WO2018043706A1 - 家畜用飼料又は家畜用サプリメント、ラクトバチルス属細菌の増殖促進剤、並びにラクトバチルス属細菌の増殖促進方法 - Google Patents

家畜用飼料又は家畜用サプリメント、ラクトバチルス属細菌の増殖促進剤、並びにラクトバチルス属細菌の増殖促進方法 Download PDF

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lactobacillus
livestock
bacteria
salacia
salacia plant
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文教 植田
由里子 小田
聡仁 天生
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富士フイルム株式会社
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    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs

Definitions

  • the present invention relates to livestock feed or livestock supplements containing Salacia.
  • the present invention further relates to a growth promoter for Lactobacillus bacteria in livestock, including Salacia.
  • the present invention further relates to a method for promoting the growth of Lactobacillus bacteria in livestock, comprising administering Salacia.
  • Thoroughbreds are light breed horses that have been improved for racing from Arab horses or hunters (British native breeds used for hunting) in the early 18th century. Thoroughbreds are still mated and trapped to win horse racing. Thoroughbreds can run at a speed of 60-70 km / hour for several minutes in a state of carrying a weight of 48-59 kg during the race. Thoroughbred is a high-value industrial animal, and about 110,000 animals are produced every year in the world including the United States, Australia, Ireland and Japan.
  • Thoroughbred illnesses include muscle fatigue, joint pain, trauma and fractures due to training and races, as well as diarrhea.
  • Examples of thoroughbred diarrhea include diarrhea due to rotavirus infection in foals, diarrhea due to transportation or administration of an antibacterial agent at the time of illness, and diarrhea due to colitis-X having a high lethality.
  • Thoroughbred diarrhea is a serious illness that is directly related to the fall in price due to hindering the growth of foals and the performance and life and death of active horses. Therefore, normalization of the intestinal environment aimed at improving such thoroughbred diarrhea is difficult. It has been demanded.
  • Patent Document 1 describes a feed additive characterized by containing a culture of microorganisms belonging to the genus Lactobacillus having a predetermined chemical taxonomic property and / or microbial cells as active ingredients.
  • Patent Document 2 describes an intestinal product containing a new strain Bifidobacterium longum having a rotavirus inhibitory activity known to cause diarrhea in children and young animals as an active ingredient. .
  • Patent Document 4 describes an agent for enhancing hypoglycemic effect by an ⁇ -glucosidase inhibitor, characterized in that it contains at least one bacterium selected from the group consisting of bifidobacteria, lactic acid bacteria, saccharifying bacteria, and butyric acid bacteria. ing. Patent Document 4 describes that Salacia may be used as an ⁇ -glucosidase inhibitor.
  • the inventors of the present invention have studied for the purpose of normalizing the intestinal environment of livestock such as horses represented by Thoroughbred, and it has been found that all of these effects are insufficient.
  • the feed additive described in Patent Document 1 administers lactic acid bacteria to animals, it is necessary to increase the stability of the lactic acid bacteria themselves, and the effect may not be obtained depending on the constitution of the animals to be administered.
  • the intestinal regulation product described in Patent Document 2 uses bifidobacteria, but when administered to horses, the intestinal pH is excessively lowered, which is undesirable for the environment where lactic acid bacteria are grown. There was concern about the internal environment.
  • the method of ingesting lactic acid bacteria or bifidobacteria itself into animals reduces the number of viable bacteria during the storage period before ingestion, or the ingested bacteria have an acidic environment in the stomach, for example. There is also a problem that the effect is not sufficient due to sterilization when passing.
  • the animal supplement described in Patent Document 3 is mainly composed of royal jelly, and the intestinal environment has not been studied.
  • the hypoglycemic effect enhancer described in Patent Document 4 at least one bacterium selected from the group consisting of bifidobacteria, lactic acid bacteria, saccharifying bacteria, and butyric acid bacteria is used, but the intestinal environment has been studied. Not.
  • the problem to be solved by the present invention is to improve the intestinal environment of livestock without administering bacteria from the outside, more specifically, to increase the composition ratio of Lactobacillus bacteria in the intestinal bacteria. It is possible to provide a livestock feed or livestock supplement, a Lactobacillus bacterium growth promoter, and a Lactobacillus bacterium growth promotion method.
  • a livestock feed or a livestock supplement used for promoting the growth of Lactobacillus bacteria in livestock comprising at least one of a Salacia plant, a Salacia plant extract, and a Salacia plant pulverized product.
  • the Lactobacillus genus bacteria are Lactobacillus equi, Lactobacillus hayakitensis, Lactobacillus equigenerosi, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus delbrueckii, and Lactobacillus delbrueckii.
  • the livestock feed or livestock supplement according to any one of [1] to [3], which is at least one selected from the group consisting of (Lactobacillus ingluviei).
  • a growth promoter for Lactobacillus bacteria in livestock comprising at least one of a Salacia plant, a Salacia plant extract, and a Salacia plant pulverized product.
  • the growth promoter for Lactobacillus bacteria in livestock according to any one of [5] to [7], which is at least one selected from the group consisting of (Lactobacillus ingluviei).
  • a method for promoting the growth of Lactobacillus bacteria in livestock comprising administering to the livestock at least one of Salacia plants, Salacia plant extracts, and Salacia plant grounds.
  • the method according to [9] wherein the average stool pH after ingestion for 6 days is 6.0 to 8.2.
  • the Lactobacillus genus bacteria are Lactobacillus equibruos, Lactobacillus hayakitensis, Lactobacillus equigenerosi, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus delbrueckii, and Lactobacillus delbrueckii
  • the number of Lactobacillus bacteria is increased without externally administering the bacteria. be able to.
  • the livestock feed or livestock supplement according to the present invention and the Lactobacillus spp. Growth promoter in the livestock according to the present invention contain at least one of a Salacia plant, a Salacia plant extract, and a Salacia plant pulverized product.
  • Lactobacillus genus bacteria which are bacteria classified as the Fermicutes gate
  • Increased Lactobacillus bacteria increase energy metabolism by producing lactic acid and acetic acid.
  • these acids break down dietary fibers that are not originally absorbed as nutrients and change them to a state where they can be absorbed as nutrients. I guess that will lead to. That is, when non-human animals ingest Salacia, it is considered that the increase in body weight was confirmed as a result of improving the intestinal environment, increasing the energy recovery rate from meals and making it easier to store as fat. .
  • lactic acid and acetic acid are energy sources that are easily consumed as described above, energy sources are also increased due to these increases, so that it is considered that the stamina of ingested non-human animals increases.
  • Livestock generally means mammals and birds other than humans that are raised by humans.
  • the livestock in the present invention refers to livestock excluding birds and pets, and specifically includes horses (light stallions, intermediate stallions, heavy stallions), pigs, cows (dairy cows, beef cattle), sheep, goats, and the like. Can do.
  • the livestock is preferably a herbivore.
  • the livestock in the present invention is preferably a horse, more preferably a light stallion.
  • the light stallion is a type of horse and generally means Arab, Thoroughbred, Anglo-Arab, Arab-type, and Thoroughbred-type.
  • the livestock in the present invention is particularly preferably thoroughbred.
  • the horses such as thoroughbreds may be not only race horses but also young horses being bred, horses for riding after retirement, or horses for meat.
  • the plant of the genus Salacia is a plant belonging to the Dechinmuraceae that grows mainly in Sri Lanka, India and Southeast Asia.
  • plants of the genus Salacia include Salacia reticulata, Salacia oblonga, Salacia prinoides, Salacia chinensis, Salacia chinensis, and Salacia chinensis.
  • One or more kinds of plants selected from Salacia buruniana, Salacia grandiflora, Salacia macrosperma are mentioned.
  • the plant belonging to the genus Salacia is preferably at least one plant selected from Salacia reticulata, Salacia oblonga, and Salacia chinensis.
  • At least one of Salacia plants, Salacia plant extracts, and Salacia plant pulverized products may be used, but Salacia plants can be preferably used.
  • Salacia plants can be preferably used as the plant belonging to the genus Salacia.
  • edible parts such as roots, trunks, leaves, flowers and fruits of the genus Salacia can be used as they are.
  • the extract of Salacia plant and the pulverized product of Salacia plant are the extract and / or pulverized product of edible parts such as roots, stems, leaves, flowers and fruits of Salacia plants, and It is used in the meaning including the dried product of the above extract and / or pulverized product.
  • the dry product may be a dry powder (extract powder).
  • extract powder obtained by drying an extract extracted from a site selected from roots and trunks is more preferably used.
  • the dry powder can be preferably obtained by extracting an edible portion of a plant of the genus Salacia with a solvent and drying the extract obtained above.
  • the solvent used for extraction include water, alcohol, or ketone, and a mixed solvent obtained by mixing two or more of these may be used.
  • the alcohol include methanol or ethanol, and ethanol is preferable.
  • ketone acetone, methyl ethyl ketone, cyclohexane or the like is preferable.
  • water, alcohol, a mixed solvent of water and alcohol, or a mixed solvent of water and ketone are preferable, water, alcohol, or a mixed solvent of water and alcohol is more preferable, and a heat of 50 ° C. to 98 ° C. Water, ethanol, or a mixed solvent of water and ethanol is more preferable.
  • the alcohol content in the mixed solvent of water and alcohol is preferably 30% by mass to 90% by mass, and more preferably 40% by mass to 70% by mass.
  • drying method used to obtain the dry powder (extract powder) by drying the extract include known drying methods such as spray drying and freeze drying.
  • a livestock feed or a livestock supplement containing at least one of a Salacia plant, a Salacia plant extract, and a Salacia plant pulverized product is provided.
  • the livestock feed or livestock supplement of the present invention is used for promoting the growth of Lactobacillus bacteria in livestock. Lactobacillus bacteria will be described later in this specification.
  • the feed for livestock of the present invention can be produced by blending at least one of a Salacia plant, a Salacia plant extract, and a Salacia plant pulverized product with a basic feed usually used according to the type of livestock. it can.
  • the basic feed may be any feed that has been conventionally fed to each livestock.
  • a horse such as a racehorse
  • cereals such as pastures, buckwheat, beans (such as soybeans), and oil pods are exemplified, but not particularly limited. It is also possible to use a mixed feed containing a plurality of materials.
  • the mixed feed for example, the following mixed feed can be used.
  • the livestock feed of the present invention contains additives such as fortifiers, quality improvers, antibiotics, antibacterial agents, enzymes, antifungal agents, antioxidants, coloring agents, sweeteners, and flavorings as necessary. May be.
  • the content of “at least one of Salacia plant, Salacia plant extract, and Salacia plant pulverized product” in the livestock feed of the present invention is not particularly limited, but is generally 1% by mass to 50% by mass.
  • the content is preferably 2% by mass to 40% by mass, more preferably 3% by mass to 30% by mass, and still more preferably 5% by mass to 20% by mass.
  • Livestock supplements are added to livestock feed and eaten with feed for the purpose of maintaining health, recovery or promotion, or prevention or improvement of disease.
  • the supplement for livestock of the present invention is particularly preferably a supplement for racehorses.
  • At least one of Salacia plant, Salacia plant extract, and Salacia plant pulverized product itself may be used, Salacia plant, Salacia plant extract, and What mix
  • blended another component with at least 1 type of the pulverized Salacia plant may be used.
  • Examples of the other components include, but are not particularly limited to, mineral yeast, flavonoids, polyphenols, and oral substances having an immunostimulatory action. Specific examples of the other components include components described in paragraph numbers 0023 to 0038 of JP-A-2015-127340.
  • the livestock supplement of the present invention is further selected from vitamins, vitamin-like substances, proteins, amino acids, fats and oils, organic acids, carbohydrates, plant-derived materials, animal-derived materials, food additives, and pharmaceutical additives.
  • One or more kinds of orally ingestible components may be appropriately contained.
  • the livestock supplement of the present invention is selected from various carriers such as excipients, lubricants, stabilizers, dispersants, binders, diluents, flavoring agents, sweeteners, flavoring agents, and coloring agents. It can be prepared using more than one type of additive, and may be prepared preferably as an oral administration agent.
  • the form of the supplement for livestock of the present invention is not particularly limited as long as the effect of the present invention is exerted.
  • the content of “at least one of Salacia plant, Salacia plant extract, and Salacia plant pulverized product” in the livestock supplement of the present invention is not particularly limited, but is generally 10% by mass to 100% by mass.
  • the content is preferably 20% by mass to 100% by mass, more preferably 50% by mass to 100% by mass, still more preferably 70% by mass to 100% by mass, and particularly preferably 90% by mass to 100% by mass. Yes, most preferably 100% by weight. That is, it is most preferable to use “at least one of Salacia plant, Salacia plant extract, and Salacia plant pulverized product” as it is as the supplement for livestock of the present invention.
  • a growth promoter for Lactobacillus bacteria in livestock comprising at least one of a Salacia plant, a Salacia plant extract, and a Salacia plant pulverized product.
  • Lactobacillus genus bacteria are Gram-positive rods classified as lactic acid bacteria. Lactobacillus is the largest genus of about 30 lactic acid bacteria. Lactobacillus bacteria are widely distributed in nature, and there are over 70 types of Lactobacillus bacteria.
  • the Lactobacillus bacterium is preferably a bacterium present in the intestines of horses. More preferably, the Lactobacillus bacterium is a bacterium that exists in the intestine of the horse and does not exist in the human intestine.
  • Lactobacillus genus Lactobacillus equi Lactobacillus hayakitensis, Lactobacillus equigenerosi, Lactobacillus deligenerosi, Lactobacillus delbruecki, At least one selected from the group consisting of Lactobacillus ingluviei.
  • Whether the growth promoter of Lactobacillus bacteria in livestock according to the present invention can promote the growth of Lactobacillus bacteria can be confirmed, for example, by the following method.
  • the livestock is ingested with a predetermined amount of the Lactobacillus bacterium growth promoter in the livestock according to the present invention for a certain period, and the feces before and after the ingestion period are collected.
  • DNA is extracted from the collected stool, and a sequence library is prepared using the obtained DNA.
  • Next-generation sequencer (MiSeq; Illumina) is used to perform sequencing, and high similarity data is divided into groups (OTU; Operation Taxonomic Unit; Operational Classification Unit) and system classification is estimated.
  • the total number of sequence data belonging to each classification group is aggregated and the data before and after is compared.
  • the initial value is set to 100, and the number of bacteria before and after ingestion is compared. By being less than 100, it can be confirmed whether the number of said predetermined microbe can be suppressed.
  • At least one of Salacia plant, Salacia plant extract, and Salacia plant pulverized product itself may be used, Salacia plant, It may be a mixture of at least one of the Salacia plant extract and Salacia plant pulverized product with other components.
  • Examples of the other components include, but are not particularly limited to, mineral yeast, flavonoids, polyphenols, and oral substances having an immunostimulatory action. Specific examples of the other components include components described in paragraph numbers 0023 to 0038 of JP-A-2015-127340.
  • the growth promoter of Lactobacillus bacteria in livestock according to the present invention further includes vitamins, vitamin-like substances, proteins, amino acids, fats and oils, organic acids, carbohydrates, plant-derived materials, animal-derived materials, feed additives, and animal medicines Ingredients that can be taken orally, such as one or more selected from the additives for use, may be appropriately contained.
  • the growth promoter of Lactobacillus bacteria in livestock according to the present invention includes various carriers such as excipients, lubricants, stabilizers, dispersants, binders, diluents, flavoring agents, sweeteners, flavoring agents, and It can be prepared using one or more additives selected from colorants, and may preferably be prepared as an oral administration agent.
  • the form of the growth promoter for Lactobacillus bacteria in livestock according to the present invention is not particularly limited as long as the effect of the present invention is exhibited.
  • tablets, pills, granules, fine granules, chewing agents It may be in the form of a capsule (filled in a hard capsule or soft capsule), liquid or chewable.
  • the content of “at least one of Salacia plant, Salacia plant extract, and Salacia plant pulverized product” in the growth promoter of Lactobacillus bacteria in livestock according to the present invention is not particularly limited, but is generally 10 mass. % To 100% by mass, preferably 20% to 100% by mass, more preferably 50% to 100% by mass, still more preferably 70% to 100% by mass, particularly preferably 90%. % By mass to 100% by mass, most preferably 100% by mass. That is, it is most preferable to use “at least one of Salacia plant, Salacia plant extract, and Salacia plant pulverized product” as it is as a growth promoter of Lactobacillus bacteria in livestock according to the present invention.
  • the livestock feed or livestock supplement and the Lactobacillus spp. Growth promoter according to the present invention can be administered orally to livestock, subject to livestock. That is, according to the third aspect of the present invention, the growth promotion of Lactobacillus bacteria in livestock, comprising administering to livestock at least one of Salacia plant, Salacia plant extract, and Salacia plant pulverized product A method is provided. Lactobacillus bacteria and preferred ranges thereof are as described above in the present specification.
  • a method for administering at least one of the Salacia plant, Salacia plant extract, and Salacia plant pulverized product to livestock is not particularly limited, but it may be orally administered, that is, taken orally by the livestock.
  • the daily intake or dose of “at least one kind of pulverized product” is preferably 0.1 mg / kg / day or more, more preferably 0.5 mg / kg / day or more, and further preferably 1.0 mg / kg / day or more. 2.0 mg / kg / day or more is even more preferable, and 4.0 mg / kg / day or more is particularly preferable.
  • the upper limit of the daily intake or dosage of the extract of Salacia plant and / or the pulverized product is not particularly limited, but is generally 2000 mg / kg / day or less, preferably 1000 mg / kg / day or less. is there.
  • the number of Lactobacillus bacteria is preferably 1.1 times or more, More preferably 1.5 times or more, still more preferably 2 times or more, still more preferably 5 times or more, particularly preferably 10 times or more.
  • Lactobacillus equi Lactobacillus hayakitensis, Lactobacillus equigenerosi, Lactobacillus deligen, Lactobacillus deligen, Lactobacillus deligen, -It is preferable that it is at least 1 sort (s) selected from the group which consists of Lingobacillus (Lactobacillus ingluviei), and it is most preferable that Lactobacillus squid is included.
  • s Lingobacillus
  • ⁇ Average stool pH after 6 days of ingestion> The average pH of feces after ingesting the livestock feed or livestock supplement or the Lactobacillus spp. Growth promoter according to the present invention for 6 days is not particularly limited, but is preferably 6.0 to 8.2, It is preferably 6.5 to 8.2, more preferably 7.0 to 8.2, even more preferably 7.4 to 8.2, and particularly preferably 7.6 to 8.0. is there.
  • the average pH of stool within the above range, the effect of killing cellulolytic bacteria can be suppressed, the increase of bad bacteria can also be suppressed, and a good intestinal environment can be maintained. it can.
  • the average pH of feces can be measured by the following method.
  • a sample solution is prepared by weighing a certain amount of stool and adding 9 times the amount of purified water to its mass.
  • the obtained sample solution is sufficiently shaken to disperse the sample in purified water, and then the sample solution is heated at 80 ° C. for 30 minutes to inactivate viruses and the like contained in the sample. Let stand. After allowing the sample solution to stand, the supernatant of the sample solution is collected and the pH is measured with a glass electrode.
  • a compact pH meter manufactured by Horiba, Ltd., LAQTwin B-172 can be used.
  • the amount of acetic acid in the stool can be increased.
  • Acetic acid can improve the intestinal environment by promoting intestinal peristalsis.
  • the amount of acetic acid in stool after ingestion for 6 days is preferably 1.1 times or more, more preferably 1.2 times or more, and still more preferably 1.3 times compared to the amount of acetic acid in stool before ingestion. More than double, still more preferably 1.4 times or more, particularly preferably 1.5 times or more.
  • the measurement of the amount of acetic acid in feces can be performed by a conventional method.
  • the method described in the Example mentioned later is mentioned as an example.
  • the number of Clostridium bacteria in the intestinal bacteria and / Or the proportion can be reduced.
  • the number of Clostridium bacteria is preferably 0.9 times or less, more preferably. Decreases to 0.8 times or less, more preferably 0.7 times or less, and particularly preferably 0.6 times or less.
  • Clostridium bacteria are obligate anaerobic bacteria that inhabit low-oxygen environments such as the soil and the intestines of organisms, and cannot grow in the presence of oxygen. Since many bacterium belonging to the genus Clostridium also contains pathogenic bacteria, the present invention may be able to suppress adverse effects caused by the pathogenic bacteria.
  • Whether or not the number or proportion of Clostridium bacteria is decreased can be measured in the same manner as the measurement method of whether or not the growth of Lactobacillus bacteria can be promoted.
  • a Salacia plant, a Salacia plant extract, and a Salacia for use in raising livestock including administration of a feed or supplement used to promote the growth of Lactobacillus bacteria in livestock
  • At least one genus plant ground product is provided.
  • the plant of Salacia, Salacia plant extract, and Salacia plant pulverization for the production of livestock feed or livestock supplement used for promoting the growth of Lactobacillus bacteria in livestock
  • At least one use of the object is provided.
  • Preferred embodiments in each of the above-described inventions are as described above in the present specification.
  • Tris is an abbreviation for trishydroxymethylaminomethane
  • EDTA is an abbreviation for ethylenediaminetetraacetic acid.
  • Example 1 After pulverizing the roots and stems of Salacia reticulata and Salacia oblonga (Salacia oblonga), they are mixed in equal weights, and the liquid obtained through the hot water extraction process at 98 ° C. is spray dried. Extracted extract powder was obtained.
  • Example 2 ⁇ Changes in the number of Lactobacillus and Clostridium bacteria in feces> Twelve thoroughbreds (weight: 440 to 480 kg) 2 to 12 years old were ingested 9 g of Salacia extract powder per day. Changes in the number of bacteria belonging to the genus Lactobacillus and Clostridium in the stool before ingestion of the extract of Salacia extract and after intake of the extract of Salacia extract for 6 days are expressed in T-RFLP (Nagashima method). Measured.
  • T-RFLP Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism
  • template DNA is amplified by PCR (polymerase chain reaction) with a primer set labeled with terminal fluorescence, and then fragment analysis is performed after digestion with a restriction enzyme.
  • the T-RFLP analysis is a fragment polymorphism analysis that is evaluated and compared based on the intensity, position, and number of detection peaks, utilizing the fact that the restriction enzyme cleavage sites differ due to differences in DNA base sequences.
  • the number of bacteria in feces can be made into a database by the “Nagashima method”, enteric bacteria can be estimated at the genus level, and the change can be visualized and digitized.
  • the average pH of feces was measured by the following method. A certain amount of sample (feces) was weighed, and 9 times the amount of purified water was added to its mass to prepare a sample solution. The obtained sample solution was sufficiently shaken to disperse the sample in purified water. Subsequently, the sample solution was heated at 80 ° C. for 30 minutes to inactivate viruses and the like contained in the sample, and then the sample solution was allowed to stand. After allowing the sample solution to stand, the supernatant of the sample solution was collected, and the pH was measured with a glass electrode. For pH measurement, a compact pH meter (manufactured by Horiba, Ltd., LAQTwin B-172) was used.
  • the amount of acetic acid in stool was measured by the following method.
  • a fixed amount of sample (feces) is precisely weighed in a bead tube and suspended in an extraction solution to obtain a sample solution.
  • the sample was pulverized by physical pulverization (beads and shaking), and then centrifuged (14000 rpm, 10 minutes).
  • the supernatant of the sample solution was collected and filtered through a membrane filter having a pore size of 0.45 ⁇ m to obtain a measurement sample.
  • the concentration of acetic acid contained in the measurement sample was measured by high performance liquid chromatography and converted to the amount of acetic acid in the sample.
  • the extraction solution is not particularly limited as long as it is a solution containing water, but is preferably a p-toluenesulfonic acid solution.
  • the results are shown in Table 2.
  • the numerical value of the amount of acetic acid in the stool in the table indicates a relative value when the amount of acetic acid in the stool before taking the Salacia extract powder is 100.
  • the average stool pH did not decrease even after 6 days of ingestion compared to before ingestion of Salacia extract powder.
  • the fecal pH is lower than pH 5.0, there is a concern that the activity of the cellulose-degrading bacterium is reduced, but the above-mentioned obstacle is not taken in the intake of Salacia extract powder.
  • the amount of acetic acid which is a kind of organic acid in feces, increased with the intake of Salacia extract powder. Acetic acid is known to promote intestinal peristalsis and improve the intestinal environment.
  • the change in the number of bacteria was measured by the following method. Feces before and after the intake period were collected using a stool collection kit (TechnoSuruga Laboratory Co., Ltd., Shizuoka, Japan). The collected stool was suspended in GTC (guanidine thiocyanate) Buffer (100 mmol / L Tris-HCl [pH 9.0], 40 mmol / L Tris-EDTA [pH 8.0], 4 mol / L Guanidine Thiocyanate). Feces added to the solution were crushed with zirconia beads, and DNA extraction was performed from 100 ⁇ l of suspension using an automatic nucleic acid extraction device (Precision System Science, Chiba, Japan).
  • GTC guanidine thiocyanate
  • the sample for the library for sequencing was prepared with the Nextera TM DNA sample preparation kit (Illumina Corporation). In addition, by adding an index sequence to each sample (according to the kit protocol), it was possible to distinguish the samples.
  • sequencing was performed with a next-generation sequencer (MiSeq; Illumina).
  • the obtained data was subjected to base sequence quality check and low quality data filtering. Data that passed the quality check was grouped into highly similar data (OTU; Operation Taxonomic Unit).
  • OTU Operation Taxonomic Unit
  • a homology search against the 16S rRNA gene database was performed to estimate the lineage classification. The total number of sequence data belonging to each classification group was counted, and the data comparison before and after was performed. However, since the existence ratio is greatly different for each bacterium, the initial value is set to 1, and the number of bacteria after ingestion is shown as a relative value. Comparison of the number of bacteria before and after ingestion was performed. The results are shown in Table 3.
  • bacteria belonging to the genus Lactobacillus which are good enteric bacteria in livestock, without administering bacteria from the outside, and it is possible to reduce harmful bacteria.
  • bacteria referred to as good bacteria there are bacteria that lower the intestinal pH and impair the function of cellulose-degrading bacteria, but in the present invention, preferably the intestinal pH is lowered.
  • lactic acid bacteria that are good bacteria can be increased.
  • the intestinal environment of livestock can be stabilized, and digestive organs such as diarrhea and constipation Disease prevention and treatment, stress relaxation, stress tolerance, health maintenance, growth promotion, digestion absorption promotion, feed efficiency improvement, and / or fecal shape and odor improvement can be achieved.
  • digestive organs such as diarrhea and constipation Disease prevention and treatment, stress relaxation, stress tolerance, health maintenance, growth promotion, digestion absorption promotion, feed efficiency improvement, and / or fecal shape and odor improvement can be achieved.

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Abstract

本発明の課題は、外部から細菌を投与することなく家畜の腸内環境を改善する、より具体的には、ラクトバチルス属細菌の腸内細菌中の構成割合を増加させることができる、家畜用飼料又は家畜用サプリメント、ラクトバチルス属細菌の増殖促進剤、及びラクトバチルス属細菌の増殖促進方法を提供することである。本発明によれば、サラシア属植物、サラシア属植物抽出物、及びサラシア属植物粉砕物の少なくとも一種を含有する、家畜におけるラクトバチルス属細菌の増殖促進のために使用される家畜用飼料又は家畜用サプリメントが提供される。

Description

家畜用飼料又は家畜用サプリメント、ラクトバチルス属細菌の増殖促進剤、並びにラクトバチルス属細菌の増殖促進方法
  本発明は、サラシアを含む、家畜用飼料又は家畜用サプリメントに関する。本発明はさらに、サラシアを含む、家畜におけるラクトバチルス属細菌の増殖促進剤に関する。本発明はさらに、サラシアを投与することを含む、家畜におけるラクトバチルス属細菌の増殖促進方法に関する。
　サラブレッドは、１８世紀初頭にイギリスにおいてアラブ馬又はハンター（狩猟に用いられたイギリス在来の品種）等から競走用に品種改良された軽種馬である。サラブレッドは、現在においても競馬で勝つことを目的として交配と淘汰が繰り返されている。サラブレッドは、競走時には４８～５９ｋｇの重量を背負った状態において数分間継続して６０～７０ｋｍ／時間の速度で走ることができる。サラブレッドは付加価値の高い産業用動物であり、アメリカ、オーストラリア、アイルランド及び日本等を含む全世界において毎年約１１万頭が生産されている。
　サラブレッドの病気としては、トレーニング及びレース等による筋疲労、関節痛、外傷及び骨折等に加え、下痢が挙げられる。サラブレッドの下痢としては、仔馬のロタウイルス感染による下痢、輸送又は病気時の抗菌剤投与による下痢、及び致死率の高いＸ大腸炎（colitis-X）による下痢などが挙げられる。サラブレッドの下痢は、仔馬の育成阻害による価格下落や、現役馬の成績及び生死に直結する重大疾患であるため、このようなサラブレッドの下痢を改善することを目的とした腸内環境の正常化が求められている。
　このような腸内環境の改善を目的として腸内の善玉菌を増やす方法としては、乳酸菌やビフィズス菌を動物に摂取させる方法が知られている。特許文献１には、所定の化学分類学的性質を有するラクトバチルス（Lactobacillus）属に属する微生物の培養物及び／又は微生物菌体を有効成分として含有することを特徴とする飼料添加物が記載されている。特許文献２には、小児及び幼い動物において下痢を起こすものとして知られるロタウイルスの抑制活性を有する新菌株ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum)を有効成分とする整腸製品が記載されている。
　一方、サラシア（コタラヒムとも言う）属植物の根及び幹は、インド及びスリランカの伝統医学アーユルヴェーダにおいて天然薬物として利用されてきた。スリランカでは、サラシア・レティキュラータ（Salacia reticulata）の根皮が、リュウマチ、淋病及び皮膚病の治療に有効であること、そして上記の根皮を初期糖尿病の治療に用いることが伝承されている。特許文献３には、ローヤルゼリーとコタラヒムとコエンザイムＱ１０とを含むことを特徴とする動物用サプリメントが記載されている。また、特許文献４には、ビフィズス菌、乳酸菌、糖化菌及び酪酸菌からなる群より選ばれる少なくとも１種の菌を含むことを特徴とするα－グルコシダーゼ阻害剤による血糖降下作用増強剤が記載されている。特許文献４には、α－グルコシダーゼ阻害剤としてサラシアを用いてもよいことが記載されている。
特開２００３－２３５５６９号公報 特開２００５－１０２６９６号公報 特開２００８－６７６３２号公報 特開２０１０－２４８１８５号公報
　本発明者らが、サラブレッドを代表とする馬などの家畜の腸内環境正常化を目的として検討したところ、いずれも効果が不十分であることがわかった。例えば、特許文献１に記載の飼料添加物は、乳酸菌自体を動物に投与することから、乳酸菌そのものの安定性を高める必要がある他、投与する動物の体質によって効果が得られないことがあった。また、特許文献２に記載の整腸製品は、ビフィズス菌を使用するものであるが、馬に投与した場合には、腸内ｐＨが過度に低下してしまい、乳酸菌の生育環境に好ましくない腸内環境となる懸念があった。特に、特許文献１及び２のように乳酸菌又はビフィズス菌自体を動物に摂取させる方法は、摂取前の保存期間中に生菌数が減少したり、摂取された細菌が例えば胃の酸性の環境を通る際に殺菌されてしまうことにより効果が十分ではないという問題もあった。
　特許文献３に記載の動物用サプリメントは、ローヤルゼリーが主成分であり、腸内環境については検討されていない。特許文献４に記載の血糖降下作用増強剤においても、ビフィズス菌、乳酸菌、糖化菌及び酪酸菌からなる群より選ばれる少なくとも１種の菌自体が使用されているが、腸内環境については検討されていない。
　本発明が解決しようとする課題は、外部から細菌を投与することなく家畜の腸内環境を改善する、より具体的には、ラクトバチルス属細菌の腸内細菌中の構成割合を増加させることができる、家畜用飼料又は家畜用サプリメント、ラクトバチルス属細菌の増殖促進剤、及びラクトバチルス属細菌の増殖促進方法を提供することである。
  本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、サラシアを家畜に摂取させることによって、外部から細菌を投与することなくラクトバチルス属細菌の数を飛躍的に増加できることを見出し、本発明を完成するに至った。本発明によれば以下の発明が提供される。
［１］　サラシア属植物、サラシア属植物抽出物、及びサラシア属植物粉砕物の少なくとも一種を含有する、家畜におけるラクトバチルス属細菌の増殖促進のために使用される家畜用飼料又は家畜用サプリメント。
［２］　６日間摂取後の糞便の平均ｐＨが６．０～８．２である、［１］に記載の家畜用飼料又は家畜用サプリメント。
［３］　６日間摂取後の糞便中の酢酸の量が、摂取前の糞便中の酢酸の量と比較して１．１倍以上増加している、［１］又は［２］に記載の家畜用飼料又は家畜用サプリメント。
［４］　ラクトバチルス属細菌が、ラクトバチルス・イクイ（Lactobacillus equi）、ラクトバチルス・ハヤキテンシス（Lactobacillus hayakitensis）、ラクトバチルス・イクイジェネロシ（Lactobacillus equigenerosi）、ラクトバチルス・デルブルエッキ（Lactobacillus delbrueckii）、及びラクトバチルス・イングルビエイ（Lactobacillus ingluviei）からなる群から選択される少なくとも一種である、［１］から［３］の何れか一に記載の家畜用飼料又は家畜用サプリメント。
［５］　サラシア属植物、サラシア属植物抽出物、及びサラシア属植物粉砕物の少なくとも一種を含有する、家畜におけるラクトバチルス属細菌の増殖促進剤。
［６］　６日間摂取後の糞便の平均ｐＨが６．０～８．２である、［５］に記載の家畜におけるラクトバチルス属細菌の増殖促進剤。
［７］　６日間摂取後の糞便中の酢酸の量が、摂取前の糞便中の酢酸の量と比較して１．１倍以上増加している、［５］又は［６］に記載の家畜におけるラクトバチルス属細菌の増殖促進剤。
［８］　ラクトバチルス属細菌が、ラクトバチルス・イクイ（Lactobacillus equi）、ラクトバチルス・ハヤキテンシス（Lactobacillus hayakitensis）、ラクトバチルス・イクイジェネロシ（Lactobacillus equigenerosi）、ラクトバチルス・デルブルエッキ（Lactobacillus delbrueckii）、及びラクトバチルス・イングルビエイ（Lactobacillus ingluviei）からなる群から選択される少なくとも一種である、［５］から［７］の何れか一に記載の家畜におけるラクトバチルス属細菌の増殖促進剤。
［９］　サラシア属植物、サラシア属植物抽出物、及びサラシア属植物粉砕物の少なくとも一種を家畜に投与することを含む、家畜におけるラクトバチルス属細菌の増殖促進方法。
［１０］　６日間摂取後の糞便の平均ｐＨが６．０～８．２である、［９］に記載の方法。
［１１］　６日間摂取後の糞便中の酢酸の量が、摂取前の糞便中の酢酸の量と比較して１．１倍以上増加している、［９］又は［１０］に記載の方法。
［１２］　ラクトバチルス属細菌が、ラクトバチルス・イクイ（Lactobacillus equi）、ラクトバチルス・ハヤキテンシス（Lactobacillus hayakitensis）、ラクトバチルス・イクイジェネロシ（Lactobacillus equigenerosi）、ラクトバチルス・デルブルエッキ（Lactobacillus delbrueckii）、及びラクトバチルス・イングルビエイ（Lactobacillus ingluviei）からなる群から選択される少なくとも一種である、［９］から［１１］の何れか一に記載の方法。
  本発明による家畜用飼料又は家畜用サプリメント、ラクトバチルス属細菌の増殖促進剤、及びラクトバチルス属細菌の増殖促進方法によれば、外部から細菌を投与することなくラクトバチルス属細菌の数を増加させることができる。
　以下に、本発明の実施の形態について説明する。
　本発明による家畜用飼料又は家畜用サプリメント、及び本発明による家畜におけるラクトバチルス属細菌の増殖促進剤は、サラシア属植物、サラシア属植物抽出物、及びサラシア属植物粉砕物の少なくとも一種を含有する。
　一般的に、ヒトがサラシアを摂取した場合、下記の理由から体重増加が抑制される傾向又は体重が減少する傾向を示すことが知られている。まず、ヒトがサラシアを摂取すると腸内において主にビフィズス菌が増加する。このビフィズス菌は糖を分解し、糖よりさらに消費され易いエネルギー源である乳酸や酢酸を生成させる。また、サラシアは、多糖を分解する酵素であるα－グルコシダーゼの阻害作用を有することが知られている。このため、ヒトにおいてはサラシア摂取による血糖上昇抑制効果および抗肥満効果が得られることが知られている。
　これに対し、非ヒト動物がサラシアを摂取した場合には体重が増加することが本発明者らの検討によって確認された。より詳細には、腸内において、乳酸菌の一種であるラクトバチルス属細菌が増加することが本発明者により今回見出された。
　この点について本発明者らは以下のように推測している。
　非ヒト動物がサラシアを摂取した場合、多糖類は、二糖類又はオリゴ糖の形態で大腸に到着し、大腸において細菌によるこれらの糖類の分解がおこるが、非ヒト動物はビフィズス菌を持たないため、乳酸菌群が増加し腸内環境が正常化するものと考えられる。この点についてさらに本発明者らが詳細に検討したところ、非ヒト動物がサラシアを摂取した場合、善玉菌として、ファーミキューテス門に分類される細菌であるラクトバチルス属細菌の増加が顕著であった。増加したラクトバチルス属細菌により、乳酸及び酢酸を生成してエネルギー代謝が高まる他、これらの酸が本来栄養として吸収されない食物繊維などを分解して栄養として吸収可能な状態に変化させることが体重増加に繋がるものと推測している。すなわち、非ヒト動物がサラシアを摂取した場合、腸内環境が改善することで、食事からのエネルギー回収率が高くなり、脂肪として蓄えやすくなる結果、体重の増加が確認されたものと考えている。また、上述の通り、乳酸や酢酸は消費され易いエネルギー源であるため、これらの増加によりエネルギー源も増加することとなるため、摂取した非ヒト動物のスタミナが増加すると考えられる。
　上記の通り、サラシアの効果は、ヒトと非ヒト動物とでは大きく異なり、馬などの家畜がサラシアを摂取することにより、外部から細菌を投与することなく腸内におけるラクトバチルス属細菌を増加させることができる。すなわち、上記家畜が元々保有していたラクトバチルス属細菌の増殖が促進されることは全く予想外な知見である。なお、ヒトにおける腸内のビフィズス菌の割合は最大２０％程度であるのに対し、馬ではビフィズス菌が検出されないので、ヒトと馬においては、腸内細菌におけるビフィズス菌と乳酸菌の割合が大きく異なっている。従って、ヒト又は非ヒト動物に細菌自体を摂取させる場合には、摂取すべき細菌の種類も本来は異なるはずであるが、従来においてはそのような検討は十分にはなされていない。上記の通りヒトと馬とでは腸内細菌の構成も異なることからも、家畜等の非ヒト動物におけるサラシア摂取の効果を予想することは困難である。
＜家畜＞
　家畜とは、一般的には、ヒト以外のほ乳類及び鳥類であって、ヒトにより飼育されるものを意味する。本発明における家畜とは、鳥類及びペットを除いた家畜であり、具体的には、馬（軽種馬、中間種馬、重種馬）、豚、牛（乳牛、肉牛）、羊、ヤギなどを挙げることができる。家畜は、草食動物であることが好ましい。
　本発明における家畜は、好ましくは馬であり、より好ましくは軽種馬である。軽種馬とは、馬の種別であり、一般的にはアラブ、サラブレッド、アングロアラブ、アラブ系種、及びサラブレッド系種を意味する。本発明における家畜は、特に好ましくはサラブレッドである。なお、サラブレッドなどの馬は、競走馬だけでなく、飼育中の若い馬、引退後の乗馬用の馬、または食肉用の馬でもよい。
＜サラシア属植物、サラシア属植物の抽出物、及びサラシア属植物の粉砕物＞
　サラシア属植物は、主としてスリランカ、インド及び東南アジア地域に自生するデチンムル科の植物である。サラシア属植物の具体例としては、サラシア・レティキュラータ（Ｓａｌａｃｉａ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔａ）、サラシア・オブロンガ（Ｓａｌａｃｉａ  ｏｂｌｏｎｇａ）、サラシア・プリノイデス（Ｓａｌａｃｉａ  ｐｒｉｎｏｉｄｅｓ）、サラシア・キネンシス（Ｓａｌａｃｉａ  ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）、サラシア・ラティフォリア（Ｓａｌａｃｉａ  ｌａｔｉｆｏｌｉａ）、サラシア・ブルノニアーナ（Ｓａｌａｃｉａ  ｂｕｒｕｎｏｎｉａｎａ）、サラシア・グランディフローラ（Ｓａｌａｃｉａ　ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒａ）、サラシア・マクロスペルマ（Ｓａｌａｃｉａ  ｍａｃｒｏｓｐｅｒｍａ）から選ばれる１種類以上の植物が挙げられる。サラシア属植物としては、サラシア・レティキュラータ（Ｓａｌａｃｉａ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔａ）、サラシア・オブロンガ（Ｓａｌａｃｉａ  ｏｂｌｏｎｇａ）、及びサラシア・キネンシス（Ｓａｌａｃｉａ  ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）から選ばれる少なくとも１種の植物であることが好ましい。
　本発明においては、サラシア属植物、サラシア属植物抽出物、及びサラシア属植物粉砕物の少なくとも一種を使用すればよいが、好ましくはサラシア属植物を使用することができる。サラシア属植物としては、サラシア属植物の根、幹、葉、花、果実等の可食部をそのまま使用することができる。
  本明細書において、サラシア属植物の抽出物、及びサラシア属植物の粉砕物とは、サラシア属植物の根、幹、葉、花、果実等の可食部の抽出物及び／又は粉砕物、並びに上記抽出物及び／又は粉砕物の乾燥物を包含する意味で用いられる。本明細書において、乾燥物とは、乾燥粉末（エキス末）でもよい。上記したサラシア属植物の抽出物及び／又は粉砕物を調製する際には、サラシア属植物の１種類以上の部位を混合して使用してもよい。家畜の摂取効率を高める観点から、サラシア属植物の抽出物としては、より好ましくは、根、及び幹から選ばれる部位から抽出した抽出物を乾燥して得られるエキス末が用いられる。
  乾燥粉末（エキス末）は、好ましくは、サラシア属植物の可食部等を溶媒によって抽出し、上記で得られた抽出物を乾燥させることによって得ることができる。
  抽出に用いる溶媒としては、水、アルコール、又はケトン等が挙げられ、これらを２種以上混合した混合溶媒を用いてもよい。
  アルコールとしては、メタノール、又はエタノール等が挙げられ、エタノールが好ましい。
  ケトンとしては、アセトン、メチルエチルケトン、又はシクロヘキサン等が好ましい。
  上記の中でも、水、アルコール、水とアルコールとの混合溶媒、又は水とケトンとの混合溶媒が好ましく、水、アルコール、又は水とアルコールとの混合溶媒がより好ましく、５０℃～９８℃の熱水、エタノール、又は水とエタノールとの混合溶媒がさらに好ましい。
  水とアルコールとの混合溶媒におけるアルコール含有量は、３０質量％～９０質量％が好ましく、４０質量％～７０質量％がより好ましい。
  抽出物を乾燥して、乾燥粉末（エキス末）を得る際の乾燥方法は、特に制限はなく、公知の乾燥方法、例えば、噴霧乾燥、凍結乾燥等の方法が挙げられる。
＜家畜用飼料又は家畜用サプリメント＞
　本発明の第一の側面によれば、サラシア属植物、サラシア属植物抽出物、及びサラシア属植物粉砕物の少なくとも一種を含有する、家畜用飼料又は家畜用サプリメントが提供される。本発明の家畜用飼料又は家畜用サプリメントは、家畜におけるラクトバチルス属細菌の増殖促進のために使用するものである。ラクトバチルス属細菌については、本明細書中において後記する。
　本発明の家畜用飼料は、家畜の種類に応じて通常使用される基本飼料に、サラシア属植物、サラシア属植物抽出物、及びサラシア属植物粉砕物の少なくとも一種を配合することにより製造することができる。
　基本飼料としては、各家畜に対して従来から給与されている飼料であればよい。競走馬などの馬の場合には、牧草類、燕麦などの穀類、豆類（大豆など）、及び油粕などが挙げられるが、特に限定されない。複数の素材を配合した配合飼料を使用することもできる。
　配合飼料としては、例えば、以下のような配合飼料を使用することができる。
　燕麦、フスマ、トウモロコシ、大豆粕、大麦、アルファルファ、ビタミン及びミネラルを配合した飼料；
　燕麦、フスマ、アルファルファミール、トウモロコシ、小麦粉、コーングルテンフィード、大豆油粕を主原料に、ビタミン、ミネラル及びハーブ等を配合した飼料；
　トウモロコシ、大麦、燕麦、小麦粉、大豆、ふすま、大豆粕、菜種粕、糖蜜、植物油を主原料に、ビタミン、ミネラル及びハーブ等を配合した飼料；
　燕麦、フスマ、大麦、トウモロコシ、小麦粉、大豆油粕、大豆、糖蜜、ビタミン・ミネラル、ハーブ等の通常の原料の他に、コエンザイムＱ１０、カルノシン、大豆ペプチドを配合した飼料：
　トウモロコシ、大麦、小麦粉、大豆、米ぬか、ふすま、大豆粕、菜種粕、黒ひまわり、糖蜜、植物油を主原料に、ビタミン、ミネラル及びハーブ等を配合した飼料；
　燕麦と混ぜて給与することを前提として、大豆、黒ヒマワリ、大豆粕、コーングルテンミール、糖蜜、トウモロコシ、ビートパルプを主原料にタンパク質、ビタミン、ミネラルを配合した飼料；並びに
　トウモロコシ、大麦、加熱処理大豆、黒ひまわり種子、燕麦、大豆粕、菜種粕、ビートパルプ等を配合した飼料。
　本発明の家畜用飼料は、必要に応じて、強化剤、品質改良剤、抗生物質、抗菌剤、酵素、防黴剤、抗酸化剤、着色剤、甘味料、香料などの添加剤を含んでいてもよい。
　本発明の家畜用飼料における「サラシア属植物、サラシア属植物抽出物、及びサラシア属植物粉砕物の少なくとも一種」の含有量は特に限定されないが、一般的には１質量％～５０質量％であり、好ましくは２質量％～４０質量％であり、より好ましくは３質量％～３０質量％であり、さらに好ましくは５質量％～２０質量％である。
　家畜用サプリメントとは、健康の保持、回復又は増進、あるいは病気の予防又は改善などを目的として、家畜の飼料に添加して飼料とともに食べさせるものである。本発明の家畜用サプリメントは、特に、競走馬（サラブレッド）用サプリメントとすることが好ましい。
　本発明の家畜用サプリメントとしては、サラシア属植物、サラシア属植物抽出物、及びサラシア属植物粉砕物の少なくとも一種それ自体のみを使用してもよいし、サラシア属植物、サラシア属植物抽出物、及びサラシア属植物粉砕物の少なくとも一種に対してさらに他の成分を配合したものでもよい。
　上記の他の成分としては、例えば、ミネラル酵母、フラボノイド、ポリフェノール、及び免疫賦活作用を有する経口物質等が挙げられるが、特に限定されない。上記の他の成分としては、具体的には、特開２０１５－１２７３４０号公報の段落番号００２３～００３８に記載された成分を挙げることができる。
  本発明の家畜用サプリメントには、さらに、ビタミン、ビタミン様物質、タンパク質、アミノ酸、油脂、有機酸、炭水化物、植物由来原料、動物由来原料、食品用添加物、及び医薬品用添加物から選択される１種以上等、経口摂取可能な成分を適宜含有させてもよい。
　本発明の家畜用サプリメントは、各種の担体、例えば賦形剤、滑沢剤、安定剤、分散剤、結合剤、希釈剤、香味料、甘味料、風味剤、及び着色剤から選択される１種以上の添加物を用いて調製することができ、好ましくは経口投与剤として調製してもよい。
　本発明の家畜用サプリメントの形態は、本発明の効果を奏するものである限り、特に制限されず、例えば、錠剤、丸剤、顆粒剤、細粒剤、咀嚼剤、カプセル剤（ハードカプセル、ソフトカプセルに充填されたもの）、液剤、チュアブル剤の形態であってもよい。
　本発明の家畜用サプリメントにおける「サラシア属植物、サラシア属植物抽出物、及びサラシア属植物粉砕物の少なくとも一種」の含有量は特に限定されないが、一般的には１０質量％～１００質量％であり、好ましくは２０質量％～１００質量％であり、より好ましくは５０質量％～１００質量％であり、さらに好ましくは７０質量％～１００質量％であり、特に好ましくは９０質量％～１００質量％であり、最も好ましくは１００質量％である。即ち、「サラシア属植物、サラシア属植物抽出物、及びサラシア属植物粉砕物の少なくとも一種」をそのまま本発明の家畜用サプリメントとして用いることが最も好ましい。
＜家畜におけるラクトバチルス属細菌の増殖促進剤＞
　本発明の第二の側面によれば、サラシア属植物、サラシア属植物抽出物、及びサラシア属植物粉砕物の少なくとも一種を含有する、家畜におけるラクトバチルス属細菌の増殖促進剤が提供される。
　ラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌とは、乳酸菌に分類されるグラム陽性桿菌である。ラクトバチルス属は約３０の乳酸菌の属の中で一番大きな属である。ラクトバチルス属細菌は自然界に広く分布しており、ラクトバチルス属細菌は７０種類以上存在する。
　ラクトバチルス属細菌は、好ましくは、馬の腸内に存在する細菌である。
　ラクトバチルス属細菌は、より好ましくは、馬の腸内に存在する細菌であり、かつヒトの腸内には存在しない細菌である。
　ラクトバチルス属細菌は、より好ましくは、ラクトバチルス・イクイ（Lactobacillus equi）、ラクトバチルス・ハヤキテンシス（Lactobacillus hayakitensis）、ラクトバチルス・イクイジェネロシ（Lactobacillus equigenerosi）、ラクトバチルス・デルブルエッキ（Lactobacillus delbrueckii）、及びラクトバチルス・イングルビエイ（Lactobacillus ingluviei）からなる群から選択される少なくとも一種である。
　本発明による家畜におけるラクトバチルス属細菌の増殖促進剤が、ラクトバチルス属細菌の増殖を促進できるかどうかは、例えば、以下の方法により確認することができる。
　家畜に、所定量の本発明による家畜におけるラクトバチルス属細菌の増殖促進剤を一定期間摂取させ、摂取期間前後の糞便を回収する。回収された便からDNAを抽出し、得られたDNAを用いて、シーケンスライブラリーを調製する。次世代シーケンサー（MiSeq；イルミナ社）により、シーケンスを行い、類似性の高いデータをグループ（OTU; Operation Taxonomic Unit; 操作的分類単位）分けし、系統分類を推定する。各分類群に属する配列データ数を集計し、前後のデータ比較を行うが、菌ごとに存在比率が大きく異なるため、初期値を１００とし、摂取前後の菌数の比較を実施し、摂取後が１００未満となることにより、上記の所定の菌の数を抑制できるかどうかを確認することができる。
　本発明による家畜におけるラクトバチルス属細菌の増殖促進剤としては、サラシア属植物、サラシア属植物抽出物、及びサラシア属植物粉砕物の少なくとも一種それ自体のみを使用してもよいし、サラシア属植物、サラシア属植物抽出物、及びサラシア属植物粉砕物の少なくとも一種に対してさらに他の成分を配合したものでもよい。
　上記の他の成分としては、例えば、ミネラル酵母、フラボノイド、ポリフェノール、及び免疫賦活作用を有する経口物質等が挙げられるが、特に限定されない。上記の他の成分としては、具体的には、特開２０１５－１２７３４０号公報の段落番号００２３～００３８に記載された成分を挙げることができる。
  本発明による家畜におけるラクトバチルス属細菌の増殖促進剤には、さらに、ビタミン、ビタミン様物質、タンパク質、アミノ酸、油脂、有機酸、炭水化物、植物由来原料、動物由来原料、飼料添加物、及び動物医薬品用添加物から選択される１種以上等、経口摂取可能な成分を適宜含有させてもよい。
　本発明による家畜におけるラクトバチルス属細菌の増殖促進剤は、各種の担体、例えば賦形剤、滑沢剤、安定剤、分散剤、結合剤、希釈剤、香味料、甘味料、風味剤、及び着色剤から選択される１種以上の添加物を用いて調製することができ、好ましくは経口投与剤として調製してもよい。
　本発明による家畜におけるラクトバチルス属細菌の増殖促進剤の形態は、本発明の効果を奏するものである限り、特に制限されず、例えば、錠剤、丸剤、顆粒剤、細粒剤、咀嚼剤、カプセル剤（ハードカプセル、ソフトカプセルに充填されたもの）、液剤、チュアブル剤の形態であってもよい。
　本発明による家畜におけるラクトバチルス属細菌の増殖促進剤における「サラシア属植物、サラシア属植物抽出物、及びサラシア属植物粉砕物の少なくとも一種」の含有量は特に限定されないが、一般的には１０質量％～１００質量％であり、好ましくは２０質量％～１００質量％であり、より好ましくは５０質量％～１００質量％であり、さらに好ましくは７０質量％～１００質量％であり、特に好ましくは９０質量％～１００質量％であり、最も好ましくは１００質量％である。即ち、「サラシア属植物、サラシア属植物抽出物、及びサラシア属植物粉砕物の少なくとも一種」をそのまま本発明による家畜におけるラクトバチルス属細菌の増殖促進剤として用いることが最も好ましい。
＜家畜におけるラクトバチルス属細菌の増殖促進方法＞
　本発明による家畜用飼料又は家畜用サプリメント、並びにラクトバチルス属細菌の増殖促進剤は、家畜を投与対象とし、家畜に経口的に投与することができる。
　即ち、本発明の第三の側面によれば、サラシア属植物、サラシア属植物抽出物、及びサラシア属植物粉砕物の少なくとも一種を家畜に投与することを含む、家畜におけるラクトバチルス属細菌の増殖促進方法が提供される。
　ラクトバチルス属細菌とその好ましい範囲は、本明細書中上記した通りである。
　サラシア属植物、サラシア属植物抽出物、及びサラシア属植物粉砕物の少なくとも一種を家畜に投与する方法は特に限定されないが、経口的に投与、即ち、家畜に経口的に摂取させればよい。
　本発明による家畜用飼料又は家畜用サプリメント、又はラクトバチルス属細菌の増殖促進剤の腸内細菌数抑制剤を、家畜に投与する場合、「サラシア属植物、サラシア属植物抽出物、及びサラシア属植物粉砕物の少なくとも一種」の一日摂取量又は投与量は、０．１ｍｇ／ｋｇ／日以上が好ましく、０．５ｍｇ／ｋｇ／日以上がより好ましく、１．０ｍｇ／ｋｇ／日以上がさらに好ましく、２．０ｍｇ／ｋｇ／日以上がさらに一層好ましく、４．０ｍｇ／ｋｇ／日以上が特に好ましい。サラシア属植物の抽出物及び／又は粉砕物の一日摂取量又は投与量の上限は特に限定されないが、一般的には、２０００ｍｇ／ｋｇ／日以下であり、好ましくは１０００ｍｇ／ｋｇ／日以下である。
　本発明による家畜用飼料又は家畜用サプリメント、又はラクトバチルス属細菌の増殖促進剤の腸内細菌数抑制剤を、家畜に投与する場合、ラクトバチルス属細菌の数は好ましくは１．１倍以上、より好ましくは１．５倍以上、さらに好ましくは２倍以上、さらに一層好ましくは５倍以上、特に好ましくは１０倍以上増殖する。このとき、増殖するラクトバチルス属細菌は、ラクトバチルス・イクイ（Lactobacillus equi）、ラクトバチルス・ハヤキテンシス（Lactobacillus hayakitensis）、ラクトバチルス・イクイジェネロシ（Lactobacillus equigenerosi）、ラクトバチルス・デルブルエッキ（Lactobacillus delbrueckii）、及びラクトバチルス・イングルビエイ（Lactobacillus ingluviei）からなる群から選択される少なくとも一種であることが好ましく、ラクトバチルス・イクイを含むことが最も好ましい。
＜６日間摂取後の糞便の平均ｐＨについて＞
　本発明による家畜用飼料又は家畜用サプリメント又はラクトバチルス属細菌の増殖促進剤を６日間摂取した後の糞便の平均ｐＨは、特に限定されないが、好ましくは６．０～８．２であり、より好ましくは６．５～８．２であり、さらに好ましくは７．０～８．２であり、さらに一層好ましくは７．４～８．２であり、特に好ましくは７．６～８．０である。糞便の平均ｐＨを上記の範囲内にすることにより、セルロース分解菌を死滅させる効果を抑制することができるとともに、悪玉菌の増加を抑制することもでき、良好な腸内環境を維持することができる。
　糞便の平均ｐＨは、以下の方法で測定することができる。一定量の糞便を量り取り、その質量に対して９倍量の精製水を添加して試料溶液を調製する。得られた試料溶液を十分に振盪して、試料を精製水中に分散させ、続いて、試料溶液を８０℃で３０分間加熱して試料中に含まれるウイルス等を失活させた後に、試料溶液を静置する。試料溶液を静置した後、試料溶液の上清を採取し、ガラス電極によるｐＨ測定を行う。ｐＨ測定には、コンパクトｐＨメータ（株式会社堀場製作所製、ＬＡＱＵＱｔｗｉｎ　Ｂ－１７２）を用いることができる。
＜酢酸について＞
　本発明による、家畜用飼料又は家畜用サプリメント、ラクトバチルス属細菌の増殖促進剤、並びにラクトバチルス属細菌の増殖促進方法によれば、好ましくは、糞便中の酢酸量を増加させることができる。酢酸は腸の蠕動運動を促進することで腸内環境を改善することができる。６日間摂取後の糞便中の酢酸の量が、摂取前の糞便中の酢酸の量と比較して、好ましくは１．１倍以上、より好ましくは１．２倍以上、さらに好ましくは１．３倍以上、更に一層好ましくは１．４倍以上、特に好ましくは１．５倍以上増加している。
　糞便中の酢酸量の測定は、常法により行うことができる。例えば、後述の実施例で記載する方法が例として挙げられる。
＜クロストリジウム（Clostridium）属細菌について＞
　本発明による、家畜用飼料又は家畜用サプリメント、ラクトバチルス属細菌の増殖促進剤、並びにラクトバチルス属細菌の増殖促進方法によれば、好ましくは、腸内細菌におけるクロストリジウム（Clostridium）属細菌の数及び／又は割合を減少させることができる。本発明による家畜用飼料又は家畜用サプリメントあるいはラクトバチルス属細菌の増殖促進剤の摂取により、摂取前と比較して、クロストリジウム（Clostridium）属細菌の数は、好ましくは０．９倍以下、より好ましくは０．８倍以下、さらに好ましくは０．７倍以下、特に好ましくは０．６倍以下に減少する。
　クロストリジウム属細菌とは、土壌内部や生物の腸内などの酸素濃度が低い環境に生息する偏性嫌気性菌であり、酸素存在下では増殖できない。クロストリジウム属細菌の中には多数の病原菌も含まれていることから、本発明によれば、病原菌による悪影響を抑制することができる場合がある。
　クロストリジウム（Clostridium）属細菌の数又は割合が減少するかどうかの測定は、ラクトバチルス属細菌の増殖を促進できるかどうかの測定方法と同様に行うことができる。
＜サラシア属植物、サラシア属植物抽出物、及びサラシア属植物粉砕物の用途＞
　さらに本発明によれば、家畜におけるラクトバチルス属細菌の増殖促進のために使用される飼料又はサプリメントの投与を含む家畜の飼育において使用するための、サラシア属植物、サラシア属植物抽出物、及びサラシア属植物粉砕物の少なくとも一種が提供される。
　さらに本発明によれば、家畜におけるラクトバチルス属細菌の増殖を促進する処置において使用するための、サラシア属植物、サラシア属植物抽出物、及びサラシア属植物粉砕物の少なくとも一種が提供される。
　さらに本発明によれば、家畜におけるラクトバチルス属細菌の増殖促進のために使用される家畜用飼料又は家畜用サプリメントの製造のための、サラシア属植物、サラシア属植物抽出物、及びサラシア属植物粉砕物の少なくとも一種の使用が提供される。
　さらに本発明によれば、家畜におけるラクトバチルス属細菌の増殖促進剤の製造のための、サラシア属植物、サラシア属植物抽出物、及びサラシア属植物粉砕物の少なくとも一種の使用が提供される。
　上記した各発明における好ましい態様は、本明細書中において上記した通りである。
  本発明を以下の実施例によりさらに説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。本明細書中において、Trisはトリスヒドロキシメチルアミノメタンの略称であり、EDTAはエチレンジアミン四酢酸の略称である。
実施例１：
　サラシア・レティキュラータ（Ｓａｌａｃｉａ　ｒｅｔｉｃｕｌａｔａ）とサラシア・オブロンガ（Ｓａｌａｃｉａ　ｏｂｌｏｎｇａ）の根及び幹の部分を粉砕後、等重量ずつ混合し、９８℃の熱水抽出工程を経て得られた液をスプレー乾燥し、サラシア抽出エキス末を得た。
実施例２：
＜糞便中におけるラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌とクロストリジウム（Clostridium）属細菌の数の変化＞
　２歳～１２歳のサラブレッド１２頭（体重：４４０～４８０ｋｇ）に、サラシア抽出エキス末を１日あたり９g摂取させた。サラシア抽出エキス末の摂取前並びにサラシア抽出エキス末を６日間摂取した後において糞便中におけるラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌とクロストリジウム（Clostridium）属細菌の数の変化を、Ｔ－ＲＦＬＰ（Ｎａｇａｓｈｉｍａ法）にて測定した。Ｔ－ＲＦＬＰ（Ｔｅｒｍｉｎａｌ　Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　Ｆｒａｇｍｅｎｔ　Ｌｅｎｇｔｈ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）解析は、末端蛍光標識したプライマーセットで鋳型ＤＮＡをＰＣＲ（polymerase chain reaction、ポリメラーゼ連鎖反応）増幅し、制限酵素による消化後、フラグメント解析を行う。Ｔ－ＲＦＬＰ解析は、ＤＮＡ塩基配列の違いから制限酵素切断部位が異なることを利用して、検出ピークの強度、位置、数により評価・比較する断片多型性解析である。糞便中における細菌数は、『Ｎａｇａｓｈｉｍａ法』によりデータベース化し、属レベルで腸内細菌を推定し、その変化を視覚化・数値化することが可能である。
　結果を表１に示す。
　表中の数値は、サラシア抽出エキス末の摂取前における各細菌の数を１００とした時の、相対値を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１に示す通り、サラシア抽出エキス末の摂取により、善玉菌であるラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌の割合が顕著に増加し、多くの病原菌が属するクロストリジウム（Clostridium）属細菌の割合は減少した。
＜糞便の平均ｐＨ及び糞便中の酢酸量の変化＞
　また、サラシア抽出エキス末の摂取前並びにサラシア抽出エキス末を６日間摂取した後において、糞便の平均ｐＨ及び糞便中の酢酸量を測定した。
　糞便の平均ｐＨは以下の方法で測定した。一定量の試料（糞便）を量り取り、その質量に対して９倍量の精製水を添加して試料溶液を調製した。得られた試料溶液を十分に振盪して、試料を精製水中に分散させた。続いて、試料溶液を８０℃で３０分間加熱して試料中に含まれるウイルス等を失活させた後に、試料溶液を静置した。試料溶液を静置した後、試料溶液の上清を採取し、ガラス電極によるｐＨ測定を行った。ｐＨ測定には、コンパクトｐＨメータ（株式会社堀場製作所製、ＬＡＱＵＱｔｗｉｎ　Ｂ－１７２）を用いた。
　糞便中の酢酸量は、以下の方法で測定した。
　一定量の試料（糞便）をビーズチューブに精秤し、抽出溶液で懸濁させ、試料溶液を得る。続いて、得られた試料溶液を熱処理（８５℃２０分）した後、物理的粉砕（ビーズおよび振盪）により試料を粉砕させた後に遠心分離（１４０００ｒｐｍ、１０分間）を行った。試料溶液の上清を採取し、孔径０．４５μｍのメンブランフィルターで濾過して得られた溶液を測定用サンプルとした。
　測定用サンプルに含まれる酢酸の濃度を高速液体クロマトグラフィーで測定し、試料中の酢酸量へと変換した。
　なお、抽出溶液としては水を含む溶液であれば特に限定されないが、ｐ－トルエンスルホン酸溶液であることが好ましい。
　結果を表２に示す。表中の糞便中の酢酸量の数値は、サラシア抽出エキス末の摂取前における糞便中の酢酸量を１００とした時の、相対値を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２に示す通り、サラシア抽出エキス末の摂取前と比べて、６日間摂取した後でも、糞便の平均ｐＨは低下しなかった。糞便のｐＨがｐＨ５．０よりも低くなると、セルロース分解菌の活性が低下する懸念があるが、サラシア抽出エキス末の摂取には上記の支障はない。また、サラシア抽出エキス末の摂取により、糞便中の有機酸の一種である酢酸の量は増加した。酢酸は腸の蠕動運動を促進し、腸内環境を改善することが知られている。
＜ラクトバチルス属の菌種ごとの菌数の変化＞
　さらに、サラシア抽出エキス末の摂取前並びにサラシア抽出エキス末を６日間摂取した後において、ラクトバチルス属の菌数の変化を、菌種ごとに調べた。
　菌数の変化の測定は以下の方法で行った。摂取期間前後の糞便を採便キット（TechnoSuruga Laboratory Co. , Ltd., Shizuoka, Japan）を用いて回収した。回収された便を、GTC（グアニジンチオシアネート） Buffer(100mmol/L Tris-HCl [pH 9.0], 40mmol/L Tris-EDTA  [pH8.0], 4mol/L Guanidine Thiocyanate)に懸濁した。液中に添加した糞便をジルコニアビーズにより破砕し、100 μlの懸濁液から自動核酸抽出装置（Precision System Science , Chiba,Japan）を用いてDNA抽出を行った。得られたDNAを用いて、NexteraTM  DNAサンプル調製キット（イルミナ株式会社）により、シーケンス用ライブラリーのサンプル調整を行った。また、各サンプルにインデックス配列を付加（キットのプロトコルに従った）することにより、サンプルの判別を可能にした。調整されたシーケンサーライブラリーを用い、次世代シーケンサー（MiSeq；イルミナ社）により、シーケンスを行った。得られたデータについては、塩基配列のクオリティチェックを行い、低クオリティデータのフィルタリングを実施した。クオリティチェックをクリアしたデータを、類似性の高いデータをグループ（OTU; Operation Taxonomic Unit; 操作的分類単位）分けした。各OTUについて、16S ｒRNA遺伝子データベースに対する相同性検索を行い、系統分類を推定した。各分類群に属する配列データ数を集計し、前後のデータ比較を行ったが、菌ごとに存在比率が大きく異なるため、初期値を１とし、摂取後の菌数を相対値として示すことにより、摂取前後の菌数の比較を実施した。結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３に示す結果から、サラシア抽出エキス末は、馬が元々保有しているラクトバチルス属細菌を顕著に増加させる効果があることが証明された。
　本発明によれば、外部から細菌を投与することなく、家畜における腸内善玉菌であるラクトバチルス属細菌を増加させることができ、また好ましくは有害な菌を低減することができる。また、善玉菌と称される菌の中には、腸内ｐＨを低下させて、セルロース分解菌の働きを損なう菌も存在するが、本発明においては、好ましくは、腸内ｐＨを低下させることなく、善玉菌である乳酸菌を増加することができる。
　本発明に従ってサラシア属植物、サラシア属植物抽出物、及びサラシア属植物粉砕物の少なくとも一種を家畜に投与することによって、家畜の腸内環境を安定化することができ、下痢及び便秘等の消化器疾患の予防や治療、ストレスの緩和、ストレス耐性の付与、健康維持、成長促進、消化吸収促進、飼料効率の向上、及び／又は糞便の形状や臭いの改善などを図ることができる。

Claims (12)

  1. サラシア属植物、サラシア属植物抽出物、及びサラシア属植物粉砕物の少なくとも一種を含有する、家畜におけるラクトバチルス属細菌の増殖促進のために使用される家畜用飼料又は家畜用サプリメント。
  2. ６日間摂取後の糞便の平均ｐＨが６．０～８．２である、請求項１に記載の家畜用飼料又は家畜用サプリメント。
  3. ６日間摂取後の糞便中の酢酸の量が、摂取前の糞便中の酢酸の量と比較して１．１倍以上増加している、請求項１又は２に記載の家畜用飼料又は家畜用サプリメント。
  4. ラクトバチルス属細菌が、ラクトバチルス・イクイ（Lactobacillus equi）、ラクトバチルス・ハヤキテンシス（Lactobacillus hayakitensis）、ラクトバチルス・イクイジェネロシ（Lactobacillus equigenerosi）、ラクトバチルス・デルブルエッキ（Lactobacillus delbrueckii）、及びラクトバチルス・イングルビエイ（Lactobacillus ingluviei）からなる群から選択される少なくとも一種である、請求項１から３の何れか一項に記載の家畜用飼料又は家畜用サプリメント。
  5. サラシア属植物、サラシア属植物抽出物、及びサラシア属植物粉砕物の少なくとも一種を含有する、家畜におけるラクトバチルス属細菌の増殖促進剤。
  6. ６日間摂取後の糞便の平均ｐＨが６．０～８．２である、請求項５に記載の家畜におけるラクトバチルス属細菌の増殖促進剤。
  7. ６日間摂取後の糞便中の酢酸の量が、摂取前の糞便中の酢酸の量と比較して１．１倍以上増加している、請求項５又は６に記載の家畜におけるラクトバチルス属細菌の増殖促進剤。
  8. ラクトバチルス属細菌が、ラクトバチルス・イクイ（Lactobacillus equi）、ラクトバチルス・ハヤキテンシス（Lactobacillus hayakitensis）、ラクトバチルス・イクイジェネロシ（Lactobacillus equigenerosi）、ラクトバチルス・デルブルエッキ（Lactobacillus delbrueckii）、及びラクトバチルス・イングルビエイ（Lactobacillus ingluviei）からなる群から選択される少なくとも一種である、請求項５から７の何れか一項に記載の家畜におけるラクトバチルス属細菌の増殖促進剤。
  9. サラシア属植物、サラシア属植物抽出物、及びサラシア属植物粉砕物の少なくとも一種を家畜に投与することを含む、家畜におけるラクトバチルス属細菌の増殖促進方法。
  10. ６日間摂取後の糞便の平均ｐＨが６．０～８．２である、請求項９に記載の方法。
  11. ６日間摂取後の糞便中の酢酸の量が、摂取前の糞便中の酢酸の量と比較して１．１倍以上増加している、請求項９又は１０に記載の方法。
  12. ラクトバチルス属細菌が、ラクトバチルス・イクイ（Lactobacillus equi）、ラクトバチルス・ハヤキテンシス（Lactobacillus hayakitensis）、ラクトバチルス・イクイジェネロシ（Lactobacillus equigenerosi）、ラクトバチルス・デルブルエッキ（Lactobacillus delbrueckii）、及びラクトバチルス・イングルビエイ（Lactobacillus ingluviei）からなる群から選択される少なくとも一種である、請求項９から１１の何れか一項に記載の方法。
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