WO2018012935A1 - 케라틴을 포함하는 항암용 조성물 - Google Patents

케라틴을 포함하는 항암용 조성물 Download PDF

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WO2018012935A1
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keratin
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hyaluronic acid
cells
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황유식
권일근
김정목
이재형
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Definitions

  • the present invention relates to a composition for preventing or treating cancer, including keratin.
  • Cancers die by themselves at the end of their lifespan or damage, balancing the overall number. However, if a cell problem occurs due to various causes, abnormal cells to be killed normally overproliferate. In some cases, they invade surrounding tissues and organs to form a mass and destroy or modify an existing structure. This condition is called cancer.
  • Cancer treatment includes surgical surgery, radiation therapy, biotherapy and chemotherapy.
  • chemotherapy using anticancer agents is currently used for cancer treatment and is one of well-established treatment methods.
  • Many anticancer drugs have excellent cancer cell killing and proliferation inhibitory effects, but conventional anticancer drugs not only act specifically on cancer cells but also on normal cells, resulting in thrombocytopenia, hair loss due to hair follicle cell destruction, ovaries and Dysmenorrhea and infertility due to side effects on the testicles, stomatitis due to mucosal cell destruction of the digestive system, nausea and vomiting and dysphagia and digestive disorders, diarrhea symptoms, nephrotoxicity due to tubular necrosis, and nervous system disorders , Various side effects such as vascular disorders such as vascular pain and rash, and discoloration of skin and nails. Therefore, research to increase the therapeutic effect while minimizing the side effects caused by anticancer drugs is urgently needed.
  • Keratin is a structural protein that makes up hair, nails, toenails, feathers, and the like.
  • keratin is composed of histidine: lysine: arginine in a molar ratio of about 1: 4: 12, and has a high content of cystine, with a sulfur content of 3 to 5%. Since keratin is a substance contained in a living body, its biocompatibility is very high, but its dissolution is low and its use is limited.
  • polyethylene glycol is a high-molecular compound having a structure of HO-(-CH 2 CH 2 O-) n -H. Because of its high hydrophilicity, it can bind to various proteins to increase its solubility. have.
  • the molecular weight range of PEG that can bind to proteins is approximately 1,000-100,000, and when the molecular weight of PEG is 1,000 or more, the toxicity is known to be quite low.
  • Keratins in health and cancer more than mere epithelial cell markers, V. Karantza et al. , Oncogene, 2001 January 13, 30 (2), 127-138
  • An object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of cancer, including keratin.
  • Another object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of cancer comprising PEGylated keratin.
  • Still another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, including keratin-hyaluronic acid complex.
  • the present inventors have confirmed that the keratin protein is effective in inhibiting the proliferation of cancer cells, and has confirmed that the proliferation inhibitory effect is weak with respect to normal normal cells and completed the present invention.
  • the present invention in one aspect, provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of cancer, including keratin.
  • the keratin may be any keratin commercially available, but preferably keratin extracted from human hair.
  • keratin includes not only pure keratin, but also keratin combined with or complexed with other compounds, and specifically includes all PEGylated keratin, keratin-hyaluronic acid complex, and the like.
  • the keratin of the present invention the human hair in a mixture of chloroform and methanol in a ratio of 2: 1 to remove lipids, stirred for 12 hours in a 2% acetic acid peracetic acid solution, 5% 2-mercaptoethanol , 5 M urea, 2.6 M thiourea and 25 mM Tris-HCl (pH 8.5) can be obtained by reacting at 50 ° C. for 72 hours.
  • cancer refers to any type of cancer, neoplasm or malignant tumor found in mammals and includes leukemia, carcinoma and sarcoma.
  • the cancer is, for example, liver cancer, lung cancer, non-small cell lung cancer, bone cancer, breast cancer, adenocarcinoma, gastric cancer, pancreatic cancer, bladder cancer, kidney cancer, ureter cancer, colon cancer, uterine cancer, cervical cancer, Prostate cancer, esophageal cancer, bronchial cancer, nasopharyngeal cancer, laryngeal cancer, brain tumor, spinal cord tumor or hematologic cancer may be included, but is not limited thereto, and may preferably be liver cancer, lung cancer, bone cancer or breast cancer.
  • keratin is 0.001% (w / v) to 10% (w / v), preferably 0.01% (w / v) to 5% (w / v) based on the weight of the total composition. More preferably 0.05% (w / v) to 2% (w / v).
  • Live & Dead assay was performed after administering a composition comprising keratin of the present invention to lung cancer cells, osteosarcoma cells and adenocarcinoma cells.
  • cell proliferation analysis of the cancer cells was performed. As a result, it was confirmed that the composition containing keratin of the present invention significantly inhibited the proliferation of the cancer cells.
  • cell proliferation analysis was performed after administering a composition comprising keratin of the present invention to liver cancer cells. As a result, it was confirmed that the composition containing keratin of the present invention inhibits the proliferation of the cancer cells.
  • ID1 is a protein involved in cancer proliferation and angiogenesis
  • HipK2 is a negative regulator of p53, a protein involved in cell death.
  • RNA sequencing was performed after administering a composition comprising keratin of the present invention to liver cancer cells. As a result, it was confirmed that the composition containing keratin of the present invention increased the expression of genes associated with cell death and inhibited the expression of genes associated with cell proliferation.
  • the pharmaceutical composition comprising the keratin of the present invention increases the expression of genes associated with various cell deaths, inhibits the expression of genes associated with cell proliferation, inhibits the proliferation of cancer cells, thereby preventing or treating cancer. It can be very effective.
  • keratin has a high biocompatibility, so the effect of inhibiting proliferation is weak for normal cells.
  • the pharmaceutical composition comprising the keratin of the present invention is effective in inhibiting the proliferation of cancer cells, and the effect of inhibiting the proliferation of normal cells is weak, and can increase the therapeutic effect of cancer while reducing side effects caused by existing anticancer drugs. .
  • the inventors of the present invention increased the solubility by converting keratin to polyethylene glycol (PEG), and confirmed that the PEGylated keratin is effective in inhibiting cancer cell proliferation and completed the present invention.
  • PEG polyethylene glycol
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising PEGylated keratin.
  • the keratin and cancer are as described above.
  • PEGylated keratin means a substance in which PEG is attached to an amino acid residue of keratin.
  • PEG can be bound to any amino acid residue of keratin, but preferably binds to an amine group.
  • PEG may be, for example, O-methyl-O ⁇ -succinyl polyethylene glycol, dibasic polyethylene glycol, ⁇ , ⁇ -bis (2-carboxyethyl-polyethylene glycol, O, O ⁇ -bis (2 Bromoethyl) polyethylene glycol, O, O ⁇ -bis (2-chloroethyl) polyethylene glycol, polyethylene glycol dimesyl acid, methoxypolyethylene glycol acetic acid, O- [2- (3-succinylamino) ethyl]- O ⁇ -methyl-polyethylene glycol, O- (2-bromoethyl) -O ⁇ -methyl polyethylene glycol, O- (2-chloroethyl) -O ⁇ -methyl polyethylene glycol, polyethylene glycol monomethyl ether mesylic acid ), Aldehyde functionalized polyethylene glycol, glycidyl functionalized polyethylene glycol, nitropetyl carbonate functionalized polyethylene glycol
  • the PEGylated keratin is N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethylated keratin
  • step ii) reacting the material produced in step i) with keratin to produce PEGylated keratin.
  • Step i) is a step of activating the succinic acid functional group of O-methyl-O ⁇ -succinyl polyethylene glycol
  • step ii) is the amine residue of the amino acid of keratin reacts with the succinyl group to produce PEGylated keratin Step.
  • Live & Dead assay was performed after administering a composition comprising PEGylated keratin of the present invention to lung cancer cells, osteosarcoma cells and liver cancer cells.
  • cell proliferation analysis of the cancer cells was performed. As a result, it was confirmed that the composition containing PEGylated keratin of the present invention significantly inhibited the proliferation of the cancer cells.
  • the pharmaceutical composition comprising PEGylated keratin of the present invention may be very effective in preventing or treating cancer by inhibiting the proliferation of cancer cells.
  • the present inventors combined the keratin with hyaluronic acid (Hyalonunic acid) to form a complex to increase the solubility, and confirmed that the keratin-hyaluronic acid complex is effective in inhibiting cancer cell proliferation and completed the present invention.
  • hyaluronic acid Hyalonunic acid
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, including keratin-hyaluronic acid complex.
  • the keratin and cancer are as described above.
  • the keratin-hyaluronic acid complex means a substance in which hyaluronic acid is bound to an amino acid residue of keratin.
  • hyaluronic acid can be bound to any amino acid residue of keratin without limitation, but preferably binds to an amine group.
  • the keratin-hyaluronic acid complex is prepared by combining a carboxyl group of hyaluronic acid with an amine group of keratin by an amidation reaction.
  • a cell proliferation assay was performed after administering a composition comprising the keratin-hyaluronic acid complex of the present invention to adenocarcinoma cells. As a result, it was confirmed that the composition containing the keratin-hyaluronic acid complex of the present invention significantly inhibited the proliferation of adenocarcinoma cells.
  • the pharmaceutical composition comprising the keratin-hyaluronic acid complex of the present invention can be very effective in preventing or treating cancer by inhibiting the proliferation of cancer cells.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further comprise at least one additional active ingredient in addition to keratin, PEGylated keratin or keratin-hyaluronic acid complex.
  • the additional active ingredient may include most anticancer agents, for example, irinotecan and tropotecan.
  • the additional active ingredient may exhibit synergistic or additive effects with keratin, and side effects may be suppressed by keratin.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be used alone, or may be used in combination with various methods such as hormonal therapy and drug treatment.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further comprise one or more pharmaceutically acceptable carriers in addition to keratin, PEGylated keratin or keratin-hyaluronic acid complex for administration.
  • Pharmaceutically acceptable carriers may be used in combination with saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol and one or more of these components, if necessary, as antioxidants, buffers And other conventional additives such as bacteriostatic agents can be added.
  • Diluents, dispersants, surfactants, binders and lubricants may also be added in addition to formulate into injectable formulations, pills, capsules, granules or tablets such as aqueous solutions, suspensions, emulsions and the like. Therefore, the pharmaceutical composition of the present invention may be a patch, liquid, pills, capsules, granules, tablets, suppositories and the like.
  • These formulations can be formulated according to the respective disease and / or component according to conventional methods used in the formulation in this field or by methods disclosed in Remington's Pharmaceutical Science (Recent Edition), Mack Publishing Company, Easton PA.
  • the invention also provides, in one aspect, a method for preventing or treating cancer by administering a pharmaceutical composition comprising keratin to a subject in need thereof.
  • the keratin may be PEGylated keratin.
  • keratin may be a keratin-hyaluronic acid complex.
  • the keratin, pharmaceutical composition, cancer is as described in detail above.
  • the route of administration of the pharmaceutical composition may be administered through any general route that can reach the target tissue.
  • oral administration intraperitoneal administration, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration, intranasal administration, pulmonary administration, rectal administration, intranasal administration, intraperitoneal administration, intradural administration, It is not limited.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on the weight, age, sex, health status, diet, time of administration, administration method, excretion rate and severity of the disease, and divided into once or several times a day. can do.
  • the invention also provides, in one aspect, the use of a pharmaceutical composition comprising keratin for the manufacture of a medicament for the prevention or treatment of cancer.
  • the keratin may be PEGylated keratin.
  • the keratin may be a keratin-hyaluronic acid complex.
  • the keratin, pharmaceutical composition, cancer is as described in detail above.
  • the pharmaceutical composition comprising the keratin of the present invention inhibits the proliferation of cancer cells, inhibits the expression of genes associated with cell proliferation, inhibits the proliferation of cancer cells, but does not affect normal cells.
  • the pharmaceutical composition comprising the PEGylated keratin or keratin-hyaluronic acid complex of the present invention can increase the solubility of keratin and more effectively inhibit the proliferation of cancer cells.
  • compositions of the present invention can act very effectively in the prevention or treatment of cancer.
  • 1 is a schematic of a process for preparing PEGylated keratin.
  • Figure 3 shows that the cell proliferation inhibitory ability when treated with keratin to lung cancer cells confirmed by Live & Dead assay and cell proliferation assay.
  • FIG. 4 is a graph showing the results of cell proliferation analysis when keratinocytes are treated with osteosarcoma cells.
  • Figure 5 is a graph showing the results of cell proliferation analysis when treated with keratin gland / breast adenocarcinoma cells.
  • FIG. 6 is a graph showing the results of cell proliferation analysis when keratin was treated to human breast adenocarcinoma cells and murine adenocarcinoma cells.
  • Fig. 7 shows the extent of cell proliferation when keratin is treated to liver cancer cells with an inverted microscope.
  • FIG. 8 is a graph showing the degree of ID1 and HipK2 expression when keratin is treated to liver cancer cells.
  • Figure 10 shows that the cell proliferation inhibitory ability when treated with hepatic cancer cells by Live & Dead assay.
  • Figure 11 shows that the liver growth cells, lung cancer cells and gland / breast adenocarcinoma cells treated with PEG keratin treated cell growth inhibition ability confirmed by Live & Dead assay.
  • Figure 12 is a graph showing the results of cell proliferation analysis when treated with PEGylated keratin to liver cancer cells, lung cancer cells and glandular / mammary adenocarcinoma cells.
  • Figure 13 illustrates the mechanism of action of anticancer activity exhibited by keratin.
  • FIG. 14 is a graph showing the results of cell proliferation analysis when the keratin-hyaluronic acid complex was treated to human breast adenocarcinoma cells and murine adenocarcinoma cells.
  • Human hair was washed with a mild detergent and then washed several times with distilled water.
  • the hairs were placed in a beaker to remove lipids, and the mixture was added to a mixture of chloroform and methanol in a ratio of 2: 1 until the hairs were submerged. After 24 hours, the hair was air-dried after washing several times with distilled water until no solution used for removing lipids remained in the hair.
  • 20 g of dried hair was added to 800 mL of 2% acetic acid peroxide (Sigma aldrich) and stirred at 300 rpm for 12 hours at 37 ° C. After 12 hours, the hairs were sieved and washed with distilled water to remove the remaining oxides.
  • the hairs were placed in 400 mL Shindai solution (5% 2-mercaptoethanol, 5 M urea, 2.6 M thiourea (or above Sigma aldrich) and 25 mM Tris-HCl (pH 8.5)) at 50 ° C and 400 rpm. The reaction was carried out for 72 hours under the conditions. The hair solution was then placed in a 50 mL tube and centrifuged for 20 minutes at 3500 rpm. Gather the supernatant was dialyzed using a 12-14 kDa cut-off Spectra / Por ® 4 dialysis membrane (Spectrum). Keratin powder was prepared by freeze-drying the dialysis of the keratin liquid sample.
  • PEGylated keratin was synthesized by the reaction shown in FIG. 1.
  • keratin powder was weighed with an electronic scale (0.001 g to 620 g, AJ-620E) for measuring the microcomponent unit coefficient and placed in a 500 mL Pyrex beaker (ISOLAB, YLS, Germany). 100 mL of tertiary water was added to the beaker and stirred for 24 hours at a speed of 300 rpm using a 40 ⁇ 8 mm magnetic stir bar ([B00C3ME4ZA], 1572500 IKAFLON 40, IKA) and MS-H-S10 10-Channel magnetic stirrer. It was.
  • the keratin solution and the combined solution of mPEG and DMTMM were placed in a 500 mL beaker and at room temperature at 500 rpm using a 40 ⁇ 8 mm magnetic stirring rod (1572500 IKAFLON 40, IKA) and MS-H-S10 10-Channel magnetic stirrer. Stirred for 3 days to react the PEG and keratin.
  • PEGylated keratin obtained in Preparation Example 2-2 was analyzed by NMR. As a result, as shown in FIG. 2, it was confirmed that peaks specifically expressed in keratin and PEG were present at the same time in PEGylated keratin.
  • HA hyaluronic acid sodium salt
  • a solution of sodium hyaluronate salt and DMTMM reacted was placed in a Spectra / Por permeable membrane tube (16 mm diameter, 25 mm width, MW10000, Spectrum) and immersed in 4 L distilled water to precipitate DMTMM after the reaction.
  • a 40 ⁇ 8 mm magnetic stir bar [B00C3ME4ZA], 1572500 IKAFLON 40, IKA) and MS-H-S10 10-Channel magnetic stirrer were removed using a stirrer at room temperature for 24 hours at 500 rpm.
  • Keratin powder (molecular weight: 4 ⁇ 60000 Da) Weigh 1200mg and dissolve in 300mL distilled water. The carboxyl group and the amine group of keratin in the solution of sodium hyaluronate salt and DMTMM react to amidate the final molar concentration of 1: 1 or Synthesized to 3: 1.
  • a 40 ⁇ 8 mm magnetic stir bar [B00C3ME4ZA], 1572500 IKAFLON 40, IKA) and an MS-H-S10 10-Channel magnetic stirrer were synthesized using a stirrer at room temperature for 3 days at 500 rpm.
  • the reacted keratin and DMTMM were completely removed in the hyaluronic acid-keratin solution. At this time, every 3 hours was changed to fresh 4 L of distilled water, and dialyzed while changing the distilled water for 5 days at room temperature. Finally, the finished hyaluronic acid-keratin solution was divided into 50 mL centrifuge tubes (17 ⁇ 120 mm, BD Falcon) in 35 mL portions, and then placed in an ultra-low temperature freezer (Nihon freezer, Upright type, Single cooling type, 542 l). And completely frozen for 24 hours.
  • the centrifuge tube was opened, placed in a lyophilizer (ALPHA 2-4 LSC PLUS, Laboratory freeze dryers, Christ) and dried for at least 3 days to form a complete powder in vacuo to obtain a final hyaluronic acid-keratin gel powder.
  • APHA 2-4 LSC PLUS Laboratory freeze dryers, Christ
  • Human lung cancer cells (A549 ATCC ® CCL-185 TM ), osteosarcoma cells (U205), human mammal spring / breast adenocarcinoma cells (MDA-MB-231 ATCC ® HTB-26 TM), human breast adenocarcinoma cells (MCF-7 ATCC ® ) And rat adenocarcinoma cells (4T1), respectively, inoculated with 5 ⁇ 10 3 or 1 ⁇ 10 4 in a 24 well plate, and after 24 hours high glucose DMEM medium or 1% (w / v) keratin containing high glucose DMEM medium Changed to.
  • human lung cancer cells A549 ATCC ® CCL-185 TM
  • osteosarcoma cells U205
  • human mammalian gland / breast adenocarcinoma cells MDA-MB-231 Live & Dead assay was performed on ATCC ® HTB-26 TM
  • human lung cancer cells A549 ATCC ® CCL-185 TM
  • osteosarcoma cells U205
  • human mammalian gland / breast adenocarcinoma cells MDA-MB-231 ATCC ® HTB -26 TM
  • human breast adenocarcinoma cells MDA-MB-231 ATCC ® HTB -26 TM
  • human breast adenocarcinoma cells MDA-MB-231 ATCC ® HTB -26 TM
  • murine adenocarcinoma cells 4T1
  • Example 1-1 Live & Dead assay
  • Live & Dead assay was performed on lung cancer cells using Live / Dead viability / cytotoxicity kit (invitrogen).
  • 0.5 ml of calcein (Calcein) and 2.0 ⁇ l of ethidium homodimer were added and mixed in 1 ml of DPBS.
  • 200 ⁇ l of the gastric mixture was added to each well washed with DPBS.
  • Light was blocked with aluminum foil, incubated at 37 ° C. for 10 minutes, washed with DPBS, and observed with a fluorescence microscope (Olympus BX51).
  • the cell counting Kit-8 solution (Dojindo laboratory) diluted 10-fold with high glucose DMEM medium was added to each well, and the light was blocked with aluminum foil. Incubate for minutes (incubation time does not exceed 4 hours). After incubation, 100 ⁇ l of each well was transferred to a 96 well plate and absorbed at 450 nm wavelength (OD 450 nm) using a 96 well format plate reader (ELX 800 universal microplate reader, Bio Tek, Inc.) instrument. Measured.
  • liver cancer cells HepG2 ATCC-HB-8065
  • HepG2 ATCC-HB-8065 6 well plate or 125 cm2 5x10 4 liver cancer cells (HepG2 ATCC-HB-8065) were inoculated into the culture flask, and the cells were replaced with high glucose DMEM medium or high glucose DMEM medium containing 1% (w / v) keratin after 24 hours. After incubation for 48 hours, the degree of proliferation of the cells was observed with an inverted microscope, and RT-PCR and RNA sequencing were performed.
  • Example 2-1 Inverted Microscopy
  • liver cancer cells HepG2 ATCC-HB-8065
  • RNA extraction and quantified using nanodrop MICROP UV-Vis Spectrophotometer M600. 1 ⁇ g of RNA was added to AccuPower Cycle Script RT Premix (Bioneer, Daejeon, Korea) and cDNA was made using a thermal cycler (T106, Bio-Rad). The sequence of the used primer is as Table 1 below.
  • RNA sequencing the culture medium of the 125 cm 2 culture flask was removed and washed with DPBS. Hybrid-R kit (Gene All) was used for RNA extraction and quantified using nanodrop (MICROP UV-Vis Spectrophotometer M600). The extracted 10 ⁇ g of RNA was transferred to a RNase free microcentrifuge, placed in an ice-filled ice box, and sent to Macrogen for analysis.
  • Cell spheroids were formed by inoculating 200 ⁇ L of a 1 ⁇ 10 6 cell / mL cell suspension into a 450 ⁇ m diameter polyethylene glycol (PEG) microwell array to create a three-dimensional in vitro micro liver cancer cell-derived tissue. After incubation, the cells were cultured in high glucose DMEM medium for 1 day. After 24 hours, the culture medium was removed, PBS was added, and the cell spheroid formed by pipetting was recovered. The recovered cells were transferred to a 10 ml vessel of HARV bioreactor (Synthecon), and high culture of glucose was added to each vessel, and dynamic culture was performed while rotating at a speed of 20 rpm.
  • HARV bioreactor Synthecon
  • Live & Dead assay was performed using the Live / Dead viability / cytotoxicity kit (invitrogen). 0.5 ml of calcein (Calcein) and 2.0 ⁇ l of ethidium homodimer were added and mixed in 1 ml of DPBS. After removing the medium, 200 ⁇ l of the gastric mixture was added to each well washed with DPBS. Light was blocked with aluminum foil, incubated at 37 ° C. for 10 minutes, washed with DPBS, and observed with a fluorescence microscope (Olympus BX51).
  • Human lung cancer cells (A549 ATCC ® CCL-185 TM), human mammalian gland / breast adenocarcinoma cells (MDA-MB-231 ATCC ® HTB-26 TM) and liver cancer cells (HepG2 ATCC-HB-8065), respectively, in 24 well plates 5 ⁇ 10 3 or 1 ⁇ 10 4 inoculated, high glucose DMEM plain medium, high glucose DMEM plain medium containing 1% (w / v) keratin, or high containing 2% (w / v) PEGylated keratin The glucose was changed to DMEM normal medium. Culture medium was changed every two days with fresh medium. After incubation for some time, Live & Dead assay and cell proliferation assay were performed.
  • Example 3-1 Live & Dead assay
  • Live & Dead assay was performed using the Live / Dead viability / cytotoxicity kit (invitrogen). 0.5 ml of calcein (Calcein) and 2.0 ⁇ l of ethidium homodimer were added and mixed in 1 ml of DPBS. After removing the medium, 200 ⁇ l of the gastric mixture was added to each well washed with DPBS. Light was blocked with aluminum foil, incubated at 37 ° C. for 10 minutes, washed with DPBS, and observed with a fluorescence microscope (Olympus BX51).
  • each well was added with a Cell Counting Kit-8 solution (Dojindo laboratory) diluted 10-fold with high glucose DMEM normal medium, light was blocked with aluminum foil, and then 1 hour 30 at 37 °C. Incubate for minutes (incubation time does not exceed 4 hours). After incubation, 100 ⁇ l of each well was transferred to a 96 well plate and absorbance was measured at 450 nm wavelength (O.D 450 nm) using a 96 well format plate reader (ELX 800 universal micro plate reader, Bio Tek, Inc.) instrument.
  • ELX 800 universal micro plate reader Bio Tek, Inc.
  • Each of human breast adenocarcinoma cells (MCF-7 ATCC ® ) and rat breast adenocarcinoma cells (4T1) was inoculated with 1 ⁇ 10 4 in 24 well plates and after 24 hours high glucose DMEM medium or 0.25-4% (w / v) It was changed to the high glucose DMEM normal medium containing keratin or 2% keratin-hyaluronic acid complex. The culture medium was exchanged with fresh medium once daily, and cultured for a certain period of time, followed by cell proliferation analysis.
  • each well was added with a Cell Counting Kit-8 solution (Dojindo laboratory) diluted 10-fold with high glucose DMEM normal medium, light was blocked with aluminum foil, and then 1 hour 30 at 37 °C. Incubate for minutes (incubation time does not exceed 4 hours). After incubation, 100 ⁇ l of each well was transferred to a 96 well plate and absorbance was measured at 450 nm wavelength (O.D 450 nm) using a 96 well format plate reader (ELX 800 universal micro plate reader, Bio Tek, Inc.) instrument.
  • ELX 800 universal micro plate reader Bio Tek, Inc.

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Abstract

본 발명은 케라틴을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 대한 것으로, 상기 조성물은 세포 사멸과 연관된 다양한 유전자의 발현을 증가시키고, 세포 증식과 연관된 유전자들의 발현을 억제하며, 암 세포의 증식을 억제하므로, 암의 예방 또는 치료제로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

케라틴을 포함하는 항암용 조성물
본 발명은 케라틴을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물에 대한 것이다.
세포는 수명이 다하거나 손상되면 스스로 사멸하여 전반적인 수의 균형을 유지한다. 그러나 여러 가지 원인에 의해 세포의 조절 기능에 문제가 생기면, 정상적으로는 사멸해야 할 비정상 세포들이 과다 증식하게 되며, 경우에 따라 주위 조직 및 장기에 침입하여 종괴를 형성하고 기존의 구조를 파괴하거나 변형시키는데, 이러한 상태를 암이라 한다.
암의 치료방법으로는 외과적 수술, 방사선 요법, 생물요법 및 화학요법 등이 있다. 이 중에서 항암제를 이용한 화학요법은 현재 암 치료를 위해 많이 사용되고 있으며, 잘 확립된 치료방법 중 하나이다. 많은 항암제들은 탁월한 암세포 사멸 효과 및 증식 억제 효과를 가지고 있으나, 통상적인 항암제는 암세포에만 특이적으로 작용하는 것이 아니라 정상세포에도 동시에 작용하며, 그로 인하여 혈구 감소증, 모낭세포 파괴로 인한 탈모증상, 난소와 고환에 대한 부작용으로 인한 월경불순 및 불임, 소화기의 점막 세포 파괴로 인한 구내염, 오심구토 및 음식 연하장애와 소화 장애, 설사증상, 세뇨관 괴사에 의한 신장독성, 신경계 장애로 인해 발생하는 말초 신경염과 쇠약감, 혈관통증 및 발진 등의 혈관장애, 피부 및 손발톱 변색 등의 다양한 부작용이 나타난다. 따라서 항암제에 의한 부작용을 최소화하면서 치료 효과를 상승시키기 위한 연구가 절실하다.
한편, 케라틴은 모발, 손톱, 발톱, 깃털 등을 구성하는 구조 단백질이다. 일반적으로 케라틴은 히스티딘 : 리신 : 아르기닌이 약 1 : 4 : 12의 몰비로 이루어져 있으며, 시스틴의 함량이 많아 황의 함량이 3 내지 5 %를 차지한다. 케라틴은 생체에 포함되어 있는 물질이기 때문에, 생체적합성이 매우 높으나, 용해가 낮은 편이어서 활용이 제한적인 실정이다.
다른 한편, 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, 이하 PEG)은 HO-(-CH2CH2O-)n-H의 구조를 갖는 고분자 화합물로, 친수성이 강하기 때문에 다양한 단백질에 결합시켜 그 용해도를 증가시킬 수 있다. 단백질에 결합 가능한 PEG의 분자량 범위는 대략 1,000-100,000으로, PEG 분자량이 1,000 이상일 경우에는 독성이 상당히 낮은 편으로 알려져 있다.
[선행기술문헌]
[비특허문헌]
Keratins in health and cancer: more than mere epithelial cell markers, V. Karantza et al., Oncogene, 2001 January 13, 30(2), 127-138
본 발명의 목적은 케라틴을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 PEG화된 케라틴을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 케라틴-히알루론산 복합체를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 케라틴 단백질이 암세포의 증식억제에 효과가 있으면서도, 일반적인 정상세포들에 대해서는 증식억제 효과가 미약한 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명은 일 양태로서, 케라틴을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학적 조성물에서, 상기 케라틴은 상업적으로 이용가능한 임의의 케라틴일 수 있으나, 바람직하게는 사람 머리카락에서 추출한 케라틴일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물에서, 케라틴은 순수한 케라틴뿐만 아니라 다른 화합물과 결합되거나 또는 복합체를 형성한 케라틴을 모두 포함하며, 구체적으로 PEG화된 케라틴, 케라틴-히알루론산 복합체 등을 모두 포함하는 개념이다.
구체적으로, 본 발명의 케라틴은, 사람 머리카락을 클로로포름과 메탄올을 2:1의 비율로 섞은 혼합액에 넣어 지질을 제거하고, 2 % 과산화아세트산 용액에서 12시간 교반한 후, 5 % 2-머캅토에탄올, 5 M 우레아, 2.6 M 티오우레아 및 25 mM Tris-HCl(pH 8.5)에 넣고, 50 ℃에서 72시간동안 반응시켜 수득할 수 있다.
본 발명에서, 암은 포유동물에서 발견되는 모든 유형의 암, 신생물 또는 악성 종양을 지칭하며, 백혈병, 암종 및 육종을 포함한다.
본 발명의 약학적 조성물에서, 상기 암은 예를 들어, 간암, 폐암, 비소세포성 폐암, 골암, 유방암, 선암종, 위암, 췌장암, 방광암, 신장암, 수뇨관 암, 대장암, 자궁암, 자궁경부암, 전립선암, 식도암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 뇌종양, 척수종양 또는 혈액암 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 바람직하게는 간암, 폐암, 골암 또는 유방암일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물에서, 케라틴은 총 조성물의 중량에 대하여 0.001 %(w/v) 내지 10 %(w/v), 바람직하게는 0.01 %(w/v) 내지 5 %(w/v), 더욱 바람직하게는 0.05 %(w/v) 내지 2 %(w/v)의 함량으로 포함될 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서, 폐암 세포, 골육종 세포 및 선암종 세포에 본 발명의 케라틴을 포함하는 조성물을 투여한 후 Live&Dead assay를 수행하였다. 또한, 본 발명의 구체적인 다른 실시예에서, 상기 암 세포의 세포 증식 분석을 수행하였다. 그 결과, 본 발명의 케라틴을 포함하는 조성물이 상기 암 세포의 증식을 현저히 억제함을 확인하였다.
또한, 본 발명의 구체적인 일 실시예에서, 간암 세포에 본 발명의 케라틴을 포함하는 조성물을 투여한 후 세포 증식 분석을 수행하였다. 그 결과, 본 발명의 케라틴을 포함하는 조성물이 상기 암 세포의 증식을 억제함을 확인하였다.
또한, 본 발명의 구체적인 일 실시예에서, 간암 세포에 본 발명의 케라틴을 포함하는 조성물을 투여한 후 ID1(Inhibitor of DNA binding 1) 및 HipK2(Homeodomain-interacting protein kinase 2)의 발현을 RT-PCR로 측정하였다. 상기 ID1은 암 증식과 혈관생성에 관여하는 단백질이며, 상기 HipK2는 세포사멸에 관여하는 단백질인 p53의 음성 조절자이다. 그 결과, 본 발명의 케라틴을 포함하는 조성물이 ID1과 HipK2의 발현을 현저히 저하시킴을 확인하였다.
또한, 본 발명의 구체적인 일 실시예에서, 간암 세포에 본 발명의 케라틴을 포함하는 조성물을 투여한 후 RNA 염기서열 분석을 수행하였다. 그 결과, 본 발명의 케라틴을 포함하는 조성물이 세포 사멸과 연관된 유전자들의 발현을 증가시키고, 세포 증식과 연관된 유전자들의 발현을 억제시킴을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 케라틴을 포함하는 약학적 조성물은 다양한 세포 사멸과 연관된 유전자의 발현을 증가시키고, 세포 증식과 연관된 유전자들의 발현을 억제하며, 암 세포의 증식을 억제여, 암의 예방 또는 치료에 매우 효과적일 수 있다.
또한, 케라틴은 생체적합성이 높은 물질이므로 정상세포에 대해서는 증식억제 효과가 미약하다. 즉, 본 발명의 케라틴을 포함하는 약학적 조성물은 암세포의 증식억제에 효과가 있으면서도, 정상세포에 대해서는 증식억제 효과가 미약하여, 기존 항암제에 의한 부작용을 경감시키면서도 암의 치료 효과를 상승시킬 수 있다.
본 발명자들은 케라틴을 폴리에틸렌글리콜(Polyethylene glycol, PEG)화하여 용해성을 증가시켰으며, 상기 PEG화된 케라틴이 암세포 증식 억제에 효과가 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명은 일 양태로서, PEG화된 케라틴을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 케라틴 및 암은 앞서 기술한 바와 같다.
본 발명에서, PEG화된 케라틴이란 케라틴의 아미노산 잔기에 PEG가 결합되어 있는 물질을 의미한다. 본 발명의 PEG화된 케라틴에 있어서, PEG는 케라틴의 임의의 아미노산 잔기에 제한 없이 결합될 수 있으나, 바람직하게는 아민기에 결합한다.
본 발명에서, PEG는 예를 들어, O-메틸-O`-숙시닐 폴리에틸렌글리콜, 2염기산 폴리에틸렌글리콜, α,ω-비스(2-카르복시에틸-폴리에틸렌글리콜, O,O`-비스(2-브로모에틸)폴리에틸렌글리콜, O,O`-비스(2-클로로에틸)폴리에틸렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 디메실산, 메톡시폴리에틸렌글리콜 아세트산, O-[2-(3-숙시닐아미노)에틸]-O`-메틸-폴리에틸렌글리콜, O-(2-브로모에틸)-O`-메틸폴리에틸렌글리콜, O-(2-클로로에틸)-O`-메틸폴리에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 모노메틸 에테르 메실산(mesylate), 알데히드 기능화 폴리에틸렌글리콜, 글리시딜이써 기능화 폴리에틸렌글리콜, 나이트로페틸 카보네이트 기능화 폴리에틸렌글리콜, 메실(Mesyl) 기능화 폴리에틸렌글리콜 또는 토실(Tosyl) 기능화 폴리에틸렌글리콜일 수 있으며, 바람직하게는 O-메틸-O`-숙시닐 폴리에틸렌글리콜일 수 있다. 상기 PEG의 분자량은 1000 내지 20000일 수 있으며, 바람직하게는 2000 내지 10000 일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 양태에서, PEG화된 케라틴은
i) O-메틸-O`-숙시닐 폴리에틸렌글리콜을 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일) 4-메톡시몰폴리늄 클로라이드(DMTMM)와 반응시키는 단계; 및
ii) 단계i)에서 생성된 물질을 케라틴과 반응시켜 PEG화된 케라틴을 생성하는 단계를 포함하는 방법으로 제조된다.
상기 제i) 단계는 O-메틸-O`-숙시닐 폴리에틸렌글리콜의 숙신산 작용기를 활성화시키는 단계이며, 상기 제ii) 단계는 케라틴의 아미노산의 아민 잔기가 숙시닐기와 반응하여 PEG화된 케라틴을 생성하는 단계이다.
본 발명의 구체적일 일 실시예에서, 폐암 세포, 골육종 세포 및 간암 세포에 본 발명의 PEG화된 케라틴을 포함하는 조성물을 투여한 후 Live&Dead assay를 수행하였다. 또한, 본 발명의 구체적인 다른 실시예에서, 상기 암 세포의 세포 증식 분석을 수행하였다. 그 결과, 본 발명의 PEG화된 케라틴을 포함하는 조성물이 상기 암 세포의 증식을 현저히 억제함을 확인하였다.
따라서 본 발명의 PEG화된 케라틴을 포함하는 약학적 조성물은 암 세포의 증식을 억제하여 암의 예방 또는 치료에 매우 효과적일 수 있다.
본 발명자들은 케라틴을 히알루론산(Hyalonunic acid)와 결합시켜 복합체를 형성하여 용해성을 증가시켰으며, 이러한 케라틴-히알루론산 복합체가 암세포 증식 억제에 효과가 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명은 일 양태로서, 케라틴-히알루론산 복합체를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 케라틴 및 암은 앞서 기술한 바와 같다.
본 발명에서, 케라틴-히알루론산 복합체란 케라틴의 아미노산 잔기에 히알루론산이 결합되어 있는 물질을 의미한다. 본 발명의 케라틴-히알루론산 복합체에 있어서, 히알루론산은 케라틴의 임의의 아미노산 잔기에 제한 없이 결합될 수 있으나, 바람직하게는 아민기에 결합한다.
본 발명의 바람직한 일 양태에서, 케라틴-히알루론산 복합체는 히알루론산의 카르복실기(Carboxyl group)와 케라틴의 아민기(amine group)를 아미드화 반응으로 결합시켜 제조된다.
본 발명의 구체적일 일 실시예에서, 선암종 세포에 본 발명의 케라틴-히알루론산 복합체를 포함하는 조성물을 투여한 후 세포 증식 분석을 수행하였다. 그 결과, 본 발명의 케라틴-히알루론산 복합체를 포함하는 조성물이 선암종 세포의 증식을 현저히 억제함을 확인하였다.
따라서 본 발명의 케라틴-히알루론산 복합체를 포함하는 약학적 조성물은 암 세포의 증식을 억제하여 암의 예방 또는 치료에 매우 효과적일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 케라틴, PEG화된 케라틴 또는 케라틴-히알루론산 복합체 외에 추가적인 유효성분을 1 종 이상 더 포함할 수 있다. 상기 추가적인 유효성분으로는 대부분의 항암제가 포함될 수 있으며, 예를 들어, 이리노테칸 및 트로포테칸 등이 포함될 수 있다. 상기 추가적인 유효성분은 케라틴과 함께 시너지 효과 또는 상가적 효과를 나타낼 수 있으며, 케라틴에 의해 부작용이 억제될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 단독으로 사용될 수 있으며, 호르몬 치료, 약물 치료 등의 다양한 방법들과 병용하여 사용될 수도 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 투여를 위해서 케라틴, PEG화된 케라틴 또는 케라틴-히알루론산 복합체 외에 추가로 약제학적으로 허용가능한 담체를 1종 이상 더 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 따라서 본 발명의 약학적 조성물은 패치제, 액제, 환약, 캡슐, 과립, 정제, 좌제 등이 될 수 있다. 이들 제제는 각 질환에 따라 및/또는 성분에 따라 이 분야에서 제제화에 사용되는 통상의 방법 또는 Remington's Pharmaceutical Science (최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법으로 제제화될 수 있다.
본 발명은 또한 일 양태로서, 케라틴을 포함하는 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에 투여함으로써 암을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
상기 암을 예방 또는 치료하는 방법에서, 케라틴은 PEG화된 케라틴 일 수 있다.
상기 암을 예방 또는 치료하는 방법에서, 케라틴은 케라틴-히알루론산 복합체일 수 있다.
상기 케라틴, 약학적 조성물, 암은 앞서 상세히 기술한 바와 같다.
본 발명에서 상기 약학적 조성물의 투여 경로는 목적조직에 도달할 수 있는 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 경구투여, 복강 내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여, 강내 투여, 복강내 투여, 경막내 투여될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다.
본 발명은 또한 일 양태로서, 암의 예방 또는 치료용 약제의 제조를 위한 케라틴을 포함하는 약학적 조성물의 용도를 제공한다.
상기 용도에서, 케라틴은 PEG화된 케라틴 일 수 있다.
상기 용도에서, 케라틴은 케라틴-히알루론산 복합체일 수 있다.
상기 케라틴, 약학적 조성물, 암은 앞서 상세히 기술한 바와 같다.
본 발명의 케라틴을 포함하는 약학적 조성물은, 암세포의 증식을 억제하고, 세포 증식과 연관된 유전자들의 발현을 억제하며, 암세포의 증식을 억제하면서도, 정상세포에는 영향을 미치지 않는다.
또한, 본 발명의 PEG화된 케라틴 또는 케라틴-히알루론산 복합체를 포함하는 약학적 조성물은, 케라틴의 용해도를 증가시켜, 암세포의 증식을 보다 효과적으로 억제할 수 있다.
따라서, 본 발명의 약학적 조성물은 암의 예방 또는 치료에 매우 효과적으로 작용할 수 있다.
도 1은 PEG화된 케라틴을 제조하는 방법을 도식화한 것이다.
도 2는 PEG화된 케라틴을 NMR 분석한 데이터이다.
도 3은 폐암 세포에 케라틴을 처리한 경우의 세포 증식 억제능을 Live&Dead assay와 세포 증식 분석으로 확인한 것을 나타낸 것이다.
도 4는 골육종 세포에 케라틴을 처리한 경우의 세포 증식 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 샘/유방 선암종 세포에 케라틴을 처리한 경우의 세포 증식 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 인간 유방 선암종 세포 및 쥐 선암종 세포에 케라틴을 처리한 경우의 세포 증식 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 간암 세포에 케라틴을 처리한 경우의 세포 증식 정도를 도립 현미경으로 관찰한 것이다.
도 8은 간암 세포에 케라틴을 처리한 경우의 ID1 및 HipK2 발현 정도를 나타낸 그래프이다.
도 9는 간암 세포에 케라틴을 처리한 경우의 RNA 서열정보 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 간암 세포에 케라틴을 처리한 경우의 세포 증식 억제능을 Live&Dead assay로 확인한 것을 나타낸 것이다.
도 11은 간암 세포, 폐암 세포 및 샘/유방 선암종 세포에 PEG화된 케라틴을 처리한 경우의 세포 증식 억제능을 Live&Dead assay로 확인한 것을 나타낸 것이다.
도 12는 간암 세포, 폐암 세포 및 샘/유방 선암종 세포에 PEG화된 케라틴을 처리한 경우의 세포 증식 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 13은 케라틴이 나타내는 항암 활성의 작용 메카니즘을 도식화한 것이다.
도 14는 인간 유방 선암종 세포 및 쥐 선암종 세포에 케라틴-히알루론산 복합체를 처리한 경우의 세포 증식 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 제조예 및 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 제조예 및 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 이에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
제조예
< 제조예 1> 케라틴의 수득
사람 머리카락을 약한 세제를 이용해서 깨끗하게 세척한 후 증류수로 여러 번 씻어주었다. 지질제거를 위해 머리카락을 비이커에 담고, 클로로포름과 메탄올을 2:1의 비율로 섞은 혼합액에 머리카락이 잠길 때까지 넣어주었다. 24시간 후 지질 제거에 사용한 용액이 머리카락에 남아있지 않을 때까지 증류수로 여러 번 세척한 후 머리카락을 기건(air-dry)시켰다. 2 % 과산화아세트산(Sigma aldrich) 800 mL에 기건시킨 머리카락 20 g을 넣고 37 ℃에서 12시간동안 300 rpm의 속도로 교반하였다. 12시간 후, 머리카락을 체에 거르고 증류수로 세척하여 남아있는 산화물을 제거하였다. 머리카락을 400 mL 신다이(Shindai) 용액(5 % 2-머캅토에탄올, 5 M 우레아, 2.6 M 티오우레아(이상 Sigma aldrich) 및 25mM Tris-HCl(pH 8.5))에 넣고, 50 ℃, 400 rpm의 조건에서 72시간동안 반응시켰다. 그 후, 머리카락 용액을 50 mL 튜브에 넣고 3500 rpm으로 20분 동안 원심분리하였다. 상등액을 모아 12-14 kDa 컷오프 Spectra/Por®4 투석막(Spectrum)을 이용해서 투석하였다. 투석이 끝난 케라틴 액체샘플을 동결 건조하여 케라틴 파우더를 제조하였다.
<제조예 2> PEG화된 케라틴의 제조
제조예 2-1: PEG화된 케라틴의 합성
도 1에 제시된 반응과정으로 PEG화된 케라틴을 합성하였다.
먼저, 케라틴 파우더 0.5 g을 미세부품 단위계수 측정 전자저울(0.001 g ~ 620 g, AJ-620E)로 달아 500 mL 파이렉스 비이커(ISOLAB, YLS, 독일)에 넣었다. 비이커에 삼차수 100 mL를 넣고, 40×8 mm 마그네틱 교반봉([B00C3ME4ZA], 1572500 IKAFLON 40, IKA)과 MS-H-S10 10-Channel 마그네틱 교반기를 이용하여 300 rpm의 속도로 24시간 동안 교반하였다.
메톡시폴리에틸렌글리콜을 변형시킨 O-메틸-O`-숙시닐 폴리에틸렌글리콜 5000(mPEG, 17929-5G-F, Lot#R063737/2V Sigma aldrich) 300 mg을 삼차수 20 mL에 1시간 동안 녹였다. mPEG 용액에 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일) 4-메톡시몰폴리늄 클로라이드(DMTMM) n-수화물(327-53752, wako chemical) 16 mg을 넣고 1시간동안 교반하였다. 케라틴 용액과 mPEG 및 DMTMM의 결합 용액을 500 mL 비커에 넣어, 40×8mm 마그네틱 교반봉(1572500 IKAFLON 40, IKA)과 MS-H-S10 10-Channel 마그네틱 교반기를 이용하여 500 rpm의 속도로 실온에서 3일 동안 교반하여 PEG와 케라틴을 반응시켰다.
제조예 2-2: PEG화된 케라틴의 정제
제조예 2-1의 반응이 끝난 후, Spectra/Por 투과막 튜브(직경 16 mm, 평폭 25 mm, MW10000, Spectrum)에 PEG화된 케라틴 용액을 한 튜브당 100 mL씩 넣고, Spectra/Por RC 투석 튜빙 클로져(최대 폭 55 mm, Orange, Spectrum)를 양쪽 튜브에 패킹하였다. 5 L 플라스틱 비이커(지름 197 mm, 높이 265 mm)에 삼차수 4 L를 채워 PEG화된 케라틴 용액이 담긴 튜브를 넣고 마그네틱 바를 넣고 교반하면서 투석하였다. 이때, 12시간마다 새로운 삼차수로 갈아주었으며, 실온에서 3일동안 삼차수로 총 6번을 갈아주면서 투석하였다. 최종 PEG화된 케라틴 용액을 50 mL 원심관(17×120 mm, BD Falcon)에 40 mL 씩 나눠 담은 후, 초저온냉장고(Nihon freezer, Upright type, Single cooling type, 542ℓ)에서 -70 ℃로 24시간 동안 완전히 동결시켰다. 원심관 뚜껑을 열고, 동결건조기(ALPHA 2-4 LSC PLUS, Laboratory freeze dryers, Christ)에 넣고 -85 ℃의 진공상태에서 완전히 파우더 형태가 되도록 3일동안 건조시켰다.
제조예 2-3: PEG화된 케라틴의 확인
제조예 2-2에서 얻은 PEG화된 케라틴을 NMR을 통해 분석하였다. 그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이 PEG화된 케라틴에서 각기 케라틴 및 PEG에서 특이적으로 나타나는 피크가 동시에 존재하고 있음을 확인하였다.
<제조예 3> 케라틴-히알루론산 복합체 (keratin-Hyaluronic acid Conjugate) 하이드로젤의 제조
제조예 3-1: 케라틴-히알루론산 복합체의 합성
500 mL 증류수에 히알루론산나트륨염(Hyaluronic acid sodium salt, HA)(분자량: 50000 Da & 2500000 Da (LifeCore biomedical, chaska, MN, 미국)) 800mg을 녹였다. 40 X 8 mm 마그네틱 교반봉([B00C3ME4ZA], 1572500 IKAFLON 40, IKA)과 MS-H-S10 10-Channel 마그네틱 교반기를 이용하여 300 rpm의 속도로 완전히 녹게 24시간 동안 교반하였다.
10 mL 증류수에 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메톡시몰폴리늄 클로라이드(DMTMM) n-수화물(327-53752, wako chemical) 16mg을 넣고 실온에서 2시간 교반하여 녹인 후 상기 히알루론산나트륨염 용액에 넣고 히알루론산나트륨염의 카르복실기(Carboxyl group)와 케라틴의 아민기(amine group)가 아미드화 반응을 할 수 있게 반응시켰다. 히알루론산나트륨염과 DMTMM이 반응된 용액을 Spectra/Por 투과막 튜브(직경 16 mm, 평폭 25 mm, MW10000, Spectrum)에 넣고 반응 후 DMTMM을 석출하기 위해 4L 증류수에 담궜다. 40 X 8 mm 마그네틱 교반봉([B00C3ME4ZA], 1572500 IKAFLON 40, IKA)과 MS-H-S10 10-Channel 마그네틱 교반기를 이용하여 500rpm의 속도로 실온에서 24시간 동안 교반기를 이용해서 제거하였다. 케라틴 파우더 (분자량:4~60000 Da) 1200mg 무게를 측정하여 300mL 증류수에 녹인 후 히알루론산나트륨염과 DMTMM이 반응된 용액의 카르복실기와 케라틴의 아민기가 아미드화 반응을 하여 최종 몰농도가 1:1 또는 3:1가 되도록 합성시켰다. 40 X 8 mm 마그네틱 교반봉([B00C3ME4ZA], 1572500 IKAFLON 40, IKA)과 MS-H-S10 10-Channel 마그네틱 교반기를 이용하여 500 rpm의 속도로 실온에서 3일 동안 교반기를 이용해서 합성하였다.
제조예 3-2: 케라틴-히알루론산 복합체의 정제
제조예 3-1의 반응이 끝난 후, Spectra/Por 투과막 튜브(직경 16 mm, 평폭 25 mm, MW10000, Spectrum)에 합성된 히알루론산-케라틴 용액을 한 튜브 당 100 mL씩 넣고, Spectra/Por RC 투석 튜빙 클로져(최대 폭 55 mm, Orange, Spectrum)를 양쪽 튜브에 패킹하였다. 5 L의 플라스틱 비이커 (5000cc, 지름 197mm, 높이 265mm)에 4L 증류수를 채워 합성된 히알루론산-케라틴 용액이 담긴 튜브를 넣고 마그네틱바를 교반하면서 투석하였다. 히알루론산-케라틴 용액 중 반응이 된 케라틴과 DMTMM을 완전히 제거하였다. 이때, 3시간마다 새로운 4 L의 증류수로 갈아주었으며, 실온에서 5일간 증류수를 갈아주면서 투석하였다. 최종적으로 완성된 히알루론산-케라틴 용액을 50 mL 원심관(17×120 mm, BD Falcon)에 35mL씩 나눠 담은 후, -70 ℃의 초저온냉장고 (Nihon freezer, Upright type, Single cooling type, 542ℓ)에 넣어 24시간 동안 완전히 동결시켰다. 원심관 뚜껑을 열고, 동결건조기(ALPHA 2-4 LSC PLUS, Laboratory freeze dryers, Christ)에 넣고 진공상태에서 완전히 파우더 형태가 되도록 3일 이상 동안 건조시켜, 최종 히알루론산-케라틴 젤 파우더를 얻었다.
실시예
<실시예 1> 폐암, 골육종 및 선암종 세포에서의 케라틴의 암세포 증식 억제능 확인
인간 폐암 세포(A549 ATCC® CCL-185™), 골육종 세포(U205), 인간 포유류 샘/유방 선암종 세포(MDA-MB-231 ATCC® HTB-26™), 인간 유방 선암종 세포(MCF-7 ATCC®) 및 쥐 선암종 세포 (4T1) 각각을, 24 웰 플레이트에 5x103 또는 1x104개씩 접종하고, 24시간 후에 high glucose DMEM 일반배지 또는 1%(w/v)의 케라틴이 포함된 high glucose DMEM 일반 배지로 바꾸어 주었다. 배양배지는 이틀에 한번씩 새로운 배지로 교환해 주었으며, 일정시간 배양한 후 인간 폐암 세포(A549 ATCC® CCL-185™), 골육종 세포(U205), 인간 포유류 샘/유방 선암종 세포(MDA-MB-231 ATCC® HTB-26™)에 대해서 Live&Dead assay를 수행하였으며, 인간 폐암 세포(A549 ATCC® CCL-185™), 골육종 세포(U205), 인간 포유류 샘/유방 선암종 세포(MDA-MB-231 ATCC® HTB-26™), 인간 유방 선암종 세포(MCF-7 ATCC®) 및 쥐 선암종 세포 (4T1)에 대해서 세포 증식 분석을 수행하였다.
실시예 1-1: Live&Dead assay
폐암 세포에 대하여 Live/Dead viability/cytotoxicity 키트(invitrogen)를 사용하여, Live&Dead assay를 수행하였다. DPBS 1ml에 0.5μl의 칼세인(Calcein)과 2.0μl의 에티듐 호모다이머(Ethidium Homodimer)를 넣고 섞어주었다. 배지를 제거한 후 DPBS로 세척한 각각의 웰에 위 혼합액을 200μl씩 넣어주었다. 알루미늄 호일로 빛을 차단하고, 37 ℃에서 10분 동안 인큐베이션한 후, DPBS로 세척해주고, 형광현미경(Olympus BX51)으로 관찰하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이 접종한 세포 밀도에 크게 상관없이 암세포의 증식이 억제되는 것을 확인하였다.
실시예 1-2: 세포 증식 분석
DPBS로 웰을 세척한 후, 각각의 웰에 high glucose DMEM 일반배지로 10배 희석된 Cell Counting Kit-8 용액(Dojindo laboratory)을 넣고, 알루미늄 호일로 빛을 차단한 후, 37 ℃에서 1시간 30분 동안 인큐베이션하였다(인큐베이션 시간은 4시간을 넘지 않는다). 인큐베이션 후, 각각의 웰에서 100μl씩을 96웰 플레이트에 옮기고, 96웰 포맷 플레이트 리더(format plate reader, ELX 800 universal microplate Reader, Bio Tek, Inc.) 기기를 이용하여 450nm 파장(O.D 450nm)에서 흡광도를 측정하였다.
케라틴 처리 1일, 4일 및 7일 후에 인간 폐암 세포(A549 ATCC® CCL-185™), 골육종 세포(U205) 및 인간 포유류 샘/유방 선암종 세포(MDA-MB-231 ATCC® HTB-26™)의 증식능을 평가한 결과, 도 3 내지 5에 나타난 바와 같이, 케라틴을 처리하지 않은 그룹에 비해 케라틴을 처리한 그룹에서 세포의 증식이 현저히 억제됨을 확인하였다. 또한 케라틴 처리 1일, 2일 및 3일 후에 인간 유방 선암종 세포(MCF-7 ATCC®) 및 쥐 선암종 세포 (4T1)의 증식능을 평가한 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 케라틴을 처리하지 않은 그룹에 비해 0.5% 이상의 농도인 케라틴을 처리한 그룹에서 세포의 증식이 현저히 억제됨을 확인하였다.
<실시예 2> 간암 세포에서 케라틴의 암세포 증식 억제능 확인
6웰 플레이트 또는 125㎠ 배양 플라스크에 간암 세포(HepG2 ATCC-HB-8065) 5x104개를 접종하고, 24시간 후 high glucose DMEM 일반 배지 또는 1%(w/v)의 케라틴이 포함된 high glucose DMEM 일반배지로 바꾸어 주었다. 48시간 동안 배양한 후, 세포의 증식 정도를 도립 현미경(inverted microscope)으로 관찰하고, RT-PCR과 RNA 염기서열 분석을 수행하였다.
실시예 2-1: 도립 현미경 관찰
현미경 관찰 결과, 도 7에 나타난 바와 같이 간암 세포(HepG2 ATCC-HB-8065)에 케라틴 처리시, 48시간 후에 세포의 증식이 억제됨을 확인하였다.
실시예 2-2: RT- PCR
RT-PCR분석을 위해 6웰 플레이트에서 배양한 세포들의 배양배지를 제거하고 DPBS로 세척해 주었다. RNA의 추출에 Hybrid-R 키트(Gene All)를 사용하였고, 나노드롭(MICROP UV-Vis Spectrophotometer M600)을 사용하여 정량 하였다. 1μg의 RNA를 AccuPower Cycle Script RT Premix (Bioneer, 대전, 한국)에 첨가하고, 열 순환기(T106, Bio-Rad)를 이용해 cDNA를 만들었다. 사용한 프라이머의 서열은 하기 [표 1]과 같다.
[표 1]
Figure PCTKR2017007597-appb-I000001
각각의 반응에 SYBR Green PCR Mix 10μL, 0.5pm의 프라이머(sense와 antisense)와 50nm의 주형(template)을 넣어주었다. RT-PCR은 RG6000 5plex HRM (Corbett Research)기기를 사용하였으며, 95 ℃에서 15초, 어닐링(annealing) 온도 57℃에서 45초로, 40 사이클을 설정하였다. 역치주기(Threshold cycle, Ct) 값을 측정하기 위해, 상대정량(comparative Ct (2-ΔΔCt))법을 사용하였다.
그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, 암증식과 혈관생성에 관여하는 ID1과, 세포사멸에 관여하는 p53의 음성 조절자인 HipK2의 유전자 발현이 현저히 저하됨을 확인하였다.
실시예 2-3: RNA 염기서열 분석
RNA 염기서열 분석을 위해 125㎠ 배양 플라스크의 배양배지를 제거하고 DPBS로 세척해 주었다. RNA의 추출에 Hybrid-R 키트(Gene All)를 사용하였고, 나노드롭(MICROP UV-Vis Spectrophotometer M600)을 사용하여 정량 하였다. 추출된 10μg의 RNA를 무-RNase 마이크로원심분리기(RNase free microcentrifuge)에 옮기고, 얼음이 채워진 아이스박스에 넣어 마크로젠사에 보내 분석을 의뢰하였다.
그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이 RNA 염기서열 분석에서도 세포 사멸와 연관된 유전자인 GO:0043067, GO:0010941 및 GO:0042987 등의 발현이 증가되고, 세포 증식과 연관된 유전자인 GO:0022403, GO:0007049 및 GO:0000279 등의 발현이 억제됨을 확인하였다.
실시예 2-4: Live&Dead assay
삼차원적 in vitro 마이크로 간암세포유래 조직을 만들기 위해 직경 450 μm의 폴리에틸렌글리콜(PEG) 마이크로웰 어레이에 1 × 106세포/mL 농도의 세포 현탁액을 200 μL씩 접종 하여 세포 스페로이드(spheroid)를 형성 시킨 후, 1일 동안 high glucose DMEM 일반배지에 배양하였다. 24시간 후에 배양배지를 제거하고, PBS를 넣고 피펫팅을 통해 형성된 세포 스페로이드를 회수하였다. 회수된 세포를 HARV bioreactor (Synthecon)의 10ml 용기(vessel)에 옮기고, 각각의 용기에 high glucose DMEM 일반배지를 넣어 20rpm의 속도로 회전시키면서 동적 배양(dynamic culture)을 수행하였다. 4일간 배양 후, Live/Dead viability/cytotoxicity 키트(invitrogen)를 사용하여 Live&Dead assay를 수행하였다. DPBS 1ml에 0.5μl의 칼세인(Calcein)과 2.0μl의 에티듐 호모다이머(Ethidium Homodimer)를 넣고 섞어주었다. 배지를 제거한 후 DPBS로 세척한 각각의 웰에 위 혼합액을 200μl씩 넣어주었다. 알루미늄 호일로 빛을 차단하고, 37 ℃에서 10분 동안 인큐베이션한 후, DPBS로 세척해주고, 형광현미경(Olympus BX51)으로 관찰하였다.
그 결과, 도 10에 나타난 바와 같이, 삼차원적 간암 세포 유래 마이크로조직에서도 케라틴 처리 시 세포가 사멸되는 것을 확인하였다.
<실시예 3> PEG화된 케라틴의 암세포 증식 억제능 확인
인간 폐암 세포(A549 ATCC® CCL-185™), 인간 포유류 샘/유방 선암종 세포(MDA-MB-231 ATCC® HTB-26™) 및 간암 세포(HepG2 ATCC-HB-8065) 각각을, 24 웰 플레이트에 5x103 또는 1x104개씩 접종하고, high glucose DMEM 일반 배지, 1%(w/v)의 케라틴이 포함된 high glucose DMEM 일반 배지, 또는 2%(w/v)의 PEG화된 케라틴이 포함된 high glucose DMEM 일반 배지로 바꾸어 주었다. 배양배지는 이틀에 한번씩 새로운 배지로 교환해 주었다. 일정 시간 배양한 후에 Live&Dead assay 및 세포 증식 분석을 수행하였다.
실시예 3-1: Live&Dead assay
Live/Dead viability/cytotoxicity 키트(invitrogen)를 사용하여, Live&Dead assay를 수행하였다. DPBS 1ml에 0.5μl의 칼세인(Calcein)과 2.0μl의 에티듐 호모다이머(Ethidium Homodimer)를 넣고 섞어주었다. 배지를 제거한 후 DPBS로 세척한 각각의 웰에 위 혼합액을 200μl씩 넣어주었다. 알루미늄 호일로 빛을 차단하고, 37 ℃에서 10분 동안 인큐베이션한 후, DPBS로 세척해주고, 형광 현미경(Olympus BX51)으로 관찰하였다.
그 결과, 도 11에 나타난 바와 같이 각 암세포들의 증식이 억제되는 것을 확인하였다.
실시예 3-2: 세포 증식 분석
DPBS로 웰을 세척한 후, 각각의 웰에 high glucose DMEM 일반 배지로 10배 희석된 Cell Counting Kit-8 용액(Dojindo laboratory)을 넣고, 알루미늄 호일로 빛을 차단한 후, 37 ℃에서 1시간 30분 동안 인큐베이션하였다 (인큐베이션 시간은 4시간을 넘지 않는다). 인큐베이션 후, 각각의 웰에서 100μl씩을 96웰 플레이트에 옮기고, 96웰 포맷 플레이트 리더(ELX 800 universal micro plate Reader, Bio Tek, Inc.) 기기를 이용하여 450nm 파장(O.D 450nm)에서 흡광도를 측정하였다.
PEG화된 케라틴 처리 1일, 4일 및 7일 후에 각 암세포들의 증식능을 평가한 결과, 도 12에 나타난 바와 같이, PEG화된 케라틴을 처리하지 않은 그룹에 비해 PEG화된 케라틴을 처리한 그룹에서 세포의 증식이 현저히 억제됨을 확인하였다.
<실시예 4> 케라틴-히알루론산 복합체의 암세포 증식 억제능 확인
사람 유방 선암종 세포(MCF-7 ATCC®) 및 쥐 유방 선암종 세포 (4T1) 각각을, 24 웰 플레이트에 1x104개씩 접종하고, 24시간 후에 high glucose DMEM 일반배지 또는 0.25-4% (w/v)의 케라틴 또는 2% 케라틴-히알루론산 복합체가 포함된 high glucose DMEM 일반 배지로 바꾸어 주었다. 배양배지는 매일 한번씩 새로운 배지로 교환해 주었으며, 일정시간 배양한 후 세포 증식 분석을 수행하였다.
DPBS로 웰을 세척한 후, 각각의 웰에 high glucose DMEM 일반 배지로 10배 희석된 Cell Counting Kit-8 용액(Dojindo laboratory)을 넣고, 알루미늄 호일로 빛을 차단한 후, 37 ℃에서 1시간 30분 동안 인큐베이션하였다 (인큐베이션 시간은 4시간을 넘지 않는다). 인큐베이션 후, 각각의 웰에서 100μl씩을 96웰 플레이트에 옮기고, 96웰 포맷 플레이트 리더(ELX 800 universal micro plate Reader, Bio Tek, Inc.) 기기를 이용하여 450nm 파장(O.D 450nm)에서 흡광도를 측정하였다.
케라틴-히알루론산 복합체 처리 1일, 2일 및 3일 후에 각 암세포들의 증식능을 평가한 결과, 도 14에 나타난 바와 같이, 케라틴-히알루론산 복합체의 처리시 세포의 증식이 현저히 억제됨을 확인하였다.

Claims (15)

  1. 케라틴을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 케라틴은 사람의 머리카락으로부터 수득된 것인 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 암은 간암, 폐암, 비소세포성 폐암, 골암, 유방암, 선암종, 위암, 췌장암, 방광암, 신장암, 수뇨관 암, 대장암, 자궁암, 자궁경부암, 전립선암, 식도암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 뇌종양, 척수종양 또는 혈액암인 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 암은 간암, 폐암, 골암 또는 유방암인 약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 케라틴이 0.001 %(w/v) 내지 10 %(w/v)의 함량으로 포함되는 약학적 조성물.
  6. PEG화된 케라틴을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 PEG화된 케라틴은 케라틴의 아민기에 PEG가 결합된 것인 약학적 조성물.
  8. 제6항에 있어서, 상기 PEG화된 케라틴은
    i) O-메틸-O`-숙시닐 폴리에틸렌글리콜을 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일) 4-메톡시몰폴리늄 클로라이드(DMTMM)와 반응시키는 단계; 및
    ii) 단계i)에서 생성된 물질을 케라틴과 반응시켜 PEG화된 케라틴을 생성하는 단계를 포함하는 방법으로 제조된 것인 약학적 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 암은 간암, 폐암, 비소세포성 폐암, 골암, 유방암, 선암종, 위암, 췌장암, 방광암, 신장암, 수뇨관 암, 대장암, 자궁암, 자궁경부암, 전립선암, 식도암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 뇌종양, 척수종양 또는 혈액암인 약학적 조성물.
  10. 제8항에 있어서, 상기 암은 간암, 폐암, 골암 또는 유방암인 약학적 조성물.
  11. 케라틴-히알루론산 복합체를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  12. 제 11항에 있어서, 케라틴-히알루론산 복합체는 케라틴과 히알루론산이 아미드 결합한 것인 약학적 조성물.
  13. 제 11항에 있어서, 케라틴-히알루론산 복합체는 히알루론산의 카르복실기(Carboxyl group)와 케라틴의 아민기(amine group)를 아미드화 반응으로 결합시켜 제조된 것인 약학적 조성물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에 투여함으로써 암을 예방 또는 치료하는 방법.
  15. 암의 예방 또는 치료용 약제의 제조를 위한 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 약학적 조성물의 용도.
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