WO2018041751A1 - Nouvel actif immunomodulateur et composition le comprenant - Google Patents

Nouvel actif immunomodulateur et composition le comprenant Download PDF

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WO2018041751A1
WO2018041751A1 PCT/EP2017/071492 EP2017071492W WO2018041751A1 WO 2018041751 A1 WO2018041751 A1 WO 2018041751A1 EP 2017071492 W EP2017071492 W EP 2017071492W WO 2018041751 A1 WO2018041751 A1 WO 2018041751A1
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WO
WIPO (PCT)
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polysaccharide
skin
agents
composition
sulfated polysaccharide
Prior art date
Application number
PCT/EP2017/071492
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English (en)
Inventor
Cédric DELATTRE
Philippe Michaud
Guillaume Pierre
Nicolas BRIDIAU
Thierry MAUGARD
Taratra Andrée FENORADOSOA
Hernas Martial RAKOTOARISOA
Original Assignee
Universite Clermont Auvergne
Sigma Clermont
Centre National De La Recherche Scientifique
Universite De La Rochelle
Universite D'antsiranana
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Publication date
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Priority to EP17762075.4A priority patent/EP3506914A1/fr
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    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin

Definitions

  • the present invention relates to a sulfated polysaccharide extracted from a red algae for use in modulating the immune response in humans or animals.
  • the skin is a keratinized multi-stratified epithelium surrounding the entire external surface of humans.
  • the skin plays a role in particular:
  • chemical barrier proteins and antimicrobial peptides that can lead to: mechanical disruption of bacterial membranes, enzymatic disruption of bacterial membranes and nutrient sequestration,
  • the skin is in constant contact with many environmental factors (viruses, parasites and bacteria, but also exposure to the sun and especially to UV) that can damage it.
  • the immune system develops natural defense mechanisms (innate immunity called natural or non-specific) and acquired (adaptive or specific immunity).
  • the characteristic molecular patterns of the microorganisms will interact with the Toll type receptors present on the membrane of keratinocytes, dendritic cells, mast cells and macrophages. These activated cells become effector (phagocytosis of bacteria by the dentritic cells and macrophages) and release vasodilator mediators allowing plasma exudation and inflammatory cytokines such as TNFa, IL1a, IL8, which again amplifies the vasodilatory reaction and vasoperméabilisation.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • MMP Microx Metallo-Proteases
  • Creams comprising corticoids, corticosteroids, anti-acne, estrogens or steroidal or non-steroidal anti-inflammatory drugs, obtained by chemical synthesis, are commonly used to treat inflammation of the skin.
  • the chemical compounds in these creams can be generated during their administration to the patient side effects, such as allergic reactions.
  • compositions of natural origin capable of inhibiting or antagonizing the effects of VEGF, in order to prevent and / or treat inflammatory diseases, especially in the skin, while decreasing the risks of side effects.
  • sulphated polysaccharides extracted from the marine red algae of the genus Haliptilon subulatum exhibit interesting immunomodulatory properties, in particular on the inhibition of the release of vascular endothelial growth factor. (VEGF) by the cells involved in the inflammatory process and / or as a VEGF antagonist.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • the present invention relates to a sulfated polysaccharide extracted from a red algae of the species Haliptilon subulatum or a salt thereof for use in modulating the immune response in humans or animals.
  • the subject of the present invention is a sulphated polysaccharide extracted from a red algae of the species Haliptilon subulatum or a salt thereof for use in the prevention and / or treatment of inflammatory diseases in the human being or the animal.
  • modulation of the immune response is meant the meaning usually given to these terms and well known to those skilled in the art, in particular any property for stimulating or inhibiting the immune reactions of the human or animal body.
  • Polysaccharides from red algae are constructed on the basis of a linear sequence of 3- / 3-galactopyranose and 4-a-galactopyranose units alternating regularly.
  • the unit / 3-galactopyranose still belongs to the D series, while the unit has galactopyranose is of configuration D in carrageenans and of L configuration in agarocolloids.
  • a portion of the 4- ⁇ -galactopyranose residues may exist in the form of 3,6-anhydrogalactose.
  • the 3,6-anhydrogalactose form is obtained by elimination of the sulfate ester carried by the carbon 6 of the 4-linked ⁇ -galactose unit, under the action of galactose-6-sulfurylases during the biosynthesis or by a alkaline treatment.
  • the sulphated polysaccharide is extracted from a red alga, advantageously from a red marine alga, advantageously a red marine alga from the class of Floridaophyceae, even more advantageously from a red marine alga of the species Haliptilon subulatum.
  • the sulphated polysaccharide according to the invention in which the sulphate level of said polysaccharide is less than or equal to 20% by weight of the polysaccharide, corresponds to formula (I):
  • the unit A is a 3 ⁇ -D-galactopyranose, in which the free hydroxyl functions are substituted with one or more groups chosen from XA 2 , XA 4 , XA 6 ,
  • unit B is selected from the group consisting of residue B1 and residue B2:
  • residue B1 being a 4-aD / L-galactopyranose, in which the free hydroxyl functions are substituted with one or more groups chosen from X B 2, XB 3 and X B e and,
  • residue B2 being a 4-a-3,6-anhydrogalactopyranose, in which the free hydroxyl functions of 4-a-3,6-anhydrogalactopyranose are substituted with an XB2 group and,
  • residues B1 and B2 being distributed randomly in the polysaccharide and the residue B2 representing at most 5% by weight of the polysaccharide
  • unit A is connected to unit B by an O-glycosidic bond between the carbon at position 1 of unit A and the carbon at position 4 of unit B and,
  • unit B is connected to unit A by an O-glycosidic bond between the carbon at position 1 of unit B and the carbon at position 3 of unit A,
  • XA2, XA4, XA6, XB2, XB3 and XB6 are independently selected from each other and independently for each A and / or B unit in the group consisting of:
  • a pyruvate group (-COO-CO-CH3), said pyruvate group being linked to the group XA 4 by its carbon in position 2 and to the group XA6 by its carbon in position 2;
  • a saccharide unit linked to unit A or B by an O-glycoside type bond at position 1 (Ci) of the saccharide unit the saccharide unit being chosen from a galactose (or T-galactose), a xylose (or T-xylose), an arabinose (or T-arabinose) and a glucuronic acid (or T-glucuronic acid); and
  • a (C1-C6) alkoxyl group a (C1-C6) alkylcarbonyl group, a (C1-C6) alkoxycarbonyl group, a (C1-C6) acyloxy group, a group derived from a diacid, a phosphate group;
  • Xa represents a hydrogen atom, a hydroxyl group, a (C1-C6) alkoxyl group, a (C1-C6) acyloxy group, a sulfate group;
  • - n is an integer between 10 and 3000.
  • polysaccharide is understood to mean either a polysaccharide of high molecular mass or a polysaccharide of low molecular weight.
  • high molecular weight polysaccharide is meant a polysaccharide having a molecular weight between 100 and 1000 kDa.
  • low molecular weight polysaccharide is meant a polysaccharide having a molecular mass of between 5 and 100 kDa.
  • n represents an integer between 10 and 3000, advantageously between 10 and 2000, advantageously between 10 and 1000, advantageously between 10 and 900, advantageously between 10 and 800 advantageously included Between 10 and 700.
  • “n” is between 10 and 700, advantageously between 50 and 700, more advantageously between 70 and 650.
  • T-saccharide unit means a saccharide unit linked to unit A or unit B by an O-glycoside type bond at position 1 (C 1) of the saccharide unit.
  • T-galactose means a galactose linked to unit A or B by an O-glycosidic type bond.
  • (Ci-Ce) alkoxyl or (C 1 -C 6) alkoxy or (C 1 -C 6) alkyloxy group means the groups -OR-, R being a C 1 -C 6 alkyl group, that is to say a straight or branched chain comprising from 1 to 6 carbon atoms.
  • alkyls mention may be made of methyl, ethyl, propyl, butyl, isobutyl, tert-butyl, pentyl, isopentyl, tert-pentyl, hexyl and isohexyl groups.
  • Examples of (C1-C6) alkoxyls include methoxy (OCH3), ethoxy, propoxy, isopropoxy, butoxy, isobutoxy, tert-butoxy, pentoxy, isopentoxy, tert-pentoxy, hexoxy, isohexoxy.
  • (C 1 -C 6) alkylcarbonyl group means -COR groups, R being a C 1 -C 6 alkyl group as defined above. Mention may be made, by way of example, of methylcarbonyl, ethylcarbonyl, n-propylcarbonyl, iso-propylcarbonyl, n-butylcarbonyl, isobutylcarbonyl, sec-butylcarbonyl, tert-butylcarbonyl, n-pentylcarbonyl, isopentylcarbonyl, neopentylcarbonyl, tert-pentylcarbonyl n-hexylcarbonyl, isohexylcarbonyl.
  • (C 1 -C 6) alkyloxycarbonyl group means COOR groups, R being a C 1 -C 6 alkyl group as defined above.
  • R being a C 1 -C 6 alkyl group as defined above.
  • methoxycarbonyl (-COOCH 3) ethoxycarbonyl
  • propoxycarbonyl isopropoxycarbonyl
  • butoxycarbonyl isobutoxycarbonyl
  • tert-butoxycarbonyl tert-butoxycarbonyl
  • pentoxycarbonyl isopentoxycarbonyl, tert-pentoxycarbonyl, hexoxycarbonyl and isohexoxycarbonyl groups.
  • (C 1 -C 6) acyloxy group means the groups - OCOR where R is a C 1 -C 6 alkyl group as defined above.
  • R is a C 1 -C 6 alkyl group as defined above.
  • group derived from a diacid means a group corresponding to the formula -COO- (CH 2) -COOH, where p is between 0 and 4.
  • diacid from which these groups are derived means a group of the (- SO 3 H) type.
  • phosphate group means a group
  • the term "sulphate group” means a group of the type (- SO 3 H) or of the type - SO 3 - .
  • the XA2 groups XA 4 XA6, XB2, XB3 and XB6 are selected independently of each other and independently for each unit A and / or B from the group comprising:
  • a pyruvate group said pyruvate group being linked to the group XA 4 by its carbon in position 2 and to the group XA6 by its carbon in position 2,
  • XA2, XB2 and XB3 are chosen from a hydrogen atom and a sulfate group
  • XA4 is chosen from a hydrogen atom, a sulfate group and a pyruvate group, said pyruvate group being bonded to the XA group 4 by its carbon in the 2-position and to the XA6 group by its carbon in the 2-position ;
  • XA6 is chosen from a hydrogen atom, a sulfate group, a T-galactose saccharide unit linked to unit A by an O-glycosidic type bond, a T-xylose saccharide unit linked to unit A by a O-glycosidic type binding, a unit-linked T-arabinose saccharide unit with an O-glycosidic type bond and a unit-linked glucuronic T-glucuronic unit with an O-glycosidic type bond, and
  • XB6 is chosen from a hydrogen atom, a sulfate group, a T-galactose saccharide unit linked by an O-glycosidic type bond to residue B1, a T-xylose saccharide unit linked by an O-glycosidic type bond to residue B1, a saccharide unit T-arabinose linked by an O-glycosidic bond to residue B1, and a saccharide unit T-glucuronic acid linked by an O-glycosidic bond to residue B1.
  • salt means any addition salt with a mineral or organic acid by the action of such an acid in an organic or aqueous solvent such as an alcohol, a ketone, an ether, and which does not cause no allergic reactions when in contact with the skin or any other part of the human body or animal.
  • salts By way of example of such salts, mention may be made of the following salts: benzenesulphonate, hydrobromide, hydrochloride, citrate, ethanesulphonate, fumarate, gluconate, iodate, isethionate, maleate, methanesulphonate, methylene-bis-b- oxynaphthoate, nitrate, oxalate, palmoate, phosphate, salicylate, sulfate, tartrate, theophyllinacetate and p-toluenesulfonate.
  • the salt is a cosmetically acceptable salt or a dermatologically acceptable salt.
  • the sulfated polysaccharide can inhibit the release of VEGF by the cells involved in the inflammatory process.
  • the sulfated polysaccharide may be a VEGF antagonist.
  • VEGF antagonist is meant a substance capable of reducing or completely inhibiting the release of VEGF.
  • the sulphated polysaccharide according to the invention is capable of reducing the release of VEGF by at least 15%, advantageously 20%, advantageously at least 25%, advantageously at least 30%, advantageously at least 35%.
  • the sulfated polysaccharide according to the invention is capable of reducing by 25% to 35% the release of VEGF, advantageously from 29% to 33% the release of VEGF.
  • the sulphated polysaccharide is capable of inhibiting or antagonizing the effects of VEGF, in order to prevent and / or treat inflammatory diseases, in particular at the level of the skin, while reducing the risks of side effects.
  • the sulfated polysaccharide according to the invention or a salt thereof can be used in the prevention and / or treatment of inflammatory diseases in humans or animals.
  • the sulfated polysaccharide according to the invention is capable of inhibiting VEGF-induced pseudotubes formation in a co-culture of human dermal endothelial cells (HMVEC) and normal human fibroblasts (NHDF). to inhibit the expression of genes involved in angiogenesis in normal human epidermal keratinocytes (NHEK), and in particular JAG1, VEGFA and CYR61.
  • the sulfated polysaccharide is also capable of inhibiting cell proliferation, in NHEK cells by stimulating the expression of the CDKN1 C gene encoding an inhibitor of cell proliferation, as well as the expression of the CEBPA gene which encodes a protein.
  • CEBPA involved in the regulation of the cell cycle.
  • the sulfated polysaccharide induces in the same NHEK cells an inhibition of the expression of the genes encoding the growth factors (HBEGF and VEGFA) or the genes involved in the regulation of cell proliferation (DUSP6, DUSP5, DUSP4, CDKN3 ).
  • these sulphated polysaccharides are obtained from algae, thus reducing the production costs and the risks of contamination.
  • the sulphated polysaccharide has a molecular mass less than or equal to 500 kDa.
  • the sulphated polysaccharide according to the invention has a molecular mass less than or equal to 450 kDa, advantageously less than or equal to 400 kDa, advantageously less than or equal to 350 kDa, advantageously less than or equal to 300 kDa, advantageously less than or equal to at 250 kDa, advantageously less than or equal to 200 kDa.
  • the sulfated polysaccharide according to the invention has a molecular mass of between 10 kDa and 500 kDa, advantageously between 10 kDa and 400 kDa, advantageously between 10 kDa and 300 kDa, advantageously between 10 kDa and 250 kDa.
  • the sulphated polysaccharide has a sulphate level of less than or equal to 20%.
  • the sulfates content of the sulphated polysaccharide is less than or equal to 19%, advantageously less than or equal to 18%, advantageously less than or equal to 17%, advantageously less than or equal to 16%.
  • the sulphate content of the sulphated polysaccharide is between 8% and 20%, advantageously between 9% and 18%, advantageously between 10% and 16%, advantageously between 13% and 16%.
  • the sulfated polysaccharide has a residue level of 3,6-anhydrogalactopyranose less than or equal to 5%.
  • the sulphated polysaccharide has a residue level of 3,6-anhydrogalactopyranose less than or equal to 4%, advantageously less than or equal to 3%, advantageously less than or equal to 2%, advantageously less than or equal to 1, 5%. Even more advantageously, the sulfated polysaccharide has a residue level of 3,6-anhydrogalactopyranose less than or equal to 1, 4%.
  • the present invention also relates to compositions, in particular cosmetic and / or dermatological compositions, making it possible to reduce vascular abnormalities by combining active agents capable of inhibiting VEGF-induced pseudotubes formation and reducing the destruction of fibers. of the matrix.
  • the composition may be a cosmetic composition or a dermatological composition.
  • Cosmetic composition means any substance or preparation intended to be applied to the skin, with a view to cleaning it, protecting it, maintaining it in good condition, modifying its appearance, perfuming it or to correct the odor.
  • skin composition any substance or preparation intended to be applied to the skin, mucous membranes and integuments (nails, hair, hair) in order to prevent the appearance of skin disorders and / or to treat them.
  • the sulphated polysaccharide is used in an amount ranging from 0.000001% to 10% by weight relative to the total mass of the composition, advantageously in an amount ranging from 0.0001% to 5% in mass relative to the total mass of the composition. Even more advantageously, the sulfated polysaccharide is used in an amount ranging from 1% to 5% by weight relative to the total mass of the composition.
  • the composition of the invention may also contain at least one pharmaceutically, dermatologically or cosmetically acceptable excipient usual in the relevant fields, such as hydrophilic or lipophilic gelling agents, hydrophilic or lipophilic compounds, oils, emulsifiers, preservatives, antioxidants, solvents, fragrances, fillers, filters, odor absorbers and dyes.
  • excipients usual in the relevant fields, such as hydrophilic or lipophilic gelling agents, hydrophilic or lipophilic compounds, oils, emulsifiers, preservatives, antioxidants, solvents, fragrances, fillers, filters, odor absorbers and dyes.
  • the amounts of these various excipients are those conventionally used in the fields under consideration, and for example from 0.01% to 10% of the total mass of the composition.
  • These excipients depending on their nature, can be introduced into the fatty phase, into the aqueous phase and / or into the lipid spherules.
  • oils that may be used in the invention, mention may be made of mineral oils (liquid petroleum jelly), vegetable oils (liquid fraction of shea butter, sunflower oil), animal oils (perhydrosqualene), synthetic oils (vegetable oil). Purcellin), silicone oils (cyclomethicone) and fluorinated oils (perfluoropolyethers). To these oils can be added fatty alcohols and fatty acids (stearic acid). As emulsifiers that may be used in the invention, mention may be made, for example, of glycerol stearate, polysorbate 60 and the mixture of PEG-6 / PEG-32 / glycol stearate.
  • solvents that can be used in the invention, mention may be made of lower alcohols, in particular ethanol and isopropanol.
  • hydrophilic gelling agents mention may be made of carboxyvinyl polymers (carbomer), acrylic copolymers such as acrylate / alkylacrylate copolymers, polyacrylamides, polysaccharides such as hydroxypropylcellulose, natural gums and clays, and, as lipophilic gelling agents there may be mentioned modified clays such as bentones, metal salts of fatty acids such as aluminum stearates, hydrophobic silica, polyethylenes and ethylcellulose.
  • hydrophilic compounds it is possible to use proteins or protein hydrolysates, amino acids, polyols, urea, allantoin, sugars and sugar derivatives, vitamins, starch, plant extracts, in particular Aloe Vera, and hydroxy acids.
  • tocopherol vitamin E
  • retinol vitamin A
  • essential fatty acids ceramides
  • essential oils essential oils
  • the sulphated polysaccharides can also be combined with active agents, in particular anti-redness agents, decongestants, antibacterials, antiseptics and antimicrobials, anti-inflammatories, anti-irritants and soothing agents, healing agents and / or or restructuring of the skin barrier, antioxidants, moisturizing / emollient agents, anti-aging agents, mineral or organic sunscreens and filters, and solar protective active agents.
  • active agents in particular anti-redness agents, decongestants, antibacterials, antiseptics and antimicrobials, anti-inflammatories, anti-irritants and soothing agents, healing agents and / or or restructuring of the skin barrier, antioxidants, moisturizing / emollient agents, anti-aging agents, mineral or organic sunscreens and filters, and solar protective active agents.
  • anti-redness agents such as lupine peptides, permethol, genistein, esculoside, dextran sulfate, hesperidin methylchalcone, retinoids, licochalcone, oxymethazoline, kinetin, licorice, vitamin P like, holly extract, Sophora japonica, Hamamelis extract, ruscus, antibiotics such as doxycycline, polyphenols including tannins, phenolic acids, anthocyanins, procyanidols flavonoids with, for example, quercetin, extracts of green tea, red fruits, cocoa, grapes, Passiflora incarnata, Citrus;
  • antiseptics such as salicylic acid and its derivatives (n-octanoyl-5-salicylic acid), or crotamiton;
  • antibacterials such as clindamycin phosphate, erythromycin or antibiotics of the tetracycline class
  • antiparasitics particularly metronidazole or pyrethroids
  • antifungals in particular compounds belonging to the class of imidazoles such as econazole, ketoconazole or miconazole or their salts, polyene compounds, such as amphotericin B, compounds of the allylamine family, such as terbinafine, or octopirox;
  • steroidal anti-inflammatory agents such as corticosteroids, hydrocortisone, betamethasone valerate, or clobetasol propionate, or salt-antiseizable agents, acetylsalicylic acid, acetaminophen, or glycyrrhetinic acid, or nonsteroidal anti-inflammatory agents (NSAIDs);
  • anesthetic agents such as lidocaine hydrochloride and its derivatives
  • antipruritic agents such as thenaldine, trimeprazine or cyproheptadine
  • anti-free radical agents such as alpha-tocopherol or its esters, superoxide dismutases, certain metal chelators or ascorbic acid and its esters;
  • keratolytic agents such as cis-retinoic acid or trans-garlic, benzoyl peroxide or hydroxy acids;
  • antiviral agents such as acyclovir and valacyclovir
  • anti-irritant and soothing agents such as glycyrrhetinic acid (licorice derivatives) with its salts and esters, lipoic acid, beta- carotene, vitamin
  • B3 niacinamide, nicotinamide
  • vitamin E vitamin C
  • vitamin B12 lycopene or lutein
  • spring or thermal waters Avène water, Roche Posay water, Saint Gervais water, water of Uriage, Gamarde water
  • isoflavones especially of soybean, for example genistein / genistin, daidzein / daidzine;
  • PPARs Peroxisome proliferator activated receptor agonists
  • RXRs retinoid X receptor agonists
  • LXRs oxysterol receptor agonists
  • antioxidants such as thiols and phenols, licorice derivatives such as glycyrrhetinic acid with its salts and esters, alpha bisabolol, lipoic acid, vitamin B12, vitamin B3 (niacinamide, nicotinamide), vitamins C, vitamins E, coenzyme Q 10, krill, glutathione, BHT for butylhydroxytoluene, BHA for butylhydroxyanisol, lycopene or lutein, beta-carotene.
  • antioxidants there are also anti-glycation substances such as carnosine or certain peptides, n-acetyl-cysteine, as well as antioxidant or antiradical enzymes such as SOD (super oxide dismutase), catalase, glutathione peroxidase, thioredoxin reductase and their agonists;
  • SOD super oxide dismutase
  • catalase glutathione peroxidase
  • thioredoxin reductase and their agonists
  • moisturizing / emollient agents such as glycerin or its derivatives, urea, pyrrolidone carboxylic acid and its derivatives, hyaluronic acid of any mass molecular, glycosaminoglycans and other polysaccharides of marine, plant or biotechnological origin, such as xanthan gum, fucogel®, fatty acids such as lauric acid, myristic acid, poly- and monounsaturated fatty acids omega 3, 6 and 7, 9 like linoleic acid and palmitoleic acid, some butter like shea butter;
  • moisturizing / emollient agents such as glycerin or its derivatives, urea, pyrrolidone carboxylic acid and its derivatives, hyaluronic acid of any mass molecular, glycosaminoglycans and other polysaccharides of marine, plant or biotechnological origin, such as xanthan gum, fucogel®, fatty acids such as
  • anti-aging agents such as vitamins C, hyaluronic acid of any molecular weight, retinoids such as retinol, retinal and retinoids; especially non-aromatic retinoids such as retinaldehyde, tretinoin, isotretinoin and 9-cis retinoic acid, vitamin A, monoaromatic retinoids such as etretinate, all-trans acitretin and motrerinide, and retinoids polyaromatic agents such as adapalene, tazarotene, tamibarotene and arotinoid methyl sulfone; solar protective active agents, in particular filters or sunscreens UVB and / or UVA; such screens or mineral and / or organic filters known to those skilled in the art that will adapt their choice and their concentrations depending on the degree of protection sought.
  • retinoids such as retinol, retinal and retinoids
  • non-aromatic retinoids such as retina
  • sun-protecting active agents examples include titanium dioxide, zinc oxide, methylene bis-benzotriazolyl tetramethylbutylphenol (trade name TINOSORB M ® ) and Bisethylhexyloxyphenol methoxyphenyl triazine (trade name: Tinosorb S ®), octocrylene, butyl methoxydibenzoylmethane, terephthalylidenedicamphorsulfonic dicamphor sulfonic acid, 4-methylbenzylidene camphor, benzophenone, ethylhexyl methoxycinnamate, ethylhexyl dimethyl PABA, diethylhexyl butamido triazone.
  • TINOSORB M ® methylene bis-benzotriazolyl tetramethylbutylphenol
  • Tinosorb S ® Bisethylhexyloxyphenol methoxyphenyl triazine
  • compositions according to the invention may be in any form known to those skilled in the art and adapted to the route of administration, in particular by injection, orally, topically, or in the form of supplements and / or products. food.
  • the compositions according to the invention may be administrable orally, topically, injectable or in the form of supplements and / or food products.
  • the composition may be in the form of aqueous, hydroalcoholic or oily solutions, or lotion or serum-type dispersions, emulsions of liquid or semi-liquid consistency of the milk type, obtained by dispersion of a fatty phase in an aqueous phase (oil in water) or conversely (water in oil), or suspensions or emulsions of soft, semi-solid or solid consistency of the cream or gel type, microemulsions, or microcapsules, microparticles, or vesicular dispersions of ionic and / or nonionic type.
  • They can also be packaged in the form of aerosol or spray compositions also containing a propellant under pressure.
  • These compositions are prepared according to the usual methods.
  • the injectable compositions may be in the form of an aqueous lotion, oily or in the form of serum.
  • the sulphated polysaccharide and the other active ingredients of the invention can be incorporated into all forms of food supplements or enriched foods, for example, food bars, compacted or unmodified powders, beverages, dairy products and the like. especially yogurts and yogurts to drink.
  • the powders can be diluted in water, sodas, fruit juices, dairy or soy-based products, rice, or incorporated into food bars.
  • compositions according to the invention are those conventionally used in the fields under consideration. These compositions comprise creams for protection, treatment or care for the face, for the hands, for the feet, for large anatomical folds or for the body, body care or protection milks, lotions, gels or foams for the care of the skin and mucous membranes, such as cleaning or disinfecting lotions, bath compositions, compositions containing a bactericidal agent.
  • compositions may also consist of solid preparations constituting soaps or cleaning bars.
  • the proportion of the fatty phase can range from 5% to 80% by weight, and advantageously from 5% to 50% by weight relative to the total mass of the composition.
  • the oils, emulsifiers and co-emulsifiers used in the composition in emulsion form are chosen from those conventionally used in the dermatological field.
  • the emulsifier and the co-emulsifier are present in the composition in a proportion ranging from 0.3% to 30% in mass, and preferably from 0.5 to 20% by weight relative to the total mass of the composition.
  • the emulsion may further contain lipid vesicles.
  • the amount of oil may be up to more than 90% by weight relative to the total mass of the composition.
  • Another aspect of the invention relates to a dermatological composition
  • a dermatological composition comprising at least one sulphated polysaccharide extracted from a red algae of the species Haliptilon subulatum, or a dermatolologically acceptable salt thereof, as described above, for its use in the prevention, reduction and treatment of inflammatory diseases, especially in the skin.
  • treat or “treatment” or “curative treatment” is defined as treatment leading to a cure or treatment that alleviates, improves and / or eliminates, reduces and / or stabilizes the symptoms of an illness or suffering that she provokes.
  • “Inflammatory disease of the skin” or “dermatitis” means any disease causing inflammation of the skin, characterized by the presence on the skin of redness, swelling, heat and a pain. These diseases can be due to an infection, for example by a microbe, a parasite, a virus or a mushroom, to inflammation of the joints, to allergies, to mechanical or chemical aggressions such as ultraviolet radiation or radiation. X-ray type.
  • psoriasis as an inflammatory disease in the skin, psoriasis, atopic dermatitis, rosacea, rosacea, acne, common warts, bullous skin diseases, contact dermatitis, skin cancers, redness, erythema, telangiectasia, skin inflammation associated with UV exposure, such as photo-irritation, photo-sensitization, photo-aging, photo-carcinogenesis, lymphatic insufficiency or heavy leg syndrome, this list is not exhaustive.
  • Another aspect of the invention relates to a method for preventing and / or treating inflammatory diseases in the skin of a patient comprising administering to said patient a dermatological composition comprising at least one sulfated polysaccharide extracted from a red algae of the species Haliptilon subulatum or a cosmetically acceptable salt thereof, as described above.
  • Another aspect of the invention relates to a method for preventing and / or treating inflammatory diseases, especially at the level of the skin, comprising administering to a patient in need of a dermatological composition comprising at least one sulfated polysaccharide extracted from a red alga of the genus Haliptilon subulatum species or a dermatologically acceptable salt thereof, as described above.
  • Another aspect of the invention relates to a cosmetic composition
  • a cosmetic composition comprising at least one sulphated polysaccharide extracted from a red alga of the species Haliptilon subulatum, or a cosmetically acceptable salt thereof, as described above, for its use in the prevention, reduction and treatment of the appearance of redness on the skin.
  • the sulphated polysaccharide Because of its anti-angiogenic properties, the sulphated polysaccharide also makes it possible to reduce the reactivity of certain types of skin likely to develop redness, and thus prevent and treat the appearance of these rednesses.
  • the sulphated polysaccharide is extracted from a red algae of the species Haliptilon subulatum, one of the advantages of the invention is therefore to propose to persons prone to skin redness and thus having a sensitive skin, a composition essentially comprising derma products. natural origin.
  • redness of the skin is meant erythema, including facial erythema and telangiectasia, of all origins.
  • preventing redness of the skin or “prevention of redness of the skin” or “prophylaxis of redness of the skin” or “preventive treatment of redness of the skin” or “prophylactic treatment of redness of the skin” means both a treatment leading to the prevention of unsightly redness on the skin that a treatment reducing and / or delaying the incidence of redness of the skin or the risk that they occur.
  • the term “prevent redness of the skin” or “prevention of redness of the skin” or “prophylaxis of redness of the skin” or “preventive treatment of redness of the skin” or “prophylactic treatment of redness of the skin” is also meant. Any action to avoid or at least reduce the formation of unsightly redness, by application of the composition, before and during an event known to cause the appearance of redness, such as sun exposure or stress.
  • person likely to develop redness or redness means a person with redness, regardless of their location on the body and in particular on the face and regardless of the stage at which the redness may be classified a clinical point of view. These rashes can be considered unsightly and / or disabling for this person.
  • Another aspect of the invention relates to a method for preventing and / or treating the appearance of redness on the skin, comprising administering to a patient by requiring a dermatological composition comprising at least one sulphated polysaccharide extracted from the skin. a red algae of the species Haliptilon subulatum or a dermatologically acceptable salt thereof, as described above.
  • Another aspect of the invention relates to a cosmetic care method comprising the application on the skin of the cosmetic composition as described above for the prevention and / or treatment of the appearance of redness on the skin.
  • application is meant any act enabling the patient to absorb the composition according to the invention by any route, form or mode of administration.
  • Another aspect of the present invention relates to a process for obtaining the sulfated polysaccharide.
  • the sulfated polysaccharide according to the invention can be obtained by methods that are well known to those skilled in the art.
  • the extraction of a sulphated polysaccharide of high molecular weight can in particular be carried out by a process comprising the steps described below: a) Dispersion in water of a powder of red algae, in particular a powder Haliptilon subulatum previously dried;
  • the alcoholic precipitation step b) is carried out using ethanol or isopropanol.
  • the step of drying the precipitate (step c) can be carried out by lyophilization or with the aid of an oven, in particular at a temperature of between 40 ° C. and 75 ° C., advantageously 50 ° C. C overnight.
  • the method of obtaining according to the invention may be repeated several times in order to obtain a degree of purity of the satisfactory polysaccharide.
  • the extraction process according to the present invention makes it possible to obtain polysaccharides in the form of a fine creamy white powder with a production yield of the order of 10-20% relative to the dry weight of Haliptilum seaweed powder. subulatum used.
  • the low molecular weight sulfated polysaccharides are prepared by acid degradation of high molecular weight polysaccharides. Sulfated polysaccharides of low molecular weight can also be obtained by depolymerization techniques well known to those skilled in the art, such as radical or enzymatic depolymerizations.
  • the process for extracting a low molecular weight sulphated polysaccharide from Haliptilon subulatum alga comprises the following steps:
  • the aqueous solution used in the dispersion step (step a)) is a solution of hydrochloric acid (HCI).
  • HCI hydrochloric acid
  • the HCl solution has a concentration of between 1M and 5M, advantageously 2M, at a temperature ranging from 50 ° C. to 100 ° C. and with stirring for 30 to 60 minutes.
  • the alcoholic precipitation step b) is carried out using ethanol or isopropanol.
  • the step of drying the precipitate (step c)) is carried out by lyophilization or with the aid of an oven, in particular at a temperature of between 40 ° C. and 75 ° C., advantageously 50 ° C. C overnight.
  • the sulphated polysaccharides extracted from red algae according to the invention have the advantage of not having the problems of contamination and safety.
  • these sulfated polysaccharides offer an economic advantage.
  • the approximate yield of sulfated polysaccharides of the present invention is about 10% to 20% based on the initial dry weight of algae from which it was extracted.
  • red algae, especially of the class Floridaophyceae, especially the species Haliptilon subulatum are easy to grow which also contributes to the low cost of the final product
  • Figure 1 Effects of the sulfated polysaccharide on the formation of pseudotubes under basal conditions or stimulated with VEGF at 10 ng / ml according to Example 6.
  • Figure 2 Effects of the sulfated polysaccharide on the viability of normal human keratinocytes, according to Example 8.
  • FIG. 3 Effects of sulfated polysaccharide on the release of VEGF by normal human keratinocytes, relative to the total amount of proteins, according to example 9.
  • FIG. 4 Effects of the sulphated polysaccharide on the release of IL8 by human keratinocytes normal, relative to the total amount of protein, according to Example 9.
  • PSHM High Molecular Weight Polysaccharides
  • Extraction of the high molecular weight polysaccharides is carried out by dispersing 100 grams of Haliptilon subulatum seaweed powder in 1 liter of water at 90 ° C. with vigorous stirring (500 rpm) for 4 hours. The mixture is then filtered hot on diatom (100 g) on a sintered glass (porosity 1, more precisely 100 to 160 ⁇ ). The filtrate is then centrifuged (10000 g, 30 minutes) at room temperature to obtain the polysaccharide-enriched algal extract. The Haliptilon subulatum extract is then precipitated in 3 volumes of 96 ° ethanol (at 4 ° C.) with stirring (500 rpm) for 2 hours.
  • the precipitate is recovered by filtration on sintered glass (porosity 1 or 2, more precisely 100 to 160 ⁇ or 40 to 100 ⁇ respectively) or centrifugation (10,000 g, 30 minutes) at room temperature and then washed with acetone (50 to 100 ⁇ ). 100 mL). Then, the precipitate is recovered by filtration on sintered glass (porosity 2, more precisely 40 to 100 ⁇ ) or centrifugation (10,000 g, 30 minutes) at room temperature and then dried in an oven at 50 ° C overnight. Finally, the precipitate is ground (Blender) to obtain a fine powder of high molecular weight polysaccharides extracted from Haliptilon subulatum.
  • the yield of polysaccharides of high molecular mass thus obtained is of the order of 10 to 20% relative to the dry weight of Haliptilon subulatum seaweed powder used.
  • low molecular weight polysaccharide or “PSFM” is meant a polysaccharide having a molecular mass of between 5 and 100 KDa.
  • the production of low molecular weight polysaccharides is carried out by dispersing 2.5 grams of high molecular weight polysaccharide powder (Haliptilon subulatum extracts) in 125 ml of HCl (2M) at 100 ° C. with vigorous stirring (500 rpm). / min) for 1 hour. The mixture is then cooled to ambient temperature and then neutralized with sodium hydroxide (5M).
  • the medium is precipitated in 7 volumes of ethanol 96 ° (at 4 ° C.) with stirring (500 rpm) for 2 hours.
  • the precipitate is recovered by filtration on sintered glass (porosity 1 or 2, more precisely 100 to 160 ⁇ or 40 to 100 ⁇ respectively) or centrifugation (10,000 g, 30 minutes) at room temperature and then washed with acetone (50 mL ).
  • the precipitate is recovered by filtration on sintered glass (porosity 2, more precisely 40 to 100 ⁇ ) or centrifugation (10,000 g, 30 minutes) at room temperature and then dried in an oven at 50 ° C overnight.
  • the precipitate is ground (Blender) to obtain a fine powder of low molecular weight polysaccharides extracted from Haliptilon subulatum.
  • the yield of polysaccharides of low molecular weight thus obtained is of the order of 70% relative to the dry mass of polysaccharide powder of high molecular weight and 14% relative to the dry weight of seaweed powder Haliptilum subulatum used.
  • Example 3 Determination of the molecular weights of polysaccharides high (PSHM) and low (PSFM) molecular weight.
  • High and low molecular weight polysaccharides are prepared according to previously described conditions (Examples 1 and 2).
  • the molecular weights of the sulphated polysaccharides are determined according to the following protocol: a) Solubilization of the polysaccharide powder at a level of from 0.5 to 10 g / L in an aqueous solution of ultrapure quality at a temperature ranging from 4 ° C. to 60 ° C and stirring for 30 minutes to 48 hours;
  • the molecular weight of polysaccharides of high molecular mass is of the order of 214 kDa and that the molecular weight of low molecular weight polysaccharides is of the order of 37 kDa.
  • Example 4 Determination of the Level of Sulfates and Residues 3,6-Anhydrogalactopyranoses of the Polysaccharides of the Invention 1 Determination of the sulphate content Determination by turbidimetry (BaC / gelatin)
  • the sulphate ions released during the hydrolysis of the polysaccharides will form, in the presence of barium chloride (BaC, 2H2O) and gelatin, a precipitate of barium sulfate, the appearance of which is measured at 550 nm, described in the publication of Dodgson & Price (Dodgson & Price, 1962, Biochemical Journal 84: 106-1-10).
  • barium chloride BaC, 2H2O
  • gelatin a precipitate of barium sulfate, the appearance of which is measured at 550 nm, described in the publication of Dodgson & Price (Dodgson & Price, 1962, Biochemical Journal 84: 106-1-10).
  • 150 mg of gelatin are dissolved in 50 ml of milli-Q water at 70 ° C. After cooling for 16 hours at 4 ° C., 0.5 g of BaC is added to the gelatin solution.
  • 120 mg of freeze-dried polysaccharide are hydrolysed with 3 ml of 2 M HCl for 2 h at 100 ° C. The mixture is centrifuged at 13,000 g for 30 minutes. 1 ml of supernatant is mixed with 9 ml of milli-Q water, 1 ml of 0.5 M HCl and 0.5 ml of BaC reagent / gelatin. After 30 min at room temperature, the mixture is stirred and the absorbance read immediately at 550 nm. The standard range is performed using a stock solution of K2SO4 at 3 mg / mL.
  • the amount of sulfates was determined by the use of the colorimetric assay method developed by Jaques et al. (Jaques LB et al., 1968, Canadian Journal of Physiology and Pharmacology 46, pp. 351-360).
  • Jaques et al. Jaques LB et al., 1968, Canadian Journal of Physiology and Pharmacology 46, pp. 351-360.
  • 3-amino-7- (dimethylamino) phenothiazin-5-ium chloride (Azure A) complexes the sulfates which can be present, in particular within the polysaccharides composing the SPE fractions.
  • the assay is semi-quantitative and gives an order of magnitude ( ⁇ mg) of the sulfate concentration of a sample.
  • ⁇ mg the sulfate concentration of a sample.
  • the quantification of sulphates is determined from the calibration range of dextran sulphate (17% sulphated) and correction of the degree of sulphation of the latter (17 mg of sulphates per 100 mg of dextran sulphate).
  • the sulfates content of polysaccharides of high molecular mass is of the order of 13.5% and that the sulfates content of low molecular weight polysaccharides is of the order of 15.7%.
  • the assay 50 to 100 ⁇ l of the polysaccharide solution to be assayed) are introduced into glass tubes. The volume is completed to 200 ⁇ using milli-Q water.
  • the resorcinol reagent is prepared extemporaneously by adding to 100 mL of 10 M HCl, 9 mL of the resorcinol solution and 1 mL of the 1/25 diluted acetaldehyde solution. This reagent is stable only 3 hours away from light. 200 ml of the resorcinol reagent are added to 200 ⁇ l of the polysaccharide solution to be determined. After stirring, the tubes are allowed to stand for 4 minutes and then placed in a water bath at 80 ° C. for 10 minutes. They are then transferred to an ice bath for 1 minute 30 minutes. The absorbance should be read within 15 minutes at 555 nm.
  • D-fructose (10 to 70 g / mL solutions) is used as a standard. Indeed, it has been shown that the absorbance curves at 555 nm as a function of the monosaccharide concentration of D-fructose and of 3,6-anhydrogalactose are identical (see Yaphe & Arsenaut, 1965, Analytical Biochemistry 13, pages 143-148).
  • the samples are evaporated under nitrogen jet, and the trimethylsilyl-O-glycoside residues are taken up in 500 ⁇ l of dichloromethane. At this stage, it is possible to dilute more or less the sample.
  • the standards (L-Rha, L-Fuc, L-Ara, D-Xyl, D-Man, D-Gal, D-GIc, D-GIcA, D-GalA) are prepared under the same conditions, at least three times. different concentrations.
  • the trimethylsilyl derivatives are analyzed by gas phase chromatography coupled to mass spectrometry, on an OPTIMA-1 MS column (30 m, 0.32 mm, 0.25 ⁇ ) with a helium flow rate of 2.3 mL / min.
  • the helium pressure is set at 8.8 psi or 60673.9 Pa and the injection ratio at 25: 1 (or 50: 1).
  • the temperature rise is 8 ° C / min up to 100 ° C for 3 min.
  • the ionization is carried out by Impact Electronique (El, 70 eV), the temperature of the trap is fixed at 150 ° C and the targeted ions between 40 and 800 m / z.
  • HMVEC + NHDF The effects of high molecular weight sulfated polysaccharide (PSHM) on the formation of pseudotubes were studied in a co-culture of human dermal endothelial cells (HMVEC) and normal human dermal fibroblasts (NHDF), under basal or stimulated by VEGF (in situ immunostaining analysis). Culture and treatment
  • the HMVEC and NHDF cells in co-culture were seeded in 96-well plates and cultured for 24 hours in culture medium.
  • the culture medium used is the following:
  • EBM-2 endothelial cell basal medium 2 supplemented with fetal calf serum (FCS) 5%, rhEGF, rhFGF, R3 IGF-1, hydrocortisone, vitamin C, gentamycin,
  • DMEM fetal calf serum
  • 50U / ml penicillin 50g / ml stretomycin
  • 10% FCS 10% FCS.
  • test medium containing or not (control) the test compound and / or the VEGF inducing reference tested at 100 ng / ml; the compound was tested in parallel under basal conditions and stimulated (in the absence and presence of VEGF).
  • test medium used is as follows:
  • EBM-2 endothelial cell basal medium 2 supplemented with rhEGF, rhFGF, R3 IGF-1, hydrocortisone, vitamin C, gentamycin,
  • DMEM fetal calf serum
  • the culture medium was removed and the cells were rinsed, fixed and permeabilized.
  • the cells were then labeled with the primary anti-VWF antibody (Von Willebrand Factor). This antibody was revealed by a secondary antibody coupled to a fluorochrome (GAR-Alexa 488).
  • GAR-Alexa 488 a fluorochrome coupled to a fluorochrome coupled to a fluorochrome.
  • the nuclei of the cells were stained with Hoechst 33258 (bis-benzimide).
  • the formation of the pseudotubes was observed using a NIKON Diaphot 300 microscope (Objective x4). Digital images (1 shot per well) were recorded with a NIKON DS-RM camera and NIS-Elements 4.13.04 software. The labeling was quantified by measuring the total area of the pseudotubes using the Image J software. The results of the labeling are shown in FIG.
  • HMVEC endothelial cells
  • NHDF dermal fibroblasts
  • the percentage inhibition is calculated according to the following formula
  • the keratinocytes were seeded in 24-well plates and fibroblasts in 12-well plates, then cultured in culture medium for 48 hours.
  • the culture medium used is the following:
  • Keratinocyte-SFM supplemented with EGF (epidermal growth factor) 0.25 ng / ml, pituitary extract (EP) 25 ⁇ g / ml and gentamycin 25 ⁇ g / ml.
  • EGF epidermal growth factor
  • EP pituitary extract
  • the culture medium was then replaced with test medium and the cells were cultured for an additional 24 hours.
  • the test medium used is the following: Keratinocyte-SFM supplemented with gentamycin 25 ⁇ g / ml.
  • RNA of each sample was extracted using the NucleoSpin® RNA Plus kit (Macherey-Nagel) according to the protocol recommended by the supplier. Differential expression analysis
  • RNAs were evaluated by capillary electrophoresis (Bioanalyzer 2100, Agilent). Synthesis of biotinylated antisense RNAs (ARNs) was performed using the "GeneChip 3'IVT Express" kit (Affymetrix®). For each biotinylated ARNa sample an electrophoretic profile was made (Bioanalyzer 2100, Agilent) before and after fragmentation. Hybridization of the labeled and fragmented ARNa on the Affymetrix® U219 chip chip (36,000 transcripts and variants) was performed on the GeneAtlasTM fluidics Affymetrix® hybridization station for 20 hours at 45 ° C. The U219 chips were then scanned using the GeneAtlasTM Imaging station (Affymetrix® - resolution 2 Inn) to generate the signal strength data. Data processing
  • Signal strength data is standardized using the Expression Console software (Affymetrix), based on the RMA algorithm. A quality control of the marking as well as the hybridization is then carried out.
  • Expression Console software Affymetrix
  • the sulphated polysaccharide PSHM is capable of inhibiting the cell proliferation process and angiogenesis at a concentration of 0.1 mg / ml on keratinocytes, whereas it tends to stimulate the process of cell proliferation and angiogenesis at a concentration of 3 mg / ml on fibroblasts.
  • the human keratinocytes are seeded in a 96-well microplate at a density of 20,000 keratinocytes per well (equivalent to 60,000 cells / cm 2 , then allowed to adhere / proliferate for 24 hours at 37 ° C. with 5% of CO2 in complete KSFM medium ( supplemented with antibiotics and growth supplements, Gibco 17005).
  • Human keratinocytes are treated with the sulphated PSHM polysaccharide to be tested in an unsupplemented medium (without growth supplements) for 48 hours and incubated at 37 ° C. with 5% CO 2. Each concentration of the product is evaluated in triplicate. Two positive controls were used: one for cytotoxicity, 10% dimethylsulfoxide (DMSO-Sigma D4540) and one for proliferation, complete medium (i.e. with growth supplements).
  • DMSO-Sigma D4540 10% dimethylsulfoxide
  • a cell viability / cytotoxicity assay (XTT test) is performed to determine non-cytotoxic doses.
  • the XTT test is performed using the kit "Cell Proliferation Kit II (XTT)" (Sigma / Roche Diagnostics, 1 1465015001).
  • XTT sodium tetrazolium
  • the viability of the treated cells is expressed as a percentage relative to the control (untreated cells):
  • the sulphated polysaccharide PSHM is non-cytotoxic for keratinocytes after 48 hours of application, at concentrations of 0.3 and 1 ⁇ g mL (above the threshold of 80% viability), whereas it appears cytotoxic at the highest doses tested. that is 10 to 600 ⁇ g mL.
  • EXAMPLE 9 Effects of PSMM Sulphated Polysaccharide on the Release of VEGF and Interleukin (IL8) by Normal Human Keratinocytes
  • the human keratinocytes are seeded in 96-well microplates at a density of 20,000 cells / well, ie 60,000 cells / cm 2 . in complete KSFM medium, and allowed to adhere / proliferate at 37 ° C under 5% CO2, 24 hours before treatment.
  • the targets of interest IL8 and VEGF are assayed by kits provided respectively by Bio-Techne / R & Dsystems (D8000C) and Thermo / Fisher scientific (EH2VEGF).
  • the results of the assays are obtained by measuring the absorbance (OD) at the wavelength of 450 nm, with 550 or 570 nm as the reference wavelength.
  • the total proteins are assayed using the BCA method.
  • the BCA assay kit (Sigma BCA1) is composed of a solution of bicinchoninic acid (BCA) (Sigma B9643) and copper sulphate (CuS0 4 - Sigma C2284).
  • BCA bovine serum albumin
  • the cell pellets are kept dry at -20 ° C. while waiting for this assay. To lyse the cells and alkalinize the reaction medium, the cell pellets are equilibrated at room temperature and then placed in an alkaline medium for a minimum of 30 minutes.
  • the assay is carried out by adding a mixture of the bicinchoninic acid and CuSO 4 reactants.
  • the plate is incubated at 37 ° C and the reaction is stopped by placing the plate for a few minutes at 4 ° C.
  • the reading of the assay is then carried out at the wavelength of 570 nm.
  • the sulfated polysaccharide PSHM allows:

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Abstract

La présente demande concerne un polysaccharide sulfaté extrait d'une algue rouge de l'espèce Haliptilon subulatum, ou un sel de celui-ci en tant que principe actif. Plus particulièrement, la présente demande concerne un polysaccharide sulfaté extrait d'une algue rouge de l'espèce Haliptilon subulatum, ou un sel de celui-ci en tant que principe actif, pour son utilisation dans la modulation de la réponse immunitaire chez l'être humain ou l'animal, notamment dans la prévention et/ou le traitement des maladies inflammatoires, en particulier au niveau de la peau.

Description

Nouvel actif immunomodulateur et composition le comprenant
La présente invention concerne un polysaccharide sulfaté extrait d'une algue rouge pour son utilisation dans la modulation de la réponse immunitaire chez l'être humain ou l'animal. La peau est un épithélium multi-stratifié kératinisé entourant toute la surface externe de l'Homme. La peau joue notamment un rôle :
de barrière mécanique au développement bactérien, virale et parasitaire, grâce à une faible perméabilité et à la desquamation de la peau,
de barrière chimique présentant des protéines et des peptides antimicrobiens pouvant entraîner : une rupture mécanique des membranes bactériennes, une déstructuration enzymatique des membranes bactériennes et une séquestration de nutriment,
de barrière biologique présentant une flore commensale qui est un ensemble de bactéries se situant sur la peau et les muqueuses et jouant un rôle important de barrière.
La peau est en contact permanent avec de nombreux facteurs environnementaux (virus, parasites et bactéries, mais également exposition au soleil et notamment aux UV) susceptibles de l'endommager. En réponse à divers facteurs environnementaux, le système immunitaire élabore des mécanismes de défense naturelle (immunité innée appelée aussi naturelle ou non spécifique) et acquise (immunité adaptative ou spécifique).
Quand l'agent infectieux a franchi la barrière épidermique, les motifs moléculaires caractéristiques des micro-organismes vont interagir avec les récepteurs de type Toll présents sur la membrane des kératinocytes, des cellules dendritiques, des mastocytes et des macrophages. Ces cellules activées deviennent effectrices (phagocytose des bactéries par les cellules dentritiques et les macrophages) et libèrent des médiateurs vasodilatateurs permettant l'exsudation plasmatique et des cytokines inflammatoires comme le TNFa, IL1 a, IL8, ce qui amplifie à nouveau la réaction de vasodilatation et vasoperméabilisation.
Le VEGF (facteur de croissance endothélial vasculaire) est un facteur épidermique essentiel au processus de vasodilatation. Son expression est souvent augmentée dans les pathologies présentant des anomalies vasculaires, comme la couperose et les kératinocytes sont capables de sécréter du VEGF sous l'effet entre autre des cytokines inflammatoires. Le VEGF agit donc directement sur les cellules endothéliales de la paroi des vaisseaux sanguins, et entraîne donc une dilatation et une perméabilisation de cette paroi. De plus, il favorise la production d'enzymes appelés MMP (Matrix Metallo-Protéases) qui sont capables de dégrader les fibres de soutien du derme (collagène et élastine), cette dégradation participe alors au relâchement des parois des vaisseaux sanguins et leur fragilisation entraînant des rougeurs installées. Des crèmes comprenant des composés de type corticoïdes, dermocorticoïdes, anti- acnéiques, oestrogènes ou encore des anti-inflammatoires stéroidiens ou non stéroidiens, obtenus par synthèse chimique, sont couramment utilisées pour traiter les inflammations de la peau. Or, les composés chimiques contenus dans ces crèmes peuvent générés lors de leur administration au patient des effets secondaires, comme notamment des réactions allergiques.
Par conséquent, il apparaît nécessaire de disposer de nouvelles compositions d'origine naturelle, capables d'inhiber ou d'antagoniser les effets du VEGF, afin de prévenir et /ou traiter les maladies inflammatoires, notamment au niveau de la peau, tout en diminuant les risques d'effets secondaires.
De manière tout à fait surprenante, les inventeurs ont montré que les polysaccharides sulfatés extrait de l'algue rouge marine du genre Haliptilon subulatum présentent des propriétés immunomodulatrices intéressantes, en particulier sur l'inhibition de la libération de facteur de croissance de l'endothélium vasculaire (VEGF) par les cellules impliquées dans le processus inflammatoire et/ou comme antagoniste du VEGF.
Ainsi la présente invention a pour objet un polysaccharide sulfaté extrait d'une algue rouge de l'espèce Haliptilon subulatum ou un sel de celui-ci pour son utilisation dans la modulation de la réponse immunitaire chez l'être humain ou l'animal. Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention a pour objet un polysaccharide sulfaté extrait d'une algue rouge de l'espèce Haliptilon subulatum ou un sel de celui-ci pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement des maladies inflammatoires chez l'être humain ou l'animal.
Par « modulation de la réponse immunitaire », on entend la signification habituellement apportée à ces termes et bien connue de l'Homme du métier, en particulier toute propriété permettant de stimuler ou d'inhiber les réactions immunitaires du corps humain ou animal.
Les polysaccharides issus des algues rouges sont construits sur la base d'un enchaînement linéaires d'unités 3-/3-galactopyranoses et 4-a-galactopyranose alternant régulièrement. L'unité /3-galactopyranose appartient toujours à la série D, alors que l'unité a- galactopyranose est de configuration D chez les carraghénanes et de configuration L chez les agarocolloïdes. Par ailleurs, une partie des résidus 4-a-galactopyranoses peut exister sous la forme de 3,6-anhydrogalactose. La forme 3,6-anhydrogalactose est obtenue par une élimination de l'ester sulfate porté par le carbone 6 de l'unité σ-galactose liée en 4, sous l'action de galactose-6-sulfurylases lors de la biosynthèse ou par un traitement alcalin.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le polysaccharide sulfaté est extrait à partir d'une algue rouge, avantageusement à partir d'une algue marine rouge, avantageusement une algue marine rouge de la classe des Florideophyceae, encore plus avantageusement d'une algue marine rouge de l'espèce Haliptilon subulatum. Dans un mode de réalisation particulier, le polysaccharide sulfaté selon l'invention, dans lequel le taux de sulfate dudit polysaccharide est inférieur ou égal à 20% en masse du polysaccharide, répond à la formule (I) :
[(unité A)-(unité B)]n (I), dans laquelle :
- l'unité A est un 3-/3-D-galactopyranose, dans lequel les fonctions hydroxyles libres sont substituées par un ou plusieurs groupements choisis parmi XA2, XA4, XA6,
l'unité B est choisie dans le groupe constitué du résidu B1 et du résidu B2 :
- le résidu B1 étant un 4-a-D/L-galactopyranose, dans lequel les fonctions hydroxyles libres sont substituées par un ou plusieurs groupements choisis parmi, XB2, XB3 et XBe et,
- le résidu B2 étant un 4-a-3,6-anhydrogalactopyranose, dans lequel les fonctions hydroxyles libres du 4-a-3,6-anhydrogalactopyranose sont substituées par un groupement XB2 et,
- les résidus B1 et B2 étant distribués de manière aléatoire dans le polysaccharide et le résidu B2 représentant au plus 5% en masse du polysaccharide,
- l'unité A est reliée à l'unité B par une liaison O-glycosidique entre le carbone en position 1 de l'unité A et le carbone en position 4 de l'unité B et,
- l'unité B est reliée à l'unité A par une liaison O-glycosidique entre le carbone en position 1 de l'unité B et le carbone en position 3 de l'unité A,
- XA2, XA4, XA6, XB2, XB3 et XB6 sont choisis indépendamment les uns des autres et indépendamment pour chaque unité A et/ou B dans le groupe comprenant :
- un atome d'hydrogène; - un groupement sulfate,
- un groupement pyruvate (-COO-CO-CH3), ledit groupement pyruvate étant lié au groupement XA4 par son carbone en position 2 et au groupement XA6 par son carbone en position 2;
- une unité saccharidique liée à l'unité A ou B par une liaison de type O- glycosidique en position 1 (Ci ) de l'unité saccharidique, l'unité saccharidique étant choisie parmi un galactose (ou T-galactose), un xylose (ou T-xylose), un arabinose (ou T-arabinose) et un acide glucuronique (ou T- acide glucuronique); et
- un groupe (C1-C6) alcoxyle, un groupe (C1-C6) alkylcarbonyle, un groupe (C1-C6) alkoxycarbonyle, un groupe (C1-C6) acyloxy, un groupement issu d'un diacide, un groupement phosphate ;
- un groupement -ChbXa, dans lequel Xa représente un atome d'hydrogène, un groupe hydroxy, un groupe (C1-C6) alcoxyle, un groupe (C1-C6) acyloxy, un groupement sulfate ;
- n est un entier compris entre 10 et 3000.
Les formules (la) et (Ib) ci-dessous illustrent respectivement les motifs (unité A) - (résidu B1 ) et (unité A) - (résidu B2) :
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Au sens de la présente invention, on entend par « polysaccharide » aussi bien un polysaccharide de haute masse moléculaire ou un polysaccharide de faible masse moléculaire. Par «polysaccharide de haute masse moléculaire», on entend un polysaccharide ayant une masse moléculaire comprise entre 100 et 1 000 kDa. Par «polysaccharide de faible masse moléculaire», on entend un polysaccharide ayant une masse moléculaire comprise entre 5 et 100 kDa.
Au sens de la présente invention, « n » représente un nombre entier compris entre 10 et 3000, avantageusement compris entre 10 et 2000, avantageusement compris entre 10 et à 1000, avantageusement compris entre 10 et 900, avantageusement compris entre 10 et 800 avantageusement compris entre 10 et 700. De manière avantageuse, « n » est compris entre 10 et 700, avantageusement entre 50 et 700, de manière plus avantageuse entre 70 et 650.
Au sens de la présente invention, on entend par « T-unité saccharidique », une unité saccharidique liée à l'unité A ou l'unité B par une liaison de type O-glycosidique en position 1 (Ci) de l'unité saccharidique. Ainsi, on entend respectivement par « T-galactose », « T- xylose », « T-arabinose » et « T-acide glucuronique », un galactose lié à l'unité A ou B par une liaison de type O-glycosidique en position 1 (Ci) du galactose, un xylose lié à l'unité A ou B par une liaison de type O-glycosidique en position 1 (Ci) du xylose, un arabinose lié à l'unité A ou B par une liaison de type O-glycosidique en position 1 (Ci) de l'arabinose et un acide glucuronique lié à l'unité A ou B par une liaison de type O-glycosidique en position 1 (Ci) de l'acide glucuronique. Au sens de la présente invention, on entend par groupe (Ci-Ce) alcoxyle ou (Ci-Ce) aikoxyle ou (Ci-Ce) alkyloxy, les groupes -OR-, R étant un groupe alkyle en C1-C6, c'est-à-dire une chaîne droite ou ramifiée comprenant de 1 à 6 atomes de carbone. A titre d'exemples d'alkyles, on peut citer les groupes méthyle, éthyle, propyle, butyle, isobutyle, tert-butyle, pentyle, isopentyle, tert-pentyle, hexyle et isohexyle. On peut citer à titre d'exemples de (C1-C6) alcoxyles, les groupes méthoxy (OCH3), éthoxy, propoxy, isopropoxy, butoxy, isobutoxy, tert-butoxy, pentoxy, isopentoxy, tert-pentoxy, hexoxy, isohexoxy.
Au sens de la présente invention on entend par groupe (C1-C6) alkylcarbonyle, les groupes -COR, R étant un groupe alkyle en Ci-Ce tel que défini précédemment. On peut citer à titre d'exemples les groupes methylcarbonyle, ethylcarbonyle, n-propylcarbonyle, iso-propylcarbonyle, n-butylcarbonyle, iso-butylcarbonyle, sec-butylcarbonyle, tert- butylcarbonyle, n-pentylcarbonyle, iso-pentylcarbonyle, neo-pentylcarbonyle, tert- pentylcarbonyle n-hexylcarbonyle, iso-hexylcarbonyle. Au sens de la présente invention, on entend par groupe (C1-C6) aikoxycarbonyle, les groupes COOR, R étant un groupe alkyle en Ci-Ce tel que défini précédemment. On peut citer à titre d'exemples les groupes méthoxycarbonyle (-COOCH3), éthoxycarbonyle, propoxycarbonyle, isopropoxycarbonyle, butoxycarbonyle, isobutoxycarbonyle, tert- butoxycarbonyle, pentoxycarbonyle, isopentoxycarbonyle, tert-pentoxycarbonyle, hexoxycarbonyle, isohexoxycarbonyle.
Au sens de la présente invention, on entend par groupe (C1-C6) acyloxy, les groupes - OCOR où R est un groupe alkyle en Ci-Ce tel que défini précédemment. On peut citer à titre d'exemple les groupes acétyloxy (-OCOCH3), propionyloxy. Au sens de la présente invention, on entend par groupement issu d'un diacide, un groupement répondant à la formule -COO -(CH2) -COOH, où p est compris entre 0 et 4. On peut citer à titre d'exemple de diacide dont sont issus ces groupements : les groupes oxalate, malonate, succinate, glutarate. Au sens de l'invention, on entend par « groupement sulfate », un groupement du type (- SO3H). Au sens de l'invention, on entend par « groupement phosphate », un groupement
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Au sens de l'invention, on entend par « groupement sulfate », un groupement du type (- SO3H) ou de type -S03 ". Dans un mode de réalisation avantageux, les groupements XA2, XA4, XA6, XB2, XB3 et XB6 sont choisis indépendamment les uns des autres et indépendamment pour chaque unité A et/ou B dans le groupe comprenant :
- un atome d'hydrogène,
- un groupement sulfate,
- un groupement pyruvate, ledit groupement pyruvate étant lié au groupement XA4 par son carbone en position 2 et au groupement XA6 par son carbone en position 2,
- une unité saccharidique liée à l'unité A ou B par une liaison de type O-glycosidique en position 1 (Ci) de l'unité saccharidique et choisie parmi un T-galactose, un T- xylose, un T-arabinose et un T-acide glucuronique.
Dans un mode de réalisation plus avantageux,
- XA2, XB2 et XB3 Sont choisis parmi un atome d'hydrogène et un groupement sulfate;
- XA4 est choisi parmi un atome d'hydrogène, un groupement sulfate et un groupement pyruvate, ledit groupement pyruvate étant lié au groupement XA4 par son carbone en position 2 et au groupement XA6 par son carbone en position 2;
- XA6 est choisi parmi un atome d'hydrogène, un groupement sulfate, une unité saccharidique T-galactose liée à l'unité A par une liaison de type O-glycosidique, une unité saccharidique T-xylose liée à l'unité A par une liaison de type O-glycosidique, une unité saccharidique T-arabinose liée à l'unité A par une liaison de type O-glycosidique et une unité saccharidique T-acide glucuronique liée à l'unité A par une liaison de type O- glycosidique, et
- XB6 est choisi parmi un atome d'hydrogène, un groupement sulfate, une unité saccharidique T-galactose liée par une liaison de type O-glycosidique au résidu B1 , une unité saccharidique T-xylose liée par une liaison de type O-glycosidique au résidu B1 , une unité saccharidique T-arabinose liée par une liaison de type O-glycosidique au résidu B1 , et une unité saccharidique T-acide glucuronique liée par une liaison de type O-glycosidique au résidu B1. On entend par « sel», tout sel d'addition avec un acide minéral ou organique par action d'un tel acide au sein d'un solvant organique ou aqueux tel qu'un alcool, une cétone, un éther, et qui ne provoque pas de réactions allergiques lors de son contact avec la peau ou toute autre partie du corps humain ou de l'animal. A titre d'exemple de tels sels, on peut citer les sels suivants : benzènesulfonate, bromhydrate, chlorhydrate, citrate, éthanesulfonate, fumarate, gluconate, iodate, iséthionate, maléate, méthanesulfonate, méthylène-bis-b- oxynaphtoate, nitrate, oxalate, palmoate, phosphate, salicylate, sulfate, tartrate, théophyllinacétate et p-toluènesulfonate. Dans un mode de réalisation particulier, le sel est un sel cosmétiquement acceptable ou un sel dermatologiquement acceptable.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le polysaccharide sulfaté peut inhiber la libération de VEGF par les cellules impliquées dans le processus inflammatoire.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le polysaccharide sulfaté peut être un antagoniste du VEGF. Par « antagoniste du VEGF », on entend une substance capable de réduire ou d'inhiber totalement la libération du VEGF. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le polysaccharide sulfaté selon l'invention est capable de réduire la libération de VEGF d'au moins 15%, avantageusement 20%, avantageusement au moins 25%, avantageusement au moins 30%, avantageusement au moins 35%. Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, le le polysaccharide sulfaté selon l'invention est capable de réduire de 25% à 35% la libération de VEGF, avantageusement de 29% à 33% la libération de VEGF. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le polysaccharide sulfaté est capable d'inhiber ou d'antagoniser les effets du VEGF, afin de prévenir et /ou traiter les maladies inflammatoires, notamment au niveau de la peau, tout en diminuant les risques d'effets secondaires. Avantageusement, le polysaccharide sulfaté selon l'invention ou un sel de celui-ci peut être utilisé dans la prévention et/ou le traitement des maladies inflammatoires chez l'être humain ou l'animal.
De plus, comme démontré dans les exemples, le polysaccharide sulfaté selon l'invention est capable d'inhiber la formation des pseudotubes induite par le VEGF dans une co-culture de cellules endothéliales dermiques humaines (HMVEC) et de fibroblastes humains normaux (NHDF), d'inhiber l'expression des gènes impliqués dans l'angiogénèse chez des keratinocytes épidermiques humains normaux (NHEK), et en particulier JAG1 , VEGFA et CYR61. Le polysaccharide sulfaté est également capable d'inhiber la prolifération cellulaire, chez des cellules de type NHEK en stimulant l'expression du gène CDKN1 C codant pour un inhibiteur de la prolifération cellulaire, ainsi que l'expression du gène CEBPA qui code pour une protéine CEBPA impliquée dans la régulation du cycle cellulaire. De plus, le polysaccharide sulfaté induit chez les mêmes cellules NHEK une inhibition de l'expression des gènes codant pour les facteurs de croissance (HBEGF et VEGFA) ou les gènes impliqués dans la régulation de la prolifération cellulaire (DUSP6, DUSP5, DUSP4, CDKN3). De plus, ces polysaccharides sulfatés sont obtenus à partir d'algues, réduisant ainsi les coûts de production et les risques de contamination.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le polysaccharide sulfaté possède une masse moléculaire inférieure ou égale à 500 kDa. De manière avantageuse, le polysaccharide sulfaté selon l'invention possède une masse moléculaire inférieure ou égale à 450 kDa, avantageusement inférieure ou égal à 400 kDa, avantageusement inférieure ou égale à 350 kDa, avantageusement inférieure ou égal à 300 kDa, avantageusement inférieure ou égale à 250 kDa, avantageusement inférieur ou égal à 200 kDa. De manière avantageuse, le polysaccharide sulfaté selon l'invention possède une masse moléculaire comprise entre 10 kDa et 500 kDa, avantageusement comprise entre 10 kDa et 400 kDa, avantageusement comprise entre 10 kDa et 300 kDa, avantageusement comprise entre 10 kDa et 250 kDa.
Dans un autre mode de réalisation particulier de l'invention, le polysaccharide sulfaté présente un taux de sulfates inférieur ou égal à 20%. De manière avantageuse, le taux de sulfates du polysaccharide sulfaté est inférieur ou égal à 19%, avantageusement inférieur ou égal à 18%, avantageusement inférieur ou égal à 17%, avantageusement inférieur ou égal à 16%. De manière avantageuse, le taux de sulfates du polysaccharide sulfaté est compris entre 8% et 20%, avantageusement entre 9% et 18%, avantageusement entre 10% et 16%, avantageusement entre 13% et 16%. Dans un autre mode de réalisation de l'invention, le polysaccharide sulfaté possède un taux de résidus 3,6-anhydrogalactopyranose inférieur ou égal à 5%. Dans un mode de réalisation avantageuse, le polysaccharide sulfaté possède un taux de résidus 3,6- anhydrogalactopyranose inférieur ou égal à 4%, avantageusement inférieur ou égal à 3%, avantageusement inférieur ou égal à 2%, avantageusement inférieur ou égal à 1 ,5%. De manière encore plus avantageuse, le polysaccharide sulfaté possède un taux de résidus 3,6-anhydrogalactopyranose inférieur ou égal à 1 ,4%.
La présente invention concerne également des compositions, notamment des compositions cosmétiques et/ou dermatologiques, permettant de réduire les anomalies vasculaires grâce à l'association d'actifs capables d'inhiber la formation des pseudotubes induite par le VEGF et de réduire la destruction des fibres de la matrice.
Dans un mode de réalisation particulier, la composition peut être une composition cosmétique ou une composition dermatologique. Par « composition cosmétique », on entend toute substance ou préparation destinée à être appliquée sur la peau, en vue de la nettoyer, de la protéger, de la maintenir en bon état, d'en modifier l'aspect, de la parfumer ou d'en corriger l'odeur.
Par « composition dermatologique», on entend toute substance ou préparation destinée à être appliquée sur la peau, les muqueuses et les phanères (ongles, cheveux, poils) en vue de prévenir l'apparition de troubles cutanés et/ou de les traiter.
Dans les compositions selon l'invention, le polysaccharide sulfaté est utilisé en une quantité allant de 0,000001 % à 10% en masse par rapport à la masse totale de la composition, avantageusement en une quantité allant de 0,0001 % à 5 % en masse par rapport à la masse totale de la composition. De manière encore plus avantageuse, le polysaccharide sulfaté est utilisé en une quantité allant de 1 % à 5 % en masse par rapport à la masse totale de la composition.
De façon connue, la composition de l'invention peut également contenir au moins un excipient pharmaceutiquement, dermatologiquement ou cosmétiquement acceptable habituel dans les domaines considérés, tels que les gélifiants hydrophiles ou lipophiles, les composés hydrophiles ou lipophiles, les huiles, les émulsifiants, les conservateurs, les antioxydants, les solvants, les parfums, les charges, les filtres, les absorbeurs d'odeur et les matières colorantes. Les quantités de ces différents excipients sont celles classiquement utilisées dans les domaines considérés, et par exemple de 0,01 % à 10 % de la masse totale de la composition. Ces excipients, selon leur nature, peuvent être introduits dans la phase grasse, dans la phase aqueuse et/ou dans les sphérules lipidiques. Comme huiles utilisables dans l'invention, on peut citer les huiles minérales (huile de vaseline), les huiles végétales (fraction liquide du beurre de karité, huile de tournesol), les huiles animales (perhydrosqualène), les huiles de synthèse (huile de Purcellin), les huiles siliconées (cyclométhicone) et les huiles fluorées (perfluoropolyéthers). On peut ajouter à ces huiles des alcools gras et des acides gras (acide stéarique). Comme émulsionnants utilisables dans l'invention, on peut citer par exemple le stéarate de glycérol, le polysorbate 60 et le mélange de PEG-6/PEG-32/Glycol Stéarate. Comme solvants utilisables dans l'invention, on peut citer les alcools inférieurs, notamment l'éthanol et l'isopropanol. Comme gélifiants hydrophiles, on peut citer les polymères carboxyvinyliques (carbomer), les copolymères acryliques tels que les copolymères d'acrylates/alkylacrylates, les polyacrylamides, les polysaccharides tels que l'hydroxypropylcellulose, les gommes naturelles et les argiles, et, comme gélifiants lipophiles, on peut citer les argiles modifiées comme les bentones, les sels métalliques d'acides gras comme les stéarates d'aluminium, la silice hydrophobe, les polyéthylènes et l'éthylcellulose. Comme composés hydrophiles, on peut utiliser les protéines ou les hydrolysats de protéine, les acides aminés, les polyols, l'urée, l'allantoïne, les sucres et les dérivés de sucre, les vitamines, l'amidon, les extraits végétaux, notamment d'Aloe Vera, et les hydroxyacides.
Comme composés lipophiles, on peut utiliser le tocophérol (vitamine E) et ses dérivés, le rétinol (vitamine A) et ses dérivés, les acides gras essentiels, les céramides, les huiles essentielles.
On peut également associer les polysaccharides sulfatés à des agents actifs, notamment des agents anti-rougeurs, des décongestionnants, des antibactériens, des antiseptiques et des antimicrobiens, des anti-inflammatoires, des agents anti-irritants et ou apaisants, des agents cicatrisants et/ou restructurant de la barrière cutanée, des antioxydants, des agents hydratants / émollients, des agents anti-âge, des filtres et écrans solaires minéraux ou organiques, des actifs protecteurs solaires.
Parmi ces agents actifs, on peut citer à titre d'exemple:
- les agents anti-rougeurs tels que les peptides de lupin, le perméthol, la génistéine, l'esculoside, le sulfate de dextrane, l'hespéridine méthylchalcone, les rétinoïdes, la licochalcone, l'oxyméthazoline, la kinétine, l'extrait de réglisse, la vitamine P like, I ' extrait de petit houx, le Sophora japonica, l'extrait d'Hamamélis, le ruscus, les antibiotiques tels que la doxycycline, les polyphénols dont les tanins, les acides phénoliques, les anthocyanes, les procyanidols, les flavonoïdes avec par exemple la quercétine, les extraits de thé vert, de fruits rouges, de cacao, de raisin, de Passiflora incarnata, de Citrus ;
les antiseptiques tels que l'acide salicylique et ses dérivés (acide n-octanoy1 -5 salicylique), ou le crotamiton ;
- les antibactériens tels que le phosphate de clindamycine, l'érythromycine ou les antibiotiques de la classe des tétracyclines ;
les antiparasitaires, en particulier le métronidazole ou les pyréthrinoïdes ;
les antifongiques, en particulier les composés appartenant à la classe des imidazoles tels que l'éconazole, le kétoconazole ou le miconazole ou leurs sels, les composés polyènes, tels que l'amphotéricine B, les composés de la famille des allylamines, tels que la terbinafine, ou encore l'octopirox ;
les agents anti-inflammatoires stéroïdiens (AIS), tels que les corticoïdes, l'hydrocortisone, le valérate de bétaméthasone ou le propionate de clobétasol, ou les agents antises sels, l'acide acétylsalicylique, l'acétaminophène ou l'acide glycyrrhétinique ou les agents anti-inflammatoires non- stéroïdiens (AINS) ;
les agents anesthésiques tels que le chlorhydrate de lidocaïne et ses dérivés ; les agents antiprurigineux comme la thénaldine, la triméprazine ou la cyproheptadine;
les agents anti-radicaux libres, tels que l'alpha-tocophérol ou ses esters, les superoxydes dismutases, certains chélatants de métaux ou l'acide ascorbique et ses esters ;
les agents kératolytiques comme l'acide rétinoïque 13 cis ou ail trans, le peroxyde de benzoyle ou les hydroxyacides ;
les agents antiviraux tels que l'acyclovir et le valacyclovir ;
les agents anti-irritants et ou apaisants tels que l'acide glycyrrhétinique (les dérivés de réglisse) avec ses sels et esters, l'acide lipoïque, le beta- carotène, la vitamine
B3 (niacinamide, nicotinamide), la vitamine E, la vitamine C, la vitamine B12, le lycopène ou la lutéine, les eaux de source ou thermales (eau d'Avène, eau de la Roche Posay, eau de Saint Gervais, eau d'Uriage, eau de Gamarde), ou encore la disulone topique. On peut citer également les isoflavones, notamment de soja, comme par exemple la génistéine/génistine, daidzéine/daidzine ;
les agents cicatrisants et/ou restructurant de la barrière cutanée tels que le panthénol (vitamine B5), l'oxyde de zinc, l'acide madécassique ou asiatique, le sulfate de dextrane, le coenzyme Q10, la glucosamine et ses dérivés, la chondroïtine sulfate et globalement les glycosaminoglycanes, le sulfate de dextrane, les céramides, le cholestérol, le squalane, les phospholipides. Peuvent également être utilisés des agonistes des récepteurs activés par les proliférateurs de peroxysomes (PPARs) tels que le rosiglitazone ou le pioglitazone, les agonistes des récepteur X de rétinoïdes (RXR), les agonistes des récepteurs des oxystérols (LXR) ;
- les antioxydants tels que les thiols et les phénols, les dérivés de réglisse comme l'acide glycyrrhétinique avec ses sels et esters, l'alpha bisabolol, l'acide lipoïque, la vitamine B12, la vitamine B3 (niacinamide, nicotinamide), les vitamines C, les vitamines E, le coenzyme Q 10, le krill, le glutathion, le BHT pour butylhydroxytoluène, le BHA pour butylhydroxyanisol, le lycopène ou la lutéine, le beta-carotène. Dans le groupe des antioxydants, on trouve aussi les substances anti-glycation telles que la carnosine ou certains peptides, la n-acétyl-cystéine, ainsi que les enzymes antioxydants ou antiradicalaires comme la SOD (super oxyde dismutase), la catalase, la glutathion peroxydase, la thioredoxine réductase et leurs agonistes ;
- les agents hydratants / émollients tels que la glycérine ou ses dérivés, l'urée, l'acide pyrrolidone carboxylique et ses dérivés, l'acide hyaluronique de toute masse moléculaire, les glycosaminoglycanes et tout autre polysaccharides d'origine marine, végétale ou biotechnologique comme par exemple la gomme xanthane, le fucogel®, des acides gras comme l'acide laurique, l'acide myristique, les acides gras poly- et mono- insaturés de type oméga 3, 6 et 7, 9 comme l'acide linoléique et acide palmitoléique, certains beurre comme le beurre de karité ;
les agents anti-âge tels que les vitamines C, l'acide hyaluronique de toute masse moléculaire, les rétinoïdes comme le rétinol, le rétinal et les rétinoïdes ; en particulier les rétinoïdes non aromatiques tels le rétinaldéhyde, la trétinoïne, l'isotrétinoïne et l'acide rétinoïque 9-cis, la vitamine A, les rétinoïdes monoaromatiques tels l'étrétinate, l'all-trans acitretine et le motrerinide, et les rétinoïdes polyaromatiques tels que l'adapalène, le tazarotène, le tamibarotène et l'arotinoïde methyl sulfone ; les actifs protecteurs solaires en particulier les filtres ou écrans solaires UVB et/ou UVA ; tels les écrans ou filtres minéraux et/ou organiques connus de l'Homme du métier qui adaptera leur choix et leurs concentrations en fonction du degré de protection recherché. A titre d'exemples d'actifs protecteur solaire, on peut notamment citer le dioxyde de titane, l'oxyde de zinc, le méthylène bis-benzotriazolyl tétraméthylbutylphénol (nom commercial TINOSORB M®) et le Bis- éthylhéxyloxyphénol méthoxyphényl triazine (nom commercial : TINOSORB S®), l'octocrylène, le butyl méthoxydibenzoylméthane, l'acide terephthalylidene dicamphor sulfonique, le 4-méthylbenzylidène de camphre, le benzophénone, l'éthylhexyl méthoxycinnamate, l'éthylhexyl diméthyl PABA, le diéthylhexyl butamido triazone.
Les compositions selon l'invention peuvent se présenter sous toutes les formes connues de la personne du métier et adaptée à la voie d'administration, notamment par injection, par voie orale, par voie topique, ou encore sous forme de compléments et/ou produits alimentaires. Avantageusement, les compositions selon l'invention peuvent être administrables par voie orale, topique, injectable ou sous forme de compléments et/ou produits alimentaires.
Pour une application topique, la composition peut se présenter notamment sous forme de solutions aqueuses, hydroalcooliques ou huileuses, ou de dispersions du type lotion ou sérum, d'émulsions de consistance liquide ou semi-liquide du type lait, obtenues par dispersion d'une phase grasse dans une phase aqueuse (Huile dans Eau) ou inversement (Eau dans Huile), ou de suspensions ou émulsions de consistance molle, semi-solide ou solide du type crème ou gel, de microémulsions, ou encore de microcapsules, de microparticules, ou de dispersions vésiculaires de type ionique et/ou non ionique. Elles peuvent être aussi conditionnées sous forme de compositions pour aérosol ou spray contenant également un agent propulseur sous pression. Ces compositions sont préparées selon les méthodes usuelles. Elle peut être également utilisée pour le cuir chevelu sous forme de solutions aqueuses, alcooliques ou hydroalcooliques, ou sous forme de crèmes, de gels, d'émulsions, de mousses, ou encore de compositions pour aérosol. Les compositions injectables peuvent se présenter sous forme d'une lotion aqueuse, huileuse ou sous forme de sérum.
Pour l'ingestion par voie orale, de nombreuses formes de réalisation et notamment de compléments alimentaires sont possibles. Leur formulation est réalisée par les procédés usuels pour produire des comprimés, des gélules, des capsules, des dragées, des émulsions, des gels, des sirops. En particulier, le polysaccharide sulfaté et les autres actifs de l'invention peuvent être incorporés dans toutes formes de compléments alimentaires ou d'aliments enrichis, par exemple, des barres alimentaires, des poudres compactées ou non, des boissons, des produits laitiers et en particulier des yaourts et des yaourts à boire. Les poudres peuvent être diluées dans de l'eau, des sodas, des jus de fruits, des produits laitiers ou à base de soja, de riz, ou être incorporées dans des barres alimentaires.
Les conditions opératoires pour préparer ces compositions selon l'invention font partie des connaissances générales de l'Homme du métier.
Les quantités des différents constituants des compositions selon l'invention sont celles classiquement utilisées dans les domaines considérés. Ces compositions constituent notamment des crèmes de protection, de traitement ou de soin pour le visage, pour les mains, pour les pieds, pour les grands plis anatomiques ou pour le corps, des laits corporels de protection ou de soin, des lotions, gels ou mousses pour le soin de la peau et des muqueuses, comme des lotions de nettoyage ou de désinfection, des compositions pour le bain, des compositions contenant un agent bactéricide. Les compositions peuvent également consister en des préparations solides constituant des savons ou des pains de nettoyage.
Lorsque la composition de l'invention est une émulsion, la proportion de la phase grasse peut aller de 5 % à 80 % en masse, et avantageusement de 5 % à 50 % en masse par rapport à la masse totale de la composition. Les huiles, les émulsionnants et les co- émulsionnants utilisés dans la composition sous forme d'émulsion sont choisis parmi ceux classiquement utilisés dans le domaine dermatologique. L'émulsionnant et le co- émulsionnant sont présents, dans la composition, en une proportion allant de 0,3 % à 30 % en masse, et de avantageusement de 0,5 à 20 % en masse par rapport à la masse totale de la composition. L'émulsion peut, en outre, contenir des vésicules lipidiques.
Lorsque la composition est une solution ou un gel huileux, la quantité d'huile peut aller jusqu'à plus de 90 % en masse par rapport à la masse totale de la composition.
Un autre aspect de l'invention concerne une composition dermatologique comprenant au moins un polysaccharide sulfaté extrait d'une algue rouge de l'espèce Haliptilon subulatum, ou un sel dermatolologiquement acceptable de celui-ci, tel que décrit précédemment, pour son utilisation dans la prévention, la réduction et le traitement des maladies inflammatoires, notamment au niveau de la peau.
Le terme «traiter » ou « traitement » ou « traitement curatif » est défini par un traitement aboutissant à une guérison ou un traitement allégeant, améliorant et/ou éliminant, réduisant et/ou stabilisant les symptômes d'une maladie ou la souffrance qu'elle provoque.
Par « maladie inflammatoire au niveau de la peau » ou « dermite », on entend toute maladie entraînant une inflammation de la peau, caractérisée par la présence sur la peau d'une rougeur, d'un gonflement, d'une chaleur et d'une douleur. Ces maladies peuvent être dues à une infection, par exemple par un microbe, un parasite, un virus ou un champignon, à une inflammation des articulations, à des allergies, à des agressions mécaniques ou chimiques tels que les rayonnements de type ultraviolet ou les radiations, de type rayon X. A titre d'exemples, on citera comme maladie inflammatoire au niveau de la peau, le psoriasis, la dermatite atopique, la rosacée, la couperose, l'acné, les verrues vulgaires, les maladies cutanée bulleuses, l'eczéma de contact, les cancers de la peau, les rougeurs, les érythèmes, les télangiectasies, les inflammations de la peau liées à une exposition aux UV, telles que la photo-irritation, la photo-sensibilisation, le photo-vieillissement, la photo- carcinogénèse, les insuffisances veineuses lymphatiques ou syndrome de jambes lourdes, cette liste n'étant pas limitative.
Un autre aspect de l'invention concerne une méthode de prévention et/ou de traitement des maladies inflammatoires au niveau de la peau chez un patient comprenant l'administration audit patient, d'une composition dermatologique comprenant au moins un polysaccharide sulfaté extrait d'une algue rouge de l'espèce Haliptilon subulatum ou un sel cosmétiquement acceptable de celui-ci, telle que décrit précédemment.
Un autre aspect de l'invention concerne une méthode de prévention et/ou de traitement des maladies inflammatoires, notamment au niveau de la peau, comprenant l'administration à un patient en nécessitant, d'une composition dermatologique comprenant au moins un polysaccharide sulfaté extrait d'une algue rouge de l'espèce genre Haliptilon subulatum ou un sel dermatologiquement acceptable de celui-ci, telle que décrit précédemment.
Un autre aspect de l'invention concerne une composition cosmétique comprenant au moins un polysaccharide sulfaté extrait d'une algue rouge de l'espèce Haliptilon subulatum, ou un sel cosmétiquement acceptable de celui-ci, tel que décrit précédemment, pour son utilisation dans la prévention, la réduction et le traitement de l'apparition des rougeurs sur la peau.
De par ses propriétés anti-angiogéniques, le polysaccharide sulfaté permet également de diminuer la réactivité de certains types de peau susceptibles de développer des rougeurs, et ainsi prévenir et traiter l'apparition de ces rougeurs. Le polysaccharide sulfaté est extrait à partir d'une algue rouge de l'espèce Haliptilon subulatum, un des avantages de l'invention est donc de proposer aux personnes sujettes aux rougeurs cutanées et ayant donc une peau sensible, une composition comprenant essentiellement des produits d'origine naturelle. Par « rougeurs de la peau », on entend les érythèmes, notamment les érythèmes faciaux et les télangiectasies, de toutes origines.
Par « prévenir les rougeurs de la peau » ou «prévention des rougeurs de la peau » ou « prophylaxie des rougeurs de la peau » ou « traitement préventif des rougeurs de la peau » ou « traitement prophylactique des rougeurs de la peau », on entend aussi bien un traitement aboutissant à la prévention des rougeurs inesthétiques sur la peau qu'un traitement réduisant et/ou retardant l'incidence des rougeurs de la peau ou le risque qu'elles surviennent. On entend également par « prévenir les rougeurs de la peau » ou «prévention des rougeurs de la peau » ou « prophylaxie des rougeurs de la peau » ou « traitement préventif des rougeurs de la peau » ou « traitement prophylactique des rougeurs de la peau », toute action permettant d'éviter ou tout du moins de réduire la formation de rougeurs inesthétiques, par application de la composition, avant et au cours d'un événement connu comme pouvant provoquer l'apparition de rougeurs, tel qu'une exposition solaire ou un stress.
Par « personne susceptible de développer des rougeurs ou ayant des rougeurs », on entend une personne présentant des rougeurs, quel que soit leurs localisations sur le corps et notamment sur le visage et quel que soit le stade auquel ces rougeurs peuvent être classifiées d'un point de vue clinique. Ces rougeurs peuvent être jugées inesthétiques et/ou handicapantes pour cette personne. Un autre aspect de l'invention concerne une méthode de prévention et/ou de traitement de l'apparition des rougeurs sur la peau, comprenant l'administration à un patient en nécessitant, d'une composition dermatologique comprenant au moins un polysaccharide sulfaté extrait d'une algue rouge de l'espèce Haliptilon subulatum ou un sel dermatologiquement acceptable de celui-ci , telle que décrit précédemment.
Un autre aspect de l'invention concerne une méthode de soin cosmétique comprenant l'application sur la peau de la composition cosmétique telle que décrite précédemment pour la prévention et/ou le traitement de l'apparition des rougeurs sur la peau.
Par « application », on entend tout acte permettant de faire absorber au patient, la composition selon l'invention par n'importe quelle voie, forme ou mode d'administration.
Un autre aspect de la présente invention concerne un procédé d'obtention du polysaccharide sulfaté. Le polysaccharide sulfaté selon l'invention peut être obtenu par des procédés bien connus de l'Homme du métier. En particulier, l'extraction d'un polysaccharide sulfaté de haute masse moléculaire peut notamment être réalisée par un procédé comprenant les étapes décrites ci-après : a) Dispersion dans l'eau d'une poudre d'algue rouge, en particulier une poudre d' Haliptilon subulatum préalablement séchée ;
b) Précipitation par au moins un solvant polaire des polysaccharides de haute masse moléculaire;
c) Séchage du précipité contenant les polysaccharides de haute masse moléculaire.
Dans un mode de réalisation particulier, l'étape b) de précipitation alcoolique est réalisée en utilisant de l'éthanol ou de l'isopropanol. Dans un mode de réalisation particulier, l'étape de séchage du précipité (étape c) peut être réalisée par lyophilisation ou à l'aide d'une étuve, notamment à une température comprise entre 40°C et 75°C, avantageusement 50°C pendant une nuit. La méthode d'obtention selon l'invention peut être renouvelée plusieurs fois afin d'obtenir un degré de pureté du polysaccharide satisfaisant.
Le procédé d'extraction selon la présente invention permet l'obtention de polysaccharides sous forme d'une fine poudre blanc crème avec un rendement de production de l'ordre de 10-20% par rapport à la masse sèche de poudre d'algue Haliptilum subulatum utilisée. Dans un autre mode de réalisation particulier, les polysaccharides sulfatés de faible masse moléculaire sont préparés par dégradation acide de polysaccharides de haute masse moléculaire. Les polysaccharides sulfatés de faible masse moléculaire peuvent également être obtenus par des techniques de dépolymérisation bien connues de l'Homme du métier, telles que les dépolymérisations radicalaire ou enzymatique.
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé d'extraction d'un polysaccharide sulfaté de faible masse moléculaire à partir d'algue Haliptilon subulatum comprend les étapes suivantes :
a) Dispersion de la poudre de polysaccharides de haute masse moléculaire dans une solution aqueuse à pH acide, en particulier un pH compris entre 3 et 6,5 ;
b) Précipitation par au moins un solvant polaire des polysaccharides de faible masse moléculaire;
c) Séchage du précipité contenant les polysaccharides de faible masse moléculaire.
Dans un mode de réalisation particulier, la solution aqueuse utilisée dans l'étape de dispersion (étape a)) est une solution d'acide chlorhydrique (HCI). Dans un mode de réalisation particulier, la solution d'HCI présente une concentration comprise entre 1 M et 5M, avantageusement 2M, à une température allant de 50°C à 100°C et sous agitation pendant 30 à 60 minutes. Dans un mode de réalisation particulier, l'étape b) de précipitation alcoolique est réalisée en utilisant de l'éthanol ou de l'isopropanol. Dans un mode de réalisation particulier, l'étape de séchage du précipité (étape c)) est réalisée par lyophilisation ou à l'aide d'une étuve, notamment à une température comprise entre 40°C et 75°C, avantageusement 50°C pendant une nuit.
Les polysaccharides sulfatés extraits à partir d'algues rouges selon l'invention présentent l'avantage de ne pas avoir les problèmes de contamination et de sécurité. De plus, ces polysaccharides sulfatés offrent un avantage économique. Le rendement approximatif de polysaccharides sulfatés de la présente invention est d'environ 10% à 20% par rapport au poids sec initial d'algues à partir desquelles il a été extrait. En outre, les algues rouges, en particulier de la classe des Florideophyceae, en particulier les espèces Haliptilon subulatum, sont faciles à cultiver ce qui contribue également au faible coût de revient du produit final
Les figures et les exemples qui suivent illustrent l'invention sans toutefois la limiter.
FIGURES
Figure 1 : Effets du polysaccharide sulfaté sur la formation des pseudotubes en condition basale ou stimulée avec du VEGF à 10ng/ml conformément à l'exemple 6. Figure 2 : Effets du polysaccharide sulfaté sur la viabilité des kératinocytes humains normaux, conformément à l'exemple 8.
Figure 3 : Effets du polysaccharide sulfaté sur la libération du VEGF par des kératinocytes humains normaux, rapporté à la quantité totale de protéines, conformément à l'exemple 9. Figure 4 : Effets du polysaccharide sulfaté sur la libération d'IL8 par des kératinocytes humains normaux, rapporté à la quantité totale de protéines, conformément à l'exemple 9.
EXEMPLES
Exemple 1 : Extraction des polysaccharides de haute masse moléculaire (PSHM) Par « polysaccharide de haute masse moléculaire» ou « PSHM », on entend un polysaccharide ayant une masse molaire comprise entre 100 et 1000 kDa.
L'extraction des polysaccharides de haute masse moléculaire est réalisée en dispersant 100 grammes de poudre d'algue Haliptilon subulatum dans 1 litre d'eau à 90 °C sous vive agitation (500 Tr/min) pendant 4H. Le mélange est ensuite filtré à chaud sur diatomée (100 g) sur un verre fritté (porosité 1 , plus précisément 100 à 160 μηη). Le filtrat est ensuite centrifugé (10000 g, 30 minutes) à température ambiante pour obtenir l'extrait d'algue enrichi en polysaccharides. L'extrait d'Haliptilon subulatum est ensuite précipité dans 3 volumes d'éthanol 96° (à 4°C) sous agitation (500 Tr/min) pendant 2 heures.
Le précipité est récupéré par filtration sur verre fritté (porosité 1 ou 2, plus précisément 100 à 160 μηη ou 40 à 100 μηη respectivement) ou centrifugation (10000 g, 30 minutes) à température ambiante puis lavé avec de l'acétone (50 à 100 mL). Ensuite, le précipité est récupéré par filtration sur verre fritté (porosité 2, plus précisément 40 à 100 μηη) ou centrifugation (10000 g, 30 minutes) à température ambiante puis séché à l'étuve à 50°C durant une nuit. Finalement, le précipité est broyé (au Blender) afin d'obtenir une fine poudre de polysaccharides de haute masse moléculaire extraits d'Haliptilon subulatum.
Le rendement en polysaccharides de haute masse moléculaire ainsi obtenu est de l'ordre de 10 à 20% par rapport à la masse sèche de poudre d'algue Haliptilon subulatum utilisée.
Exemple 2 : Extraction des polysaccharides de faible masse moléculaire (PSFM) Par « polysaccharide de faible masse moléculaire» ou « PSFM », on entend un polysaccharide ayant une masse moléculaire comprise entre 5 et 100 KDa. La production de polysaccharides de faible masse moléculaires est réalisée en dispersant 2,5 grammes de poudre de polysaccharide de haute masse moléculaire (extraits d'Haliptilon subulatum) dans 125 mL d'HCI (2M) à 100 °C sous vive agitation (500 Tr/min) pendant 1 heure. Le mélange est ensuite refroidi à température ambiante puis neutralisé avec de la soude (5 M). Le milieu est précipité dans 7 volumes d'éthanol 96° (à 4°C) sous agitation (500 Tr/min) pendant 2 heures. Le précipité est récupéré par filtration sur verre fritté (porosité 1 ou 2, plus précisément 100 à 160 μηη ou 40 à 100 μηη respectivement) ou centrifugation (10000 g, 30 minutes) à température ambiante puis lavé avec de l'acétone (50 mL). Ensuite, le précipité est récupéré par filtration sur verre fritté (porosité 2, plus précisément 40 à 100 μηη) ou centrifugation (10000 g, 30 minutes) à température ambiante puis séché à l'étuve à 50°C durant une nuit. Finalement, le précipité est broyé (au Blender) afin d'obtenir une fine poudre de polysaccharides de faible masse moléculaire extraits d'Haliptilon subulatum.
Le rendement en polysaccharides de faible masse moléculaire ainsi obtenu est de l'ordre de 70% par rapport à la masse sèche de poudre de polysaccharides de haute masses moléculaires et 14 % par rapport à la masse sèche de poudre d'algue Haliptilum subulatum utilisée.
Exemple 3 : Détermination des masses moléculaires des polysaccharides de haute (PSHM) et de faible (PSFM) masse moléculaire.
Les polysaccharides de haute et faible masse moléculaire sont préparés selon des conditions décrites préalablement (exemples 1 et 2). Les masses moléculaires des polysaccharides sulfatés sont déterminées selon le protocole ci-après : a) Solubilisation de la poudre de polysaccharides à hauteur de 0,5 à 10 g/L dans une solution aqueuse de qualité ultrapure à une température allant de 4°C à 60°C et sous agitation pendant 30 minutes à 48 heures ;
b) Filtration des échantillons sur membrane de porosité 0,45 μηη ;
c) Injection et analyse par chromatographie d'exclusion stérique couplée à la diffusion de la lumière (SEC/MALLS) ;
d) La technique permet d'accéder aux masses molaires moyennes en nombre (Mn) et en poids (Mw) et renseigne également sur la forme et la dimension des chaînes et la polydispersité (Ip). Tableau 1 : Récapitulatif des masses moléculaires moyennes en poids et en nombre observées pour PSHM et PSFM.
Mn (g/mol) Mw (g/mol) Ip (Mw/Mn)
PSHM 133300 213500 1 ,6
PSFM 12840 36640 2,8
Il ressort de cet exemple que la masse moléculaire des polysaccharides de haute masse moléculaire est de l'ordre de 214 kDa et que la masse moléculaire des polysaccharides de faible masse moléculaire est de l'ordre de 37 kDa.
Exemple 4 : Détermination du taux de sulfates et de résidus 3,6- anhydrogalactopyranoses des polysaccharides de l'invention 1 . Détermination du taux de sulfates Dosage par turbidimétrie (BaC /gélatine)
Les ions sulfates libérés lors de l'hydrolyse des polysaccharides vont former, en présence de chlorure de baryum (BaC , 2H2O) et de gélatine un précipité de sulfate de baryum dont l'apparition est mesurée à 550 nm, dans décrit dans la publication de Dodgson & Price (Dodgson & Price, 1962, Biochemical Journal 84 : 106-1 10).
150 mg de gélatine sont dissous dans 50 ml_ d'eau milli-Q à 70°C. Après refroidissement 16 h à 4°C, la solution de gélatine est additionnée de 0,5 g de BaC . 120 mg de polysaccharide lyophilisé sont hydrolysés par 3 ml_ d'HCI 2 M pendant 2 h à 100°C. Le mélange est centrifugé à 13 000 g pendant 30 min. 1 mL de surnageant est mélangé à 9 mL d'eau milli-Q, 1 mL d'HCI 0,5 M et 0,5 mL de réactif BaC /gélatine. Après 30 min à température ambiante, le mélange est agité et l'absorbance est lue immédiatement à 550 nm. La gamme étalon est réalisée à l'aide d'une solution mère de K2SO4 à 3 mg/mL.
Dosage à l'Azuré A
La quantité de sulfates a été déterminée par l'utilisation de la méthode de dosage colorimétrique développée par Jaques et al. (Jaques L.B et al., 1968, Canadian Journal of Physiology and Pharmacology 46, pages : 351 -360). En phase aqueuse, le chlorure de 3- amino-7-(diméthylamino)phénothizin-5-ium (Azuré A) complexe les sulfates pouvant être présents, notamment au sein des polysaccharides composant les fractions de SPE. Le milieu développe alors une couleur rose-violet absorbant à λ=535 nm, due à la formation d'un chromophore en présence de sulfates. Le dosage est semi-quantitatif et donne un ordre de grandeur (~mg) de la concentration en sulfates d'un échantillon. Dans des cuves en plastique pour spectrophotomètre sont introduits 200 μί de solution à doser. 2 mL de solution aqueuse d'Azuré A à 10 mg/L sont ajoutés puis l'échantillon est agité. L'absorbance est mesurée à λ=535 nm.
La quantification des sulfates est déterminée à partir de la gamme d'étalonnage de dextrane sulfate (17 % sulfaté) et correction du degré de sulfatation de ce dernier (17 mg de sulfates pour 100 mg de dextrane sulfate).
Tableau 2. Récapitulatif des taux de sulfates pour PSHM et PSFM.
Taux de sulfates (% m/m) Ecart-type
PSHM 13,5 0,09
PSFM 15,7 0,26
Il ressort de cet exemple que le taux de sulfates des polysaccharides de haute masse moléculaire est de l'ordre de 13,5% et que le taux de sulfates des polysaccharides de faible masse moléculaires est de l'ordre de 15,7%.
2. Détermination du taux de résidus 3,6-anhvdrogalactopyranoses
La méthode colorimétrique la plus reproductible pour doser les résidus 3,6- anhydrogalactoses est celle qui emploie un réactif à base de résorcinol (voir Yaphe & Arsenaut, 1965, Analytical Biochemistry 13, pages 143-148). La coloration rose qui se développe au cours de la réaction est suivie à 555 nm. Trois solutions sont nécessaires à la réalisation de ce dosage : (i) une solution d'acétaldehyde préparée en diluant 1 mL d'acétaldehyde dans 100 mL d'eau ultrapure (stable environ 1 mois) ; (ii) une solution de résorcinol préparée par dissolution de 150 mg de résorcinol dans 100 mL d'eau ultrapure (stable 7 jours, à l'abri de la lumière) et (iii) une solution d'HCI 10 M.
Pour le dosage, 50 à 100 μί de la solution de polysaccharide à doser) sont introduits dans des tubes en verre. Le volume est complété à 200 μί à l'aide d'eau milli-Q. Le réactif au résorcinol est préparé de façon extemporanée en ajoutant à 100 mL d'HCI 10 M, 9 mL de la solution de résorcinol et 1 mL de la solution d'acétaldéhyde diluée au 1/25. Ce réactif n'est stable que 3 h à l'abri de la lumière. A 200 μΙ_ de la solution de polysaccharide à doser sont ajoutés 1 mL du réactif au résorcinol. Après agitation, les tubes sont laissés au repos pendant 4 min, puis placés dans un bain- marie à 80°C pendant 10 min. Ils sont ensuite transférés dans un bain de glace pendant 1 min 30. L'absorbance doit être lue dans les 15 min qui suivent à 555 nm.
Le D-fructose (solutions de 10 à 70 g/mL) est utilisé comme standard. En effet, il a été démontré que les courbes d'absorbance à 555 nm en fonction de la concentration en monosaccharide du D-fructose et du le 3,6-anhydrogalactose sont identiques (voir Yaphe & Arsenaut, 1965, Analytical Biochemistry 13, pages 143-148).
Tableau 3. Récapitulatif du taux de résidus 3,6-anhydroçialactopyranoses (anhydroG) pour PSHM.
Taux de (3,6) anhydroG (% m/m) Ecart-type
PSHM 1^32 0,013
Il ressort de cet exemple que le taux de 3,6-anhydrogalactopyranose des polysaccharides de haute masse moléculaire est de 1 ,32 %.
Exemple 5 : Détermination de la composition en monosaccharides et de la structure des polysaccharides selon l'invention
10 mg de polysaccharides sont dissous dans 1 mL d'acide trifluoracétique à 2 M pendant 90 min à 120 °C, avec agitation manuelle toutes les 30 minutes. Les échantillons sont évaporés sous jet d'azote pour éliminer les traces d'acide en excès. 1 mL de méthanol est ajouté, puis l'échantillon est agité au vortex et évaporé sous jet d'azote. Cette étape est répétée 2 fois pour éliminer les traces résiduelles d'acides. La dérivatisation est réalisée via l'utilisation de BSTFA : TMCS (99 : 1 ). Pour 2 mg de monosaccharides, on ajoute 400 μί de pyridine et 400 μί de Λ , O-bis(triméthylsilyl) trifluoroacétamide : triméthylchlosylane (BSTFA : TMCS) (99 : 1 ). Les échantillons sont ensuite mélangés puis placés à température ambiante pendant 2 heures sous agitation (450 rpm).
On évapore sous jet d'azote les échantillons, puis les résidus triméthylsilyl-O-glycosides sont repris par 500 μί de dichlorométhane. A cette étape, il est possible de diluer plus ou moins l'échantillon. Les standards (L-Rha, L-Fuc, L-Ara, D-Xyl, D-Man, D-Gal, D-GIc, D-GIcA, D-GalA) sont préparés dans les mêmes conditions, à au moins trois concentrations différentes. Les dérivés triméthylsilylés sont analysés par chromatographie phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse, sur une colonne OPTIMA-1 MS (30 m, 0,32 mm, 0,25 μηη) avec un débit d'hélium de 2,3 mL/min (jusqu'à 3 mL/min). La pression d'hélium est fixée à 8,8 psi soit 60673,9 Pa et le ratio d'injection à 25 : 1 (ou 50 : 1 ). La montée de température est de 8°C/min jusqu'à 100°C, pendant 3 min. On programme une autre montée en température de 8°C/min jusqu'à 200°C, maintenue pendant 1 min. On termine par une montée en température de 5°C/min jusqu'à 250°C. L'ionisation est réalisée par Impact Electronique (El, 70 eV), la température de la trappe est fixée à 150 °C et les ions ciblés entre 40 et 800 m/z.
Tableau 4. Composition en monosaccharides de l'échantillon PSHM.
Monosaccharides (mol %)*
Figure imgf000025_0001
"94/1 Ï^5Ï Û38 Ï^5Ï Û)
* Composition en monosaccharides estimées par CG/SM-IE. Gai: Galactose; Ara: Arabinose; Xyl: Xylose; GlcA: Acide glucuronique, Glc: Glucose.
Exemple 6 : Effet du polysaccharide sulfaté de haute masse moléculaire (PSHM) selon l'invention sur la formation de pseudotubes dans une co-culture
HMVEC+NHDF Les effets du polysaccharide sulfaté de haute masse moléculaire (PSHM) sur la formation de pseudotubes ont été étudiés dans une co-culture de cellules endothéliales dermiques humaines (HMVEC) et de fibroblastes dermiques humains normaux (NHDF), en condition basale ou stimulée par du VEGF (analyse par immunomarquage in situ). Culture et traitement
Les cellules HMVEC et NHDF en co-culture ont été ensemencées en plaques 96 puits et cultivées pendant 24 heures en milieu de culture.
Le milieu de culture utilisé est le suivant :
EBM-2 (Endothelial cell basai médium 2) supplémenté en sérum de veau foetal (SVF) 5%, rhEGF, rhFGF, R3 IGF-1 , hydrocortisone, vitamine C, gentamycine,
DMEM complémenté avec L-glutamine 2mM, pénicilline 50U/ml, stretomycine 50 g/ml et SVF 10%. Le milieu a ensuite été remplacé par du milieu d'essai contenant ou non (témoin) le composé à tester et/ou la référence inductrice VEGF testée à 100 ng/ml ; le composé a été testé en parallèle en condition basale et stimulée (en absence et en présence de VEGF).
Le milieu d'essai utilisé est le suivant :
- EBM-2 (Endothelial cell basai médium 2) supplémenté en rhEGF, rhFGF, R3 IGF- 1 , hydrocortisone, vitamine C, gentamycine,
DMEM complémenté avec L-glutamine 2mM, pénicilline 50U/ml, stretomycine 50 g ml et SVF 1 %.
Les cellules ont ensuite été incubées pendant 7 jours avec renouvellement du traitement après 72 heures d'incubation. Toutes les conditions expérimentales ont été réalisées en triplicata (n=3).
Immunomarguape in situ des pseudotubes
Après incubation, le milieu de culture a été éliminé et les cellules ont été rincées, fixées et perméabilisées. Les cellules ont ensuite été marquées avec l'anticorps primaire anti-VWF (Von Willebrand Factor). Cet anticorps a été révélé par un anticorps secondaire couplé à un fluorochrome (GAR-Alexa 488). En parallèle, les noyaux des cellules ont été colorés par le Hoechst 33258 (bis-benzimide).
La formation des pseudotubes a été observée à l'aide d'un microscope NIKON Diaphot 300 (Objectif x4). Les images numériques (1 photo par puits) ont été enregistrées avec une caméra NIKON DS-RM et le logiciel NIS-Elements 4.13.04. Le marquage a été quantifié par mesure de la surface totale des pseudotubes à l'aide du logiciel Image J. Les résultats du marquage sont présentés en Figure 1.
Résultats
La formation de pseudotubes dans la co-culture de cellules endothéliales (HMVEC) et de fibroblastes dermiques (NHDF) après 7 jours d'incubation a été mesurée par analyse d'images suite à un immunomarquage par un anticorps anti-vWF, le vWF étant spécifiquement exprimé par les cellules HMVEC. Le pourcentage de stimulation est calculé selon la formule suivante Stimulation (%) =
Figure imgf000027_0001
^ oyenne u t mo n
Le pourcentage d'inhibition est calculé selon la formule suivante
Inhibition (%) = Moyenne Témoin stimulé - Valeur x 100
Moyenne Témoin stimulé - Moyenne Témoin basai
Tableau 5. Effet du polysaccharide sulfaté PSHM selon l'invention sur la formation des pseudotubes - Condition basale.
Figure imgf000027_0002
1): Seuil de significativité statistique
ns : > 0,05, Non significatif
* : 0,01 à 0,05, Significatif
** : 0,001 à 0,01 , Très significatif
*** : < 0,001 , Extrêmement significatif
esm : erreur standard de la moyenne
Les comparaisons intergroupes ont été réalisées à l'aide du test t de Student bilatéral non apparié. Tableau 6. Effet du polysaccharide sulfaté PSHM selon l'invention sur la formation des pseudotubes - Condition stimulée par le VEGF
Figure imgf000028_0001
(1 ): Seuil de significativité statistique
ns : > 0,05, Non significatif
* : 0,01 à 0,05, Significatif
** : 0,001 à 0,01 , Très significatif
*** : < 0,001 , Extrêmement significatif
esm : erreur standard de la moyenne
Les comparaisons intergroupes ont été réalisées à l'aide du test t de Student bilatéral non apparié. En condition basale, seul un marquage diffus et faible pouvait être observé, indiquant une absence d'organisation des cellules endothéliales. Le traitement par la référence VEGF (100 ng/ml) a clairement conduit à une organisation des cellules endothéliales en pseudotubes. Testé en condition basale, le composé PSHM, à 10 pg/ml, n'a pas présenté d'effet significatif par rapport à la condition témoin non stimulé et n'a donc pas induit la formation de pseudotubes dans la co-culture HMVEC / NHDF. Testé en condition stimulée, le composé PSHM, à 10 μ g/m I , a inhibé de façon nette et significative la formation de pseudotubes induite par le VEGF (77% d'inhibition).
Exemple 7 : Analyse transcriptomique complète des effets du polysaccharide sulfaté PSHM
L'analyse transcriptomique complète des effets du polysaccharide sulfaté PSHM a été réalisée sur des kératinocytes épidermiques humains normaux (NHEK) et sur des fibroblastes dermiques humains normaux (NHDF) à deux temps d'incubation : 4 heures et 24 heures. Composé testé
Composé testé : Polysaccharide sulfaté PSHM
Concentrations testées :
o 0,1 mg/ml sur les NHEK
o 3 mg/ml sur les NHDF Cultures et traitements
Les kératinocytes ont été ensemencés en plaques 24 puits et les fibroblastes en plaques 12 puits, puis cultivés en milieu de culture pendant 48 heures.
Le milieu de culture utilisé est le suivant :
Keratinocyte-SFM complémenté en EGF (epidermal growth factor) 0,25ng/ml, extrait pituitaire (EP) 25μg/ml et gentamycine 25μg/ml.
Le milieu de culture a ensuite été remplacé par du milieu d'essai et les cellules ont été cultivées pendant 24 heures supplémentaires. Le milieu d'essai utilisé est le suivant : Keratinocyte-SFM complémenté en gentamycine 25μg/ml. Les cellules ont ensuite été traitées ou non (témoin) par le composé à tester et incubées pendant 4 ou 24 heures. Toutes les expériences ont été réalisées en triplicata (n=3).
A la fin de l'incubation, les surnageants de culture ont été éliminés et les tapis cellulaires ont été rincés avec une solution de « phosphate buffered saline » (PBS). Les plaques ont été immédiatement congelées à sec à -80°C. Extraction d'ARN
Avant l'extraction, les réplicats de culture ont été poolés. L'ARN total de chaque échantillon a été extrait à l'aide du kit NucleoSpin® RNA Plus (Macherey-Nagel) selon le protocole préconisé par le fournisseur. Analyse de l'expression différentielle
La quantité et la qualité des ARN ont été évaluées par électrophorèse capillaire (Bioanalyzer 2100, Agilent). La synthèse des ARN anti-sens (ARNa) biotinylés a été réalisée à l'aide du kit « GeneChip 3'IVT Express » (Affymetrix®). Pour chaque échantillon d'ARNa biotinylé un profil électrophorétique a été réalisé (Bioanalyzer 2100, Agilent) avant et après fragmentation. L'hybridation des ARNa marqués et fragmentés sur la puce Affymetrix® U219 chip (36,000 transcripts and variants) a été réalisée sur la station d'hybridation GeneAtlasTM fluidics Affymetrix® hybridization station pendant 20 heures à 45°C. Les puces U219 ont ensuite été scannées à l'aide du GeneAtlasTM Imaging station (Affymetrix® - resolution 2 Inn) afin de générer les données d'intensité de signal. Traitement des données
Les données d'intensité de signal sont normalisées à l'aide du logiciel Expression Console (Affymetrix), à partir de l'algorithme RMA. Un contrôle qualité du marquage ainsi que de l'hybridation est ensuite réalisé.
Résultats obtenus Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 7.
Tableau 7. Analyse transcriptiomigue du PSHM et effets sur le processus de prolifération cellulaire et l'angiogenèse
Figure imgf000031_0001
Il ressort de cet exemple que le polysaccharide sulfaté PSHM est capable d'inhiber le processus de prolifération cellulaire et l'angiogenèse à une concentration de 0,1 mg/ml sur les kératinocytes, alors qu'il a plutôt tendance à stimuler le processus de prolifération cellulaire et l'angiogenèse à une concentration de 3 mg/ml sur les fibroblastes.
Ceci en fait un bon principe actif pour la prévention et/ou le traitement des rougeurs. Exemple 8 : Évaluation du polysaccharide sulfaté PSHM sur la viabilité cellulaire des kératinocytes humains normaux
Les kératinocytes humains sont ensemencés en microplaque 96 puits à la densité de 20 000 kératinocytes par puits (équivalant à 60 000 cellules/cm2, puis laissées à adhérer/proliférer 24 heures à 37°C avec 5% de CO2 en milieu KSFM complet (additionné d'antibiotiques et de suppléments de croissance, Gibco 17005).
Les kératinocytes humains sont traitées avec le polysaccharide sulfaté PSHM à tester en milieu non supplémenté (sans suppléments de croissance) pendant 48 heures et incubés à 37°C avec 5% de CO2. Chaque concentration du produit est évaluée en triplicata. Deux témoins positifs sont utilisés : un de cytotoxicité, le Diméthylsulfoxyde à 10% (DMSO - Sigma D4540) et un de prolifération, le milieu complet (i.e. avec suppléments de croissance).
Un test de viabilité cellulaire/cytoxicité (test XTT) est réalisé, afin de déterminer les doses non cytotoxiques. Le test du XTT est réalisé au moyen du kit « Cell Prolifération Kit II (XTT)» (Sigma/Roche Diagnostics, 1 1465015001 ).
Après les 48 heures de traitement, les puits sont rincés délicatement avec un tampon phosphate salin (PBS, Invitrogen). Les kératinocytes sont alors mis en présence d'une solution de tétrazolium sodique (XTT) à 0,3 mg/mL. Les plaques sont incubées à 37°C avec 5% de CO2 dans l'obscurité. La solution de de tétrazolium sodique (XTT) est également déposée dans des puits sans cellule (milieu avec produit ou non) afin de réaliser des blancs. Après 3h d'incubation, l'absorbance est mesurée à 450 nm avec référence à 650 nm. Pour chaque condition, les valeurs de densité optique (DO, absorbance) sont moyennées.
La viabilité des cellules traitées est exprimée en pourcentage par rapport au témoin (cellules non traitées) :
DO "échantillon"
%viabilité "échantillon'^ - —— : —— x 100
Moyenne DO témoin non traite
Un traitement entraînant une diminution de la viabilité, en-dessous de la valeur seuil de 80% d'activité mitochondriale par rapport au témoin, est considéré comme cytotoxique pour les cellules. A l'inverse, une augmentation de la valeur témoigne d'une augmentation de l'activité mitochondriale, voire de prolifération cellulaire. La significativité des résultats est évaluée par comparaison des valeurs à celles obtenues pour la condition témoin, par le test t de Student (t-Test) avec les critères suivant :
Figure imgf000033_0001
Les résultats obtenus sont présentés en Figure 2. Conclusions :
Le polysaccharide sulfaté PSHM est non cytotoxique pour les kératinocytes après 48h d'application, aux concentrations de 0,3 et 1 μg mL (au-dessus du seuil de 80% de viabilité), alors qu'il apparaît cytotoxique aux plus fortes doses testées, à savoir de 10 à 600 μg mL.
Exemple 9 : Effets du polysaccharide sulfaté PSHM sur la libération de VEGF et d'interleukine (IL8) par des kératinocytes humains normaux Les kératinocytes humains sont ensemencés en microplaques 96 puits à une densité de 20.000 cellules/puits, soit 60.000 cellules/cm2, en milieu KSFM complet, et laissés à adhérer/proliférer à 37°C sous 5% de CO2, 24 heures avant traitement.
Le polysaccharide sulfaté PSHM, testé à 3 concentrations non cytotoxiques (0,1 μg ml, 0,3 μg ml et 1 μg ml), est mis en présence des kératinocytes pendant 24 heures à 37°C avec 5% de CO2 (en milieu KSFM non supplémenté). Le polysaccharide sulfaté PSHM est ensuite ré-appliqué pour 24h supplémentaires (soit 48h au total), en présence ou non de stimulation à ΓΙ L1 β à 20ng/mL (Bio-Techne/R&Dsystems, 201 -LB). Chaque condition non stimulée est testée en triplicata (n=3 puits cellulaires), de même pour chaque condition stimulée. Les dosages sont ensuite réalisés en duplicata. Des témoins positifs d'inhibition de la production de VEGF et d'IL8 sont utilisés (à 1 μΜ) : l'EGCG (Epigallocatechin gallate - Tocris 4524) et la staurosporine (Sigma S4400) respectivement. Dosage de l'IL8 et du VEGF
Les cibles d'intérêt IL8 et VEGF sont dosées grâce aux kits fournis par respectivement Bio- Techne/R&Dsystems (D8000C) et Thermo/Fisher scientific (EH2VEGF). Les résultats des dosages sont obtenus par mesure de l'absorbance (DO) à la longueur d'onde de 450 nm, avec 550 ou 570 nm comme longueur d'onde de référence.
Dosage des protéines totales
Les protéines totales sont dosées à l'aide de la méthode BCA. Le kit de dosage BCA (Sigma BCA1 ) est composé d'une solution d'acide bicinchoninique (BCA) (Sigma B9643) et de sulfate de cuivre (CuS04 - Sigma C2284). La gamme de standard est préparée à partir d'albumine de sérum bovin (BSA) (Bovine Sérum Albumin - Sigma A9418). Les culots cellulaires sont conservés à sec à -20°C en attendant ce dosage. Pour lyser les cellules et alcaliniser le milieu réactionnel, les culots cellulaires sont équilibrés à température ambiante puis mis en milieu alcalin durant un minimum de 30 minutes. Le dosage est réalisé par ajout d'un mélange des réactifs acide bicinchoninique et de CuS04. La plaque est mise à incuber à 37°C et la réaction est arrêtée en plaçant la plaque quelques minutes à 4°C. La lecture du dosage est ensuite effectuée à la longueur d'onde de 570 nm.
Résultats :
Les résultats obtenus par la méthode BCA sont présentés en Figures 3 et 4. Avec le polysaccharide sulfaté PSHM, en cas de stress inflammatoire, on observe un potentiel effet inhibiteur sur les synthèses du VEGF et d'IL8, aux plus faibles doses testées. En effet, suite au traitement avec le polysaccharide sulfaté PSHM, aux deux concentrations testées les plus faibles de 0,1 et 0,3 μg/mL, une baisse significative de la libération kératinocytaire du VEGF induite par le stress inflammatoire (ΓΙ L1 β), de -29% et -33% respectivement, par rapport au témoin non traité mais stimulé (significatif * ou hautement significatif ** respectivement) est obtenue. Cette inhibition est comparable à celle obtenue avec le contrôle positif.
A la plus forte concentration testée de 1 μg/mL, l'effet du polysaccharide sulfaté PSHM est léger (-9%) et non significatif.
En ce qui concerne NL8, on observe une diminution significative (*) de la libération kératinocytaire après induction (stress inflammatoire), de -14% après application de 0,1 μg/mL du produit, par rapport au témoin stimulé. Cet effet inhibiteur est du même ordre de grandeur que celui constaté avec le témoin positif. A la dose de 0,3 μg/mL, l'effet de l'extrait est léger (-6%) et non significatif et à 1 μg mL il n'y a pas d'effet.
En l'absence de stimulation, il n'y a pas d'inhibition significative des libérations basales de VEGF ou d'IL8, avec aucune des trois doses testées :
- Aux doses de 0,1 et 0,3 μg mL, on constate une faible diminution du VEGF relargué (-5% et -10% respectivement, de façon non significative). A l'inverse, à la plus forte concentration testée (1 μg mL,) on observe une stimulation de cette production de +31 % (significatif *).
- A la concentration de 0,1 μg mL, on constate une faible baisse d'IL8 (-7%, de façon non significative). A l'inverse, à 0,3 et 1 μg mL, il apparaît une faible stimulation de cette production (+8% et +19% respectivement, de manière non significative ou significative **).
Conclusions :
Le polysaccharide sulfaté PSHM permet :
- aux doses de 0,1 et 0,3 μg mL, de contrer la libération du VEGF dans un contexte de stress inflammatoire,
- à la dose de 0,1 μg mL, de lutter également contre la production d'IL8 (sous stress inflammatoire).

Claims

REVENDICATIONS
1 . Polysaccharide sulfaté extrait d'une algue rouge de l'espèce Haliptilon subulatum ou un sel de celui-ci pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement des maladies inflammatoires chez l'être humain ou l'animal.
2. Polysaccharide sulfaté selon la revendication 1 , caractérisé en ce ledit polysaccharide sulfaté est un antagoniste du VEGF.
3. Polysaccharide sulfaté selon l'une quelconque des revendications 1 à 2, caractérisée en ce que le polysaccharide sulfaté possède une masse moléculaire inférieure ou égale à 500 kDa.
4. Polysaccharide sulfaté selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que le polysaccharide sulfaté possède une masse moléculaire comprise entre 10 kDa et 250 kDa.
5. Composition, comprenant le polysaccharide sulfaté selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, et au moins un excipient pharmaceutiquement ou dermatologiquement ou cosmétiquement acceptable.
6. Composition selon l'une des revendications 1 à 5, comprenant en outre au moins un autre agent actif, l'agent actif étant notamment choisi parmi des agents antirougeurs, des décongestionnants, des antibactériens, des antiseptiques et des antimicrobiens, des anti-inflammatoires, des agents anti-irritants et ou apaisants, des agents cicatrisants et/ou restructurant de la barrière cutanée, des antioxydants, des agents hydratants et/ou émollients, des agents anti-âge, des filtres et écrans solaires minéraux ou organiques et des actifs protecteurs solaires.
7. Composition selon l'une des revendications 5 à 6, caractérisée en ce qu'elle est administrable par voie orale, topique, injectable ou sous forme de compléments et/ou produits alimentaires.
8. Composition selon l'une des revendications 5 à 7, caractérisée en ce que la composition est une composition cosmétique ou une composition dermatologique.
9. Composition dermatologique selon la revendication 8 pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement des maladies inflammatoires, notamment au niveau de la peau.
10. Composition dermatologique selon la revendication 9, caractérisée en ce que la maladie inflammatoire est choisie dans le groupe comprenant : le psoriasis, la dermatite atopique, la rosacée, la couperose, l'acné, les verrues vulgaires, les maladies cutanée bulleuses, l'eczéma de contact, les cancers de la peau, les rougeurs, les érythèmes, les télangiectasies, les inflammations de la peau liées à une exposition aux UV, telles que la photo-irritation, la photo-sensibilisation, le photovieillissement, la photo-carcinogénèse, les insuffisances veineuses lymphatiques ou syndrome de jambes lourdes.
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