Leeum bacterium vaccine was diluted orally or intramuscularly by 10 mice in 20 ⁇ L of PBS solution at 1.0 ⁇ 10 7 , 1.0 ⁇ 10 8 , and 1.0 ⁇ 10 9 CFU concentrations, respectively.
  • IgG and IgA IgG and IgA (InV1trogen, Carlsbad, CA) specific for Salmonella typhimurium outer membrane proteins (OMPs) were titrated to serum and fecal samples from mice of Example 4-1, respectively, and It was analyzed using the ELISA method of Lee (Hur and Lee, 2011, Vaccine Immunolo. 18, 203-209), it is shown in Figure 9.
  • the concentration of plasma IgG specific for Salmonella typhimurium outer membrane protein was gradually increased after 2 WPPI in group B to D, and at the time of 4 WPPI, 3 and 3.4 times higher than control group, respectively. And 4.6-fold increase (P ⁇ 0.05).
  • the concentration of fecal IgA specific to Salmonella typhimurium outer membrane protein increased 6.6 times, 7.9 times, and 11.5 times, respectively, at 4 WPPI compared to the control group A (P ⁇ 0.01).
  • the bacteriophage vaccine obtained by treating the mastoparan peptide of the present invention secreted antibodies involved in the immune response through the humoral immune system, and showed an excellent vaccine effect against pathogenic bacteria. .
  • mice orally administered the Salmonella typhimurium bacterium vaccine prepared by treatment of mastoparan V1 in groups A to D were sacrificed and sterile. The spleen was removed from the state. Splenocytes were prepared according to the method of Hur et al. (Hur and Lee, 2011, Vaccine Immunolo. 18, 203-209).
  • the average concentration of the cytokine IL-10 in groups B to D was increased 2.6 times, 2.9 times, and 3.7 times, respectively, compared to the control group A, the TNF- ⁇ of Concentrations were increased by 3.8, 4.3 and 4.9 times, respectively, compared to the control group A (P ⁇ 0.05).
  • the bacteriophage vaccine obtained by treating the mastoparan peptide of the present invention secretes cytokines through the cellular immune system, and shows an excellent vaccine effect against pathogenic bacteria.
  • a Salmonella Typhimurium HJL 456 strain a non-destructive, high-risk pathogenic strain, was prepared according to Hu et al. (Hur and Lee, 2011, Vaccine Immunolo. 18, 203-209).
  • the pathogenic Salmonella typhimurium HJL 456 strain was 2 ⁇ 10 8 CFU concentration. Intraperitoneal injection was diluted in 20 ⁇ L of PBS solution, and death was observed sequentially until 14 days later.
  • mice among the five mice in the group D were observed to survive until the end of the experiment.
  • group B one animal was observed to die at 8 and 10 days after the experiment
  • group C one animal died at 9 and 11 days after the experiment, and three mice survived until the end of the experiment. Was observed.
  • group A all mice died between 7 and 11 days of inoculation of pathogenic bacteria.
  • the pathogenic Salmonella typhimurium HJL 456 strain was 2 ⁇ 10 8.
  • CFU concentration was diluted in 20 ⁇ L PBS solution and injected intraperitoneally, and death was observed sequentially until 14 days later.
  • mice of the C and D groups survived until the end of the experiment.
  • Group B one animal was observed to die each at 8 and 9 days of the experiment, and finally, three mice were observed to survive until the end of the experiment.
  • group A all mice died between 7 and 11 days of inoculation of pathogenic bacteria.
  • Salmonella galilarum strains isolated from Korean chickens were used for ghost vaccine preparation.
  • the isolated pathogenic Salmonella galilarum strain was used as the field challenge strain. These strains were incubated in LB liquid medium and LB agar medium (Becton Dickinson, Sparks, MD, USA) at 37 ° C.
  • Seventy four-week-old brown Leghorn species female chickens were purchased and seventy chickens were used in the experiment, divided into seven groups of ten each. All chickens were first inoculated into muscle at 6 weeks of age (0 weeks post prime immunization; WPPI) and at 9 weeks of age into muscle (2 WPPI). Inoculation for each of the seven groups was performed as shown in Table 4. All vaccines were inoculated into the muscle 500 ⁇ l.
  • Example 5-1 For challenge experiments, the pathogenic Salmonella galilarum strain isolated in Example 5-1 was challenged orally with 7 ⁇ 10 7 CFU bacteria at 6 WPPI orally. All chickens were then observed to die twice daily for 14 days after challenge.
  • the animal experiments used in this study were conducted under ethical approval (CBU 2015-052) from Chonbuk National University Animal Ethics Committee in accordance with the guidelines of the Korea Animal Protection Association.
  • Salmonella galilarum bactericidal vaccine prepared by treating the mastoparan V1 prepared in Example 5-2 was administered at 1.6 ⁇ 10 10 , 1.6 ⁇ 10 9 , and 1.0 ⁇ 10 8 cells / 500ul concentration;
  • a commercial live vaccine at a concentration of 2.0 ⁇ 10 7 cells / 500 ul, all 10 chickens survived and were resistant to the pathogenic Salmonella galilarum, and were prepared by treating mastoparan V1.
  • Salmonella typhimurium bacterium vaccine administered at 1.6 ⁇ 10 10 CFU / mL concentration 50% of the chickens survived and showed a higher survival rate compared to the group receiving the vaccine of commercially available M vaccine.
  • the bacteriophage vaccine prepared by treating the mastoparan peptide of the present invention can effectively prevent diseases of animals caused by outdoor pathogenic strains.
  • Pair-wise comparisons were performed by post hoc turkey using SPSS version 16.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). All values are expressed as mean ⁇ SE for at least 3 independent experimental values. Statistical significance was determined at P ⁇ 0.01 level.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

본 발명은 본 발명은 사균 백신 제조용 펩타이드 및 이를 이용한 사 균 백신에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 사균 백신 제조를 위한 마스토파란 펩타이드 및 이를 이용한 사균 백신의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 마스토파란 펩타이드를 처리하여 제조된 사균 백신 은 포르말린 등의 화학약품 처리에 의해 제조된 사균 백신 대비 안전하면서도 생균백신과 대비하여 동등 이상의 우수한 면역유도 능력을 갖는다.

Description

사균 백신 제조용 펩타이드 및 이를 이용한 사균 백신
본 발명은 사균 백신 제조용 펩타이드 및 이를 이용한 사균 백신에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 사균 백신 제조를 위한 마스토파란 펩타이드 및 이를 이용한 사균 백신의 제조방법에 관한 것이다.
최근 병원성 세균에 대한 동물의 자체방어능력을 향상시키기 위해 건강기능식품, 사료 및 사료첨가제의 개발, 면역증강제의 개발 등에 관한 연구가 활발하게 진행되고 있다.
그러나, 인간을 포함한 동물 질병 치료를 위하여 과량의 항생제 투여로 인한 항생제 내성균이 발생하였으며, 항생제에 대한 내성 문제는 점차 심각해지고 있다. 현재 반코마이신을 대체할 새로운 항생제는 아직까지 개발되어 있지 못한 상황이며, 항생제 사용을 규제하여 내성을 줄이기 위한 시도로 국제기구가 만들어져 활동을 하고 있는 상황이다.
또한, 가축에 과량의 항생제를 투여하는 경우에는 식품으로서의 안정성을 위협할 수 있고, 이는 곧 상품저하를 가져오므로 축산 농가에 큰 경제적 손실을 초래하게 된다. 더욱이, 동물용 의약품 중 항생제와 항균제를 배합사료에 혼합하여 사용하는 것은 2012년부터 전면 금지되고 있다. 해외에서도 세계보건기구(WHO)가 가축사료용 항생제 사용의 위험을 경고하고 있고, 유럽연합(EU)도 치료목적 외에는 항생제를 투여하지 못하도록 규제하고 있다.
이와 같이 항생제 오남용으로 인한 폐해로 세균성 질병의 폭발적인 증가에 대한 시급한 대책이 요구되고 있고, 항생제의 사용 없이 동물의 질병을 예방하는 방법의 개발이 필요하며, 질병을 예방하기 위해서는 예방백신의 역할이 증대되고 있다.
기존의 병원성 세균에 대한 전통적인 백신들은 주로 사균 백신(killed vaccine) 또는 서브유닛 백신(subunit vaccine)들이다. 그러나 기존의 사균 백신은 포르말린, 베타프로프리오락톤(BPL), 이성분 에틸렌이민(BEI) 등의 화학 약품을 처리하거나 열처리를 통하여 제조되므로, 세포 외 부속기관들이 이탈되거나 자연적인 에피톱(epitope)을 유지하지 못하여 면역원성이 낮아지는 단점이 존재하며, 사균 백신을 처리하여 면역반응을 유발할 경우에 면역유도 능력의 저하가 종종 발생하는 문제점이 발생하고 있다. 그 예로, Shuai-Cheng Wu 등의 연구에 따르면, 포르말린 처리에 의해 제조된 사균 백신(formalin-inactivated Salmonella typhimurium, FIST)을 접종한 마우스는 치사량(1 × 1010 CFU/mouse, n = 10)의 살모넬라 타이피뮤리움을 복강 내 주입시, 생존율이 30% 정도에 불과한 것으로 나타났다(Shuai-Cheng Wu, International Immunopharmacology 25 (2015) 353.362).
이와 같은 단점을 보완하기 위해 최근에는 강독성 균주를 약독화시켜 생약독화 백신을 제조하고 있다. 그러나 상기 생약독화 백신은 병원성 균주를 약독화하지만, 생균을 사용하기 때문에 혐오감을 유발할 가능성이 있고, 생약독화를 위해 소실시킨 유전자가 자연 상태에서 회복되면 원래의 강독성 균주로 전환될 수 있는 가능성이 있다(Lin and He, 2012, AV1la-Calderon et al., 2013; Langemann et al., 2010). 따라서, 생약독화 백신과 같은 면역유도 능력을 보유하면서도, 사균 백신처럼 안정한 백신의 제조방법의 개발이 지속적으로 요구되고 있다.
한편, 모든 생명체는 생존을 위하여 항균 물질을 생산하는 것으로 알려져 있는데, 각종 생물체에서 분리된 항균 펩타이드는 박테리아, 곰팡이 및 바이러스에 이르기까지 다양하게 작용하는 것으로 알려져 있고, 숙주 방어 및 선천적 면역계에 있어서 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있다. 생물은 항균 펩타이드를 자체적으로 생산하는데(BeV1ns et al., Ann. Rev. Biochem., 59, 395-414, 1990), 대략 10 내지 40 개의 아미노산으로 이루어진 작은 펩티드를 형성하며, 구조에 따라 크게 세 개의 그룹으로 나눌 수 있다. 첫 번째는 시스테인이 풍부한(cysteine-rich) β-시트(sheet) 펩타이드 분자이고, 두 번째는 α-헬릭스 구조의 양친화성 펩타이드 분자이며, 세 번째는 프롤린이 풍부한(proline-rich) 펩타이드 분자이다. 이러한 항균 펩타이드들은 아미노산 서열에 따라 다양한 구조를 갖는데, 이들 구조 중 가장 흔한 것은 곤충에서 발견된 항균 펩타이드인 세크로핀(cecropin)과 같이 시스테인(cysteine) 잔기가 없고 양친화성 알파 나선형을 형성하는 구조이다. 이와 같이 생물체에서 분리된 펩타이드의 항균활성에 대해서 많은 연구가 이루어지고 있다.
현재, 생물체에서 분리된 펩타이드를 이용해 항균제를 개발하는 연구는 많이 시도되고 있으나, 아직까지 병원성 유해 세균을 항균 펩타이드로 처리하여 사멸시킨 후, 이를 사균 백신의 개발에 이용하고자 하는 연구는 진행되지 않고 있다.
이에, 본 발명자들은 상기와 같은 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 항균 펩타이드들 중 마스토파란 펩타이드를 병원성 세균에 처리하여 사멸시킨 후, 이를 회수하여 사균 백신으로 적용하는 경우, 생약독화 백신과 같은 면역유도 능력을 보유하면서도, 종래 포르말린 등의 화학약품을 처리하여 생성된 사균 백신처럼 안전한 백신을 제조할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
[선행기술문헌]
[특허문헌]
한국특허등록 제10-1456160호, 한국특허등록 제10-1481119호, 한국특허등록 제10-1478202 및 한국특허등록 제10-1456160호
따라서, 본 발명의 주된 목적은 포르말린 등의 화학약품 대비 안전하면서도 우수한 면역유도 능력을 생성시키는 사균 백신 제조용 펩타이드 마스토파란을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 사균 백신 제조용 펩타이드 마스토파란을 이용한 백신의 제조방법 및 이에 따른 백신을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 사균 백신 제조용 마스토파란 펩타이드를 제공한다.
본 발명자들은 포르말린 등의 화학약품 대비 안전하면서도 우수한 면역유도 능력을 생성시키는 사균 백신 제조에 적합한 항균 펩타이드(antimicrobial peptides , AMPs)의 발굴을 위해 수년간 연구, 분석하였고, 그 결과 마스토파란 펩타이드의 사균 백신 제조와 관련한 기능성을 검증하였다. 그 결과, 마스토파란 펩타이드를 적용하면, 포르말린 등의 화학약품 대비 안전하면서도 우수한 면역유도 능력을 생성시키는 사균 백신을 제조할 수 있음을 확인하였다.
본 발명에서 용어 “마스토파란”은 벌의 독에 함유되어 있는 테트라데카펩티드(Ile-Asn-Leu-Lys-Ala-Leu-Ala-Ala-Leu-Ala-Lys-Lys-Ile-Leu-NH2) 및 그 유사 펩타이드를 의미하며, 이외에도 벌과에 속한 벌의 독에 상기 펩티드 서열과 유사한 서열의 펩타이드를 모두 포함하는 개념이다. 통상적으로 상기 마스토파란 펩타이드는 마스토파란군으로 총칭하여 정의될 수 있다. 상기 마스토파란은 소수성 아미노산과 염기성 아미노산이 풍부하여, 친수성 환경에서는 무작위 입체구조를 취하지만 소수성 환경에서는 양친매성 α-헬릭스 구조 형태를 갖는다.
상기 마스토파란 펩타이드들은 항균활성에 대한 공통적인 생체물리학적인 특징을 공유하는데, 전체적으로 네트 양전하(net positive charge)를 보유하며, 이러한 양전하는 미생물의 표면에 존재하는 음전하를 정전기적으로 잡아당기는 역할을 매개한다. 또한, 마스토파란은 양친성(amphipathic)의 α-헬릭스 구조를 형성하며, 그 결과 미생물 막 표면의 소수성 부위에 위치한 소수성 잔기에 접촉하게 된다. 막 과의 상호 작용 중에 마스토파란은 카펫 모델, 도넛(toroidal) 모델, 또는 통-막대(barrel-stave) 모델로 알려진 메커니즘을 통하여 막의 붕괴를 일으키게 된다.
특히, 막과의 상호 작용 중에, 마스토파란은 양친성(amphipathicity)을 최적화하기 위해 α-헬릭스 구조를 형성하며, 에너지 상태가 더 선호되는 구조로 변화하기 위해 펩타이드의 중간 부위의 구조가 변화하게 되고, 이를 통해 병원성 미생물의 지질층 이중막 구조를 불안정하게 한다.
따라서, 본 발명의 마스토파란 펩타이드를 병원성 세균에 처리하는 경우, 병원성 세균의 세포막 붕괴가 유도되고, 붕괴된 세포막을 통해 세포질 성분들이 세균 밖으로 용출되게 되며, 이 과정에서 병원성 세균은 사멸되어 병원성은 소실되게 된다. 반면에, 사멸한 병원성 세균의 세포 표면 구조는 온전하게 형태학적으로 보존(intact cellular morphology including cell surface structures)되게 되며, 따라서 본 발명의 마스토파란을 처리하여 사멸된 병원성 세균의 사체는 생약독화 백신과 같은 면역유도 능력을 보유하게 된다.
본 발명에서 용어, “펩타이드(peptide)”란 아미드 결합(또는 펩타이드 결합)으로 연결된 아미노산으로 이루어진 폴리머를 의미한다. 본 발명의 목적상, 병원성 균주의 세포막의 붕괴를 일으키는 펩타이드를 의미한다. 본 발명의 펩타이드 구조는 α-헬릭스 구조를 갖는 것이 특징이다.
본 발명에서, 상기 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 항균 펩타이드인 것이 바람직하다. 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 마스토파란 펩타이드는 한국 자생 땅벌의 독선 발현 전체 발현 유전체와 단백체를 분석하여 분리된 마스토파란 펩타이드다. 상기 펩타이드는 아미노산 서열이 INWKKIKSIIKAAMN의 15개 아미노산으로 구성된 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 마스토파란(MP-V1) 펩타이드이다.
상기 서열번호 1의 마스토파란 펩타이드와 유사한 효과를 나타내는 마스토파란 펩타이드의 예로는 서열번호 2의 아미노산 서열(INLKALAALAKKIL)을 갖는 마스토파란-L, 서열번호 3의 아미노산 서열(INWKGIAAMAKKIL)을 갖는 마스토파란-X(V), 및 서열번호 4의 아미노산 서열(LKLKSIVSWAKKVL)을 갖는 마스토파란-B 등을 들 수 있다.
기존에 알려진 다른 마스토파란과 비교해 보면, 상기 서열번호 1의 마스토파란(MP -V1) 펩타이드는 다른 마스토파란에 비해 현저히 개선된 우수한 항균 활동을 나타내며, 마스토파란의 항균 활성 기작이 세포막 붕괴와 세포질 용출에 의한 항균 활성이므로, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 마스토파란 펩타이드는 다른 마스토파란 펩타이드에 비해 더욱 효과적으로 병원성 세균을 사멸시키는 동시에 병원성 세균의 세포 표면 구조는 온전하게 형태학적으로 보존하는 장점이 있다(도 4 및 도 5 참조).
ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/) 프로그램을 통한 상기 서열번호 1의 마스토파란(MP -V1) 펩타이드의 극성(hydropathicity)(GRAVY) 계산의 평균은 본 발명의 마스토파란 MP-V1이 종래 알려진 다른 마스토파란과 비교하여 좀 더 낮은 소수성(hydrophobicity)을 갖으며, 이러한 낮은 소수성으로 인하여 병원성 세균의 지질 막에 대한 친화력이 더욱 증가할 것으로 예상된다.
또한, 상기 서열번호 1의 마스토파란(MP -V1) 펩타이드는 14개의 아미노산으로 구성된 전형적인 마스토파란들과 명백하게 구별되게, 부가적으로 15번째 아미노산으로 아스파라긴(asparagine)을 포함하고 있다. 상기 15번째 아미노산인 아스파라긴은 그 사이드 체인의 아미드 그룹이 펩타이드 골격과 상호작용하는 수소결합을 형성할 수 있기 때문에, 헬릭스 구조를 안정화하는 C-말단의 캡핑 역할을 수행하며, 이를 통해 유해 병원균의 억제 활성을 증가시킨다. 즉, 서열번호 1의 마스토파란(MP -V1) 펩타이드에 존재하는 C-말단의 아미드 캡핑은 α-헬릭스 구조의 안정화를 촉진시키며, 마스토파란이 동물 및 박테리아 세포막에 강력하게 매립(embodiment) 되는 현상을 이끌어내며, 세포 표면 구조의 손상 없이 효과적으로 병원성 세균의 사멸을 촉진시키게 된다.
본 연구진들은 선행특허 제10-2015-0168226호에서 C-말단의 아미드 그룹 없이 산성의 C-말단을 포함하는 합성 마스토파란의 CD 스펙트럼과, 상기 서열번호 1의 마스토파란(MP -V1) 펩타이드를 비교한 결과, 본 발명의 마스토파란 MP-V1에서는 C-말단의 아미드 캡핑 구조로 인하여 α-헬릭스 구조의 안정화가 이루어지고, 미생물의 막 유사 환경에서 보다 안정적인 헬릭스 구조를 형성함으로써, 다른 통상의 마스토파란보다 높은 항균 활성을 갖는 것을 증명한 바 있다.
또한, 본 발명의 마스토파란 MP-V1 펩타이드의 높은 항균활성은 7번째 아미노산인 라이신에 일정부분 기인한다. 일반적으로, 전형적인 마스토파란은 펩타이드의 중간에 소수성 아미노산을 갖고, 미생물 막 표면의 소수성 부위에 매립(embodiment)되어 막의 붕괴를 일으킨다. 이러한 통상적인 마스토파란과는 달리 본 발명의 마스토파란 MP-V1은 전하를 갖는 라이신의 사이드 체인 잔기가 미생물 막의 소수성 부분에 삽입되고, 이를 통해 마스토파란 MP-V1 펩타이드의 중간 부분에서 구조적 변화가 빈번하게 발생되며, 이를 통해 병원성 유해 미생물 막의 붕괴가 촉진된다.
본 발명에서, 상기 백신은 그람음성 병원성 세균 및 그람양성 병원성 세균에 대한 백신인 것을 특징으로 하며, 이는 상기 마스토파란 펩타이드가 상기 그람음성 및 그람양성 병원성 세균의 세포막을 천공하여 세포질 성분을 세포막 외부로 유동시키는 원리에 기인한다(도 4 내지 도 8 참조).
마스토파란 펩타이드의 작용에 의해 사균백신으로 작용할 수 있는 상기 그람음성 병원성 세균의 종류로는 살모넬라 속의 균주, 비브리오 속 균주, 마이코박테리움 속 균주, 시겔라 속 균주 및 대장균이 있고, 보다 구체적으로 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella Typhimurium), 살모넬라 겔린아룸(Salmonella gallinarum), 비브리오 콜레라(V1brio cholera), 마이코박테리움 보비스(mycobacterium boV1s), 시겔라 디센테리애(Shigella dysenteriae), 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri), 및 장내 유해 대장균 등을 들 수 있다.
또한, 상기 그람 양성 병원성 세균의 종류로는 스타필로코커스 속 균주, 스트렙토코커스 속 균주, 리스테리아 속 균주 등을 들 수 있으며, 보다 구체적으로는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스트렙토코커스 수이스(Streptococcus suis), 리스테리아 모노싸이토제네스(Listeria monocytogenesis) 균주 등이 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에서는 상기 마스토파란 펩타이드를 처리한 병원성 세균인 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella Typhimurium), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스트렙토코커스 수이스(Streptococcus suis), 살모넬라 겔린아룸(Salmonella gallinarum), 및 장내 독성 대장균(Enterotoxigenic Escherichia coli)의 전자현미경 사진에서 명확하게 세포질 공동현상을 관찰할 수 있었으며, 세포막의 일부 천공(pore) 현상을 제외하고는 세포막의 형태 변형이 없는 것을 관찰할 수 있었다(도 4 및 도 8). 따라서, 본 발명의 마스토파란 펩타이드가 병원성 세균의 세포막 천공을 통해 세포질 성분들이 세균 밖으로 용출되게 되며, 이 과정에서 병원성 세균은 사멸되어 병원성은 소실되게 함을 알 수 있는 반면에, 사멸한 병원성 세균의 세포 표면 구조는 일부 천공을 제외하고 온전하게 형태학적으로 보존(intact cellular morphology including cell surface structures)되게 되며, 따라서 본 발명의 마스토파란 펩타이드를 처리하여 사멸된 상기 그람음성 및 그람양성 병원성 세균의 사체를 사균 백신으로 활용 가능함을 확인할 수 있었다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 사균 백신의 제조방법을 제공한다:
(a) 병원성 세균을 준비하는 단계;
(b) 상기 준비된 병원성 세균에 마스토파란 펩타이드를 처리하여 상기 병원성 세균을 사멸시키는 단계; 및
(c) 상기 사멸된 병원성 세균을 분리하는 단계.
본 발명의 방법에서, 상기 마스토파란 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 방법에서, 상기 병원성 세균은 그람음성 병원성 세균, 및 그람양성 병원성 세균인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 사균 백신의 제조방법에 따른 사균 백신 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 실시예에서는 BALB/c 수컷 마우스 동물 모델을 대상으로 본 발명의 사균 백신을 처리하는 경우, 체액성 면역의 활성화 지표인 IgG 및 IgA 단백질의 발현과, 세포성 면역의 활성화 지표인 IL-10 및 TNF-α 단백질의 발현이 유의하게 증가하는 것을 관찰할 수 있었고, 본 발명의 사균 백신을 접종한 마우스와 닭에서 병원성 미생물에 대한 예방 효과가 있음을 확인할 수 있었다. 본 발명의 용어 "예방"이란, 본 발명의 사균 백신 조성물의 투여로 병원성 세균 감염에 의한 질환 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하며, 상기 질환은 병원성 세균 감염에 의해 인간 또는 동물에 발생하는 모든 세균성 질환을 의미한다.
본 발명의 상기 사균 백신은 백신으로 투여되어 병원성 세균에 의해 감염되어 발생하는 질환에 대한 면역성을 유도할 수 있는데, 상기 사균 백신은 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 적절하게 제제화될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 경구 투여시에는 결합제, 활택제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소 및 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 주사제는 생리식염액 및 링겔액 등의 수성용제, 식물유, 고급 지방산 에스텔(예, 올레인산에칠 등) 및 알코올류(예, 에탄올, 벤질알코올, 프로필렌글리콜, 글리세린 등) 등의 비수성 용제 등을 이용하여 제조할 수 있고, 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장화제 및 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있다. 분사제의 경우에는 적합한 분사제, 예컨대, 압축공기, 질소, 이산화탄소, 또는 탄화수소 기반 낮은 끓는점 용매 등을 사용하여 가압팩 또는 분무기로부터 에어로졸 스프레이 제시체의 형태로 편리하게 전달될 수 있다.
본 발명의 백신 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여 시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릴시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단회 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다.
상기 백신 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다.
본 발명의 용어 "투여"란, 어떠한 적절한 방법으로 인간 또는 동물에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 인체 또는 수의용으로 제형화되어 다양한 경로로 투여된다. 본 발명의 상기 백신 조성물은 비경구 경로, 예컨대 혈관 내, 정맥 내, 동맥 내, 근육 내 또는 피하 등의 경로로 투여될 수 있고, 경구, 비강, 직장, 경피 또는 에어로졸을 통한 흡입 경로로 투여될 수도 있으며, 볼루스로 투여하거나 또는 서서히 주입할 수도 있다. 구체적으로는 설하, 근육 내 또는 비강 경로로 투여될 수 있으며, 보다 구체적으로는 근육 내 또는 비강 경로이나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 사균 백신을 포함하는 백신 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명의 용어 "약제학적으로 유효한 양"이란, 백신 효과를 나타낼 수 있을 정도의 충분한 양과 부작용이나 심각한 또는 과도한 면역반응을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 치료될 장애, 장애의 중증도, 특정 화합물의 활성, 투여 경로, 제거 속도, 치료 지속 기간, 마스토파란이 처리되어 사멸된 유해균 사체를 포함하는 사균 백신과 조합되거나 또는 동시에 사용되는 약물, 대상체의 나이, 체중, 성별, 식습관, 일반적인 건강 상태, 및 의약 업계 및 의학 분야에 공지된 인자를 비롯한 다양한 인자들에 따라 달라질 것이다. "치료 상 유효량" 결정시 고려되는 다양한 일반적인 사항들은 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌 [Gilman etal., eds., Goodman And Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th ed., Pergamon Press, 1990] 및 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990]에 기재되어 있다. 본 발명의 사균 백신을 투여하는 경우, 1회 투여시 투여되는 수는 통상적으로 약 1×106 내지 1×1010, 보다 구체적으로는 1×107 내지 5×1010, 더욱 구체적으로는 5×107 내지 1×109 개의 사균 범위이다.
본 발명의 사균 백신 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(i) 본 발명의 마스토파란 펩타이드는 병원성 세균의 세포막 천공을 통해 세포질 성분들이 세균 밖으로 용출시켜 병원성 세균을 완전하게 사멸시킬 수 있으며, 사멸한 병원성 세균의 세포 표면 구조는 일부 천공을 제외하고 온전하게 형태학적으로 보존시킬 수 있다.
(ii) 따라서, 본 발명의 마스토파란 펩타이드를 처리하여 제조된 사균 백신은 포르말린 등의 화학물질 처리에 의해 제조된 백신과 비교하여 우수한 면역유도 능력을 보유하며, 체액성 및 세포성 면역체계를 통해 병원성 세균에 대한 우수한 백신 효과를 나타낸다.
도 1은 마스토파란의 일차구조를 비교한 그림이다.
도 2는 마스토파란 펩타이드 계통도를 도시한 그림이다.
도 3은 마스토파란 펩타이드의 원평광 이색 스펙트럼 분석 결과이다.
도 4는 병원성 세균인 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella Typhimurium) HJL 491 세균의 세포막 상태 및 세포질 변형을 관찰한 전자현미경 사진이다.
도 5는 병원성 세균인 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella Typhimurium) HJL 491 세균에 마스토파란 V1을 처리하고, 세포막 상태 및 세포질 변형을 관찰한 전자현미경 사진이다.
도 6은 병원성 세균인 S. 수이스(Streptococcus suis)에 마스토파란 V1을 처리하고, 세포막 상태 및 세포질 변형을 관찰한 전자현미경 사진이다.
도 7은 병원성 세균인 살모넬라 겔린아룸(Salmonella gallinarum)에 마스토파란 V1을 처리하고, 세포막 상태 및 세포질 변형을 관찰한 전자현미경 사진이다.
도 8은 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella Typhimurium) HJL 491 세균에 포르말린을 처리하고 세포막 상태 및 세포질 변형을 관찰한 전자현미경 사진이다.
도 9는 BALB/c 수컷 마우스에 마스토파란 펩타이드 처리를 통해 제조된 사균 백신을 경구 접종하고, IgG 및 IgA 단백질에 대한 ELISA 면역 반응 수행결과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 BALB/c 수컷 마우스에 마스토파란 펩타이드 처리를 통해 제조된 사균 백신을 근육 내 접종하고, IgG 단백질에 대한 ELISA 면역 반응 수행결과를 나타낸 그래프이다.
도 11은 BALB/c 수컷 마우스에 마스토파란 펩타이드 처리를 통해 제조된 사균 백신을 접종하고, IL-10 및 TNF-α 단백질에 대한 ELISA 면역 반응 수행결과를 나타낸 그래프이다.
도 12는 마우스 모델에서 마스토파란 펩타이드 처리를 통해 제조된 사균백신의 경구접종이 병원성 미생물인 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella Typhimurium) HJL 456에 대해 예방 효과가 있음을 증명하는 그래프이다.
도 13은 마우스 모델에서 마스토파란 펩타이드 처리를 통해 제조된 사균백신의 근육 내 접종이 병원성 미생물인 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella Typhimurium) HJL 456에 대해 예방 효과가 있음을 증명하는 그래프이다.
도 14는 닭 모델에서 마스토파란 펩타이드 처리를 통해 제조된 사균백신의 경구접종이 병원성 미생물인 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella Typhimurium) HJL 456에 대해 예방 효과가 있음을 증명하는 그래프이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1. 실험재료 준비
1-1. 병원성 세균 및 생장조건
한국산 닭에서 분리된 악성 스트레인인 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella Typhimurium) HJL 491을 병원성 세균으로 선정하였다. 병원성 세균 살모넬라 타이피뮤리움을 37℃에서 LB 브로스와 LB 아가 배지(Becton Dickinson, Sparks, MD, USA)에서 배양하여 준비하였다.
그리고, 본 발명에서 사용된 S. 아우레우스(Staphylococcus aureus, KCTC 1621) 및 S. 수이스(Streptococcus suis)의 그람 양성세균 2종과, 살모넬라 겔린아룸(Salmonella gallinarum), 장내 독성 대장균(Enterotoxigenic Escherichia coli)의 그람 음성세균 3종을 각각 KCTC(Korean Collection for Type Cultures, Daejeon, Korea) 및 ATCC(ATCC, Manassas, VA, USA)에서 분양 또는 구입하여 분양 기관의 프로토콜에 따라 사용하였다.
1-2. 마스토파란 펩타이드 합성 및 정제
모든 마스토파란 펩타이드는 달리 언급하지 않는 한 0.61 mmol/g의 초기 로딩된 링크 아미드 수지(100mg)로 9-플루오레닐메톡시카르보닐(Fmoc, 9-fluorenylmethoxy carbonyl)을 아미노산의 보호기로 사용하여 통상의 고체상 펩타이드 합성법(solid phase peptide synthesis: SPPS)에 의해 합성하였다.
수지는 적절한 팽창을 위해 합성 전에 45분 동안 DMF(N,N-디메틸포름아미드) 용액으로 세척 하였다. 서열 연장을 위해, 9-플루오레닐메톡시카르보닐기로 보호된 아미노산(5 당량)은 DMF 용액(2 mL, 0.15 mM) 내의 HBTU[2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸유로늄 헥사플루오로포스페이트, 5.0 eq.], HOBt(1-히드록시벤조트리아졸, 5.0 eq.) 및 DIEA(디이소프로필에틸아민, 10 eq.)로 2분 동안 처리하여 활성화시켰다.
이 용액을 레진 상의 유리된 아민에 첨가하고, 커플링 반응은 볼텍스 교반과 동시에 1시간 동안 진행시켰다. DMF 용액으로 세정 후, DMF 용액 중 20% 피페리딘(2회: 1×10분, 2×3분)에 의해 9-플루오레닐메톡시카르보닐기를 제거하였다. 수지를 DMF(3×3 분) 용액으로 세척하고, 다음의 아미노산에 대해 같은 반응을 반복하여 수행하였다. 선형 펩타이드는 TFA(trifluoroacetic acid, 레진 100mg 당 TFA 2mL)에 존재하는 5% TIS(triisopropylsilane) 및 5% H2O로 2 시간 동안 반응시켜 수지에서 절단하였다.
펩타이드가 침전되도록 절단된 칵테일을 차가운 에테르(ether)와 혼합하였고, 이후 원심분리 하였다.
예비 RP- HPLC(reverse-phase HPLC) 분석은 0.05% TPA 존재 하에서 0% 내지 90%의 물/아세토니트릴 농도구배를 사용하여 비닥(Vydac) C18 컬럼 상에서 수행되었다. 펩타이드의 마지막 순도(>95%)는 분석용 비닥 C18 컬럼(4.6mm×250mm, 300A5mm 입자 사이즈) 상에서의 RP- HPLC 분석에 의해 평가하였다
서열 정렬(도 1) 및 계통 분석(phylogenetic analyse, 도 2) 결과를 참조하면, 마스토파란 MP-L, MP-X(V), MP-B, 및 MP-V1은 전형적인 마스토파란류로 분류되며, 공통적인 모티프를 공유한다.
한편, 땅벌(Vespula vulgaris)의 독에서 분리한 서열번호 1의 서열을 갖는 마스토파란(MP-V1) 펩타이드는 부가적인 15번째 서열에 극성 아미노산인 아스파라긴을 포함하는 비정형적인 마스토파란으로, 이는 14개의 잔기로 이루어진 전형적인 마스토파란과는 확연하게 구별된다(도 1 및 도 2 참조).
또한, 전형적인 마스토파란이 소수성 아미노산을 포함하는 것과 달리, MP -V1은 펩타이드의 중간에 극성을 갖는 사이드 체인인 7번째 라이신을 갖는 것이 밝혀졌다.
또한, JASCO J-715 스펙트로폴라리미터(JASCO 인터내셔널, 도쿄, 일본)를 이용하여 합성된 폴리펩타이드들의 2차 구조를 조사하기 위해, 원편광 이색성 스펙트럼을 분석하였다.
상기 합성된 모든 마스토파란의 CD 스펙트럼은 수용액 상태에서 랜덤 코일(random-coil) 형태의 특성을 보였다(도 1C). 그러나, 8mM의 SDS 및 40%의 TFE 존재 하에서, 모든 마스토파란의 CD 스펙트럼은 α-헬릭스(α-helical) 특성을 보였다(도 3).
다른 환경에서 마스토파란에 대해 측정된 퍼센트 α-헬릭스(Percent α-helix)는 마스토파란이 8mM의 SDS 또는 40%의 TFE 존재 하에서, α-헬릭스 구조를 형성하는 경향이 있는 반면, 수용액 상태에서는 랜덤 코일 형태를 형성하는 경향이 있는 것으로 밝혀졌다(표 1).
Figure PCTKR2017009390-appb-T000001
특히, 모든 마스토파란 중, MP-X(V)는 8mM SDS 또는 40% TFE 조건에서 가장 높은 α-헬릭스 퍼센트를 보인 반면 MP-V1은 MP-L과 MP-B에 비해 다소 높은 α 헬릭스 퍼센트를 나타내는 것으로 나타났다.
실시예 2. 마스토파란을 이용한 백신 제조
2-1. 병원성 세균에 대한 사멸 효과 확인
실시예 1-1에서 준비한 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella Typhimurium), 스타필 로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스트렙토코커스 수이스(Streptococcus suis), 살모넬라 겔린아룸(Salmonella gallinarum), 및 장내 독성 대장균(Enterotoxigenic Escherichia col i)의 단일 콜로니를 LB 브로스 200mL에 독립적으로 주입하고, 37℃에서 천천히 교반 배양하여 600nm에서 광학 밀도가 0.3에 도달할 때까지 배양하였다.
이 후, 상기 실시예 1-2에서 제조한 서열번호 1의 마스토파란 V1 80μg/ml를 상기 병원균 배양 배지에 접종하고 반응시켰다. 16 시간 경과 후, 상기 마스토파란 처리된 병원성 세균들을 LB 아가 배지로 옮겨 72시간 동안 배양하고, 병원성 세균의 사멸 상태를 확인하였다.
그 결과, 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella Typhimurium), 스타필 로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스트렙토코커스 수이스(Streptococcus suis), 살모넬라 겔린아룸(Salmonella gallinarum), 및 장내 독성 대장균(Enterotoxigenic Escherichia col i)의 콜로니가 형성되지 않음을 확인할 수 있었고, 본 발명의 마스토파란 펩타이드가 병원성 세균을 완전하게 사멸시킬 수 있음을 확인할 수 있었다.
2-2. 유해균주에 대한 마스토파란 V1의 MIC 측정
상기 실시예 2-1에서 실험한 균주 중에서 농업현장에서 가장 큰 피해를 입히고 방제가 어려운 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella Enteritidis)와 살모넬라 겔린아룸(Salmonella gallinarum) 균주에 대하여 항균 펩타이드들의 항균능력을 검정하였다.
MIC 분석을 위해 국내 분리 균주인 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella Enteritidis)와 살모넬라 겔린아룸(Salmonella gallinarum) 균주에 대해 아래 <표 2>의 합성 항균 펩타이드를 처리하여 Microtiter plate 방법으로 MIC 분석을 수행하였다. 합성 항균 펩타이드들은 stock을 제조한 후 적절한 농도로 희석하여 항균활성 분석을 위해 사용하였다.
Figure PCTKR2017009390-appb-T000002
MIC 분석을 위해 overnight(O/N)으로 전배양된 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella Enteritidis)와 살모넬라 겔린아룸(Salmonella gallinarum) 균주는 106 CFU/ml 농도로 희석한 후 연구에 사용되었다. MIC 분석에 사용된 합성 항균 펩타이드들의 농도는 각각 0, 25, 50, 100, 250, 500, 및 1000 ug/ml를 사용하였다. 반응액을 microtiter plate에 첨가한 후 37℃에서 O/N 배양하면서 반응성상을 관찰하였다. 최종 MIC 판정은 배양된 Microtiter plate를 Microtiter reader에서 600 nm로 측정하여 MIC 농도를 결정하고, 그 결과를 아래 표 3에 나타내었다.
Figure PCTKR2017009390-appb-T000003
그 결과, 살모넬라 타이피뮤리움 균주에 대한 마스토파란 V1의 최소저해농도는 123ug/ml로 측정되었고, 살모넬라 겔린아룸 균주에 대한 마스토파란 V1의 최소저해농도는 106.95ug/ml로 측정되었다.
상기 결과를 통해 마스토파란 V1의 항균 활성은 다른 항균 펩타이드에 비해 월등한 것을 알 수 있었으며, 마스토파란 V1을 사균백신의 제조에 사용하는 경우에 강력한 항균 활성으로 인하여 유해균주를 완전히 사멸시킴으로써 백신 제조의 안전성을 높일 수 있음을 확인할 수 있었다.
2-3. 사균 회수
실시예 2-1에서 마스토파란을 처리하여 사멸한 유해균이 있는 상기 LB 아가 배지를 4000g 원심분리기에 넣고 30분 동안 원심분리하여 용해되어(lysated) 사멸된 세포들을 수거하였고, PBS 용액에 5 × 1010 세포/mL 농도로 재현탁하였다. 이렇게 준비된 사멸된 유해균주를 병원성 세균에 대한 백신(ghost vaccine)으로 이용하였다.
실시예 3. 전자현미경을 이용한 사멸된 병원성 세균의 형태학적 특성 관찰
상기 실시예 2의 방법으로 마스토파란 V1을 처리하여 사멸된 유해균주의 세포질 특성 변화를 관찰하기 위해 전자 현미경을 이용하였다. 상기 병원성 세균의 사체를 전자현미경(Hitachi H-7600, Japan)으로 관찰하였다 .
먼저, 도 4 및 도 5에 도시된 바와 같이 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella Typhimurium) HJL 491 균주의 세포막 상태 및 세포질 변형을 관찰하면, 본 발명의 마스토파란 펩타이드를 처리하지 않은 살모넬라균에서는 완전한 세포질 함유 및 세포막 상태를 관찰할 수 있었다(도 4 참조).
이에 반해, 마스토파란 펩타이드를 처리한 박테리아는 명확하게 세포질의 공동현상이 관찰되는 한편, 세포막의 일부 천공(pore) 현상을 제외 하고는 세포막의 형태 변형이 없는 온전한 상태를 관찰할 수 있었다(도 5 참조).
또한, 살모넬라 겔린아룸( Salmonella gallinarum), 및 스트렙토코커스 수이스(Streptococcus suis)의 경우에도 세포막의 일부 천공(pore) 현상을 제외하고는 세포막의 형태 변형이 없는 것을 관찰할 수 있었다(도 6 및 7 참조).
이에 반해, 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella Typhimurium) HJL 491 세균에 포르말린을 처리한 군에 서는 세포질의 외부 유출은 없는 것으로 관찰되었고, 세포막 외부의 손상만이 관찰되었다.
상기 전자현미경을 통한 병원성 세균의 형태학적 특성 분석 결과를 통하여, 본 발명의 마스토파란 펩타이드는 병원성 세균의 세포막 천공을 통해 세포질 성분들을 세균 밖으로 용출시키며, 이 과정에서 병원성 세균은 사멸되어 병원성이 소실되게 함을 알 수 있었다. 반면에, 사멸한 병원성 세균의 세포 표면 구조는 일부 천공을 제외하고 온전하게 형태학적으로 보존(intact cellular morphology including cell surface structures) 되게 되며, 따라서 본 발명의 마스토파란 펩타이드를 처리하여 사멸된 병원성 세균의 사체는 생약독화 백신과 같은 면역유도 능력을 보유하게 된다.
실시예 4. 마우스 모델을 통한 면역원성 검증
4-1. 마우스 동물모델
BALB/c 수컷 마우스(Orie nt Bio, Inc., Sungnam, Korea)를 4개의 군으로 나누었고, 각각의 군에는 20마리의 마우스를 배치하였다. 각각의 군에 속한 마우스는 절반으로 나누어 6주령에 프라임 항원을 경구 또는 근육 접종(0 WPPI)하였고, 2주 후인 8주령에 부스트 항원을 경구 접종(2 WPPI)하였다.
A 군의 20마리 마우스는 각각 10 마리씩 나누어 살균된 PBS 용액을 경구 또는 근육 주사하여 대조군으로 사용하였고, B 내지 D 군은 상기 실시예 2의 방법으로 마스토파란 V1을 처리하여 제조된 살모넬라 타이피뮤리움 사균 백신을 각각 1.0 × 107, 1.0 × 108, 및 1.0 × 109 CFU 농도로 20μL의 PBS 용액에 희석하여 각각 10마리씩 경구 또는 근육 주사하였다.
혈청 및 분변 샘플은 각각, 0, 2, 및 4 WPPI(week post prime inoculation) 경과 후에 면역 반응을 평가하기 위해 채취하였다.
모든 동물실험은 한국 동물 보호 위원 회의 가이드라인에 따른 전북대학교 동물 윤리 위원회의 윤리 규정(CBU 2012-0017) 승인 하에 수행되었다.
4-2. ELISA 면역 반응
살모넬라 타이피뮤리움 외부 멤브레인 단백질(OMPs, outer membrane proteins)에 특이적인 IgG 및 IgA(InV1trogen, Carlsbad, CA)를 상기 실시예 4-1의 마우스에서 채취한 혈청 및 분변 샘플에 각각 적정하고, 허 및 이(Hur and Lee, 2011, Vaccine Immunolo. 18, 203-209)의 ELISA 방법을 이용하여 분석하여, 도 9에 나타내었다.
그 결과, B 내지 D 군에서는 살모넬라 타이피뮤리움 외부 멤브레인 단백질에 특이적인 혈장 IgG의 농도가 2 WPPI 경과 후부터 점진적으로 증가하였고, 4 WPPI 경과시점에서는 대조군인 A 군에 비해 각각 3배, 3.4배, 및 4.6배 증가하는 것으로 나타났다(P < 0.05).
그리고, B 내지 D 군에서는 살모넬라 타이피뮤리움 외부 멤브레인 단백질에 특이적인 분변 IgA의 농도가 4 WPPI 경과시점에서는 대조군인 A 군에 비해 각각 6.6배, 7.9배, 및 11.5배 증가하는 것으로 나타났다(P < 0.01).
또한, 도 10을 참조하면, 상기 실시예 4-1의 마스토파란 V1을 처리하여 제조된 살모넬라 타이피뮤리움 사균 백신을 근육 내 투여한 마우스에서 채취 한 혈청을 분석한 결과, 경구투여 결과와 마찬가지로 IgG의 농도가 2 WPPI 경과 후부터 점진적으로 증가하였고, 4 WPPI 경과시점에서는 대조군인 A 군에 비해 2 내지 3배 증가하는 것으로 나타났다(P < 0.05).
상기와 같은 결과를 통해서, 본 발명의 마스토파란 펩타이드를 처리하여 얻은 사균 백신이 체액성 면역체계를 통해 면역반응에 관여하는 항체를 분비하여 병원성 세균에 대한 우수한 백신 효과를 나타냄을 알 수 있었 다.
4-3. 사이토카인 정량
상기 실시예 4-2의 실험이 끝나고, 4 WPPI 경과 시점에서, A 내지 D 군에서 마스토파란 V1을 처리하여 제조된 살모넬라 타이피뮤리움 사균 백신을 경구 투여한 5마리의 마우스를 희생시키고, 무균상태에서 비장을 제거하였다. 비장세포를 허 등의 방법(Hur and Lee, 2011, Vaccine Immunolo. 18, 203-209)에 따라 준비하였다.
그 결과, 도 11에 나타난 바와 같이, B 내지 D 군에서는 사이토카인 IL-10의 평균 농도가 대조군인 A 군에 비해 각각 2.6배, 2.9배, 및 3.7배 증가하는 것으로 나타났고, TNF-α의 농도가 대조군인 A 군에 비해 각각 3.8배, 4.3배, 및 4.9배 증가하는 것으로 나타났다(P < 0.05).
상기와 같은 결과를 통해서, 본 발명의 마스토파란 펩타이드를 처리하여 얻은 사균 백신이 세포성 면역체계를 통해 사이토카인을 분비하여 병원성 세균에 대한 우수한 백신 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
4-4. 병원성 세균 접종 후 마우스 생존 실험
4-4-1. 경구 투여
사멸하지 않는 고위험성 병원성 균주인 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella Typhimurium) HJL 456 균주를 허 등의 방법(Hur and Lee, 2011, Vaccine Immunolo. 18, 203-209)에 따라 준비하였다.
상기 실시예 4-1에서 준비된 마스토파란 VI을 처리하여 제조된 살모넬라 타이피뮤리움 사균 백신을 경구 투여한 모든 마우스에 4 WPPI 경과 후, 병원성 살모넬라 타이피뮤리움 HJL 456 균주를 2 × 108 CFU 농도로 20μL의 PBS 용액에 희석하여 복강 내 주사하였고, 14일 경과 후까지 사망 여부를 순차적으로 관찰하였다.
그 결과, 도 12에 나타난 바와 같이, D 군의 5 마리 마우스 중에서 4마리의 마우스는 실험 종료 시까지 생존하는 것이 관찰되었다. 또한, B군에서는 실험 8일 및 10일 경과 시점에서 각각 한 마리씩 죽는 것이 관찰되었고, C군에서는 실험 9일 및 11일 경과 시점에서 각각 한 마리씩 죽어 3마리의 마우스가 실험 종료 시까지 생존하는 것으로 관찰되었다. 이에 반해 대조군인 A 군에서는 모든 마우스가 병원성 세균 접종 7일부터 11일 사이에 죽는 것이 관찰 되었다.
4-4-2. 근육 투여
상기 실시예 4-1에서 준비된 마스토파란 VI을 처리하여 제조된 살모넬라 타이피뮤리움 사균 백신을 근육 내 투여한 모든 마우스에 4 WPPI 경과 후, 병원성 살모 넬라 타이피뮤리움 HJL 456 균주를 2 × 108 CFU 농도로 20μL의 PBS 용액에 희석하여 복강 내 주사하였고, 14일 경과 후 까지 사망 여부를 순차적으로 관찰하였다.
그 결과, 도 13에 나타난 바와 같이, C 및 D 군의 5 마리 마우스 모두 실험 종료 시까지 생존하는 것이 관찰되었다. 또한, B군에서는 실험 8일 및 9일 경과 시점에서 각각 한 마리씩 죽는 것이 관찰되었고, 최종적으로 3마리의 마우스가 실험 종료 시까지 생존하는 것으로 관찰되었다. 이에 반해 대조군인 A 군에서는 모든 마우스가 병원성 세균 접종 7일부터 11일 사이에 죽는 것이 관찰 되었다.
본 실험에서는 고위험성 병원성 균주인 살모넬라 타이피 뮤리움(Salmonella Typhimurium) HJL 456 균주에 대한 본 발명의 백신 예방의 효과를 검증하기 위하여 극단적으로 높은 농도로 병원균을 접종하였고, 상기 균주가 100% 치사율을 갖는 것을 감안하면, 실제 현장에서 본 발명의 마스토파란 펩타이드를 처리하여 얻은 사균 백신의 경구 및 근육 내 투여를 통하여, 병원성 균주로 인해 발생하는 동물의 질병을 효과적으로 예방할 수 있을 것으로 사료된다.
실시예 5. 닭 모델을 통한 면역원성 검증
5-1. 균주 및 세균성장조건
한국 닭에서 분리한 살모넬라 갈리라룸 균주를 고스트 백신 제조를 위해 사용하였다. 분리된 병원성 살모넬라 갈리라룸 균주를 야외 공격균주로서 사용하였다. 이들 균주는 37℃에서 LB 액체 배지 및 LB 아가 배지(Becton Dickinson, Sparks, MD, USA)에서 배양되었다.
5-2. 살모넬라 갈리라룸 고스트백신 후보의 제조
살모넬라 갈리라룸 분리 균주의 단일 콜로니를 각각 200 ㎖의 LB 배지에 접종하여 600 nm에서 0.3의 광학 밀도(OD)에 도달하도록 천천히 교반하면서 37 ℃에서 배양 하였다. 이 배양액을 1:9로 희석한 후 합성 펩타이드인 마스토파란 V1(INWKKIKSIIKAAMN)을 40μg/㎖의 농도가 되도록 배양액에 첨가하고, 고스트 유도를 위해 37 ℃에서 16시간 배양하였다. 배양액의 고스트 유도 여부를 확인하기 위해, 반응액 100㎕를 LB 아가 배지에 도말한 후 37℃에서 72 시간 동안 배양하였다. 이 후, 생존 세포가 없음을 확인하고, 고스트 유도를 확인하였다. 고스트 유도가 확인된 배양액은 3,000rpm, 4℃ 조건에서 30분간 원심 분리하고 멸균 PBS로 부유시킨 후 냉동 보관하며 실험에 사용하였다.
5-3. 백신 접종 및 도전 실험
70마리의 4주령 갈색 레그혼 종 암컷 닭을 구입하였으며, 70마리의 닭은 10마리씩 7 그룹으로 나누어 실험에 사용되었다. 모든 닭은 6주령에 근육으로 1차 접종(0 weeks post prime immunization; WPPI) 되었고, 9주령 째에 근육으로 2차 접종(3 WPPI) 되었다. 일곱 그룹 각각에 대한 접종은 <표 4>와 같이 수행하였으며, 모든 백신은 근육으로 500㎕ 접종하였다.
Figure PCTKR2017009390-appb-T000004
도전 실험을 위해 상기 실시예 5-1에서 분리된 병원성 살모넬라 갈리라룸 균주를 사용하여 경구로 6 WPPI 째에 7×107 CFU 균수로 도전 감염하였다. 그 후에 모든 닭은 챌린지 후 14일 동안 매일 하루에 두 번 폐사 여부가 관찰되었다. 이 연구에 사용된 동물실험은 한국동물보호협회의 가이드라인에 준거하여 전북대학교 동물 윤리 위원회로부터의 윤리적 승인(CBU 2015-052) 하에 진행되었다.
실험 결과, 도 14에 나타난 바와 같이, 백신을 투여하지 않은 음성대조군에서는 병원성 살모넬라 갈리라룸 균주를 주사 다음날부터 2마리의 닭이 죽는 것이 관찰되었고, 투여 5일 후에 모든 닭이 죽는 것이 관찰되었다. 또한, 포르말린 불활화 사균백신 투여군에서는 병원성 살모넬라 갈리라룸 균주를 주사한 다음날부터 1마리의 닭이 죽는 것이 관찰되었고, 실험 종료일인 투여 7일 후에는 20%의 닭만이 생존하는 것이 관찰되었다. 마찬가지로 시판 사균백신인 M사의 상업용 백신을 투여한 군에서도 정도의 차이는 있으나 포르말린 처리 사균백신 투여군과 유사한 결과를 보였다.
반면, 상기 실시예 5-2에서 준비된 마스토파란 V1을 처리하여 제조된 살모넬라 갈리라룸 사균 백신을 1.6 × 1010, 1.6 × 109, 및 1.0 × 108 cells/500ul 농도로 투여한 군과 시판 생균백신인 SG9R을 2.0×107 cells/500 ul 농도로 투여한 군에서는 10마리의 닭이 모두 생존하여 병원성 살모넬라 갈리라룸에 대한 저항성을 갖는 것이 관찰되었고, 마스토파란 V1을 처리하여 제조된 살모넬라 타이피뮤리움 사균 백신을 1.6 × 1010 CFU/mL 농도로 투여한 군에서도 50%의 닭이 생존하여 시판 사균백신인 M사의 백신을 투여한 군에 비해 높은 생존율을 보이는 것이 관찰되었다.
상기와 같은 결과를 통해 본 발명의 마스토파란 펩타이드를 처리하여 제조된 사균 백신은 야외 병원성 균주로 인해 발생하는 동물의 질병을 효과적으로 예방할 수 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 6. 통계분석
SPSS version 16.0(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 사용하여 PHT 검정(post hoc turkey)에 의해 쌍별 비교 (pair-wise comparison)를 수행하였다. 모든 수치는 적어도 3회 이상의 독립적인 실험값에 대한 평균±SE로 표시하였다. 통계학적 유의성은 P < 0.01 수준에서 결정되었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
서열번호 1: INWKKIKSII KAAMN
서열번호 2: INLKALAALA KKIL
서열번호 3: INWKGIAAMA KKIL
서열번호 4: LKLKSIVSWA KKVL

Claims (9)

  1. 사균 백신 제조용 마스토파란 펩타이드.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 항균 펩타이드인 것을 특징으로 하는 마스토파란 펩타이드.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 항균 활성은 그람음성 병원성 세균 및 그람양성 병원성 세균에 대한 항균 활성인 것을 특징으로 하는 마스토파란 펩타이드.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 그람음성 병원성 세균은 살모넬라 속의 균주, 비브리오 속 균주, 마이코박테리움 속 균주, 시겔라 속 균주 및 대장균인 것을 특징으로 하는 마스토파란 펩타이드.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 그람양성 병원성 세균은 스타필로코커스 속 균주, 스트렙토코커스 속 균주, 및 리스테리아 속 균주인 것을 특징으로 하는 마스토파란 펩타이드.
  6. 다음 단계를 포함하는 사균 백신의 제조방법:
    (a) 병원성 세균 을 준비하는 단계;
    (b) 상기 준비된 병원성 세균에 마스토파란 펩타이드를 처리하여 상기 병원성 세균을 사멸시키는 단계; 및
    (c) 상기 사멸된 병원성 세균을 분리하는 단계.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 마스토파란 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 병원성 세균은 그람음성 병원성 세균 및 그람양성 병원성 세균인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된 사균 백신.
PCT/KR2017/009390 2016-08-31 2017-08-28 사균 백신 제조용 펩타이드 및 이를 이용한 사균 백신 WO2018044018A1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2016-0111500 2016-08-31
KR1020160111500A KR101980146B1 (ko) 2016-08-31 2016-08-31 사균 백신 제조용 펩타이드 마스토파란 및 이를 이용한 사균 백신

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2018044018A1 true WO2018044018A1 (ko) 2018-03-08

Family

ID=61301146

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2017/009390 WO2018044018A1 (ko) 2016-08-31 2017-08-28 사균 백신 제조용 펩타이드 및 이를 이용한 사균 백신

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR101980146B1 (ko)
WO (1) WO2018044018A1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102077701B1 (ko) * 2018-12-18 2020-02-14 전북대학교산학협력단 살모넬라 갈리나룸 사균체를 포함하는 가금 티푸스의 예방 또는 치료용 백신 조성물

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120201782A1 (en) * 2009-09-28 2012-08-09 Staats Herman F Peptide, adjuvants, vaccines, and methods of use

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100974185B1 (ko) * 2007-08-27 2010-08-05 주식회사 인트론바이오테크놀로지 박테리오파지 유래 용균단백질 작용에 의해 제조된세균파쇄물 및 이를 포함하는 동물질병 예방용 백신 조성물
KR101456160B1 (ko) 2012-12-11 2014-11-04 경남과학기술대학교 산학협력단 고스트 살모넬라 및 이를 함유하는 세균성 소화기 질환 예방용 백신

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120201782A1 (en) * 2009-09-28 2012-08-09 Staats Herman F Peptide, adjuvants, vaccines, and methods of use

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE Protein [O] 12 April 2017 (2017-04-12), XP055470357, Database accession no. P0C1Q8.1 *
JI, JAE HO: "Finding a new killed vaccine production method from the poison of vespula vulgaris", DAILY GRID, 9 September 2016 (2016-09-09), Retrieved from the Internet <URL:http://www.dailygrid.net/news/articleView.html?idxno=42519> *
KIM, Y. ET AL.: "MP-V1 from the Venom of Social Wasp Vespula Vulgaris Is a De Novo Type of Mastoparan that Displays Superior Antimicrobial Activities", MOLECULES, vol. 21, no. 512, 19 April 2016 (2016-04-19), pages 1 - 10, XP055470340 *
KING, T. P. ET AL.: "Inflammatory Role of Two Venom Components of Yellow Jackets (Vespula Vulgaris): a Mast Cell Degranulating Peptide Mastoparan and Phospholipase Al", INTERNATIONAL ARCHIVES OF ALLERGY AND IMMUNOLOGY, vol. 131, 2003, pages 25 - 32 *
MORENO, M. ET AL.: "Three Valuable Peptides from Bee and Wasp Venoms for Therapeutic and Biotechnological Use: Melittin, Apamin and Mastoparan", TOXINS, vol. 7, 2015, pages 1126 - 1150, XP05547037 *
YANG, M. J. ET AL.: "Enhancing Antimicrobial Activity of Mastoparan-B by Amino Acid Substitutions", JOURNAL OF ASIA-PACIFIC ENTOMOLOGY, vol. 16, 2013, pages 349 - 355, XP028741949 *

Also Published As

Publication number Publication date
KR101980146B1 (ko) 2019-05-20
KR20180024734A (ko) 2018-03-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2018092955A1 (ko) 전복에서 유래한 항균 펩타이드 유사체 및 이를 포함하는 항균용 약학 조성물
WO2021221486A1 (en) Vaccine composition for preventing or treating infection of sars-cov-2
US20050260223A1 (en) Salmonella vaccine materials and methods
WO2011025310A2 (ko) 돼지의 병원성 대장균의 부착인자가 형질전환된 약독화 살모넬라균 변이주 및 이를 포함하는 돼지의 병원성 대장균증 및 살모넬라균증의 예방 및 치료용 백신 조성물
WO2010074388A1 (ko) 신규한 박테리오파지 및 이를 포함하는 항균 조성물
US20210246177A1 (en) Cath2 derivatives
Safley et al. Role of listeriolysin-O (LLO) in the T lymphocyte response to infection with Listeria monocytogenes. Identification of T cell epitopes of LLO.
WO2015160089A1 (ko) 신규 박테리오파지 및 이를 포함하는 조성물
WO2017048028A1 (ko) 마이시니딘 펩타이드로부터 유래한 신규 항균 펩타이드 및 이의 용도
WO2015156509A1 (ko) 신규 박테리오파지 및 이를 포함하는 조성물
WO2015160166A1 (ko) 신규 박테리오파지 및 이를 포함하는 조성물
WO2013157813A1 (ko) 신규 박테리오파지 및 이를 포함하는 항균 조성물
AU2001256957A1 (en) Salmonella vaccine materials and methods
WO2015160165A1 (ko) 신규 박테리오파지 및 이를 포함하는 조성물
WO2017073851A1 (ko) 돼지유행성설사병바이러스 약독화주 및 불활화백신 조성물과 이를 이용한 경구 투여용 백신 조성물
WO2018044018A1 (ko) 사균 백신 제조용 펩타이드 및 이를 이용한 사균 백신
WO2011025344A2 (ko) 소의 병원성 대장균의 부착인자가 형질전환된 약독화 살모넬라균 변이주 및 이를 포함하는 소의 대장균증 및 살모넬라균증의 예방 및 치료용 백신조성물
WO2021066585A1 (ko) 면역 증강 활성 및 병원성 세균에 대한 항균 활성을 갖는 스타필로코커스 에피데르미데스 균주 및 이의 용도
WO2020213898A1 (ko) 돼지 유행성 설사병 바이러스 백신 조성물 및 이의 제조 방법
WO2017116005A1 (ko) 세포밖 소포 생성 및 숙주 면역반응을 조절하는 small rna 유전자 및 이의 용도
WO2019235705A1 (en) Vaccine composition comprising recombinant protein of staphylococcus aureus attenuated enterotoxin and cytotoxin
WO2022250416A1 (ko) 리포펩타이드와 폴리(i:c) 아쥬번트를 이용하는 면역항암치료제 조성물
WO2019172666A1 (ko) Ll37 펩타이드로부터 유래한 신규 항균 펩타이드 및 이의 용도
Sjöstedt et al. Immunization of mice with an attenuated Salmonella typhimurium strain expressing a membrane protein of Francisella tularensis a model for identification of bacterial determinants relevant to the host defence against tularemia
WO2019093611A1 (ko) 신규한 페디오코커스 펜토사세우스 에이비160011 균주 및 이를 포함하는 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 17846943

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 17846943

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1