WO2024014517A1 - 細胞の培養方法、治療用組成物の製造方法及び治療用組成物 - Google Patents

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WO2024014517A1
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collagen
culturing
culture
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純 佐々木
広和 小田桐
芳人 田中
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デクセリアルズ株式会社
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    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues

Definitions

  • the present invention relates to a method for culturing cells, a method for producing a therapeutic composition, and a therapeutic composition.
  • cell transplantation treatments are effective.
  • diseases such as aplastic anemia and myelodysplastic syndrome
  • cell transplantation treatments such as hematopoietic stem cells and bone marrow supporting cells are effective.
  • the supply system for source cells and therapeutic compositions containing the cells is not sufficient due to the shortage of donors and the high risk of HLA mismatch.
  • no cell proliferation method has been established to ensure a stable supply of cells.
  • cell proliferation methods for these cells have not yet been sufficiently established.
  • Bone marrow cells are injected and cultured into a porous polyvinyl formal (PVF) resin coated with type I collagen and then transplanted into a mouse, allowing hematopoietic stem cells to invade into the carrier within the mouse body, and the cells It has been reported that proliferation and differentiation into blood cells are observed (see Patent Document 1).
  • this method requires the preparation of a carrier, and furthermore, it is necessary to transplant the carrier into a mouse in order to proliferate hematopoietic stem cells, so it is difficult to say that it is a simple method. The cells cannot be transplanted into humans and are unsuitable for the proliferation of human hematopoietic stem cells and blood cells.
  • a method has been reported in which a suspension of fibroblasts is added onto a type I collagen gel, cultured for 25 hours, and the cells are collected by collagenase treatment (see Patent Document 2). However, there have been no reports on culture for 25 hours or more or its cell proliferation effect.
  • a method for producing mesodermal cells from pluripotent stem cells using a collagen sponge has been reported (see Patent Document 3). However, the method using a collagen sponge cannot be called a simple method, and is not suitable for mass proliferation of cells.
  • a method has been reported that includes a step of mixing stem cells and a collagen solution, a step of centrifuging the mixture to accumulate the stem cells and collagen, and a step of culturing the aggregate of stem cells and collagen (see Patent Document 4). However, this method involves a step of accumulating stem cells and collagen, and cannot be called a simple method.
  • Patent No. 3421741 Patent No. 6448216 International Publication No. 2015/199127 Patent No. 6945242
  • An object of the present invention is to solve the above-mentioned conventional problems and achieve the following objects. That is, the present invention provides a method for culturing cells, a method for producing a therapeutic composition, and a therapeutic composition containing the cells, which can easily, stably, and efficiently produce a large amount of cells.
  • the purpose is to
  • Means for solving the above problem are as follows. That is, ⁇ 1> A method for culturing cells, comprising a culturing step of culturing the cells by bringing the cells into contact with a collagen gel containing type III collagen. ⁇ 2> A method for producing a therapeutic composition comprising a culturing step of bringing cells into contact with a collagen gel containing type III collagen and culturing the cells. ⁇ 3> Contains a collagen gel containing type III collagen and cells, The therapeutic composition is characterized in that the cells are in contact with the collagen gel.
  • a method for culturing cells which can solve the above-mentioned problems in the past, achieve the above-mentioned objectives, and easily, stably and efficiently produce a large amount of cells, as well as a method for therapeutic use.
  • Methods of making compositions and therapeutic compositions comprising the cells can be provided.
  • FIG. 1 is a diagram showing the results of cell number measurement in Example 1 and Comparative Example 1.
  • the white bar on the right shows Example 1 (Type III collagen gel).
  • the black bar on the left indicates Comparative Example 1 (2D).
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of cell number measurement in Example 1, Example 2, and Comparative Example 2.
  • the white bar on the right shows Example 1 (Type III collagen gel).
  • the gray bar in the center indicates Example 2 (Type I+III collagen gel).
  • the black bar on the left shows Comparative Example 2 (Type I collagen gel).
  • FIG. 3A is a diagram showing the results of cell number measurement in Example 3-1.
  • FIG. 3B is a diagram showing the results of cell number measurement in Example 3-2 (Type III collagen gel 0.5 mg/mL or 2 mg/mL) and Comparative Example 3 (2D).
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of cell number measurement in Example 4 (Type III collagen gel) and Comparative Example 4 (2D).
  • FIG. 5 is a diagram showing the results of cell number measurement in Comparative Example 5.
  • FIG. 6A is a diagram showing the cell number measurement results of the human adipose-derived mesenchymal stem cell line HAdpc-28 in Example 5 (Type III collagen) and Comparative Example 6 (2D).
  • FIG. 6B is a diagram showing the cell number measurement results of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells UE6E7T-3 in Example 5 (Type III collagen) and Comparative Example 6 (2D).
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of cell number measurement in Comparative Example 7.
  • FIG. 8 is a diagram showing the cell survival rate in Test Example 1.
  • FIG. 9A is a diagram showing the results of cell number measurement in Example 6.
  • FIG. 9B is a diagram showing the cell survival rate in Example 6.
  • FIG. 10 is a scanning electron micrograph of collagen gel in Test Example 2. The left side shows an observed image of collagen fibers of Comparative Example 2 (Bovine Type I collagen gel). The center shows an observed image of collagen fibers of Example 2 (pig Type I+III collagen gel). The right side shows an observed image of collagen fibers of Example 1 (bovine Type III collagen gel).
  • FIG. 11 is a phase contrast micrograph of cells in Example 7.
  • the upper left shows an observed image of cells cultured with collagen fibers of Comparative Example 2 (Type I collagen gel).
  • the lower left shows an observed image of cells cultured with collagen fibers of Example 1 (Type III collagen gel).
  • the upper right shows an observed image of cells cultured with collagen fibers of Example 2 (pig Type I+III collagen gel).
  • the lower right shows an observed image of cells cultured with collagen fibers of Comparative Example 1 (2D).
  • the cell culturing method of the present invention includes a culturing step and may further include other steps.
  • the culturing step is a step of culturing the cells by bringing them into contact with a collagen gel containing type III collagen.
  • the type III collagen is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose, but animal-derived type III collagen or fish-derived type III collagen is preferable, and animal-derived type III collagen is more preferable.
  • the type III collagen is recombinant type III collagen.
  • the type III collagen may be medical grade collagen.
  • the animal-derived type III collagen is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose, but human-derived type III collagen, bovine type III collagen, or pig-derived type III collagen is preferable, and human-derived type III collagen Type collagen or bovine type III collagen is more preferred.
  • the method for producing the type III collagen is not particularly limited and can be selected as appropriate depending on the purpose, for example, extraction from the dermis of animals or fish with acid, solubilization with enzymes, etc. Can be mentioned. Among these, the method of solubilizing the dermis of animals or fish with enzymes is preferred.
  • the enzyme is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose, but pepsin is preferred.
  • a commercially available product can be used as the type III collagen.
  • Examples of the commercially available products include bovine type III collagen (Nippi Co., Ltd., PSC-3-100-20), porcine dermis-derived type I+III collagen (Nippi Co., Ltd., PSC-S-200-100PW), and the like.
  • the type III collagen may be used alone or in combination of two or more types.
  • the lower limit of the concentration of type III collagen in the collagen gel is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose, but it is preferably 0.01 mg/mL or more, and more preferably 0.05 mg/mL or more. It is preferably 0.1 mg/mL or more, even more preferably 0.2 mg/mL or more, particularly preferably 0.25 mg/mL or more, and most preferably 0.3 mg/mL or more.
  • the upper limit of the concentration of type III collagen in the collagen gel is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose, but from the viewpoint of stably and efficiently producing a large amount of cells, 10 mg/ mL or less is preferable, 5 mg/mL or less is more preferable, 2.5 mg/mL or less is even more preferable, 1.5 mg/mL or less is even more preferable, 1 mg/mL or less is especially preferable, and 0.75 mg/mL or less is most preferable. preferable.
  • the lower limit and upper limit of the concentration of type III collagen can be appropriately combined, but preferably 0.01 mg/mL or more and 10 mg/mL or less, more preferably 0.05 mg/mL or more and 5 mg/mL or less, and .1 mg/mL or more and 2.5 mg/mL or less is more preferable, 0.2 mg/mL or more and 1.5 mg/mL or less is even more preferable, 0.25 mg/mL or more and 1 mg/mL or less is particularly preferable, and 0.3 mg/mL or more The most preferred range is mL or more and 0.75 mg/mL or less.
  • the collagen gel may further contain type I collagen.
  • the concentration of type I collagen in the collagen gel is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose. From the viewpoint of producing cells, the amount is preferably 3 mg/mL or less, more preferably 1 mg/mL or less, even more preferably 0.5 mg/mL or less, even more preferably 0.1 mg/mL or less, and even more preferably 0.05 mg/mL or less. Particularly preferred, and most preferably free of type I collagen.
  • the method for producing the collagen gel is not particularly limited and can be selected as appropriate depending on the purpose.
  • a collagen solution containing type III collagen is turned into a gel, that is, into fibers (also referred to as "fibers").
  • the solvent for the collagen solution is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose, such as PBS (phosphate buffered saline), the medium used for the culture, and the like.
  • the method for gelling the collagen solution containing type III collagen is not particularly limited and can be selected as appropriate depending on the purpose.
  • One example is a method of heating and gelling (fibrillating). It can be made porous by making it neutral and turning it into a gel (fibrillation).
  • the pH of the collagen solution when gelling the collagen solution is not particularly limited as long as it is neutral and can be appropriately selected depending on the purpose, but preferably pH 6 to 9, pH 7 to 8. is more preferred, and still more preferably has a pH of 7 to 7.5.
  • the lower limit of the heating temperature is not particularly limited and can be selected appropriately depending on the purpose, but is preferably 20°C or higher, more preferably 25°C or higher, even more preferably 30°C or higher, and 35°C. The above is even more preferred.
  • the upper limit of the heating temperature is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose, but is preferably 50°C or lower, more preferably 45°C or lower, and even more preferably 40°C or lower.
  • the lower and upper limits of the heating temperature can be appropriately combined, but are preferably 20°C or more and 50°C or less, more preferably 25°C or more and 45°C or less, and even more preferably 30°C or more and 40°C or less. More preferably, the temperature is 35°C or higher and 40°C or lower.
  • the lower limit of the heating time is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose, but is preferably 1 hour or more, more preferably 3 hours or more, even more preferably 6 hours or more, and 12 hours. The above is even more preferred.
  • the upper limit of the heating time is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose, but is preferably 48 hours or less, more preferably 24 hours or less, and even more preferably 18 hours or less.
  • the lower and upper limits of the heating time can be appropriately combined, but are preferably 1 hour or more and 48 hours or less, more preferably 3 hours or more and 24 hours or less, and even more preferably 6 hours or more and 24 hours or less. More preferably, the time is 12 hours or more and 18 hours or less.
  • the amount per well is preferably 0.25 mL or more, more preferably 0.5 mL or more, and even more preferably 0.75 mL or more. Furthermore, when using a 96-well plate, the amount per well is preferably 50 ⁇ L or more, more preferably 75 ⁇ L or more, even more preferably 100 ⁇ L or more, and particularly preferably 110 ⁇ L or more.
  • the upper limit of the amount of the collagen gel used in the culture step is not particularly limited and can be selected appropriately depending on the purpose, but from the viewpoint of stably and efficiently producing a large amount of cells, 24-well
  • the amount per well is preferably 2 mL or less, more preferably 1.5 mL or less, even more preferably 1.25 mL or less, particularly preferably 1 mL or less.
  • the amount per well is preferably 200 ⁇ L or less, more preferably 175 ⁇ L or less, and even more preferably 150 ⁇ L or less.
  • the lower limit and upper limit of the usage amount of the collagen gel in the culture step can be appropriately combined, but when using a 24-well plate, it is preferably 0.25 mL or more and 2 mL or less, and 0.5 mL per well.
  • the amount is more preferably 1.5 mL or less, even more preferably 0.75 mL or more and 1.25 mL or less, and particularly preferably 0.75 mL or more and 1 mL or less.
  • the amount per well is preferably 50 ⁇ L or more and 200 ⁇ L or less, more preferably 75 ⁇ L or more and 175 ⁇ L or less, even more preferably 100 ⁇ L or more and 150 ⁇ L or less, and particularly preferably 110 ⁇ L or more and 150 ⁇ L or less.
  • collagen coat culture (culture on a collagen molecule coat), a collagen-containing solution is added to a plate or a well within the plate, and the collagen is coated by coating on ice or at around 4°C. Get a plate.
  • collagen is coated onto a plate in the form of collagen molecules (a collagen helix composed of three peptide chains) without gelation (fibrillation).
  • a neutralized collagen-containing solution is added to the plate or inside the plate. Obtain a collagen gel plate by adding to the wells and heating.
  • collagen molecules self-associate with each other, resulting in collagen gelation (fibrosis).
  • Whether collagen is in the state of collagen molecules or in the state of gelation (fibrosis) can be determined by visual inspection, because in the state of gelation (fibrosis) it becomes cloudy compared to the state of collagen molecules. be able to.
  • gelation can be determined by the fluctuation of the liquid surface.
  • the cells are not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose, but eukaryotic cells are preferred.
  • the eukaryotic cells are not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose, but animal cells or plant cells are preferred, and animal cells are more preferred.
  • the animal cells are not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose of use after culturing, and include, for example, cells derived from humans, monkeys, primates such as marmosets; Cells derived from teeth; cells derived from birds such as chickens; cells derived from lagomorphs such as rabbits; cells derived from ungulates such as pigs, sheep, cows, goats, horses; cells derived from feline orders such as dogs and cats. Examples include cells. Among these, human-derived cells are preferred because they can be applied to the treatment of blood cancers such as leukemia, malignant lymphoma, and multiple myeloma, aplastic anemia, myelodysplastic syndrome, and the like.
  • blood cancers such as leukemia, malignant lymphoma, and multiple myeloma, aplastic anemia, myelodysplastic syndrome, and the like.
  • the tissue from which the animal cells are derived is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose, and includes, for example, bone marrow, umbilical cord blood, peripheral blood, liver, and the like.
  • the cells may be primary cultured cells isolated from the tissue, subcultured cells, or cells derived from a cell line. Alternatively, the cells may be thawed after cryopreserving the primary cultured cells or the subcultured cells.
  • the type of cells is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose, and examples thereof include stem cells and cells differentiated from stem cells.
  • the stem cells are not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose, and include, for example, pluripotent stem cells, somatic stem cells, and the like.
  • the pluripotent stem cells are not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose, such as embryonic stem cells (ES cells), embryonic tumor cells (EC cells), embryonic germ stem cells (EG cells). ), induced pluripotent stem cells, induced pluripotent cells (iPS cells), and the like.
  • the somatic stem cells are not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose, such as hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, vascular endothelial stem cells, neural stem cells, hepatic stem cells, epithelial stem cells, adipose stem cells, etc. Can be mentioned. Among these, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, vascular endothelial stem cells, or cells differentiated from these are preferred from the viewpoint of stably and efficiently producing large quantities of cells.
  • Stem cells Stem cells, hematopoietic progenitor cells (lymphoid stem cells), myeloid stem cells, blood cells, bone marrow stromal cells, megakaryocytes, or vascular endothelial stem cells are more preferred, and hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, vascular endothelial stem cells, blood cells, or Bone marrow stromal cells are more preferred, and hematopoietic stem cells, blood cells, or bone marrow stromal cells are particularly preferred.
  • the blood cells are not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose, such as white blood cells such as neutrophils, eosinophils, basophils, lymphocytes, monocytes, and macrophages, red blood cells, and platelets. , mast cells, dendritic cells, etc.
  • the bone marrow stromal cells are not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose, and include, for example, adipose-derived bone marrow stromal cells, bone marrow-derived bone marrow stromal cells, and the like. The cells may be used alone or in combination of two or more.
  • hematopoietic stem cells mesenchymal stem cells, vascular endothelial stem cells, or cells differentiated from these from the tissues, and can be appropriately selected depending on the purpose.
  • hematopoietic stem cells examples include a method of isolating mesenchymal stem cells, vascular endothelial stem cells, or cells differentiated from these tissues from the tissue using expression of a cell surface marker specific to these as an indicator.
  • hematopoietic stem cells mesenchymal stem cells, vascular endothelial stem cells, or cells differentiated from these tissues from the tissue using expression of specific cell surface markers as an indicator
  • any known method may be used.
  • An appropriate method can be selected from among them, and examples include a method of isolating cells having the characteristics of the cell surface marker using an antibody against the cell surface marker using a cell sorter, magnetic beads, or the like.
  • the cell surface markers specific to the hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, vascular endothelial stem cells, or cells differentiated from these can be appropriately selected depending on the animal species from which they are derived.
  • Human-derived hematopoietic stem cells are usually CD34 positive (+), CD90 positive (+), and CD45RA negative (-). In addition to these cell surface markers, cell surface markers such as CD38 negative (-) and CD49f positive (+) may be used in combination. Human-derived hematopoietic progenitor cells are usually CD34 positive (+), CD38 negative (-), CD45RA negative (-), and CD90 negative (-).
  • Mouse-derived hematopoietic stem cells are usually CD34 negative (-), CD150 positive (+), CD48 negative (-), Flt3 negative (-), Lin negative (-), Sca1 positive (+), and cKit positive (+ ) (Lin(-), Sca1(+), cKit(+) are also referred to as "LSK”).
  • Mouse-derived hematopoietic progenitor cells are usually CD34 positive (+), CD48 negative (-), Flt3 positive (+), Sca-1 positive (+), and cKit positive (+).
  • Human-derived mesenchymal stem cells are usually Stro-1 positive (+), CD105 positive (+), CD73 positive (+), CD90 positive (+), CD34 negative (-), CD45 negative (-), and CD11b. negative (-), CD14 negative (-), and HLA-DR negative (-).
  • Mesenchymal stem cells derived from mice are usually Sca-1 positive (+), CD105 positive (+), CD106 positive (+), CD73 positive (+), CD44 positive (+), CD29 positive (+), and CD45 positive. negative (-) and CD11b negative (-).
  • Mouse-derived vascular endothelial stem cells are usually CD157 positive (+) and CD200 positive (+).
  • the cell line is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose, such as human acute myeloid leukemia-derived cell line MOLM-13 (JCRB1810), human adipose-derived mesenchymal stem cell line HAdpc-28-E6E7. -TERT (JCRB1572), human bone marrow-derived mesenchymal stem cells UE6E7T-3 (JCRB1136), and the like. These can be obtained from the JCRB cell bank of the National Institute of Biomedical Innovation, Health and Nutrition.
  • the number of passages for these cell lines is not particularly limited and can be selected as appropriate depending on the purpose, but from the point of view of producing a large amount of cells stably and efficiently, from 5 times (p5) to 40 times. The number of times (p40) is preferred, and the number of times (p8) to 35 times (p35) is more preferred.
  • the lower limit of the number of cells in the culturing process (the number of cells before culturing), and it can be selected as appropriate depending on the purpose, but it is important to stably and efficiently produce a large amount of cells. From this point of view, when using a 24-well plate, 1 x 10 4 or more per well is preferable, 2 x 10 4 or more is more preferable, 3 x 10 4 or more is even more preferable, 4 x 10 4 or more. The above is particularly preferable.
  • 3 x 10 3 or more per well is preferable, 4 x 10 3 or more is more preferable, 5 x 10 3 or more is even more preferable, and 6 x 10 3 or more is more preferable.
  • Particularly preferred There is no particular limit to the upper limit of the number of cells (the number of cells before culturing) in the culturing process, and it can be selected as appropriate depending on the purpose, but it is important to stably and efficiently produce a large amount of cells.
  • a 24-well plate from the viewpoint of The following is even more preferable, and 6 ⁇ 10 4 or less is particularly preferable.
  • the number per well is preferably 1.5 x 10 4 or less, more preferably 1 x 10 4 or less, even more preferably 9 x 10 3 or less, and 8 x 10 3 or less.
  • the following are particularly preferred.
  • the lower limit and upper limit of the cell number (cell number before culturing) in the culturing process can be combined as appropriate, but when using a 24-well plate, 1 ⁇ 10 4 or more per well.
  • 1 ⁇ 10 5 or less is preferable, 2 ⁇ 10 4 or more and 9 ⁇ 10 4 or less is more preferable, 3 ⁇ 10 4 or more and 8 ⁇ 10 4 or less is still more preferable, 4 ⁇ 10 4 or more and 7 ⁇ 10 4 or less is even more preferable, and 4 ⁇ 10 4 or more and 6 ⁇ 10 4 or less is particularly preferable.
  • 3 x 10 3 or more and 1.5 x 10 4 or less per well are preferable, 4 x 10 3 or more and 1 x 10 4 or less are more preferable, and 5 x 10 More preferably 3 or more and 9 ⁇ 10 3 or less, and particularly preferably 6 ⁇ 10 3 or more and 8 ⁇ 10 3 or less.
  • the period of the culture is not particularly limited and can be selected as appropriate depending on the purpose, but from the viewpoint of stably and efficiently producing a large amount of cells, a period of 3 days or more is preferable, and a period of 5 days or more is more preferable. Preferably, 7 days or more is more preferable.
  • the method of bringing the collagen gel containing type III collagen into contact with the cells is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose.
  • examples include three-dimensional culture using The three-dimensional culture using the collagen gel containing type III collagen is not particularly limited and can be selected as appropriate depending on the purpose.
  • a method of culturing cells in the collagen gel i.e. Examples include a method of culturing cells by embedding them in gel (embedding culture method), a method of culturing cells on the collagen gel, that is, a method of culturing cells by adding them to the collagen gel, and the like.
  • a method of culturing cells in the collagen gel is preferred from the viewpoint of stably and efficiently producing a large amount of cells.
  • the method for culturing cells in the collagen gel is not particularly limited and can be selected as appropriate depending on the purpose, for example, a collagen solution containing cells (a collagen solution containing collagen and a cell suspension containing cells).
  • a method of culturing a collagen gel produced by heating a mixed solution (mixed solution of Among these, from the viewpoint of stably and efficiently producing a large amount of cells, a method of culturing using a collagen gel produced by layering a collagen gel containing cells on a collagen gel that does not contain cells is preferred. .
  • the solvent in the collagen solution containing the cells is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose, such as PBS (phosphate buffered saline) and the medium used for the culture.
  • the method of layering the collagen gel containing cells on the collagen gel containing no cells is not particularly limited and can be selected as appropriate depending on the purpose.
  • a method in which a neutral collagen solution containing cells is added onto the resulting collagen gel (hereinafter sometimes referred to as a "gel bed"), and then heated to gel. can be mentioned.
  • the method for producing the collagen gel (gel bed) is as described in the above section ⁇ Collagen gel containing type III collagen>>.
  • a collagen solution containing the cells is added, heated to gel, and then a medium can be gently added onto the collagen gel.
  • the lower limit of the heating temperature after adding the collagen solution containing the cells is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose, but is preferably 20°C or higher, more preferably 25°C or higher. , more preferably 30°C or higher, even more preferably 35°C or higher.
  • the upper limit of the heating temperature after adding the collagen solution containing the cells is not particularly limited and can be selected as appropriate depending on the purpose, but is preferably 50°C or lower, more preferably 45°C or lower. , 40°C or less is more preferable.
  • the lower limit and upper limit of the heating temperature after adding the collagen solution containing cells can be appropriately combined, but preferably 20°C or more and 50°C or less, more preferably 25°C or more and 45°C or less, The temperature is more preferably 30°C or more and 40°C or less, even more preferably 35°C or more and 40°C or less.
  • the lower limit of the heating time after adding the collagen solution containing the cells is not particularly limited and can be selected as appropriate depending on the purpose, but for 30 minutes. or more is preferable, and 45 minutes or more is more preferable.
  • the upper limit of the heating time after adding the collagen solution containing the cells is not particularly limited and can be selected as appropriate depending on the purpose, but it may be 2 hours.
  • the time is preferably at most 1.5 hours, more preferably at most 1 hour, even more preferably at most 1 hour.
  • the lower limit and upper limit of the heating time after adding the collagen solution containing cells can be appropriately combined, but preferably 30 minutes or more and 1.5 hours or less, more preferably 45 minutes or more and 1 hour or less. preferable.
  • the volume ratio is preferably 0.1 times or more, more preferably 0.15 times or more, and 0.18 times or more. More preferred.
  • the volume ratio is preferably 0.3 times or less, more preferably 0.29 times or less, and 0.28 times or less. It is more preferable, and particularly preferably 0.27 times or less.
  • the lower and upper limits of the amount of collagen gel (gel bed) not containing cells relative to the total amount of collagen gel (gel bed) not containing cells and collagen gel containing cells can be combined as appropriate.
  • the volume ratio is preferably 0.1 times or more and 0.3 times or less, more preferably 0.15 times or more and 0.29 times or less, even more preferably 0.18 times or more and 0.28 times or less, and 0.18 times. Particularly preferably 0.27 times or less.
  • the method for culturing cells on the collagen gel is not particularly limited and can be selected as appropriate depending on the purpose.
  • a neutral collagen solution containing no cells is heated to form a gel (fibrosis )
  • a method of culturing using a collagen gel produced by the method described above can be mentioned.
  • the method of culturing using a collagen gel produced by heating a neutral collagen solution that does not contain cells to form a gel (fibrillation) and the method may be selected as appropriate depending on the purpose.
  • a method may be used in which a cell suspension is added to the collagen gel and cultured.
  • the method for producing the collagen gel is as described in the above section ⁇ Collagen gel containing type III collagen>>.
  • the culture conditions for the culture are not particularly limited and can be appropriately selected from known conditions.
  • the culture temperature is usually 30°C to 40°C, preferably about 37°C.
  • the CO 2 concentration during the culture is usually 1% to 10% by volume, preferably 2% to 5% by volume.
  • the culture conditions can be adjusted using a commercially available cell culture device such as an incubator.
  • the medium (culture solution) used for the culture is not particularly limited and can be appropriately selected from known media.
  • the cells are stem cells, for the purpose of maintaining their undifferentiated nature, stem cell factor (SCF), thrombopoietin (TPO), Flt-3 ligand (FL), interleukin (IL)-3, IL-6 , IL-11 and other cytokines, and serum albumin such as bovine serum albumin (BSA).
  • SCF stem cell factor
  • TPO thrombopoietin
  • FL Flt-3 ligand
  • IL interleukin
  • IL-6 interleukin-6
  • IL-11 interleukin-11
  • serum albumin such as bovine serum albumin (BSA).
  • the medium may be replaced with a new one or circulated as appropriate, or the subculture step described below may be performed.
  • the cells cultured in the culture step are specific cells by confirming the expression of a cell surface marker specific to the cells.
  • a method for confirming the expression of the cell surface marker in addition to the above-mentioned methods using a cell sorter, magnetic beads, etc., immunostaining method, enzyme activity measurement method, real-time RT-PCR method, etc. can also be used.
  • the other steps are not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose, and include, for example, a collection step, a subculture step, and the like.
  • the collecting step is a step of collecting the cells after the culturing step.
  • the recovery method is not particularly limited and can be selected as appropriate depending on the purpose, but from the viewpoint of stably and efficiently producing a large amount of cells, a method of treating the collagen gel with an enzyme is preferred.
  • the enzyme is not particularly limited and can be selected as appropriate depending on the purpose, but from the viewpoint of stably and efficiently producing a large amount of cells, at least one selected from the group consisting of collagenase and thermolysin. is preferred, and it is more preferred to use collagenase and thermolysin together.
  • the amount of the collagenase added is not particularly limited and can be selected appropriately depending on the purpose, but from the viewpoint of stably and efficiently producing a large amount of cells,
  • the mass ratio of the added amount of thermolysin is preferably 3 times or more, more preferably 4 times or more, even more preferably 5 times or more, even more preferably 6 times or more, particularly preferably 7 times or more, and 8 times The above is most preferable.
  • the lower limit of the final concentration of collagenase is not particularly limited and can be selected as appropriate depending on the purpose, but from the viewpoint of stably and efficiently producing a large amount of cells, , it is preferably 0.1 mg/mL or more, more preferably 0.25 mg/mL or more, even more preferably 0.5 mg/mL or more, and particularly preferably 0.75 mg/mL or more.
  • the upper limit of the final concentration of collagenase is not particularly limited and can be selected as appropriate depending on the purpose, but from the viewpoint of stably and efficiently producing a large amount of cells, 3 mg/mL or less, more preferably 2 mg/mL or less, even more preferably 1.5 mg/mL or less, particularly preferably 1.25 mg/mL or less.
  • the combination of the lower limit and upper limit of the final concentration of collagenase can be selected as appropriate, but is preferably 0.1 mg/mL or more and 3 mg/mL or less, more preferably 0.25 mg/mL or more and 2 mg/mL or less. , more preferably 0.5 mg/mL or more and 1.5 mg/mL or less, particularly preferably 0.75 mg/mL or more and 1.25 mg/mL or less.
  • the lower limit of the final concentration of thermolysin is not particularly limited and can be selected as appropriate depending on the purpose, but from the viewpoint of stably and efficiently producing a large amount of cells, 0.01 mg/mL or more, more preferably 0.03 mg/mL or more, even more preferably 0.05 mg/mL or more.
  • the upper limit of the final concentration of thermolysin is not particularly limited and can be selected as appropriate depending on the purpose, but from the viewpoint of stably and efficiently producing a large amount of cells, , preferably 0.5 mg/mL or less, more preferably 0.25 mg/mL or less, even more preferably 0.2 mg/mL or less, even more preferably 0.15 mg/mL or less, and even more preferably 0.1 mg/mL or less.
  • thermolysin can be selected as appropriate, but is preferably 0.01 mg/mL or more and 0.5 mg/mL or less, and 0.03 mg/mL or more and 0.25 mg/mL. The following are more preferable, 0.03 mg/mL or more and 0.2 mg/mL or less, even more preferably 0.05 mg/mL or more and 0.15 mg/mL or less, and 0.05 mg/mL or more and 0.1 mg/mL or less. is particularly preferred.
  • the subculture step is a step in which the cells cultured in the culture step are further subcultured.
  • the method for carrying out the subculture is not particularly limited and can be selected as appropriate depending on the purpose, but it is carried out by repeating the recovery step, the culture step, and the recovery step if necessary. It is preferable.
  • the subculture step may be performed only once or multiple times.
  • the cell culture method described above can easily, stably, and efficiently produce a large amount of cells, and therefore can be suitably used as a cell culture method for use in cell transplantation therapy, production of biological preparations, etc. I can do it.
  • the method for producing a therapeutic composition of the present invention includes a culturing step and may further include other steps.
  • the culturing step and the other steps are as described in the ⁇ Culture step> and ⁇ Other steps> section of the above-mentioned (Method for culturing cells).
  • the therapeutic composition is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose, but the therapeutic composition of the present invention described below is preferred.
  • the therapeutic composition of the present invention includes a collagen gel comprising type III collagen and cells, the cells being in contact with the collagen gel.
  • the therapeutic composition may further contain other components as necessary.
  • the collagen gel containing type III collagen and the cells are as described in the ⁇ Culture step> section of the above-mentioned (cell culture method).
  • ⁇ Other ingredients The other components described above are not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose from among formulation additives that can be used in the pharmaceutical industry without impairing the effects of the present invention.
  • formulation additives that can be used in the pharmaceutical industry without impairing the effects of the present invention.
  • excipients fillers, agents, binders, wetting agents, disintegrants, surfactants, lubricants, dispersants, buffers, preservatives, solubilizing agents, preservatives, flavoring agents, soothing agents, stabilizers, etc.
  • excipients fillers, agents, binders, wetting agents, disintegrants, surfactants, lubricants, dispersants, buffers, preservatives, solubilizing agents, preservatives, flavoring agents, soothing agents, stabilizers, etc.
  • the use of the therapeutic composition is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the type of the cells, and includes, for example, a therapeutic composition for diseases for which treatment by cell transplantation of the cells is effective. It will be done. Specific examples include compositions for treating aplastic anemia, compositions for treating myelodysplastic syndromes, and the like. Therefore, the therapeutic composition of the present invention can be suitably used as a composition for treating aplastic anemia, a composition for treating myelodysplastic syndrome, etc., and these compositions are also within the scope of the present invention.
  • Example 1 Culture in type III collagen gel (embedded culture)
  • bovine type III collagen solution (Nippi Co., Ltd., PSC-3-100-20) was diluted with 10x D-PBS (-) (Fujifilm Wako Pure Chemical, 048-29805) with sterile water.
  • the mixture was neutralized to 2 mg/mL and pH 7.3 by mixing on ice with the prepared 3 ⁇ PBS(-) (3 times the concentration of D-PBS(-)).
  • Example 2 Culture in type I + type III collagen gel (embedded culture)
  • Culture was performed in the same manner as in Example 1, except that instead of bovine type III collagen, porcine dermis-derived collagen containing type I and type III collagen (Nippi Co., Ltd., PSC-S-200-100PW) was used.
  • bovine type III collagen porcine dermis-derived collagen containing type I and type III collagen (Nippi Co., Ltd., PSC-S-200-100PW) was used.
  • Countess II FL Thermo Fisher Scientific, AMQAF1000.
  • Example 2 Culture in type I collagen gel (embedded culture) Culture was carried out in the same manner as in Example 1, except that bovine type I collagen (Nippi Co., Ltd., ASC-1-100-20) was used instead of bovine type III collagen. On the 3rd, 6th, and 7th day from the start of culture, cells were collected in the same manner as in Example 1, and living cells were counted using an automatic cell counter Countess II FL (Thermo Fisher Scientific, AMQAF1000). In addition, on the 3rd and 6th day of culture, 0.5 mL of supernatant was removed from each well, and 0.5 mL of new medium was added to perform medium exchange. The results are shown in Figure 2 (left bar: Type I collagen gel).
  • Example 3-1 Culture in type III collagen gel (embedded culture) concentration study 1) After diluting 3 mg/mL bovine type III collagen solution (Nippi Co., Ltd., PSC-3-100-20) with 5 mM acetic acid, 10x D-PBS (-) (Fujifilm Wako Pure Chemical, 048-29805) was added. Neutralize to pH 7.3 by mixing on ice with 3x PBS (-) (3x concentration D-PBS (-)) prepared by diluting with sterile water to a final concentration of 0.25 mg/mL. , 0.5 mg/mL, 1 mg/mL, or 2 mg/mL, respectively.
  • a medium (RPMI1640 medium (Thermo Fisher Scientific, 10270-106) containing 3% by volume fetal bovine serum (Thermo Fisher Scientific, 10270-106) was added to the medium to avoid breaking the gel. , 11875-085)
  • RPMI1640 medium Thermo Fisher Scientific, 10270-106
  • fetal bovine serum Thermo Fisher Scientific, 10270-106
  • Example 3-2 Culture in type III collagen gel (embedded culture) concentration study 2)
  • the final concentration of type III collagen solution pH 7.3
  • the RPMI 1640 medium containing 3% by volume fetal bovine serum was changed to the RPMI1640 medium containing 10% by volume fetal bovine serum for analysis.
  • Culture and cell counting were performed in the same manner as in Example 3-1, except that the number of wells (n) was 4.
  • the results are shown in FIG. 3B (Type III collagen gel).
  • the cells were added to wells in a 96-well plate (Fukae Kasei, 197-96CIPS) and incubated for 2 hours (37°C, 5% CO 2 ) in a constant temperature bath (PHC Corporation, MCO-170AICUVD-PJ). Thereafter, 0.15 mL of a medium (RPMI1640 medium (Thermo Fisher Scientific, 11875-085) containing 10% by volume fetal bovine serum (Thermo Fisher Scientific, 10270-106)) was added, and the mixture was placed in a constant temperature bath (PHC Corporation, MCO-). 170 AICUVD-PJ) (37° C., 5% CO 2 ).
  • RPMI1640 medium Thermo Fisher Scientific, 11875-085
  • fetal bovine serum Thermo Fisher Scientific, 10270-106
  • Example 4 Culture on type III collagen gel
  • 10x D-PBS (-) (Fujifilm Wako Pure Chemical, 048-29805) was added.
  • JCRB1810 human acute myeloid leukemia-derived cell line MOLM-13 (JCRB1810), obtained from the JCRB cell bank of the National Institute of Biomedical Innovation, Health and Nutrition) 0.26 mL of cell suspension was added and cultured (37° C., 5% CO 2 ) in a constant temperature bath (PHC Corporation, MCO-170AICUVD-PJ).
  • Untreated 24-well plate or collagen molecule coated plate 5 x 104 cells per well human acute myeloid leukemia-derived cell line MOLM-13 (JCRB1810), National Institute of Biomedical Innovation, Health and Nutrition) Cells were collected on the 3rd and 5th day of culture and stained with 0.4% trypan blue reagent (Thermo Fisher Scientific, 15250-061) using an automatic cell counter (Countess). Live cells were measured using II FL (Thermo Fisher Scientific, AMQAF1000). The results are shown in Figure 5.
  • Example 5 Culture in type III collagen gel (embedded culture)
  • bovine type III collagen solution Nappi Co., Ltd., PSC-3-100-20
  • 10x D-PBS (-) Flujifilm Wako Pure Chemical, 048-29805
  • 3x PBS (-) 3x concentrated D-PBS (-)
  • sterile water a final concentration of 0.5 mg/mL. , or 2 mg/mL, respectively.
  • FIG. 6A human adipose-derived mesenchymal stem cell line HAdpc-28-E6E7-TERT: Type III collagen
  • FIG. 6B human bone marrow-derived mesenchymal stem cell UE6E7T-3: Type III collagen.
  • Untreated 24-well plate or collagen molecule-coated plate with 5 x 10 cells per well (human adipose-derived mesenchymal stem cell line HAdpc-28-E6E7-TERT (JCRB1572), National Institute for Biomedical Innovation and Health) - Obtained from the JCRB Cell Bank of the Institute of Nutrition) were seeded, and cells were collected on the second and fifth day of culture and stained with 0.4% trypan blue reagent (Thermo Fisher Scientific, 15250-061). Live cells were counted using an automatic cell counter Countess II FL (Thermo Fisher Scientific, AMQAF1000). The results are shown in FIG.
  • Example 6 Examination of enzymes
  • the final concentration of type III collagen solution was 0.5 mg/mL, and in the recovery of cells from collagen gel-embedded culture, 1 mg/mL collagenase, 0.12 mg/mL thermolysin, 0.06 mg/mL thermolysin, 1 mg Culture was performed in the same manner as in Example 3-1, and viable cells were counted, except that 1 mg/mL collagenase and 0.12 mg/mL thermolysin, or 1 mg/mL collagenase and 0.06 mg/mL thermolysin were used. The results are shown in Figure 9A. Cell viability is shown in Figure 9B.
  • thermolysin alone has a large concentration-dependent effect on cell viability and only a slight effect on the number of recovered cells, but when used in combination with collagenase, On the contrary, it was found that the effect on cell survival rate disappeared and the number of recovered cells increased synergistically.
  • the obtained collagen gel was immersed in 1 mL of t-butanol (Tokyo Kasei Kogyo Co., Ltd., 75-65-0) and solidified in a refrigerator at 8°C. After removing the cap of the 1.5 mL tube and sealing it with parafilm, a hole was made with tweezers. While maintaining solidification with an ice pack (cooling pack), place the Eppendorf tube in a vacuum constant temperature dryer (Tokyo Rikakikai Co., Ltd., VOS-201SD), and use a vacuum pump (Nitto Kohki Co., Ltd., LV-660). was used to dry t-butanol by sublimation for 3 hours.
  • t-butanol Tokyo Kasei Kogyo Co., Ltd., 75-65-0
  • Example 7 Phase contrast microscopy observation
  • Culture was carried out in the same manner as in Example 1, Example 2, Comparative Example 1, and Comparative Example 2, except that the number of days of culture was 14 days.
  • On the 14th day of culture cells were observed using a phase contrast microscope (Nikon Corporation, ECLIPSE Ts2-FL). The results are shown in FIG. Note that the scale bar in FIG. 11 was 100 ⁇ m.
  • Examples of aspects of the present invention include the following.
  • a method for culturing cells comprising a culturing step of culturing the cells by bringing the cells into contact with a collagen gel containing type III collagen.
  • the collagen gel further contains type I collagen
  • ⁇ 4> The method for culturing cells according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3> above, wherein the cells are hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, vascular endothelial stem cells, or cells differentiated from these.
  • ⁇ 5> The method for culturing cells according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 4>, including a recovery step of recovering the cells after the culturing step.
  • ⁇ 6> The method for culturing cells according to ⁇ 5>, wherein the collagen gel is treated with collagenase and thermolysin in the recovery step.
  • ⁇ 7> The method for culturing cells according to ⁇ 6>, wherein the amount of collagenase added is three times or more the amount of thermolysin added, in terms of mass ratio.
  • ⁇ 8> The method for culturing cells according to ⁇ 6> or ⁇ 7>, wherein the amount of thermolysin added is 0.3 mg/mL or less.
  • a method for producing a therapeutic composition comprising a culturing step of bringing cells into contact with a collagen gel containing type III collagen and culturing the cells.
  • ⁇ 10> Contains a collagen gel containing type III collagen and cells, The therapeutic composition is characterized in that the cells are in contact with the collagen gel.
  • the cell culture method of the present invention can easily, stably, and efficiently produce large amounts of cells, it is suitable as a cell culture method for use in cell transplant therapy or the production of biological products. can be used.

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Abstract

ＩＩＩ型コラーゲンを含むコラーゲンゲルと細胞を接触させて、前記細胞を培養する培養工程を含む細胞の培養方法、ＩＩＩ型コラーゲンを含むコラーゲンゲルと細胞を接触させて、前記細胞を培養する培養工程を含む治療用組成物の製造方法、又はＩＩＩ型コラーゲンを含むコラーゲンゲルと、細胞と、を含み、前記細胞は、前記コラーゲンゲルと接触している治療用組成物である。

Description

細胞の培養方法、治療用組成物の製造方法及び治療用組成物
　本発明は、細胞の培養方法、治療用組成物の製造方法及び治療用組成物に関する。
　近年、様々な種類の細胞移植治療が有効であることが明らかになってきている。例えば、再生不良性貧血や骨髄異形成症候群などの疾患では、造血幹細胞や骨髄支持細胞などの細胞移植治療が有効である。しかしながら、これらの細胞移植治療において、ドナーが不足していることやＨＬＡが不一致の場合のリスクが大きいことなどから、ソースとなる細胞、及び前記細胞を含む治療用組成物の供給体制は十分ではなく、細胞の安定供給のための細胞増殖方法も確立されていない。
　また、多くの生物学的製剤は細胞を用いて製造されるが、これらの細胞についても、十分に細胞増殖方法が確立されているとはいえない。
　Ｉ型コラーゲンで被覆された多孔質のポリビニルフォルマール（ＰＶＦ）樹脂に、骨髄細胞を注入して培養した担体をマウスに移植することで、マウス体内で造血幹細胞が担体内へ侵入し、前記細胞の増殖と血球細胞への分化が認められることが報告されている（特許文献１参照）。しかし、この方法では、担体の作製が必要であり、更に、造血幹細胞を増殖させるためには、前記担体をマウスに移植する必要があることから、簡易な方法とは言い難く、また、増殖した細胞をヒトへ移植することはできず、ヒトの造血幹細胞や血球細胞の増殖には不適である。
　Ｉ型コラーゲンゲル上に線維芽細胞の懸濁液を加え、２５時間培養し、コラゲナーゼ処理により細胞を回収する方法が報告されている（特許文献２参照）。しかし、２５時間以上の培養や、その細胞増殖効果については報告されていない。
　コラーゲンスポンジを用いて、多能性幹細胞から中胚葉細胞を製造する方法が報告されている（特許文献３参照）。しかし、コラーゲンスポンジを用いる方法は、簡易な方法とは言い難く、また、細胞の大量増殖には不適である。
　幹細胞とコラーゲン溶液を混合する工程、前記混合物を遠心分離して幹細胞とコラーゲンを集積させる工程、及び幹細胞とコラーゲンの集積物を培養する工程を含む方法が報告されている（特許文献４参照）。しかし、この方法は、幹細胞とコラーゲンを集積させる工程を含むものであり、簡易な方法とは言い難い。
　したがって、簡易に、安定的かつ効率的に大量の細胞を製造することができる、細胞の培養方法、並びに治療用組成物の製造方法、及び前記細胞を含む治療用組成物は未だ提供されておらず、その提供が強く望まれている。
特許第３４２１７４１号 特許第６４４８２１６号 国際公開第２０１５／１９９１２７号 特許第６９４５２４２号
　本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、簡易に、安定的かつ効率的に大量の細胞を製造することができる、細胞の培養方法、並びに治療用組成物の製造方法、及び前記細胞を含む治療用組成物を提供することを目的とする。
　前記課題を解決するための手段としては、以下のとおりである。即ち、
　＜１＞　ＩＩＩ型コラーゲンを含むコラーゲンゲルと細胞を接触させて、前記細胞を培養する培養工程を含むことを特徴とする細胞の培養方法である。
　＜２＞　ＩＩＩ型コラーゲンを含むコラーゲンゲルと細胞を接触させて、前記細胞を培養する培養工程を含むことを特徴とする治療用組成物の製造方法である。
　＜３＞　ＩＩＩ型コラーゲンを含むコラーゲンゲルと、細胞と、を含み、
　前記細胞は、前記コラーゲンゲルと接触していることを特徴とする治療用組成物である。
　本発明によると、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、簡易に、安定的かつ効率的に大量の細胞を製造することができる、細胞の培養方法、並びに治療用組成物の製造方法、及び前記細胞を含む治療用組成物を提供することができる。
図１は、実施例１及び比較例１における細胞数の計測結果を示した図である。右の白色のバーは実施例１（Ｔｙｐｅ　ＩＩＩ　ｃｏｌｌａｇｅｎ　ｇｅｌ）を示す。左の黒色のバーは比較例１（２Ｄ）を示す。 図２は、実施例１、実施例２、及び比較例２における細胞数の計測結果を示した図である。右の白色のバーは実施例１（Ｔｙｐｅ　ＩＩＩ　ｃｏｌｌａｇｅｎ　ｇｅｌ）を示す。中央の灰色のバーは実施例２（Ｔｙｐｅ　Ｉ＋ＩＩＩ　ｃｏｌｌａｇｅｎ　ｇｅｌ）を示す。左の黒色のバーは比較例２（Ｔｙｐｅ　Ｉ　ｃｏｌｌａｇｅｎ　ｇｅｌ）を示す。 図３Ａは、実施例３－１における細胞数の計測結果を示した図である。 図３Ｂは、実施例３－２（Ｔｙｐｅ　ＩＩＩ　ｃｏｌｌａｇｅｎ　ｇｅｌ　０．５ｍｇ／ｍＬ又は２ｍｇ／ｍＬ）及び比較例３（２Ｄ）における細胞数の計測結果を示した図である。実施例３－２及び比較例３は、Ｎ＝４で実施した。＊＊＊ｐ＜０．００１である。 図４は、実施例４（Ｔｙｐｅ　ＩＩＩ　ｃｏｌｌａｇｅｎ　ｇｅｌ）及び比較例４（２Ｄ）における細胞数の計測結果を示した図である。 図５は、比較例５における細胞数の計測結果を示した図である。 図６Ａは、実施例５（Ｔｙｐｅ　ＩＩＩ　ｃｏｌｌａｇｅｎ）及び比較例６（２Ｄ）におけるヒト脂肪由来間葉系幹細胞株ＨＡｄｐｃ－２８の細胞数の計測結果を示した図である。 図６Ｂは、実施例５（Ｔｙｐｅ　ＩＩＩ　ｃｏｌｌａｇｅｎ）及び比較例６（２Ｄ）におけるヒト骨髄由来間葉系幹細胞ＵＥ６Ｅ７Ｔ－３の細胞数の計測結果を示した図である。 図７は、比較例７における細胞数の計測結果を示した図である。 図８は、試験例１における細胞の生存率を示した図である。 図９Ａは、実施例６における細胞数の計測結果を示した図である。 図９Ｂは、実施例６における細胞の生存率を示した図である。 図１０は、試験例２におけるコラーゲンゲルの走査型電子顕微鏡写真である。左側は比較例２（ウシＴｙｐｅ　Ｉ　ｃｏｌｌａｇｅｎ　ｇｅｌ）のコラーゲン線維の観察像を示す。中央は実施例２（ブタＴｙｐｅ　Ｉ＋ＩＩＩ　ｃｏｌｌａｇｅｎ　ｇｅｌ）のコラーゲン線維の観察像を示す。右側は実施例１（ウシＴｙｐｅ　ＩＩＩ　ｃｏｌｌａｇｅｎ　ｇｅｌ）のコラーゲン線維の観察像を示す。 図１１は、実施例７における細胞の位相差顕微鏡写真である。左上は比較例２（Ｔｙｐｅ　Ｉ　ｃｏｌｌａｇｅｎ　ｇｅｌ）のコラーゲン線維と共に培養した細胞の観察像を示す。左下は実施例１（Ｔｙｐｅ　ＩＩＩ　ｃｏｌｌａｇｅｎ　ｇｅｌ）のコラーゲン線維と共に培養した細胞の観察像を示す。右上は実施例２（ブタＴｙｐｅ　Ｉ＋ＩＩＩ　ｃｏｌｌａｇｅｎ　ｇｅｌ）のコラーゲン線維と共に培養した細胞の観察像を示す。右下は比較例１（２Ｄ）のコラーゲン線維と共に培養した細胞の観察像を示す。
（細胞の培養方法）
　本発明の細胞の培養方法は、培養工程を含み、更にその他の工程を含むことができる。
＜培養工程＞
　前記培養工程は、ＩＩＩ型コラーゲンを含むコラーゲンゲルと細胞を接触させて、前記細胞を培養する工程である。
＜＜ＩＩＩ型コラーゲンを含むコラーゲンゲル＞＞
　前記ＩＩＩ型コラーゲンとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、動物由来ＩＩＩ型コラーゲン、又は魚類由来ＩＩＩ型コラーゲンが好ましく、動物由来ＩＩＩ型コラーゲンがより好ましい。
　前記ＩＩＩ型コラーゲンは、組換えＩＩＩ型コラーゲンであることが好ましい。
　前記ＩＩＩ型コラーゲンは、医療グレードコラーゲンであってもよい。
　前記動物由来ＩＩＩ型コラーゲンとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ヒト由来ＩＩＩ型コラーゲン、ウシ由来ＩＩＩ型コラーゲン、又はブタ由来ＩＩＩ型コラーゲンが好ましく、ヒト由来ＩＩＩ型コラーゲン、又はウシ由来ＩＩＩ型コラーゲンがより好ましい。
　前記ＩＩＩ型コラーゲンの製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、動物又は魚類の真皮等から、酸により抽出する方法、酵素で可溶化する方法などが挙げられる。これらの中でも、動物又は魚類の真皮等から酵素で可溶化する方法が好ましい。
　前記酵素としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ペプシンが好ましい。
　前記ＩＩＩ型コラーゲンは、市販品を用いることができる。
　前記市販品としては、ウシＩＩＩ型コラーゲン（株式会社ニッピ，　ＰＳＣ－３－１００－２０）、ブタ真皮由来Ｉ＋ＩＩＩ型コラーゲン（株式会社ニッピ，　ＰＳＣ－Ｓ－２００－１００ＰＷ）などが挙げられる。
　前記ＩＩＩ型コラーゲンは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
　前記コラーゲンゲルにおける、ＩＩＩ型コラーゲンの濃度の下限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．０１ｍｇ／ｍＬ以上が好ましく、０．０５ｍｇ／ｍＬ以上がより好ましく、０．１ｍｇ／ｍＬ以上が更に好ましく、０．２ｍｇ／ｍＬ以上がより更に好ましく、０．２５ｍｇ／ｍＬ以上が特に好ましく、０．３ｍｇ／ｍＬ以上が最も好ましい。
　前記コラーゲンゲルにおける、ＩＩＩ型コラーゲンの濃度の上限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、安定的かつ効率的に大量の細胞を製造する点から、１０ｍｇ／ｍＬ以下が好ましく、５ｍｇ／ｍＬ以下がより好ましく、２．５ｍｇ／ｍＬ以下が更に好ましく、１．５ｍｇ／ｍＬ以下がより更に好ましく、１ｍｇ／ｍＬ以下が特に好ましく、０．７５ｍｇ／ｍＬ以下が最も好ましい。
　前記ＩＩＩ型コラーゲンの濃度の下限値と上限値とは、適宜組み合わせることができるが、０．０１ｍｇ／ｍＬ以上１０ｍｇ／ｍＬ以下が好ましく、０．０５ｍｇ／ｍＬ以上５ｍｇ／ｍＬ以下がより好ましく、０．１ｍｇ／ｍＬ以上２．５ｍｇ／ｍＬ以下が更に好ましく、０．２ｍｇ／ｍＬ以上１．５ｍｇ／ｍＬ以下がより更に好ましく、０．２５ｍｇ／ｍＬ以上１ｍｇ／ｍＬ以下が特に好ましく、０．３ｍｇ／ｍＬ以上０．７５ｍｇ／ｍＬ以下が最も好ましい。
　前記コラーゲンゲルは、更にＩ型コラーゲンを含んでいてもよい。
　前記コラーゲンゲルが前記Ｉ型コラーゲンを含む場合、前記コラーゲンゲルにおける、Ｉ型コラーゲンの濃度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、安定的かつ効率的に大量の細胞を製造する点から、３ｍｇ／ｍＬ以下が好ましく、１ｍｇ／ｍＬ以下がより好ましく、０．５ｍｇ／ｍＬ以下が更に好ましく、０．１ｍｇ／ｍＬ以下がより更に好ましく、０．０５ｍｇ／ｍＬ以下が特に好ましく、Ｉ型コラーゲンを含まないことが最も好ましい。
　前記コラーゲンゲルの製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＩＩＩ型コラーゲンを含むコラーゲン溶液をゲル化、すなわち、線維（「繊維」ともいう）化する方法などが挙げられる。
　前記コラーゲン溶液における溶媒としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）、前記培養に使用する培地などが挙げられる。
　前記ＩＩＩ型コラーゲンを含むコラーゲン溶液をゲル化する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＩＩＩ型コラーゲンを含む氷冷コラーゲン溶液を、中性にして加温してゲル化（線維化）する方法が挙げられる。中性にしてゲル化（線維化）することで、多孔質化させることができる。
　前記コラーゲン溶液をゲル化する際の、該コラーゲン溶液のｐＨとしては、中性であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ｐＨ６～９が好ましく、ｐＨ７～８がより好ましく、ｐＨ７～７．５が更に好ましい。
　前記加温の温度の下限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、２０℃以上が好ましく、２５℃以上がより好ましく、３０℃以上が更に好ましく、３５℃以上がより更に好ましい。
　前記加温の温度の上限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、５０℃以下が好ましく、４５℃以下がより好ましく、４０℃以下が更に好ましい。
　前記加温の温度の下限値と上限値とは、適宜組み合わせることができるが、２０℃以上５０℃以下が好ましく、２５℃以上４５℃以下がより好ましく、３０℃以上４０℃以下が更に好ましく、３５℃以上４０℃以下がより更に好ましい。
　前記加温の時間の下限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１時間以上が好ましく、３時間以上がより好ましく、６時間以上が更に好ましく、１２時間以上がより更に好ましい。
　前記加温の時間の上限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、４８時間以下が好ましく、２４時間以下がより好ましく、１８時間以下が更に好ましい。
　前記加温の時間の下限値と上限値とは、適宜組み合わせることができるが、１時間以上４８時間以下が好ましく、３時間以上２４時間以下がより好ましく、６時間以上２４時間以下が更に好ましく、１２時間以上１８時間以下がより更に好ましい。
　前記培養工程における前記コラーゲンゲルの使用量の下限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、安定的かつ効率的に大量の細胞を製造する点から、２４ウェルプレートを用いる場合は、１ウェルあたり、０．２５ｍＬ以上が好ましく、０．５ｍＬ以上がより好ましく、０．７５ｍＬ以上が更に好ましい。また、９６ウェルプレートを用いる場合は、１ウェルあたり、５０μＬ以上が好ましく、７５μＬ以上がより好ましく、１００μＬ以上が更に好ましく、１１０μＬ以上が特に好ましい。
　前記培養工程における前記コラーゲンゲルの使用量の上限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、安定的かつ効率的に大量の細胞を製造する点から、２４ウェルプレートを用いる場合は、１ウェルあたり、２ｍＬ以下が好ましく、１．５ｍＬ以下がより好ましく、１．２５ｍＬ以下が更に好ましく、１ｍＬ以下が特に好ましい。また、９６ウェルプレートを用いる場合は、１ウェルあたり、２００μＬ以下が好ましく、１７５μＬ以下がより好ましく、１５０μＬ以下が更に好ましい。
　前記培養工程における前記コラーゲンゲルの使用量の下限値と上限値とは、適宜組み合わせることができるが、２４ウェルプレートを用いる場合は、１ウェルあたり、０．２５ｍＬ以上２ｍＬ以下が好ましく、０．５ｍＬ以上１．５ｍＬ以下がより好ましく、０．７５ｍＬ以上１．２５ｍＬ以下が更に好ましく、０．７５ｍＬ以上１ｍＬ以下が特に好ましい。また、９６ウェルプレートを用いる場合は、１ウェルあたり、５０μＬ以上２００μＬ以下が好ましく、７５μＬ以上１７５μＬ以下がより好ましく、１００μＬ以上１５０μＬ以下が更に好ましく、１１０μＬ以上１５０μＬ以下が特に好ましい。
　従来の培養法である、コラーゲンコート培養（コラーゲン分子コート上での培養）では、コラーゲンを含む溶液をプレート又はプレート内のウェルに加えて、氷冷下又は４℃程度でコーティングすることでコラーゲンコートプレートを得る。この方法では、コラーゲンはゲル化（線維化）することなく、コラーゲン分子（３本のペプチド鎖で構成されるコラーゲンらせん）の状態でプレートにコートされる。
　一方、本発明の細胞の培養方法の培養工程において、コラーゲンゲル中での培養（包埋培養）やコラーゲンゲル上での培養を行う場合は、中性にしたコラーゲンを含む溶液をプレート又はプレート内のウェルに加えて、加温することでコラーゲンゲルプレートを得る。この方法では、コラーゲン分子同士が自己会合することで、コラーゲンはゲル化（線維化）する。
　コラーゲンが、コラーゲン分子の状態であるか、ゲル化（線維化）の状態であるかは、ゲル化（線維化）の状態では、コラーゲン分子の状態と比較して白濁するため、目視により判別することができる。また、液面の揺れ具合でもゲル化を判別することができる。
＜＜細胞＞＞
　前記細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、真核細胞が好ましい。
　前記真核細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、動物細胞、又は植物細胞が好ましく、動物細胞がより好ましい。
　前記動物細胞としては、特に制限はなく、培養後の使用目的などに応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、サル、マーモセット等の霊長類由来の細胞；マウス、ラット、ハムスター等の齧歯類由来の細胞；ニワトリ等の鳥類由来の細胞；ウサギ等のウサギ目由来の細胞；ブタ、ヒツジ、ウシ、ヤギ、ウマ等の有蹄目由来の細胞；イヌ、ネコ等のネコ目由来の細胞などが挙げられる。
　これらの中でも、白血病、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫等の血液癌、再生不良性貧血、骨髄異形成症候群などの治療に応用できる点から、ヒト由来の細胞が好ましい。
　前記動物細胞が由来とする組織としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、骨髄、臍帯血、末梢血、肝臓などが挙げられる。
　前記細胞は、前記組織から単離した初代培養細胞であってもよく、継代培養した細胞であってもよく、細胞株由来の細胞であってもよい。また前記初代培養細胞又は前記継代培養した細胞を凍結保存した後に融解した細胞であってもよい。
　前記細胞の種類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、幹細胞、又は幹細胞から分化した細胞などが挙げられる。
　前記幹細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、多能性幹細胞、体性幹細胞などが挙げられる。
　前記多能性幹細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性腫瘍細胞（ＥＣ細胞）、胚性生殖幹細胞（ＥＧ細胞）、人工多能性幹細胞、誘導万能細胞（ｉＰＳ細胞）などが挙げられる。
　前記体性幹細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、造血幹細胞、間葉系幹細胞、血管内皮幹細胞、神経幹細胞、肝幹細胞、上皮幹細胞、脂肪幹細胞などが挙げられる。
　これらの中でも、安定的かつ効率的に大量の細胞を製造する点から、造血幹細胞、間葉系幹細胞、血管内皮幹細胞、又はこれらから分化した細胞が好ましく、造血幹細胞、間葉系幹細胞、血管内皮幹細胞、造血前駆細胞（リンパ系幹細胞）、骨髄系幹細胞、血球細胞、骨髄間質細胞、巨核球、又は血管内皮幹細胞がより好ましく、造血幹細胞、間葉系幹細胞、血管内皮幹細胞、血球細胞、又は骨髄間質細胞が更に好ましく、造血幹細胞、血球細胞、又は骨髄間質細胞が特に好ましい。
　前記血球細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球、単球、マクロファージ等の白血球、赤血球、血小板、肥満細胞、樹状細胞などが挙げられる。
　前記骨髄間質細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、脂肪由来の骨髄間質細胞、骨髄由来の骨髄間質細胞などが挙げられる。
　前記細胞は、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
　前記組織から造血幹細胞、間葉系幹細胞、血管内皮幹細胞、又はこれらから分化した細胞を単離する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、造血幹細胞、間葉系幹細胞、血管内皮幹細胞、又はこれらから分化した細胞に特異的な細胞表面マーカーの発現を指標として前記組織から単離する方法などが挙げられる。
　前記造血幹細胞、間葉系幹細胞、血管内皮幹細胞、又はこれらから分化した細胞に特異的な細胞表面マーカーの発現を指標として前記組織から単離する方法としては、特に制限はなく、公知の手法の中から適宜選択することができ、例えば、細胞表面マーカーに対する抗体を用い、セルソーター、磁気ビーズ等によって、前記細胞表面マーカーの特性を有する細胞を単離する方法などが挙げられる。
　前記造血幹細胞、間葉系幹細胞、血管内皮幹細胞、又はこれらから分化した細胞に特異的な細胞表面マーカーは、これらが由来する動物種によって適宜選択することができる。
　ヒト由来の造血幹細胞は、通常、ＣＤ３４陽性（＋）、ＣＤ９０陽性（＋）、かつＣＤ４５ＲＡ陰性（－）である。また、これらの細胞表面マーカーに加え、ＣＤ３８陰性（－）、ＣＤ４９ｆ陽性（＋）などの細胞表面マーカーを併用してもよい。
　ヒト由来の造血前駆細胞は、通常、ＣＤ３４陽性（＋）、ＣＤ３８陰性（－）、ＣＤ４５ＲＡ陰性（－）、かつＣＤ９０陰性（－）である。
　マウス由来の造血幹細胞は、通常、ＣＤ３４陰性（－）、ＣＤ１５０陽性（＋）、ＣＤ４８陰性（－）、Ｆｌｔ３陰性（－）、Ｌｉｎ陰性（－）、Ｓｃａ１陽性（＋）、かつｃＫｉｔ陽性（＋）（Ｌｉｎ（－）、Ｓｃａ１（＋）、ｃＫｉｔ（＋）は、「ＬＳＫ」ともいう）である。
　マウス由来の造血前駆細胞は、通常、ＣＤ３４陽性（＋）、ＣＤ４８陰性（－）、Ｆｌｔ３陽性（＋）、Ｓｃａ－１陽性（＋）、かつｃＫｉｔ陽性（＋）である。
　ヒト由来の間葉系幹細胞は、通常、Ｓｔｒｏ－１陽性（＋）、ＣＤ１０５陽性（＋）、ＣＤ７３陽性（＋）、ＣＤ９０陽性（＋）、ＣＤ３４陰性（－）、ＣＤ４５陰性（－）、ＣＤ１１ｂ陰性（－）、ＣＤ１４陰性（－）、かつＨＬＡ－ＤＲ陰性（－）である。
　マウス由来の間葉系幹細胞は、通常、Ｓｃａ－１陽性（＋）、ＣＤ１０５陽性（＋）、ＣＤ１０６陽性（＋）、ＣＤ７３陽性（＋）、ＣＤ４４陽性（＋）、ＣＤ２９陽性（＋）、ＣＤ４５陰性（－）、かつＣＤ１１ｂ陰性（－）である。
　マウス由来の血管内皮幹細胞は、通常、ＣＤ１５７陽性（＋）かつＣＤ２００陽性（＋）である。
　前記細胞株としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、ヒト急性骨髄性白血病由来細胞株ＭＯＬＭ－１３（ＪＣＲＢ１８１０）、ヒト脂肪由来間葉系幹細胞株ＨＡｄｐｃ－２８－Ｅ６Ｅ７－ＴＥＲＴ（ＪＣＲＢ１５７２）、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞ＵＥ６Ｅ７Ｔ－３（ＪＣＲＢ１１３６）などが挙げられる。これらは国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所のＪＣＲＢ細胞バンクから入手できる。
　これらの細胞株の継代回数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、安定的かつ効率的に大量の細胞を製造する点から、５回（ｐ５）から４０回（ｐ４０）が好ましく、８回（ｐ８）から３５回（ｐ３５）がより好ましい。
　前記培養工程における前記細胞の細胞数（培養前の細胞数）の下限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、安定的かつ効率的に大量の細胞を製造する点から、２４ウェルプレートを用いる場合は、１ウェルあたり、１×１０４個以上が好ましく、２×１０４個以上がより好ましく、３×１０４個以上が更に好ましく、４×１０４個以上が特に好ましい。また、９６ウェルプレートを用いる場合は、１ウェルあたり、３×１０３個以上が好ましく、４×１０３個以上がより好ましく、５×１０３個以上が更に好ましく、６×１０３個以上が特に好ましい。
　前記培養工程における前記細胞の細胞数（培養前の細胞数）の上限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、安定的かつ効率的に大量の細胞を製造する点から、２４ウェルプレートを用いる場合は、１ウェルあたり、１×１０５個以下が好ましく、９×１０４個以下がより好ましく、８×１０４個以下が更に好ましく、７×１０４個以下がより更に好ましく、６×１０４個以下が特に好ましい。また、９６ウェルプレートを用いる場合は、１ウェルあたり、１．５×１０４個以下が好ましく、１×１０４個以下がより好ましく、９×１０３個以下が更に好ましく、８×１０３個以下が特に好ましい。
　前記培養工程における前記細胞の細胞数（培養前の細胞数）の下限値と上限値とは、適宜組み合わせることができるが、２４ウェルプレートを用いる場合は、１ウェルあたり、１×１０４個以上１×１０５個以下が好ましく、２×１０４個以上９×１０４個以下がより好ましく、３×１０４個以上８×１０４個以下が更に好ましく、４×１０４個以上７×１０４個以下がより更に好ましく、４×１０４個以上６×１０４個以下が特に好ましい。また、９６ウェルプレートを用いる場合は、１ウェルあたり、３×１０３個以上１．５×１０４個以下が好ましく、４×１０３個以上１×１０４個以下がより好ましく、５×１０３個以上９×１０３個以下が更に好ましく、６×１０３個以上８×１０３個が特に好ましい。
＜＜培養＞＞
　前記培養の期間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、安定的かつ効率的に大量の細胞を製造する点から、３日間以上が好ましく、５日間以上がより好ましく、７日間以上が更に好ましい。
　前記培養において、前記ＩＩＩ型コラーゲンを含むコラーゲンゲルと前記細胞とを接触させる方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ＩＩＩ型コラーゲンを含むコラーゲンゲルを用いた三次元培養などが挙げられる。
　前記ＩＩＩ型コラーゲンを含むコラーゲンゲルを用いた三次元培養としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記コラーゲンゲル中で細胞を培養する方法、すなわち、前記コラーゲンゲルに細胞を包埋させて培養する方法（包埋培養法）、前記コラーゲンゲル上で細胞を培養する方法、すなわち、前記コラーゲンゲル上に細胞を添加して培養する方法などが挙げられる。これらの中でも、前記ＩＩＩ型コラーゲンを含むコラーゲンゲルを用いた三次元培養としては、安定的かつ効率的に大量の細胞を製造する点から、前記コラーゲンゲル中で細胞を培養する方法が好ましい。
　前記コラーゲンゲル中で細胞を培養する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、細胞を含むコラーゲン溶液（コラーゲンを含むコラーゲン溶液と細胞を含む細胞懸濁液との混合溶液）を、加温してゲル化（線維化）する方法で製造されたコラーゲンゲルを用いて培養する方法などが挙げられる。これらの中でも、安定的かつ効率的に大量の細胞を製造する点から、細胞を含まないコラーゲンゲル上に、細胞を含むコラーゲンゲルを積層して製造されたコラーゲンゲルを用いて培養する方法が好ましい。細胞を含まないコラーゲンゲル上に、細胞を含むコラーゲンゲルを積層することにより、細胞を含むコラーゲン溶液を積層した直後においても、細胞を、プレート上ではなく、コラーゲン線維上に落下させることができる。
　前記細胞を含むコラーゲン溶液における溶媒としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）、前記培養に使用する培地などが挙げられる。
　前記細胞を含まないコラーゲンゲル上に、細胞を含むコラーゲンゲルを積層する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、細胞を含まないコラーゲン溶液を、中性にして加温してゲル化し、その後、得られたコラーゲンゲル（以下、「ゲルベッド」と称することがある）上に、細胞を含む中性コラーゲン溶液を加え、加温してゲル化する方法などが挙げられる。
　前記コラーゲンゲル（ゲルベッド）の製造方法は、前述の＜＜ＩＩＩ型コラーゲンを含むコラーゲンゲル＞＞の項目に記載のとおりである。
　前記コラーゲンゲル中で細胞を培養する方法においては、前記細胞を含むコラーゲン溶液を加え、加温してゲル化した後に、前記コラーゲンゲル上に静かに培地を添加することができる。
　前記細胞を含むコラーゲン溶液を加えた後の加温の温度の下限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、２０℃以上が好ましく、２５℃以上がより好ましく、３０℃以上が更に好ましく、３５℃以上がより更に好ましい。
　前記細胞を含むコラーゲン溶液を加えた後の加温の温度の上限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、５０℃以下が好ましく、４５℃以下がより好ましく、４０℃以下が更に好ましい。
　前記細胞を含むコラーゲン溶液を加えた後の加温の温度の下限値と上限値とは、適宜組み合わせることができるが、２０℃以上５０℃以下が好ましく、２５℃以上４５℃以下がより好ましく、３０℃以上４０℃以下が更に好ましく、３５℃以上４０℃以下がより更に好ましい。
　前記細胞を含むコラーゲン溶液を加えた後の加温の時間（前記培地を添加するまでの時間）の下限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、３０分間以上が好ましく、４５分間以上がより好ましい。
　前記細胞を含むコラーゲン溶液を加えた後の加温の時間（前記培地を添加するまでの時間）の上限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、２時間以下が好ましく、１．５時間以下がより好ましく、１時間以下が更に好ましい。
　前記細胞を含むコラーゲン溶液を加えた後の加温の時間の下限値と上限値とは、適宜組み合わせることができるが、３０分間以上１．５時間以下が好ましく、４５分間以上１時間以下がより好ましい。
　前記細胞を含まないコラーゲンゲル（ゲルベッド）と前記細胞を含むコラーゲンゲルとの合計量に対する、前記細胞を含まないコラーゲンゲル（ゲルベッド）の量の下限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、安定的かつ効率的に大量の細胞を製造する点から、体積比で、０．１倍以上が好ましく、０．１５倍以上がより好ましく、０．１８倍以上が更に好ましい。
　前記細胞を含まないコラーゲンゲル（ゲルベッド）と前記細胞を含むコラーゲンゲルとの合計量に対する、前記細胞を含まないコラーゲンゲル（ゲルベッド）の量の上限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、安定的かつ効率的に大量の細胞を製造する点から、体積比で、０．３倍以下が好ましく、０．２９倍以下がより好ましく、０．２８倍以下が更に好ましく、０．２７倍以下が特に好ましい。
　前記細胞を含まないコラーゲンゲル（ゲルベッド）と前記細胞を含むコラーゲンゲルとの合計量に対する、前記細胞を含まないコラーゲンゲル（ゲルベッド）の量の下限値と上限値とは、適宜組み合わせることができるが、体積比で、０．１倍以上０．３倍以下が好ましく、０．１５倍以上０．２９倍以下がより好ましく、０．１８倍以上０．２８倍以下が更に好ましく、０．１８倍以上０．２７倍以下が特に好ましい。
　前記コラーゲンゲル上で細胞を培養する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、細胞を含まない中性コラーゲン溶液を、加温してゲル化（線維化）する方法で製造されたコラーゲンゲルを用いて培養する方法などが挙げられる。
　細胞を含まない中性コラーゲン溶液を、加温してゲル化（線維化）する方法で製造されたコラーゲンゲルを用いて培養する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記コラーゲンゲルに、細胞懸濁液を加えて培養する方法などが挙げられる。
　前記コラーゲンゲルの製造方法は、前述の＜＜ＩＩＩ型コラーゲンを含むコラーゲンゲル＞＞の項目に記載のとおりである。
　前記培養の培養条件（温度、二酸化炭素（ＣＯ２）濃度、酸素濃度など）としては、特に制限はなく、公知の条件の中から適宜選択することができる。
　前記培養の温度としては、通常、３０℃～４０℃であり、約３７℃が好ましい。
　前記培養する際のＣＯ２濃度としては、通常、１体積％～１０体積％であり、２体積％～５体積％が好ましい。
　前記培養条件は、市販のインキュベーター等の細胞培養装置によって調節することができる。
　前記培養に用いられる培地（培養液）としては、特に制限はなく、公知の培地の中から適宜選択することができる。
　前記細胞が、幹細胞である場合は、その未分化性を維持する目的で、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、Ｆｌｔ－３リガンド（ＦＬ）、インターロイキン（ＩＬ）－３、ＩＬ－６、ＩＬ－１１等のサイトカインや、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等の血清アルブミンなどを含む培地で培養することができる。
　前記培養工程における細胞の培養期間が長期間に渡る場合、培地を適宜新しいものと交換又は循環させてもよく、後述の継代培養工程を経てもよい。
　前記培養工程で培養された細胞が、特定の細胞であることの確認は、前記細胞に特異的な細胞表面マーカーの発現を確認することにより行うことができる。
　前記細胞表面マーカーの発現を確認する方法としては、前述のセルソーター、磁気ビーズ等による方法の他、免疫染色法、酵素活性測定法、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法などを使用することもできる。
＜その他の工程＞
　前記その他の工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、回収工程、継代培養工程などが挙げられる。
＜＜回収工程＞＞
　前記回収工程は、前記培養工程後に、前記細胞を回収する工程である。
　前記回収方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、安定的かつ効率的に大量の細胞を製造する点から、前記コラーゲンゲルを、酵素で処理する方法が好ましい。
　前記酵素としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、安定的かつ効率的に大量の細胞を製造する点から、コラゲナーゼ及びサーモリシンからなる群より選択される少なくともいずれかが好ましく、コラゲナーゼ及びサーモリシンを併用することがより好ましい。
　前記コラゲナーゼ及び前記サーモリシンを併用する場合、前記コラゲナーゼの添加量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、安定的かつ効率的に大量の細胞を製造する点から、前記サーモリシンの添加量に対して、質量比で、３倍以上が好ましく、４倍以上がより好ましく、５倍以上が更に好ましく、６倍以上がより更に好ましく、７倍以上が特に好ましく、８倍以上が最も好ましい。
　前記コラゲナーゼの終濃度の下限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、安定的かつ効率的に大量の細胞を製造する点から、前記培養工程後の培養液に対して、０．１ｍｇ／ｍＬ以上が好ましく、０．２５ｍｇ／ｍＬ以上がより好ましく、０．５ｍｇ／ｍＬ以上が更に好ましく、０．７５ｍｇ／ｍＬ以上が特に好ましい。
　前記コラゲナーゼの終濃度の上限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、安定的かつ効率的に大量の細胞を製造する点から、前記培養工程後の培養液に対して、３ｍｇ／ｍＬ以下が好ましく、２ｍｇ／ｍＬ以下がより好ましく、１．５ｍｇ／ｍＬ以下が更に好ましく、１．２５ｍｇ／ｍＬ以下が特に好ましい。
　前記コラゲナーゼの終濃度の下限値と上限値との組み合わせは、適宜選択することができるが、０．１ｍｇ／ｍＬ以上３ｍｇ／ｍＬ以下が好ましく、０．２５ｍｇ／ｍＬ以上２ｍｇ／ｍＬ以下がより好ましく、０．５ｍｇ／ｍＬ以上１．５ｍｇ／ｍＬ以下が更に好ましく、０．７５ｍｇ／ｍＬ以上１．２５ｍｇ／ｍＬ以下が特に好ましい。
　前記サーモリシンの終濃度の下限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、安定的かつ効率的に大量の細胞を製造する点から、前記培養工程後の培養液に対して、０．０１ｍｇ／ｍＬ以上が好ましく、０．０３ｍｇ／ｍＬ以上がより好ましく、０．０５ｍｇ／ｍＬ以上が更に好ましい。
　前記サーモリシンの終濃度の上限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、安定的かつ効率的に大量の細胞を製造する点から、前記培養工程後の培養液に対して、０．５ｍｇ／ｍＬ以下が好ましく、０．２５ｍｇ／ｍＬ以下がより好ましく、０．２ｍｇ／ｍＬ以下が更に好ましく、０．１５ｍｇ／ｍＬ以下がより更に好ましく、０．１ｍｇ／ｍＬ以下が特に好ましい。
　前記サーモリシンの終濃度の下限値と上限値との組み合わせは、適宜選択することができるが、０．０１ｍｇ／ｍＬ以上０．５ｍｇ／ｍＬ以下が好ましく、０．０３ｍｇ／ｍＬ以上０．２５ｍｇ／ｍＬ以下がより好ましく、０．０３ｍｇ／ｍＬ以上０．２ｍｇ／ｍＬ以下が更に好ましく、０．０５ｍｇ／ｍＬ以上０．１５ｍｇ／ｍＬ以下がより更に好ましく、０．０５ｍｇ／ｍＬ以上０．１ｍｇ／ｍＬ以下が特に好ましい。
＜＜継代培養工程＞＞
　前記継代培養工程は、前記培養工程で培養した細胞を、更に継代培養する工程である。
　前記継代培養を行う方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記回収工程、及び前記培養工程、必要に応じて更に前記回収工程を繰り返すことにより行われることが好ましい。前記継代培養工程は、１回のみ行ってもよく、複数回行ってもよい。
＜用途＞
　前記細胞の培養方法は、簡易に、安定的かつ効率的に大量の細胞を製造することができるため、細胞移植治療、又は生物学的製剤の製造等に用いる細胞の培養方法として好適に用いることができる。
（治療用組成物の製造方法）
　 本発明の治療用組成物の製造方法は、培養工程を含み、更にその他の工程を含むことができる。
　前記培養工程、及び前記その他の工程は、前述の（細胞の培養方法）の＜培養工程＞及び＜その他の工程＞の項目に記載のとおりである。
　前記治療用組成物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、後述する本発明の治療用組成物が好ましい。
（治療用組成物）
　本発明の治療用組成物は、ＩＩＩ型コラーゲンを含むコラーゲンゲルと、細胞と、を含み、前記細胞は、前記コラーゲンゲルと接触している。前記治療用組成物は、更に必要に応じて、その他の成分を含んでいてもよい。
＜ＩＩＩ型コラーゲンを含むコラーゲンゲル及び細胞＞
　前記ＩＩＩ型コラーゲンを含むコラーゲンゲル、及び前記細胞は、前述の（細胞の培養方法）の＜培養工程＞の項目に記載のとおりである。
＜その他の成分＞
　前記その他の成分としては、本発明の効果を損なわず、特に制限はなく、医薬品業界において使用可能な製剤添加物の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤化剤、崩壊剤、界面活性化剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤などが挙げられる。
＜用途＞
　前記治療用組成物の用途としては、特に制限はなく、前記細胞の種類に応じて適宜選択することができ、例えば、前記細胞の細胞移植による治療が有効な疾患に対する治療用組成物などが挙げられる。具体例としては、再生不良性貧血に対する治療用組成物、骨髄異形成症候群に対する治療用組成物などが挙げられる。したがって、本発明の治療用組成物は、再生不良性貧血治療用組成物、骨髄異形成症候群治療用組成物などとしても好適に利用でき、これらの組成物も本発明の範囲内である。
　以下に実施例、比較例、及び試験例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例及び試験例に何ら限定されるものではない。
（実施例１：ＩＩＩ型コラーゲンゲル中での培養（包埋培養））
　３ｍｇ／ｍＬのウシＩＩＩ型コラーゲン溶液（株式会社ニッピ，　ＰＳＣ－３－１００－２０）を、１０×Ｄ－ＰＢＳ（－）（富士フイルム和光純薬，　０４８－２９８０５）を滅菌水で希釈して調製した３×ＰＢＳ（－）（３倍濃度のＤ－ＰＢＳ（－））で氷冷混合することにより中和して２ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ７．３に調製した。２４ウェルプレート（深江化成，　１９７－２４ＣＰＳ）内のウェルに中和したコラーゲン溶液０．２ｍＬを加え、恒温槽（ＰＨＣ株式会社，　ＭＣＯ－１７０ＡＩＣＵＶＤ－ＰＪ）内で一晩インキュベート（３７℃、５％ＣＯ２）してゲル化させコラーゲンゲルベッドを作製した。
　翌日、新たに前記３×ＰＢＳ（－）で中和したコラーゲン溶液（２ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ７．３）０．８ｍＬで５×１０４個の細胞（ヒト急性骨髄性白血病由来細胞株ＭＯＬＭ－１３（ＪＣＲＢ１８１０）、国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所のＪＣＲＢ細胞バンクから入手）を懸濁し、その混合液０．８ｍＬを前記コラーゲンゲルベッド上に加えて、恒温槽（ＰＨＣ株式会社，　ＭＣＯ－１７０ＡＩＣＵＶＤ－ＰＪ）内で２時間インキュベート（３７℃、５％ＣＯ２）してゲル化させた。コラーゲンのゲル化を目視で確認後（白濁、液面の揺れ具合）、ゲルを壊さないように培地（１０体積％ウシ胎児血清（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，　１０２７０－１０６）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，　１１８７５－０８５））１ｍＬを添加して、恒温槽（ＰＨＣ株式会社，　ＭＣＯ－１７０ＡＩＣＵＶＤ－ＰＪ）内で包埋培養（３７℃、５％ＣＯ２）した。
　培養開始から３日目、６日目、７日目、１０日目、及び１４日目に細胞を、下記のとおりに回収して自動セルカウンターＣｏｕｎｔｅｓｓ　ＩＩ　ＦＬ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，　ＡＭＱＡＦ１０００）で生細胞を計測した。別途、培養開始前（０日目）の細胞も同様にして、生細胞を計測した。なお、培養３日目、６日目、７日目、及び１０日目に各ウェルから上清０．５ｍＬを除去し、新たに培地０．５ｍＬを加えて培地交換を実施した。０日目、３日目、６日目、７日目、１０日目、及び１４日目の結果を図１（右のバー：Ｔｙｐｅ　ＩＩＩ　ｃｏｌｌａｇｅｎ　ｇｅｌ）に示し、０日目、３日目、６日目、及び７日目の結果を図２（右のバー：Ｔｙｐｅ　ＩＩＩ　ｃｏｌｌａｇｅｎ　ｇｅｌ）に示した。
＜コラーゲンゲル中での培養（包埋培養）からの細胞の回収と計数＞
　コラーゲンゲル包埋培養完了後に上清を除去し、終濃度１ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼ（株式会社ニッピ，　８９２　４３１）と終濃度０．０６ｍｇ／ｍＬサーモリシン（株式会社ニッピ，　８９２　４４１）を添加し、３０分間インキュベート（３７℃、５％ＣＯ２）して、ゲルを溶解させた。その後、ピペッティングして１．５ｍＬチューブに細胞含有液を移して、遠心機（エッペンドルフ株式会社，　５７０２Ｒ）で遠心分離（５００×ｇ，　５分間，　４℃）して細胞を回収し、０．１ｍＬの培地に再懸濁後、０．４体積％トリパンブルー試薬（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，　１５２５０－０６１）で細胞を染色して自動セルカウンターＣｏｕｎｔｅｓｓ　ＩＩ　ＦＬ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，　ＡＭＱＡＦ１０００）で生細胞を計測した。
（比較例１：２次元培養）
　５×１０４個の細胞（ヒト急性骨髄性白血病由来細胞株ＭＯＬＭ－１３（ＪＣＲＢ１８１０）、国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所のＪＣＲＢ細胞バンクから入手）を、１０×Ｄ－ＰＢＳ（－）（富士フイルム和光純薬，　０４８－２９８０５）を滅菌水で希釈して調製した１ｍＬの１×ＰＢＳ（－）（Ｄ－ＰＢＳ（－））に懸濁し、２４ウェルプレート（深江化成，　１９７－２４ＣＰＳ）内のウェルに１ｍＬ／ウェル加えて、恒温槽（ＰＨＣ株式会社，　ＭＣＯ－１７０ＡＩＣＵＶＤ－ＰＪ）内で２時間インキュベート（３７℃、５％ＣＯ２）した。その後、培地（１０体積％ウシ胎児血清（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，　１０２７０－１０６）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，　１１８７５－０８５））１ｍＬを添加して、恒温槽（ＰＨＣ株式会社，　ＭＣＯ－１７０ＡＩＣＵＶＤ－ＰＪ）内で培養（３７℃、５％ＣＯ２）した。
　培養開始から３日目、６日目、７日目、１０日目、及び１４日目に細胞を、実施例１と同様に回収して自動セルカウンターＣｏｕｎｔｅｓｓ　ＩＩ　ＦＬ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，　ＡＭＱＡＦ１０００）で生細胞を計数した。なお、培養３日目、６日目、７日目、及び１０日目に各ウェルから上清０．５ｍＬを除去し、新たに培地０．５ｍＬを加えて培地交換を実施した。結果を図１（左のバー：２Ｄ）に示した。
　図１の結果より、ＩＩＩ型コラーゲンを含むコラーゲンゲルと細胞を接触させて、前記細胞を培養することにより、簡易に、安定的かつ効率的に大量の細胞を製造することができることが分かった。ＩＩＩ型コラーゲンを含むコラーゲンゲルと細胞を接触させて培養する場合は、２次元培養の場合と比較して、効率的に大量の細胞を製造することができることが分かった。また、２次元培養の場合は、培養１０日目辺りで細胞増殖が頭打ち（細胞数のピーク）となることが分かった。
（実施例２：Ｉ型＋ＩＩＩ型コラーゲンゲル中での培養（包埋培養））
　ウシＩＩＩ型コラーゲンに代えて、Ｉ型コラーゲン及びＩＩＩ型コラーゲンを含むブタ真皮由来コラーゲン（株式会社ニッピ，　ＰＳＣ－Ｓ－２００－１００ＰＷ）を使用した以外は、実施例１と同様に培養を行った。
　培養開始から３日目、６日目、及び７日目に細胞を、実施例１と同様に回収して自動セルカウンターＣｏｕｎｔｅｓｓ　ＩＩ　ＦＬ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，　ＡＭＱＡＦ１０００）で生細胞を計数した。なお、培養３日目、及び６日目に各ウェルから上清０．５ｍＬを除去し、新たに培地０．５ｍＬを加えて培地交換を実施した。結果を図２（中央のバー：Ｔｙｐｅ　Ｉ＋ＩＩＩ　ｃｏｌｌａｇｅｎ　ｇｅｌ）に示した。
（比較例２：Ｉ型コラーゲンゲル中での培養（包埋培養））
　ウシＩＩＩ型コラーゲンに代えて、ウシＩ型コラーゲン（株式会社ニッピ，　ＡＳＣ－１－１００－２０）を使用した以外は、実施例１と同様に培養を行った。
　培養開始から３日目、６日目、及び７日目に細胞を、実施例１と同様に回収して自動セルカウンターＣｏｕｎｔｅｓｓ　ＩＩ　ＦＬ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，　ＡＭＱＡＦ１０００）で生細胞を計数した。なお、培養３日目、及び６日目に各ウェルから上清０．５ｍＬを除去し、新たに培地０．５ｍＬを加えて培地交換を実施した。結果を図２（左のバー：Ｔｙｐｅ　Ｉ　ｃｏｌｌａｇｅｎ　ｇｅｌ）に示した。
　図２の結果より、Ｉ型コラーゲンのみを含むコラーゲンゲルと比較して、ＩＩＩ型コラーゲンを含むコラーゲンゲルと細胞を接触させて、前記細胞を培養することにより、効率的に大量の細胞を製造することができることが分かった。
（実施例３－１：ＩＩＩ型コラーゲンゲル中での培養（包埋培養）　濃度検討１）
　３ｍｇ／ｍＬのウシＩＩＩ型コラーゲン溶液（株式会社ニッピ，　ＰＳＣ－３－１００－２０）を５ｍＭ酢酸で希釈した後、１０×Ｄ－ＰＢＳ（－）（富士フイルム和光純薬，　０４８－２９８０５）を滅菌水で希釈して調製した３×ＰＢＳ（－）（３倍濃度のＤ－ＰＢＳ（－））で氷冷混合することにより中和してｐＨ７．３とし、終濃度が０．２５ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、又は２ｍｇ／ｍＬとなるようにそれぞれ調製した。９６ウェルプレート（深江化成，　１９７－９６ＣＩＰＳ）内のウェルに中和したコラーゲン溶液０．０４ｍＬを加え、恒温槽（ＰＨＣ株式会社，　ＭＣＯ－１７０ＡＩＣＵＶＤ－ＰＪ）内で一晩インキュベート（３７℃、５％ＣＯ２）してゲル化させコラーゲンゲルベッドを作製した。
　翌日、新たに前記３×ＰＢＳ（－）で調製した各濃度のコラーゲン溶液で７×１０３個の細胞（ヒト急性骨髄性白血病由来細胞株ＭＯＬＭ－１３（ＪＣＲＢ１８１０）、国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所のＪＣＲＢ細胞バンクから入手）を懸濁し、その混合液０．１１ｍＬ／ウェルを前記コラーゲンゲルベッド上に加えて、恒温槽（ＰＨＣ株式会社，　ＭＣＯ－１７０ＡＩＣＵＶＤ－ＰＪ）内で２時間インキュベート（３７℃、５％ＣＯ２）してゲル化させた。コラーゲンのゲル化を目視で確認後（白濁、液面の揺れ具合）、ゲルを壊さないように培地（３体積％ウシ胎児血清（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，　１０２７０－１０６）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，　１１８７５－０８５））０．１５ｍＬを添加して、恒温槽（ＰＨＣ株式会社，　ＭＣＯ－１７０ＡＩＣＵＶＤ－ＰＪ）内で培養（３７℃、５％ＣＯ２）した。
　培養開始から７日目に細胞を、実施例１と同様に回収して自動セルカウンターＣｏｕｎｔｅｓｓ　ＩＩ　ＦＬ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，　ＡＭＱＡＦ１０００）で生細胞を計数した。なお、培養３日目、及び６日目に各ウェルから上清０．１ｍＬを除去し、新たに培地０．１ｍＬを加えて培地交換を実施した。結果を図３Ａに示した。
　図３Ａの結果より、ＩＩＩ型コラーゲン溶液中に、終濃度２ｍｇ／ｍＬのＩＩＩ型コラーゲンを含むコラーゲンゲルと細胞を接触させて、前記細胞を培養した場合と比較して、ＩＩＩ型コラーゲン溶液中に、終濃度１ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ、又は０．２５ｍｇ／ｍＬのＩＩＩ型コラーゲンを含むコラーゲンゲルと細胞を接触させて、前記細胞を培養することにより、効率的に大量の細胞を製造することができることが分かった。ＩＩＩ型コラーゲン溶液中に、終濃度０．５ｍｇ／ｍＬのＩＩＩ型コラーゲンを含むコラーゲンゲルと細胞を接触させて、前記細胞を培養した場合は、ＩＩＩ型コラーゲン溶液中に、終濃度２ｍｇ／ｍＬのＩＩＩ型コラーゲンを含むコラーゲンゲルと細胞を接触させて、前記細胞を培養した場合と比較して、３．７倍の細胞数の細胞を得ることができた。
（実施例３－２：ＩＩＩ型コラーゲンゲル中での培養（包埋培養）　濃度検討２）
　ＩＩＩ型コラーゲン溶液（ｐＨ７．３）の終濃度を０．５ｍｇ／ｍＬ、又は２ｍｇ／ｍＬとし、３体積％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地を、１０体積％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地とし、解析ウェル数（ｎ）を４とした以外は、実施例３－１と同様に培養及び細胞数の計数を行った。結果を図３Ｂ（Ｔｙｐｅ　ＩＩＩ　ｃｏｌｌａｇｅｎ　ｇｅｌ）に示した。
（比較例３：２次元培養）
　７×１０３個の細胞（ヒト急性骨髄性白血病由来細胞株ＭＯＬＭ－１３（ＪＣＲＢ１８１０）、国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所のＪＣＲＢ細胞バンクから入手）を、１０×Ｄ－ＰＢＳ（－）（富士フイルム和光純薬，　０４８－２９８０５）を滅菌水で希釈して調製した０．１５ｍＬの１×ＰＢＳ（－）（Ｄ－ＰＢＳ（－））に懸濁し、０．１５ｍＬ／ウェルで９６ウェルプレート（深江化成，　１９７－９６ＣＩＰＳ）内のウェルに加えて、恒温槽（ＰＨＣ株式会社，　ＭＣＯ－１７０ＡＩＣＵＶＤ－ＰＪ）内で２時間インキュベート（３７℃、５％ＣＯ２）した。その後、培地（１０体積％ウシ胎児血清（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，　１０２７０－１０６）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，　１１８７５－０８５））０．１５ｍＬを添加して、恒温槽（ＰＨＣ株式会社，　ＭＣＯ－１７０ＡＩＣＵＶＤ－ＰＪ）内で培養（３７℃、５％ＣＯ２）した。
　培養開始から７日目に細胞を、実施例１と同様に回収して自動セルカウンターＣｏｕｎｔｅｓｓ　ＩＩ　ＦＬ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，　ＡＭＱＡＦ１０００）で生細胞を計数した。なお、培養３日目、及び６日目に各ウェルから上清０．１ｍＬを除去し、新たに培地０．１ｍＬを加えて培地交換を実施した。解析ウェル数（ｎ）を４とした。結果を図３Ｂ（２Ｄ）に示した。
　図３Ｂの結果より、ＩＩＩ型コラーゲン溶液の終濃度を０．５ｍｇ／ｍＬ、又は２ｍｇ／ｍＬとした場合は、いずれの場合も２次元培養した場合と比較して、０．１％水準で有意性が認められ、有意に増殖性が向上することが分かった。
（実施例４：ＩＩＩ型コラーゲンゲル上での培養）
　３ｍｇ／ｍＬのウシＩＩＩ型コラーゲン溶液（株式会社ニッピ，　ＰＳＣ－３－１００－２０）を５ｍＭ　酢酸で希釈した後、１０×Ｄ－ＰＢＳ（－）（富士フイルム和光純薬，　０４８－２９８０５）を滅菌水で希釈して調製した３×ＰＢＳ（－）（３倍濃度のＤ－ＰＢＳ（－））で氷冷混合することにより中和してｐＨ７．３とし、終濃度が０．２５ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬとなるようにそれぞれ調製した。９６ウェルプレート（深江化成株式会社，　１９７－９６ＣＩＰＳ）内のウェルに中和したコラーゲン溶液０．０４ｍＬを加え、恒温槽（ＰＨＣ株式会社，　ＭＣＯ－１７０ＡＩＣＵＶＤ－ＰＪ）内で２時間インキュベート（３７℃、５％ＣＯ２）してゲルを作製した。
　前記ゲルの上から、７×１０３個の細胞（ヒト急性骨髄性白血病由来細胞株ＭＯＬＭ－１３（ＪＣＲＢ１８１０）、国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所のＪＣＲＢ細胞バンクから入手）を含む０．２６ｍＬの細胞懸濁液を加えて恒温槽（ＰＨＣ株式会社，　ＭＣＯ－１７０ＡＩＣＵＶＤ－ＰＪ）内で培養（３７℃、５％ＣＯ２）した。
　培養開始から３日目、及び７日目に細胞を、下記のとおり回収して自動セルカウンターＣｏｕｎｔｅｓｓ　ＩＩ　ＦＬ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，　ＡＭＱＡＦ１０００）で生細胞を計数した。なお、培養４日目に各ウェルから上清０．１ｍＬを除去し、新たに培地０．１ｍＬを加えて培地交換を実施した。結果を図４（Ｔｙｐｅ　ＩＩＩ　ｃｏｌｌａｇｅｎ　ｇｅｌ）に示した。
＜コラーゲンゲル上での培養からの細胞の回収と計数＞
　コラーゲンゲル上での培養完了後に上清を除去し、終濃度１ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼ（株式会社ニッピ，　８９２　４３１）を添加し、３０分間インキュベート（３７℃、５％ＣＯ２）して、ゲルを溶解させた。その後、ピペッティングして１．５ｍＬチューブに細胞含有液を移して、遠心機（エッペンドルフ株式会社，　５７０２Ｒ）で遠心分離（５００×ｇ，　５分間，　４℃）して細胞を回収し、０．１ｍＬの培地に再懸濁後、０．４体積％トリパンブルー試薬（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，　１５２５０－０６１）で細胞を染色して自動セルカウンターＣｏｕｎｔｅｓｓ　ＩＩ　ＦＬ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，　ＡＭＱＡＦ１０００）で生細胞を計測した。
（比較例４：２次元培養）
　７×１０３個の細胞（ヒト急性骨髄性白血病由来細胞株ＭＯＬＭ－１３（ＪＣＲＢ１８１０）、国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所のＪＣＲＢ細胞バンクから入手）を含む０．３ｍＬの細胞懸濁液を、９６ウェルプレート（深江化成株式会社，　１９７－９６ＣＩＰＳ）内のウェルに全量加えて恒温槽（ＰＨＣ株式会社，　ＭＣＯ－１７０ＡＩＣＵＶＤ－ＰＪ）内で培養（３７℃、５％ＣＯ２）した。
　培養開始から３日目、及び７日目に細胞を、実施例４と同様に回収して自動セルカウンターＣｏｕｎｔｅｓｓ　ＩＩ　ＦＬ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，　ＡＭＱＡＦ１０００）で生細胞を計数した。なお、培養４日目に各ウェルから上清０．１ｍＬを除去し、新たに培地０．１ｍＬを加えて培地交換を実施した。結果を図４（２Ｄ）に示した。
　図４の結果より、ＩＩＩ型コラーゲンを含むコラーゲンゲルと細胞を接触させて、前記細胞を培養することにより、簡易に、安定的かつ効率的に大量の細胞を製造することができることが分かった。
（比較例５：コラーゲン分子コート上での培養）
　３ｍｇ／ｍＬのウシＩＩＩ型コラーゲン溶液（株式会社ニッピ，　ＰＳＣ－３－１００－２０）、３ｍｇ／ｍＬのブタ真皮由来Ｉ＋ＩＩＩ型コラーゲン溶液（株式会社ニッピ，　ＰＳＣ－Ｓ－２００－１００ＰＷ）、又は３ｍｇ／ｍＬのウシＩ型コラーゲン溶液（株式会社ニッピ，　ＡＳＣ－１－１００－２０）を５ｍＭ　酢酸で１０μｇ／ｍＬ又は１００μｇ／ｍＬの濃度に希釈して、２４ウェルプレート（深江化成，　１９７－２４ＣＰＳ）内のウェルに０．５ｍＬずつ加え、４℃冷蔵庫で一晩コーティングした。コーティング完了後、１０×Ｄ－ＰＢＳ（－）（富士フイルム和光純薬，　０４８－２９８０５）を滅菌水で希釈して調製した１×ＰＢＳ（－）（Ｄ－ＰＢＳ（－））で３回洗浄しコラーゲン分子コートプレートを製造した。
　未処理２４ウェルプレート、又は前記コラーゲン分子コートプレート１ウェルあたり５×１０４個の細胞（ヒト急性骨髄性白血病由来細胞株ＭＯＬＭ－１３（ＪＣＲＢ１８１０）、国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所のＪＣＲＢ細胞バンクから入手）を播種し、培養３日目、及び５日目の細胞を回収して０．４体積％トリパンブルー試薬（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，　１５２５０－０６１）で染色後に自動セルカウンターＣｏｕｎｔｅｓｓ　ＩＩ　ＦＬ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，　ＡＭＱＡＦ１０００）で生細胞を計測した。結果を図５に示した。
　図５の結果より、（線維化した）コラーゲンゲルではなく、コラーゲン分子をコートした場合は、コラーゲンの型やコーティング濃度に依らず、未処理２４ウェルプレート（ＮＴ）と比較して、増殖促進効果はみられないことが分かった。
（実施例５：ＩＩＩ型コラーゲンゲル中での培養（包埋培養））
　３ｍｇ／ｍＬのウシＩＩＩ型コラーゲン溶液（株式会社ニッピ，　ＰＳＣ－３－１００－２０）を５ｍＭ酢酸で希釈した後、１０×Ｄ－ＰＢＳ（－）（富士フイルム和光純薬，　０４８－２９８０５）を滅菌水で希釈して調製した３×ＰＢＳ（－）（３倍濃度のＤ－ＰＢＳ（－））で氷冷混合することにより中和してｐＨ７．３とし、終濃度が０．５ｍｇ／ｍＬ、又は２ｍｇ／ｍＬとなるようにそれぞれ調製した。９６ウェルプレート（深江化成，　１９７－９６ＣＩＰＳ）内のウェルに中和したコラーゲン溶液０．０４ｍＬを加え、恒温槽（ＰＨＣ株式会社，　ＭＣＯ－１７０ＡＩＣＵＶＤ－ＰＪ）内で一晩インキュベート（３７℃、５％ＣＯ２）してゲル化させコラーゲンゲルベッドを作製した。
　翌日、新たに前記３×ＰＢＳ（－）で調製した各濃度のコラーゲン溶液で７×１０３個の細胞（ヒト脂肪由来間葉系幹細胞株ＨＡｄｐｃ－２８－Ｅ６Ｅ７－ＴＥＲＴ（ＪＣＲＢ１５７２）、又はヒト骨髄由来間葉系幹細胞ＵＥ６Ｅ７Ｔ－３（ＪＣＲＢ１１３６）、国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所のＪＣＲＢ細胞バンクから入手）を懸濁し、その混合液０．１１ｍＬを前記コラーゲンゲルベッド上に加えて、恒温槽（ＰＨＣ株式会社，　ＭＣＯ－１７０ＡＩＣＵＶＤ－ＰＪ）内で２時間インキュベート（３７℃、５％ＣＯ２）してゲル化させた。コラーゲンのゲル化を目視で確認後（白濁、液面の揺れ具合）、ゲルを壊さないように培地（Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ培地（タカラバイオ株式会社，　Ｙ５０２０１））０．１５ｍＬを添加して、恒温槽（ＰＨＣ株式会社，　ＭＣＯ－１７０ＡＩＣＵＶＤ－ＰＪ）内で培養（３７℃、５％ＣＯ２）した。
　培養開始から３日目、又は７日目に細胞を、実施例１と同様に回収して自動セルカウンターＣｏｕｎｔｅｓｓ　ＩＩ　ＦＬ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，　ＡＭＱＡＦ１０００）で生細胞を計数した。なお、培養４日目に各ウェルから上清０．１ｍＬを除去し、新たに培地０．１ｍＬを加えて培地交換を実施した。結果を図６Ａ（ヒト脂肪由来間葉系幹細胞株ＨＡｄｐｃ－２８－Ｅ６Ｅ７－ＴＥＲＴ：Ｔｙｐｅ　ＩＩＩ　ｃｏｌｌａｇｅｎ）及び図６Ｂ（ヒト骨髄由来間葉系幹細胞ＵＥ６Ｅ７Ｔ－３：Ｔｙｐｅ　ＩＩＩ　ｃｏｌｌａｇｅｎ）に示した。
（比較例６：２次元培養）
　７×１０３個の細胞（ヒト脂肪由来間葉系幹細胞株ＨＡｄｐｃ－２８－Ｅ６Ｅ７－ＴＥＲＴ（ＪＣＲＢ１５７２）、又はヒト骨髄由来間葉系幹細胞ＵＥ６Ｅ７Ｔ－３（ＪＣＲＢ１１３６）、国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所のＪＣＲＢ細胞バンクから入手）を、１０×Ｄ－ＰＢＳ（－）（富士フイルム和光純薬，　０４８－２９８０５）を滅菌水で希釈して調製した０．１５ｍＬの１×ＰＢＳ（－）（Ｄ－ＰＢＳ（－））に懸濁し、９６ウェルプレート（深江化成，　１９７－９６ＣＩＰＳ）内のウェルに全量加えて、恒温槽（ＰＨＣ株式会社，　ＭＣＯ－１７０ＡＩＣＵＶＤ－ＰＪ）内で２時間インキュベート（３７℃、５％ＣＯ２）した。その後、培地（Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ培地（タカラバイオ株式会社，　Ｙ５０２０１））０．１５ｍＬを添加して、恒温槽（ＰＨＣ株式会社，　ＭＣＯ－１７０ＡＩＣＵＶＤ－ＰＪ）内で培養（３７℃、５％ＣＯ２）した。
　培養開始から３日目、又は７日目に細胞を、実施例１と同様に回収して自動セルカウンターＣｏｕｎｔｅｓｓ　ＩＩ　ＦＬ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，　ＡＭＱＡＦ１０００）で生細胞を計数した。なお、培養４日目に各ウェルから上清０．１ｍＬを除去し、新たに培地０．１ｍＬを加えて培地交換を実施した。結果を図６Ａ（ヒト脂肪由来間葉系幹細胞株ＨＡｄｐｃ－２８－Ｅ６Ｅ７－ＴＥＲＴ：２Ｄ）及び図６Ｂ（ヒト骨髄由来間葉系幹細胞ＵＥ６Ｅ７Ｔ－３：２Ｄ）に示した。
　図６Ａ及び図６Ｂの結果より、ＩＩＩ型コラーゲンを含むコラーゲンゲルと細胞を接触させて、前記細胞を培養することにより、簡易に、安定的かつ効率的に大量の細胞を製造することができることが分かった。ＩＩＩ型コラーゲンを含むコラーゲンゲルと細胞を接触させて培養する場合は、２次元培養の場合と比較して、効率的に大量の細胞を製造することができることが分かった。また、２ｍｇ／ｍＬと比較して、０．５ｍｇ／ｍＬのＩＩＩ型コラーゲンを含むコラーゲンゲルと細胞を接触させて、前記細胞を培養することにより、効率的に大量の細胞を製造することができることが分かった。
（比較例７：コラーゲン分子コート上培養）
　３ｍｇ／ｍＬのウシＩＩＩ型コラーゲン溶液（株式会社ニッピ，　ＰＳＣ－３－１００－２０）、３ｍｇ／ｍＬのブタ真皮由来Ｉ＋ＩＩＩ型コラーゲン溶液（株式会社ニッピ，　ＰＳＣ－Ｓ－２００－１００ＰＷ）、又は３ｍｇ／ｍＬのウシＩ型コラーゲン溶液（株式会社ニッピ，　ＡＳＣ－１－１００－２０）を５ｍＭ　酢酸で１０μｇ／ｍＬ又は１００μｇ／ｍＬの濃度に希釈して、２４ウェルプレート（深江化成，　１９７－２４ＣＰＳ）内のウェルに０．５ｍＬずつ加え、４℃冷蔵庫で一晩コーティングした。コーティング完了後、１０×Ｄ－ＰＢＳ（－）（富士フイルム和光純薬，　０４８－２９８０５）を滅菌水で希釈して調製した１×ＰＢＳ（－）（Ｄ－ＰＢＳ（－））で３回洗浄しコラーゲン分子コートプレートを製造した。
　未処理２４ウェルプレート、又は前記コラーゲン分子コートプレート１ウェルあたり５×１０４個の細胞（ヒト脂肪由来間葉系幹細胞株ＨＡｄｐｃ－２８－Ｅ６Ｅ７－ＴＥＲＴ（ＪＣＲＢ１５７２）、国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所のＪＣＲＢ細胞バンクから入手）を播種し、培養２日目、及び５日目の細胞を回収して０．４体積％トリパンブルー試薬（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，　１５２５０－０６１）で染色後に自動セルカウンターＣｏｕｎｔｅｓｓ　ＩＩ　ＦＬ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，　ＡＭＱＡＦ１０００）で生細胞を計測した。結果を図７に示した。
　図７の結果より、（線維化した）コラーゲンゲルではなく、コラーゲン分子をコートした場合は、コラーゲンの型やコーティング濃度に依らず、未処理２４ウェルプレート（ＮＴ）と比較して、増殖促進効果はみられないことが分かった。
（試験例１：酵素の検討）
　９６ウェルプレート（深江化成，　１９７－９６ＣＩＰＳ）内のウェルに２×１０４個の細胞（ヒト急性骨髄性白血病由来細胞株ＭＯＬＭ－１３（ＪＣＲＢ１８１０）を播種し、０ｍｇ／ｍＬ、０．０６ｍｇ／ｍＬ、０．１２ｍｇ／ｍＬ、０．２４ｍｇ／ｍＬ、若しくは０．４７ｍｇ／ｍＬのサーモリシン（株式会社ニッピ，　８９２　４４１）又は０、０．２５ｍｇ／ｍＬ、０．５０ｍｇ／ｍＬ、１．００ｍｇ／ｍＬ、若しくは２．００ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼ（株式会社ニッピ，　８９２　４３１）を各濃度となるように添加し、３０分間インキュベート（３７℃，５％ＣＯ２）した。その後、細胞を回収し０．４体積％トリパンブルー試薬で染色して自動セルカウンターＣｏｕｎｔｅｓｓ　ＩＩ　ＦＬ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，　ＡＭＱＡＦ１０００）で計数し生存率を求めた。結果を図８に示した。
　図８の結果より、コラゲナーゼは細胞の生存率に影響を与えないが、サーモリシンは濃度に依存して細胞の生存率に影響を与えることが分かった。
（実施例６：酵素の検討）
　ＩＩＩ型コラーゲン溶液の終濃度を０．５ｍｇ／ｍＬとし、コラーゲンゲル包埋培養からの細胞の回収において、１ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼ、０．１２ｍｇ／ｍＬのサーモリシン、０．０６ｍｇ／ｍＬのサーモリシン、１ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼ及び０．１２ｍｇ／ｍＬのサーモリシン、又は１ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼ及び０．０６ｍｇ／ｍＬのサーモリシンを使用した以外は、実施例３－１と同様に培養し、生細胞を計測した。結果を図９Ａに示した。細胞の生存率を図９Ｂに示した。
　図９Ａ及び図９Ｂの結果より、サーモリシン単独では、濃度に依存して細胞の生存率に大きな影響を与え、回収細胞数にはわずかな影響しか与えないが、コラゲナーゼと併用することで、予想に反し、細胞の生存率への影響は消失し、回収細胞数が相乗的に増加することが分かった。
（試験例２：コラーゲンゲルの走査型電子顕微鏡観察）
　実施例１、実施例２、及び比較例２に記載の方法で、２ｍｇ／ｍＬの各コラーゲンゲルを１．５ｍＬチューブ内に作製し、４体積％パラホルムアルデヒドで固定化処理（６０分間、室温、振とう）後、１０×Ｄ－ＰＢＳ（－）（富士フイルム和光純薬，　０４８－２９８０５）を滅菌水で希釈して調製した１×ＰＢＳ（－）（Ｄ－ＰＢＳ（－））で洗浄して、エタノール系列（５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、及び９５％）で脱水処理（各１０分間、振とう）を行った。得られたコラーゲンゲルを１ｍＬのｔ－ブタノール（東京化成工業株式会社，　７５－６５－０）に浸した後、８℃冷蔵庫内で凝固させた。１．５ｍＬチューブの蓋を外し、パラフィルムでシールした後、ピンセットで孔を開けた。保冷剤（冷却パック）にて凝固を保った状態で、エッペンドルフチューブを真空定温乾燥器（東京理化器械株式会社，　ＶＯＳ－２０１ＳＤ）に入れ、真空ポンプ（日東工器社製、ＬＶ－６６０）を用いてｔ－ブタノールを昇華により３時間乾燥させた。イオンスパッター装置（日本電子株式会社，　ＪＥＣ－３０００ＦＣ）を用いたスパッタリング処理（３０ｍＡ，　６０秒）により、コラーゲンサンプル表面に白金パラジウムをコーティングした。その後、走査型電子顕微鏡（日本電子株式会社，　ＪＳＭ６５１０）で１０ｋＶ、３０，０００倍でコラーゲン線維を観察した。結果を図１０に示した。なお、図１０のスケールバーは０．５μｍであった。
　図１０の結果より、Ｉ型コラーゲンと比較すると、ＩＩＩ型コラーゲンの割合が多いほど、細かい線維が形成されることが分かった。
（実施例７：位相差顕微鏡観察）
　培養日数を１４日間とした以外は、実施例１、実施例２、比較例１、及び比較例２と同様に培養を行った。培養１４日目に、位相差顕微鏡（株式会社ニコン，ＥＣＬＩＰＳＥ　Ｔｓ２－ＦＬ）を用いて細胞を観察した。結果を図１１に示した。なお、図１１のスケールバーは１００μｍであった。
　図１１の結果より、２次元培養した場合は、プレート底面でコンフルエントになっていることが分かった。また、Ｉ型コラーゲンを用いた場合は、細胞凝集塊の割合が少なく、ＩＩＩ型コラーゲンを用いた場合は、大小様々な大きさの凝集塊が大量に形成され、Ｉ型コラーゲン及びＩＩＩ型コラーゲンを用いた場合は、ゲル内に小さな凝集塊が３次元的に散見されることが分かった。
　図１０に示したとおり、ＩＩＩ型コラーゲンの割合が多いほど、細かい線維が形成されることから、細胞増殖効率は、線維により形成される孔部の大きさに依存することが示唆された。
　本発明の態様としては、例えば、以下のものなどが挙げられる。
　＜１＞　ＩＩＩ型コラーゲンを含むコラーゲンゲルと細胞を接触させて、前記細胞を培養する培養工程を含むことを特徴とする細胞の培養方法である。
　＜２＞　前記コラーゲンゲルにおける、前記ＩＩＩ型コラーゲンの濃度は０．０１ｍｇ／ｍＬ以上１０ｍｇ／ｍＬ以下である、前記＜１＞に記載の細胞の培養方法である。
　＜３＞　前記コラーゲンゲルが更にＩ型コラーゲンを含む場合、
　前記コラーゲンゲルにおける、前記Ｉ型コラーゲンの濃度は３ｍｇ／ｍＬ以下である、前記＜１＞又は＜２＞に記載の細胞の培養方法である。
　＜４＞　前記細胞は、造血幹細胞、間葉系幹細胞、血管内皮幹細胞、又はこれらから分化した細胞である、前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の細胞の培養方法である。
　＜５＞　前記培養工程後に、前記細胞を回収する回収工程を含む、前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の細胞の培養方法である。
　＜６＞　前記回収工程において、前記コラーゲンゲルを、コラゲナーゼ及びサーモリシンで処理する、前記＜５＞に記載の細胞の培養方法である。
　＜７＞　前記コラゲナーゼの添加量は、質量比で、前記サーモリシンの添加量の３倍以上である、前記＜６＞に記載の細胞の培養方法である。
　＜８＞　前記サーモリシンの添加量は、０．３ｍｇ／ｍＬ以下である、前記＜６＞又は＜７＞に記載の細胞の培養方法である。
　＜９＞　ＩＩＩ型コラーゲンを含むコラーゲンゲルと細胞を接触させて、前記細胞を培養する培養工程を含むことを特徴とする治療用組成物の製造方法である。
　＜１０＞　ＩＩＩ型コラーゲンを含むコラーゲンゲルと、細胞と、を含み、
　前記細胞は、前記コラーゲンゲルと接触していることを特徴とする治療用組成物である。
　本国際出願は、２０２２年７月１５日に出願した日本国特許出願第２０２２－１１４３６６号に基づく優先権を主張するものであり、日本国特許出願第２０２２－１１４３６６号の全内容を参照することにより本国際出願に援用する。
　本発明の細胞の培養方法は、簡易に、安定的かつ効率的に大量の細胞を製造することができるため、細胞移植治療、又は生物学的製剤の製造等に用いる細胞の培養方法として好適に利用することができる。

Claims (10)

  1. 　ＩＩＩ型コラーゲンを含むコラーゲンゲルと細胞を接触させて、前記細胞を培養する培養工程を含むことを特徴とする細胞の培養方法。
  2. 　前記コラーゲンゲルにおける、前記ＩＩＩ型コラーゲンの濃度は０．０１ｍｇ／ｍＬ以上１０ｍｇ／ｍＬ以下である、請求項１に記載の細胞の培養方法。
  3. 　前記コラーゲンゲルが更にＩ型コラーゲンを含む場合、
    　前記コラーゲンゲルにおける、前記Ｉ型コラーゲンの濃度は３ｍｇ／ｍＬ以下である、請求項１又は２に記載の細胞の培養方法。
  4. 　前記細胞は、造血幹細胞、間葉系幹細胞、血管内皮幹細胞、又はこれらから分化した細胞である、請求項１から３のいずれかに記載の細胞の培養方法。
  5. 　前記培養工程後に、前記細胞を回収する回収工程を含む、請求項１から４のいずれかに記載の細胞の培養方法。
  6. 　前記回収工程において、前記コラーゲンゲルを、コラゲナーゼ及びサーモリシンで処理する、請求項５に記載の細胞の培養方法。
  7. 　前記コラゲナーゼの添加量は、質量比で、前記サーモリシンの添加量の３倍以上である、請求項６に記載の細胞の培養方法。
  8. 　前記サーモリシンの添加量は、０．３ｍｇ／ｍＬ以下である、請求項６又は７に記載の細胞の培養方法。
  9. 　ＩＩＩ型コラーゲンを含むコラーゲンゲルと細胞を接触させて、前記細胞を培養する培養工程を含むことを特徴とする治療用組成物の製造方法。
  10. 　ＩＩＩ型コラーゲンを含むコラーゲンゲルと、細胞と、を含み、
    　前記細胞は、前記コラーゲンゲルと接触していることを特徴とする治療用組成物。
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