WO2018016797A1 - 내성암, 재발암 또는 전이암의 예방 또는 치료용 약학 조성물 - Google Patents

내성암, 재발암 또는 전이암의 예방 또는 치료용 약학 조성물 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of resistant cancer, relapse cancer, or metastatic cancer, and more specifically, it can prevent or treat resistant cancer, relapse cancer, or metastatic cancer by using a Namtin (Nicotinamide phosphoribosyltransferase) inhibitor.
  • a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of resistant cancer, relapse cancer, or metastatic cancer, and more specifically, it can prevent or treat resistant cancer, relapse cancer, or metastatic cancer by using a Namtin (Nicotinamide phosphoribosyltransferase) inhibitor.
  • Stomach cancer is one of the most common cancers worldwide, and it is the most common cancer occurring in Asia such as Korea and Japan.
  • the actual mortality rate shows a mortality rate of about 90% after deteriorating metastatic cancer rather than the state of primary tumor.
  • Herceptin which is used as an anticancer agent for HER2 + in breast cancer, is the only target anticancer agent currently used in metastatic gastric cancer, but it can be applied only to 16% of patients with metastatic gastric cancer. This exists.
  • Epithelial-mesenchymal transition is a process by which epithelial cells lose the characteristics of cell polarity and intercellular adhesion and obtain the mobility and invasive properties that can become mesenchymal stem cells. (Cancer and Metastasis Reviews 28, June 2009). When epithelial mesenchymal metastasis has occurred, the cells not only have characteristics such as mobility, invasiveness and stem cells, but also have a feature of preventing cell death and aging. Therefore, it has been reported that the cell diversity that may appear in the process can be confirmed in the early stages of metastasis of cancer (Cell 139, November 25, 2009).
  • CTCs circulating tumor cells
  • recurrence is one of the biggest challenges in cancer treatment. It is a common phenomenon in all chemotherapy and targeted chemotherapy, and can occur in both primary and metastatic cancers. Once relapsed, the prognosis is very poor. Epithelial mesenchymal metastasis is also known to cause cancer recurrence and resistance to anticancer agents. Cancer cells with epithelial mesenchymal metastases have been reported to induce cancer recurrence by inhibiting proliferation, increasing the expression of genes resistant to apoptosis and causing resistance to anticancer agents (Nature 527). , November 26, 2015).
  • An object of the present invention is to use a NamPT (Nicotinamide phosphoribosyltransferase) inhibitor to effectively inhibit the proliferation of resistant cancer, relapse cancer, or metastatic cancer cells to prevent and / or treat resistant cancer, relapse cancer, or metastatic cancer
  • the purpose is to provide.
  • the present invention administers a pharmaceutical composition comprising a Namtin (Nicotinamide phosphoribosyltransferase) inhibitor to an epithelial mesenchymal metastasis subtype (hereinafter, referred to as an 'EMT subtype') with the poorest prognosis of a patient among cancer cell lines
  • a Namtin Naturaltinamide phosphoribosyltransferase
  • an 'EMT subtype' epithelial mesenchymal metastasis subtype
  • EMT epithelial mesenchymal transition
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating resistant cancer, relapse cancer, or metastatic cancer, comprising a NamPT (Nicotinamide phosphoribosyltransferase) inhibitor as an active ingredient.
  • NamPT Natural-Nicotinamide phosphoribosyltransferase
  • the "NamPT inhibitor” means a drug that catalyzes the phosphoibosylation of nicotinamide and inhibits the activity of NamPT, an enzyme that mediates NAD biosynthesis.
  • the NamPT inhibitor is ((E) -N- [4- (1-benzoylpiperidin-4-yl) butyl] -3-pyridin-3-yl represented by the following formula (1) Prop-2-enamide) ((E) -N- [4- (1-benzoylpiperidin-4-yl) butyl] -3-pyridin-3-ylprop-2-enamide), N- (4-((3,5-difluorophenyl) sulfonyl) benzyl) imidazo [1,2-a] pyridine-6-carboxamide (N- (4-((3,5-difluorophenyl) sulfonyl ) benzyl) imidazo [1,2-a] pyridine-6-carboxamide) and (Z) -2- (6- (4-chlorophenoxy) hexyl) -1-cyano-3- ( Consisting of pyridine-4 (1H) -ylidine) gu
  • metalstatic cancer in the present invention means cancer caused by proliferation of cancer cells leaving other organs and moving to other organs.
  • the spread of cancer to other parts of the body can be largely divided into primary cancers in which cancerous tissues grow and directly invade surrounding organs and distant metastases along blood vessels or lymphatic vessels to other organs in the distance.
  • it may mean that the cancer has metastasized to the above organs in other primary cancers, but is not limited thereto.
  • the "resistant cancer” is extremely low sensitivity to cancer therapy or cancer therapy drugs, especially anticancer drugs, such as radiation therapy, so that the symptoms are not improved, alleviated, alleviated or treated by the therapy It does mean cancer.
  • the resistant cancer may be resistant to a specific treatment from the beginning or may not be initially resistant, but may be caused by a long time of treatment and no longer susceptible to the same treatment due to genetic mutations in cancer cells. .
  • the "recurrence cancer” means a case where the cancer occurs again at the site where the cancer occurred after receiving a cure determination after treatment of the first cancer.
  • the cancer may be a recurrence of cancer caused by epithelial mesenchymal metastasis process, but is not limited thereto.
  • the NamPT inhibitor may be applied without limitation as long as it is a cancer having resistance, recurrence, or metastasis, for example, breast cancer, biliary cancer, gallbladder cancer, pancreatic cancer, colon cancer, or uterine cancer having resistance, recurrence, or metastasis.
  • Esophageal cancer, stomach cancer, brain cancer, rectal cancer, lung cancer, bladder cancer, kidney cancer, ovarian cancer, prostate cancer, uterine cancer, head and neck cancer, skin cancer, hematologic cancer and liver cancer can be targeted to any one selected from cancer.
  • recurrent, or metastatic gastric cancer, colorectal cancer, pancreatic cancer, lung cancer, and breast cancer can be targeted to any one selected from cancer.
  • recurrent, or metastatic gastric cancer, colorectal cancer, pancreatic cancer, lung cancer, and breast cancer can be targeted to any one selected from cancer.
  • the resistant cancer, relapse cancer, or metastatic cancer may be an EMT subtype.
  • the metastatic cancer may be a cancer in which metastasis and / or relapse has occurred through an epithelial mesenchymal metastasis process, or a cancer that is difficult to treat due to resistance to drugs for treating cancer, and specific carcinoma is not particularly limited.
  • the cancer may be targeted to any one selected from cancer and liver cancer, and preferably, any one or more cancers selected from gastric cancer, colon cancer, pancreatic cancer, lung cancer and breast cancer of the EMT subtype.
  • the EMT subtype may be any one or more genes selected from the group consisting of SNAIL, E-cadherin, Vimentin, and CD44 or overexpressed or underexpressed proteins, preferably E.
  • the gene of -cadherin or the protein encoded by the gene may be underexpressed, or one or more genes selected from SNAIL, CD44 and Vimentin or the protein encoded by the gene may be overexpressed, but is not limited thereto. no.
  • the EMT subtype may be classified by a method for measuring the expression level of epidermal mesenchymal metastasis characteristic signature gene (BMC Medical Genomics 4, January 20, 2011).
  • the epithelial mesenchymal metastasis characteristic signature gene may be any one or more of over- and low-expression genes (Table 1 and 2).
  • the "signature score of epithelial mesenchymal metastasis” refers to the difference between the expression level average value of epithelial mesenchymal metastasis overexpression gene and the mean value of epithelial mesenchymal metastasis low expression gene in a subject.
  • the values can be used to classify the subject into an EMT subtype and a non-EMT subtype.
  • the epithelial mesenchymal metastasis characteristic overexpression genes are ADAM23, ADAMTS1, AFF3, AK5, AKAP12, ALPK2, ANGPTL2, ANKRD1, ANTXR1, ANXA6, AOX1, AP1S2, ARMCX1, ATP8B2, ATP8B3, AXL1, BDNFNC , BVES, FAM171A1, ZCCHC24, C16orf45, C1S, GLIPR2, CAP2, CCL2, CDH11, CDH2, CDH4, CHN1, CLDN11, CLIP3, CMTM3, COL12A1, COL1A2, COL3A1, COL4A1, COL5A1, COL5A1, COL5A1, COL5A1, COL5A1, COL5A1, COL5A1, COL5A1, COL5A1, COL5A1, COL5A1, COL5A1, COL5A1, COL5A1, COL5A1, COL5A1,
  • epithelial mesenchymal metastasis-characteristic low expression genes are ACPP, AGR3, ALDH3B2, ANK3, ANKRD22, ANXA9, AP1M2, AQP3, ARHGAP8, ARHGDIB, PRR15L, ATP2C2, B3GNT3, BLNK, BSPRY, C11orf52f, MISP, F11f1 116f C1orf210, TTC39A, CCDC64B, CD24, CDH1, CDH3, CDS1, CEACAM5, CEACAM6, CGN, CKMT1B, CLDN4, CLDN7, CNKSR1, CNTNAP2, CTAGE4, DAPP1, DENND2D, DMKN, DSC2, EP3, EHF, ELF EPPK1, ERBB3, ERP27, FA2H, FAAH2, FAM110C, FAM83A, FAM84A, FAM84B, FBP1, FGD2, FGFBP1, FUT1, FUT3, FXYD3, G
  • the epithelial mesenchymal metastasis characteristic overexpression gene and low expression gene and its sequence number Entrez ID are shown in Table 1 and 2, respectively.
  • Overexpression genes Overexpression genes gene Entrez ID gene Entrez ID gene Entrez ID gene Entrez ID gene Entrez ID ADAM23 NM_8745 DPYSL3 NM_1809 NRG1 NM_3084 ADAMTS1 NM_9510 EDIL3 NM_10085 NUDT11 NM_55190 AFF3 NM_3899 ELOVL2 NM_54898 PAPPA NM_5069 AK5 NM_26289 EML1 NM_2009 PDE7B NM_27115 AKAP12 NM_9590 EMP3 NM_2014 PLAGL1 NM_5325 ALPK2 NM_115701 EPB41L5 NM_57669 PMP22 NM_5376 ANGPTL2 NM_23452 EPDR1 NM_54749 PNMA2 NM_10687 ANKRD1 NM_27063 EVI2A NM_2123 POPDC3 NM_64208 ANTXR1 NM_84168 F2R NM
  • a method for measuring the expression level of a gene overexpressed or underexpressed in the EMT subtype or a protein encoded by the gene is, for example, Western blot assay, ELISA (enzyme linked immunosorbent). assay, Radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion, Ouchterlony immunodiffusion, rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, immunoprecipitation assay, Complement Fixation Assay, FACS, RNA-sequencing Analysis, Microarray, RNA-scope, N-Counter, Reverse Phase Protein Array (RPPA) , FPPA (forward phase protein array), LC-MS / MS, ABCD (antibody barcoding with photocleavable DNA) and protein chips can be performed using, but not limited to.
  • Western blot assay ELISA (enzyme linked immunosorbent). assay, Radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion, Ouchterlony immuno
  • the resistant cancer, relapse cancer, or metastatic cancer may be one in which the NAPRT (Nicotinic acid phosphoribosyltransferase) protein is down regulated.
  • the expression level of the protein may be evaluated to be low by comparing the expression level of the NAPRT with that of the normal control group.
  • the resistant cancer, recurrence cancer, or metastatic cancer may be included without limitation, especially among the EMT subtypes, in which the NAPRT protein is low in expression, for example, breast cancer, biliary cancer, gallbladder cancer, in which the NAPRT protein is low in expression,
  • the NAPRT protein may be gastric cancer, colon cancer, pancreatic cancer, lung cancer or breast cancer with low expression.
  • the "NAPRT protein” is an enzyme involved in the NAD biosynthesis process using nicotinic acid as a substrate in raw vegetables.
  • the biosynthesis of the NAD may be performed by de novo synthesis or by the salvage pathway, and the synthesis of the salvage pathway is performed by the nicotinic acid phosphoribosyltransferase (NAPRT) enzyme and nicotine.
  • NAPRT nicotinic acid phosphoribosyltransferase
  • NamPT Naturaltinamide phosphoribosyl transferase
  • amide nicotinamide
  • the resistant cancer, recurrence cancer, or metastatic cancer may be classified as a diffuse type gastric cancer by immunostaining.
  • the diffuse gastric cancer has a low NAPRT expression level, and thus, when the NamPT inhibitor according to the present invention is administered to the diffuse gastric cancer, NAD may inhibit biosynthesis of NAD, thereby inducing cell death more effectively.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be further administered in combination with other anticancer agents, thereby effectively inhibiting general cancer cell proliferation and cancer metastasis, thereby being used for the treatment of cancer.
  • the anticancer agent is nitrogen mustard, imatinib, oxaliplatin, rituximab, erlotinib, neratinib, lapatinib, zefitinib, vandetanib, nirotinib, semasanib, conservinib, axitinib, cediranib , Restautinib, trastuzumab, gefitinib, bortezomib, sunitinib, carboplatin, sorafenib, bevacizumab, cisplatin, cetuximab, biscumalboom, asparaginase, tretinoin, hydroxycarba Amide, dasatinib, estramastine, gemtuzumab ozogamycin, ibritumab tucetan, heptaplatin, methylaminolevulinic acid, amsacrine, alemtuzumab,
  • the pharmaceutical composition may be characterized in that the capsule, tablets, granules, injections, ointments, powder or beverage form, the pharmaceutical composition may be characterized in that it is intended for humans.
  • compositions of the present invention may be used in the form of oral dosage forms, such as powders, granules, capsules, tablets, aqueous suspensions, external preparations, suppositories, and sterile injectable solutions, respectively, according to conventional methods.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may comprise a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Pharmaceutically acceptable carriers can be used as oral administration binders, suspending agents, disintegrants, excipients, solubilizers, dispersants, stabilizers, suspending agents, pigments, fragrances, etc.
  • buffers, preservatives, analgesic Topical agents, solubilizers, isotonic agents, stabilizers and the like can be mixed and used, and for topical administration, bases, excipients, lubricants, preservatives and the like can be used.
  • the formulation of the pharmaceutical composition of the present invention may be prepared in various ways by mixing with a pharmaceutically acceptable carrier as described above.
  • oral administration may be in the form of tablets, troches, capsules, elixirs, suspensions, syrups, wafers, and the like, in the case of injections, in unit dosage ampoules or multiple dosage forms. have. And others, solutions, suspensions, tablets, capsules, sustained release preparations and the like.
  • suitable carriers, excipients and diluents suitable for formulation include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, malditol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, Cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate or mineral oil and the like can be used.
  • fillers, anti-coagulants, lubricants, wetting agents, fragrances, emulsifiers, preservatives and the like may be further included.
  • Routes of administration of the pharmaceutical compositions according to the invention are not limited to these, but are oral, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intradural, intracardiac, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, intestinal, topical, Sublingual or rectal. Oral or parenteral release is preferred.
  • parenteral includes subcutaneous, intradermal, intravenous, intramuscular, intraarticular, intramuscular, intrasternal, intradural, intralesional and intracranial injection or infusion techniques.
  • the pharmaceutical compositions of the invention may also be administered in the form of suppositories for rectal administration.
  • the pharmaceutical compositions of the present invention vary depending on a number of factors including the activity, age, weight, general health, sex, formulation, time of administration, route of administration, rate of release, drug combination and severity of the particular disease to be prevented or treated, of the specific compound employed.
  • the dosage of the pharmaceutical composition may be appropriately selected by those skilled in the art depending on the patient's condition, weight, degree of disease, drug form, route of administration and duration, and 0.0001 to 50 mg / kg or It may be administered at 0.001 to 50 mg / kg. Administration may be administered once a day or may be divided several times. The dosage does not limit the scope of the invention in any aspect.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may be formulated as pills, dragees, capsules, solutions, gels, syrups, slurries, suspensions.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention can be used to prevent and / or treat cancer by effectively inducing cell proliferation and apoptosis among resistant cancer, recurrent cancer, or metastatic cancer cells, among cancers.
  • Figure 1 shows the results of EMT subtype gene characterization analysis according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 2 shows the results of Western blot assay (Western blot assay) for confirming the expression of EMT-related proteins according to an embodiment of the present invention.
  • 3 to 5 show the results of Matrigel (Matrigel) invasion analysis according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 20 shows the results of EMT subtype cell line survival analysis according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 21 shows the result of Western blot assay (Western blot assay) for confirming NAPRT protein expression according to an embodiment of the present invention.
  • 25 to 38 show the results of NAPRT gene expression in EMT and non-EMT subtypes and normal tissues of five carcinomas according to an embodiment of the present invention.
  • the pharmaceutical composition comprising NamPT (Nicotinamide phosphoribosyltransferase) inhibitor of the present invention as an active ingredient is a cell proliferation and cells of resistant cancer, recurrent cancer, or metastatic cancer cells having the characteristics of epithelial-mesenchymal transition (EMT) subtype. It can be effectively used to prevent and / or treat cancer by effectively inducing death.
  • NamPT Natural-Nicotinamide phosphoribosyltransferase
  • EMT epithelial-mesenchymal transition
  • ((E) -N- [4- (1-benzoylpiperidin-4-yl) butyl] -3-pyridin-3-ylprop-2-enamide) according to the invention
  • FBS fetal bovine serum
  • antibiotics penicillin-streptomycin (Invitrogen)
  • EMT epithelium Mesenchymal metastasis
  • the genes used in the classification of gastric cancer cohort EMT subtypes of ACRG were up-regulated and down-regulated 161 genes. Unsupervised hierarchical clustering was performed.
  • the epithelial mesenchymal transition gene feature autonomic hierarchical clustering analysis method is as follows. For gastric cancer cell lines, RNA-sequence analysis was used to calculate normalized expression levels for the transcripts of 28 cell lines. 1 was added to the FPKM value obtained by the expression analysis and then converted to the log2 level was used for analysis. The R package hclust was used to perform autonomic hierarchical clustering with the expression values of the 149 overexpression genes and 161 low expression genes. The distance was calculated using the maximum linkage by Euclidean method, and the results are shown in FIG. 1.
  • Hs746T, SNU484, YCC11, SNU1750, SK4, SNU668 and MKN1 cell lines belong to the EMT subtype.
  • Epithelial mesenchymal transition marker protein expression was confirmed by Western blot assay to verify the epithelial mesenchymal metastasis characteristics of the EMT subtype cell line.
  • the preparation method of the protein used for the Western blot analysis is as follows.
  • the biliary cancer cell line was harvested by treatment with PBS, washed with PBS, and lysed using RIPA buffer, a cell lysis buffer containing proteolytic inhibitor.
  • the dissolved solution was fractionated from the total solution using a centrifuge, and only the solution containing the protein was extracted.
  • the extracted protein was quantified by the Bradford method.
  • the same concentration of protein obtained through quantification was separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and transferred to PVDF membrane.
  • the membrane to which the protein was transferred was blocked with Tris-buffered saline / 0.1% Tween-20 (TBS-T) solution containing 5% non-fat milk for 1 hour at room temperature to reduce nonspecific binding.
  • TBS-T Tris-buffered saline / 0.1% Tween-20
  • the primary antibody diluted in 5% BSA solution was reacted at 4 ° C. for at least 12 hours, and the secondary antibody (1: 5000 dilution) was reacted at room temperature for 1 hour.
  • an enhanced chemiluminescence system was used for visualization.
  • E-cadherin expression is low in epithelial mesenchymal metastasis cell lines, and although there is a difference in the degree of expression, expression of Vimentin and snail does not occur epithelial mesenchymal metastasis without epithelial mesenchymal metastasis. (Hereinafter referred to as 'non-EMT') It was confirmed that the increase compared to the cell line. On the other hand, in the case of the non-EMT cell line, the epithelial mesenchymal metastasis cell line and the expression pattern was found to be reversed.
  • Matrigel invasion assay method was cultured in serum-free medium epithelial mesenchymal transition cell line and control in a transwell coated with Matrigel at a concentration of 300 ⁇ g / ml.
  • the lower part of the transwell was a nutrient medium containing fetal calf serum (FBS) and cultured in an incubator at 37 ° C., 5%, and CO 2 .
  • FBS fetal calf serum
  • MKN45 and NCC59 cells which are cell lines without epithelial mesenchymal metastasis, were used.
  • the matrigel membrane were fixed with methanol, and stained with 0.2% crystal violet.
  • the number of cells contained in the membrane was counted, and the results are shown in FIGS. 3 to 5.
  • the sphere formation experiment was carried out by incubating the epithelial mesenchymal metastatic subtype cell line and control group MKN45 in DMEM-F12 medium (20 ng / ml EGF, 20 ng / ml basal FGF, 2% B27 supplement) without serum. was observed under a microscope. Moreover, the number of the cells which formed the sphere was aggregated, and the result is shown to FIGS. 6-8.
  • EMT subtype cell lines SK4, Hs746T, SNU484, SNU1750, YCC11 and SNU668 according to the present invention have cancer stem cell properties.
  • the small molecule pharmacological compounds are related to oncology, cardiology, anti-inflammatory, immunology, neuropsychiatry and anticancer, and the anticancer small molecule compounds are known to have anticancer effects and have been used in preclinical, clinical trial stages or tested. All materials were purchased from Selleckchem.
  • each of the seven EMT subtype gastric cancer cell lines according to the present invention was dispensed at 5,000 wells in 96 well-plates, and the drug concentration in the cell culture solution was diluted to 2.5 ⁇ M at 24 hours.
  • Cells were added using a Mac Liquid Handler instrument (Beckman).
  • the control group was treated with the same concentration of DMSO as the experimental group.
  • the cells were incubated for 72 hours in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator, and then cell viability was measured using a CellTiter-Glo Assay Kit (Promega), and the results are shown in FIGS. 9 to 15.
  • the viability values were divided by 0.1 units, and the number of drugs selected according to the number of cell lines corresponding to the corresponding viability values or less is shown in FIGS. 16 and 17.
  • the 63 small molecule compounds include 9 drugs related to DNA synthesis, Topoisomerase, 6 cell cycle inhibitors, 8 HDAC inhibitors, 3 EGFR, HER2, PIK3CA and src related drugs, 4 mTOR and PI3K inhibitors, and proteasome 4 related drugs, 2 autophagy related drugs, 5 microtubule related cases, 2 DNA / RNA damage related cases, 2 ALK related cases, 3 Ubiquitine ligase cases, 6 infection related cases and 3 other cases were identified (Table 3). .
  • Target Drug Topoisomerase DNA synthesis Epirubicin Hydrochloride, Mitoxantrone Hydrochloride, Camptothecin, Doxorubicin (Adriamycin), Gemcitabine, Daunorubicin HCl (Daunocycine HCl), Gemcitabine HCl (Gemzar), Clofarabine, Niclosamide (Niclocide), Fludarabine Phosphate (Fludara) Cell cycle (Aurora, cdk plk1, etc) Danusertib (PHA-739358), AT9283, Flavopiridol (Alvocidib) HCl, BI2536, GSK461364, BI6727 (Volasertib), SB743921, Ispinesib (SB-715992) HDAC Trichostatin A (TSA), PCI-24781, CUDC-101, JNJ-26481585, Belinostat (PXD101), SB939 (Paracino
  • the 29 gastric cancer cell lines were dispensed in 5,000 wells each into 96 well-plates, and the drug concentration in the cell culture solution was measured by log serial dilution at 24 hours. Dilutions were made at 12 concentrations corresponding to a minimum of 0.5 nM to a maximum of 50 ⁇ M and added to the cells using a BioMac Liquid Handler instrument (Beckman). The cells were incubated for 72 hours in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator, and cell viability was measured using a CellTiter-Glo assay kit (Promega). The measured values yielded cell viability values for 12 concentrations per drug for each of 63 drugs and 29 cell lines.
  • the AUC (Area under the curve) value which is an indicator of cell line specific sensitivity for 63 drugs, was calculated, and the results are shown in FIG. 18. Also, to classify the 63 drugs based on the difference in AUC values between EMT subtypes and non-EMT subtypes, the difference between the median value of the AUC values of 7 EMT gastric cancer cell lines and the AUC median value of 22 non-EMT cell lines. was calculated. In addition, 63 drugs were classified based on the p-value obtained by performing the Student t-test to confirm the significant difference between the two groups, and the results are shown in FIG. 19.
  • the drug with low AUC blue was found to have high drug sensitivity in the cell line.
  • FK866 showed the largest AUC difference between gastric cancer cells of the EMT subtype and gastric cancer cell lines of the non-EMT subtype and had a significant p-value.
  • the effect of inhibiting survival rate by FK866 was confirmed in the EMT subtype cell line. After incubating 72 hours with 0-50 ⁇ M of FK866 to each of the cell lines, the survival rate was measured in the manner of Example 3, and the results are shown in FIG. 20.
  • FK866 according to the present invention has therapeutic efficacy in gastric cancer cell lines having EMT subtypes.
  • NAPRT As shown in FIG. 21, it was confirmed that the expression of NAPRT was reduced in five cells except YCC1 and SK4 classified as EMT subtypes. SK4 cell lines with high NAPRT expression were exceptionally resistant to FK866. In addition, YCC1 showed low sensitivity to FK866 for NAPRT expression. On the other hand, seven cell lines belonging to the non-EMT was confirmed that the expression of NAPRT at a high level.
  • the total NAD + / NADH amount was analyzed in the cell lines SNU668 and Hs746T and non-EMT cell lines of the EMT subtype.
  • the NAD protein amount analysis was quantitatively measured NAD + / NADH using Ultra-Glo TM Recombinant Luciferase assay kit (Promega, # G9071). Specifically, 5000 cells were cultured in 96-well plates, and then FK866 was administered at a concentration of 2.5-20 nM, followed by a culture process for 40 hours. After the above process, after treating the cyclic enzyme converting NAD + to NADH, the activity of reductase by NADH was measured, and the results are shown in FIG. 22.
  • Each of the EMT subtype cell lines was treated with 25 nM FK866, and nicotinic acid (NA), nicotinamide (NAM) and NAD were added to the cell culture medium at 50 to 200 mM to measure survival. The results are shown in FIGS. 23 and 24.
  • Analyzes were performed to classify samples corresponding to EMT subtypes from published transcript datasets in a number of carcinomas. Then, the amount of expression of NAPRT between the EMT subtype and the non-EMT subtype in the sorted samples was compared.
  • NAPRT expression levels were performed by TCGA, Gene Expression Omnibus (GEO) for 17 carcinomas [Barrett et al. 2013 PMID 23193258] and ArrayExpress [Kolesnikov et al. 2015 PMID 25361974] utilized transcript profiles of 33 cohorts collected from ttps: //tcga-data.nci.nih.gov/tcga/, http: Downloaded from the web link at //www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/, https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress and used for analysis.
  • GEO Gene Expression Omnibus
  • the E-MTAB-923 data set was normalized to a robust multichip average (RMA) method using affy R package, and then converted to Log2 level for analysis.
  • the RNA-seq data set was used for the E-MTAB-923 data set.
  • RSEM method when normalized by the above method, it was normalized by the RSEM method.
  • 1 was added to the normalized RPKM value and then converted to the log2 level to be used for the following analysis.
  • Samples belonging to the EMT subtype are calculated from the average value of the low-expression 161 genes from the average value of the 149 genes overexpressing the EMT subtypes, and then displayed in a quantile-quartile gram (q-q plot) through the difference values.
  • q-q plot the point which begins to deviate in the direction of the high score from the diagonal distribution trend connecting the first quantile and the third quantile is determined as the threshold, and the epithelium is above the threshold. If the mesenchymal metastasis gene feature scores were large, they were classified as EMT subtypes.
  • the assay was used for analysis only if EMT subtypes were identified in at least 3% of the total samples per each cohort.
  • the expression level of NAPRT gene between the EMT subtype and non-EMT subtype samples in gastric cancer, colorectal cancer, pancreatic cancer, lung adenocarcinoma and breast cancer, where more than 3% of EMT subtypes were found in at least two cohorts. are shown in FIGS. 25 to 38 and 39.
  • EMT subtypes are present not only in gastric cancer but also in colorectal cancer, pancreatic cancer, lung cancer and breast cancer, and NAPRT low expression is observed in cancers of all the EMT subtypes. It has been found to be useful as a target anticancer drug for cancer.
  • TMA tissue microarray
  • NamPT inhibitor including FK866 of the present invention will induce apoptosis by interfering with the biosynthesis of NAD in subtype gastric cancer with low NAPRT expression.
  • the pharmaceutical composition comprising the NamPT (Nicotinamide phosphoribosyltransferase) inhibitor of the present invention as an active ingredient can be effectively used to prevent and / or treat cancer by effectively inducing cell proliferation and apoptosis of resistant cancer, relapse cancer, or metastatic cancer cells. have.
  • NamPT Natural-Nicotinamide phosphoribosyltransferase

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Abstract

본 발명은 내성암, 재발암, 또는 전이암의 예방 또는 치료용 약학 조성물, 보다 상세하게는 NamPT(Nicotinamide phosphoribosyltransferase) 저해제를 이용한 내성암, 재발암 또는 전이암의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 암 중에서도 특히 내성암, 재발암, 또는 전이암 세포의 세포 증식 및 세포사멸을 효과적으로 유도하여 암을 예방 및/또는 치료하는데 사용될 수 있다.

Description

내성암, 재발암 또는 전이암의 예방 또는 치료용 약학 조성물
본 발명은 내성암, 재발암, 또는 전이암의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 NamPT(Nicotinamide phosphoribosyltransferase) 저해제를 이용하여 내성암, 재발암, 또는 전이암을 예방 또는 치료할 수 있는 약학 조성물에 관한 것이다.
위암은 전세계적으로 발생빈도가 높은 암 중 하나로 한국 및 일본 등의 아시아에서 발생하는 가장 흔한 암으로서 사망률 1위를 나타내는 암에 해당한다. 특히, 실제 사망률은 원발암(primary tumor)의 상태보다 전이암으로 악화된 후에 약 90%에 가까운 사망률을 보이고 있다.
한편, 최근 전 세계적으로 항암제 연구 개발 동향은 암의 유전적 소인에 기반한 개인 맞춤형 표적 항암제 개발이 주류를 이루고 있는 추세이다. 이러한 연구 개발에도 불구하고, 유방암에서 HER2+ 표적치료용 항암제로 사용 중인 허셉틴(Herceptin)이 전이성 위암에서 현재 유일하게 사용될 수 있는 표적 항암제에 해당하나 그마저도 전이성 위암 환자의 16%에 밖에 적용될 수 없다는 한계점이 존재한다.
상피 중간엽 전이(Epithelial-mesenchymal transition; EMT)란 상피 세포가 세포 극성 및 세포간의 부착의 특성을 잃고, 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)이 될 수 있는 이동성 및 침습성의 특성을 얻을 수 있는 과정을 의미한다(Cancer and Metastasis Reviews 28, June 2009). 상기 상피 중간엽 전이가 일어난 경우 세포는 이동성, 침습성 및 줄기세포와 같은 특성을 가질 뿐만 아니라, 세포사멸 및 노화를 방해한다는 특징이 존재한다. 따라서, 상기 과정에서 나타날 수 있는 세포의 다양성이 암의 전이(metastasis) 초기의 과정에서 확인될 수 있는 것으로 보고되어 있다(Cell 139, November 25, 2009). 상기 전이(metastasis)의 개시는 E-cadherin 억제에 의해 매개된 세포-세포 흡착을 상실하고 증가된 침투성 특성에 의하여 기저막을 파괴하고, 인트라베세이션(intravasation)을 통하여 혈류로 들어가는 것을 통해 일어난다. 그 뒤, 순환 종양 세포(CTC)는 상기 혈류로 나가 미세전이암을 형성하고, 전이성 부위에서 클론성 성장을 진행하는 과정의 연속을 통하여 완성된다고 보고되어 있다.
한편, 전이와 더불어 암치료의 가장 큰 난제 중 하나는 재발이다. 모든 항암 화학요법이나 표적 항암제 치료에서 공통적으로 나타나는 현상이며 원발암 또는 전이암 모두에서 나타날 수 있다. 일단 재발이 된 경우 예후가 매우 안 좋은 특징을 보인다. 이러한 암의 재발과 항암제에 대한 저항성에도 상피 중간엽 전이가 원인이 되는 것으로 알려져 있다. 상피 중간엽 전이가 일어난 암 세포는 증식 (proliferation)이 억제되며 세포사멸 (apoptosis)에 저항성을 갖고 항암제에 대해 내성을 유발하는 유전자의 발현을 증가시켜 암의 재발을 유도한다고 보고되어 있다 (Nature 527, November 26, 2015).
본 발명의 일 목적은 NamPT(Nicotinamide phosphoribosyltransferase) 저해제를 사용하여 내성암, 재발암, 또는 전이암 세포의 증식을 효과적으로 억제해 내성암, 재발암, 또는 전이암을 예방 및/또는 치료할 수 있는 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명자들은 암 세포주 중 환자의 예후가 가장 좋지 않은 상피 중간엽 전이 아형(이하 'EMT 아형'이라 함.)에 NamPT(Nicotinamide phosphoribosyltransferase) 저해제를 포함하는 약학 조성물을 투여하는 경우, 상기 아형의 암 세포주에서 특이적으로 성장 억제 및 세포 사멸(apoptosis)을 효과적으로 유도함으로써 내성암, 재발암, 또는 전이암을 예방 및/또는 치료할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.
단, 본 발명에서 상기 "상피 중간엽 전이(Epithelial mesenchymal transition; EMT)"란, 상피 세포가 중간엽 세포로 변하는 과정을 말한다. 즉 상피 세포의 모습을 잃어버리고 중간엽 세포의 특징을 가지게 되는 변이과정으로 개체 형성 발달에 중요한 과정으로 알려져 있으며, 암세포의 생장, 약물 저항성, 암세포의 침윤 및 전이 등과 관련되어 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따르면, NamPT(Nicotinamide phosphoribosyltransferase) 저해제를 유효성분으로 포함하는, 내성암, 재발암, 또는 전이암의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서 상기 "NamPT 저해제" 란, 니코틴아마이드(Nicotinamide)의 인산라이보스화(Posphoribosylation)를 촉매하고, NAD 생합성을 매개하는 효소인 NamPT의 활성을 저해하는 약물을 의미한다.
본 발명의 일 구체예에서는, 상기 NamPT 저해제는 하기 화학식 1로 표시되는 ((E)-N-[4-(1-벤조일피페리딘-4-일)부틸]-3-피리딘-3-일프로프-2-엔아마이드) ((E)-N-[4-(1-benzoylpiperidin-4-yl)butyl]-3-pyridin-3-ylprop-2-enamide), 화학식 2로 표시되는 N-(4-((3,5-다이플로로페닐)설포닐)벤질)이미다조[1,2-a]피리딘-6-카르복사마이드(N-(4-((3,5-difluorophenyl)sulfonyl)benzyl)imidazo[1,2-a]pyridine-6-carboxamide) 및 화학식 3으로 표시되는 (Z)-2-(6-(4-클로로페녹시)헥실)-1-시아노-3-(피리딘-4(1H)-일이딘)구아니딘((Z)-2-(6-(4-chlorophenoxy)hexyl)-1-cyano-3-(pyridin-4(1H)-ylidene)guanidine)으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나일 수 있고, 바람직하게는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다:
[화학식 1]
Figure PCTKR2017007519-appb-I000001
[화학식 2]
Figure PCTKR2017007519-appb-I000002
[화학식 3]
Figure PCTKR2017007519-appb-I000003
본 발명에서 상기 "전이암"이란, 암세포가 원발 장기를 떠나 다른 장기로 이동하여 증식되어 발생된 암을 의미한다. 암이 신체 다른 부분으로 퍼지는 것은 크게 원발암에서 암 조직이 성장하여 직접적으로 주위 장기를 침습하는 것과 멀리 있는 다른 장기로 혈관이나 림프관을 따라 원격 전이를 하는 것으로 구분할 수 있다. 바람직하게는 다른 원발암에서 암이 위의 장기로 전이된 것을 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 "내성암"이란, 방사선 치료법 등과 같은 암 치료 요법 또는 암 치료용 약물, 특히 항암제 치료에 대하여 극히 낮은 감수성을 나타내어, 상기 치료법에 의해 증세가 호전, 완화, 경감 또는 치료증상을 나타내지 않는 암을 의미한다. 상기 내성암은 특정한 치료법에 대하여 처음부터 내성을 가질 수도 있고, 최초에는 내성을 나타내지 않았으나, 긴 시간의 치료로 인하여 암 세포 내의 유전자 변이 등에 의하여 동일한 치료에 대해 더 이상 감수성을 나타내지 않게 되어 발생할 수도 있다.
또한, 본 발명에서 상기 "재발암"이란, 최초 암의 발생 후 치료로 인해 완치 판정을 받은 후 암이 생긴 부위에 다시 암이 발생한 경우를 의미한다. 본 발명의 목적상 상피 중간엽 전이 과정을 통해 발생한 암의 재발일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 NamPT 저해제는 내성, 재발성, 또는 전이성을 갖는 암이라면 제한없이 적용될 수 있으나, 예를 들면, 내성, 재발성, 또는 전이성을 갖는 유방암, 담도암, 담낭암, 췌장암, 대장암, 자궁암, 식도암, 위암, 뇌암, 직장암, 폐암, 방광암, 신장암, 난소암, 전립선암, 자궁암, 두경부암, 피부암, 혈액암 및 간암 중에서 선택된 어느 하나의 암을 대상으로 할 수 있으며, 바람직하게는 내성, 재발성, 또는 전이성 위암, 대장암, 췌장암, 폐암 및 유방암 중에서 선택된 어느 하나 이상의 암을 대상으로 할 수 있다.
본 발명에서 상기 내성암, 재발암, 또는 전이암은 EMT 아형일 수 있다. 보다 상세하게 상기 전이암은 상피 중간엽 전이 과정을 통해 전이(metastasis) 및/또는 재발이 일어난 암이거나, 암 치료용 약물에 대한 내성을 가져 치료가 어려운 암일 수 있으며, 구체적인 암종은 특별히 제한하지 않고 예를 들면, EMT 아형의 유방암, 담도암, 담낭암, 췌장암, 대장암, 자궁암, 식도암, 위암, 뇌암, 직장암, 폐암, 방광암, 신장암, 난소암, 전립선암, 자궁암, 두경부암, 피부암, 혈액암 및 간암 중에서 선택된 어느 하나의 암을 대상으로 할 수 있으며, 바람직하게는 EMT 아형의 위암, 대장암, 췌장암, 폐암 및 유방암 중에서 선택된 어느 하나 이상의 암을 대상으로 할 수 있다.
본 발명의 일 구체 예에서 상기 EMT 아형은 SNAIL, E-cadherin, Vimentin 및 CD44로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자 또는 이에 의해 코딩되는 단백질이 과발현 또는 저발현된 것일 수 있으며, 바람직하게는 E-cadherin의 유전자 또는 상기 유전자로부터 코딩된 단백질이 저발현된 것이거나, 혹은 SNAIL, CD44 및 Vimentin으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자에 의해 코딩된 단백질이 과발현된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 다른 구체 예에서, 상기 EMT 아형은 상피 중간엽 전이 특징적 시그니처 유전자의 발현 수준을 측정하는 방법(BMC Medical Genomics 4, January 20, 2011)을 통해 분류된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 상피 중간엽 전이 특징적 시그니처 유전자는 과발현 유전자 및 저발현 유전자 중 어느 하나 이상일 수 있다(표 1 및 2).
단, 본 발명에서 상기 "상피 중간엽 전이 특정 스코어(signature score)"란, 목적하는 개체에서 상피 중간엽 전이 과발현 유전자의 발현 수준 평균값에서 상피 중간엽 전이 저발현 유전자의 발현 수준 평균값의 차이를 통하여 계산되는 값으로(BMC Medical Genomics 4, January 20, 2011), 상기 값을 통하여 목적하는 개체를 EMT 아형과 EMT 아형이 아닌 군으로 분류할 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 상피 중간엽 전이 특징적 과발현 유전자는 ADAM23, ADAMTS1, AFF3, AK5, AKAP12, ALPK2, ANGPTL2, ANKRD1, ANTXR1, ANXA6, AOX1, AP1S2, ARMCX1, ATP8B2, ATP8B3, AXL, BDNF, BICC1, BNC2, BVES, FAM171A1, ZCCHC24, C16orf45, C1S, GLIPR2, CAP2, CCL2, CDH11, CDH2, CDH4, CHN1, CLDN11, CLIP3, CMTM3, COL12A1, COL1A2, COL3A1, COL4A1, COL5A1, COL5A2, COL6A1, CPA4, CTGF, CYBRD1, DAB2, DFNA5, DIO2, DKK3, DLC1, DOCK10, DPYSL3, EDIL3, ELOVL2, EML1, EMP3, EPB41L5, EPDR1, EVI2A, F2R, FAM101B, FAT4, FBN1, FGF2, FGF5, FGFR1, FHL1, FLRT2, FSTL1, GFPT2, GLIPR1, COLGALT2, GNB4, GNG11, GPC6, GPR176, GREM1, HAS2, HEG1, HS3ST3A1, HTRA1, IGFBP7, IL13RA2, JAM3, KIRREL, LAMA4, LEPREL1, LGALS1, LHFP, LIX1L, LOX, MAP1B, MMP2, MRAS, MSRB3, NAP1L3, NAV3, NDN, NEGR1, NEXN, NID1, NRG1, NUDT11, PAPPA, PDE7B, PLAGL1, PMP22, PNMA2, POPDC3, POSTN, PRKD1, PRR16, PTGIS, PTRF, PTX3, RBM24, RBMS3, RBPMS2, RECK, RFTN1, SERPINE1, SIRPA, SLC2A3, SLC47A1, SPARC, SRGN, SRPX, ST3GAL2, SUSD5, SYDE1, TBXA2R, TCF4, TGFB2, TMEM158, TMEM47, TMSB15A, TNFRSF19, TRPA1, TTC28, TTLL7, TUB, TUBA1A, UCHL1, VIM, WIPF1, WNT5B, ZEB1, ZEB2, ZFPM2, ZNF788 로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 상피 중간엽 전이 특징적 저발현 유전자는 ACPP, AGR3, ALDH3B2, ANK3, ANKRD22, ANXA9, AP1M2, AQP3, ARHGAP8, ARHGDIB, PRR15L, ATP2C2, B3GNT3, BLNK, BSPRY, C11orf52, MISP, C1orf106, C1orf116, C1orf210, TTC39A, CCDC64B, CD24, CDH1, CDH3, CDS1, CEACAM5, CEACAM6, CGN, CKMT1B, CLDN4, CLDN7, CNKSR1, CNTNAP2, CTAGE4, DAPP1, DENND2D, DMKN, DSC2, DSP, EHF, ELF3, ELF5, EPN3, EPPK1, ERBB3, ERP27, FA2H, FAAH2, FAM110C, FAM83A, FAM84A, FAM84B, FBP1, FGD2, FGFBP1, FUT1, FUT3, FXYD3, GALNT3, GCNT3, GJB6, GOLT1A, GPR110, GPR87, GPX2, GRAMD2, GRHL1, GRHL2, HOOK1, HS3ST1, HS6ST2, IL1RN, ILDR1, INPP4B, IRF6, ITGB6, KLK10, KLK5, KLK6, KLK8, KRT16, KRT19, KRT5, KRTCAP3, LAMA3, LAMB3, LAMC2, LCN2, LCP1, LIPG, MAL2, MAP7, MAPK13, MARVELD2, MARVELD3, MB, MBNL3, MPP7, MUC20, MYH14, MYO5B, NPNT, OR2A4, OVOL2, PAK6, PKP3, PLA2G10, POU2F3, PPL, PPP1R14C, PROM2, PRR15, PRSS8, PTAFR, PVRL4, RAB25, RAPGEF5, RASEF, RASGEF1B, ESRP1, ESRP2, S100A14, S100A8, S100A9, S100P, SCEL, SCNN1A, SERPINB5, SH2D3A, SH3YL1, SLC6A14, SLPI, SORBS2, SPINK5, SPINT1, SPINT2, SPRR1A, SPRR1B, SPRR3, ST14, STEAP4, STX19, SYK, SYT7, TMC4, TMC5, TMEM125, TMEM30B, TMEM45B, TMPRSS11E, TMPRSS13, TMPRSS4, TOX3, TRIM29, TSPAN1, TTC22, TTC9, VTCN1, WDR72, WFDC2으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 상피 중간엽 전이 특징적 과발현 유전자 및 저발현 유전자와 그 서열번호 Entrez ID는 각각 하기 표 1 및 2와 같다.
과발현 유전자 과발현 유전자 과발현 유전자
유전자 서열번호(Entrez ID) 유전자 서열번호(Entrez ID) 유전자 서열번호(Entrez ID)
ADAM23 NM_8745 DPYSL3 NM_1809 NRG1 NM_3084
ADAMTS1 NM_9510 EDIL3 NM_10085 NUDT11 NM_55190
AFF3 NM_3899 ELOVL2 NM_54898 PAPPA NM_5069
AK5 NM_26289 EML1 NM_2009 PDE7B NM_27115
AKAP12 NM_9590 EMP3 NM_2014 PLAGL1 NM_5325
ALPK2 NM_115701 EPB41L5 NM_57669 PMP22 NM_5376
ANGPTL2 NM_23452 EPDR1 NM_54749 PNMA2 NM_10687
ANKRD1 NM_27063 EVI2A NM_2123 POPDC3 NM_64208
ANTXR1 NM_84168 F2R NM_2149 POSTN NM_10631
ANXA6 NM_309 FAM101B NM_359845 PRKD1 NM_5587
AOX1 NM_316 FAT4 NM_79633 PRR16 NM_51334
AP1S2 NM_8905 FBN1 NM_2200 PTGIS NM_5740
ARMCX1 NM_51309 FGF2 NM_2247 PTRF NM_284119
ATP8B2 NM_57198 FGF5 NM_2250 PTX3 NM_5806
ATP8B3 NM_148229 FGFR1 NM_2260 RBM24 NM_221662
AXL NM_558 FHL1 NM_2273 RBMS3 NM_27303
BDNF NM_627 FLRT2 NM_23768 RBPMS2 NM_348093
BICC1 NM_80114 FSTL1 NM_11167 RECK NM_8434
BNC2 NM_54796 GFPT2 NM_9945 RFTN1 NM_23180
BVES NM_11149 GLIPR1 NM_11010 SERPINE1 NM_5054
FAM171A1 NM_221061 COLGALT2 NM_23127 SIRPA NM_140885
ZCCHC24 NM_219654 GNB4 NM_59345 SLC2A3 NM_6515
C16orf45 NM_89927 GNG11 NM_2791 SLC47A1 NM_55244
C1S NM_716 GPC6 NM_10082 SPARC NM_6678
GLIPR2 NM_152007 GPR176 NM_11245 SRGN NM_5552
CAP2 NM_10486 GREM1 NM_26585 SRPX NM_8406
CCL2 NM_6347 HAS2 NM_3037 ST3GAL2 NM_6483
CDH11 NM_1009 HEG1 NM_57493 SUSD5 NM_26032
CDH2 NM_1000 HS3ST3A1 NM_9955 SYDE1 NM_85360
CDH4 NM_1002 HTRA1 NM_5654 TBXA2R NM_6915
CHN1 NM_1123 IGFBP7 NM_3490 TCF4 NM_6925
CLDN11 NM_5010 IL13RA2 NM_3598 TGFB2 NM_7042
CLIP3 NM_25999 JAM3 NM_83700 TMEM158 NM_25907
CMTM3 NM_123920 KIRREL NM_55243 TMEM47 NM_83604
COL12A1 NM_1303 LAMA4 NM_3910 TMSB15A NM_11013
COL1A2 NM_1278 LEPREL1 NM_55214 TNFRSF19 NM_55504
COL3A1 NM_1281 LGALS1 NM_3956 TRPA1 NM_8989
COL4A1 NM_1282 LHFP NM_10186 TTC28 NM_23331
COL5A1 NM_1289 LIX1L NM_128077 TTLL7 NM_79739
COL5A2 NM_1290 LOX NM_4015 TUB NM_7275
COL6A1 NM_1291 MAP1B NM_4131 TUBA1A NM_7846
CPA4 NM_51200 MMP2 NM_4313 UCHL1 NM_7345
CTGF NM_1490 MRAS NM_22808 VIM NM_7431
CYBRD1 NM_79901 MSRB3 NM_253827 WIPF1 NM_7456
DAB2 NM_1601 NAP1L3 NM_4675 WNT5B NM_81029
DFNA5 NM_1687 NAV3 NM_89795 ZEB1 NM_6935
DIO2 NM_1734 NDN NM_4692 ZEB2 NM_9839
DKK3 NM_27122 NEGR1 NM_257194 ZFPM2 NM_23414
DLC1 NM_10395 NEXN NM_91624 ZNF788 NM_388507
DOCK10 NM_55619 NID1 NM_4811
저발현 유전자 저발현 유전자 저발현 유전자
유전자 서열번호(Entrez ID) 유전자 서열번호(Entrez ID) 유전자 서열번호(Entrez ID)
ACPP NM_55 FGD2 NM_221472 POU2F3 NM_25833
AGR3 NM_155465 FGFBP1 NM_9982 PPL NM_5493
ALDH3B2 NM_222 FUT1 NM_2523 PPP1R14C NM_81706
ANK3 NM_288 FUT3 NM_2525 PROM2 NM_150696
ANKRD22 NM_118932 FXYD3 NM_5349 PRR15 NM_222171
ANXA9 NM_8416 GALNT3 NM_2591 PRSS8 NM_5652
AP1M2 NM_10053 GCNT3 NM_9245 PTAFR NM_5724
AQP3 NM_360 GJB6 NM_10804 PVRL4 NM_81607
ARHGAP8 NM_23779 GOLT1A NM_127845 RAB25 NM_57111
ARHGDIB NM_397 ADGRF1 NM_266977 RAPGEF5 NM_9771
PRR15L NM_79170 GPR87 NM_53836 RASEF NM_158158
ATP2C2 NM_9914 GPX2 NM_2877 RASGEF1B NM_153020
B3GNT3 NM_10331 GRAMD2 NM_196996 ESRP1 NM_54845
BLNK NM_29760 GRHL1 NM_29841 ESRP2 NM_80004
BSPRY NM_54836 GRHL2 NM_79977 S100A14 NM_57402
C11orf52 NM_91894 HOOK1 NM_51361 S100A8 NM_6279
MISP NM_126353 HS3ST1 NM_9957 S100A9 NM_6280
C1orf106 NM_55765 HS6ST2 NM_90161 S100P NM_6286
C1orf116 NM_79098 IL1RN NM_3557 SCEL NM_8796
C1orf210 NM_149466 ILDR1 NM_286676 SCNN1A NM_6337
TTC39A NM_22996 INPP4B NM_8821 SERPINB5 NM_5268
CCDC64B NM_146439 IRF6 NM_3664 SH2D3A NM_10045
CD24 NM_100133941 ITGB6 NM_3694 SH3YL1 NM_26751
CDH1 NM_999 KLK10 NM_5655 SLC6A14 NM_11254
CDH3 NM_1001 KLK5 NM_25818 SLPI NM_6590
CDS1 NM_1040 KLK6 NM_5653 SORBS2 NM_8470
CEACAM5 NM_1048 KLK8 NM_11202 SPINK5 NM_11005
CEACAM6 NM_4680 KRT16 NM_3868 SPINT1 NM_6692
CGN NM_57530 KRT19 NM_3880 SPINT2 NM_10653
CKMT1B NM_1159 KRT5 NM_3852 SPRR1A NM_6698
CLDN4 NM_1364 KRTCAP3 NM_200634 SPRR1B NM_6699
CLDN7 NM_1366 LAMA3 NM_3909 SPRR3 NM_6707
CNKSR1 NM_10256 LAMB3 NM_3914 ST14 NM_6768
CNTNAP2 NM_26047 LAMC2 NM_3918 STEAP4 NM_79689
CTAGE4 NM_100128553 LCN2 NM_3934 STX19 NM_415117
DAPP1 NM_27071 LCP1 NM_3936 SYK NM_6850
DENND2D NM_79961 LIPG NM_9388 SYT7 NM_9066
DMKN NM_93099 MAL2 NM_114569 TMC4 NM_147798
DSC2 NM_1824 MAP7 NM_9053 TMC5 NM_79838
DSP NM_1832 MAPK13 NM_5603 TMEM125 NM_128218
EHF NM_26298 MARVELD2 NM_153562 TMEM30B NM_161291
ELF3 NM_1999 MARVELD3 NM_91862 TMEM45B NM_120224
ELF5 NM_2001 MB NM_4151 TMPRSS11E NM_28983
EPN3 NM_55040 MBNL3 NM_55796 TMPRSS13 NM_84000
EPPK1 NM_83481 MPP7 NM_143098 TMPRSS4 NM_56649
ERBB3 NM_2065 MUC20 NM_200958 TOX3 NM_27324
ERP27 NM_121506 MYH14 NM_79784 TRIM29 NM_23650
FA2H NM_79152 MYO5B NM_4645 TSPAN1 NM_10103
FAAH2 NM_158584 NPNT NM_255743 TTC22 NM_55001
FAM110C NM_642273 OR2A4 NM_79541 TTC9 NM_23508
FAM83A NM_84985 OVOL2 NM_58495 VTCN1 NM_79679
FAM84A NM_151354 PAK6 NM_56924 WDR72 NM_256764
FAM84B NM_157638 PKP3 NM_11187 WFDC2 NM_10406
FBP1 NM_2203 PLA2G10 NM_8399
본 발명에서, 상기 EMT 아형에서 특징적으로 과발현 또는 저발현되는 유전자 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현 수준을 측정하는 방법은, 예를 들면 웨스턴 블럿 분석(Western blot assay), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(Radioimmunoassay; RIA), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케이트(rocket) 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법 (Immunoprecipitation assay), 보체고정분석법 (Complement Fixation Assay), FACS, RNA-서열 (RNA-sequencing) 분석, 마이크로어레이 (microarray), RNA-스코프 (RNA-scope), N-카운터 (nCounter), RPPA (reverse phase protein array), FPPA (forward phase protein array), LC-MS/MS, ABCD (antibody barcoding with photocleavable DNA) 및 단백질 칩 등을 이용하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 아니한다.
또한, 본 발명에서는 상기 내성암, 재발암, 또는 전이암은 EMT 아형 중에서도 특히 NAPRT(Nicotinic acid phosphoribosyltransferase) 단백질이 저발현(down regulated) 되어 있는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 NAPRT의 발현 수준과 정상 대조군의 발현 수준을 비교하여 상기 단백질의 발현이 낮은 것으로 평가되는 것일 수 있다. 본 발명에 따른 상기 NamPT 저해제를 투여하는 경우, EMT 아형에 속하며 NAPRT의 발현이 저하되어 있는 암 세포에서 NAD의 생합성을 억제시켜 세포 사멸을 보다 효과적으로 유도할 수 있다.
본 발명에서 상기 내성암, 재발암, 또는 전이암은 EMT 아형 중에서도 특히 NAPRT 단백질이 저발현되어 있는 암종이라면 제한없이 포함될 수 있고, 예를 들면 상기 NAPRT 단백질이 저발현된 유방암, 담도암, 담낭암, 췌장암, 대장암, 자궁암, 식도암, 위암, 뇌암, 직장암, 폐암, 방광암, 신장암, 난소암, 전립선암, 자궁암, 두경부암, 피부암, 혈액암 및 간암 중에서 선택된 어느 하나의 암을 대상으로 할 수 있으며, 바람직하게는 NAPRT 단백질이 저발현된 위암, 대장암, 췌장암, 폐암 또는 유방암일 수 있다.
단, 본 발명에서 상기 "NAPRT 단백질"은, 생채 내에서 니코티닉 산(nicotinic acid)을 기질로 하여 NAD 생합성 과정에 관여하는 효소이다. 상기 NAD를 생합성하는 과정은 데노보 (De novo) 합성에 의한 방법과 회수경로 (salvage pathway)를 통한 합성 방법이 있으며 이 중 회수경로에 의한 합성은 NAPRT(Nicotinic acid phosphoribosyltransferase) 효소에 의한 과정 및 니코틴아마이드(nicotinamide)를 기질로 하는 NamPT(Nicotinamide phosphoribosyl transferase)과정으로 구성되어 있는데, 상기 두개의 과정 중 어느 하나가 작동하지 않는 경우 나머지 하나의 과정이 정상적으로 작동 되어야 NAD 생합성이 원활하게 이루어져 ROS 조절 및 에너지 대사 조절 과정이 정상적으로 일어나게 된다.
또한, 본 발명에서 상기 내성암, 재발암, 또는 전이암은 면역 염색에 의하여 미만형(diffuse type) 위암으로 분류된 것일 수 있다. 본 발명에서 상기 미만형 위암은 NAPRT 발현 수준이 낮아, 본 발명에 따른 상기 NamPT 저해제를 상기 미만형 위암에 투여하는 경우 NAD의 생합성을 억제시켜 세포 사멸을 더욱 효과적으로 유도할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 추가로 다른 항암제와 병용 투여할 수 있으며, 이를 통해서 일반적인 암세포 증식 및 암 전이를 효과적으로 억제하여 암의 치료에 사용될 수 있다.
여기서 상기 항암제로는 나이트로젠 머스타드, 이마티닙, 옥살리플라틴, 리툭시맙, 엘로티닙, 네라티닙, 라파티닙, 제피티닙, 반데타닙, 니로티닙, 세마사닙, 보수티닙, 악시티닙, 세디라닙, 레스타우르티닙, 트라스투주맙, 게피티니브, 보르테조밉, 수니티닙, 카보플라틴, 소라페닙, 베바시주맙, 시스플라틴, 세툭시맙, 비스쿰알붐, 아스파라기나제, 트레티노인, 하이드록시카바마이드, 다사티닙, 에스트라머스틴, 겜투주맵오조가마이신, 이브리투모맙튜세탄, 헵타플라틴, 메칠아미노레불린산, 암사크린, 알렘투주맙, 프로카르바진, 알프로스타딜, 질산홀뮴 키토산, 젬시타빈, 독시플루리딘, 페메트렉세드, 테가푸르, 카페시타빈, 기메라신, 오테라실, 아자시티딘, 메토트렉세이트, 우라실, 시타라빈, 플루오로우라실, 플루다가빈, 에노시타빈, 플루타미드, 카페시타빈, 데시타빈, 머캅토푸린, 티오구아닌, 클라드리빈, 카르모퍼, 랄티트렉세드, 도세탁셀, 파클리탁셀, 이리노테칸, 벨로테칸, 토포테칸, 비노렐빈, 에토포시드, 빈블라스틴, 이다루비신, 미토마이신, 블레로마이신, 닥티노마이신, 피라루비신, 아클라루비신, 페프로마이신, 템시롤리무스, 테모졸로마이드, 부설판, 이포스파미드, 사이클로포스파미드, 멜파란, 알트레트민, 다카바진, 치오테파, 니무스틴, 클로람부실, 미토락톨, 레우코보린, 트레토닌, 엑스메스탄, 아미노글루테시미드, 아나그렐리드, 올라파립, 나벨빈, 파드라졸, 타목시펜, 토레미펜, 테스토락톤, 아나스트로졸, 레트로졸, 보로졸, 비칼루타미드, 로무스틴, 5FU, 보리노스텟, 엔티노스텟 및 카르무스틴으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 약학 조성물은 캡슐, 정제, 과립, 주사제, 연고제, 분말 또는 음료 형태임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 약학 조성물은 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 약제적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체는 경구 투여 시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형할 수 있다.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다. 본원에 사용된 용어 "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 약학 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여시간, 투여경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약학 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약무형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 0.0001 내지 50mg/kg 또는 0.001 내지 50mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 따른 의약 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형화될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 암 중에서도 특히 내성암, 재발암, 또는 전이암 세포의 세포 증식 및 세포사멸을 효과적으로 유도하여 암을 예방 및/또는 치료하는데 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 EMT 아형 유전자 특징 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 EMT 관련 단백질 발현 확인을 위한 웨스턴 블롯 분석(Western blot assay) 결과를 나타낸 것이다.
도 3 내지 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 마트리겔(Matrigel) 침습(invasion)분석 결과를 나타낸 것이다.
도 6 내지 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 구 형성(Sphere formation) 결과를 나타낸 것이다.
도 9 내지 17은 본 발명의 일 실시예에 따른 1차 약물 스크리닝 결과를 나타낸 것이다.
도 18 및 19는 본 발명의 일 실시예에 따른 2차 약물 스크리닝 결과를 나타낸 것이다.
도 20은 본 발명의 일 실시예에 따른 EMT 아형 세포주 생존율 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 21은 본 발명의 일 실시예에 따른 NAPRT 단백질 발현 확인을 위한 웨스턴 블롯 분석(Western blot assay) 결과를 나타낸 것이다.
도 22는 본 발명의 일 실시예에 따른 NAD 양의 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 23 및 24는 본 발명의 일 실시예에 따른 EMT 아형 세포주 생존율 회복 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 25 내지 38은 본 발명의 일 실시예에 따른 다섯개 암종의 EMT 아형과 비-EMT 아형, 정상조직에서의 NAPRT 유전자 발현에 대한 결과를 나타낸 것이다.
도 39는 본 발명의 일 실시예에 따른 종양샘플에서 NAPRT 유전자 발현에 대한 메타 분석 결과를 나타낸 것이다.
본 발명의 NamPT(Nicotinamide phosphoribosyltransferase) 저해제를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물은 상피 중간엽 전이(Epithelial-mesenchymal transition; EMT) 아형의 특성을 갖는 내성암, 재발암, 또는 전이암 세포의 세포 증식 및 세포사멸을 효과적으로 유도하여 암을 예방 및/또는 치료하는데 매우 효과적으로 사용될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
[ 실시예 ]
[ 실시예 1] EMT 아형 위암 세포주 배양 및 시퀀싱 분석 시료 준비
본 발명에 따른 ((E)-N-[4-(1-벤조일피페리딘-4-일)부틸]-3-피리딘-3-일프로프-2-엔아마이드) ((E)-N-[4-(1-benzoylpiperidin-4-yl)butyl]-3-pyridin-3-ylprop-2-enamide) (이하 'FK866'이라함.)에 의한 EMT 아형의 세포 생존 저해 확인을 위하여 위암 세포주 YCC2, SNU216, AGS, MKN28, MKN74, SNU1967, SNU16, SNU719, MKN45, OCUM1, NCIN87, YCC3, NCC19, NCC20, NCC59, NCC24, SNU620, KATOIII, SNU601, Hs746T, SNU668, YCC11, MKN1, SK4, SNU1750, SNU484, SNU638, FU97, 및 SNU1(YCC2, YCC3, 및 YCC11은 연세 암전이연구센터에서 확립하였고, 26개의 세포주는 ATCC 또는 한국 세포주 은행(KCLB)에서 얻을 수 있는 세포주를 사용하였다.)를 RPMI1640과 배지 볼륨의 10%에 해당하는 우태아혈청(FBS; Gibco)과 배지 볼륨의 1%에 해당하는 항생제 (penicillin-streptomycin; Invitrogen)를 포함하도록 하는 영양배지로 37℃, 5 %, CO2 배양기 내에서 배양을 실시하였다.
[ 실시예 2] 상피 중간엽 전이 (Epithelial mesenchymal transition; EMT ) 아 형
2-1. 상피 중간엽 전이(EMT) 유전자 특징(signature) 분석
본 발명에서 상피 중간엽 전이 유전자 특징으로 분류하기 위하여 ACRG의 위암 코호트 EMT 아형 분류에 사용된 유전자 특징으로서 과발현되는(up-regulated) 149개 유전자와 저발현되는(down-regulated) 161개 유전자를 이용한 자율 계층 클러스터링(unsupervised hierarchical clustering)을 수행하였다.
상기 상피 중간엽 전이 유전자 특징 자율 계층 클러스터링 분석 방식은 다음과 같다. 위암 세포주의 경우 RNA-서열 분석을 통해 28종의 세포주의 전사체에 대한 정규화된 발현양을 계산하였다. 상기 발현양 분석으로 얻은 FPKM값에 1을 더한 뒤 log2 수준으로 변환하여 분석에 사용하였다. 상기 149개의 과발현 유전자와 161개의 저발현 유전자의 발현값으로 자율 계층 클러스터링을 수행하기 위해 R 패키지인 hclust를 사용하였다. 거리계산에는 유클리디안 (Euclidean) 방법으로 최대 링키지 (maximum linkage)를 이용하여 계산하여, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에서 보는 바와 같이, Hs746T, SNU484, YCC11, SNU1750, SK4, SNU668 및 MKN1 세포주가 EMT 아형에 속하는 것을 확인할 수 있었다.
2-2. 상피 중간엽 전이 단백질 발현 확인
상기 EMT 아형 세포주의 상피 중간엽 전이 특성에 대하여 검증하기 위하여 상피 중간엽 전이 마커 단백질 발현을 웨스턴 블롯 분석(Western blot assay)으로 확인 하였다.
상기 웨스턴 블롯 분석에 사용된 단백질의 준비 방법은 하기와 같다. 상기 담도암 세포주에 PBS를 처리하여 수득(harvest)하고, PBS로 세척 후 단백질 분해 억제제가 포함되어 있는 세포 용해 버퍼(cell lysis buffer)인 RIPA버퍼를 이용하여 용해시켰다. 상기 용해된 용액을 원심분리기를 이용하여 전체 용액을 분획한 뒤, 단백질이 포함된 용액만을 추출하였다. 상기 추출된 단백질은 브래드포드(Bradford) 방법에 의해 정량화 하였다. 정량화를 통해 얻은 동일 농도의 단백질을 SDS-폴리아크릴아미드(polyacrylamide) 겔 전기영동을 수행하여 분리한 뒤, PVDF 막에 옮겼다. 단백질이 옮겨진 막은 비 특이적 결합을 줄이기 위하여 5% 탈지유(non-fat milk)가 포함된 TBS-T(Tris-buffered saline/0.1% Tween-20)용액으로 상온에서 1시간 동안 차단(blocking)한 후, 5% BSA 용액에 희석된 1차 항체를 4℃ 조건에서 12시간 이상 동안 반응시킨 뒤, 2차 항체(1:5000 희석)를 1시간 동안 상온에서 반응시켰다. 시각화를 위해서는 강화된 화학발광 시스템(Enhanced chemiluminescence system)을 이용하였다.
웨스턴 블롯 분석은 상피 중간엽 전이 마커로 보고되어 있는 E-cadherin, Vimentin 및 Snail마커를 이용하여 수행하였고, 발현의 정량적 비교를 위하여 항존(housekeeping) 단백질인 β-actin을 이용하였으며, 그 결과는 도 2에 나타내었다.
도 2에서 보는 바와 같이, 상피 중간엽 전이 세포주에서는 E-cadherin의 발현이 낮으며, 발현 정도의 차이가 존재하긴 하지만 Vimentin 및 snail의 발현이 상피 중간엽 전이가 일어나지 않는 상피 중간엽 전이가 일어나지 않은 (이하 '비-EMT'라 함.) 세포주와 비교하여 증가되어 있는 것을 확인할 수 있었다. 반면에, 비EMT 세포주의 경우에서는 상피 중간엽 전이 세포주와 발현 패턴이 정 반대로 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
2-3. EMT 아형 세포주 침습(invasion) 확인
본 발명에 따른 EMT 아형 세포주의 침습(invasion) 여부를 확인하기 위하여 마트리겔(matrigel) 침습 분석을 수행하였다.
마트리겔 침습 분석 방법은 마트리겔이 300μg/ml의 농도로 코팅되어 있는 트랜스웰(transwell)에 상피 중간엽 전이 세포주 및 대조군을 무혈청 배지에서 배양하였다. 트랜스웰 아래쪽은 우태아혈청(FBS)가 포함되어 있는 영양배지로 하여 37℃, 5 %, CO2 조건으로 배양기 내에서 배양하였다. 상기 대조군 세포는 상피 중간엽 전이가 일어나지 않는 세포주인 MKN45 및 NCC59 세포를 사용하였다. 상기 각각의 분주된 세포주를 48시간 배양한 뒤, 마트리겔 막 위쪽의 세포를 면섬유를 이용하여 닦아내고, 상기 마트리겔을 메탄올로 고정시킨 후 0.2% 크리스탈 바이올렛으로 염색하여 사진 촬영하였다. 또한, 상기 막에 포함되어 있는 세포의 수를 집계하여, 그 결과는 도 3 내지 5에 나타내었다.
도 3 내지 5의 결과에서 알 수 있듯이, EMT 아형 세포주의 막 침습은 세포주 마다 차이가 존재하였지만, SNU1750을 제외한 모든 세포주에서 대조군인 비EMT 세포주에 비하여 높은 비율로 막 침습이 일어나는 것을 확인할 수 있었다.
2-4. EMT 아형 세포주 구 형성(sphere formation) 확인
상기 EMT 아형 세포주의 줄기세포성(stemness)을 확인하기 위하여 구 형성(sphere formation) 실험을 수행하였다.
상기 구 형성 실험은 혈청이 포함되지 않은 DMEM-F12 배지(20ng/ml EGF, 20ng/ml 기초 FGF, 2% B27 보충물)에서 상기 상피 중간엽 전이 아형 세포주 및 대조군인 MKN45를 배양하여 구 형성 여부에 대하여 현미경으로 관찰하였다. 또한, 구를 형성한 세포의 수를 집계하여, 그 결과를 도 6 내지 8에 나타내었다.
도 6 내지 8에서 보는 바와 같이, SK4, Hs746T, SNU484, SNU1750, YCC11 및 SNU668 세포주의 경우 대조군인 MKN45와 NCC59에 비하여 구 형성 능력이 증가되어 있는 것을 확인할 수 있었다.
상기 결과를 통하여, 본 발명에 따른 EMT 아형 세포주 SK4, Hs746T, SNU484, SNU1750, YCC11 및 SNU668은 암 줄기세포성을 갖는다는 것을 알 수 있다.
[ 실시예 3] EMT 아형을 이용한 1차 약물 스크리닝
상기 실시예 2에 의해 분류된 7개의 EMT 아형 세포주를 이용하여 미국 FDA에서 승인 받은 1132개 소분자 약리 화합물 및 213개의 항암 소분자 화합물에 대한 약물 민감도를 측정 하였다. 상기 소분자 약리 화합물은 종양학, 심장학, 항염증, 면역학, 신경 정신과 및 항암에 관련되고, 상기 항암 소분자 화합물은 항암 효과가 있는 것으로 알려져 있으며 전임상, 임상시험 단계에 있거나 시험이 완료된 물질을 사용하였다. 모든 물질은 Selleckchem에서 구입하였다.
상기 약물 스크리닝을 위하여 본 발명에 따른 7개의 EMT 아형 위암 세포주 각각을 96 웰-플레이트에 웰당 5,000개씩 분주한 뒤, 24시간이 되는 때 세포 배양액에서의 약물 농도를 2.5μM에 해당하게 희석하여, 바이오맥 리퀴드 핸들러 기기(베크만사)를 이용해 세포에 첨가하였다. 또한, 대조군으로 실험군과 같은 농도의 DMSO를 처리 하였다. 상기 세포는 37℃, 5 % CO2 배양기 내에서 72시간 동안 배양한 뒤, CellTiter-Glo 분석 키트(Promega사)를 이용하여 세포 생존율(cell viability)을 측정하였고, 그 결과를 도 9 내지 15에 나타낸 뒤, 상기 세포 생존율 값으로 계층적 클러스터링 분석을 수행하여 생존율 값을 0.1 단위로 나누어 해당 생존율 값 이하에 해당되는 세포주의 개수에 따라 선택되는 약물의 수를 도 16 및 17에 나타내었다.
도 17에서 보는 바와 같이, 상피 중간엽 전이 아형 세포주에 생존율 한계점(threshold) 0.5 이하에 해당하는 세포주 수가 4개 이상에 해당하는 소분자 화합물은 총 63개에 해당하는 것으로 확인할 수 있었다. 상기 63개의 소분자 화합물은 DNA 합성을 타겟하는 약물인 Topoisomerase 관련한 약물 9건, 세포 주기 저해제 6건, HDAC 저해제 8건, EGFR, HER2, PIK3CA 및 src 관련 약물 3건, mTOR 및 PI3K 저해제 4건, proteasome관련 약물 4건, Autophagy관련 약물 2건, microtubule관련 5건, DNA/RNA 손상 관련 2건, ALK 관련 2건, Ubiquitine ligase 3건, 감염 관련 6건 및 기타 3건을 확인할 수 있었다(표 3).
타겟(Target) 약물(Drug)
Topoisomerase, DNA synthesis Epirubicin Hydrochloride, Mitoxantrone Hydrochloride, Camptothecin, Doxorubicin(Adriamycin), Gemcitabine, Daunorubicin HCl(Daunocycine HCl), Gemcitabine HCl(Gemzar), Clofarabine, Niclosamide(Niclocide), Fludarabine Phosphate(Fludara)
Cell cycle (Aurora, cdk plk1, etc) Danusertib(PHA-739358), AT9283, Flavopiridol(Alvocidib) HCl, BI2536, GSK461364, BI6727(Volasertib), SB743921, Ispinesib(SB-715992)
HDAC Trichostatin A(TSA), PCI-24781, CUDC-101, JNJ-26481585, Belinostat(PXD101), SB939(Paracinostat), AR-42(HDAC-42), Vorinostat(SAHA)
EGFR, HER2, PIK3CA, src Neratinib(HKI-272), CUDC-101, Ponatinib(AP24534), GSK2126458, PIK-75, KX2-391
mTOR, PI3K Torin 2, BEZ235(NVP-BEZ235), PI-103, INK 128(MLN0128), BKM120(NVP-BKM120)
Proteasome Carfilzomib(PR-171), MLN9708, Bortezomib(Velcade), MLN2238
Autophagy Geldanamycin, Nocodazole, Obatoclax mesylate(GX15-070)
microtubule Paclitaxel(Taxol), vinblastine, Epothilone A
DNA/RNA damage(chk1, chk2) AZD7762, LY2603618(IC-83)
ALK LDN193189, TAE684(NVP-TAE684)
Hsp30, Ubiquitine ligase BAY 11-7082(BAY 11-7821), YM155
Infection Pynithione zinc, Thonzonium Bromide, Fenbendazole(Panacur), Albendazole(Albenza), Cetylpyridinium Chloride, Triptolide, Flubendazole(Flutelmium)
Etc Na+, K+-ATPase inhibitor, NampT inhibitor, acute lymphocytic leukemia, PTPMT1, anti-cancer, natural taxoid
[ 실시예 4] EMT 아형을 이용한 2차 약물 스크리닝
상기 실시예 3을 통해 얻은 63개의 소분자 화합물을 이용하여 상기 29개의 위암 세포주를 각각 96 웰-플레이트에 웰당 5,000개씩 분주한 뒤, 24시간이 되는 때 세포 배양액에서의 약물 농도를 로그 연속 희석 방법으로 최소 0.5nM 내지 최대 50 μM에 해당하게 12개의 농도로 희석하여, 바이오맥 리퀴드 핸들러 기기(베크만사)를 이용해 세포에 첨가하였다. 상기 세포는 37℃, 5 % CO2 배양기 내에서 72시간 동안 배양한 뒤, CellTiter-Glo 분석 키트(Promega사)를 이용하여 세포 생존율(cell viability)을 측정하였다. 상기 측정 값은 63종의 약물과 29종의 세포주 각각에 대하여 약물당 12개의 농도에 대한 세포 생존율 값을 얻었다. 상기 생존율 값으로 trapezoidal 방법을 사용하여 63개의 약물에 대한 세포주 특이적 민감도를 나타내는 지표인 AUC(Area under the curve)값을 계산하여, 그 결과를 도 18에 나타내었다. 또한, EMT 아형과 비-EMT 아형 간에서 AUC값의 차이를 기준으로 상기 63개의 약물을 분류하기 위하여, EMT 위암 세포주 7개의 AUC값의 중간값과 비-EMT 세포주 22개의 AUC 중간값 사이의 차이를 계산하였다. 이와 더불어 두 그룹간의 유의한 차이를 확인하기 위해 Student t-test를 수행하여 얻은 p값을 기준으로 63개 약물을 분류하여, 그 결과를 도 19에 나타내었다.
도 18에서 보는 바와 같이, AUC 값이 낮은(파란색) 약물의 경우 해당 세포주에서 약물 민감도가 높은 것으로 확인할 수 있었다.
또한, 도 19에서 보는 바와 같이, FK866이 EMT 아형의 위암과 비-EMT 아형의 위암 세포주 사이에 가장 큰 AUC 차이를 보이며 유의한 p-값을 가짐을 확인하였다.
[ 실시예 5] EMT 아형 위암 세포주에서 생존율 확인
상기 EMT 아형 세포주에서 FK866에 의한 생존율 저해 효과를 확인하였다. 상기 세포주 각각에 FK866을 0 내지 50 μM 투여하고 72시간 배양한 뒤, 상기 실시예 3의 방식에 따라 생존율을 측정하였고, 그 결과를 도 20에 나타내었다.
도 20에서 보는 바와 같이, SK4을 제외한 EMT 아형에 속하는 6개의 세포주는 FK866의 농도가 높아짐에 따라 그 생존율이 저하되는 것을 확인할 수 있었다. 특히, EMT 아형에 속하는 세포주에서는 세포 종류에 따른 차이점이 존재하기는 하였지만 0.005028904 μM 정도의 낮은 농도에서도 세포 생존저해 효과가 나타나는 것을 확인하였다. 반면, 대부분의 비-EMT 아형 세포주는 50 μM에서도 세포 생존 저해 효과가 나타나지 않는 것을 확인할 수 있었다.
상기 결과를 통해, 본 발명에 따른 FK866은 EMT 아형을 갖는 위암 세포주에서 치료 효능이 있을 것을 알 수 있다.
[ 실시예 6] NAPRT (Nicotinic acid phosphoribosyl transferse ) 발현 확인
상기 실시예 2에서 나타난 EMT 아형 세포에서 생존저해 효과가 NAPRT 단백질 발현 여부와 연관성이 있는지 확인하기 위하여 웨스턴 블롯 분석(Western blot assay)을 하였다. 웨스턴 블롯 분석은 상기 실시예 2와 같다.
상기 웨스턴 블롯 분석은 발현되지 않는 경우 NamPT 저해제에 의해 세포 사멸을 유도하는 NAPRT 마커를 이용하여 수행하였고, 발현의 정량적 비교를 위하여 항존(housekeeping) 단백질인 β-actin을 이용하였으며, 그 결과는 도 21에 나타내었다.
도 21에서 보는 바와 같이, EMT 아형으로 분류되어 있는 세포주의 경우 YCC1 및 SK4를 제외한 5개의 세포에서 NAPRT의 발현이 감소되어 있는 것을 확인할 수 있었다. 높은 NAPRT 발현을 보인 SK4 세포주는 예외적으로 FK866에 대해 저항성을 나타냈다. 또한, 낮은 수준의 NAPRT 발현을 보인 YCC1의 경우는 FK866에 대해 민감도를 보임을 확인하였다. 반면, 비-EMT에 속하는 7개의 세포주는 NAPRT의 발현이 높은 수준으로 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
상기 결과를 통하여 전체 7개 EMT 아형 세포주 중 6개에서 NAPRT 단백질 발현의 저하가 확인되었으며 (86%), 이는 NamPT 저해제에 대한 민감도와 높은 상관관계를 보임을 확인하였다.
[ 실시예 7] NamPT 저해제에 의한 전체 NAD ( Nicotinamide Adenine Dinucleotide) 양의 변화
본 발명에 따른 FK866에 의한 전체 NAD(Nicotinamide Adenine Dinucleotide) 발현의 변화를 확인하기 위하여, EMT 아형의 세포주인 SNU668 및 Hs746T와 비-EMT로 분류되는 세포주인 MKN45에서 전체 NAD+/NADH 양을 분석하였다.
상기 NAD 단백질 양 분석은 Ultra-Glo™ 재조합 루시퍼레이즈 분석 키트(Recombinant Luciferase assay kit) (Promega사, #G9071)를 이용하여 NAD+/NADH를 정량적으로 측정하였다. 구체적으로, 96웰 플레이트에 상기 세포주를 5000개씩 각각 배양한 후 2.5 내지 20 nM 농도로 FK866을 투여한 뒤, 40시간 동안 배양 과정을 거쳤다. 상기 과정 이후, NAD+를 NADH로 바꿔주는 cyclic 효소를 처리한 후 NADH에 의해 의한 reductase의 활성을 측정하여, 그 결과는 도 22에 나타내었다.
도 22에서 보는 바와 같이, NAD+/NADH 양을 측정한 결과 FK866을 투여한 경우에 EMT 아형에 속하는 SNU668 및 Hs746T는 NAD+/NADH의 양이 줄어드는 것을 확인 할 수 있었으나, Non-EMT로 분류되는 세포주인 MKN45는 NAD+/NADH의 양이 줄어들지 않는 것을 확인 할 수 있었다.
상기 결과를 통하여 FK866을 처리하는 경우 EMT 아형에 속하는 세포주에서는 NAD의 생합성을 방해하여 세포사멸을 유도하는 것을 알 수 있다.
[ 실시예 8] NAD에 의한 세포 생존율 회복 확인
본 발명에 따른 FK866에 의한 EMT 아형의 세포주(SNU668 및 SNU484) 생존율 저하가 NAD 생합성 양의 감소에 의한 효과인지 여부를 확인하기 위하여 외부에서 NAD, 니코틴아마이드, 또는 니코티닉산을 넣고 생존율의 회복을 측정 하였다. 생존율 측정은 상기 실시예 3과 동일하게 수행하였다.
상기 EMT 아형 세포주 각각에 25 nM의 FK866을 처리하고, 니코티닉 산(Nicotinic acid; NA), 니코틴아마이드(Nicotinamide; NAM) 및 NAD를 50 내지 200 mM로 세포 배양액에 넣어준 뒤 생존율을 측정하여, 그 결과를 도 23 및 24에 나타내었다.
도 23 및 24에서 보는 바와 같이, SNU668 및 SNU484 세포 모두에서 NAD 및 NAM을 넣어 준 경우에는 FK866에 의한 생존 저해를 극복하는 반면, NA를 넣어준 경우에는 생존 저해를 극복하지 못하는 것을 확인하였다.
상기 결과를 통하여 EMT 아형 암 세포주의 NamPT 저해제에 대한 민감성은 NAPRT 저발현에 따른 NAD 생합성의 문제에 기인하는 것으로 볼 수 있다.
[ 실시예 9] 17개 암종의 EMT 아형 분석
다수의 암종에서 공개된 전사체 데이터셋에서 EMT 아형에 해당하는 샘플을 분류하는 분석을 하였다. 그 뒤, 상기 분류된 샘플에서 EMT 아형과 비-EMT 아형 간의 NAPRT의 발현양을 비교하였다.
상기 NAPRT 발현양 비교는 17개의 암종에 대하여 TCGA, Gene Expression Omnibus (GEO) [Barrett et al. 2013 PMID 23193258] 및 ArrayExpress [Kolesnikov et al. 2015 PMID 25361974] 로부터 수집된 33개의 코호트들의 전사체 프로파일을 활용하였으며, 수집된 샘플 크기가 100명 이상이 되는 경우에 각각 ttps://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/, https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress의 웹 링크로부터 다운로드 받아 분석에 사용하였다. 또한, E-MTAB-923 데이터 셋은 raw 데이터인 CEL 파일 포멧을 affy R package를 이용하여 robust multichip average (RMA) 방법으로 정규화한 뒤, Log2 수준으로 변환하여 분석에 사용하였고, RNA-seq 데이터셋의 경우는 다운로드한 정규화된 RPKM 값을 활용하였다. 단, 상기 방법에 의해 정규화가 어려운 경우는 RSEM 방법으로 정규화 하였다. 최종적으로 상기 정규화된 RPKM 값에 1을 더한 후 log2 수준으로 변환하여 하기 분석에 사용하였다.
상기 EMT 아형에 속하는 샘플은 상기 EMT 아형 과발현 149개 유전자 평균 값에서 저발현 161개 유전자의 평균값의 차이값을 계산한 뒤, 상기 차이값을 통하여 분위수-분위수 그램(q-q plot)에 나타내었다. 상기 분위수-분위수 그램(q-q plot)에서 1사분위수(first quantile) 및 3사분위수(third quantile)를 잇는 대각선의 분포 경향에서 높은 스코어 방향으로 벗어나기 시작하는 지점을 한계점으로 결정하여, 상기 한계점보다 상피 중간엽 전이 유전자 특징 스코어 값이 큰 경우에 EMT 아형으로 분류하였다. 상기 분석은 각 코호트당 전체의 3% 이상의 샘플에서 EMT 아형이 확인된 경우만 분석에 사용하였다. 그 중에서도 적어도 두개 이상의 코호트(cohort)에서 3% 이상의 EMT 아형이 발견된 경우에 해당하는 위암, 대장암, 췌장암, 폐선암, 유방암에서 EMT 아형과 비-EMT 아형 샘플 사이에 나타나는 NAPRT 유전자의 발현양의 차이를 도 25 내지 38과 도 39에 나타내었다.
도 25 내지 39에서 보는 바와 같이, 위암뿐만 아니라 대장암, 췌장암, 폐암, 유방암에서도 EMT 아형이 존재하며, 상기 모든 EMT 아형의 암에서 NAPRT 저발현이 확인되어, 결과적으로 NamPT 저해제는 폭넓은 EMT 아형 암에 대한 표적 항암 치료 약물로의 활용성이 있을 것으로 확인되었다.
[ 실시예 10] 위암 조직의 아형별 NAPRT 발현 수준 분석
942명의 위암 환자에서 얻은 종양 조직 샘플을 Lauren 분류법에 따라 위암 조직을 장형(Intestinal), 미만형(Diffuse) 및 기타(Others)로 분류하였다. 이후, 각 군별 샘플의 조직 미세 배열법(tissue microarray; TMA) 블록(block)의 섹션을 면역염색하여 NAPRT 단백질의 발현양을 측정한 뒤, 조직별 염색 강도와 염색 범위로부터 H 스코어를 계산하여 하기 표 4에 나타내엇다. 이때, NAPRT 음성은 H score가 0에 해당하는 조직을 의미하며 NAPRT 양성은 H score가 0 보다 큰 모든 경우를 포함하였다.
전체 NAPTRT 음성(n=402) NAPTRT 양성(n=540) p-value(c2 test)
Lauren <0.001
장형(Intestinal) 461(49.0%) 151(37.6%) 310(57.5%)
미만형(Diffues) 411(43.7%) 226(56.2%) 185(34.3%)
기타(Others) 68(49.0%) 25(6.2%) 43(8.0%)
상기 표 4에서 보는 바와 같이, Lauren 분류법에 의해 미만형 (diffuse) 위암으로 분류된 441명의 암 조직 중 226개 (56%)의 조직에서 NAPRT 음성으로 판별되었다. 반면 장형 (intestinal) 위암으로 판별된 461명의 암 조직은 310개 (58%)가 NAPRT 양성으로 판별되어, 미만형 위암에서 통계학적으로 유의하게 (chi-squred test p 값 < 0.001) NAPRT 발현이 억제되어 있는 것으로 확인되었다.
이에 따라 본원발명의 FK866을 포함한 NamPT 저해제는 NAPRT가 저발현되는 미만형 위암에서 NAD의 생합성을 방해하여 세포사멸을 유도할 것임을 용이하게 알 수 있다.
이상에서 본 발명에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고, 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능하다는 것은 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게는 자명할 것이다.
본 발명의 NamPT(Nicotinamide phosphoribosyltransferase) 저해제를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물은 내성암, 재발암, 또는 전이암 세포의 세포 증식 및 세포사멸을 효과적으로 유도하여 암을 예방 및/또는 치료하는데 매우 효과적으로 사용될 수 있다.

Claims (12)

  1. NamPT(Nicotinamide phosphoribosyltransferase) 저해제를 유효성분으로 포함하는, 내성암, 재발암, 또는 전이암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 NamPT 저해제는 하기 화학식 1 내지 3 중 어느 하나로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 하는, 약학 조성물:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2017007519-appb-I000004
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2017007519-appb-I000005
    [화학식 3]
    Figure PCTKR2017007519-appb-I000006
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 내성암, 재발암, 또는 전이암은 내성, 재발성 또는 전이성을 갖는, 유방암, 담도암, 담낭암, 췌장암, 대장암, 자궁암, 식도암, 위암, 뇌암, 직장암, 폐암, 방광암, 신장암, 난소암, 전립선암, 자궁암, 두경부암, 피부암, 혈액암 및 간암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 암인, 약학 조성물.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 내성암, 재발암, 또는 전이암은 내성, 재발성 또는 전이성을 갖는 위암, 대장암, 췌장암, 폐암 및 유방암 중 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 내성암, 재발암, 또는 전이암은 내성, 재발성 또는 전이성을 갖는 위암인 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 내성암, 재발암, 또는 전이암은 상피 중간엽 전이(Epithelial-mesenchymal transition; EMT) 아형의 특성을 갖는, 약학 조성물.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 내성암, 재발암, 또는 전이암은 SNAIL, Vimentin 및 CD44로부터 선택된 어느 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자로부터 코딩된 단백질이 과발현(up-regulated)된 것인, 약학 조성물.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 내성암, 재발암, 또는 전이암은 E-cadherin의 유전자 또는 상기 유전자로부터 코딩된 단백질이 저발현(down-regulated)된 것인, 약학 조성물.
  9. 제 6항에 있어서,
    상기 상피 중간엽 전이 아형은 상피 중간엽 전이 특정 스코어(signature score) 측정을 통하여 분류된 것인, 약학 조성물.
  10. 제 9항에 있어서,
    상기 상피 중간엽 전이 특정 스코어는 진뱅크(GeneBank) 접근번호 NM_8745, NM_9510, NM_3899, NM_26289, NM_9590, NM_115701, NM_23452, NM_27063, NM_84168, NM_309, NM_316, NM_8905, NM_51309, NM_57198, NM_148229, NM_558, NM_627, NM_80114, NM_54796, NM_11149, NM_221061, NM_219654, NM_89927, NM_716, NM_152007, NM_10486, NM_6347, NM_1009, NM_1000, NM_1002, NM_1123, NM_5010, NM_25999, NM_123920, NM_1303, NM_1278, NM_1281, NM_1282, NM_1289, NM_1290, NM_1291, NM_51200, NM_1490, NM_79901, NM_1601, NM_1687, NM_1734, NM_27122, NM_10395, NM_55619, NM_1809, NM_10085, NM_54898, NM_2009, NM_2014, NM_57669, NM_54749, NM_2123, NM_2149, NM_359845, NM_79633, NM_2200, NM_2247, NM_2250, NM_2260, NM_2273, NM_23768, NM_11167, NM_9945, NM_11010, NM_23127, NM_59345, NM_2791, NM_10082, NM_11245, NM_26585, NM_3037, NM_57493, NM_9955, NM_5654, NM_3490, NM_3598, NM_83700, NM_55243, NM_3910, NM_55214, NM_3956, NM_10186, NM_128077, NM_4015, NM_4131, NM_4313, NM_22808, NM_253827, NM_4675, NM_89795, NM_4692, NM_257194, NM_91624, NM_4811, NM_3084, NM_55190, NM_5069, NM_27115, NM_5325, NM_5376, NM_10687, NM_64208, NM_10631, NM_5587, NM_51334, NM_5740, NM_284119, NM_5806, NM_221662, NM_27303, NM_348093, NM_8434, NM_23180, NM_5054, NM_140885, NM_6515, NM_55244, NM_6678, NM_5552, NM_8406, NM_6483, NM_26032, NM_85360, NM_6915, NM_6925, NM_7042, NM_25907, NM_83604, NM_11013, NM_55504, NM_8989, NM_23331, NM_79739, NM_7275, NM_7846, NM_7345, NM_7431, NM_7456, NM_81029, NM_6935, NM_9839, NM_23414, NM_388507, NM_55, NM_155465, NM_222, NM_288, NM_118932, NM_8416, NM_10053, NM_360, NM_23779, NM_397, NM_79170, NM_9914, NM_10331, NM_29760, NM_54836, NM_91894, NM_126353, NM_55765, NM_79098, NM_149466, NM_22996, NM_146439, NM_100133941, NM_999, NM_1001, NM_1040, NM_1048, NM_4680, NM_57530, NM_1159, NM_1364, NM_1366, NM_10256, NM_26047, NM_100128553, NM_27071, NM_79961, NM_93099, NM_1824, NM_1832, NM_26298, NM_1999, NM_2001, NM_55040, NM_83481, NM_2065, NM_121506, NM_79152, NM_158584, NM_642273, NM_84985, NM_151354, NM_157638, NM_2203, NM_221472, NM_9982, NM_2523, NM_2525, NM_5349, NM_2591, NM_9245, NM_10804, NM_127845, NM_266977, NM_53836, NM_2877, NM_196996, NM_29841, NM_79977, NM_51361, NM_9957, NM_90161, NM_3557, NM_286676, NM_8821, NM_3664, NM_3694, NM_5655, NM_25818, NM_5653, NM_11202, NM_3868, NM_3880, NM_3852, NM_200634, NM_3909, NM_3914, NM_3918, NM_3934, NM_3936, NM_9388, NM_114569, NM_9053, NM_5603, NM_153562, NM_91862, NM_4151, NM_55796, NM_143098, NM_200958, NM_79784, NM_4645, NM_255743, NM_79541, NM_58495, NM_56924, NM_11187, NM_8399, NM_25833, NM_5493, NM_81706, NM_150696, NM_222171, NM_5652, NM_5724, NM_81607, NM_57111, NM_9771, NM_158158, NM_153020, NM_54845, NM_80004, NM_57402, NM_6279, NM_6280, NM_6286, NM_8796, NM_6337, NM_5268, NM_10045, NM_26751, NM_11254, NM_6590, NM_8470, NM_11005, NM_6692, NM_10653, NM_6698, NM_6699, NM_6707, NM_6768, NM_79689, NM_415117, NM_6850, NM_9066, NM_147798, NM_79838, NM_128218, NM_161291, NM_120224, NM_28983, NM_84000, NM_56649, NM_27324, NM_23650, NM_10103, NM_55001, NM_23508, NM_79679, NM_256764, 및 NM_10406로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 상피 중간엽 전이 특정 유전자의 발현 수준 값으로부터 계산된 것인, 약학 조성물.
  11. 제 1항에 있어서,
    상기 내성암, 재발암, 또는 전이암은 NAPRT(Nicotinic acid phosphoribosyltransferse) 단백질이 저발현(down-regulated) 되어 있는, 약학 조성물.
  12. 제 1항에 있어서,
    상기 내성암, 재발암, 또는 전이암은 미만형 위암인, 약학 조성물.
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