WO2018020970A1 - 細胞積層体、細胞積層体の製造方法、表皮の増殖又は分化の評価方法、被験物質の評価方法、及び生体移植材料 - Google Patents

細胞積層体、細胞積層体の製造方法、表皮の増殖又は分化の評価方法、被験物質の評価方法、及び生体移植材料 Download PDF

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太一 村口
田代　朋子
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Definitions

  • the present disclosure relates to a cell laminate, a method for producing the cell laminate, a method for evaluating epidermal proliferation or differentiation, a method for evaluating a test substance, and a biological transplant material.
  • the reconstructed artificial skin is used as a biological transplant material for the treatment of burns or wounds, for example.
  • the reconstructed artificial skin is also used as an evaluation system for elucidating the structure or function of the skin, or an evaluation system for developing pharmaceuticals, cosmetics, etc. Has been.
  • Japanese Patent No. 5458259 discloses a cell laminate in which a first cell layer, a layer made of type IV collagen that has not been treated with an enzyme, and a second cell layer are laminated in this order, A cell laminate for use as a bioassay system is disclosed, wherein the second cell layer is a collagen gel containing fibroblasts and the second cell layer is epidermal keratinocytes.
  • Japanese Patent No. 5228246 discloses a three-dimensional disease skin reconstruction obtained by three-dimensionally culturing a gene-introduced epidermal basal cell into which epimorphin-encoding nucleic acid is introduced so that it can be expressed. ing.
  • a cell laminate comprising an epidermis layer in which epidermis keratinocytes lacking a specific gene are laminated.
  • the support layer is a layer containing at least one of mesenchymal cells and mesenchymal stem cells and collagen.
  • ⁇ 5> The cell laminate according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 4>, wherein the specific gene includes a gene for a cell membrane receptor.
  • the specific gene includes a gene for insulin-like growth factor 1 receptor.
  • a method for producing a cell laminate comprising a step of culturing epidermal keratinocytes lacking a specific gene by gas-liquid interface culture.
  • the epidermal keratinocytes are human epidermal keratinocytes.
  • the step of culturing epidermal keratinocytes lacking a specific gene by gas-liquid interface culture includes culturing epidermal keratinocytes lacking a specific gene by gas-liquid interface culture on a support layer, 7.
  • ⁇ 11> The method for producing a cell laminate according to ⁇ 10>, wherein the support layer is a layer containing at least one of mesenchymal cells and mesenchymal stem cells and collagen.
  • the specific gene includes a gene for a cell membrane receptor.
  • the specific gene comprises a gene for insulin-like growth factor 1 receptor.
  • a method for evaluating proliferation or differentiation of epidermis comprising a step of culturing epidermal keratinocytes lacking a specific gene by gas-liquid interface culture.
  • ⁇ 15> A method for evaluating a test substance comprising a step of culturing epidermal keratinocytes lacking a specific gene by gas-liquid interface culture in the presence of the test substance.
  • ⁇ 16> A method for evaluating a test substance, comprising a step of bringing the test substance into contact with the cell laminate according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 6>.
  • ⁇ 17> A biological transplant material comprising the cell laminate according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 6>.
  • the present disclosure it is possible to provide a novel cell laminate obtained by culturing epidermal keratinocytes lacking a specific gene and a method for producing the same. Moreover, according to this indication, the evaluation method of the proliferation or differentiation of the epidermis which applied the cell laminated body and its manufacturing method, the evaluation method of a test substance, and a biological transplant material can be provided.
  • FIG. 1 is a diagram schematically illustrating an example of a culturing step in the method for producing a cell laminate of the present disclosure.
  • FIG. 2 is a diagram schematically showing another example of the culturing step in the method for producing a cell laminate of the present disclosure.
  • FIG. 3 shows that the IGF-1R gene is deleted when the insulin-like growth factor-1 receptor (IGF-1R) gene of HaCaT cells is deleted by the CRISPER-CAS9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR associated proteins 9) method. It is a figure which shows the position of target sequence of.
  • IGF-1R insulin-like growth factor-1 receptor
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of the Cel1 assay after introducing a plasmid vector for CRISPER-CAS9 into HaCaT cells and cloning.
  • FIG. 5 is a diagram showing the results of Western blotting using a Cel1 assay positive strain after cloning.
  • FIG. 6 is a diagram showing the results of cell immunostaining using a Cel1 assay positive strain after cloning.
  • FIG. 7 shows the results of Western blotting after passage of HaCaT cells deficient in the IGF-1R gene.
  • FIG. 8 shows the results of confirming the sequence of the region containing the target sequence of the IGF-1R gene in HaCaT cells lacking the IGF-1R gene.
  • FIG. 8 shows the results of confirming the sequence of the region containing the target sequence of the IGF-1R gene in HaCaT cells lacking the IGF-1R gene.
  • FIG. 9 is a view showing a HE (hematoxylin and eosin) -stained image of a cell laminate produced by culturing HaCaT cells deficient in the IGF-1R gene on a support by gas-liquid interface culture.
  • FIG. 10 is a diagram showing the average thickness of the epidermis layer of a cell laminate produced by culturing HaCaT cells deficient in the IGF-1R gene on a support by gas-liquid interface culture.
  • FIG. 11 shows an HE-stained image of a cell laminate produced by culturing HaCaT cells deficient in the IGF-1R gene on a support layer (collagen gel embedded with fibroblasts) by gas-liquid interface culture. It is.
  • the cell laminate the method for producing the cell laminate, the method for evaluating proliferation or differentiation of the epidermis, the method for evaluating the test substance, and the biological transplant material will be described in detail.
  • the present invention is not limited to the following embodiments, and can be implemented with appropriate modifications within the scope of the object of the present invention.
  • a numerical range indicated by using “to” means a range including the numerical values described before and after “to” as the minimum value and the maximum value, respectively.
  • the upper limit value or lower limit value described in a numerical range may be replaced with the upper limit value or lower limit value of the numerical range described in other steps.
  • the upper limit value or the lower limit value described in a certain numerical range may be replaced with the values shown in the examples.
  • the concentration of each component means the total concentration of a plurality of types of substances when there are a plurality of types of substances corresponding to each component, unless otherwise specified.
  • the term “layer” includes not only the case where the layer is formed, but also the case where the layer is formed only on a part of the region. It is.
  • the term “process” is not limited to an independent process, and is included in the term if the intended purpose of the process is achieved even when the process cannot be clearly distinguished from other processes. .
  • the cell laminate of the present disclosure includes an epidermis layer in which epidermis keratinocytes lacking a specific gene (hereinafter also referred to as “gene-deficient epidermis keratinocytes”) are laminated.
  • the cell laminate of the present disclosure may have only a skin layer or may further include layers other than the skin layer such as a support layer described later.
  • the epidermal layer is a layer in which at least gene-deficient epidermal keratinocytes are stacked.
  • “stacking” is sufficient if gene-deficient epidermal keratinocytes are stacked, and it is not necessary that the layer division can be clearly confirmed.
  • epidermal keratinocytes include cells derived from mammals.
  • mammals include primates such as humans, rhesus monkeys, marmosets, orangutans, chimpanzees; rodents such as mice, rats, hamsters, guinea pigs; and rabbits, pigs, cows, goats, horses, sheep, minks, dogs , Cats; and the like.
  • primate epidermal keratinocytes are preferable, and human epidermal keratinocytes are more preferable.
  • human epidermal keratinocytes is not particularly limited, and examples thereof include HaCaT cells (J. Invest. Dermatol., L1999, 112 (3): 343-353), HDK (Human Dermal Keratinocyte) cells (Cancer Sciocyte). ., 2007, 98: 147-154), NHEK (Normal Human Epidermal Keratinocyte) cells and the like.
  • HaCaT cells are preferable because the properties of the cells are relatively uniform regardless of the number of passages, the handling is simple, and the cell differentiation state is normal.
  • the epidermal keratinocytes may be non-immortalized cells or immortalized cells.
  • a non-immortalized cell means a cell whose growth is stopped by a finite number of cell divisions.
  • an immortalized cell means a cell that does not stop growing even after repeated cell division, that is, a cell that has acquired infinite autonomous proliferation ability.
  • Immortalization of cells can be performed by introducing immortalizing genes such as SV (Simian Virus) 40 T antigen gene, TERT (Telomerase Reverse Transcriptase) gene, HPV (Human Papilloma Virus) E6 to E7 gene into cells. .
  • Cell immortalization may also occur accidentally.
  • the above-mentioned HaCaT cell is an immortalized cell established by immortalizing naturally without introducing an immortalizing gene.
  • the type of specific gene lacking epidermal keratinocytes is not particularly limited.
  • specific genes include cell membrane receptor genes, causative genes for skin diseases, and the like.
  • cell membrane receptors include insulin-like growth factor-1 receptor (IGF-1R), epidermal growth factor receptor (EGF-R) and other tyrosine kinase receptors; G protein-coupled receptors; guanylate cyclase receptors Body; and ion channel receptor; and the like.
  • IGF-1R insulin-like growth factor-1 receptor
  • EGF-R epidermal growth factor receptor
  • G protein-coupled receptors G protein-coupled receptors
  • guanylate cyclase receptors Body and ion channel receptor
  • ion channel receptor and the like.
  • the specific gene lacking epidermal keratinocytes may be one type or two or more types.
  • the specific gene includes a cell membrane receptor gene (eg, IGF-1R gene).
  • a cell membrane receptor gene eg, IGF-1R gene.
  • Cell membrane receptor genes are thought to play an important role in the homeostasis of the epidermis of living organisms. Therefore, by using epidermal keratinocytes that lack the cell membrane receptor genes, A cell stack can be obtained. For example, as shown in the Examples described later, a cell laminate in which the epidermal layer is thinned can be obtained by culturing epidermal keratinocytes lacking the IGF-1R gene by gas-liquid interface culture.
  • the specific gene includes a skin disease causative gene.
  • a cell laminate produced using epidermal keratinocytes lacking a causative gene for skin diseases can be used as a biological transplant material for the treatment of skin diseases.
  • Gene-deficient epidermal keratinocytes can be obtained by deleting specific genes of epidermal keratinocytes.
  • a method using a site-specific nuclease is preferable as a method of deleting a specific gene of an epidermal keratinocyte.
  • the method using site-specific nuclease include CRISPR-Cas9 method, TALEN (registered trademark, TranscriptionTActivator-Like Effector Nucleases) method, and ZFN (Zinc Finger Nucleases) method.
  • the gene-deficient epidermal keratinocytes are obtained by deleting specific genes of epidermal keratinocytes in vitro.
  • the CRISPR-Cas9 method is preferable because it is simple and can edit a plurality of locations on the genomic DNA simultaneously.
  • the principle of the CRISPR-Cas9 method is as follows. That is, in the CRISPR-Cas9 method, Cas9 nuclease and gRNA (guide RNA) are introduced into cells.
  • gRNA is composed of crRNA (CRISPR RNA) having a base sequence complementary to a target sequence (for example, a sequence on a gene to be deleted) and tracrRNA (trans-activating crRNA), and by binding to genomic DNA, Induces cleavage of the target sequence by Cas9 nuclease.
  • the target sequence is mutated, and as a result, the gene can be deleted.
  • the method (a) is preferable from the viewpoint of simplicity and introduction efficiency.
  • A A method of introducing DNA encoding Cas9 nuclease and DNA encoding gRNA into a cell via a plasmid vector.
  • B A method in which a DNA encoding Cas9 nuclease is introduced into a cell via a viral vector, and a DNA encoding gRNA is directly introduced into the cell.
  • C A method of producing RNA and gRNA encoding Cas9 nuclease by in vitro transcription and introducing them directly into cells.
  • D A method for directly introducing a Cas9 nuclease recombinant protein and gRNA prepared by in vitro transcription into a cell.
  • the epidermis layer may contain one type of gene-deficient epidermal keratinocytes, or may contain two or more types of gene-deficient epidermal keratinocytes.
  • the epidermis layer may contain one type of gene-deficient epidermal keratinocytes, or may contain two or more types of gene-deficient epidermal keratinocytes.
  • two or more types of gene-deficient epidermal keratinocytes for example, two or more types of gene-deficient epidermal keratinocytes having the same cell type of epidermal keratinocytes but different types of specific genes to be deleted are used.
  • aspects of inclusion Aspect of including two or more types of gene-deficient epidermal keratinocytes with the same type of specific gene to be deficient but different cell types of epidermal keratinocytes; and cell types and defects of epidermal keratinocytes
  • An embodiment comprising two or more types of gene-deficient epidermal keratinocytes having different types of specific genes.
  • the epidermal layer may contain cells other than gene-deficient epidermal keratinocytes. Examples of other cells include melanocytes and immune system cells. The number of cells other than the gene-deficient epidermal keratinocytes may be 20% or less, 15% or less, or 10% or less with respect to the total number of cells in the epidermis layer. Also good.
  • the epidermis layer may be one in which a four-layer structure of a basal layer, a spiny layer, a granule layer, and a horny layer is confirmed, or only a part of the layers may be confirmed.
  • the confirmation method in particular of each said layer is not restrict
  • the cell laminate of the present disclosure may further include a support layer.
  • the support layer is not particularly limited as long as it can support the epidermis layer and form a cell laminate.
  • the support layer may be a membrane filter.
  • the material for the membrane filter include polyethylene terephthalate (PET), polycarbonate, and polytetrafluoroethylene (PTFE).
  • the support layer is a layer containing at least one of mesenchymal cells and mesenchymal stem cells and collagen (hereinafter referred to as “collagen”). It is also referred to as “containing layer”).
  • the collagen-containing layer corresponds to the dermis layer of the skin.
  • signal transduction between cells plays an important role in the homeostasis of the epidermis layer of a living body.
  • the cell laminate of the present disclosure further includes a collagen-containing layer, the structure and function of the cell laminate can be brought closer to the skin of a living body.
  • mesenchymal cells and mesenchymal stem cells contained in the collagen-containing layer include mammal-derived cells.
  • mammals include primates such as humans, rhesus monkeys, marmosets, orangutans, chimpanzees; rodents such as mice, rats, hamsters, guinea pigs; and rabbits, pigs, cows, goats, horses, sheep, minks, dogs , Cats; and the like.
  • primate cells are preferable, and human cells are more preferable.
  • the type of mesenchymal cells is not particularly limited, and examples include fibroblasts, adipocytes, cardiomyocytes, bone cells, chondrocytes, and tendon cells. Among these, fibroblasts are preferable from the viewpoint of bringing the cell laminate closer to the living body skin.
  • the type of mesenchymal stem cells is not particularly limited, and examples thereof include mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose tissue, placental tissue, umbilical cord tissue, dental pulp, and the like. Among these, bone marrow-derived mesenchymal stem cells are preferable from the viewpoint of maintaining undifferentiation. Whether a mesenchymal stem cell is derived from bone marrow can be determined by analyzing the CD (Cluster-of-Differentiation) antigen of the cell by, for example, cell immunostaining, flow cytometer, or Western blotting.
  • CD Cluster-of-Differentiation
  • the mesenchymal cells and mesenchymal stem cells may be non-immortalized cells or immortalized cells. From the viewpoint of bringing the proliferation state and differentiation state of the epidermis closer to the epidermis of a living body, the mesenchymal cells and the mesenchymal stem cells are preferably non-immortalized cells.
  • the collagen-containing layer may contain one type of mesenchymal cells or may contain two or more types of mesenchymal cells. Further, the collagen-containing layer may contain one type of mesenchymal stem cells or may contain two or more types of mesenchymal stem cells.
  • the collagen contained in the collagen-containing layer is not particularly limited, and examples thereof include gelling fibrous collagen.
  • fibrous collagen include type I collagen, type II collagen, type III collagen, type V collagen, and type XI collagen, type I collagen and type III collagen are preferred, and type I collagen is more preferred.
  • the collagen may be acid solubilized collagen. As the collagen, acid-solubilized type I collagen is more preferable.
  • the origin of collagen is not particularly limited, and examples thereof include collagen derived from humans, cows, horses, pigs, mice or rats.
  • the collagen-containing layer may contain one type of collagen or two or more types of collagen.
  • the collagen-containing layer examples include a collagen gel in which at least one of mesenchymal cells and mesenchymal stem cells is embedded.
  • a collagen gel can be prepared, for example, by gelling a collagen solution in which at least one of mesenchymal cells and mesenchymal stem cells and collagen are added to a medium.
  • the medium is not particularly limited, and examples thereof include a cell laminate medium used for gas-liquid interface culture described below.
  • the density of the collagen gel is preferably about 0.1 mg / mL to 100 mg / mL, for example.
  • the collagen-containing layer may contain cells other than mesenchymal cells and mesenchymal stem cells. Examples of other cells include cells of the immune system.
  • the cell density per 1 cm 2 of the bottom area of the collagen-containing layer is, for example, preferably 1 ⁇ 10 5 cells / cm 2 or more, more preferably 2.5 ⁇ 10 5 cells / cm 2 or more. It is more preferable that it is ⁇ 10 5 pieces / cm 2 or more, and it is particularly preferable that it is 1 ⁇ 10 6 pieces / cm 2 or more.
  • the number of cells in the collagen-containing layer can be measured by a conventional method using a cell counter or a hemocytometer. The number of cells can also be estimated based on a calibration curve by colorimetry using the MTT method.
  • the MTT method refers to an enzyme activity that reduces MTT (3- (4,5-dimethyl-thiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide) or a similar dye to formazan dye (purple). This is a colorimetric method for measuring.
  • the cell laminate of the present disclosure may further include other layers other than the epidermis layer and the support layer.
  • the cell laminate of the present disclosure may include a layer made of type IV collagen that has not been treated with an enzyme (see Japanese Patent No. 5458259) between the epidermis layer and the support layer.
  • the method for producing a cell laminate of the present disclosure includes a step of culturing epidermal keratinocytes lacking a specific gene (that is, the above-described gene-deficient epidermal keratinocytes) by gas-liquid interface culture (hereinafter also referred to as “culture step”). .)including.
  • the epidermal keratinocytes are preferably human epidermal keratinocytes.
  • the method for producing a cell laminate of the present disclosure may further include a step of deleting a specific gene of epidermal keratinocytes using a site-specific nuclease.
  • the specific gene comprises a cell membrane receptor gene (eg, an IGF-1R gene).
  • the step of deleting a specific gene of epidermal keratinocytes using a site-specific nuclease is performed in vitro. As shown in the examples described later, by culturing epidermal keratinocytes lacking the IGF-1R gene by gas-liquid interface culture, a cell laminate in which the epidermis layer is thinned can be obtained.
  • Cell laminate medium examples of the medium used in the culturing step include a medium in which serum is added to a basic medium.
  • the cell laminate medium may further contain CaCl 2 , an ascorbic acid derivative, an antibiotic, and / or a pH buffer.
  • Examples of basic media include: DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), EMEM (Eagle's Minimum Essential Medium), MEM ⁇ (Minimum Essential Medium Alpha modification), RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute 1am) F12 Etc.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • EMEM Eagle's Minimum Essential Medium
  • MEM ⁇ Minimum Essential Medium Alpha modification
  • RPMI 1640 Roswell Park Memorial Institute 1am F12 Etc.
  • a basic medium may be used individually by 1 type, and 2 or more types may be mixed and used for it.
  • serum examples include FBS (Fetal bovine serum) and the like.
  • concentration of serum in the cell laminate medium is preferably, for example, 5 v / v% to 20 v / v%.
  • the cell laminate medium preferably contains CaCl 2 .
  • CaCl 2 When the cell laminate medium contains CaCl 2 , differentiation of epidermal keratinocytes tends to be promoted. Calcium ions are also ions necessary for cell-cell adhesion.
  • the calcium concentration in the cell laminate medium is preferably, for example, 0.5 mmol / L to 5 mmol / L, or 1 mmol / L to 3 mmol / L. It is more preferable.
  • the cell laminate medium preferably contains an ascorbic acid derivative.
  • ascorbic acid derivatives include ascorbic acid, sodium ascorbate, potassium ascorbate, calcium ascorbate, L-ascorbyl phosphate, magnesium ascorbyl phosphate, sodium ascorbyl phosphate, ascorbyl sulfate, ascorbyl sulfate, disodium ascorbyl sulfate, And ascorbyl-2-glucoside.
  • the concentration of the ascorbic acid derivative in the cell stack medium is preferably, for example, 0.01 w / w% to 1 w / w%.
  • the cell laminate medium may contain an antibiotic.
  • antibiotics include penicillin, streptomycin, neomycin, amphotericin B, kanamycin, gentamicin and the like.
  • the cell laminate medium may contain a pH buffer.
  • pH buffering agents include sodium bicarbonate, calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, 2- [4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinyl] ethanesulfonic acid (HEPES), and 3-morpholinopropane- Examples thereof include 1-sulfonic acid (MOPS).
  • the pH of the cell laminate medium is preferably, for example, pH 6.8 to pH 7.6, and more preferably pH 7.0 to pH 7.4.
  • the method for culturing gene-deficient epidermal keratinocytes by gas-liquid interface culture to produce a cell laminate is not particularly limited, and for example, a known method for producing artificial skin using epidermal keratinocytes may be adopted. it can.
  • the gas-liquid interface culture of gene-deficient epidermal keratinocytes may be performed on a support such as a cell culture insert made of polycarbonate, or may be performed on the support layer described above.
  • FIG. 1 An example of the culture process is shown in FIG. First, a layer of gene-deficient epidermal keratinocytes is formed by seeding and culturing the gene-deficient epidermal keratinocytes 30 on the support 10. Next, a cell stack 50 composed of the epidermal layer 40 in which the gene-deficient epidermal keratinocytes are stacked is obtained by removing the medium on the layer of the gene-deficient epidermal keratinocytes to form a gas-liquid interface and continuing the culture. Can do.
  • FIG. 1 Another example of the culture process is shown in FIG. First, as the support layer 20, a collagen gel in which at least one of mesenchymal cells and mesenchymal stem cells is embedded is prepared. Next, the gene-deficient epidermal keratinocytes 30 are seeded on the support layer 20 and cultured to form a gene-deficient epidermal keratinocyte layer. Next, the medium on the layer of the gene-deficient epidermal keratinocytes is removed to form a gas-liquid interface, and by continuing the culture, cells comprising the support layer 20 and the epidermal layer 40 on which the gene-deficient epidermal keratinocytes are stacked. The laminated body 60 can be obtained.
  • the number of passages of the gene-deficient epidermal keratinocytes seeded on the support 10 or the support layer 20 is not particularly limited.
  • the number of passages of the gene-deficient epidermal keratinocytes is, for example, preferably 10 passages or less, and more preferably 8 passages or less. More preferably, it is 5 passages or less.
  • the culture conditions for the gas-liquid interface culture can be adopted.
  • the conditions of 37 ° C. and 5 v / v% CO 2 can be employed.
  • the number of days of culture by gas-liquid interface culture is, for example, preferably 10 days or more, and more preferably 11 days or more. By setting the number of culture days to 10 days or more, the differentiation state of the epidermis layer tends to be sufficient.
  • the upper limit of the number of culture days is not particularly limited, and is generally within 30 days, preferably within 25 days.
  • the method for evaluating proliferation or differentiation of the epidermis of the present disclosure includes a step of culturing epidermal keratinocytes lacking a specific gene (that is, the above-described gene-deficient epidermal keratinocytes) by gas-liquid interface culture.
  • a specific gene that is, the above-described gene-deficient epidermal keratinocytes
  • gas-liquid interface culture By culturing gene-deficient epidermal keratinocytes by gas-liquid interface culture to produce a cell laminate, proliferation or differentiation of the epidermis can be evaluated.
  • the function of a specific gene can also be evaluated from the proliferation state or differentiation state of the epidermis.
  • a gene-deficient epidermal keratinocyte is cultured by gas-liquid interface culture to produce a cell laminate, and then the epidermis layer is stained with HE and observed with an optical microscope.
  • the proliferation state or differentiation state of the epidermis can be evaluated.
  • gene-deficient epidermal keratinocytes are cultured by gas-liquid interface culture to produce a cell laminate, and gene expression in cells of the epidermis layer is detected.
  • the differentiation state of the epidermis can be evaluated.
  • genes that serve as indicators of epidermal differentiation include loricrin gene (LOR), periostin gene (POSTN), transglutaminase 3 gene (TGM3), wingless MMTV (Mouse Mammary Tumor Virus) integration site family member 3 gene (WNT3), wingless MMTV integration site family member 4 gene (WNT4), filaggrin gene (FLG), kallikrein related peptidase 14 gene (KLK14), desmocollin 1 gene (DSC1), caspase 14 gene (CASP14), and fibronectin 1 Gene (FN1) and the like.
  • LOR loricrin gene
  • POSTN periostin gene
  • TGM3 transglutaminase 3 gene
  • WNT3 wingless MMTV integration site family member 3 gene
  • WNT4 wingless MMTV integration site family member 4 gene
  • FLG filaggrin gene
  • KLK14 kallikrein related peptidase 14 gene
  • DSC1 desm
  • the method for detecting gene expression is not particularly limited.
  • the expression of RNA corresponding to the above gene can be detected by RT-PCR (ReverseReTranscription Polymerase Chain Reaction) method or microarray method.
  • the expression of the protein corresponding to said gene can also be detected by ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) method or Western blot method.
  • the test substance evaluation method of one embodiment includes a step of culturing epidermal keratinocytes lacking a specific gene (that is, the above-described gene-deficient epidermal keratinocytes) by gas-liquid interface culture in the presence of the test substance. .
  • culturing gene-deficient epidermal keratinocytes by gas-liquid interface culture in the presence of the test substance to produce a cell stack the influence of the test substance on the structure, function, etc. of the cell stack can be evaluated.
  • the step of culturing gene-deficient epidermal keratinocytes by gas-liquid interface culture is the same as the method for producing a cell laminate of the present disclosure described above except that the cells are cultured in the presence of a test substance. Description is omitted.
  • test substance in the presence of the test substance is not particularly limited as long as the test substance can contact the gene-deficient epidermal keratinocytes.
  • the test substance may be contained in the above-described collagen-containing layer, or cells that secrete the test substance may be contained in the above-described collagen-containing layer.
  • the test substance is not particularly limited, and may be a component of a pharmaceutical or cosmetic, a biological substance such as a cytokine, or other compound.
  • the test substance evaluation method includes a step of bringing the test substance into contact with the cell stack of the present disclosure described above. By bringing the test substance into contact with the cell laminate, it is possible to evaluate the influence of the test substance on the cell laminate, such as toxicity, or the permeability of the test substance into the cell laminate.
  • this cell laminate can be used for evaluation of a test substance as a skin thinning model or aging model.
  • the method for bringing the test substance into contact with the cell laminate is not particularly limited, and examples thereof include a method of applying to the epidermis layer.
  • the test substance is not particularly limited, and may be a pharmaceutical product or a cosmetic product, may be a component of a pharmaceutical product or a cosmetic product, or may be another compound.
  • the biological transplant material of the present disclosure includes the cell laminate of the present disclosure described above.
  • the cell laminate can be engrafted and self-organized. In this case, even if the structure or function of the cell laminate is incomplete, it is self-organized by the action of factors in the body after engraftment, and the purpose of treatment can be achieved.
  • artificial skin is produced by culturing patient-derived cells and transplanted to a patient as a biological transplant material.
  • a biological transplant material including a cell laminate produced using epidermis keratinocytes lacking a causative gene for skin diseases can also be used for treatment of patients with genetic skin diseases.
  • HaCaT cells lacking the IGF-1R gene were prepared by using HaCaT cells as epidermal keratinocytes and deleting the IGF-1R gene of the HaCaT cells by the CRISPR-Cas9 method.
  • HaCaT cells were prepared using 10 v / v% FBS (Thermo Fisher Scientific) and DMEM (Thermo Fisher Scientific) containing penicillin and streptomycin (pen / strep, Thermo Fisher Scientific) as a medium.
  • the cells were cultured in a humidified incubator at 37 ° C. and 5 v / v% CO 2 .
  • Passage is 0.25 w / v% trypsin-EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) (Thermo Fisher Scientific) when the occupancy rate is about 80% of the bottom area of the culture vessel (ie, 80% confluent). ) was used to collect the cells.
  • the medium was changed every 2 to 3 days.
  • plasmid vector for genome editing (2) Preparation of a plasmid vector for genome editing Using a commercially available kit (GeneArt CRISPR Nuclease Vector with OFP Reporter Kit, Thermo Fisher Scientific), a plasmid vector for genome editing (hereinafter simply referred to as “plasmid”) as follows. Or “vector”).
  • the plasmid vector attached to this kit can express Cas9 nuclease and gRNA with a single vector, and is equipped with an OFP (Orange Fluorescent Protein) gene as a reporter gene.
  • OFP Range Fluorescent Protein
  • a target sequence was selected.
  • CRISPRdirect http://crispr.dbcls.jp/
  • E-CRISP http://www.e-crisp.org/E-CRISP/
  • a target sequence was selected.
  • CRISPRdirect http://crispr.dbcls.jp/
  • E-CRISP http://www.e-crisp.org/E-CRISP/
  • a target sequence was selected.
  • CRISPRdirect http://crispr.dbcls.jp/
  • E-CRISP http://www.e-crisp.org/E-CRISP/
  • oligo DNAs (IGF1R.1, IGF1R.2, and IGF1R.3) encoding crRNA complementary to each target sequence were designed.
  • the base sequence of the designed oligo DNA is shown in Table 1 below.
  • Table 1 also shows the PAM sequence adjacent to each base sequence, the number of mismatched bases with the target sequence, and the gene position of the target sequence.
  • oligo DNA in which an additional sequence for ligation was added to the base sequence of each oligo DNA shown in Table 1 and its complementary sequence, denatured at 95 ° C., and then annealed at room temperature (25 ° C.), Double-stranded oligo DNA was prepared.
  • the prepared double-stranded oligo DNA was ligated to a vector using T4 DNA ligase attached to the kit.
  • E. coli (One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli) attached to the kit was transformed.
  • the transformed Escherichia coli was cultured in an agar medium supplemented with ampicillin. A part of E. coli that formed colonies was recovered, and the plasmid was purified using a plasmid recovery kit (QIAGEN). And it confirmed that it was the target plasmid by PCR using the U6 forward primer attached to the kit. Thereafter, Escherichia coli having the target plasmid was cultured again, and the plasmid was purified using a plasmid recovery kit (QIAGEN). The sequence of the plasmid was confirmed using a commercially available kit (BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit, ABI, “BigDye” is a registered trademark), and used for the subsequent experiments.
  • Plasmid for genome editing by lipofection method on HaCaT cells cultured until the occupancy rate is 70-80% of the bottom area of 24-well plate (Becton Dickinson) was introduced.
  • the plasmid was introduced using Lipofectamine 3000 reagent (Thermo Fisher Scientific, “Lipofectamine” is a registered trademark) according to the manufacturer's protocol. Forty-eight hours after the introduction of the plasmid, the medium was changed to remove dead cells.
  • OFP positive cells were confirmed with a fluorescence microscope (excitation wavelength: 548 nm, fluorescence wavelength: 560 nm), the plasmid introduction rate was about 2% to 3%.
  • the Cel1 assay was carried out using a commercially available kit (GeneArt Genomic Cleavage Detection Kit, Thermo Fisher Scientific) as follows.
  • the base sequences of the forward primer (hIGF-1R_E2_13F) and reverse primer (hIGF-1R_E2_401R) used for PCR are shown in Table 2 below.
  • Genomic DNA was extracted from OFP positive cells concentrated by FACS, and the region containing the target sequence of the IGF-1R gene was amplified using the above primers.
  • the amplification product was denatured at 95 ° C. and then annealed at room temperature (25 ° C.) to obtain double-stranded DNA.
  • Cel1 endonuclease was added to the double-stranded DNA after annealing, and incubated at 37 ° C. for 1 hour, and then the enzyme was inactivated by heat. Then, the amplified product after the enzyme reaction was electrophoresed on a 4 w / v% agarose gel (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) to confirm the electrophoresis pattern. As a result, three bands were detected and mutation introduction into the IGF-1R gene was confirmed.
  • FIG. 4 A part of the electrophoresis pattern in the Cel1 assay is shown in FIG. In FIG. 4, the lane indicated by a circle corresponds to a clone in which a mutation in the IGF-1R gene was confirmed.
  • IGF-1R protein was detected using an IGF-1R specific antibody (Thermo Fisher Scientific).
  • IGF-1R specific antibody Thermo Fisher Scientific
  • HaCaT cells into which no plasmid was introduced were used.
  • IGF-1R protein was not detected in 6 of the 24 clones, confirming deletion of the IGF-1R gene. It is presumed that clones in which no deletion of the IGF-1R gene was confirmed despite the fact that the IGF-1R gene mutation was confirmed did not cause a frameshift due to the gene mutation.
  • lane 3 lane 7, lane 10, lane 13, lane 16, and lane 21 correspond to 6 clones in which deletion of the IGF-1R gene was confirmed.
  • lane 7 clone hereinafter also referred to as “IGF-1R-deficient HaCaT cell 1”
  • lane 10 clone hereinafter also referred to as “IGF-1R-deficient HaCaT cell 2”.
  • the clone in lane 15 in which the deletion of the IGF-1R gene was not confirmed was used as a sham control cell. Thereafter, in all operations, the lane 15 clone was used as the sham control.
  • IGF-1R-deficient HaCaT cells 1 and sham control cells were 4 w / v% paraformaldehyde-containing PBS (Phosphate Buffered Saline) (20 g of paraformaldehyde dissolved in 500 mL of 0.1 mol / L PBS (pH 7.4)) It fixed by processing for 15 minutes in a pharmaceutical industry. The cells were washed twice with PBS, treated with PBS containing 0.1 v / v% Triton-X 100 for 20 minutes and then permeabilized, and then blocked with blocking agent (Blocking One, Nacalai Tesque) for 1 hour or longer.
  • PBS Phosphate Buffered Saline
  • Blocking was performed by processing. Thereafter, a 200-fold diluted solution of anti-IGF-1R antibody (Thermo Fisher Scientific) was added and reacted at 4 ° C. overnight. The cells were washed about 3 times with PBS, and then reacted for 2 hours with a 200-fold diluted anti-mouse-FITC (Fluorescein IsoThioCyanate) antibody (abcam). After washing with PBS about 3 times and nuclear staining with Hoechst (Dojindo Laboratories), the cells were sealed and observed with a fluorescence microscope (Keyence Corporation).
  • a fluorescence microscope Keyence Corporation
  • FIG. 6 The results of cell immunostaining are shown in FIG. The scale bar in the figure indicates 100 ⁇ m. As can be seen from FIG. 6, IGF-1R protein was confirmed in sham control cells, whereas IGF-1R protein was not confirmed in IGF-1R-deficient HaCaT cells 1.
  • FIG. 7 Western blot results are shown in FIG. In FIG. 7, “P” indicates the number of passages before the experiment, “P + 1” indicates that the passage has been performed once, “P + 2” indicates that the passage has been performed twice, and “P + 3” indicates that the passage has been performed three times. It means that it was passaged. As can be seen from FIG. 7, even when the IGF-1R-deficient HaCaT cell 1 and the IGF-1R-deficient HaCaT cell 2 were repeatedly passaged, the deletion of the IGF-1R gene continued.
  • Example 1 IGF-1R-deficient HaCaT cells 1 were cultured by a gas-liquid interface culture on a polycarbonate support to produce a cell laminate.
  • a normal human skin fibroblast medium, 10% v / v FBS-containing DMEM, and a normal human epidermal keratinocyte medium (HuMedia-KG2, Kurabo) excluding human epidermal growth factor (hEGF) are 1: 1. (Volume ratio).
  • CaCl 2 solution 225 ⁇ L prepared above was added to the resulting medium 500 mL.
  • the medium after the addition of the CaCl 2 solution was dispensed into a 50 mL falcon tube (Corning, “Falcon” is a registered trademark), and ascorbic acid 2-glucoside was added to a concentration of 0.1 w / w%, A layered medium was prepared.
  • the paraffin-embedded section was deparaffinized with xylene and then immersed in an aqueous ethanol solution whose concentration was gradually reduced from 100 v / v% to 70 v / v%.
  • the sample was washed with distilled water, then immersed in a hematoxylin staining solution (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) for 5 minutes, and washed with running water. Further, the sample was immersed in 70 v / v% ethanol containing 0.2 w / v% HCl for 1 second and washed with running water for 10 minutes.
  • FIG. 9 shows an HE-stained image of a cell laminate obtained by culturing IGF-1R-deficient HaCaT cells 1 and HaCaT cells as a control.
  • the scale bar in the figure indicates 50 ⁇ m.
  • the average thickness of the epidermal layer was about 55 ⁇ m, whereas it was obtained by culturing IGF-1R-deficient HaCaT cells 1.
  • the average thickness of the epidermal layer was about 25 ⁇ m, and the epidermal layer was significantly thinned (P ⁇ 0.01).
  • Example 2 IGF-1R-deficient HaCaT cells 1 were cultured by gas-liquid interface culture on a collagen gel (support layer) in which fibroblasts were embedded to produce a cell laminate.
  • the medium inside and outside the ring was removed, taking care not to break the layer of IGF-1R-deficient HaCaT cells 1 layered on the collagen gel, and the ring was removed using tweezers. Subsequently, the cell laminate medium was added from the end of the well. At that time, the volume of the medium was adjusted to about 2 to 3 mL so that the boundary between the IGF-1R-deficient HaCaT cell 1 and the collagen gel was immersed in the medium and the medium did not touch the IGF-1R-deficient HaCaT cell 1. From this day, gas-liquid interface culture was started and cultured for 7 days or 14 days. The medium was changed every two days.
  • FIG. 11 shows an HE-stained image of a cell laminate obtained by culturing IGF-1R-deficient HaCaT cells 1 and HaCaT cells as a control.
  • the scale bar in the figure indicates 50 ⁇ m.
  • the epidermal layer is thinner in the case of culturing on a collagen gel in which fibroblasts are embedded than in the case of culturing on a polycarbonate support.
  • the culture medium for cell laminates is less likely to contact the IGF-1R-deficient HaCaT cell 1 when culturing on a collagen gel in which fibroblasts are embedded.

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Abstract

特定遺伝子を欠損した表皮角化細胞が積層した表皮層を含む細胞積層体；特定遺伝子を欠損した表皮角化細胞を気液界面培養により培養する工程を含む細胞積層体の製造方法；及びそれらの応用。

Description

細胞積層体、細胞積層体の製造方法、表皮の増殖又は分化の評価方法、被験物質の評価方法、及び生体移植材料
　本開示は、細胞積層体、細胞積層体の製造方法、表皮の増殖又は分化の評価方法、被験物質の評価方法、及び生体移植材料に関する。
　細胞培養技術の進歩により、生体の皮膚を人工的に再構成し、生体の皮膚と類似した構造及び機能を有する人工皮膚を製造することが可能となっている。
　再構成された人工皮膚は、例えば、火傷、または創傷等の治療のための生体移植材料として使用されている。また、再構成された人工皮膚は、皮膚の構造又は機能を解明するための評価系、または医薬品、化粧品等を開発する際の評価系などとしても使用されており、これまで種々の技術が提案されている。
　例えば、特許第５４５８２５９号公報には、第１の細胞層、酵素処理されていないIV型コラーゲンからなる層、及び第２の細胞層がこの順番で積層されている細胞積層体であって、第２の細胞層が、線維芽細胞を含有するコラーゲンゲルであり、第２の細胞層が表皮角化細胞である、バイオアッセイ系として使用するための細胞積層体が開示されている。
　特許第５２２８２４６号公報には、エピモルフィンをコードする核酸が発現可能に導入されている遺伝子導入表皮基底細胞を、支持体上で三次元に培養して得られる三次元疾患皮膚再構築物が開示されている。
　皮膚の構造及び機能には種々の内在遺伝子が関与している。しかし、特許第５４５８２５９号公報の細胞積層体は、皮膚の内在遺伝子に着目したものではなかった。また、特許第５２２８２４６号公報の三次元疾患皮膚再構築物は、外来遺伝子を導入した細胞を培養して得られるものであり、皮膚の内在遺伝子に着目したものではなかった。
　本発明の一実施形態は、特定遺伝子を欠損した表皮角化細胞を培養して得られる新規な細胞積層体及びその製造方法を提供することを課題とする。また、本発明の一実施形態は、細胞積層体及びその製造方法を応用した表皮の増殖又は分化の評価方法、被験物質の評価方法、及び生体移植材料を提供することを課題とする。
　上記課題を解決するための具体的手段には、以下の態様が含まれる。
　＜１＞　特定遺伝子を欠損した表皮角化細胞が積層した表皮層を含む細胞積層体。
　＜２＞　表皮角化細胞がヒト表皮角化細胞である、＜１＞に記載の細胞積層体。
　＜３＞　支持層をさらに含む、＜１＞又は＜２＞に記載の細胞積層体。
　＜４＞　支持層が、間葉系細胞及び間葉系幹細胞の少なくとも一方とコラーゲンとを含む層である、＜３＞に記載の細胞積層体。
　＜５＞　特定遺伝子が細胞膜受容体の遺伝子を含む、＜１＞～＜４＞のいずれか１つに記載の細胞積層体。
　＜６＞　特定遺伝子がインスリン様成長因子１受容体の遺伝子を含む、＜１＞～＜５＞のいずれか１つに記載の細胞積層体。
　＜７＞　特定遺伝子を欠損した表皮角化細胞を気液界面培養により培養する工程を含む細胞積層体の製造方法。
　＜８＞　表皮角化細胞がヒト表皮角化細胞である、＜７＞に記載の細胞積層体の製造方法。
　＜９＞　部位特異的ヌクレアーゼを用いて表皮角化細胞の特定遺伝子を欠損させる工程をさらに含む、＜７＞又は＜８＞に記載の細胞積層体の製造方法。
　＜１０＞　特定遺伝子を欠損した表皮角化細胞を気液界面培養により培養する工程が、特定遺伝子を欠損した表皮角化細胞を、支持層上で気液界面培養により培養することを含む、＜７＞～＜９＞のいずれか１つに記載の細胞積層体の製造方法。
　＜１１＞　支持層が、間葉系細胞及び間葉系幹細胞の少なくとも一方とコラーゲンとを含む層である、＜１０＞に記載の細胞積層体の製造方法。
　＜１２＞　特定遺伝子が細胞膜受容体の遺伝子を含む、＜７＞～＜１１＞のいずれか１つに記載の細胞積層体の製造方法。
　＜１３＞　特定遺伝子がインスリン様成長因子１受容体の遺伝子を含む、＜７＞～＜１２＞のいずれか１つに記載の細胞積層体の製造方法。
　＜１４＞　特定遺伝子を欠損した表皮角化細胞を気液界面培養により培養する工程を含む表皮の増殖又は分化の評価方法。
　＜１５＞　特定遺伝子を欠損した表皮角化細胞を、被験物質の存在下、気液界面培養により培養する工程を含む被験物質の評価方法。
　＜１６＞　＜１＞～＜６＞のいずれか１つに記載の細胞積層体に被験物質を接触させる工程を含む被験物質の評価方法。
　＜１７＞　＜１＞～＜６＞のいずれか１つに記載の細胞積層体を含む生体移植材料。
　本開示によれば、特定遺伝子を欠損した表皮角化細胞を培養して得られる新規な細胞積層体及びその製造方法を提供することができる。また、本開示によれば、細胞積層体及びその製造方法を応用した表皮の増殖又は分化の評価方法、被験物質の評価方法、及び生体移植材料を提供することができる。
図１は、本開示の細胞積層体の製造方法における培養工程の一例を模式的に示す図である。 図２は、本開示の細胞積層体の製造方法における培養工程の他の例を模式的に示す図である。 図３は、ＣＲＩＳＰＥＲ－ＣＡＳ９（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats - CRISPR associated proteins 9）法によりＨａＣａＴ細胞のインスリン様成長因子－１受容体（IGF-1R）遺伝子を欠損させる際の、ＩＧＦ－１Ｒ遺伝子上の標的配列の位置を示す図である。 図４は、ＣＲＩＳＰＥＲ－ＣＡＳ９用のプラスミドベクターをＨａＣａＴ細胞に導入し、クローニングした後のＣｅｌ１アッセイ結果を示す図である。 図５は、クローニング後のＣｅｌ１アッセイ陽性株を用いたウェスタンブロット結果を示す図である。 図６は、クローニング後のＣｅｌ１アッセイ陽性株を用いた細胞免疫染色結果を示す図である。 図７は、ＩＧＦ－１Ｒ遺伝子を欠損したＨａＣａＴ細胞の継代後におけるウェスタンブロット結果を示す図である。 図８は、ＩＧＦ－１Ｒ遺伝子を欠損したＨａＣａＴ細胞について、ＩＧＦ－１Ｒ遺伝子の標的配列を含む領域のシークエンスを確認した結果を示す図である。 図９は、ＩＧＦ－１Ｒ遺伝子を欠損したＨａＣａＴ細胞を支持体上で気液界面培養により培養して製造した細胞積層体のＨＥ（ヘマトキシリン・エオシン）染色像を示す図である。 図１０は、ＩＧＦ－１Ｒ遺伝子を欠損したＨａＣａＴ細胞を支持体上で気液界面培養により培養して製造した細胞積層体の表皮層の平均厚さを示す図である。 図１１は、ＩＧＦ－１Ｒ遺伝子を欠損したＨａＣａＴ細胞を支持層（線維芽細胞が包埋されたコラーゲンゲル）上で気液界面培養により培養して製造した細胞積層体のＨＥ染色像を示す図である。
　以下、本開示の細胞積層体、細胞積層体の製造方法、表皮の増殖又は分化の評価方法、被験物質の評価方法、及び生体移植材料について、詳細に説明する。但し、本発明は、以下の実施形態に何ら限定されるものではなく、本発明の目的の範囲内において、適宜変更を加えて実施することができる。
　本明細書において「～」を用いて示された数値範囲は、「～」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を意味する。
　本明細書中に段階的に記載されている数値範囲において、ある数値範囲で記載された上限値又は下限値は、他の段階的な記載の数値範囲の上限値又は下限値に置き換えてもよい。また、本明細書中に記載されている数値範囲において、ある数値範囲で記載された上限値又は下限値は、実施例に示されている値に置き換えてもよい。
　本明細書において各成分の濃度は、各成分に該当する物質が複数種類存在する場合には、特に断らない限り、複数種類の物質の合計の濃度を意味する。
　本明細書において「層」との語には、その層が存在する領域を観察したときに、領域の全体に形成されている場合に加え、領域の一部にのみ形成されている場合も含まれる。
　本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけではなく、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。
＜細胞積層体＞
　本開示の細胞積層体は、特定遺伝子を欠損した表皮角化細胞（以下、「遺伝子欠損表皮角化細胞」ともいう。）が積層した表皮層を含む。本開示の細胞積層体は、表皮層のみを有していてもよく、後述する支持層等の表皮層以外の層をさらに含んでいてもよい。
（表皮層）
　表皮層は、少なくとも遺伝子欠損表皮角化細胞が積層した層である。ここで、「積層」とは、遺伝子欠損表皮角化細胞が積み重なっていればよく、層の区分が明瞭に確認できることを要しない。
　表皮角化細胞としては、例えば、哺乳動物由来の細胞が挙げられる。哺乳動物の例としては、ヒト、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジー等の霊長類；マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類；及びウサギ、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ミンク、イヌ、ネコ；などが挙げられる。これらの中でも、霊長類の表皮角化細胞が好ましく、ヒト表皮角化細胞がより好ましい。
　ヒト表皮角化細胞の種類は特に制限されず、その例としては、ＨａＣａＴ細胞（J. Invest. Dermatol., 1999, 112(3):343-353）、ＨＤＫ（Human Dermal Keratinocyte）細胞（Cancer Sci., 2007, 98:147-154）、及びＮＨＥＫ（Normal Human Epidermal Keratinocyte）細胞等が挙げられる。これらの中でも、細胞の性質が継代回数によらず比較的均一であり、取り扱いが簡便であり、細胞分化状態が正常である点から、ＨａＣａＴ細胞が好ましい。
　表皮角化細胞は、非不死化細胞であっても不死化細胞であってもよい。非不死化細胞とは、有限回の細胞分裂により増殖が停止する細胞を意味する。一方、不死化細胞とは、細胞分裂を繰り返しても増殖が停止しない細胞、すなわち、無限自律増殖能を獲得した細胞を意味する。細胞の不死化は、ＳＶ（Simian Virus）４０ Ｔ抗原遺伝子、ＴＥＲＴ（Telomerase Reverse Transcriptase）遺伝子、ＨＰＶ（Human Papilloma Virus） Ｅ６－Ｅ７遺伝子等の不死化遺伝子を細胞に導入することにより行うことができる。また、細胞の不死化は、偶発的に生じることもある。例えば、上述したＨａＣａＴ細胞は、不死化遺伝子を導入することなく、自然に不死化して樹立された不死化細胞である。
　表皮角化細胞が欠損する特定遺伝子の種類は特に制限されない。特定遺伝子の例としては、細胞膜受容体の遺伝子、皮膚疾患の原因遺伝子等が挙げられる。細胞膜受容体の例としては、インスリン様成長因子－１受容体（IGF-1R）、上皮成長因子受容体（EGF-R）等のチロシンキナーゼ受容体；Ｇタンパク質共役型受容体；グアニル酸シクラーゼ受容体；及びイオンチャネル型受容体；などが挙げられる。表皮角化細胞が欠損する特定遺伝子は、１種類であっても２種類以上であってもよい。
　ある態様では、特定遺伝子は、細胞膜受容体の遺伝子（例えば、ＩＧＦ－１Ｒ遺伝子）を含む。生体の表皮層の恒常性には、細胞膜受容体の遺伝子が重要な役割を果たしていると考えられるため、細胞膜受容体の遺伝子を欠損した表皮角化細胞を用いることにより、従来とは異なる新規な細胞積層体を得ることができる。例えば、後述する実施例に示すとおり、ＩＧＦ－１Ｒ遺伝子を欠損した表皮角化細胞を気液界面培養により培養することで、表皮層が菲薄化した細胞積層体を得ることができる。
　また、他の態様では、特定遺伝子は、皮膚疾患の原因遺伝子を含む。後述するように、皮膚疾患の原因遺伝子を欠損した表皮角化細胞を用いて製造した細胞積層体は、生体移植材料として、皮膚疾患の治療に使用し得る。
　遺伝子欠損表皮角化細胞は、表皮角化細胞の特定遺伝子を欠損させることにより得ることができる。特定遺伝子を特異的に欠損させる観点から、表皮角化細胞の特定遺伝子を欠損させる方法としては、部位特異的ヌクレアーゼを用いた方法が好ましい。部位特異的ヌクレアーゼを用いた方法の例としては、例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９法、ＴＡＬＥＮ（登録商標、Transcription Activator-Like Effector Nucleases）法、及びＺＦＮ（Zinc Finger Nucleases）法が挙げられる。ある態様では、遺伝子欠損表皮角化細胞は、表皮角化細胞の特定遺伝子をインビトロで欠損させることにより得られる。
　これらの中でも、簡便性及びゲノムＤＮＡ上の複数箇所を同時に編集可能である点から、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９法が好ましい。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９法の原理は以下のとおりである。すなわち、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９法では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ及びｇＲＮＡ（guide RNA）を細胞内に導入する。ｇＲＮＡは、標的配列（例えば、欠損させる遺伝子上の配列）に相補的な塩基配列を有するｃｒＲＮＡ（CRISPR RNA）と、ｔｒａｃｒＲＮＡ（trans-activating crRNA）とから構成され、ゲノムＤＮＡに結合することで、Ｃａｓ９ヌクレアーゼによる標的配列の切断を誘導する。切断されたゲノムＤＮＡの修復過程で標的配列の変異が引き起こされ、その結果、遺伝子を欠損させることが可能となる。
　Ｃａｓ９ヌクレアーゼ及びｇＲＮＡを細胞内に導入する方法としては、例えば、以下の（ａ）～（ｄ）の方法が知られている。これらの中でも、簡便性及び導入効率の観点から（ａ）の方法が好ましい。
　（ａ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードするＤＮＡとｇＲＮＡをコードするＤＮＡとを、プラスミドベクターを介して細胞内に導入する方法。
　（ｂ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードするＤＮＡを、ウイルスベクターを介して細胞内に導入し、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡを直接細胞内に導入する方法。
　（ｃ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードするＲＮＡとｇＲＮＡとをin vitro転写により作製し、直接細胞内に導入する方法。
　（ｄ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼのリコンビナントタンパク質とin vitro転写により作製したｇＲＮＡとを直接細胞内に導入する方法。
　表皮層は、１種類の遺伝子欠損表皮角化細胞を含んでいてもよく、２種類以上の遺伝子欠損表皮角化細胞を含んでいてもよい。２種類以上の遺伝子欠損表皮角化細胞を含む態様としては、例えば、表皮角化細胞の細胞種が同じであるものの、欠損する特定遺伝子の種類が異なる２種類以上の遺伝子欠損表皮角化細胞を含む態様；欠損する特定遺伝子の種類が同じであるものの、表皮角化細胞の細胞種が異なる２種類以上の遺伝子欠損表皮角化細胞を含む態様；並びに、表皮角化細胞の細胞種及び欠損する特定遺伝子の種類が異なる２種類以上の遺伝子欠損表皮角化細胞を含む態様；が挙げられる。
　表皮層は、遺伝子欠損表皮角化細胞以外のその他の細胞を含んでいてもよい。その他の細胞の例としては、メラノサイト、及び免疫系の細胞等が挙げられる。
　遺伝子欠損表皮角化細胞以外のその他の細胞の細胞数は、表皮層の細胞数全体に対して、２０％以下であってもよく、１５％以下であってもよく、１０％以下であってもよい。
　また、表皮層は、基底層、有棘層、顆粒層、及び角層の４層構造が確認されるものであってもよく、一部の層のみが確認されるものであってもよい。上記の各層の確認方法は特に制限されず、公知の方法により確認することができる。一般的には、表皮層をＨＥ染色し、光学顕微鏡下で特徴的な構造及び位置情報を確認することにより、各層を確認することができる。
（支持層）
　本開示の細胞積層体は、支持層をさらに含んでいてもよい。支持層としては、表皮層を支持し、細胞積層体を形成できるものであれば特に制限されない。
　遺伝子欠損表皮角化細胞を気液界面培養により培養する際の準備及び取り扱いが容易になるという観点からは、支持層は、メンブレンフィルタであってもよい。メンブレンフィルタの材料の例としては、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリカーボネート、及びポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）等が挙げられる。
　また、細胞積層体の構造及び機能を生体の皮膚により近付けることができるという観点からは、支持層は、間葉系細胞及び間葉系幹細胞の少なくとも一方とコラーゲンとを含む層（以下、「コラーゲン含有層」ともいう。）であることが好ましい。コラーゲン含有層は、皮膚の真皮層に相当する。生体の表皮層の恒常性には、真皮層から供給される成長因子及び栄養分のほか、細胞間のシグナル伝達が重要な役割を果たしている。本開示の細胞積層体がコラーゲン含有層をさらに含むことにより、細胞積層体の構造及び機能を生体の皮膚により近付けることが可能となる。
　コラーゲン含有層に含まれる間葉系細胞及び間葉系幹細胞としては、例えば、哺乳動物由来の細胞が挙げられる。哺乳動物の例としては、ヒト、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジー等の霊長類；マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類；及びウサギ、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ミンク、イヌ、ネコ；などが挙げられる。これらの中でも、霊長類の細胞が好ましく、ヒトの細胞がより好ましい。
　間葉系細胞の種類は特に制限されず、その例としては、線維芽細胞、脂肪細胞、心筋細胞、骨細胞、軟骨細胞、及び腱細胞等が挙げられる。これらの中でも、細胞積層体を生体の皮膚により近付ける観点から、線維芽細胞が好ましい。
　また、間葉系幹細胞の種類は特に制限されず、その例としては、骨髄、脂肪組織、胎盤組織、臍帯組織、又は歯髄等に由来する間葉系幹細胞が挙げられる。これらの中でも、未分化性の維持の観点から、骨髄由来間葉系幹細胞が好ましい。間葉系幹細胞が骨髄由来であることは、例えば、細胞免疫染色、フローサイトメーター、又はウェスタンブロッティング等によって、細胞のＣＤ（Cluster of Differentiation）抗原を分析することにより判別することができる。
　間葉系細胞及び間葉系幹細胞は、非不死化細胞であっても不死化細胞であってもよい。表皮の増殖状態及び分化状態を生体の表皮に近付ける観点から、間葉系細胞及び間葉系幹細胞は、非不死化細胞であることが好ましい。
　コラーゲン含有層は、１種類の間葉系細胞を含んでいてもよく、２種類以上の間葉系細胞を含んでいてもよい。また、コラーゲン含有層は、１種類の間葉系幹細胞を含んでいてもよく、２種類以上の間葉系幹細胞を含んでいてもよい。
　コラーゲン含有層に含まれるコラーゲンとしては特に制限されず、例えば、ゲル化する線維性コラーゲンが挙げられる。線維性コラーゲンとしては、例えば、Ｉ型コラーゲン、II型コラーゲン、III型コラーゲン、Ｖ型コラーゲン、及びXI型コラーゲンが挙げられ、Ｉ型コラーゲン及びIII型コラーゲンが好ましく、Ｉ型コラーゲンがより好ましい。コラーゲンは酸可溶化コラーゲンであってもよい。コラーゲンとしては、酸可溶化Ｉ型コラーゲンがさらに好ましい。
　また、コラーゲンの由来は特に制限されず、その例としては、ヒト、ウシ、ウマ、ブタ、マウス、又はラット等に由来するコラーゲンが挙げられる。
　コラーゲン含有層は、１種類のコラーゲンを含んでいてもよく、２種類以上のコラーゲンを含んでいてもよい。
　コラーゲン含有層としては、例えば、間葉系細胞及び間葉系幹細胞の少なくとも一方が包埋されたコラーゲンゲルが挙げられる。このようなコラーゲンゲルは、例えば、間葉系細胞及び間葉系幹細胞の少なくとも一方とコラーゲンとを培地に添加したコラーゲン溶液をゲル化させることにより作製することができる。培地としては特に制限されず、例えば、後述する気液界面培養に用いられる細胞積層体用培地が挙げられる。コラーゲンゲルの密度は、例えば、０．１ｍｇ／ｍＬ～１００ｍｇ／ｍＬ程度が好ましい。
　コラーゲン含有層は、間葉系細胞及び間葉系幹細胞以外のその他の細胞を含んでいてもよい。その他の細胞の例としては、免疫系の細胞等が挙げられる。
　コラーゲン含有層の底面積１ｃｍ２あたりの細胞密度は、例えば、１×１０５個／ｃｍ２以上であることが好ましく、２．５×１０５個／ｃｍ２以上であることがより好ましく、５×１０５個／ｃｍ２以上であることがさらに好ましく、１×１０６個／ｃｍ２以上であることが特に好ましい。コラーゲン含有層中の細胞数の計測は、セルカウンター又は血球計算盤を用いて、常法により行うことができる。また、ＭＴＴ法による比色によっても、検量線に基づいて細胞数を見積もることができる。なお、ＭＴＴ法とは、ＭＴＴ（３－（４，５－ジメチル－チアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロマイド）又は類似の色素をホルマザン色素（紫色）へと還元する酵素活性を測定する比色定量法である。
（その他の層）
　本開示の細胞積層体は、表皮層及び支持層以外のその他の層をさらに含んでいてもよい。例えば、本開示の細胞積層体は、表皮層と支持層との間に、酵素処理されていないIV型コラーゲンからなる層（特許第５４５８２５９号公報を参照）を含んでいてもよい。
＜細胞積層体の製造方法＞
　本開示の細胞積層体の製造方法は、特定遺伝子を欠損した表皮角化細胞（すなわち、上述した遺伝子欠損表皮角化細胞）を気液界面培養により培養する工程（以下、「培養工程」ともいう。）を含む。表皮角化細胞は、好ましくはヒト表皮角化細胞である。
　本開示の細胞積層体の製造方法は、部位特異的ヌクレアーゼを用いて表皮角化細胞の特定遺伝子を欠損させる工程をさらに含んでいてもよい。部位特異的ヌクレアーゼを用いた方法としては、例えば、上述したＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９法が挙げられる。ある態様では、特定遺伝子は、細胞膜受容体の遺伝子（例えば、ＩＧＦ－１Ｒ遺伝子）を含む。ある態様では、部位特異的ヌクレアーゼを用いて表皮角化細胞の特定遺伝子を欠損させる工程は、インビトロで行われる。後述する実施例に示すとおり、ＩＧＦ－１Ｒ遺伝子を欠損した表皮角化細胞を気液界面培養により培養することで、表皮層が菲薄化した細胞積層体を得ることができる。
（培地）
　培養工程で用いる培地（以下、「細胞積層体用培地」ともいう。）としては、例えば、基本培地に血清を添加した培地が挙げられる。細胞積層体用培地は、ＣａＣｌ２、アスコルビン酸誘導体、抗生物質、及び／又はｐＨ緩衝剤等をさらに含有していてもよい。
　基本培地の例としては、ＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle Medium）、ＥＭＥＭ（Eagle's Minimum Essential Medium）、ＭＥＭα（Minimum Essential Medium Alpha modification）、ＲＰＭＩ １６４０（Roswell Park Memorial Institute 1640）培地、及びＨａｍＦ１２（Ham's F12）培地等が挙げられる。基本培地は、１種類を単独で用いてもよく、２種類以上を混合して用いてもよい。
　血清の例としては、ＦＢＳ（Fetal bovine serum）等が挙げられる。細胞積層体用培地中の血清の濃度は、例えば、５ｖ／ｖ％～２０ｖ／ｖ％であることが好ましい。
　細胞積層体用培地は、ＣａＣｌ２を含有することが好ましい。細胞積層体用培地がＣａＣｌ２を含有することにより、表皮角化細胞の分化が促進される傾向にある。また、カルシウムイオンは、細胞間接着に必要なイオンでもある。
　細胞積層体用培地がＣａＣｌ２を含有する場合、細胞積層体用培地中のカルシウム濃度は、例えば、０．５ｍｍｏｌ／Ｌ～５ｍｍｏｌ／Ｌであることが好ましく、１ｍｍｏｌ／Ｌ～３ｍｍｏｌ／Ｌであることがより好ましい。
　細胞積層体用培地は、アスコルビン酸誘導体を含有することが好ましい。細胞積層体用培地がアスコルビン酸誘導体を含有することにより、表皮角化細胞が賦活化され、分化が促進される傾向にある。
　アスコルビン酸誘導体の例としては、アスコルビン酸、アスコルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸カリウム、アスコルビン酸カルシウム、Ｌ－アスコルビン酸リン酸エステル、リン酸アスコルビルマグネシウム、リン酸アスコルビルナトリウム、硫酸アスコルビル、硫酸アスコルビル二ナトリウム塩、及びアスコルビル－２－グルコシド等が挙げられる。
　細胞積層体用培地がアスコルビン酸誘導体を含有する場合、細胞積層体用培地中のアスコルビン酸誘導体の濃度は、例えば、０．０１ｗ／ｗ％～１ｗ／ｗ％であることが好ましい。
　細胞積層体用培地は、抗生物質を含有していてもよい。抗生物質の例としては、ペニシリン、ストレプトマイシン、ネオマイシン、アムホテリシンＢ、カナマイシン、及びゲンタマイシン等が挙げられる。
　細胞積層体用培地は、ｐＨ緩衝剤を含有していてもよい。ｐＨ緩衝剤の例としては、炭酸水素ナトリウム、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、２－［４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル］エタンスルホン酸（HEPES）、及び３－モルホリノプロパン－１－スルホン酸（MOPS）等が挙げられる。
　細胞積層体用培地のｐＨは、例えば、ｐＨ６．８～ｐＨ７．６であることが好ましく、ｐＨ７．０～ｐＨ７．４であることがより好ましい。
（培養工程）
　遺伝子欠損表皮角化細胞を気液界面培養により培養し、細胞積層体を製造する方法は特に制限されず、例えば、表皮角化細胞を用いて人工皮膚を製造する公知の方法を採用することができる。遺伝子欠損表皮角化細胞の気液界面培養は、ポリカーボネート製のセルカルチャーインサート等の支持体上で行ってもよく、上述した支持層上で行ってもよい。
　培養工程の一例を図１に示す。まず、支持体１０上に遺伝子欠損表皮角化細胞３０を播種し、培養することにより、遺伝子欠損表皮角化細胞の層を形成する。次いで、遺伝子欠損表皮角化細胞の層上の培地を取り除いて気液界面を形成し、培養を続けることにより、遺伝子欠損表皮角化細胞が積層した表皮層４０からなる細胞積層体５０を得ることができる。
　培養工程の他の例を図２に示す。まず、支持層２０として、間葉系細胞及び間葉系幹細胞の少なくとも一方が包埋されたコラーゲンゲルを準備する。次いで、支持層２０上に遺伝子欠損表皮角化細胞３０を播種し、培養することにより、遺伝子欠損表皮角化細胞の層を形成する。次いで、遺伝子欠損表皮角化細胞の層上の培地を取り除いて気液界面を形成し、培養を続けることにより、支持層２０と、遺伝子欠損表皮角化細胞が積層した表皮層４０とからなる細胞積層体６０を得ることができる。
　支持体１０上又は支持層２０上に播種する遺伝子欠損表皮角化細胞の継代数は特に制限されない。遺伝子欠損表皮角化細胞が非不死化細胞である場合には、遺伝子欠損表皮角化細胞の継代数は、例えば、１０継代以下であることが好ましく、８継代以下であることがより好ましく、５継代以下であることがさらに好ましい。
　気液界面培養の培養条件としては、一般的な条件を採用することができる。例えば、３７℃、５ｖ／ｖ％ ＣＯ２の条件を採用することができる。
　気液界面培養による培養日数は、例えば、１０日以上であることが好ましく、１１日以上であることがより好ましい。培養日数を１０日以上とすることで、表皮層の分化状態が十分なものとなる傾向にある。培養日数の上限は特に制限されず、一般的には３０日以内であり、２５日以内であることが好ましい。
　なお、以上では、遺伝子欠損表皮角化細胞のみを播種するものとして説明したが、遺伝子欠損表皮角化細胞とともにメラノサイト等の他の細胞を播種してもよい。
＜表皮の増殖又は分化の評価方法＞
　本開示の表皮の増殖又は分化の評価方法は、特定遺伝子を欠損した表皮角化細胞（すなわち、上述した遺伝子欠損表皮角化細胞）を気液界面培養により培養する工程を含む。遺伝子欠損表皮角化細胞を気液界面培養により培養して細胞積層体を製造することで、表皮の増殖又は分化を評価することができる。また、表皮の増殖状態又は分化状態から、特定遺伝子の機能を評価することもできる。
　なお、遺伝子欠損表皮角化細胞を気液界面培養により培養する工程は、上述した本開示の細胞積層体の製造方法と同様であるため、詳細な説明を省略する。
　本開示の表皮の増殖又は分化の評価方法では、例えば、遺伝子欠損表皮角化細胞を気液界面培養により培養して細胞積層体を製造した後、表皮層をＨＥ染色して光学顕微鏡で観察することにより、表皮の増殖状態又は分化状態を評価することができる。
　また、本開示の表皮の増殖又は分化の評価方法では、例えば、遺伝子欠損表皮角化細胞を気液界面培養により培養して細胞積層体を製造し、表皮層の細胞における遺伝子発現を検出することにより、表皮の分化状態を評価することができる。
　表皮の分化状態の指標となる遺伝子の例としては、ロリクリン遺伝子（LOR）、ペリオスチン遺伝子（POSTN）、トランスグルタミナーゼ３遺伝子（TGM3）、ウィングレス型ＭＭＴＶ（Mouse Mammary Tumor Virus）組み込み部位ファミリーメンバー３遺伝子（WNT3）、ウィングレス型ＭＭＴＶ組み込み部位ファミリーメンバー４遺伝子（WNT4）、フィラグリン遺伝子（FLG）、カリクレイン関連ペプチダーゼ１４遺伝子（KLK14）、デスモコリン１遺伝子（DSC1）、カスパーゼ１４遺伝子（CASP14）、及びフィブロネクチン１遺伝子（FN1）等が挙げられる。これらの中でも、ロリクリン遺伝子、フィラグリン遺伝子、及びカスパーゼ１４遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子の発現を検出することが好ましく、フィラグリン遺伝子の発現を検出することがより好ましい。
　遺伝子発現の検出方法は特に制限されない。例えば、ＲＴ－ＰＣＲ（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction）法又はマイクロアレイ法により、上記の遺伝子に対応するＲＮＡの発現を検出することができる。また、ＥＬＩＳＡ（Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay）法又はウェスタンブロット法により、上記の遺伝子に対応するタンパク質の発現を検出することもできる。
＜被験物質の評価方法＞
　一実施形態の被験物質の評価方法は、特定遺伝子を欠損した表皮角化細胞（すなわち、上述した遺伝子欠損表皮角化細胞）を、被験物質の存在下、気液界面培養により培養する工程を含む。被験物質の存在下で遺伝子欠損表皮角化細胞を気液界面培養により培養し、細胞積層体を製造することで、細胞積層体の構造、機能等に対する被験物質の影響を評価することができる。
　なお、遺伝子欠損表皮角化細胞を気液界面培養により培養する工程は、被験物質の存在下で培養する点を除き、上述した本開示の細胞積層体の製造方法と同様であるため、詳細な説明を省略する。
　「被験物質の存在下」とは、遺伝子欠損表皮角化細胞に被験物質が接触し得る状況下であれば特に制限されない。例えば、上述した細胞積層体用培地に被験物質を添加してもよい。また、上述したコラーゲン含有層に被験物質を含有させてもよく、上述したコラーゲン含有層に被験物質を分泌する細胞を含有させてもよい。
　被験物質としては特に制限されず、医薬品又は化粧品の含有成分であってもよく、サイトカイン等の生体関連物質であってもよく、その他の化合物であってもよい。
　他の実施形態の被験物質の評価方法は、上述した本開示の細胞積層体に被験物質を接触させる工程を含む。細胞積層体に被験物質を接触させることで、細胞積層体に対する被験物質の毒性等の影響、又は細胞積層体への被験物質の浸透性などを評価することができる。
　例えば、後述する実施例に示すとおり、ＩＧＦ－１Ｒ遺伝子を欠損した表皮角化細胞を気液界面培養により培養することで、表皮層が菲薄化した細胞積層体を得ることができる。そこで、この細胞積層体を皮膚の菲薄化モデル又は老化モデルとして、被験物質の評価に使用することができる。
　細胞積層体に被験物質を接触させる方法は特に制限されず、例えば、表皮層に塗布する方法が挙げられる。
　被験物質としては特に制限されず、医薬品又は化粧品であってもよく、医薬品又は化粧品の含有成分であってもよく、その他の化合物であってもよい。
＜生体移植材料＞
　本開示の生体移植材料は、上述した本開示の細胞積層体を含む。本開示の生体移植材料を疾患部位等に移植すると、細胞積層体が生着し、自己組織化し得る。この場合、細胞積層体の構造又は機能が不完全であっても、生着後には生体内の因子の作用により自己組織化され、治療の目的を達成することができる。
　従来、患者由来の細胞を培養して人工皮膚を製造し、生体移植材料として患者に移植することが行われている。しかし、遺伝的な皮膚疾患を有する患者の場合には、このような人工皮膚を移植しても疾患の改善は期待できない。この点、皮膚疾患の原因遺伝子を欠損した表皮角化細胞を用いて製造した細胞積層体を含む生体移植材料は、遺伝的な皮膚疾患を有する患者の治療にも使用し得る。
　以下、本発明の一実施形態を実施例によりさらに具体的に説明する。但し、本発明の実施形態は、その主旨を超えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。
＜参考例１＞
　参考例１では、表皮角化細胞としてＨａＣａＴ細胞を用い、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９法によりＨａＣａＴ細胞のＩＧＦ－１Ｒ遺伝子を欠損させることにより、ＩＧＦ－１Ｒ遺伝子を欠損したＨａＣａＴ細胞を作製した。
（１）ＨａＣａＴ細胞の培養
　ＨａＣａＴ細胞は、１０ｖ／ｖ％ ＦＢＳ（Thermo Fisher Scientific社）並びにペニシリン及びストレプトマイシン（pen/strep、Thermo Fisher Scientific社）を含有するＤＭＥＭ（Thermo Fisher Scientific社）を培地として、加湿したインキュベーター中、３７℃、５ｖ／ｖ％ ＣＯ２の条件で培養した。継代は、培養容器の底面積に対して８割程度の占有率（すなわち、８０％コンフルエント）となった時点で、０．２５ｗ／ｖ％ トリプシン－ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）（Thermo Fisher Scientific社）を用いて細胞を回収することによって行った。培養中は、２日～３日おきに培地交換を実施した。
（２）ゲノム編集用のプラスミドベクターの作製
　市販のキット（GeneArt CRISPR Nuclease Vector with OFP Reporter Kit、Thermo Fisher Scientific社）を用いて、以下のようにゲノム編集用のプラスミドベクター（以下、単に「プラスミド」又は「ベクター」ともいう。）を作製した。本キットに付属のプラスミドベクターは、単一のベクターでＣａｓ９ヌクレアーゼ及びｇＲＮＡを発現させることができ、且つ、レポーター遺伝子としてＯＦＰ（Orange Fluorescent Protein）遺伝子が搭載されている。
　まず、CRISPRdirect（http://crispr.dbcls.jp/）、又はE-CRISP（http://www.e-crisp.org/E-CRISP/）等のソフトウェアを利用して、ゲノムＤＮＡ上の標的配列を選択した。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９法により遺伝子を欠損させる場合、遺伝子の上流側から標的配列を選択することが好ましい。そこで、ＩＧＦ－１Ｒ遺伝子の第１エクソン及び第２エクソンの中から、ＰＡＭ（Proto-spacer Adjacent Motif）配列に隣接する１９塩基長～２０塩基長の領域を検索した。さらに、検索された候補配列についてゲノムＤＮＡ上のホモロジー検索を実施し、非特異的に認識する箇所の有無を確認した。その結果、３種類の標的配列を選択した。３種類の標的配列のＩＧＦ－１Ｒ遺伝子上の位置を図３に示す。図３中、四角で囲んでいる箇所が標的配列である。
　そして、各標的配列に基づいて、各標的配列に相補的なｃｒＲＮＡをコードする３種類のオリゴＤＮＡ（IGF1R.1、IGF1R.2、及びIGF1R.3）を設計した。設計したオリゴＤＮＡの塩基配列を下記の表１に示す。なお、表１には、各塩基配列に隣接するＰＡＭ配列、標的配列とのミスマッチ塩基数、及び標的配列の遺伝子位置についても併せて示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 
　次いで、表１に示す各オリゴＤＮＡの塩基配列及びその相補配列にライゲーション用の付加配列を加えたオリゴＤＮＡを作製し、９５℃で変性させた後、室温（２５℃）でアニーリングすることにより、２本鎖オリゴＤＮＡを作製した。作製した２本鎖オリゴＤＮＡを、キットに付属のＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いてベクターにライゲーションした。
　次いで、ライゲーション後のベクターを用いて、キットに付属の大腸菌（One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli）の形質転換を行った。形質転換後の大腸菌は、アンピシリン添加の寒天培地にて培養した。コロニーを形成した大腸菌の一部を回収し、プラスミド回収キット（QIAGEN社）を用いてプラスミドを精製した。そして、キットに付属のＵ６フォワードプライマーを用いたＰＣＲにより、目的のプラスミドであることを確認した。その後、目的のプラスミドを有する大腸菌を再度培養し、プラスミド回収キット（QIAGEN社）を用いてプラスミドを精製した。市販のキット（BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit、ABI社、「BigDye」は登録商標）を用いてプラスミドのシークエンスを確認し、以降の実験に用いた。
（３）ＨａＣａＴ細胞へのプラスミド導入
　２４ウェルプレート（Becton Dickinson社）の底面積に対して７割～８割の占有率となるまで培養したＨａＣａＴ細胞に対して、リポフェクション法によりゲノム編集用のプラスミドを導入した。プラスミドの導入は、Lipofectamine 3000 reagent（Thermo Fisher Scientific社、「Lipofectamine」は登録商標）を用いて、メーカーのプロトコルに従って実施した。プラスミドを導入して４８時間後に培地を交換し、死細胞を取り除いた。ＯＦＰ陽性細胞を蛍光顕微鏡（励起波長：５４８ｎｍ、蛍光波長：５６０ｎｍ）にて確認したところ、プラスミド導入率は２％～３％程度であった。
（４）ＦＡＣＳ（Fluorescence Activated Cell Sorting）による細胞濃縮
　プラスミド導入後のＨａＣａＴ細胞を０．２５ｗ／ｖ％ トリプシン－ＥＤＴＡ（Thermo Fisher Scientific社）を用いて回収した後、セルソーター（BD FACSAria、Becton Dickinson社、「FACSAria」は登録商標）によりＯＦＰ陽性細胞を濃縮した。分離したＯＦＰ陽性細胞を蛍光顕微鏡にて観察（励起波長：５４８ｎｍ、蛍光波長：５６０ｎｍ）したところ、プラスミド導入率は約１００％であった。
（５）ＩＧＦ－１Ｒ遺伝子の変異の確認
　ＩＧＦ－１Ｒ遺伝子の変異の有無を検出するため、ヘテロ２本鎖ＤＮＡのミスマッチ部分を認識して切断する特殊な酵素（Ｃｅｌ１エンドヌクレアーゼ）を用いたＣｅｌ１アッセイを実施した。Ｃｅｌ１アッセイの原理は以下のとおりである。ゲノムＤＮＡ上の標的配列を含む領域をＰＣＲにより増幅し、増幅産物を変性させた後、リアニーリングする。増幅産物に変異が存在する場合には、リアニーリングした際にヘテロ２本鎖ＤＮＡが形成されるため、Ｃｅｌ１エンドヌクレアーゼによってミスマッチ部分が切断される。この切断の有無を電気泳動により確認することで、遺伝子変異の有無を確認することができる。
　Ｃｅｌ１アッセイは、市販のキット（GeneArt Genomic Cleavage Detection Kit、Thermo Fisher Scientific社）を用いて以下のように行った。ＰＣＲに使用したフォワードプライマー（hIGF-1R_E2_13F）及びリバースプライマー（hIGF-1R_E2_401R）の塩基配列を下記の表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 
　ＦＡＣＳにより濃縮されたＯＦＰ陽性細胞からゲノムＤＮＡを抽出し、上記のプライマーを用いて、ＩＧＦ－１Ｒ遺伝子の標的配列を含む領域を増幅した。増幅産物を９５℃で変性させた後、室温（２５℃）でリアニーリングすることで、２本鎖ＤＮＡを得た。リアニーリング後の２本鎖ＤＮＡに対してＣｅｌ１エンドヌクレアーゼを添加し、３７℃で１時間インキュベートした後、熱により酵素を失活させた。そして、酵素反応後の増幅産物を４ｗ／ｖ％ アガロースゲル（和光純薬工業（株））で電気泳動し、泳動パターンを確認した。その結果、３本のバンドが検出され、ＩＧＦ－１Ｒ遺伝子への変異導入が確認された。
（６）細胞のクローニング
　ＦＡＣＳにより濃縮されたＯＦＰ陽性細胞を０．５個／ウェル～１個／ウェルとなるように希釈し、９６ウェルプレートに播種した。細胞を２週間～４週間培養した後、増殖した細胞のゲノムＤＮＡを抽出し、上記と同様にＣｅｌ１アッセイを行った。その結果、２４株のクローンについて、ＩＧＦ－１Ｒ遺伝子の変異が確認された。
　Ｃｅｌ１アッセイにおける電気泳動パターンの一部を図４に示す。図４中、丸印で示すレーンは、ＩＧＦ－１Ｒ遺伝子の変異が確認されたクローンに対応する。
（７）ＩＧＦ－１Ｒ遺伝子の欠損の確認（ウェスタンブロット法）
　クローニング後のＣｅｌ１アッセイ陽性株を培養し、細胞をＲＩＰＡ（Radio-ImmunoPrecipitation Assay）バッファー（Thermo Fisher Scientific社）で可溶化した後、市販のキット（BCA Protein Assay Kit、Thermo Fisher Scientific社）を用いてタンパク質を定量した。各クローンにつき２０μｇのタンパク質を１０ｗ／ｖ％ ポリアクリルアミドゲルに展開し、ブロッティング装置（アトー（株））を用いて、タンパク質をＰＶＤＦ（PolyVinylidene DiFluoride）膜に転写した。その後、ＩＧＦ－１Ｒ特異的抗体（Thermo Fisher Scientific社）を用いてＩＧＦ－１Ｒタンパク質を検出した。ポジティブコントロールとしては、プラスミドを導入していないＨａＣａＴ細胞を用いた。その結果、２４株中の６株のクローンについてＩＧＦ－１Ｒタンパク質が検出されず、ＩＧＦ－１Ｒ遺伝子の欠損が確認された。ＩＧＦ－１Ｒ遺伝子の変異が確認されたにも関わらず、ＩＧＦ－１Ｒ遺伝子の欠損が確認されなかったクローンは、遺伝子変異によりフレームシフトが生じなかったものと推測される。
　ウェスタンブロット結果を図５に示す。図５中、レーン３、レーン７、レーン１０、レーン１３、レーン１６、及びレーン２１は、ＩＧＦ－１Ｒ遺伝子の欠損が確認された６株のクローンに対応する。
　これらの６株のクローンのうち、レーン７のクローン（以下、「ＩＧＦ－１Ｒ欠損ＨａＣａＴ細胞１」ともいう。）及びレーン１０のクローン（以下、「ＩＧＦ－１Ｒ欠損ＨａＣａＴ細胞２」ともいう。）を以降の実験に用いた。また、ＩＧＦ－１Ｒ遺伝子の欠損が確認されなかったレーン１５のクローンをシャムコントロール細胞として用いた。以降、全ての操作において、シャムコントロールとしてはレーン１５のクローンを用いた。
（８）ＩＧＦ－１Ｒ遺伝子の欠損の確認（細胞免疫染色法）
　ＩＧＦ－１Ｒ欠損ＨａＣａＴ細胞１及びシャムコントロール細胞を４ｗ／ｖ％ パラホルムアルデヒド含有ＰＢＳ（Phosphate Buffered Saline）（パラホルムアルデヒド２０ｇを０．１ｍｏｌ／Ｌ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）５００ｍＬに溶解したもの）（和光純薬工業（株））で１５分間処理することにより固定した。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、０．１ｖ／ｖ％ Triton-X 100含有ＰＢＳで２０分間処理して浸透処理を行った後、ブロッキング剤（Blocking One、ナカライテスク（株））で１時間以上処理することによりブロッキングを行った。その後、抗ＩＧＦ－１Ｒ抗体（Thermo Fisher Scientific社）を２００倍希釈した溶液を添加して、４℃で終夜反応させた。細胞をＰＢＳで３回程度洗浄した後、抗マウス－ＦＩＴＣ（Fluorescein IsoThioCyanate）抗体（abcam社）を２００倍希釈した溶液で２時間反応させた。ＰＢＳで３回程度洗浄し、ヘキスト（（株）同仁化学研究所）で核染色した後、封入して、蛍光顕微鏡（（株）キーエンス）で観察した。
　細胞免疫染色結果を図６に示す。図中のスケールバーは１００μｍを示す。図６から分かるように、シャムコントロール細胞ではＩＧＦ－１Ｒタンパク質が確認されたのに対し、ＩＧＦ－１Ｒ欠損ＨａＣａＴ細胞１ではＩＧＦ－１Ｒタンパク質が確認されなかった。
（９）ＩＧＦ－１Ｒ遺伝子の欠損の継続性の確認
　ＩＧＦ－１Ｒ欠損ＨａＣａＴ細胞１、ＩＧＦ－１Ｒ欠損ＨａＣａＴ細胞２、及びシャムコントロール細胞を追加で継代培養し、上記と同様にしてウェスタンブロットによりＩＧＦ－１Ｒタンパク質を検出した。ポジティブコントロールとしては、プラスミドを導入していないＨａＣａＴ細胞を用いた。
　ウェスタンブロット結果を図７に示す。図７中、「Ｐ」は実験前の継代数を示し、「Ｐ＋１」は追加で１回継代したこと、「Ｐ＋２」は追加で２回継代したこと、「Ｐ＋３」は追加で３回継代したことを意味する。図７から分かるように、ＩＧＦ－１Ｒ欠損ＨａＣａＴ細胞１及びＩＧＦ－１Ｒ欠損ＨａＣａＴ細胞２の継代を繰り返しても、ＩＧＦ－１Ｒ遺伝子の欠損は継続されていた。
（１０）ＩＧＦ－１Ｒ遺伝子のシークエンスの確認
　ＩＧＦ－１Ｒ欠損ＨａＣａＴ細胞１からゲノムＤＮＡを抽出し、常法により、ＩＧＦ－１Ｒ遺伝子の標的配列を含む領域のシークエンスを確認した。
　シークエンスの確認結果を図８に示す。図８中、上段の配列は、ＩＧＦ－１Ｒ欠損ＨａＣａＴ細胞１におけるＩＧＦ－１Ｒ遺伝子の標的配列を含む領域のシークエンスを示し、下段の配列は、同領域の本来のシークエンスを示す。下線を付した配列は標的配列に対応し、四角で囲んだ配列はＰＡＭ配列に対応する。図８から分かるように、ＩＧＦ－１Ｒ欠損ＨａＣａＴ細胞１では、標的配列中の４塩基（ＣＴＣＡ）が欠失していることが確認された。
＜実施例１＞
　実施例１では、ポリカーボネート製の支持体上でＩＧＦ－１Ｒ欠損ＨａＣａＴ細胞１を気液界面培養により培養し、細胞積層体を製造した。
（１）細胞積層体用培地の調製
　２９４．０４ｍｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏを１ｍＬの超純水に溶解し、ボルテックスミキサーにて撹拌した後、フィルター滅菌した。得られたＣａＣｌ２溶液をマイクロチューブに分注し、使用時まで－３０℃で保存した。
　正常ヒト皮膚線維芽細胞用培地である１０ｖ／ｖ％ ＦＢＳ含有ＤＭＥＭと、ヒト上皮細胞成長因子（hEGF）を除いた正常ヒト表皮角化細胞用培地（HuMedia-KG2、クラボウ）とを１：１（容量比）で混合した。得られた培地５００ｍＬに対して、上記で調製したＣａＣｌ２溶液２２５μＬ（培地中のカルシウムの終濃度：１．８ｍｍｏｌ／Ｌ）を添加した。ＣａＣｌ２溶液の添加後の培地を５０ｍＬのファルコンチューブ（Corning社、「ファルコン」は登録商標）に分注し、アスコルビン酸２－グルコシドを０．１ｗ／ｗ％となるように添加して、細胞積層体用培地を調製した。
（２）細胞積層体の製造
　細胞濃度が２×１０５個／０．２ｍＬとなるようにＩＧＦ－１Ｒ欠損ＨａＣａＴ細胞１を細胞積層体用培地に分散させ、細胞分散液を調製した。得られた細胞分散液０．２ｍＬをポリカーボネート製のセルカルチャーインサート（Becton Dickinson社）上に播種した後、セルカルチャーインサートを１２ウェルプレートのウェル内に配置した。セルカルチャーインサートの外側に細胞積層体用培地１．５ｍＬを添加し、３７℃、５ｖ／ｖ％ ＣＯ２の条件で２４時間培養した。２４時間後、セルカルチャーインサート内の培地を丁寧に取り除いて気液界面を形成し、追加で１４日間培養した。培地交換は２日おきに実施した。
（３）細胞積層体の組織学的解析（ＨＥ染色）
　１４日間培養して得られた細胞積層体を、４ｗ／ｖ％ パラホルムアルデヒド含有ＰＢＳ（パラホルムアルデヒド２０ｇを０．１ｍｏｌ／Ｌ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）５００ｍＬに溶解したもの）（和光純薬工業（株））を用いて固定した。固定した細胞積層体を０．１ｍｏｌ／Ｌ ＰＢＳに浸漬し、液を数回交換して固定液を置換した。細胞積層体を剃刀により短冊状に切断してパラフィン包埋した後、ミクロトームを用いて厚さ４μｍの切片を作製し、スライドグラスに貼って４５℃で乾燥させた。得られた細胞積層体のパラフィン包埋切片は室温（２５℃）にて保存した。
　パラフィン包埋切片をキシレンによって脱パラフィン処理した後、１００ｖ／ｖ％から７０ｖ／ｖ％まで段階的に濃度を低下させたエタノール水溶液に順に浸漬した。サンプルを蒸留水にて洗浄した後、ヘマトキシリン染色液（和光純薬工業（株））に５分間浸漬し、流水にて洗浄した。さらに、サンプルを０．２ｗ／ｖ％ ＨＣｌを含有する７０ｖ／ｖ％ エタノールに１秒間浸漬し、流水にて１０分間洗浄した。次いで、サンプルをエオシン染色液（和光純薬工業（株））に１０分間浸漬し、９５ｖ／ｖ％から１００ｖ／ｖ％まで段階的に濃度を増加させたエタノール水溶液に順に浸漬して脱水した後、キシレンに２分間～３分間浸漬した。得られたサンプルに封入剤を乗せてカバーガラスで覆い、乾燥させて封入した。
　ＩＧＦ－１Ｒ欠損ＨａＣａＴ細胞１及びコントロールとしてのＨａＣａＴ細胞を培養して得られた細胞積層体のＨＥ染色像を図９に示す。図中のスケールバーは５０μｍを示す。図９から分かるように、ＩＧＦ－１Ｒ欠損ＨａＣａＴ細胞１を培養して得られた細胞積層体では、ＨａＣａＴ細胞を培養して得られた細胞積層体と比較して、表皮の増殖及び分化が顕著に低下していた。
　ＩＧＦ－１Ｒ欠損ＨａＣａＴ細胞１及びコントロールとしてのＨａＣａＴ細胞を培養して得られた細胞積層体の表皮層の平均厚さを図１０に示す（いずれもｎ＝３）。図１０から分かるように、ＨａＣａＴ細胞を培養して得られた細胞積層体では、表皮層の平均厚さが約５５μｍであったのに対し、ＩＧＦ－１Ｒ欠損ＨａＣａＴ細胞１を培養して得られた細胞積層体では、表皮層の平均厚さが約２５μｍであり、表皮層が有意に菲薄化していた（Ｐ＜０．０１）。
＜実施例２＞
　実施例２では、線維芽細胞が包埋されたコラーゲンゲル（支持層）上でＩＧＦ－１Ｒ欠損ＨａＣａＴ細胞１を気液界面培養により培養し、細胞積層体を製造した。
（１）線維芽細胞が包埋されたコラーゲンゲルの作製
　合計５×１０５個の正常ヒト新生児包皮皮膚線維芽細胞（クラボウ）と終濃度１ｍｇ／ｍＬの酸可溶化Ｉ型コラーゲン（ウシ由来）とを含有する５ｍＬの細胞積層体用培地（実施例１で調製したもの）をコラーゲン溶液として、６ウェルプレートに分注した。そして、３７℃、５ｖ／ｖ％ ＣＯ２の条件で、静置又は５回転／分～６０回転／分の速度で撹拌しながら培養した。２日間～３日間の培養後に、底面が直径１．０ｃｍ程度まで収縮したコラーゲンゲルが得られた。
（２）細胞積層体の製造
　細胞濃度が２×１０５個／０．２ｍＬとなるようにＩＧＦ－１Ｒ欠損ＨａＣａＴ細胞１を細胞積層体用培地に分散させ、細胞分散液を調製した。コラーゲンゲル上にリング（内径７ｍｍ）を載せ、リングの内外の培地を取り除いた。細胞分散液０．４ｍＬをリング内に添加し、リングの外側に細胞分散液が漏れ出ていないことを確認した。次いで、リングの外側に細胞積層体用培地３ｍＬを添加し、３７℃、５ｖ／ｖ％ ＣＯ２の条件で２４時間培養した。
　２４時間後、コラーゲンゲル上に重層したＩＧＦ－１Ｒ欠損ＨａＣａＴ細胞１の層が壊れないように注意しながらリング内外の培地を取り除き、ピンセットを用いてリングを外した。次いで、細胞積層体用培地をウェルの端から添加した。その際、ＩＧＦ－１Ｒ欠損ＨａＣａＴ細胞１とコラーゲンゲルとの境界までが培地に浸り、ＩＧＦ－１Ｒ欠損ＨａＣａＴ細胞１に培地が触れないように、培地の量を２ｍＬ～３ｍＬ程度に調整した。この日より気液界面培養を開始し、７日間又は１４日間培養した。培地交換は２日おきに実施した。
（３）細胞積層体の組織学的解析（ＨＥ染色）
　７日間又は１４日間培養して得られた細胞積層体について、実施例１と同様にしてＨＥ染色を行った。
　ＩＧＦ－１Ｒ欠損ＨａＣａＴ細胞１及びコントロールとしてのＨａＣａＴ細胞を培養して得られた細胞積層体のＨＥ染色像を図１１に示す。図中のスケールバーは５０μｍを示す。図１１から分かるように、ＩＧＦ－１Ｒ欠損ＨａＣａＴ細胞１を培養して得られた細胞積層体では、ＨａＣａＴ細胞を培養して得られた細胞積層体と比較して、表皮の増殖及び分化が顕著に低下していた。
　なお、図９と図１１とを比較すると、ポリカーボネート製の支持体上で培養する場合よりも線維芽細胞が包埋されたコラーゲンゲル上で培養する場合の方が、表皮層が菲薄化していることが分かる。これは、線維芽細胞が包埋されたコラーゲンゲル上で培養する場合の方が、ＩＧＦ－１Ｒ欠損ＨａＣａＴ細胞１に細胞積層体用培地が接触し難いためと推測される。
　２０１６年７月２９日に出願された日本国特許出願２０１６－１５０２９６号の開示は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。
　本明細書に記載された全ての文献、特許出願、および技術規格は、個々の文献、特許出願、および技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。

Claims (17)

  1. 　特定遺伝子を欠損した表皮角化細胞が積層した表皮層を含む細胞積層体。
  2. 　前記表皮角化細胞がヒト表皮角化細胞である、請求項１に記載の細胞積層体。
  3. 　支持層をさらに含む、請求項１又は請求項２に記載の細胞積層体。
  4. 　前記支持層が、間葉系細胞及び間葉系幹細胞の少なくとも一方とコラーゲンとを含む層である、請求項３に記載の細胞積層体。
  5. 　前記特定遺伝子が細胞膜受容体の遺伝子を含む、請求項１～請求項４のいずれか１項に記載の細胞積層体。
  6. 　前記特定遺伝子がインスリン様成長因子－１受容体の遺伝子を含む、請求項１～請求項５のいずれか１項に記載の細胞積層体。
  7. 　特定遺伝子を欠損した表皮角化細胞を気液界面培養により培養する工程を含む細胞積層体の製造方法。
  8. 　前記表皮角化細胞がヒト表皮角化細胞である、請求項７に記載の細胞積層体の製造方法。
  9. 　部位特異的ヌクレアーゼを用いて前記表皮角化細胞の特定遺伝子を欠損させる工程をさらに含む、請求項７又は請求項８に記載の細胞積層体の製造方法。
  10. 　前記特定遺伝子を欠損した表皮角化細胞を気液界面培養により培養する工程が、前記特定遺伝子を欠損した表皮角化細胞を、支持層上で気液界面培養により培養することを含む、請求項７～請求項９のいずれか１項に記載の細胞積層体の製造方法。
  11. 　前記支持層が、間葉系細胞及び間葉系幹細胞の少なくとも一方とコラーゲンとを含む層である、請求項１０に記載の細胞積層体の製造方法。
  12. 　前記特定遺伝子が細胞膜受容体の遺伝子を含む、請求項７～請求項１１のいずれか１項に記載の細胞積層体の製造方法。
  13. 　前記特定遺伝子がインスリン様成長因子－１受容体の遺伝子を含む、請求項７～請求項１２のいずれか１項に記載の細胞積層体の製造方法。
  14. 　特定遺伝子を欠損した表皮角化細胞を気液界面培養により培養する工程を含む表皮の増殖又は分化の評価方法。
  15. 　特定遺伝子を欠損した表皮角化細胞を、被験物質の存在下、気液界面培養により培養する工程を含む被験物質の評価方法。
  16. 　請求項１～請求項６のいずれか１項に記載の細胞積層体に被験物質を接触させる工程を含む被験物質の評価方法。
  17. 　請求項１～請求項６のいずれか１項に記載の細胞積層体を含む生体移植材料。
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