JP7437056B2 - 表層に角質層が形成された不死化皮膚細胞の3次元培養物、前記3次元培養物の製造方法、および前記3次元培養物を用いた被検物質の評価方法 - Google Patents
表層に角質層が形成された不死化皮膚細胞の3次元培養物、前記3次元培養物の製造方法、および前記3次元培養物を用いた被検物質の評価方法 Download PDFInfo
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Description
本出願は、2020年1月22日に出願された、日本国特許出願特願2020-8607号に基づく。本明細書中に日本国特許出願特願2020-8607号の明細書、特許請求の範囲、図面全体を参照として取り込むものとする。
前記培養積層物は、表層が角質層で構成され、
前記HaCaT細胞は、定常発現プロモーターで制御される第1のルシフェラーゼの遺伝子と、皮膚感作性を評価できるプロモーターで制御される、前記第1のルシフェラーゼとシグナルが区別して検出される第2のルシフェラーゼの遺伝子とを有し、
前記定常発現プロモーターは、
ユビキチンC、β-2-microglobulin、GAPDH、TK、SV-40、HPRT、β-actin、G6PDH及びelongation factorからなる群から選択され、
前記皮膚感作性を評価できるプロモーターは、
IL-1beta、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-17、IL-22、IL-12、IL-2、IFN-γ及びHO-1からなる群から選択される遺伝子のプロモーターである、
不死化皮膚細胞の3次元培養物を提供するものである。
前記生理活性を評価できるプロモーターは、
bmal1、per2、filaggrin、keratin type 10及びTNF-alphaからなる群から選択される遺伝子のプロモーターである、こととしてもよい。
また、前記不死化皮膚細胞の3次元培養物は、被検物質の評価に使用される、こととしてもよい。
前記定常発現プロモーターは、
ユビキチンC、β-2-microglobulin、GAPDH、TK、SV-40、HPRT、β-actin、G6PDH及びelongation factorからなる群から選択され、
前記皮膚感作性を評価できるプロモーターは、
IL-1beta、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-17、IL-22、IL-12、IL-2、IFN-γ及びHO-1からなる群から選択される遺伝子のプロモーターである、
表層に角質層が形成された不死化皮膚細胞の3次元培養物の製造方法を提供するものである。
培養液含浸性板状基材の上面に前記HaCaT細胞を播種し、
前記HaCaT細胞層の表層が乾かない程度の培養液を仕込んで前記HaCaT細胞を3次元培養する、こととしてもよい。
前記培養液含浸性板状基材を底部に有する内側容器を外側容器に収納し、
前記外側容器に入れた培養液を前記底部に供給しながら、前記HaCaT細胞層の表層が乾かない程度の培養液を仕込んで前記HaCaT細胞を3次元培養する、こととしてもよい。
前記生理活性を評価できるプロモーターは、
bmal1、per2、filaggrin、keratin type 10及びTNF-alphaからなる群から選択される遺伝子のプロモーターである、こととしてもよい。
セルベッド24ウェルキャリア(日本バイリーン社:シリカファイバー製)を、24ウェルプレート(日本バイリーン社)の各ウェルに1枚ずつ入れ、PBSで親水化処理を行った。その後、各ウェルにHaCaTのD-MEM懸濁液(10%FBS及び抗生物質を含有、細胞濃度:1×106cells/mL)を500μLずつ入れ、37℃、5%CO2、湿度100%雰囲気下で3時間培養した。
実施例1と同様にしてHaCaT細胞を25日間培養し、HaCaT細胞の3次元培養物を得た。この3次元培養物は、セルベッドを板状基材とし、これにHaCaTの培養積層物が層状に付着するものである。この3次元培養物を3回PBSでリンスしたのち、4%パラフォルムアルデヒド/PBSに一晩浸して固定化を行った。固定化した細胞をリトリービングバッファーで脱パラフォルムアルデヒド処理した後、OTCコンパウンドで包埋し、クライオスタットで5μmの幅で縦に切断した。次いで得られた切片について、免疫染色およびヘキスト染色を行った。免疫染色は1次抗体に抗サイトケラチン2ウサギ抗体、抗サイトケラチン10ウサギ抗体、抗サイトケラチン14ウサギ抗体、二次抗体にAlexa488をコンジュゲートした抗ウサギ抗体を用いた。また得られた切片について抗イルボクリン(involcurin)マウス抗体で染色し、二次抗体にAlexa568をコンジュゲートした抗マウス抗体を用いてイルボクリンを検出した。また、ヘキスト染色はテルモ社のNucBlue reagentを用いて行い、核を検出した。染色切片にそれぞれの励起光を当てて検鏡した。結果を図5、図6、図7の各上段に示す。図5~図7において、暗色の細胞の下層にある淡色層は、板状基材に該当するセルベッドである。
カバーガラスに実施例1で使用したD-MEM1mlを滴下し、これに7×104個のHaCaTを播種し、温度37℃、5%CO2、湿度100%雰囲気下で培養を行った。説明の便宜のため、3日間の培養により得られた培養物を2次元培養物と称する。培養3日後の2次元培養物をパラフォルムアルデヒドで固定し、免疫染色およびヘキスト染色を行った。結果を図5、図6、図7の各下段に示す。図5の下段は、サイトケラチン2(K2)、核、および明視野観察の結果、図6の下段はサイトケラチン10(K10)、核、および明視野観察の結果、図7の下段は、サイトケラチン14(K14)、イルボクリン、核、および明視野観察の結果である。
図5下段に示すように、表層に発現するサイトケラチン2(K2)は確認することができなかった。図6下段に示すように、有棘層に発現するK10は疎らに発現するが、図7下段に示すように、同じく有棘層から表層に発現するインボルクリンはほとんど発現していなかった。一方で基底層に発現するK14は良く発現していた。これらの発現プロフィールを実施例2の3次元培養物と比較すると、3次元培養物を構成する細胞は角質層に特徴的なサイトケラチン2を発現し、分化が進んで表面が角化し、正常皮膚組織の特性を備えていることが示されていた。
常法に従い、マウス人工染色体ベクターを保持するCHO-K1細胞からマウス人工染色体ベクターを含む微小核を単離した。この微小核をポリエチレングリコールを用いてHaCaT細胞に導入して微小核細胞融合させ、次いで、マウス人工染色体ベクターが導入されたHaCaT細胞をハイグロマイシンを用いて選択した。また、定法に従い、IL-8プロモーター配列と赤色発光ルシフェラーゼ配列、配列番号1に示すユビキチンCプロモーター配列と緑色発光ルシフェラーゼ配列の両カセットの上流・下流および連結部にHS4インスレーター配列を配置したベクターを作製した。これをリポフェクション法により、前記したマウス人工染色体ベクターを保持するHaCaT細胞に導入した。レポーターベクター導入細胞はG418を用いた選択培養により選択した。配列番号1は、ユビキチンCプロモーター(NCBI sequence ID NG_027722)の第4891から第5491の601塩基配列である。また、使用したIL-8プロモーター配列は、配列番号2に示すNCBI sequence ID NG_029889.1の、第8から第5202の塩基配列部位である。これにより、IL-8プロモーターで制御される赤色発光ルシフェラーゼ遺伝子と、ユビキチンCプロモーターで制御される緑色発光ルシフェラーゼ遺伝子とを有するHaCaTを得た。
壁面が黒色で底面が無色透明の細胞培養用24ウェルプレートの3つに実施例3で得た3次元培養物を1枚ずつ入れ、そこに10%FBS、抗生物質[ペニシリン(100U/mL)/ストレプトマイシン(0.1mg/mL)]0.2mMルシフェリンカリウム塩を含むD-MEMを1mL入れた。
3次元構造体の発光強度を評価するため、このウェルプレートの周囲にプラスチックパラフィンフィルムをまき、培養細胞リアルタイム発光モニタリングシステム クロノスHT(アトー株式会社製)で発光を測定した。測定は特許文献3に示す色分離法を用いて、赤色と緑色を分離するため光学フィルター有・無しで各々10秒間の測定を各ウェルで72時間継続した。多色発光測定の結果を示す図8に示す。図8(A)は赤色発光ルシフェラーゼ(IL-8プロモーター)による発色を示し、図8(B)は緑色発光ルシフェラーゼ(UBCプロモーター)による発色を示す。なお、図8には、比較例2の結果も併せて記載する。図8において3Dで示す曲線が実施例4(3次元培養物)の結果であり、2Dで示す曲線は比較例2(2次元培養物)の結果である。
実施例3で調製したIL-8プロモーターで制御される赤色発光ルシフェラーゼ遺伝子と、ユビキチンCプロモーターで制御される緑色発光ルシフェラーゼ遺伝子とを有するHaCaTを、壁面が黒色で底面が無色透明の細胞培養用24ウェルプレートの3つにそれぞれ細胞2×105個入れ、そこに10%FBS、抗生物質[ペニシリン(100U/mL)/ストレプトマイシン(0.1mg/mL)]0.2mMルシフェリンカリウム塩を含むD-MEMを1mL入れた。
実施例4と同様に、このウェルプレートの周囲にプラスチックパラフィンフィルムをまき、培養細胞リアルタイム発光モニタリングシステム クロノスHT(アトー株式会社製)で発光を測定した。測定は光学フィルター有・無しで各々10秒間の測定を各ウェルで72時間継続した。多色発光測定の結果を示す図8に示す。
実施例4と比較例2とにより、24ウェルプレートの底全面に2次元培養の細胞が存在する場合と3次元培養構造体が存在する場合の赤色発光ルシフェラーゼ(IL-8プロモーター)と緑色発光ルシフェラーゼ(ユビキチンCプロモーター)の発光強度を比較することができる。図8に示すように、3次元培養物(3D)は2次元培養物(2D)よりも、赤色発光ルシフェラーゼ(IL-8プロモーター)および緑色発光ルシフェラーゼ(ユビキチンCプロモーター)の発光強度が高い結果となった。特に感作性物質の影響で発光する赤色発光ルシフェラーゼ(IL-8プロモーター)は3Dのほうが2Dより発光強度が強く、細胞が層状に積層することで細胞の機能的な変化が生じて発光が増加したことを示唆するものと考えられた。
実施例3で得た3次元培養物を使用して、親水性の感作性物質としてヒドロキノン(HQ)に対する応答を評価した。
壁面が黒色で底面が無色透明の細胞培養用24ウェルプレートのウェルに、24ウェル用の無色透明、底面が孔径0.4μmのPETメンブレンで構成されたセルカルチャーインサート(Falconカルチャーインサート #353095)を挿入し、カルチャーインサートの底面に3次元培養物を細胞が上面になるように入れ、カルチャーインサートの外側のウェルに0.2mMルシフェリンカリウム塩を含むKGM-goldを0.8mL入れた。感作性評価のために、インサートの内側にある3次元培養物の上から被検物質を負荷した。HQは200μM,800μM、2mMとなるようにKGM培地に溶解し、その溶解液30μLを3次元培養物の上部からのみ負荷した。また、溶媒対照としてはKGM培地を3次元培養物の上部から30μL加えた。このウェルプレートの周囲にプラスチックパラフィンフィルムをまき、培養細胞リアルタイム発光モニタリングシステムクロノスHT(アトー株式会社製)で0~72時間発光を測定した。測定は1分おきにそれぞれの色で10秒間行い、0~72時間継続した。
実施例5で、多色発光を72時間測定した後の3次元培養物を回収した。この3次元培養物について、実施例1と同様にニュートラルレッドで染色し、縦に切断して切片を得た。これを図11に示す。多色発光測定後も、3次元培養物を維持していることを確認できた。
実施例3で得た3次元培養物を使用して、親油性の感作性物質としてジブチルアニリン(DA)およびヘキリルサリシレート(HS)に対する応答を評価した。
実施例5と同様に、壁面が黒色で底面が無色透明の細胞培養用24ウェルプレートのウェルに、24ウェル用の無色透明、底面が孔径0.4μmのPETメンブレンで構成されたセルカルチャーインサート(Falconカルチャーインサート #353095)を挿入し、カルチャーインサートの底面に3次元培養物を細胞が上面になるように入れ、カルチャーインサートの外側のウェルに0.2mMルシフェリンカリウム塩を含むKGM-goldを0.8mL入れた。感作性評価のために、インサートの内側にある3次元培養物の上から被検物質を負荷した。DAは、濃度12.5%(v/v)、25%(v/v)となるようにオリーブオイルで希釈して、その溶解液30μLを3次元培養物の上部から負荷した。またHSは、濃度12.5%(v/v)となるようにオリーブオイルで希釈して、その溶解液30μLを3次元培養物の上部から負荷した。また、溶媒対照としてオリーブオイルを3次元培養物の上部から30μL加えた。このウェルプレートの周囲にプラスチックパラフィンフィルムをまき、培養細胞リアルタイム発光モニタリングシステムクロノスHT(アトー株式会社製)で0~72時間発光を測定した。測定は1分おきにそれぞれの色で10秒間行い、0~72時間継続した。
実施例3で得た3次元培養物を使用して、3次元培養物の下面および上面からヒドロキノンを負荷して、ヒドロキノンに対する応答を評価した。
壁面が黒色で底面が無色透明の細胞培養用24ウェルプレートのウェルに、24ウェル用の無色透明、底面が孔径0.4μmのPETメンブレンで構成されたセルカルチャーインサート(Falconカルチャーインサート #353095)を挿入し、カルチャーインサートの底面に実施例3で得た3次元培養物を細胞が上面になるように入れた。0.2mMルシフェリンカリウム塩および25mMのHEPES-KOH(pH7.5)を含むKGM-goldを調製し、そこに最終濃度が20μM、100μM、200μMとなるようにヒドロキノンを加えた培地をそれぞれ5mLずつ調製した。この培地をカルチャーインサートの外側に0.8mL入れ、ついで、30μLを3次元培養物の上部から負荷した。溶媒対照としてウェルに0.2mMルシフェリンカリウム塩および25mMのHEPES-KOH(pH7.5)を含むKGM培地を0.8mL加え、3次元培養物の上部から0.2mMルシフェリンカリウム塩および25mMのHEPES-KOH(pH7.5)を含むKGM培地を30μL負荷した。これにより、3次元培養物の上面および下面からヒドロキノンが添加された。
Claims (10)
- 板状基材と前記板状基材の表面に付着するHaCaT細胞の培養積層物であって、
前記培養積層物は、表層が角質層で構成され、
前記HaCaT細胞は、定常発現プロモーターで制御される第1のルシフェラーゼの遺伝子と、皮膚感作性を評価できるプロモーターで制御される、前記第1のルシフェラーゼとシグナルが区別して検出される第2のルシフェラーゼの遺伝子とを有し、
前記定常発現プロモーターは、
ユビキチンC、β-2-microglobulin、GAPDH、TK、SV-40、HPRT、β-actin、G6PDH及びelongation factorからなる群から選択され、
前記皮膚感作性を評価できるプロモーターは、
IL-1beta、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-17、IL-22、IL-12、IL-2、IFN-γ及びHO-1からなる群から選択される遺伝子のプロモーターである、
不死化皮膚細胞の3次元培養物。 - 前記HaCaT細胞は、生理活性を評価できるプロモーターで制御される、前記第1のルシフェラーゼ及び前記第2のルシフェラーゼのいずれともシグナルが区別して検出される第3のルシフェラーゼの遺伝子をさらに有し、
前記生理活性を評価できるプロモーターは、
bmal1、per2、filaggrin、keratin type 10及びTNF-alphaからなる群から選択される遺伝子のプロモーターである、
請求項1記載の不死化皮膚細胞の3次元培養物。 - 前記板状基材は、シリカ、アルミナ、ジルコニア、チタニア、ハイドロキシアパタイト、および合成樹脂からなる群から選択される1以上の基材で構成される液含浸性基材である、請求項1または2記載の不死化皮膚細胞の3次元培養物。
- 被検物質の評価に使用される、請求項1~3のいずれかに記載の不死化皮膚細胞の3次元培養物。
- 定常発現プロモーターで制御される第1のルシフェラーゼの遺伝子と、皮膚感作性を評価できるプロモーターで制御される、前記第1のルシフェラーゼとシグナルが区別して検出される第2のルシフェラーゼの遺伝子とを有するHaCaT細胞を、前記HaCaT細胞が積層するHaCaT細胞層の表層が乾かない程度の培養液を仕込んで3次元培養することを含み、
前記定常発現プロモーターは、
ユビキチンC、β-2-microglobulin、GAPDH、TK、SV-40、HPRT、β-actin、G6PDH及びelongation factorからなる群から選択され、
前記皮膚感作性を評価できるプロモーターは、
IL-1beta、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-17、IL-22、IL-12、IL-2、IFN-γ及びHO-1からなる群から選択される遺伝子のプロモーターである、
表層に角質層が形成された不死化皮膚細胞の3次元培養物の製造方法。 - 培養液含浸性板状基材の上面に前記HaCaT細胞を播種し、
前記HaCaT細胞層の表層が乾かない程度の培養液を仕込んで前記HaCaT細胞を3次元培養する、請求項5記載の製造方法。 - 前記培養液含浸性板状基材を底部に有する内側容器を外側容器に収納し、
前記外側容器に入れた培養液を前記底部に供給しながら、前記HaCaT細胞層の表層が乾かない程度の培養液を仕込んで前記HaCaT細胞を3次元培養する、
請求項6記載の製造方法。 - 前記HaCaT細胞を培養して3~10段の細胞層を形成した後に、前記HaCaT細胞層の表層が乾かない程度の培養液を仕込んで3次元培養する、請求項5~7のいずれかに記載の製造方法。
- 前記HaCaT細胞は、生理活性を評価できるプロモーターで制御される、前記第1のルシフェラーゼ及び前記第2のルシフェラーゼのいずれともシグナルが区別して検出される第3のルシフェラーゼの遺伝子をさらに有し、
前記生理活性を評価できるプロモーターは、
bmal1、per2、filaggrin、keratin type 10及びTNF-alphaからなる群から選択される遺伝子のプロモーターである、
請求項5~8のいずれかに記載の製造方法。 - 請求項1記載の不死化皮膚細胞の3次元培養物に被検物質を投与し、前記第1のルシフェラーゼの遺伝子の発現量に対する前記第2のルシフェラーゼの遺伝子の発現量に基づいて前記被検物質の皮膚感作性を評価する、被検物質の評価方法。
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Non-Patent Citations (4)
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SCHAGAT, T. et al.,レポータ遺伝子アッセイの標準化:整合性と統計的有意性向上のためのアプローチと検討材料,Promega[online],2007年,インターネット:<URL:https://www.promega.co.jp/jp/prometec_J/pdf/pj23/PJ-No23-4.pdf>,[retrieved on 3/19/2021] |
TOMITA, T. et al.,Development of novel skin sensitizing test with human keratinocyte cell line,AATEX,2018年,Vol. 23(Supplement),p. 126:P-34 |
シリカファイバー細胞培養担体 Cellbed,Cellbed[online],2019年,インターネット:<URL:https://web.archive.org/web/20190816024238/http://www.cellbed-jp.com/qaf.html>,[retrieved on 3/19/2021] |
小島 肇夫,化学物質の安全性評価に利用されるインビトロアッセイ(in vitro試験)法,生物工学会誌,2017年,Vol. 95(8),pp. 455-460 |
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