WO2018038567A1 - 피부 세포 증식 효과가 증가한 전갈독 융합단백질 및 이를 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선, 피부 탄력 증대 및 항노화 화장료 조성물 - Google Patents

피부 세포 증식 효과가 증가한 전갈독 융합단백질 및 이를 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선, 피부 탄력 증대 및 항노화 화장료 조성물 Download PDF

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Definitions

  • the invention also includes fragments, derivatives and analogues of the human thioredoxin-scorpion fusion protein.
  • fragment refers to a polypeptide that retains the same biological function or activity as the human thioredoxin-scorpion fusion protein of the invention.

Abstract

본 발명은 피부 세포 증식 효과가 증가한 전갈독 융합단백질 및 이를 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선, 탄력 증대 및 항노화 화장료 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 화장료 조성물은 세포 증식 효과가 우수하며, 피부 주름 개선 및 피부 탄력 유지 효과를 증진시킬 수 있는 효과가 있으므로, 추후 기능성 화장품 분야에 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

Description

피부 세포 증식 효과가 증가한 전갈독 융합단백질 및 이를 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선, 피부 탄력 증대 및 항노화 화장료 조성물
본 발명은 피부 세포 증식 효과가 증가한 전갈독 융합단백질 및 이를 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선, 피부 탄력 증대 및 항노화 화장료 조성물에 관한 것이다.
티오레독신(Thioredoxin, TRX)은 모든 생명체에 존재하며 활성부위(Cys-Gly-Pro-Cys)에 두개의 산화-환원 활성이 있는 12kDa의 작은 단백질이다. 시스테인(cysteine, Cys) 티올기(thiol groups)를 포함하는 TRX는 산화-환원 반응에 의존적인 세포사멸의 억제, 산화스트레스 관련 전사인자들의 안정화를 포함한 여러 항산화 반응에 관여한다.
산화 스트레스는 세포 및 생명체의 수명을 결정하는 것으로 알려져 있으며, TRX의 산화-환원 반응에서 보호역할과 수명을 연장하는데 이것의 연관성을 증명하기 위해 정상적인 인간의 피부섬유 모세포에서 shRNA을 통하여 TRX의 발현을 억제시켰다. TRX의 손실이 p16INK4a 및 p53/p21Cip1/Waf1 종양 억제 경로들의 활성화를 통하여 인간의 피부섬유 모세포에서 세포노화를 빠르게 유도할 수 있음을 보여준다. 산화스트레스로부터 세포를 보호하는 기능 외에도 TRX는 세포노화를 억제한다.
인간상피세포성장인자(Human Epidermal Growth Factor, hEGF)는 세포 표면에 존재하는 상피세포성장인자 수용체와 결합하여 상피세포성장인자 수용체의 이합체화(Dimerization)를 유도한다. 이합체의 상피세포성장인자 수용체는 수용체 내에 존재하는 타이로신 키나아제(Tyrosine kinase)를 활성화 시켜 세포 내 신호전달 시스템을 유도하게 된다. 이러한 일련의 과정을 통해 세포 내에서는 해당 작용(Glycolysis)과 단백질 합성 등이 촉진되어 최종적으로 세포의 성장이 진행된다.
피부 재생의 중추적인 역할을 수행하는 인간상피세포성장인자는 노화가 진행될수록 감소한다. 그 결과 피부 세포 증식 및 이동이 감소하여 피부의 노화, 주름 증가, 탄력 감소 등의 원인이 될 수 있으며, 현재에는 피부세포 성장을 촉진하는 의약품 또는 기능성 화장품으로 사용하고 있다.
과대한 양의 독 사용은 인체에 피해를 줄 수 있으나 적정량의 사용은 인체에 유용할 수 있다. 독소에 대한 지속적인 연구는 의학분야에 한정되어 왔으나, 현재는 코스메틱 산업, 특히 스킨케어 분야에 이르기까지 많은 연구가 진행되고 있다. 보툴리눔 톡신과 거미독 단백질은 피부 주름 개선 및 피부 탄력 유지용 신소재로 사용되고 있다. 거미독 단백질 또한 피부 세포 증식 효과가 우수한 것으로 확인되었다.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 인간 티오레독신의 항산화 효과로 인한 노화 방지 기능 및 인간상피세포성장인자의 피부 재생 기능을 전갈독 단백질과 융합시켜 전갈독 단백질의 피부 세포 증식 효과를 극대화 하고자 새로운 단백질 개발을 진행한 결과, 인간 티오레독신의 항산화 효과로 인한 노화 방지 기능과 인간상피세포성장인자의 피부 재생 효과를 전갈독 단백질의 피부 세포 증식 효과와 접목하여 새로운 인간 티오레독신과 전갈독을 포함하는 융합단백질 및 인간상피세포성장인자와 전갈독을 포함하는 융합단백질 개발에 성공하였다. 또한, 이를 화장료 조성물로 사용하여 피부에 도포 시 안전성 및 노화 방지 효능과 피부 재생(주름 개선) 및 피부 탄력 증대 기능을 모두 확인하여 최종적으로 본 발명을 완성하였다.
한편, 한국공개특허 제2012-0114397호에는 '클로로톡신 폴리펩티드 및 그의 접합체 및 용도'가 개시되어 있고, 한국공개특허 제2015-0056022호에는 '상피세포 성장인자의 융합단백질을 포함하는 피부개선용 화장료 조성물'이 개시되어 있으나, 본 발명의 피부 세포 증식 효과가 증가한 전갈독 융합단백질 및 이를 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선, 피부 탄력 증대 및 항노화 화장료 조성물에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 피부 주름 개선과 피부 탄력 증대 및 노화 방지 효능을 가지는 신규 인간 티오레독신과 전갈독을 포함하는 융합단백질 및 인간상피세포성장인자와 전갈독을 포함하는 융합단백질을 개발하였으며, 상기 융합단백질들이 피부 주름 개선 기능과 피부 탄력 증대 및 노화 방지에 효과적임을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 피부 세포 증식 및 항산화 효과가 증가한 인간 티오레독신-전갈독 융합단백질을 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 피부 세포 증식 효과가 증가한 인간상피세포성장인자-전갈독 융합단백질을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 인간 티오레독신-전갈독 융합단백질 또는 인간상피세포성장인자-전갈독 융합단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환시켜 인간 티오레독신-전갈독 융합단백질 또는 인간상피세포성장인자-전갈독 융합단백질을 코딩하는 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는, 숙주세포에서 인간 티오레독신-전갈독 융합단백질 또는 인간상피세포성장인자-전갈독 융합단백질의 생산 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 생산된 인간 티오레독신-전갈독 융합단백질 또는 인간상피세포성장인자-전갈독 융합단백질을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 피부 세포 증식 효과와 항산화 기능이 증가한 인간 티오레독신-전갈독 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 개선, 피부 탄력 증대 및 항노화 기능의 화장료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 피부 세포 증식 효과가 증가한 인간상피세포성장인자-전갈독 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 개선과 피부 탄력 증대 기능의 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 인간 티오레독신과 전갈독을 포함하는 융합단백질 및 인간상피세포성장인자와 전갈독을 포함하는 융합단백질은 대장균 내에서 응집체(Inclusion bodies) 형태의 단백질로 발현하여, 융합단백질의 불안정성 해결과 함께 생산공정을 간소화하였다. 또한 상기 융합단백질은 피부 재생 효과를 통한 주름 개선과 피부 탄력 증대 및 노화 방지 효과가 우수하여, 기능성 화장료 조성물의 유효성분으로 널리 사용될 수 있을 것이다.
도 1은 인간 티오레독신과 전갈독을 포함하는 융합유전자의 재조합 플라스미드(pET22b::TRX-CTL)의 제작 및 형질전환에 관한 개략도이다.
도 2는 인간상피세포성장인자와 전갈독을 포함하는 융합유전자의 재조합 플라스미드(pET22b::EGF-CLT)의 제작 및 형질전환에 관한 개략도이다.
도 3은 15% SDS-폴리아크릴아마이드겔 전기영동법으로 융합단백질 발현 및 정제를 확인하여 도시한 것이다. M은 DokDo-MARK(Broad range, un-stained, Elpis Biotech)이고, 3A는 인간 티오레독신과 전갈독을 포함하는 융합단백질(TRX-CTL)의 발현 및 정제를 나타낸 것이며, 3B는 인간상피세포성장인자와 전갈독을 포함하는 융합단백질(EGF-CLT)이 발현 및 정제된 것을 가리킨다.
도 4는 본 발명에 따라 생산된 인간 티오레독신과 전갈독을 포함하는 융합단백질(TRX-CTL) 및 인간상피세포성장인자와 전갈독을 포함하는 융합단백질(EGF-CLT)을 분리, 정제한 후 피부섬유아세포(Human Dermal Fibroblasts adult, HDFa cell)에 처리한 후, 피부섬유아세포의 세포 증식효과를 확인한 사진이다.
도 5는 인간 티오레독신과 전갈독을 포함하는 융합단백질(TRX-CTL)에 의한 피부 세포(HaCaT cell)의 상처치유 효과를 24시간 동안 관찰한 사진이다.
도 6은 인간상피세포성장인자와 전갈독을 포함하는 융합단백질에 의한 피부 세포(HaCaT cell)의 상처치유 효과를 24시간 동안 관찰한 사진이다.
도 7은 인간 티오레독신과 전갈독을 포함하는 융합단백질(TRX-CTL) 및 인간상피세포성장인자와 전갈독을 포함하는 융합단백질(EGF-CLT)의 항산화 효능을 측정하기 위해 자유라디칼 소거 효과 측정 결과이다.
도 8은 인간 티오레독신과 전갈독을 포함하는 융합단백질(TRX-CTL) 및 인간상피세포성장인자와 전갈독을 포함하는 융합단백질(EGF-CLT)의 콜라겐 합성 결과이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 피부 세포 증식 및 항산화 효과가 증가한 인간 티오레독신-전갈독 융합단백질을 제공한다.
본 발명에 따른 인간 티오레독신-전갈독 융합단백질의 범위는 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2의 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 활성"이란 피부 세포 증식 및 항산화 활성을 의미한다. 본 발명은 또한 인간 티오레독신-전갈독 융합단백질의 단편, 유도체 및 유사체(analogues)를 포함한다. 본원에 사용된, 용어 "단편", "유도체" 및 "유사체"는 본 발명의 인간 티오레독신-전갈독 융합단백질과 실질적으로 같은 생물학적 기능 또는 활성을 보유하는 폴리펩타이드를 말한다.
본 발명의 인간 티오레독신-전갈독 융합단백질은 바람직하게는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지며, 상기 아미노산 서열 중 1번째 내지 105번째 아미노산 서열로 이루어진 인간 티오레독신 단백질과 106번째 내지 140번째 아미노산 서열로 이루어진 전갈독 단백질을 융합시켜 제작된 신규 단백질일 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 피부 세포 증식 효과가 증가한 인간상피세포성장인자-전갈독 융합단백질을 제공한다.
본 발명에 따른 인간상피세포성장인자-전갈독 융합단백질의 범위는 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. 상기 단백질의 기능적 동등물에 대한 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.
본 발명의 인간상피세포성장인자-전갈독 융합단백질은 바람직하게는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지며, 상기 아미노산 서열 중 1번째 내지 54번째 아미노산 서열로 이루어진 인간상피세포성장인자 단백질과 55번째 내지 89번째 아미노산 서열로 이루어진 전갈독 단백질을 융합시켜 제작된 신규 단백질일 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 인간 티오레독신-전갈독 융합단백질 또는 인간상피세포성장인자-전갈독 융합단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.
상기 인간 티오레독신-전갈독 융합단백질을 코딩하는 유전자는 대장균 코돈 최적화된 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는 본 발명에 따른 인간 티오레독신-전갈독 융합단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로는, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
"코돈 최적화"는 코딩된 단백질이 유기체에서 보다 효율적으로 발현되도록 특정 유기체에서 우선적으로 사용되는 것으로 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 코돈을 변화시키는 것을 의미한다. 대부분의 아미노산이 "동의어" 또는 "동의" 코돈이라고 하는, 몇몇 코돈에 의해 표시된다는 점에서, 유전자 코드가 축퇴적이지만, 특정 유기체에 의한 코돈 용법은 임의적이지 않고 특정 코돈 트리플렛에 편향적이다. 이러한 코돈 용법 편향성은 소정 유전자, 공통 기능 또는 조상 기원의 유전자, 고도로 발현되는 단백질 대 낮은 복제수 단백질, 및 유기체 게놈의 집합적 단백질 코딩 영역과 관련하여 더 높을 수 있다. 본 발명의 상기 서열번호 1의 염기서열은 인간 티오레독신-전갈독 융합단백질을 코딩하는 유전자가 대장균 내에서 발현될 수 있도록 대장균의 코돈에 최적화된 서열이다.
또한, 상기 인간상피세포성장인자-전갈독 융합단백질을 코딩하는 유전자는 대장균 코돈 최적화된 서열번호 2의 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 유전자는 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기 서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함될 수 있으며, 상동체의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.
본 발명은 또한, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
본 발명에서, 상기 인간 티오레독신-전갈독 융합단백질 또는 인간상피세포성장인자-전갈독 융합단백질을 코딩하는 유전자는 재조합 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다. 용어 "재조합 발현 벡터"는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소(translation control element)를 가지는 것이다.
인간 티오레독신-전갈독 융합단백질 또는 인간상피세포성장인자-전갈독 융합단백질을 코딩하는 유전자 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보좀 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 재조합 벡터는, pET22b 벡터에 합성한 인간 티오레독신-전갈독 융합단백질 또는 인간상피세포성장인자-전갈독 융합단백질을 코딩하는 유전자를 5' 말단(NdeI 제한효소 사이트)과 3' 말단(XhoI 제한효소 사이트)에 인프레임(in frame)으로 융합하여 제조하였고, 상기 유전자를 lac 프로모터(lac promoter)와 lacI 리프레서(lacI repressor)에 의하여 효과적으로 발현시켜 인간 티오레독신-전갈독 융합단백질 또는 인간상피세포성장인자-전갈독 융합단백질을 제조하는 것을 특징으로 하는 벡터이다.
본 발명의 벡터를 원핵세포에 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli Rosetta, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.
또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포(예컨대, CHO 세포주(Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포는 E. coli Rosetta2(DE3) pLysS일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법, 하나한 방법(Hanahan, D., 1983 J. Mol. Biol. 166, 557-580) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환시켜 인간 티오레독신-전갈독 융합단백질 또는 인간상피세포성장인자-전갈독 융합단백질을 코딩하는 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는, 숙주세포에서 인간 티오레독신-전갈독 융합단백질 또는 인간상피세포성장인자-전갈독 융합단백질의 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서는, 140개의 아미노산을 암호화한 인간 티오레독신과 전갈독을 포함하는 융합유전자 및 89개의 아미노산을 암호화한 인간상피세포성장인자와 전갈독을 포함하는 융합유전자를 합성한 후, 이를 포함하는 재조합 벡터를 제작하고 이를 이용하여 숙주 미생물을 형질 전환시켜 인간 티오레독신과 전갈독을 포함하는 융합단백질 및 인간상피세포성장인자와 전갈독을 포함하는 융합단백질을 대량 생산하는 것을 포함한다.
한편, 본 발명자들은 인간 티오레독신과 전갈독을 포함하는 융합단백질 및 인간상피세포성장인자와 전갈독을 포함하는 융합단백질을 세포 밖 분비보다 더 효율적인 세포 내 생산방식을 채택하여 대량 생산하였다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 숙주세포는 바람직하게는 대장균일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 E. coli Rosetta2(DE3) pLysS일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 재조합 미생물, 즉 형질 전환체를 배양하는 방법은, 숙주의 배양에 사용되는 통상의 방법을 사용할 수 있다. 또 배양방법은, 배치(Batch)식, 유동배치식, 연속배양, 리액터 형식 등 통상의 미생물의 배양에 사용하는 어떠한 방법도 사용할 수 있다. 대장균 등의 세균을 숙주로 해서 얻게 된 형질전환체를 배양하는 배지로서는, 완전 배지 또는 합성 배지, 예를 들면 LB(10% Tryptone, 10% Sodium chloride, 5% Yeast extract) 배지, BSB(1% Tryptone, 0.5% Yeast extract, 0.1% HEPES, 1% glucose, pH 7.0), ㈜넥스젠바이오텍 배지 등을 들 수 있다. 또, 배양 온도는 적온의 범위, 바람직하게는 약 37℃에서 배양함으로써 인간 티오레독신-전갈독 융합단백질 또는 인간상피세포성장인자-전갈독 융합단백질을 균체 내에 축적시키고 회수할 수 있다. 배양액에 카나마이신, 암피실린, 테트라사이클린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신 등의 항생물질을 첨가해도 된다. 프로모터가 유도성의 발현벡터를 사용해서 형질전환한 미생물을 배양하는 경우는, 프로모터의 종류에 적합한 유도 물질을 배지에 첨가하면 된다. 예를 들면, 이소프로필-D-티오갈락토피라노시드(IPTG), 락토오즈 등을 유도물질로서 들 수 있다.
인간 티오레독신-전갈독 융합단백질 또는 인간상피세포성장인자-전갈독 융합단백질의 획득은 얻게 되는 배양물로부터 균체 또는 상층액을 원심 회수하여, 균체 파쇄, 추출, 초미세 여과(Ultrafiltration) 방법을 이용하여 분리 후 친화성 크로마토 그래피, 양이온 또는 음이온교환 크로마토 그래피, 겔 여과 등을 단독으로 또는 적당히 조합함으로써 행할 수 있다. 얻게 된 정제물질이 목적의 단백질인 것의 확인은, 통상의 방법, 예를 들면 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 웨스턴 블로팅, 인간상피세포재생인자를 확인할 수 있는 키트 사용 등에 의해 행할 수 있다.
상기 인간 티오레독신-전갈독 융합단백질 또는 인간상피세포성장인자-전갈독 융합단백질은 피부섬유아세포(Human Dermal Fibroblasts adult, HDFa cell)의 세포 증식효과와 항산화 효능을 측정함으로써, 인간 티오레독신-전갈독 융합단백질 또는 인간상피세포성장인자-전갈독 융합단백질의 활성여부를 확인할 수 있다.
또한, 자외선 자극에 의한 피부 노화 억제 수단 중 하나인 아교섬유(collagen fiber) 합성의 촉진을 알아보기 위해 본 발명의 상기 단백질을 섬유아세포에 처리한 후 콜라겐 합성 촉진 여부를 평가하였다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 생산된 인간 티오레독신-전갈독 융합단백질 또는 인간상피세포성장인자-전갈독 융합단백질을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 인간 티오레독신-전갈독 융합단백질 또는 인간상피세포성장인자-전갈독 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 피부 세포 증식 효과와 항산화 기능이 증가한 인간 티오레독신-전갈독 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 개선과 피부 탄력 증대 및 항노화 기능의 화장료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 피부 세포 증식 효과가 증가한 인간 상피세포성장인자-전갈독 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 개선과 피부 탄력 증대 기능의 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 화장료 조성물에서, 상기 인간 티오레독신-전갈독 융합단백질 또는 인간상피세포성장인자-전갈독 융합단백질의 함량은 화장료 조성물 총 중량 대비 0.000001 내지 0.001 중량%로 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 단백질의 함량이 0.000001 중량% 미만인 경우에는 피부 내에서 효능이 이루어지지 않아 효과가 나타나지 않으며, 0.001 중량% 초과인 경우에는 함유량 증가에 대한 효과 증대 정도가 미미하며, 제형상의 안전 및 안정성에 문제가 있을 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물에는 상기 유효성분 이외에 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온 봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭과 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.
본 발명의 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 스킨, 스킨 소프트너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 아이 크림, 모이스쳐 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 클렌징폼, 클렌징 워터, 클렌징 로션, 클렌징 크림, 바디로션, 바디클렌져, 비누 및 파우더의 화장품 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물이 계면활성제 비함유 클렌징 제형일 경우, 피부에 도포한 후 닦아내거나 떼거나 물로 씻어낼 수도 있다. 구체적인 예로서, 상기 계면활성제 비함유 클렌징 제형은 클렌징 크림, 클렌징 로션, 클렌징 워터 및 클렌징 겔이며, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 제형이 파우더인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있다.
본 발명에 따른 인간 티오레독신과 전갈독을 포함하는 융합단백질 및 인간상피세포성장인자와 전갈독을 포함하는 융합단백질을 포함하는 화장료 조성물은 피부 안전성을 확인한 후 인간 티오레독신과 전갈독을 포함하는 융합단백질 및 인간상피세포성장인자와 전갈독을 포함하는 융합단백질의 노화방지 효능 등 인간 티오레독신과 전갈독을 포함하는 융합단백질 및 인간상피세포재생인자와 전갈독을 포함하는 융합단백질의 효과를 확인하였다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 인간 티오레독신과 전갈독을 포함하는 융합단백질 및 인간상피세포성장인자와 전갈독을 포함하는 융합단백질의 생산을 위한 재조합 발현벡터 및 형질전환 재조합 미생물의 제조
인간 티오레독신과 전갈독을 포함하는 융합단백질 및 인간상피세포성장인자와 전갈독을 포함하는 융합단백질을 코딩하는 최적화된 유전자, 재조합 발현벡터 및 형질전환 재조합 미생물은 아래의 방법으로 제작하였다. 인간 티오레독신과 전갈독을 포함하는 융합단백질 및 인간상피세포성장인자와 전갈독을 포함하는 융합단백질을 코딩하는 유전자를 주형으로 사용하여 숙주 미생물 내에서 발현될 수 있도록 최적화된, 140개의 아미노산을 암호화한 인간 티오레독신과 전갈독을 포함하는 융합단백질(서열번호 3)을 코딩하는 유전자(서열번호 1) 및 89개의 아미노산을 암호화한 인간상피세포성장인자와 전갈독을 포함하는 융합단백질(서열번호 4)을 코딩하는 유전자(서열번호 2) 단편들을 제작, 합성하였다. 사용한 프라이머는 다음과 같다.
인간 티오레독신과 전갈독을 포함하는 융합단백질 합성을 위한 프라이머는 하기와 같다.
정방향 프라이머: 5'-AAGGAGATATACATATGGTGAAGCAGATCGAG-3'(서열번호 5)
역방향 프라이머: 5'-CGTCACGGACACGGCAGACTAATTCATTAATGGTG-3'(서열번호 6)
센스 프라이머: 5'-CACCATTAATGAATTAGTCATGTGCATGCCGTGCTTC-3'(서열번호 7)
안티센스 프라이머: 5'-GAAGCACGGCATGCACATGACTAATTCATTAATGGTG-3'(서열번호 8)
인간상피세포성장인자와 전갈독을 포함하는 융합단백질 합성을 위한 프라이머는 하기와 같다.
정방향 프라이머: 5'-AAGGAGATATACATATGAACTCAGACTCTGAGTGC-3'(서열번호 9)
역방향 프라이머: 5'-GGTGGTGGTGCTCGAGACGGCACAGGCACTGCGG-3'(서열번호 10)
센스 프라이머: 5'-AAATGGTGGGAGTTGCGCATGTGCATGCCGTGCTTC-3'(서열번호 11)
안티센스 프라이머: 5'-GAAGCACGGCATGCACATGCGCAACTCCCACCATTT-3'(서열번호 12)
상기 유전자 단편과 재조합 플라스미드를 동일한 제한효소(5'쪽 말단 NdeI 제한효소 사이트(CATATG)와 3'쪽 말단 XhoI 제한효소 사이트(CTCGAG))로 절단하고 삽입하여, 도 1에 나타낸 재조합 플라스미드(pET22b::TRX-CLT)와 도 2에 나타낸 재조합 플라스미드(pET22b::EGF-CLT)를 제작하였다. 상기에서 제조된 재조합 플라스미드(pET22b::TRX-CLT, pET22b::EGF-CLT) 반응물을 E. coli TOP10에 각각 형질전환시켜서, 숙주 미생물로부터 유전자 컨스트럭트를 대량 얻었다.
상기에서 제조된 재조합 플라스미드(pET22b::TRX-CLT, pET22b::EGF-CLT) 반응물을 E. coli Rosetta2(DE3) pLysS(Novagen)에 각각 형질 전환시켜서, 숙주 미생물에 유전자 컨스트럭트가 삽입되어 있는 인간 티오레독신과 전갈독을 포함하는 융합단백질 및 인간상피세포성장인자와 전갈독을 포함하는 융합단백질 생산을 위한 재조합 미생물을 제작하였다. 보다 자세한 모식도는 도 1과 도 2에 표시하였다.
실시예 2. 인간 티오레독신과 전갈독을 포함하는 융합단백질 및 인간상피세 포성장인자와 전갈독을 포함하는 융합단백질의 발현유도 및 분리
실시예 1에서 제조한 E. coli Rosetta2(DE3) pLysS(Novagen)를 각각 1 L LB 혹은 BSB 배지에 배치 컬쳐시 OD600=0.6~0.8, 20 L 발효기를 사용하여 연속 배양 시 OD600=15~20가 될 때까지 배양하였다. 이후, 이들을 각각 최종 1~5 mM IPTG 또는 0.2~2% 락토오즈를 가하여 클론 내의 유전자들의 발현을 유도하였다. 그 다음 4시간 내지 5시간 더 배양한 후 세포들을 원심분리방법으로 회수하였다. 이 세포들을 완충용액(Phosphate buffered saline, NaCl 8g, KCl 0.2g, Na2HPO4 1.44g, KH2PO4 0.24g/L, pH 7.4)에 완전히 현탁시킨 후, 초음파 파쇄기를 사용하여 세포를 파괴하고 세포내 단백질 포함용액을 분리하였다.
도 3를 통해, 인간 티오레독신과 전갈독을 포함하는 융합단백질 및 인간상피세포성장인자와 전갈독을 포함하는 융합단백질이 과량발현된 것을 확인할 수 있다.
실시예 3. 인간 티오레독신과 전갈독을 포함하는 융합단백질 및 인간상피세포성장인자와 전갈독을 포함하는 융합단백질의 활성측정(세포 증식 효과)
실시예 2에서 분리, 정제된 인간 티오레독신과 전갈독을 포함하는 융합단백질 및 인간상피세포성장인자와 전갈독을 포함하는 융합단백질의 존재가 확인된 분획에서 시료를 택하여 피부섬유아세포(Human Dermal Fibroblasts adult, HDFa cell)의 세포증식 효과를 확인하였다.
인간 티오레독신과 전갈독을 포함하는 융합단백질 및 인간상피세포성장인자와 전갈독을 포함하는 융합단백질의 활성측정을 위해 배양한 피부섬유아세포에 0, 0.02 ppm, 0.2 ppm, 2 ppm, 20 ppm 농도의 인간 티오레독신과 전갈독을 포함하는 융합단백질 및 인간상피세포성장인자와 전갈독을 포함하는 융합단백질을 각각 처리한 후 3일 동안 37℃에서 배양하였다. 이후 크리스털 바이올렛 염색법으로 세포증식 여부를 확인하였다.
그 결과, 인간 티오레독신과 전갈독을 포함하는 융합단백질 및 인간상피세포재생인자와 전갈독을 포함하는 융합단백질은 피부섬유아세포에 대한 세포증식 효과를 나타냄을 확인하였다(도 4).
실시예 4. 인간 티오레독신과 전갈독을 포함하는 융합단백질 및 인간상피세포성장인자와 전갈독을 포함하는 융합단백질의 활성 측정( HaCaT cell의 세포 증식, 상처 치유)
실시예 2에서 분리, 정제된 인간 티오레독신과 전갈독을 포함하는 융합단백질 및 인간상피세포상장인자와 전갈독을 포함하는 융합단백질의 존재가 확인된 시료를 택하여 HaCaT 세포(Human, Adult, low Calcium, High Temperature, epithelial keratinocyte)의 세포 증식 및 상처 치유 효과를 확인하였다. 도 5~6는 HaCaT 세포를 배양한 후 각각의 농도(0~20 ppm)의 인간 티오레독신과 전갈독을 포함하는 융합단백질 및 인간상피세포성장인자와 전갈독을 포함하는 융합단백질을 처리한 후 24시간 동안 현미경(올림푸스 CK40)을 사용하여 HaCaT 세포의 상처 치유 효과를 24시간 동안 관찰하였다. 0.02~20 ppm 농도의 인간 티오레독신과 전갈독을 포함하는 융합단백질 및 인간상피세포성장인자와 전갈독을 포함하는 융합단백질을 처리한 HaCaT 세포는 대조군에 비해 상처 치유 효과를 나타냈다. 도 5~6 결과를 통해 인간 티오레독신과 전갈독을 포함하는 융합단백질 및 인간상피세포성장인자와 전갈독을 포함하는 융합단백질은 저농도에서도 상처 치유 효과를 나타냄을 알 수 있다.
실시예 5. 인간 티오레독신과 전갈독을 포함하는 융합단백질 및 인간상피세포성장인자와 전갈독을 포함하는 융합단백질의 활성 측정(항산화 효능)
도 7은 인간 티오레독신과 전갈독을 포함하는 융합단백질 및 인간상피세포성장인자와 전갈독을 포함하는 융합단백질의 항산화 효능에 대한 결과를 나타낸 것이다. 인간 티오레독신과 전갈독을 포함하는 융합단백질 및 인간상피세포성장인자와 전갈독을 포함하는 융합단백질의 항산화 효능을 측정하기 위해 자유라디칼 소거 효과 측정 방법 중 하나인 1,1-디페닐-2-히드라질(1,1-Diphenyl-2-pycryl-Hydrazyl; DPPH) 방법을 사용하였다. 이 시약은 비교적 안정한 자유라디칼로 존재하여 자유라디칼 소거 작용을 확인하는데 일차적으로 사용되는 시험관적 방법 중 하나이다.
인간 티오레독신과 전갈독을 포함하는 융합단백질 및 인간상피세포성장인자와 전갈독을 포함하는 융합단백질의 항산화 효능을 알아보기 위해 대조군으로 L-아스코르브산(L-Ascorbic acid)을 사용하였다. 실험 방법은 인간 티오레독신과 전갈독을 포함하는 융합단백질 및 인간상피세포성장인자와 전갈독을 포함하는 융합단백질과 L-아스코르브산을 각각 1 μM 농도로 준비하였으며 DPPH는 0.2 mM 농도로 준비하였다. 각각을 1:1로 혼합한 후 37℃에서 30분 방치하였다. 이 후 520nm ELISA reader로 흡광도를 관찰하였다. 자유라디칼 소거 작용(%)은 하기 수학식 1로 계산하였으며, 그 결과는 도 7에 나타내었다.
[수학식 1]
자유라디칼 소거작용(%)=100-((B/A)*100)
A: 시료를 처리하지 않은 대조군의 흡광도
B: 시료를 처리한 실험군의 흡광도
그 결과, 인간 티오레독신과 전갈독을 포함하는 융합단백질은 L-아스코르브산 대조군보다 약 4배의 높은 자유라디칼 소거능을 보였으며, 인간상피세포재생인자와 전갈독을 포함하는 융합단백질은 L-아스코르브산 대조군과 비슷한 자유라디칼 소거능을 보여주었다(도 7). 따라서, 본 발명의 인간 티오레독신과 전갈독을 포함하는 융합단백질 및 인간상피세포성장인자와 전갈독을 포함하는 융합단백질은 특히, 인간 티오레독신과 전갈독을 포함하는 융합단백질은 항산화 효능에 따른 피부 노화 방지 효과가 우수하다는 것을 알 수 있다.
실시예 6. 인간 티오레독신과 전갈독을 포함하는 융합단백질 및 인간상피세포성장인자와 전갈독을 포함하는 융합단백질의 섬유아세포 내 제1형 프로콜라 겐(Procollagen type-1) 발현 평가
자외선 자극에 의한 피부 노화 억제 수단 중 하나인 아교섬유(collagen fiber) 합성의 촉진을 알아보기 위해 본 발명의 상기 단백질을 섬유아세포에 처리한 후 콜라겐 합성 촉진 여부를 평가하였다. 인간 티오레독신과 전갈독을 포함하는 융합단백질 및 인간상피세포성장인자와 전갈독을 포함하는 융합단백질을 무혈청 DMEM 배지에 0~20 ppm의 농도로 섬유아세포에 처리한 후 72시간 후, 세포추출물을 대상으로 Collagen-I ELISA kit(Cloud-Clone Corp., 미국)을 사용하여 제1형 프로콜라겐 발현량의 변화를 측정하였으며, 그 결과는 도 8와 같다. 도 8에서 확인할 수 있는 바와 같이, 제1형 프로콜라겐의 발현량은 인간상피세포성장인자와 전갈독을 포함하는 융합단백질에 의하여 농도-의존적으로 증가하였다. 반면에, 인간 티오레독신과 전갈독을 포함하는 융합단백질의 경우 0.2 ppm 이하 농도에서는 농도-의존적으로 증가하였으나, 이후 감소 패턴을 나타내었다. 이는 도 4에서 나타난 것처럼 섬유아세포 증식효과 결과와 일치하는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명에 따른 상기 단백질은 도 8를 통해 콜라겐 소실에 의한 피부의 노화, 특히 피부 주름을 억제할 수 있음을 확인할 수 있었다.

Claims (16)

  1. 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 피부 세포 증식 및 항산화 효과가 증가한 인간 티오레독신-전갈독 융합단백질.
  2. 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 피부 세포 증식 효과가 증가한 인간상피세포성장인자-전갈독 융합단백질.
  3. 제1항의 피부 세포 증식 및 항산화 효과가 증가한 인간 티오레독신-전갈독 융합단백질을 코딩하는 유전자.
  4. 제3항에 있어서, 상기 유전자는 대장균 코돈 최적화된 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 유전자.
  5. 제2항의 피부 세포 증식 효과가 증가한 인간상피세포성장인자-전갈독 융합단백질을 코딩하는 유전자.
  6. 제5항에 있어서, 상기 유전자는 대장균 코돈 최적화된 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 유전자.
  7. 제3항 또는 제5항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
  8. 제7항의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포.
  9. 제3항 또는 제4항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환시켜 인간 티오레독신-전갈독 융합단백질을 코딩하는 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는, 숙주세포에서 인간 티오레독신-전갈독 융합단백질의 생산 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 숙주세포는 대장균인 것을 특징으로 하는 인간 티오레독신-전갈독 융합단백질의 생산 방법.
  11. 제5항 또는 제6항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환시켜 인간상피세포성장인자-전갈독 융합단백질을 코딩하는 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는, 숙주세포에서 인간상피세포성장인자-전갈독 융합단백질의 생산 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 숙주세포는 대장균인 것을 특징으로 하는 인간상피세포성장인자-전갈독 융합단백질의 생산 방법.
  13. 제9항의 방법에 의해 생산된 인간 티오레독신-전갈독 융합단백질.
  14. 제11항의 방법에 의해 생산된 인간상피세포성장인자신-전갈독 융합단백질.
  15. 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 피부 세포 증식 효과와 항산화 기능이 증가한 인간 티오레독신-전갈독 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 개선, 피부 탄력 증대 및 항노화 기능의 화장료 조성물.
  16. 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 피부 세포 증식 효과가 증가한 인간상피세포성장인자-전갈독 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 개선과 피부 탄력 증대 기능의 화장료 조성물.
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