FR2842201A1 - Nouvel oligosaccharide, compositions cosmetiques et/ou dermatologiques en contenant et ses applications - Google Patents

Abstract

La présente invention se rapporte au domaine des nécessités de la vie et plus particulièrement aux domaines de la cosmétologie, de la pharmacie et plus spécifiquement de la dermatologie.La présente invention a plus particulièrement pour objet un nouveau composé actif oligosaccharidique, d'environ 5kd dont l'unité répétitive, est un hexasaccharide constitué de résidus fucose, galactose, glucose et acide glucuronique. La présente invention concerne également l'utilisation de ce composé oligosaccharidique comme agent apaisant pour lutter contre le stress cellulaire, notamment comme anti-inflammatoire, comme stimulant de la libération des β-endorphines par les kératinocytes et/ou comme inhibiteur de l'adhésion cellulaire. La présente invention a également pour objet les compositions cosmétiques et/ou pharmaceutiques en particulier dermatologiques, qui contiennent ce composé actif, éventuellement en association ou en mélange avec un ou plusieurs excipients et/ou véhicules cosmétiques et/ou pharmaceutiques appropriés.De telles compositions trouvent une utilisation notamment pour les soins et/ou pour le traitement de la peau et/ou des phanères.

Description

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NOUVEL OLIGOSACCHARIDE, COMPOSITIONS COSMETIQUES ET/OU DERMATOLOGIQUES EN CONTENANT ET APPLICATIONS La présente invention se rapporte au domaine des nécessités de la vie et plus particulièrement aux domaines de la cosmétologie, de la pharmacie et plus spécifiquement de la dermatologie.

La présente invention concerne un nouveau composé actif oligosaccharidique, dont l'unité saccharidique constitutive et répétitive est un hexasaccharide constitué de résidus de Dglucose, L-fucose, D-galactose et d'acide D-glucuronique. Plus précisément, l'invention a pour objet un oligosaccharide ayant un poids moléculaire d'environ 5 000 daltons (5kd) dont l'unité constitutive saccharidique et répétitive est un hexasaccharide constitué de deux molécules de L-fucose, de deux molécules de D-Galactose, d'une molécule de D-glucose et d'une molécule d'acide D-glucuronique.

La présente invention concerne spécifiquement un agent apaisant oligosaccharidique et/ou un dérivé de celui-ci, caractérisé en ce qu'il est constitué de l'unité répétitive de séquence (I):

, dans laquelle D-Glcp désigne un résidu D-glucose, D-Galp désigne un résidu D-galactose, L-Fucp désigne un résidu L-fucose, et D-GlcpA désigne un résidu d'acide D-glucuronique, n ayant une valeur telle que le poids moléculaire dudit oligosaccharide soit de 5kd..

En outre, la présente invention a pour objet les compositions cosmétiques et/ou pharmaceutiques qui contiennent au moins ce nouvel agent apaisant cosmétique et/ou dermatologique, éventuellement en association ou en mélange avec un ou plusieurs excipients ou véhicules cosmétiques et/ou pharmaceutiques appropriés, pour l'application sur la peau, les muqueuses ou les phanères. De telles compositions se rapportent notamment au soin et/ou au traitement de la peau, y compris des lèvres et des phanères (ongles, cheveux..).

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La présente invention concerne également l'utilisation de ce composé oligosaccharidique comme agent apaisant, notamment par ses propriétés inflammatoires et stimulantes de la libération des P-endorphines par les kératinocytes. Ce nouvel agent cosmétique et/ou dermatologique permet, par là même, de lutter contre le stress cellulaire.

On sait que la peau, directement en contact avec l'environnement, est l'organe le plus exposé aux agressions chimiques, physiques ou biologiques de l'environnement. Ainsi, parmi la grande variété d'agents qui la menacent quotidiennenment, on peut notamment citer des agents chimiques (gaz d'échappement, les émanations industrielles, les fumées de tabac, microparticules nocives en suspension), des agents physiques ( traumatismes, brûlures dues aux expositions solaires, irradiations, hyper ou hypothermie), des facteurs métaboliques (acidose, xénobiotiques, variation hormonale, fatigue, alimentation carencée, stress) et des agents infectieux.

Ces agressions cutanées déclenchent au niveau cellulaire un mécanisme dit de stress cellulaire encore appelé stress oxydatif . Les systèmes naturels de détoxification, de défense et de réparation des cellules ainsi agressées sont alors stimulés pour induire une réponse cellulaire adaptée à l'agent agressant. Cependant, dans un environnement trop agressif, ces systèmes cellulaires s'épuisent ou peuvent s'exacerber en produisant des réactions cutanées incontrôlées et inadaptées à l'agent agressant, et accélèrent le phénomène de mort cellulaire. Ceci se traduit au niveau de la peau par des effets immédiats, notamment de déshydratation, de sensibilité accrue, d'irritations pouvant aller jusqu'à une réaction inflammatoire avec toutes les manifestations inconfortables qui lui sont associées : rougeurs, boutons, démangeaisons, sensation de brûlure,.... Exposée à long terme, la peau ainsi sensible et réactive perd de sa sensibilité, de sa souplesse, de son éclat, et vieillit plus vite.

De nombreuses recherches ont ainsi été menées en cosmétologie et/ou en dermatologie afin d'identifier des substances pouvant aider la peau à résister à ces agressions physiques et/ou chimiques qu'elle subit quotidiennement et à mieux lutter contre ces agents qui en sont la cause.

Le stress cellulaire a des effets particulièrement nocifs en produisant des dérivés de l'oxygène particulièrement toxiques, voire mutagènes pour les cellules. Il s'agit en particulier du radical superoxyde 02-, du peroxyde d'hydrogène H202, du radical hydroxyle HO'. Les mécanismes cellulaires, notamment les systèmes enzymatiques anti-oxydants (catalase, superoxyde

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dismutase,...) et les systèmes de séquestration de métaux lourds ( vitamines C, E, A..) peuvent prévenir la formation de ces radicaux toxiques mais ne peuvent lutter contre les effets néfastes. De nombreuses molécules anti-oxydantes ont d'ailleurs été identifiées telles que les composés polyphénoliques extraits de végétaux et les vitamines C, E et A qui sont également largement utilisées en cosmétologie et dermatologie.

Le stress cellulaire est également géré par des mécanismes de coopération des différentes cellules présentes dans la peau. Ces cellules, dans les différentes strates du tissus cutané, sont capables, en présence d'un agent nocif, de générer une réponse inflammatoire et/ou immunitaire dirigée contre cet agent agressant. De même, de nombreuses molécules inhibitrices de la communication cellulaire ont ainsi été découvertes. Par exemple, on a décrit dans le brevet FR 2823440, un composé stérol capable d'inhiber la migration des cellules impliquées dans la réponse immunitaire et/ou inflammatoire et/ou irritative telles que les dendrocytes dermiques, les monocytes, les lymphocytes, et plus particulièrement les cellules de Langerhans.

La réponse irritative et inflammatoire se manifeste en outre, bien souvent, par des sensations cutanées inconfortables, désagréables, voire douloureuses.

Les (3-endorphines synthétisées par la peau représentent plus de 50% du taux d'endorphines circulantes et sont de ce fait particulièrement intéressantes pour atténuer ou supprimer les phénomènes douloureux. Leur libération peut être déclenchée en réponse à de nombreux signaux, notamment en réponse à un stress cellulaire. Cependant, d'autres mécanismes de libération cellulaire de (3-endorphines existent en l'absence de stress cellulaire. Ces neuromédiateurs constituent de véritables molécules "plaisir" car leur libération est accompagnée d'un effet apaisant ou de soulagement, au niveau local et général.

On a déjà identifié, sans plus de précision, plusieurs extraits d'algues ou de plantes susceptibles d'induire la libération de 0-endorphines. Ainsi, un extrait de cacao (Theobroma cacao), plus particulièrement sous la forme d'extrait hydroglycolique 30/70 titré en caféine et en théobromine et commercialisé sous la marque Caobromine#(CEP) est susceptible de déclencher une libération de (3-endorphines. De même, on a décrit, dans le brevet FR-A1- 2774292, un extrait d'une algue Cyclotella, capable de déclencher une libération de ssendorphines, 16 fois supérieure à celle d'un témoin.

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Ainsi le développement d'agents cosmétiques et/ou dermatologiques susceptibles d'agir, de façon complémentaire, à ces différents niveaux, est d'un grand intérêt en cosmétique et/ou en dermatologie, afin d'aider la peau à lutter contre le stress cellulaire et la réponse irritative et/ou inflammatoire qui peuvent en résulter.

Pour obtenir un effet apaisant efficace, une solution consisterait à inclure dans les compositions cosmétiques et/ou dermatologiques, des agents agissant spécifiquement sur chacune de ces voies. Ceci soulève cependant souvent des problèmes de compatibilité.

Ce problème est résolu selon la présente invention par la découverte d'un nouvel oligosaccharide capable d'agir sur ces trois mécanismes d'action.

La Demanderesse a récemment décrit, dans sa demande de brevet français non publiée n 0207464 et intitulée Nouveau microorganisme de la famille des Enterobacteriaceae , un nouveau polysaccharide de plus de 100 000 daltons dont l'unité répétitive a pour séquence :

, dans laquelle D-Glcp désigne un résidu D-glucose, D-Galp désigne un résidu D-galactose, L-Fucp désigne un résidu L-fucose, et D-GlcpA désigne un résidu d'acide D-glucuronique.

Dans ce brevet, le polysaccharide est utilisé pour ses propriétés rhéologiques. En effet, le polysaccharide présente notamment des propriétés épaissisantes, autoémulsionnantes, et rhéofuidifiantes très similaires à celles du produit dénommé Fucogel ( objet du brevet FR 9500898).

La Demanderesse, a maintenant découvert, de manière particulièrement surprenante, que l'oligosaccharide d'environ 5kd, contrairement au polysaccharide natif dont il est issu par hydrolyse, possède de remarquables propriétés biologiques permettant de l'utiliser comme un principe actif particulièrement efficace contre les manifestations nocives du stress cellulaire.

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De manière tout à fait inattendue, elle a en effet découvert que ce nouvel oligosaccharide est capable de prévenir et/ou de lutter efficacement contre le stress cellulaire notamment par ses effets anti-inflammatoires par inhibition de l'adhésion cellulaire et/ou anti-oxydant et/ou en stimulant la libération des (3-endorphines par les kératinocytes.

Il est connu que les polysaccharides ainsi que leurs dérivés de faible poids moléculaire, d'origine végétale ou bactérienne, extraits d'algues ou produits par synthèse, présentent de nombreuses activités biologiques (immunomodulation, anti-inflammation, ...). Depuis de nombreuses années, ils sont ainsi utilisés pour leurs propriétés potentielles dans de nombreux domaines d'application industrielle, par exemple en tant que gélifiant dans l'agroalimentaire, hydratant, démaquillant, texturant en cosmétique. Cependant, l'influence réelle de la composition et de la nature de ces principes actifs saccharidiques et/ou de leurs dérivés, sur lesdites propriétés biologiques et notamment les mécanismes cellulaires, restait encore à établir.

Ainsi, on a déjà décrit, dans le document WO-A1-0203945, l'utilisation d'oligosaccharides de 2 à 6 sucres contenant au moins deux motifs galactose, notamment ceux extraits de la plante Tephrosia dans une composition cosmétique et/ou dermatologique susceptible de stimuler la libération de (3-endorphines par la peau.

De même, le document FR 2768623 décrit l'utilisation, dans des compositions cosmétiques et/ou dermatologiques, d'un complexe anti-inflammatoire constitué d'au moins un agent antiradicalaire et d'au moins un monosaccharide sous forme de mélange fucose-rhamnose. Ce document indique, sans plus de précision, que ce complexe a un effet apaisant.

Un autre brevet FR 2813885 décrit l'utilisation, dans une composition cosmétique et/ou dermatologique, d'un mélange d'oligosaccharides non sulfatés à base de fucose en position finale, non réductrice, et issu de Klebsiella pneumoniae. Cet oligosaccharide présente la particularité de stimuler la communication cellulaire et la prolifération des kératinocytes.

On doit ainsi constater que les sucres en général et leurs dérivés immédiats induisent des effets cellulaires très variés, parfois antagonistes, et ceci de façon très imprévisible. Aucune de ces études réalisées auparavant sur les oligosaccharides ne permettait ainsi de prévoir un tel effet apaisant, et en particulier anti-oxydant, de l'oligosaccharide de 5kd, objet de la présente invention.

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Ce nouvel agent cosmétique et/ou dermatologique oligosaccharidique, est formé d'unités répétitives hexasaccharidiques constituées de 2 molécules de L-fucose, de 2 molécules de Dgalactose, d'une molécule de D-glucose et d'une molécule d'acide D-glucuronique, ledit oligosaccharide ayant un poids moléculaire d'environ 5kd.

Plus précisément, l'invention a pour objet un nouvel agent apaisant oligosaccharidique et/ou un dérivé de celui-ci, dont l'unité répétitive de formule (I) a pour séquence :

dans laquelle D-Glcp désigne un résidu D-glucose, D-Galp désigne un résidu D-galactose, LFucp désigne un résidu L-fucose, et D-GlcpA désigne un résidu d'acide D-glucuronique. Il est en outre caractérisé en ce qu'il a un poids moléculaire d'environ 5kd.

Selon l'invention, on regroupe sous le terme dérivés , à la fois les produits d'hydrolyse des polysaccharides et les dérivés des sucres obtenus par modification chimique de la structure des saccharides selon l'invention. Cependant, il convient de préciser que les nouveaux dérivés selon l'invention doivent globalement conserver la même unité répétitive que l'oligosaccharide selon l'invention et posséder un poids moléculaire proche de 5kd. Il peut notamment s'agir de dérivés aminés, acides, et des sels de saccharides et/ou des produits d'hydrolyse de poids moléculaire voisin de 5kd et obtenus par modification chimique de l'oligosaccharide, objet de la présente invention.

D'une manière générale, l'oligosaccharide, objet de la présente invention, peut être obtenu par les techniques classiques de production et d'extraction des polysaccharides (synthèse chimique, extraction enzymatique d'exopolysaccharides suivie d'hydrolyse..).

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Selon un mode de réalisation avantageux, l'oligosaccharide est un produit d'hydrolyse de l'exopolysaccharide produit par fermentation de bactéries en produisant, telles que l'entérobactérie Enterobacter species ci-après dénommée BEC 1645, et/ou ses mutants capables de synthétiser le polysaccharide.

Ce microorganisme BEC 1645 est déposé à la Collection Nationale des Cultures de Microorganismes sous le numéro 1-2744 en date du 25 octobre 2001. Il s'agit d'un bacille gram négatif. L'Institut Pasteur a réalisé le séquençage de l'ADNr 16S et a déterminé que cette souche appartient vraisemblablement à la famille des Enterobacteriaceae. Cependant, en l'état actuel des banques de données, il n'a pas été possible de définir de façon certaine le genre ou l'espèce de cette souche. Présentant à la fois 98% d'homologie de séquence avec les souches Enterobacter sp. 16-31 et Enterobacter sp. 3-45, BEC 1645 semble proche du genre Enterobacter. Elle a ainsi la morphologie d'un bacille Gram négatif. Le profil biochimique de cette bactérie, établi par galerie API 20 E, est par ailleurs identique à celui de la bactérie Enterobacter cloacae.

Par mutant , on entend les souches mutantes obtenues à partir de la souche BEC 1645.

Elles peuvent être obtenues soit par sélection de mutants spontanés isolés à partir d'une culture en fermenteur, soit par induction de mutants en soumettant une culture de BEC 1645 à l'action d'un agent mutagène tel qu'un rayonnement énergétique (rayons UV, rayons X) ou un agent chimique ( ozone, acide nitreux,..) Selon un mode particulièrement intéressant, l'exopolysaccharide objet du précédent brevet de la Demanderesse (demande de brevet français n 0207464) est un produit de fermentation aérobie de BEC 1645 et/ou de ses mutants, selon le procédé en trois étapes ci-après résumé et décrit en exemple I.

Une première étape consiste à inoculer une culture de la souche BEC 1645 dans un milieu aqueux nutritif. Ce milieu comporte une source de glucide, telle que notamment du glucose de préférence à une concentration de 2 à 6% du poids du milieu, une source d'azote telle qu' un mélange d'hydrolysat de protéines de blé et un extrait autolytique de levure à une concentration de 0. 05 à 0. 5% du poids du milieu nutritif, et une source de sels minéraux usuels tels que des phosphates, sulfates, chlorures et carbonates de sodium, potassium, ammonium, calcium, magnésium.

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Dans une deuxième étape, la fermentation aérobie de la souche est menée sous agitation et aération, à une température de l'ordre de 25 à 30 C, à un pH d'environ 6. 0 à 7. 5 pendant environ 2 à 6 jours dans un fermenteur.

Enfin, le polysaccharide est isolé par extraction à partir du moût de fermentation. Pour ce faire, le moût de fermentation est soumis à un traitement protéolytique puis autoclavé et refroidi. Afin de séparer le polysaccharide par précipitation , le produit ainsi obtenu est alors traité à l'éthanol ou à l'acétone puis purifié par essorage et lavage. Le produit ainsi purifié est alors remis sous forme de solution aqueuse.

L'oligosaccharide d'environ 5kd, objet de la présente invention, peut ensuite avantageusement être obtenu par hydrolyse acide du polysaccharide natif ainsi obtenu. Cette hydrolyse contrôlée dont le principe est résumé ci-après est réalisée selon les méthodes usuelles.

Les fractions hydrolysées du polysaccharide BEC 1645 sont obtenues en majorité lors de l'hydrolyse du polysaccharide BEC 1645 en présence d'un acide.

Par acide, on entend, selon l'invention, toutes les molécules donneuses de protons et susceptibles d'engendrer une coupure de la liaison saccharidique. Parmi les molécules donneuses de protons, il s'agit notamment des acides dits minéraux, tels que l'acide chlorhydrique, l'acide sulfurique mais également des acides organiques tels que l'acide acétique, l'acide citrique, ou encore des résines acides telles que les résines organiques Amberlyst.

La concentration en polysaccharide lors de l'hydrolyse est préférentiellement comprise entre 1 et 500 g/1 pour une concentration en protons comprise entre 0,1et 5 mole de protons par litre. L'hydrolyse est par ailleurs réalisée à une température comprise entre 50 et 100 C et pendant une durée comprise entre 30 minutes et 8 heures, selon le poids moléculaire de l'oligosaccharide recherché.

Ainsi, on pourra notamment se référer au protocole détaillé en exemple I pour obtenir la fraction de 5 kd. Dans cet exemple, l'hydrolyse a été effectuée pendant 4h, à une concentration de 1 mole de produit protoné par litre pour une concentration en polysaccharide de 50g par litre.

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Les fractions obtenues lors de cette hydrolyse peuvent ensuite être purifiées, si nécessaire, par précipitation éthanolique, par Chromatographie Liquide Haute Performance, par filtration sur membrane ou par toute autre méthode de séparation compatible avec les produits. La Chromatographie Liquide à Haute Performance sera préférentiellement utilisée, selon les méthodes habituelles, pour isoler les fractions de poids moléculaire souhaité.

Sans sortir du cadre de l'invention, l'homme de l'art comprendra qu'il est possible de faire varier légèrement les différents paramètres de l'hydrolyse en milieu acide tout en contrôlant le poids moléculaire des oligosaccharides ainsi obtenus. L'oligosaccharide selon l'invention n'est donc pas nécessairement limité à celui obtenu par le procédé d'hydrolyse précédemment décrit.

Le poids moléculaire des polysaccharides ainsi obtenus peut être évalué par chromatographie d'exclusion sur une colonne Ultrahydrogel 250-7. 8 X 300 mm (Waters), par rapport à une gamme d'étalonnage réalisée par des solutions de polyéthylène glycol de différents poids moléculaires, les conditions opératoires utilisées étant connues de l'homme de l'art.

Selon la présente invention, les oligosaccharides ont un poids moléculaire de l'ordre de 5 000 daltons. Cette valeur n'est cependant pas fixe et l'on pourra tout aussi bien utiliser plus globalement des oligosaccharides de poids moléculaire compris entre 4 et 6 kd. De la même manière, on pourra utiliser l'oligosaccharide sous forme d'un mélange le contenant majoritairement, tel qu'obtenu par le procédé défini précédemment.

Une fraction oligosaccharidique de 15kd a également été testée dans les exemples. Elle est obtenue selon le même procédé en faisant varier les paramètres de l'hydrolyse selon les méthodes habituelles, afin d'obtenir une fraction moins hydrolysée.

Les oligosaccharides ainsi obtenus possèdent la même unité répétitive que le polysaccharide natif selon un enchaînement structural préservé. Le nouvel oligosaccharide, utilisé dans la présente invention, se définit ainsi comme un polymère anionique ramifié d'environ 5kd constitué d'une unité répétitrice formée de résidus de L-fucose, D-galactose, D-glucose et d'acide D-glucuronique selon un rapport molaire respectivement de 2 :2 :1 :1. (structure présentée en exemple II) L'oligosaccharide diffère du polysaccharide en ce qu'il a un poids moléculaire de 5kd et en ce qu'il possède de remarquables et très étonnantes propriétés apaisantes, comme en témoignent les tests présentés dans les exemples III à VI.

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Par propriétés apaisantes, on entend selon l'invention les propriétés permettant de prévenir et/ou de calmer les sensations inconfortables de la peau et ou des phanères, tels que notamment, les irritations, les inflammations, et les douleurs. Ainsi il s'agit notamment de la capacité à stimuler la sécrétion des (3-endorphines et à diminuer l'inflammation par un mécanisme d'inhibition de l'adhésion cellulaire, notamment des lymphocytes T aux cellules endothéliales, et par un mécanisme anti-oxydant.

On a en effet constaté (exemple IV) que l'oligosaccharide provoque une augmentation significative et importante de la libération de [3-endorphines par les kératinocytes, à une concentration d' au moins environ 0. 01% en poids de l'échantillon. Les études préalables(exemple III) sur kératinocytes isolés ont montré l'absence de cytotoxicité à des concentrations inférieures à 0. 5%. Ainsi, à des concentrations comprises entre 0. 01 et 0.5%, l'oligosaccharide a un effet stimulant indépendant du stress cellulaire, et réellement dû à son interaction avec les récepteurs des kératinocytes.

L'absence de résultats significatifs avec les tests effectués sur les polynucléaires neutrophiles humains (exemple VI B) et sur les mastocytes péritonéaux de rats montre que le composé oligosaccharidique exerce son action anti-inflammatoire sans utiliser respectivement ni la voie d'inhibition des prostaglandines ni la voie histaminique.

En revanche, (exemple V A ), l'oligosaccharide présente un effet inhibiteur significatif de l'adhésion des lymphocytes B aux cellules endothéliales ce qui traduit une action antiinflammatoire. En outre, l'oligosaccharide présente des propriétés anti-oxydantes (exemple V) ce qui témoigne d'une autre action anti-inflammatoire de l'oligosaccharide notamment protectrice et réparatrice contre les effets négatifs des dérivés de l'oxygène, produits notamment lors du stress cellulaire.

On peut utiliser l'oligosaccharide et/ou le mélange d'oligosaccharides, éventuellement en solution aqueuse ou incorporé dans une composition cosmétique et/ou dermatologique.

L'oligosaccharide et/ou le mélange d'oligosaccharides peuvent également, dans le cadre de l'invention, être utilisés en tant que principe actif sous forme greffée, notamment par des moyens chimiques de substitution sur la fonction carboxylique libre de l'acide glucuronique, sur un reste chimique, biochimique ou biologique qui ne modifie pas l'effet apaisant. A titre d'exemple, il peut s'agir de chaînes grasses comportant de 6 à 30 atomes de carbone ou de chaînes d'acides aminés. On peut également incorporer les oligosaccharides et/ou leurs dérivés selon l'invention dans une cyclodextrine.

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Du fait de ces remarquables propriétés apaisantes, cet oligosaccharide convient donc particulièrement pour une utilisation comme agent cosmétique et/ou pharmaceutique et plus particulièrement dermatologique, notamment comme agent anti-inflammatoire par son action inhibitrice de l'adhésion cellulaire et plus particulièrement de l'adhésion des lymphocytes B aux cellules endothéliales et par son action anti-oxydante, et comme agent stimulant le libération de [3-endorphines.

L'invention a donc également pour objet les compositions cosmétiques et/ou pharmaceutiques et en particulier dermatologiques comprenant, à titre de principe actif, au moins un composé oligosaccharidique et/ou un mélange d'oligosaccharides tel que précédemment défini, éventuellement en association ou en mélange avec un ou plusieurs excipients ou véhicules cosmétiques et/ou pharmaceutiques appropriés. Ledit polysaccharide et/ou ledit mélange peut être incorporé dans ces compositions à une concentration variant entre 0. 01% et 30% en poids, et de préférence entre 0,01 à 10% en poids total de la composition. La Demanderesse a en effet découvert selon l'étude présentée en exemple IV, qu'il est nécessaire que la composition contienne un minimum d'environ 0,01% d'oligosaccharide et/ou du mélange pour stimuler efficacement la sécrétion de (3-endorphines par les kératinocytes. Selon un mode particulièrement intéressant, on utilisera l'oligosaccharide à une concentration comprise entre 0,1 et 5%en poids total de la composition.

Les compositions selon l'invention peuvent se présenter sous toute forme appropriée pour l'application cutanée, notamment sous la forme d'un gel, d'une émulsion, par exemple, une émulsion huile-dans-eau ou eau-dans-huile, ou sous la forme d'une émulsion multiple, à cristaux liquides ou non. Elles peuvent également être sous la forme de solution aqueuse, de lotion, de lait, de crème, de masque, de mousse. Il est également possible de les utiliser sous la forme de patches.

Selon l'invention, la composition peut en outre comporter les excipients habituels pharmaceutiques et/ou cosmétiques acceptables appropriés. Parmi ces excipients, on peut notamment citer des agents de protection solaire notamment pour la réalisation de soins solaires, des actifs hydrophiles ou lipophiles, des gommes, des résines, des agents tensioactifs, des solvants, des charges telles que l'amidon de riz, des pigments, des agents conservateurs, des huiles essentielles, des agents antioxydants, des colorants, des pigments, des nacres, des paillettes, des parfums, des absorbeurs d'odeur, des agents régulateurs de pH ou des agents neutralisants, des agents pénétrants, des agents épaississants, tels que ceux habituellement utilisés.

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Le choix et/ou la quantité d'ingrédients, complémentaires à la composition, seront naturellement déterminés par le choix des propriétés physiques et de la consistance souhaitée pour la composition conforme à l'invention. On emploie les différents adjuvants dans des proportions classiquement utilisées dans le domaine de la cosmétique, à savoir par exemple de 0. 01 à 20 % du poids total de la composition, le complément étant~constitué par un véhicule tel que l'eau ou un mélange eau-alcool.

Tout autre produit influençant positivement la libération de (3-endorphines peut également être incorporé dans la composition selon l'invention, notamment l'extrait de cacao commercialisé sous le nom Caobromine (CEP).

En outre, la composition peut encore contenir un deuxième principe actif compatible, notamment pour un usage dermatologique, afin de conférer une double propriété à la composition ou afin de limiter les sensations inconfortables qui seraient liées à l'application de ce deuxième principe actif. A titre d'exemples de principes actifs, on peut notamment citer les antiseptiques locaux tels que la chlorhexidine, les anti-acnéiques locaux tels que la trétinoïne, un antibactérien local tels que le sulfacétamide ou le peroxyde de benzoyle pour réduire leurs effets secondaires d'irritation locale, un anti-inflammatoire local tel que l'ibuprofène. Le deuxième principe actif est ajouté à la composition en une quantité thérapeutique habituellement efficace.

La composition selon l'invention peut être réalisée de manière conventionnelle, selon les procédés connus, habituellement utilisés dans le domaine de la cosmétologie et/ou de la dermatologie.

Dans le domaine cosmétique, les compositions peuvent être utilisées pour le soin quotidien et/ou le traitement et/ou la protection de la peau du corps et/ou du visage et/ou des phanères(ongles, poils, cheveux..). En stimulant la production de (3-endorphines et par ses actions anti-inflammatoires, ces compositions présentent des propriétés apaisantes, calmantes, notamment de l'inconfort cutané pouvant résulter par exemple d'irritations, de rougeurs et d'agressions de la peau, en particulier par des agents extérieurs tels que certains traitements thérapeutiques, les agents climatiques (le vent, le froid, les coups de soleil,..), les épilations, les rasages, les piqûres d'insectes...et procurent ainsi une sensation de bien-être. Elles peuvent donc particulièrement être utilisées pour le soin des peaux sensibles ou sensibilisées.

En effet, elle les apaise efficacement, normalise les rougeurs, et favorise leur résistance.

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De telles compositions procurent également un effet analgésique local et peuvent en outre être utilisées dans le domaine pharmaceutique et plus particulièrement dermatologique pour soulager les douleurs cutanées et/ou sous-cutanées, pour supprimer la perception désagréable des réactions cutanées, les sensations d'inconfort de la peau qui se manifestent notamment dans les cas d'allergies, de prurit, de démangeaisons, de piqûres d'insectes.

L'invention a donc également pour objet l'utilisation de l'oligosaccharide et/ou du mélange d'oligosaccharides selon l'invention pour la réalisation d'un médicament destiné à traiter les réactions d'irritations et d'inflammations et/ou à soulager des douleurs cutanées et/ou souscutanées, de la peau et/ou des phanères, et/ou à supprimer les sensations d'inconfort de la peau (allergies, prurit, irritations, douleurs cutanées liées à des brûlures, piqûres, gerçures, coupures ...) par application topique.

Par application topique, on entend selon l'invention l'application sur toute surface corporelle kératinisée à protéger, soigner et/ou traiter telle que notamment la peau y compris des lèvres et du cuir chevelu, les muqueuses, les cils, les sourcils, les poils, les ongles.

Selon un autre aspect, l'invention concerne également un procédé de soin cosmétique comprenant l'application sur une zone de la peau et/ou des phanères concernée notamment irritée ou douloureuse d'au moins un composé actif précédemment défini dans un excipient cosmétiquement acceptable ou éventuellement sous la forme d'une des compositions cosmétiques précédemment définies.

Les compositions selon l'invention ne présentent aucune toxicité et n'entraînent aucune intolérance locale. Elles ne sont pas non plus allergisantes.

Les exemples et les préparations suivants illustrent l'invention sans la limiter aucunement.

Dans les exemples et les préparations, les proportions indiquées sont des pourcentages en volume/volume sauf mention contraire.

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Exemple 1 : Exemple de protocole de synthèse de l'oligosaccharide selon l'invention de poids moléculaire d'environ 5kd.

Fermentation : Le polysaccharide est produit par la souche BEC 1645, par fermentation d'un milieu à base de glucose.

-1) Milieu de culture : Le milieu de culture a la composition suivante: Glucose 30 g/1 Peptone de blé 3 g/1 autolysat de levure 1 g/1 K2S04 1 g/1 NaCI 1 g/1 MgS04 7 H20 0,2 g/1 CaCl2 0,002 g/1 Afin d'éviter le développement de coloration trop importante du milieu de culture, celui-ci a été stérilisé en deux étapes distinctes: - Stérilisation d'une solution concentrée de glucose (200 g/1) (20 minutes à 120 C) - Stérilisation d'une solution des autres constituants (sels et sources azotées) (20 minutes à 120 C).

Les deux solutions sont mélangées pour obtenir un milieu de culture de composition précitée.

-2) Inoculation et fermentation : Une colonie de la bactérie BEC 1645 (CNCM 1-2744) préalablement cultivée sur milieu gélosé est inoculée dans 500 ml du milieu de culture ainsi préparé. L'ensemble est incubé, sous agitation, à 25 C, pendant 15 heures environ.

Un volume de 12 litres de milieu de culture disposé dans une cuve de fermentation Biolafitte d'un volume utile de 12 litres est alors inoculé avec 500 ml d'inoculum, puis placé en fermentation dans les conditions suivantes : - température 25 C - Aération 1,5 vvm (18 1 d'air/mn) - pH 7,00 (régulé par une solution de soude) - temps 72 à 96 heures En fin de culture, on mesure une viscosité du milieu de 10000 Mpa. s à 30 C, et une teneur en fucose de 1,5 à 2 g/1, soit une teneur en polysaccharide d'environ 6 g/1.

<Desc/Clms Page number 15>

- Extraction du polysaccharide : Le pH du moût de fermentation (12 litres) est ajusté à 8,5 puis est soumis à un traitement protéolytique à une température comprise entre 50 C et 60 C pendant 3 heures à l'aide de 12 ml d'Alcalase (subtilisine A de Bacillus licheniformis vendue par la société NOVO NORDISK).

Le moût de fermentation est ensuite autoclavé à 120 C pendant 20 minutes. Après refroidissement, on ajoute 480 g de chlorure de sodium. On ajoute ensuite 24 litres d'éthanol à 95ù, soit 2 volumes par volume de moût. Le polysaccharide précipite, et après décantation pendant quelques heures, on élimine le surnageant. Le précipité est ensuite essoré et lavé sur Büchner. Le précipité est alors séché en étuve à 40 C pendant 24 à 48 heures. Le polysaccharide se présente alors sous forme d'une poudre ayant une teneur en fucose d'environ 20 %.

Cette poudre peut ensuite être mise en solution dans l'eau à une concentration de 1 % par exemple. La viscosité de cette solution est d'environ 1000 à 2000 Mpa. s (Viscosimètre Brookfield DV-II+ modèle LV, mobile SP 31, chambre SC4-31/13R, 30 C).

Hydrolyse acide pour l'obtention de l'oligosaccharide de 5kd : L'acide chlorhydrique est mis dans le milieu réactionnel à la concentration de 1 molaire. Le polysaccharide est dans ce milieu à la concentration de 50g par litre en solution aqueuse. La réaction est menée pendant 4 heures à la température de 100 C, sous agitation. L'hydrolyse est stoppée par l'ajout d'une même quantité de soude normale. On extrait par précipitation éthanolique et filtration, un mélange de fractions contenant majoritairement l'oligosaccharide de 5kd. La fraction oligosaccharidique de poids moléculaire spécifique de 5 000 daltons peut être isolée selon les méthodes habituelles de Chromatographie Liquide à Haute Performance.

L'oligosaccharide peut de même être séché sous forme de poudre.

Dans les exemples suivants, on utilise le mélange d'oligosaccharides de 5 kd ainsi obtenu en solution aqueuse et à la concentration indiquée en pourcentage pondéral d'oligosaccharide par rapport au poids total de la solution.

Le mélange d'oligosaccharides contenant majoritairement le fraction de 15kd a également été testé dans les exemples suivants. Il est obtenu selon le même protocole d'hydrolyse, à la seule différence que la réaction d'hydrolyse est effectuée pendant 2 heures. Elle est utilisée dans les exemples suivants en solution aqueuse à la concentration indiquée en pourcentage pondéral de polysaccharide par rapport au poids total de la solution.

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Exemple II : Structure de l'unité répétitive de l'oligosaccharide issu du polysaccharide produit par BEC 1645, et déposée à la Collection Nationale des Cultures des Microorganismes sous le numéro 1-2744 La composition de l'oligosaccharide a été étudiée par chromatographie en phase gazeuse GC et par chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (GC/MS) des produits de dégradation après perméthylation de la molécule native. La méthode de dégradation des acides uroniques par (3-élimination après perméthylation (décrite par Aspinall GO et al. Carbohydr Res. 1977 May;55:11-9) a été utilisée. La séquence a été déterminée par résonance magnétique nucléaire (RMN).

Le poids moléculaire de l'oligosaccharide a été déterminé par chromatographie d'exclusion sur une colonne Ultrahydrogel 250-7. 8 X 300 mm (Waters) par rapport à une gamme d'étalonnage réalisée avec des solutions de polyéthylène glycol de différents poids moléculaires, selon les conditions habituelles.

De structure ramifiée, la séquence constitutive comporte deux molécules de fucose (II, III), deux molécules de galactose ( IV et VI), une molécule de glucose ( I) et une molécule d'acide glucuronique (V).

L'unité répétitive du polysaccharide et de l'oligosaccharide a donc la séquence ramifiée de formule ( I) suivante :

dans laquelle D-Glcp désigne un résidu D-glucose, D-Galp désigne un résidu D-galactose, LFucp désigne un résidu L-fucose, et D-GlcpA désigne un résidu d'acide D-glucuronique,.

Dans l'oligosaccharide selon l'invention, n a une valeur telle que l'oligosaccharide ait un poids moléculaire de l'ordre de 5 kd.

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Exemple III: Etude de l'effet produit par l'oligosaccharide de 5kd selon l'invention sur la viabilité des kératinocytes humains normaux en culture.

- Principe du test : Il s'agit, par ce test, de quantifier la viabilité et la prolifération cellulaire de kératinocytes en culture. Pour ce faire, on utilise le système XTT (sel de tétrazolium) qui fait intervenir l'activité déshydrogénasique des mitochondries. Le clivage du sel de XTT, par le système "succinate tétrazolium déshydrogénase" présent dans la chaîne respiratoire des cellules métaboliquement actives (donc vivantes), donne naissance à un dérivé de formazan dont la coloration est mesurée par spectrophotométrie.

- Protocole: Après la mise en culture des kératinocytes humains jusqu'à l'obtention de cellules confluentes à 70%, l'oligosaccharide est ajouté à différentes concentrations dans le milieu de culture. En parallèle, un témoin non exposé (sans oligosaccharide) est réalisé. Le réactif est enfin ajouté après 24 heures d'incubation et on mesure l'absorbance à 450 nm après 4 heures.

Résultat : Les concentrations des oligosaccharides sont données en pourcentage.

La viabilité cellulaire est exprimée en pourcentage par rapport au témoin.

<tb>
<tb>

Concentration <SEP> en <SEP> 1% <SEP> 0. <SEP> 5% <SEP> 0.1% <SEP> 0. <SEP> 05% <SEP> 0.01%
<tb> oligosaccharide
<tb> Fraction <SEP> de <SEP> 5 <SEP> kd <SEP> :
<tb> Viabilité <SEP> en <SEP> % <SEP> 62% <SEP> 79% <SEP> 124% <SEP> 116% <SEP> 98%
<tb> Valeur <SEP> de <SEP> p <SEP> p<0.01 <SEP> pO.Ol <SEP> 0. <SEP> 11 <SEP> 0. <SEP> 1 <SEP> 0. <SEP> 6
<tb> Validation <SEP> S <SEP> S <SEP> NS <SEP> NS <SEP> NS
<tb> Fraction <SEP> de <SEP> 15 <SEP> kd <SEP> :
<tb> Viabilité <SEP> en <SEP> % <SEP> 114%- <SEP> 118%- <SEP> 120%
<tb> Valeur <SEP> de <SEP> p <SEP> p<0.1 <SEP> p<0.01 <SEP> 0. <SEP> 085
<tb> validation <SEP> S <SEP> S <SEP> NS <SEP>
<tb>
S : le résultat est significativement différent de celui obtenu avec le témoin, selon la valeur p.

NS : le résultat n'est pas significativement différent de celui obtenu avec le témoin, selon la valeur p.

Ainsi, l'oligosaccharide de poids moléculaire de 5 kd présente une cytotoxicité significative à partir de 0,5% (p/v) dans ce modèle mais n'a pas d'effet sur la viabilité des cellules pour de plus faibles pourcentages d'utilisation. Les kératinocytes isolés étant particulièrement sensibles aux molécules qui les environnent, il n'est cependant pas possible de conclure à l'existence de toxicité au delà de 0,. 5% en application réelle.

L'oligosaccharide de poids moléculaire de 15 kd, ne présente en revanche aucune cytotoxicité aux concentrations testées. Il stimule même légèrement et de manière significative, la croissance des kératinocytes aux plus fortes concentrations testées.

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Exemple IV : de l'effet de l'oligosaccharide de 5kd selon l'invention sur la libération de (3-endorphines par les kératinocytes.

- Mode opératoire : Des kératinocytes humains normaux sont mis en culture pendant 48 heures jusqu'à confluence à 80%. Ils sont traités pendant 36 heures avec le produit à tester. Les surnageants, contenant la (3-endorphine, sont recueillis et conservés à -20 C jusqu'au dosage. Le témoin du test est réalisé en traitant les kératinocytes avec l'excipient (butylène glycol 70%) à 2%. Le dosage est effectué avec un kit ELISA (dosage spectrophotométrique à 450 nm).

Les résultats sont exprimés en picogrammes par litre de (3-endorphine synthétisée.

Les études préalables de cytotoxicité (exemple III) effectuées systématiquement pour ces concentrations permettent de déterminer si les effets du produit sont liés à un effet cytotoxique. Un témoin positif de libération de (3-endorphines a par ailleurs été réalisé en utilisant du dibutyril-cAMP à 2mM qui, en tant qu'agent agressant des kératinocytes, induit la libération de (3-endorphines par un mécanisme de stress cellulaire.

- Préparation de l'oligosaccharide: La fraction hydrolysée de 5 kdaltons est majoritairement obtenue lors de l'hydrolyse acide selon le procédé décrit précédemment (exemple I).

L'oligosaccharide, sous forme de mélange contenant majoritairement la fraction de 5kd, a ainsi été testé aux concentrations de 0,01%, 0,05% et 0,1%.

Le polysaccharide natif et la fraction de 15kd ont été testés à différentes concentrations : 0.01%, 0.05 et 0.1 %. La fraction 15kd a été obtenue par hydrolyse du polysaccharide dans les conditions décrites à l'exemple (I) pendant 2 heures environ.

- Résultats :

<tb>
<tb> Essais <SEP> Témoin <SEP> Témoin <SEP> positif <SEP> Fraction <SEP> oligosaccharidique <SEP> de <SEP> 5kd
<tb> % <SEP> - <SEP> 0,1% <SEP> 0. <SEP> 05% <SEP> 0. <SEP> 01%
<tb> Moyenne <SEP> 114 <SEP> 189 <SEP> 226 <SEP> 227 <SEP> 247
<tb> Ecart <SEP> type <SEP> 36 <SEP> 10 <SEP> 60- <SEP> 55 <SEP> 39
<tb> % <SEP> de <SEP> stimulation <SEP> par- <SEP> +66% <SEP> +98% <SEP> +98% <SEP> +117%
<tb> rapport <SEP> au <SEP> témoin <SEP> S <SEP> S <SEP> S <SEP> S
<tb>
S désigne les résultats significatifs et NS les résultats non significatifs.

<Desc/Clms Page number 19>

<tb>
<tb>

Essais <SEP> Témoin <SEP> Témoin <SEP> positif <SEP> Fraction <SEP> oligosaccharidique <SEP> de <SEP> 15kd
<tb> %- <SEP> 0,1% <SEP> 0. <SEP> 05% <SEP> 0. <SEP> 01%
<tb> Moyenne <SEP> 305 <SEP> 350 <SEP> 289 <SEP> 291 <SEP> 333
<tb> Ecart <SEP> type <SEP> 42 <SEP> 47 <SEP> 47- <SEP> 35 <SEP> 31
<tb> % <SEP> de <SEP> - <SEP> +15% <SEP> -5%-5% <SEP> +9%
<tb> stimulation <SEP> S <SEP> NS <SEP> NS <SEP> NS
<tb> par <SEP> rapport
<tb> au <SEP> témoin
<tb>
S désigne les résultats significatifs et NS les résultats non significatifs.

Le polysaccharide natif a également été testé à différentes concentrations 0. 01 et 0.1%. Aucun résultat significatif n'a été obtenu à ces concentrations.

Il ressort de ces résultats que la fraction 5 kd, à la différence de la fraction oligosaccharidique de 15kd et du polysaccharide dont elle est issue, provoque une augmentation significative et importante de la libération de (3-endorphines par les kératinocytes, à une concentration d'environ au moins 0. 01% en poids de l'échantillon. Les études préalables ont montré l'absence de cytotoxicité à des concentrations inférieures à 0,5% et confirment donc que l'effet de la fraction entre 0. 01 et 0. 5% n'est pas dû à un stress cellulaire, mais bien à son interaction avec les récepteurs des kératinocytes.

Exemple V : de l'effet de l'oligosaccharide de 5kd selon l'invention sur l'adhésion de lymphocytes T (CEMT 4) sur des cellules endothéliales de peau.

A. Test de la fractalkine - Principe du test : Afin de déterminer les effets de molécules sur les cellules endothéliales de la peau, un modèle d'étude in vitro du processus inflammatoire est réalisé. Il s'agit de mimer l'état inflammatoire en activant au préalable les cellules par des cytokines et/ou des chimiokines et d'observer les effets des molécules testées sur le recrutement de lymphocytes CEMT4 sur les cellules endothéliales activées.

La fractalkine est le composé utilisé pour activer les cellules endothéliales de peau.

- Protocole : Les cellules endothéliales sont ensemencées dans des plaques de 24 puits. Vingt quatre heures après, elles sont incubées pendant 16 heures avec de la fractalkine à 100ng/ml diluée dans du milieu OPTIMEME sans antibiotique et sans sérum. A la fin de l'incubation avec la fractalkine, le milieu est retiré et remplacé par du milieu OPTIMEM contenant les molécules

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à tester à savoir l'oligosaccharide. Après 5 heures d'incubation, le test d'adhésion est réalisé et se déroule selon les étapes suivantes: a Les lymphocytes T marqués au tritium sont introduits sur la culture de cellules endothéliales # Incubation 30 minutes à température ambiante # Lavage afin d'éliminer les cellules non adhérentes # Décollement enzymatique des cellules endothéliales (avec ou sans lymphocytes T adhérents à leur surface) # Comptage des lymphocytes T adhérents aux cellules endothéliales par Cytométrie de flux (FACS), les lymphocytes T marqués émettant un signal particulier Les concentrations testées ont été choisies après étude de la viabilité des cellules endothéliales en présence des molécules testées. Les essais ont été réalisés dans 2 conditions : endothéliales non activées ou activées par chimiokines (fractalkine) afin de mimer l'état inflammatoire.

- Résultat : Les résultats sont exprimés en pourcentage d'activation ou d'inhibition par rapport au témoin non activé ou activé (cellules et fractalkine) FRACTALKINE

<tb>
<tb> concentration <SEP> 5 <SEP> kD <SEP> 15 <SEP> kD
<tb> 10 <SEP> ng/ml
<tb> non <SEP> activées <SEP> -21% <SEP> NS
<tb> activées <SEP> RAS <SEP> NS
<tb> 1 <SEP> ng/ml
<tb> non <SEP> activées <SEP> NS <SEP> 30%
<tb> activées <SEP> NS <SEP> -12%
<tb> 100 <SEP> pg/ml
<tb> non <SEP> activées <SEP> 52% <SEP> 22%
<tb> activées <SEP> -17% <SEP> NS
<tb> 10 <SEP> pg/ml
<tb> non <SEP> activées <SEP> NS <SEP> NT
<tb> activées <SEP> NS <SEP> NT
<tb>
NT : non traité NS : pas d'effet ou non significatif

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Sous forme graphique, l'effet induit par l'oligosaccharide 5kd, dans ce modèle inflammatoire, a ainsi l'aspect d'une courbe Gaussienne notamment pour les cellules non activées, caractéristique de l'existence d'un second messager cellulaire.

B. Test de l'activation par H202 - Principe du test : Il s'agit dans ce cas de mimer un stress oxydatif qui aboutit dans la plupart des cas à une réponse de type inflammatoire.

- Protocole : Les cellules endothéliales de peau sont incubées 1 heure avec H2O2 100 M seule puis 11 heures en milieu complet puis 5 heures en présence des produits à l'essai (les oligosaccharides). Le test d'adhésion est réalisé ensuite dans les conditions habituelles.

L'évaluation du stress peut également être effectué par dosage de la production de l'oxyde nitrique intracellulaire après incubation des cellules avec H2O2. Le dosage est réalisé par l'intermédiaire du DAF-FM, composé qui fluoresce lorsqu'il se couple à l'oxyde nitrique, et l'analyse est réalisée par FACS. A l'issue des 16 heures d'activation, les cellules sont incubées 1 heure à 37 C avec une solution 1 M de DAF-FM. Les cellules sont ensuite lavées avec du PBS et décollées pour analyse en FACS.

Résultat : Les résultats sont exprimés en pourcentage d'activation ou d'inhibition par rapport au témoin non activé ou activé (cellules et H202) H202

<tb>
<tb> ~ <SEP> ~ <SEP> 5 <SEP> kD <SEP> 5kD
<tb> 1 <SEP> Concentration <SEP> 1 <SEP> ng/ml <SEP> 10 <SEP> ng/ml <SEP>
<tb> Adhésion
<tb> sans <SEP> H2O2 <SEP> 0 <SEP> 0%
<tb> avec <SEP> H2O2 <SEP> -37% <SEP> 18%
<tb> NO <SEP> intracellulaire
<tb> sans <SEP> H2O2 <SEP> 68% <SEP> 0%
<tb> avec <SEP> H2O2 <SEP> 5% <SEP> 0%
<tb>
NT : non traité NS : pas d'effet ou non significatif L'oligosaccharide de 5 kd dans ce modèle manifeste une activité anti-oxydante efficace aux concentrations testées.

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Ainsi ces deux tests témoignent de l'activité anti-inflammatoire efficace de l'oligosaccharide de 5kd par son action inhibitrice de l'adhésion des lymphocytes B aux cellules endothéliales et par son action anti-radicalaire, et ce à des doses extrêmement faibles.

Exemple VI : Etude de l'influence des oligosaccharides sur la libération de certains messagers de l'inflammation
A. Influence des oligosacharides de 15kd et de 5kd sur la libération d'histamine par des mastocytes péritonéaux de rat.

- Principe du test : On étudie ici les effets inhibiteurs de l'oligosaccharide sur l'inflammation neurogène. Pour ce faire, on détermine in vitro, si l'oligosaccharide inhibe la dégranulation des mastocytes péritonéaux de rat induite par la substance P. Les mastocytes péritonéaux de rat sont considérés en pharmacologie comme un modèle classique des mastocytes cutanés humains.

L'activation des mastocytes peut non seulement faire intervenir la stimulation de leurs récepteurs spécifiques des IgE mais également leur réactivité à différents peptides. Ainsi, la voie d'activation peptidergique des mastocytes constitue la seconde voie d'activation physiologique de ces cellules, à côté de la voie dépendante des IgE (voie antigénique).

- Protocole : Les mastocytes péritonéaux de rat sont obtenus par lavage après injection d'une solution de Tyrode. Les mastocytes représentent de 8 à 10 % des cellules péritonéales, composées également de macrophages, lymphocytes et monocytes. Les mastocytes sont purifiés sur un coussin de métrizamide à 22,5 % puis remis en suspension dans une solution de Tyrode.

Les mastocytes sont préincubés (5 min; 37 C au bain-marie) avec un témoin (le tampon Tyrode), avec différentes concentrations d'oligosaccharide, dans le tampon Tyrode.

Les mastocytes sont ensuite stimulés par la substance P (5 min; 37 C). De l'acide perchlorique (0,4N final) est ajouté sur les culots et les surnageants cellulaires puis l'histamine est mesurée par une méthode spectrofluorométrique.

- Résultat : Aux concentrations non cytotoxiques testées (0. 01, 0. 05 et 0.1% p/v), les oligosaccharides n'influencent pas la libération d'histamine.

B. Influence des oligosaccharides de 15kd et de 5kd, sur la libération de PGE2 par des polynucléaires neutrophiles humains.

Protocole :

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Des neutrophiles humains normaux sont mis en culture à 37 C pendant 15 minutes en présence des produits suivants : -l'oligosaccharide de 5kd 1645 à 0.01% (v/v), 0. 05% (v/v), et 0.1% (v/v) - l'indométhacine à 1 M (molécule anti-inflammatoire de référence) Ils sont stimulés par ajout de Zymosan (1 mg/ml) pendant 10 minutes.

Le milieu est ensuite dosé en prostaglandines PEG2 par radio-immuno-essai (SPIBIO).

-Résultat : Aux concentrations non cytotoxiques testées (0. 01, 0. 05 et 0.1% p/v), les oligosaccharides n'ont aucune influence sur la libération de PGE2 par les cellules.

Exemple VI : Exemples de formulations cosmétiques selon l'invention.

Ces préparations ont été obtenues par mélange des ingrédients.

L'oligosaccharide utilisé est obtenu selon le procédé décrit en exemple I.

Gelée hydratante pour peaux sensibles Phase A : Eau déminéralisée qsp 100% Dihydrogenoéthylènediamine tetraacétate disodique 0,2% Urée 3,00% Glycérol 1,50% Carbomer 1,00% oligosaccharide de 5kd 3,00% conservateurs qsp triéthanolamine 0.1 % Phase B : Mélange de PCA* de Sodium, de Magnésium, de Zinc et de Manganèse 1,00% Polysorbate 20 3,00% Parfum 0,15% Lait solaire Phase A : PEG-30 Dipolyhydroxystearate 2,00% Isohexadecane 8,00% Methoxycinnamate d'octyle 5,00% Huile de monoï 4,00% Butyl Methoxydibenzoylmethane 1,50% conservateurs qsp

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Phase B : Eau déminéralisée qsp 100% Disodium Dihydrogenoethylènediamine tétraacétate 0,2% Glycérol 1,50% Sulfate de magnésium heptahydraté 0,70% Oligosaccharide 5kd 2,00% conservateurs qsp Phase C : Eau déminéralisée 15,00% Acide Phenylbenzimidazole Sulfonique 1,50% Soude qs pH Phase D : Fucogel 1000 ( Polysaccharide riche en fucose) 4,00% Phase E : Silica Dimethyl Silylate 0,30% * : PCA=acide pyrrolidone-carboxylique Exemple VII : de formulations dermatologiques selon l'invention.

Ces préparations ont été obtenues par mélange des ingrédients.

Pommade bien-être anti-moustique : Oligosaccharide 5kd 1% repellent 3535 (acetylaminopropionate d'ethylbutyl) 15% filtre solaire UV B 2% essence de lavande 0.4% enoxolone 0.5% excipient qsp 100 Crème apaisante antibactérienne cutanée pour peaux lésées ou infectées p-aminophényl sulfamide 2% Oligosaccharide 5kd 2% Butylhydroxyanisole 0.05% Alcool cétylique 1 % Glycérol 0.75% Paraffine liquide 2% Sorbate de potassium 0.02% Polysorbate 60 0.5% Vaseline 0.4% Eau purifiée qsp 100

Claims (17)

1. REVENDICATIONS : 1. Nouvel oligosaccharide, dont l'unité répétitive est un hexasaccharide constitué de 2 molécules de L-fucose, de 2 molécules de D-galactose, d'une molécule de D-glucose et d'une molécule d'acide D-glucuronique et de poids moléculaire de l'ordre de 5kd.
2. 2. Nouvel oligosaccharide selon la revendication 1, caractérisé en ce que son unité répétitive a une séquence de formule (I ):

   

   dans laquelle D-GlcpA désigne un résidu d'acide D-glucuronique, L-Fucp désigne un résidu de L-fucose, D-Glcp désigne un résidu de D-glucose, D-Galp désigne un résidu de

   D-galactose, n étant une valeur telle que ledit oligosaccharide ait un poids moléculaire de

   5kd.
3. 3. Nouvel oligosaccharide selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il est obtenu par hydrolyse du polysaccharide produit par fermentation de la bactérie Enterobacter species déposée à la Collection Nationale des Cultures de Microorganismes sous le numéro 1-2744.
4. 4. Mélange d'oligosaccharides, caractérisé en ce qu'il contient majoritairement l'oligosaccharide de 5kd, défini selon l'une des revendications 1 à 3.
5. 5. Composition cosmétique et/ou pharmaceutique, en particulier dermatologique, caractérisée en ce qu'elle contient au moins un composé actif de type oligosaccharide

   <Desc/Clms Page number 26>

   selon l'une des revendications 1 à 4, seul ou en mélange avec un ou plusieurs excipient(s) ou véhicule (s) et/ou pharmaceutique(s) approprié(s).
6. 6. Composition selon la revendication 5, caractérisée en ce qu'elle contient entre 0.01% et

   30% dudit oligosaccharide et/ou dérivé, en poids total de la composition.
7. 7. Composition selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'elle contient entre 0.01% et

   10% dudit oligosaccharide et/ou dérivé, en poids total de la composition.
8. 8. Composition selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'elle contient de 0.1% à 5% dudit oligosaccharide et/ou dérivé, en poids total de la composition.
9. 9. Utilisation d'au moins un oligosaccharide selon l'une des revendications 1 à 8, comme agent cosmétique et/ou pharmaceutique, notamment dermatologique, en application topique pour apaiser la peau et/ou les phanères.
10. 10. Utilisation d'au moins un oligosaccharide selon l'une des revendications 1 à 8, comme agent cosmétique et/ou pharmaceutique, notamment dermatologique, en application topique pour lutter contre les effets du stress cellulaire.
11. 11. Utilisation d'au moins un oligosaccharide selon l'une des revendications 1 à 8, comme agent cosmétique et/ou pharmaceutique stimulant la libération de (3-endorphines par application cutanée.
12. 12. Utilisation d'au moins un oligosaccharide selon l'une des revendications 1 à 8, comme agent cosmétique et/ou pharmaceutique anti-oxydant par application topique..
13. 13. Utilisation d'au moins un oligosaccharide selon l'une des revendications 1 à 8, comme agent cosmétique et/ou dermatologique inhibiteur de l'adhésion cellulaire par application topique.
14. 14. Utilisation d'au moins un oligosaccharide et/ou d'un dérivé selon l'une des revendications

    1 à 4 pour la fabrication d'un médicament destiné à traiter les réactions d'irritation et/ou à soulager les douleurs de la peau et/ou des phanères et/ou à supprimer les réactions d'inconfort par application topique.
15. 15. Procédé de soin cosmétique, caractérisé en ce qu'il comprend l'application sur une zone de la peau et/ou des phanères irritée ou douloureuse, d'un oligosaccharide selon l'une des

    <Desc/Clms Page number 27>

    revendications 1 à 4, éventuellement en mélange avec un ou plusieurs excipients ou véhicules cosmétiques appropriés, notamment sous la forme d'une composition cosmétique selon l'une des revendications 5 à 8.
16. 16. Procédé d'obtention de l'oligosaccharide selon l'une des revendications 1 à 4 comportant une étape de fermentation aérobie de la bactérie Enterobacter species selon la revendication 3, une étape d'extraction et de séparation du moût de fermentation puis une étape d'hydrolyse.
17. 17. Procédé d'obtention de l'oligosaccharide selon la revendication 16, caractérisé en ce que l'hydrolyse est une hydrolyse acide réalisée à l'aide d'un donneur de protons minéral ou organique à une concentration d'environ 1 mole pour 50g de polysaccharide et à une température comprise entre 50 et 100 C.