WO2017221879A1 - トロフィックファクタ放出剤および炎症疾患処置剤 - Google Patents

トロフィックファクタ放出剤および炎症疾患処置剤 Download PDF

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cells
cell
amino acid
polymer block
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中村　健太郎
彩也子 小境
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富士フイルム株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]

Definitions

  • the present invention relates to a tropic factor release agent and an inflammatory disease treatment agent. More specifically, the present invention relates to a tropic comprising a cell structure, comprising a biocompatible polymer block and cells, wherein a plurality of biocompatible polymer blocks are disposed in gaps between the plurality of cells. The present invention relates to a factor release agent and an inflammatory disease treatment agent.
  • tropic factor therapy in which cells are locally administered and treated with the tropic factor produced by the cells is being studied.
  • tropic factor therapy when cells are locally administered, it is attempted to administer the locally administered cells as a cell mass so that the cells remain in the administration site and are engrafted.
  • Non-Patent Document 1 describes that human mesenchymal stem / stromal cells cultured as spheroids are self-activated and produce prostaglandin E2.
  • Non-Patent Document 2 describes that spheroids of human mesenchymal stromal cells secrete TSG-6, which is an anti-inflammatory protein.
  • Patent Document 1 describes fine particles mainly composed of biocompatible and biodegradable materials.
  • the biocompatible and biodegradable material has transplanted cells on the surface, and the microparticles are incorporated into the microparticles and are active on the cell or its environment upon implantation. Contains substances.
  • the microparticles also have a diameter of 10 to 500 ⁇ m and further include a coating of a cell adhesive compound.
  • the agent is selected from the group consisting of growth factors, hormones and cytokines and is sustained and controlled release by the microparticles.
  • Patent Document 2 discloses a method for preventing / treating inflammatory bowel disease by administering MSC intravenously.
  • Several clinical studies and trials are also being conducted.
  • Non-patent Document 3 Studies have also been conducted to enhance anti-inflammatory ability by introducing genes into MSC itself.
  • Non-patent Document 4 introduction of a gene into the cell itself is not always a desirable option in view of the effect on its effectiveness and safety.
  • Patent Document 3 describes a cell structure including a polymer block having biocompatibility and cells, and a plurality of the polymer blocks arranged in the gaps between the plurality of cells.
  • nutrients can be delivered from the outside to the inside of the cell structure.
  • Patent Document 4 discloses a cell structure for cell transplantation, which includes a polymer block having biocompatibility and at least one kind of cell, and a plurality of the polymer blocks are arranged in a gap between the plurality of cells. The body is listed. In the example of Patent Document 4, it is described that blood vessels can be formed using a cell structure for cell transplantation.
  • An object of the present invention is to provide a tropic factor releasing agent in which the amount of tropic factor released by a cell is increased as compared with the case of using a cell mass. Furthermore, this invention made it the subject which should be solved to provide the inflammatory disease treatment agent.
  • the present inventor includes a biocompatible polymer block and cells, and a plurality of biocompatible polymer blocks are arranged in a gap between a plurality of cells.
  • the amount of tropic factor released by the cell is increased as compared with the cell mass not containing the biocompatible polymer block, and the cell structure is useful for the treatment of inflammatory diseases.
  • the present invention has been completed.
  • a tropic factor releasing agent comprising a cell structure, comprising a biocompatible polymer block and cells, wherein a plurality of biocompatible polymer blocks are arranged in a gap between a plurality of cells.
  • a tropic factor releasing agent wherein the biocompatible polymer block has a size of 20 ⁇ m or more and 200 ⁇ m or less and tropic factor is released from the cells.
  • ⁇ 3> The tropic factor releasing agent according to ⁇ 1> or ⁇ 2>, wherein in the biocompatible polymer block, the biocompatible polymer is crosslinked by heat, ultraviolet rays or an enzyme.
  • ⁇ 4> The tropic factor releasing agent according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3>, wherein the biocompatible polymer block is amorphous.
  • ⁇ 5> The tropic factor releasing agent according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 4>, wherein the cell structure comprises a biocompatible polymer block of 0.0000001 ⁇ g or more and 1 ⁇ g or less per cell.
  • ⁇ 6> The tropic factor releasing agent according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 5>, wherein the cell is a somatic stem cell.
  • ⁇ 7> The tropic factor releasing agent according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 6>, wherein the tropic factor is a cytokine.
  • Biocompatible polymers are gelatin, collagen, atelocollagen, elastin, fibronectin, pronectin, laminin, tenascin, fibrin, fibroin, entactin, thrombospondin, retronectin (registered trademark), polylactic acid, polyglycolic acid, lactic acid
  • the tropic factor releasing agent according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 7>, which is a glycolic acid copolymer, hyaluronic acid, glycosaminoglycan, proteoglycan, chondroitin, cellulose, agarose, carboxymethylcellulose, chitin, or chitosan .
  • ⁇ 9> The tropic factor releasing agent according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 8>, wherein the biocompatible polymer is recombinant gelatin.
  • A represents any amino acid or amino acid sequence
  • B represents any amino acid or amino acid sequence
  • n Xs independently represent any of the amino acids
  • n Ys each independently represent an amino acid.
  • N represents an integer of 3 to 100
  • m represents an integer of 2 to 10.
  • the n Gly-XY may be the same or different.
  • ⁇ 11> Recombinant gelatin (1) a peptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1; (2) a peptide having a bioaffinity consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1, or (3) described in SEQ ID NO: 1
  • the tropic factor releasing agent according to ⁇ 9> or ⁇ 10>, wherein ⁇ 12> An inflammatory disease treatment agent comprising the tropic factor releasing agent according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 11>.
  • ⁇ 13> a cell structure including a biocompatible polymer block and a mesenchymal stem cell, wherein a plurality of biocompatible polymer blocks are disposed in a gap between the plurality of mesenchymal stem cells.
  • An inflammatory disease treatment agent wherein the biocompatible polymer block has a size of 20 ⁇ m or more and 200 ⁇ m or less.
  • ⁇ 15> The inflammatory disease treatment agent according to ⁇ 13> or ⁇ 14>, wherein in the biocompatible polymer block, the biocompatible polymer is crosslinked by heat, ultraviolet light or an enzyme.
  • ⁇ 16> The inflammatory disease treatment agent according to any one of ⁇ 13> to ⁇ 15>, wherein the biocompatible polymer block is amorphous.
  • ⁇ 17> The inflammatory disease treatment agent according to any one of ⁇ 13> to ⁇ 16>, wherein the cell structure comprises a biocompatible polymer block of 0.0000001 ⁇ g or more and 1 ⁇ g or less per cell.
  • Biocompatible polymers are gelatin, collagen, atelocollagen, elastin, fibronectin, pronectin, laminin, tenascin, fibrin, fibroin, entactin, thrombospondin, retronectin (registered trademark), polylactic acid, polyglycolic acid, lactic acid
  • the therapeutic agent for inflammatory diseases according to any one of ⁇ 13> to ⁇ 18>, which is glycolic acid copolymer, hyaluronic acid, glycosaminoglycan, proteoglycan, chondroitin, cellulose, agarose, carboxymethylcellulose, chitin, or chitosan.
  • ⁇ 20> The inflammatory disease treatment agent according to any one of ⁇ 13> to ⁇ 19>, wherein the biocompatible polymer is recombinant gelatin.
  • ⁇ 21> The inflammatory disease treatment agent according to ⁇ 20>, wherein the recombinant gelatin is represented by the following formula 1.
  • A represents any amino acid or amino acid sequence
  • B represents any amino acid or amino acid sequence
  • n Xs independently represent any of the amino acids
  • n Ys each independently represent an amino acid.
  • N represents an integer of 3 to 100
  • m represents an integer of 2 to 10.
  • the n Gly-XY may be the same or different.
  • Recombinant gelatin is (1) a peptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1; (2) a peptide having a bioaffinity consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1, or (3) described in SEQ ID NO: 1
  • the therapeutic agent for inflammatory disease according to ⁇ 20> or ⁇ 21>, wherein ⁇ 23>
  • the inflammatory disease treatment agent according to any one of ⁇ 13> to ⁇ 22>, wherein the mesenchymal stem cells are human or dog-derived mesenchymal stem cells.
  • a cell structure comprising a biocompatible polymer block and a cell, wherein a plurality of biocompatible polymer blocks are arranged in a gap between the plurality of cells
  • a method for releasing a tropic factor comprising a step of transplanting a cell structure having a size of one molecular block of 20 ⁇ m or more and 200 ⁇ m or less to a subject who needs the tropic factor.
  • B A cell structure comprising a biocompatible polymer block and cells, wherein a plurality of biocompatible polymer blocks are arranged in the gaps between the plurality of cells.
  • a method for treating an inflammatory disease comprising a step of transplanting a cell structure having a size of one molecular block of 20 ⁇ m or more and 200 ⁇ m or less to a subject in need of treatment of the inflammatory disease.
  • D A cell structure comprising a biocompatible polymer block and cells for the treatment of inflammatory diseases, wherein a plurality of biocompatible polymer blocks are arranged in a gap between a plurality of cells.
  • a cell structure in which the size of one biocompatible polymer block is 20 ⁇ m or more and 200 ⁇ m or less.
  • a cell comprising a biocompatible polymer block and a cell for producing a tropic factor releasing agent, wherein a plurality of biocompatible polymer blocks are arranged in a gap between the plurality of cells.
  • Use of a cell structure wherein the size of one biocompatible polymer block is 20 ⁇ m or more and 200 ⁇ m or less.
  • Cell structure comprising a biocompatible polymer block and cells for the manufacture of a therapeutic agent for inflammatory diseases, wherein a plurality of biocompatible polymer blocks are arranged in a gap between a plurality of cells
  • Use of a cell structure wherein the size of one biocompatible polymer block is 20 ⁇ m or more and 200 ⁇ m or less.
  • the amount of tropic factor released by the cells can be increased as compared with the case of using a cell mass.
  • the inflammatory disease treatment agent of this invention the inflammatory disease treatment effect can be increased compared with the case where a cell mass is used.
  • FIG. 1 shows the liquid temperature profiling of the experiment described in Condition A.
  • FIG. 2 shows the liquid temperature profiling of the experiment described in Condition B.
  • FIG. 3 shows the liquid temperature profiling of the experiment described in condition C.
  • FIG. 4 shows the results of measuring the amount of TSG-6 production and release dependent on the inflammation-stimulated TNF ⁇ .
  • FIG. 5 shows the results of determining the amount of TSG-6 production / release dependent on the inflammation-stimulated TNF ⁇ as the amount of production / release per cell.
  • FIG. 6 shows the results of measuring the body weight of mice induced with 2.5 mass% sodium dextran sulfate (DSS).
  • FIG. 7 shows the results of measuring the body weight of mice induced with 2.5 mass% sodium dextran sulfate (DSS).
  • FIG. 8 shows the results of measuring the body weight of mice induced with 3.0 mass% dextran sulfate sodium (DSS).
  • FIG. 9 shows the results of measuring the body weight of mice induced with 3.0 mass% dextran sulfate sodium (DSS).
  • FIG. 10 shows the results of measuring the length of the large intestine of 3.0% by mass dextran sulfate sodium (DSS) -induced mice.
  • FIG. 11 shows the pathological score of 3.0 mass% dextran sulfate sodium (DSS) induced mice.
  • FIG. 12 shows representative HE tissue stained images of each mouse group.
  • FIG. 13 shows representative HE tissue stained images of each mouse group.
  • FIG. 14 shows the measurement results of the average number of divisions of T cells.
  • FIG. 15 shows the quantification results of IL-2.
  • FIG. 16 shows the average value of the body weight ratio (%) of each mouse group relative to normal mice.
  • FIG. 17 shows the results of measuring the length of the large intestine of
  • the cell structure used in the present invention may be referred to as a mosaic cell mass (a mosaic cell mass).
  • “to” indicates a range including the numerical values described before and after the minimum and maximum values, respectively.
  • the present invention relates to a tropic factor releasing agent comprising a cell structure, comprising a biocompatible polymer block and cells, wherein a plurality of biocompatible polymer blocks are arranged in the gaps between the plurality of cells.
  • the biocompatible polymer block has a size of 20 ⁇ m or more and 200 ⁇ m or less, and relates to a tropic factor releasing agent that releases tropic factor from the cells.
  • the amount of various tropic factors released using the mosaic cell mass and the cell mass was measured, and as a result, the tropic released from the mosaic cell mass with respect to the amount released from the cell mass.
  • the factor increased (Example 8).
  • the degree of increase in the amount of release differs depending on the type of tropic factor
  • the factor that increases the amount of released tropic factor is the mosaic cell mass. It is presumed that not only the increase in the number of viable cells due to this, but also the increase effect of the released amount is exhibited by other factors.
  • the amount of TSG-6 released was measured using a mosaic cell mass and the cell mass, the tropic factor released from the mosaic cell mass relative to the amount released from the cell mass. Increased (Example 11). Also. The amount of TSG-6 released after TNF ⁇ stimulation was measured using the mosaic cell mass and the cell mass, and the tropic factor released from the mosaic cell mass was greatly increased relative to the amount released from the cell mass. (Example 12).
  • Non-patent document 1 or non-patent document 2 describes that spheroids (cell mass) of human mesenchymal stem / stromal cells produce tropic factor, but there is no description of mosaic cell mass.
  • Patent Document 1 describes that microparticles mainly composed of biocompatible and biodegradable materials contain an active substance selected from the group consisting of growth factors, hormones, and cytokines. The substance is not released from the cell, and Patent Document 1 does not describe that the cell produces a tropic factor.
  • Patent Document 2 describes a mosaic cell mass, but there is no description about the release of tropic factors from cells.
  • FIG. 6 of Non-Patent Document 1 and FIG. 6 of Non-Patent Document 2 show that the production amount of tropic factor is larger in spheroids than in flat culture.
  • the cell culture is considered to have a better nutritional state than the spheroid in the flat culture, it is assumed that the amount of tropic factor produced does not depend on the nutritional state of the cells.
  • Patent Document 2 describes that the mosaic cell mass has a better nutritional state than the spheroid, but it is assumed that the amount of tropic factor produced does not depend on the nutritional state of the cells. Therefore, the effect of the present invention cannot be expected from the descriptions of Non-Patent Documents 1 and 2 and Patent Document 1.
  • a tropic factor from a cell in a cell structure comprising a biocompatible polymer block and a cell, wherein a plurality of biocompatible polymer blocks are arranged in gaps between the plurality of cells. It is an effect that cannot be expected from the prior art to increase the amount of released as compared with the cell mass.
  • the biocompatible polymer used in the present invention is not particularly limited as to whether or not it is degraded in vivo as long as it has affinity for the living body, but is preferably a biodegradable polymer.
  • Specific examples of non-biodegradable materials include polytetrafluoroethylene (PTFE), polyurethane, polypropylene, polyester, vinyl chloride, polycarbonate, acrylic, stainless steel, titanium, silicone, and MPC (2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine). Can be mentioned.
  • biodegradable materials include naturally occurring peptides, polypeptides such as recombinant peptides or chemically synthesized peptides (eg, gelatin described below), polylactic acid, polyglycolic acid, and lactic acid / glycolic acid copolymers. (PLGA), hyaluronic acid, glycosaminoglycan, proteoglycan, chondroitin, cellulose, agarose, carboxymethylcellulose, chitin, and chitosan.
  • a recombinant peptide is particularly preferable.
  • biocompatible polymers may be devised to enhance cell adhesion.
  • cell adhesion substrate fibronectin, vitronectin, laminin
  • cell adhesion sequence amino acid single letter notation, RGD sequence, LDV sequence, REDV sequence, YIGSR sequence, PDSGR sequence, RYVVLPR sequence expressed on the substrate surface
  • LGTIPG sequence RNIAEIIKDI sequence, IKVAV sequence, LRE sequence, DGEA sequence, and HAV sequence
  • substrate surface amination, cationization or “substrate surface plasma treatment, corona discharge hydrophilicity”
  • polypeptide including recombinant peptide or chemically synthesized peptide is not particularly limited as long as it has biocompatibility.
  • gelatin, collagen, atelocollagen, elastin, fibronectin, pronectin, laminin, tenascin, fibrin, fibroin, enteractin , Thrombospondin, and RetroNectin (registered trademark) are preferable, and gelatin, collagen, and atelocollagen are most preferable.
  • the gelatin for use in the present invention is preferably natural gelatin, recombinant gelatin or chemically synthesized gelatin, and more preferably recombinant gelatin.
  • natural gelatin means gelatin made from naturally derived collagen.
  • Chemically synthesized peptide or chemically synthesized gelatin means an artificially synthesized peptide or gelatin.
  • the peptide such as gelatin may be synthesized by solid phase synthesis or liquid phase synthesis, but is preferably solid phase synthesis.
  • Solid-phase synthesis of peptides is known to those skilled in the art. For example, Fmoc group synthesis method using Fmoc group (Fluorenyl-Methoxy-Carbonyl group) as amino group protection, and Boc group (tert-Butyl group) as amino group protection Boc group synthesis method using Oxy Carbonyl group).
  • the preferable aspect of chemically synthesized gelatin can apply the content described in the recombinant gelatin mentioned later in this specification.
  • the hydrophilicity value “1 / IOB” value of the biocompatible polymer used in the present invention is preferably from 0 to 1.0. More preferably, it is 0 to 0.6, and still more preferably 0 to 0.4.
  • IOB is an index of hydrophilicity / hydrophobicity based on an organic conceptual diagram representing the polarity / non-polarity of an organic compound proposed by Satoshi Fujita. Details thereof can be found in, for example, “Pharmaceutical Bulletin”, vol.2, 2, pp .163-173 (1954), “Area of Chemistry” vol.11, 10, pp.719-725 (1957), “Fragrance Journal”, vol.50, pp.79-82 (1981), etc. Yes.
  • methane (CH 4 ) is the source of all organic compounds, and all the other compounds are all methane derivatives, with certain numbers set for their carbon number, substituents, transformations, rings, etc. Then, the score is added to obtain an organic value (OV) and an inorganic value (IV), and these values are plotted on a diagram with the organic value on the X axis and the inorganic value on the Y axis. It is going.
  • the IOB in the organic conceptual diagram refers to the ratio of the inorganic value (IV) to the organic value (OV) in the organic conceptual diagram, that is, “inorganic value (IV) / organic value (OV)”.
  • hydrophilicity / hydrophobicity is represented by a “1 / IOB” value obtained by taking the reciprocal of IOB. The smaller the “1 / IOB” value (closer to 0), the more hydrophilic it is.
  • the hydrophilicity is high and the water absorption is high. It is presumed that it contributes to the stabilization and survival of cells in the cell structure (mosaic cell mass) according to the invention.
  • the biocompatible polymer used in the present invention is a polypeptide
  • the hydrophilicity / hydrophobicity index represented by Grand ⁇ average of hydropathicity (GRAVY) value 0.3 or less, preferably minus 9.0 or more, More preferably, it is 0.0 or less and minus 7.0 or more.
  • Grand average of hydropathicity (GRAVY) values are: Gasteiger E., Hoogland C., Gattiker A., Duvaud S., Wilkins MR, Appel RD, Bairoch A.; Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server John M. Walker (ed): The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press (2005). Pp.
  • the GRAVY value of the polymer used in the present invention in the above range, it has high hydrophilicity and high water absorption, so that it effectively acts on retention of nutrient components, and as a result, the cell according to the present invention. It is presumed to contribute to the stabilization and survival of cells in the structure (mosaic cell mass).
  • the biocompatible polymer used in the present invention may be cross-linked or non-cross-linked, but is preferably cross-linked.
  • a cross-linked biocompatible polymer it is possible to obtain an effect of preventing instantaneous degradation when cultured in a medium or transplanted to a living body.
  • crosslinking methods include thermal crosslinking, crosslinking with aldehydes (eg, formaldehyde, glutaraldehyde, etc.), crosslinking with condensing agents (carbodiimide, cyanamide, etc.), enzyme crosslinking, photocrosslinking, UV crosslinking, hydrophobic interaction, Hydrogen bonding, ionic interaction, and the like are known, and the above crosslinking method can also be used in the present invention.
  • the crosslinking method used in the present invention is more preferably thermal crosslinking, ultraviolet crosslinking, or enzyme crosslinking, and particularly preferably thermal crosslinking.
  • the enzyme When performing cross-linking with an enzyme, the enzyme is not particularly limited as long as it has a cross-linking action between polymer materials. However, it is preferable to perform cross-linking using transglutaminase or laccase, most preferably transglutaminase. .
  • transglutaminase A specific example of a protein that is enzymatically cross-linked with transglutaminase is not particularly limited as long as it has a lysine residue and a glutamine residue.
  • the transglutaminase may be derived from a mammal or a microorganism. Specifically, transglutaminase derived from a mammal sold as an Ajinomoto Co., Ltd.
  • Guinea pig liver-derived transglutaminase such as Oriental Yeast Industry Co., Ltd., Upstate® USA Inc., Biodesign® International, etc.
  • goat-derived transglutaminase rabbit-derived transglutaminase, etc.
  • human-derived blood coagulation factors Factor® XIIIa, Haematologic® Technologies, Inc.
  • the reaction temperature at the time of performing crosslinking is not particularly limited as long as crosslinking is possible, but is preferably ⁇ 100 ° C. to 500 ° C., more preferably 0 ° C. to 300 ° C., and still more preferably. It is 50 ° C to 300 ° C, particularly preferably 100 ° C to 250 ° C, and most preferably 120 ° C to 200 ° C.
  • the recombinant gelatin referred to in the present invention means a polypeptide or protein-like substance having an amino acid sequence similar to gelatin produced by a gene recombination technique.
  • the recombinant gelatin that can be used in the present invention preferably has a repeating sequence represented by Gly-XY, which is characteristic of collagen (X and Y independently represent any of amino acids).
  • Gly-XY is characteristic of collagen (X and Y independently represent any of amino acids).
  • the plurality of Gly-XY may be the same or different.
  • two or more cell adhesion signals are contained in one molecule.
  • recombinant gelatin used in the present invention recombinant gelatin having an amino acid sequence derived from a partial amino acid sequence of collagen can be used.
  • EP1014176, US Pat. No. 6,992,172, International Publication WO2004 / 85473, International Publication WO2008 / 103041, and the like can be used, but are not limited thereto.
  • a preferable example of the recombinant gelatin used in the present invention is the recombinant gelatin of the following embodiment.
  • Recombinant gelatin has excellent biocompatibility due to the inherent performance of natural gelatin, and is not naturally derived, so there is no concern about bovine spongiform encephalopathy (BSE) and excellent non-infectivity. Recombinant gelatin is more uniform than natural gelatin and its sequence is determined, so that strength and degradability can be precisely designed with less blur due to crosslinking or the like.
  • BSE bovine spongiform encephalopathy
  • the molecular weight of the recombinant gelatin is not particularly limited, but is preferably 2000 or more and 100000 or less (2 kDa (kilo dalton) or more and 100 kDa or less), more preferably 2500 or more and 95000 or less (2.5 kDa or more and 95 kDa or less), and further preferably. Is from 5,000 to 90,000 (5 kDa to 90 kDa), and most preferably from 10,000 to 90,000 (10 kDa to 90 kDa).
  • Recombinant gelatin preferably has a repeating sequence represented by Gly-XY characteristic of collagen.
  • the plurality of Gly-XY may be the same or different.
  • Gly-XY Gly represents glycine
  • X and Y represent any amino acid (preferably any amino acid other than glycine).
  • the sequence represented by Gly-XY, which is characteristic of collagen, is a very specific partial structure in the amino acid composition and sequence of gelatin / collagen compared to other proteins. In this part, glycine accounts for about one third of the whole, and in the amino acid sequence, it is one in three repeats.
  • Glycine is the simplest amino acid, has few constraints on the arrangement of molecular chains, and greatly contributes to the regeneration of the helix structure upon gelation.
  • the amino acids represented by X and Y are rich in imino acids (proline, oxyproline), and preferably account for 10% to 45% of the total.
  • 80% or more, more preferably 95% or more, and most preferably 99% or more of the amino acid sequence of the recombinant gelatin is a Gly-XY repeating structure.
  • polar amino acids are charged and uncharged at 1: 1.
  • the polar amino acid specifically refers to cysteine, aspartic acid, glutamic acid, histidine, lysine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine and arginine, and among these polar uncharged amino acids are cysteine, asparagine, glutamine, serine. Refers to threonine and tyrosine.
  • the proportion of polar amino acids is 10 to 40%, preferably 20 to 30%, of all the constituent amino acids.
  • the proportion of uncharged amino acids in the polar amino acid is preferably 5% or more and less than 20%, preferably 5% or more and less than 10%. Furthermore, it is preferable that any one amino acid, preferably two or more amino acids among serine, threonine, asparagine, tyrosine and cysteine are not included in the sequence.
  • the minimum amino acid sequence that acts as a cell adhesion signal in a polypeptide is known (for example, “Pathophysiology”, Vol. 9, No. 7 (1990), page 527, published by Nagai Publishing Co., Ltd.).
  • the recombinant gelatin used in the present invention preferably has two or more of these cell adhesion signals in one molecule.
  • Specific sequences include RGD sequences, LDV sequences, REDV sequences, YIGSR sequences, PDSGR sequences, RYVVLPR sequences, LGITIPG sequences, RNIAEIIKDI sequences, which are expressed in one-letter amino acid notation in that many types of cells adhere.
  • IKVAV sequences IKVAV sequences, LRE sequences, DGEA sequences, and HAV sequences are preferred. More preferred are RGD sequence, YIGSR sequence, PDSGR sequence, LGTIPG sequence, IKVAV sequence and HAV sequence, and particularly preferred is RGD sequence. Of the RGD sequences, an ERGD sequence is preferred. By using recombinant gelatin having a cell adhesion signal, the amount of cell substrate produced can be improved.
  • the arrangement of RGD sequences in the recombinant gelatin used in the present invention is preferably such that the number of amino acids between RGDs is not uniform between 0 and 100, and more preferably the number of amino acids between RGDs is not uniform between 25 and 60. .
  • the content of the minimum amino acid sequence is preferably 3 to 50, more preferably 4 to 30, and particularly preferably 5 to 20 in one protein molecule from the viewpoint of cell adhesion and proliferation. Yes, most preferably 12.
  • the ratio of the RGD motif to the total number of amino acids is preferably at least 0.4%.
  • each stretch of 350 amino acids contains at least one RGD motif.
  • the ratio of the RGD motif to the total number of amino acids is more preferably at least 0.6%, even more preferably at least 0.8%, even more preferably at least 1.0%, particularly preferably at least 1.2%. %, Most preferably at least 1.5%.
  • the number of RGD motifs in the recombinant peptide is preferably at least 4, more preferably 6, more preferably 8, even more preferably 12 or more and 16 or less per 250 amino acids.
  • a ratio of 0.4% of the RGD motif corresponds to at least one RGD sequence per 250 amino acids. Since the number of RGD motifs is an integer, a gelatin of 251 amino acids must contain at least two RGD sequences to meet the 0.4% feature.
  • the recombinant gelatin of the present invention comprises at least 2 RGD sequences per 250 amino acids, more preferably comprises at least 3 RGD sequences per 250 amino acids, more preferably at least 4 per 250 amino acids. Contains the RGD sequence.
  • it preferably contains at least 4 RGD motifs, more preferably contains 6 RGD motifs, more preferably contains 8 RGD motifs, particularly preferably 12 or more and 16 or less RGD. Includes a motif.
  • Recombinant gelatin may be partially hydrolyzed.
  • the recombinant gelatin used in the present invention is represented by the formula 1: A-[(Gly-XY) n ] m -B.
  • n Xs independently represents any of amino acids
  • n Ys independently represents any of amino acids.
  • m is preferably an integer of 2 to 10, more preferably an integer of 3 to 5.
  • n is preferably an integer of 3 to 100, more preferably an integer of 15 to 70, and most preferably an integer of 50 to 65.
  • A represents any amino acid or amino acid sequence
  • B represents any amino acid or amino acid sequence.
  • the n Gly-XY may be the same or different.
  • the recombinant gelatin used in the present invention is Gly-Ala-Pro-[(Gly-XY) 63 ] 3 -Gly (wherein 63 X independently represent any of amino acids, 63 Y's each independently represent any of the amino acids, wherein 63 Gly-XY may be the same or different.
  • the naturally occurring collagen referred to here may be any naturally occurring collagen, but is preferably type I, type II, type III, type IV, or type V collagen. More preferred is type I, type II, or type III collagen.
  • the collagen origin is preferably human, bovine, porcine, mouse or rat, more preferably human.
  • the isoelectric point of the recombinant gelatin used in the present invention is preferably 5 to 10, more preferably 6 to 10, and further preferably 7 to 9.5.
  • the measurement of the isoelectric point of recombinant gelatin was described in the isoelectric focusing method (see Maxey, CR (1976; Phitogr. Gelatin 2, Editor Cox, PJ Academic, London, Engl.). Thus, it can be carried out by measuring the pH after passing a 1% by mass gelatin solution through a mixed crystal column of cation and anion exchange resin.
  • the recombinant gelatin is not deaminated.
  • the recombinant gelatin has no telopeptide.
  • the recombinant gelatin is a substantially pure polypeptide prepared with a nucleic acid encoding an amino acid sequence.
  • a peptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1; (2) a peptide having a bioaffinity consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1, or (3) described in SEQ ID NO: 1
  • sequence identity between two amino acid sequences can be determined by any method known to those skilled in the art, and the BLAST ((Basic Local Alignment Search Tool)) program (J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990) Etc. can be used to determine.
  • amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and further preferably 1 to 5. Means, particularly preferably 1 to 3.
  • the recombinant gelatin used in the present invention can be produced by a genetic recombination technique known to those skilled in the art. For example, in EP1014176A2, US Pat. No. 6,992,172, International Publication WO2004 / 85473, International Publication WO2008 / 103041, etc. It can be produced according to the method described. Specifically, a gene encoding the amino acid sequence of a predetermined recombinant gelatin is obtained, and this is incorporated into an expression vector to produce a recombinant expression vector, which is introduced into an appropriate host to produce a transformant. . Recombinant gelatin is produced by culturing the obtained transformant in an appropriate medium. Therefore, the recombinant gelatin used in the present invention can be prepared by recovering the recombinant gelatin produced from the culture. .
  • Bioaffinity polymer block In the present invention, a block (lumb) made of the above-described bioaffinity polymer is used.
  • the shape of the biocompatible polymer block in the present invention is not particularly limited. For example, amorphous, spherical, particulate (granule), powder, porous, fiber, spindle, flat and sheet, preferably amorphous, spherical, particulate (granule), powder And porous.
  • An indeterminate shape indicates that the surface shape is not uniform, for example, an object having irregularities such as rocks.
  • illustration of said shape is not different, respectively, For example, it may become an indefinite form as an example of the subordinate concept of a particulate form (granule).
  • the shape of the biocompatible polymer block in the present invention is not particularly limited as described above, but the tap density is preferably 10 mg / cm 3 or more and 500 mg / cm 3 or less, more preferably 20 mg / cm 3. It is 400 mg / cm 3 or less, more preferably 40 mg / cm 3 or more and 220 mg / cm 3 or less, and particularly preferably 50 mg / cm 3 or more and 150 mg / cm 3 or less.
  • the tap density is a value that indicates how many blocks can be densely packed in a certain volume. It can be seen that the smaller the value, the more densely packed, that is, the more complicated the block structure.
  • the tap density of the biocompatible polymer block represents the complexity of the surface structure of the biocompatible polymer block and the amount of voids formed when the biocompatible polymer block is collected as an aggregate. it is conceivable that. The smaller the tap density, the more voids between the biocompatible polymer blocks and the larger the cell engraftment area.
  • a biocompatible polymer block can appropriately exist between cells, and when a cell structure is formed, nutrients can be delivered to the inside of the structure. It is considered that it is preferable to be within the range.
  • the tap density as used in this specification can be measured as follows.
  • a container hereinafter referred to as a cap
  • a funnel is attached to the cap and the block is poured from the funnel so that the block accumulates in the cap.
  • tap the cap part 200 times on a hard place such as a desk, remove the funnel and clean with a spatula.
  • the mass is measured with the cap fully filled.
  • the degree of crosslinking of the biocompatible polymer block in the present invention is not particularly limited, but is preferably 2 or more, more preferably 2 or more and 30 or less, still more preferably 4 or more and 25 or less, and particularly preferably 4 It is 22 or less.
  • the method for measuring the degree of crosslinking of the biocompatible polymer block is not particularly limited.
  • the biocompatible polymer is CBE3, for example, TNBS (2 , 4,6-trinitrobenzenesulfonic acid) method.
  • the biocompatible polymer block, the NaHCO 3 aqueous solution and the TNBS aqueous solution were mixed and reacted at 37 ° C. for 3 hours, and then the reaction was stopped.
  • the biocompatible polymer block, the NaHCO 3 aqueous solution and the TNBS aqueous solution A blank whose reaction was stopped immediately after mixing was prepared, and the absorbance (345 nm) of the sample diluted with pure water and the blank was measured. From the following (Equation 2) and (Equation 3), the crosslinking degree (1 The number of crosslinks per molecule) can be calculated.
  • Forma 2 (As-Ab) / 14600 ⁇ V / w (Formula 2) shows the amount of lysine (molar equivalent) per 1 g of the biocompatible polymer block.
  • Ab is the blank absorbance
  • V is the amount of the reaction solution (g)
  • w is the biocompatible polymer block mass (mg).
  • the water absorption rate of the biocompatible polymer block in the present invention is not particularly limited, but is preferably 300% or more, more preferably 400% or more, still more preferably 500% or more, particularly preferably 600% or more, and most preferably 700. % Or more.
  • the upper limit of water absorption is not particularly limited, but is generally 4000% or less, or 2000% or less.
  • the method for measuring the water absorption rate of the biocompatible polymer block is not particularly limited, and for example, it can be measured by the method described in Examples below. Specifically, a biocompatible polymer block of about 15 mg is filled in a 3 cm ⁇ 3 cm nylon mesh bag at 25 ° C., swollen in ion exchange water for 2 hours, and then air-dried for 10 minutes. In this stage, the mass is measured, and the water absorption rate can be obtained according to (Equation 4).
  • the size of one biocompatible polymer block in the present invention is 20 ⁇ m or more and 200 ⁇ m or less, preferably 20 ⁇ m or more and 150 ⁇ m or less, more preferably 50 ⁇ m or more and 120 ⁇ m or less, and further preferably 53 ⁇ m or more and 106 ⁇ m or less. .
  • the size of one biocompatible polymer block does not mean that the average value of the sizes of a plurality of biocompatible polymer blocks is in the above range. It means the size of each biocompatible polymer block obtained by sieving the block.
  • the size of one block can be defined by the size of the sieve used to separate the blocks.
  • a block remaining on the sieve when the passed block is passed through a 106 ⁇ m sieve after passing through a 180 ⁇ m sieve can be a block having a size of 106 to 180 ⁇ m.
  • the block remaining on the sieve when the block passed through the sieve of 106 ⁇ m and the passed block is passed through the sieve of 53 ⁇ m can be a block having a size of 53 to 106 ⁇ m.
  • a block remaining on the sieve when the passed block is passed through a sieve of 53 ⁇ m and passed through a sieve of 25 ⁇ m can be made a block having a size of 25 to 53 ⁇ m.
  • the method for producing the bioaffinity polymer block is not particularly limited.
  • the solid material containing the bioaffinity polymer porous material of the bioaffinity polymer
  • the biocompatible polymer block can be obtained by pulverizing the material and the like using a pulverizer (such as a new power mill).
  • a solid (eg, a porous body) containing a biocompatible polymer can be obtained, for example, by lyophilizing an aqueous solution containing a biocompatible polymer.
  • an amorphous biocompatible polymer block having a nonuniform surface shape can be produced by pulverizing a solid containing a biocompatible polymer.
  • the method for producing the porous body of the biocompatible polymer is not particularly limited, but it can also be obtained by freeze-drying an aqueous solution containing the biocompatible polymer. For example, by including a freezing step in which the liquid temperature at the highest liquid temperature in the solution (internal maximum liquid temperature) is not more than “solvent melting point ⁇ 3 ° C.” in an unfrozen state, the ice formed is spherical. can do. Through this step, the ice is dried to obtain a porous body having spherical isotropic pores (spherical holes).
  • a method for producing a porous body of a biocompatible polymer As an example of a method for producing a porous body of a biocompatible polymer, (A) The difference between the temperature of the highest liquid temperature in the solution and the temperature of the lowest liquid temperature in the solution is 2.5 ° C. or less, and Cooling the biocompatible polymer solution to an unfrozen state at a temperature below the melting point of the solvent; (B) a method comprising freezing the solution of the biocompatible polymer obtained in step (a), and (c) lyophilizing the frozen biocompatible polymer obtained in step (b).
  • the method is not limited to the above method.
  • the difference between the highest liquid temperature and the lowest liquid temperature in the solution is 2.5 ° C. or less (preferably 2 .3 ° C. or lower, more preferably 2.1 ° C. or lower), that is, by reducing the temperature difference, the variation in the size of the porous pores obtained is reduced.
  • the lower limit of the difference between the temperature of the highest liquid temperature and the temperature of the lowest liquid temperature in the solution is not particularly limited, and may be 0 ° C. or higher, for example, 0.1 ° C. or higher, 0.5 It may be at least 0 ° C, at least 0.8 ° C, or at least 0.9 ° C.
  • the cooling in the step (a) is preferably performed via, for example, a material having a lower thermal conductivity than water (preferably, Teflon (registered trademark)), and the portion having the highest liquid temperature in the solution is cooled.
  • a material having a lower thermal conductivity than water preferably, Teflon (registered trademark)
  • Teflon registered trademark
  • the difference between the temperature of the highest liquid temperature in the solution and the temperature of the lowest liquid temperature in the solution immediately before the generation of heat of solidification is 2.5 ° C. or less, More preferably, it is 2.3 degrees C or less, More preferably, it is 2.1 degrees C or less.
  • the “temperature difference immediately before the generation of solidification heat” means a temperature difference when the temperature difference becomes the largest between 1 second and 10 seconds before the generation of solidification heat.
  • the temperature of the lowest liquid temperature in the solution is a solvent melting point of ⁇ 5 ° C. or lower, more preferably a solvent melting point of ⁇ 5 ° C. or lower and a solvent melting point of ⁇ 20 ° C. or higher. More preferably, the solvent melting point is ⁇ 6 ° C. or lower and the solvent melting point is ⁇ 16 ° C. or higher.
  • the solvent having a solvent melting point is a solvent for a biocompatible polymer solution.
  • step (b) the biocompatible polymer solution obtained in step (a) is frozen.
  • the cooling temperature for freezing in the step (b) is not particularly limited and depends on the equipment to be cooled, but preferably 3 ° C. to 30 ° C. from the temperature of the lowest liquid temperature in the solution. The temperature is lower by 0 ° C, more preferably by 5 ° C to 25 ° C, and still more preferably by 10 ° C by 20 ° C.
  • step (c) the frozen biocompatible polymer obtained in step (b) is lyophilized.
  • Freeze-drying can be performed by a conventional method.
  • freeze-drying can be performed by vacuum drying at a temperature lower than the melting point of the solvent and further vacuum drying at room temperature (20 ° C.).
  • the biocompatible polymer block can be produced by pulverizing the porous body obtained in the step (c).
  • ES embryonic stem
  • GS reproductive stem
  • iPS induced pluripotent stem
  • somatic stem cells for example, mesenchymal stem cells (MSC), hematopoietic stem cells, amniotic cells, umbilical cord blood cells, bone marrow-derived cells (for example, bone marrow-derived MSC, etc.), myocardial stem cells, adipose-derived stem cells, or neural stem cells are used. can do.
  • progenitor cells and mature cells include skin, dermis, epidermis, muscle, heart muscle, nerve, bone, cartilage, endothelium, brain, epithelium, heart, kidney, liver, pancreas, spleen, oral cavity, cornea, bone marrow, umbilical cord Cells derived from blood, amniotic membrane, or hair can be used.
  • human-derived cells examples include ES cells, iPS cells, MSCs, chondrocytes, osteoblasts, osteoprogenitor cells, mesenchymal cells, myoblasts, cardiomyocytes, cardioblasts, neurons, hepatocytes, Beta cells, fibroblasts, corneal endothelial cells, vascular endothelial cells, corneal epithelial cells, amniotic cells, umbilical cord blood cells, bone marrow derived cells, or hematopoietic stem cells can be used.
  • the origin of the cell may be either an autologous cell or an allogeneic cell.
  • mesenchymal stem cells are preferably used as the cells.
  • mesenchymal stem cells fat-derived mesenchymal stem cells or bone marrow-derived mesenchymal stem cells are preferable.
  • the origin of mesenchymal stem cells is preferably human or canine.
  • the cell structure of the present invention includes the above-described biocompatible polymer block according to the present invention and at least one kind of cell, and a plurality of bioaffinities in the gaps between the plurality of cells. Is a cell structure in which a functional polymer block is disposed.
  • a plurality of polymer blocks are three-dimensionally arranged in a gap between a plurality of cells in a three-dimensional manner.
  • Affinity polymer block and cells are arranged three-dimensionally in a mosaic shape to form a three-dimensional cell structure in which cells are uniformly present in the structure, and has substance permeability as described above. It becomes.
  • a plurality of polymer blocks are arranged in gaps between a plurality of cells.
  • the “gap between cells” is closed by the constituted cells. It does not have to be a space, and only needs to be sandwiched between cells. Note that there is no need for a gap between all cells, and there may be a place where the cells are in contact with each other.
  • the gap distance between cells via the polymer block that is, the gap distance when selecting a cell and a cell that is the shortest distance from the cell is not particularly limited, but the size of the polymer block The preferred distance is also within the preferred size range of the polymer block.
  • the polymer block according to the present invention is sandwiched between cells, but there is no need for cells between all the polymer blocks, and there may be locations where the polymer blocks are in contact with each other. .
  • the distance between the polymer blocks through the cells that is, the distance when selecting the polymer block and the polymer block present at the shortest distance from the polymer block is not particularly limited, but the cell used Is preferably the size of a cell mass when 1 to several cells are collected, for example, 10 ⁇ m or more and 1000 ⁇ m or less, preferably 10 ⁇ m or more and 100 ⁇ m or less, and more preferably 10 ⁇ m or more and 50 ⁇ m or less.
  • the thickness or diameter of the cell structure of the present invention can be set to a desired thickness, but the lower limit is preferably 215 ⁇ m or more, more preferably 400 ⁇ m or more, and most preferably 730 ⁇ m or more.
  • the upper limit of the thickness or diameter is not particularly limited, but the general range for use is preferably 3 cm or less, more preferably 2 cm or less, and even more preferably 1 cm or less.
  • the range of the thickness or diameter of the cell structure is preferably 400 ⁇ m to 3 cm, more preferably 500 ⁇ m to 2 cm, and still more preferably 720 ⁇ m to 1 cm.
  • a region composed of polymer blocks and a region composed of cells are arranged in a mosaic pattern.
  • the “thickness or diameter of the cell structure” in the present specification indicates the following.
  • the length of the line segment that divides the cell structure so that the distance from the outside of the cell structure becomes the shortest in a straight line passing through the point A is shown. Minute A.
  • a point A having the longest line segment A is selected in the cell structure, and the length of the line segment A at that time is defined as the “thickness or diameter of the cell structure”.
  • the ratio of the cells to the polymer block is not particularly limited, but preferably the mass of the polymer block per cell is preferably 0.0000001 ⁇ g or more and 1 ⁇ g or less, more preferably It is 0.000001 ⁇ g or more and 0.1 ⁇ g or less, more preferably 0.00001 ⁇ g or more and 0.01 ⁇ g or less, and most preferably 0.00002 ⁇ g or more and 0.006 ⁇ g or less. By setting it as the said range, a cell can exist more uniformly.
  • the effect of the cells can be exerted when used for the above applications
  • the upper limit to the above range any component in the polymer block that is present arbitrarily can be added to the cells. Can supply.
  • the component in the polymer block is not particularly limited, and examples thereof include components contained in the medium described later.
  • the cell structure used in the present invention can be produced by mixing a biocompatible polymer block and at least one kind of cell. More specifically, the cell structure of the present invention can be produced by alternately arranging biocompatible polymer blocks (lumps made of biocompatible polymer) and cells.
  • the production method is not particularly limited, but is preferably a method of seeding cells after forming a polymer block.
  • a cell structure can be produced by incubating a mixture of a biocompatible polymer block and a cell-containing culture solution.
  • cells and a biocompatible polymer block prepared in advance are arranged in a mosaic in a container and in a liquid held in the container.
  • it is preferable to promote and control the formation of a mosaic array composed of cells and a biocompatible substrate by using natural aggregation, natural dropping, centrifugation, and stirring.
  • the container used is preferably a container made of a low-cell adhesive material or a non-cell-adhesive material, more preferably a container made of polystyrene, polypropylene, polyethylene, glass, polycarbonate, or polyethylene terephthalate.
  • the shape of the bottom surface of the container is preferably a flat bottom type, a U shape, or a V shape.
  • the mosaic cell structure obtained by the above method is, for example, a method of (a) fusing separately prepared mosaic cell masses or (b) increasing the volume under a differentiation medium or a growth medium.
  • a cell structure having a desired size can be produced.
  • the fusion method and the volume increase method are not particularly limited.
  • the cell structure in the step of incubating the mixture of the biocompatible polymer block and the cell-containing culture solution, can be increased in volume by exchanging the medium with a differentiation medium or a growth medium.
  • a cell structure having a desired size is obtained by further adding the biocompatible polymer block. A cell structure in which cells are uniformly present in the body can be produced.
  • the method for fusing the separately prepared mosaic cell masses specifically includes a plurality of biocompatible polymer blocks and a plurality of cells, and a plurality of cells formed by the plurality of cells. It is a method for producing a cell structure, comprising a step of fusing a plurality of cell structures in which one or a plurality of the biocompatible polymer blocks are arranged in a part or all of the gaps.
  • Biocompatible polymer block (type, size, etc.)”, “cell”, “gap between cells”, “obtained cell structure (size, etc.)” in the method for producing a cell structure used in the present invention A suitable range such as “ratio of cells and polymer block” is the same as described above in the present specification.
  • the tropic factor is released from the cells of the cell structure.
  • the release of a tropic factor from a cell means that the tropic factor is produced in the cell and the tropic factor produced in the cell is secreted outside the cell.
  • the tropic factor means a substance having physiological activity or biological activity (particularly a substance produced by cells).
  • examples of tropic factors include cytokines, hormones, growth factors and enzymes. Cytokines refer to proteinaceous factors that are released from cells and mediate cell-cell interactions.
  • a hormone means a chemical substance produced in an animal body (generally, an endocrine gland) and secreted into a body fluid to give a certain change to the activity of a specific organ, tissue or cell.
  • a growth factor means a substance that promotes or controls the growth of cells.
  • An enzyme means a protein that catalyzes various chemical reactions in a living body. Cytokines, hormones, growth factors and enzymes do not have mutually exclusive meanings.
  • tropic factors include TSG-6 (TNF-stimulated gene 6 ⁇ protein) (TNF is Tumor Necrosis Factor), ANG (Angiogenin), EGF (Epidermal Growth Factor), ENA-78 (epithelial-derived neutrophil-activating).
  • bFGF Basic fibroblast growth factor
  • IGF Insulin-like growth factors
  • MCP Membrane Cofactor Protein
  • PDGF Plate-Derived Growth factor
  • TGF Transforming growth factor
  • TIMP tissue inhibitors of matrix metalloproteinase
  • THPO Thrombopoietin
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • VEGF- D vascular endothelial growth factor D
  • NGF nerve growth factor
  • BDNF Brain-derived neurotrophic factor
  • G-CSF granulocyte-colony stimulating factor
  • GM-CSF Gramulocyte Macrophage colony-stimulating Factor
  • EPO Erythropoietin
  • TPO Thrombopoietin
  • the tropic factor is preferably TSG-6, ANG, EGF, ENA-78, bFGF, IFN ⁇ , IGF-1, IL-6, IL-8, MCP-1, PDGF-BB, TGF ⁇ , TIMP-1, TIMP -2, one or more of THPO, VEGF, and VEGF-D.
  • the tropic factor is more preferably any one or more of TSG-6, ANG, EGF, ENA-78, IGF-1, IL-8, PDGF-BB, TGF ⁇ , THPO, and VEGF-D.
  • the tropic factor is particularly preferably TSG-6.
  • the tropic factor is preferably a cytokine, more preferably an anti-inflammatory cytokine, and particularly preferably TSG-6.
  • Anti-inflammatory cytokine means a cytokine having an anti-inflammatory effect.
  • Anti-inflammatory cytokines include TSG-6, TGF ⁇ , IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13, IL-14, IL-22, IL-27, IL-33, IL- 37, IL-38, Interleukin-1 receptor antagonist (IL-1ra (Interleukin-1 Receptor Antagonist)), Fas ligand (FasL (Fas ligand)), TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL (TNF-ralated apotosis-inducing) ligand)), type I interferon (IFN ⁇ (Interferon alfa), IFN ⁇ (Interferon beta)) human leukocyte antigen-G5 (HLA-G5 (human leukocyte antigen G)), indoleamine-2,3-dioxygenase (IDO (indoleamine) -2,3
  • the ratio of the production / release amount in the cell mass to the production / release amount in the mosaic cell mass is preferably 1.1 times or more, more preferably 1.2 times or more, and 1.3 times The above are more preferable, and those of 1.4 times or more are particularly preferable.
  • the production release amount can be measured by culturing the mosaic cell mass and the cell mass, respectively, and quantifying the amount of tropic factor released into the culture supernatant after 3 days.
  • the amount of the tropic factor can be determined by a conventional method using a commercially available kit or the like according to the type of the tropic factor.
  • the tropic factor releasing agent of the present invention can be used by transplanting it into a living body.
  • an implantation method an incision, an injection, an endoscope, or the like can be used.
  • the tropic factor releasing agent of the present invention can reduce the size of the structure, so that a minimally invasive transplantation method such as transplantation by injection becomes possible.
  • the amount of the tropic factor-releasing agent of the present invention to be transplanted can be appropriately selected according to the condition of the transplant recipient, etc.
  • the number of cells to be transplanted is 1.0 ⁇ 10 5 cells / kg or more. It is preferably 2.0 ⁇ 10 9 cells / kg or less, more preferably 1.0 ⁇ 10 6 cells / kg or more and 2.0 ⁇ 10 8 cells / kg or less.
  • the tropic factor releasing agent of the present invention may be transplanted only once, or may be transplanted two or more times as necessary.
  • the tropic factor-releasing agent of the present invention can stimulate with TNF ⁇ . Compared with the case where it was not performed, TGS ⁇ production was significantly released by TNF ⁇ stimulation. That is, the tropic factor releasing agent of the present invention is useful as a therapeutic agent for inflammatory diseases because it has a high response to inflammatory stimuli and can release a large amount of anti-inflammatory cytokines. According to the present invention, there is provided an inflammatory disease treatment agent comprising the above-described tropic factor releasing agent of the present invention.
  • the biocompatible polymer block and mesenchymal stem cells are included, and a plurality of biocompatible polymer blocks are disposed in the gaps between the plurality of mesenchymal stem cells.
  • the cell structure can exert an inflammatory disease treatment effect.
  • the inflammatory disease treatment agent of the present invention is considered to exert an inflammatory disease treatment effect by releasing anti-inflammatory cytokines or suppressing proliferation or activation of T cells.
  • An inflammatory disease is a disease that exhibits a pathological condition when an inflammatory reaction is observed in a living body.
  • Inflammatory diseases include inflammatory bowel disease, ulcerative colitis, Crohn's disease, nephritis, acute nephritis, chronic nephritis, glomerulonephritis, IgA nephropathy, diabetic nephropathy, membranous nephropathy, hydronephrosis, contrast agent Nephropathy, pyelonephritis, renal failure, acute nephritis, chronic nephritis, interstitial nephritis, nephropathy, nephrotic syndrome, hypertensive nephrosclerosis, diabetic glomerulosclerosis, kidney stones, amyloid kidney, renal vein thrombosis, Alport syndrome, hepatitis, cirrhosis, pancreatitis, pneumonia, sinusitis, rhinitis,
  • Treatment means prevention or treatment for various diseases.
  • prevention means to suppress in advance the progression of symptoms peculiar to the target disease, and includes inhibition of onset, reduction of onset risk, or delay of onset.
  • the degree of inhibition of progression is not limited at all, and it is included in prevention as long as the progression can be inhibited even if the degree is negligible.
  • Treatment means improvement of a target disease or condition or suppression of progression.
  • the treatment agent means a substance provided for the purpose of treatment.
  • the inflammatory disease treatment agent of the present invention can be used by transplanting it into a living body.
  • an implantation method an incision, an injection, an endoscope, or the like can be used. Since the therapeutic agent for inflammatory diseases of the present invention can reduce the size of the structure, unlike a cell transplant such as a cell sheet, a minimally invasive transplantation method such as transplantation by injection becomes possible.
  • the amount for transplanting the therapeutic agent for inflammatory diseases of the present invention can be appropriately selected according to the condition of the transplant recipient, etc.
  • the number of cells to be transplanted is 1.0 ⁇ 10 5 cells / kg or more 2 0 ⁇ 10 9 cells / kg or less is preferable, and 1.0 ⁇ 10 6 cells / kg or more and 2.0 ⁇ 10 8 cells / kg or less is more preferable.
  • the inflammatory disease treatment agent of the present invention may be transplanted only once, or may be transplanted twice or more as necessary.
  • a method for releasing a tropic factor comprising a step of transplanting a cell structure defined in the present invention to a subject who needs the tropic factor.
  • a method for treating an inflammatory disease including a step of transplanting a cell structure defined in the present invention to a subject in need of treatment of the inflammatory disease.
  • preferred ranges of the cell structure and the tropic factor are the same as described above.
  • a cell structure as defined in the present invention for tropic factor release and / or for treatment by tropic factor release there is provided a cell structure as defined in the present invention for the treatment of inflammatory diseases.
  • preferred ranges of the cell structure and the tropic factor are the same as described above.
  • a cell structure as defined in the present invention for the manufacture of a tropic factor releasing agent.
  • the cell structure defined in the present invention for the manufacture of a therapeutic agent for inflammatory diseases.
  • preferred ranges of the cell structure and the tropic factor are the same as described above.
  • the following examples further illustrate the present invention, but the present invention is not limited to the examples.
  • CBE3 Recombinant peptide (recombinant gelatin)
  • the following CBE3 was prepared as a recombinant peptide (recombinant gelatin) (described in International Publication No. WO2008 / 103041).
  • CBE3 Molecular weight: 51.6 kDa Structure: GAP [(GXY) 63 ] 3
  • the amino acid sequence of CBE3 does not include serine, threonine, asparagine, tyrosine and cysteine.
  • CBE3 has an ERGD sequence.
  • GAP GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP) 3 GAP (GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP) 3 GAP (GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKG
  • Example 2 Production of recombinant peptide porous body [PTFE thickness / cylindrical container]
  • PTFE polytetrafluoroethylene
  • the cylindrical cup has a curved surface as a side surface, the side surface is closed with 8 mm PTFE, and the bottom surface (flat plate shape) is also closed with 3 mm PTFE.
  • the upper surface has an open shape. Therefore, the inner diameter of the cylindrical cup is 43 mm.
  • this container is referred to as a PTFE thick / cylindrical container.
  • the CBE3 aqueous solution was poured into a PTFE thick cylindrical container or an aluminum glass plate / cylindrical container, and the CBE3 aqueous solution was cooled from the bottom using a cooling shelf in a vacuum freeze dryer (TF5-85ATNNNN).
  • TF5-85ATNNNN a vacuum freeze dryer
  • Condition A PTFE thick cylindrical container, final concentration of CBE3 aqueous solution 4% by mass, amount of aqueous solution 4mL.
  • Set the shelf temperature to -10 ° C cool to -10 ° C for 1 hour, then -20 ° C for 2 hours, further -40 ° C for 3 hours, and finally freeze at -50 ° C for 1 hour It was.
  • the frozen product is then dried for 24 hours at -20 ° C after returning the shelf temperature to -20 ° C. After 24 hours, the shelf temperature is increased to 20 ° C with vacuum drying continued. Then, vacuum drying was further performed at 20 ° C. for 48 hours until the degree of vacuum was sufficiently reduced (1.9 ⁇ 10 5 Pa), and then the product was taken out from the vacuum freeze dryer.
  • the porous body was obtained by the above.
  • Condition B Aluminum / glass plate / cylindrical container, final concentration of CBE3 aqueous solution 4% by mass, amount of aqueous solution 4mL. Set the shelf temperature to -10 ° C, cool to -10 ° C for 1 hour, then -20 ° C for 2 hours, further -40 ° C for 3 hours, and finally freeze at -50 ° C for 1 hour It was. The frozen product is then dried for 24 hours at -20 ° C after returning the shelf temperature to -20 ° C. After 24 hours, the shelf temperature is increased to 20 ° C with vacuum drying continued. Then, vacuum drying was further performed at 20 ° C. for 48 hours until the degree of vacuum was sufficiently reduced (1.9 ⁇ 10 5 Pa), and then the product was taken out from the vacuum freeze dryer. The porous body was obtained by the above.
  • Condition C PTFE thick / cylindrical container, final concentration of 4 mass% of CBE3 aqueous solution, 10 mL of aqueous solution.
  • Set the shelf temperature to -10 ° C cool to -10 ° C for 1 hour, then -20 ° C for 2 hours, further -40 ° C for 3 hours, and finally freeze at -50 ° C for 1 hour It was.
  • the frozen product is then dried for 24 hours at -20 ° C after returning the shelf temperature to -20 ° C.
  • the shelf temperature is increased to 20 ° C with vacuum drying continued.
  • vacuum drying was further performed at 20 ° C. for 48 hours until the degree of vacuum was sufficiently reduced (1.9 ⁇ 10 5 Pa), and then the product was taken out from the vacuum freeze dryer.
  • the porous body was obtained by the above.
  • condition A condition B, and condition C
  • the liquid temperature is below the melting point of 0 ° C. in the shelf temperature ⁇ 10 ° C. setting section (before lowering to ⁇ 20 ° C.), and in this state It can be seen that freezing has not occurred (unfrozen / supercooled).
  • the temperature difference between the cooling surface liquid temperature and the non-cooling surface liquid temperature was 2.5 ° C. or less.
  • “temperature difference” means “non-cooling surface liquid temperature” ⁇ “cooling surface liquid temperature”.
  • the term “temperature difference immediately before” as used in the present invention refers to the highest temperature among the temperature differences that can be detected between 1 second and 20 seconds before the event (solidification heat generation, etc.). Yes.
  • Example 3 Preparation of biocompatible polymer block (pulverization and crosslinking of porous material)
  • the CBE3 porous material obtained under the conditions A and B obtained in Example 2 was pulverized with a new power mill (Osaka Chemical, New Power Mill PM-2005).
  • the pulverization was performed by pulverization for 5 minutes in total for 1 minute ⁇ 5 times at the maximum rotation speed.
  • the obtained pulverized product was sized with a stainless steel sieve to obtain uncrosslinked blocks of 25 to 53 ⁇ m, 53 to 106 ⁇ m, and 106 to 180 ⁇ m.
  • thermal crosslinking was performed at 160 ° C. under reduced pressure (6 types of crosslinking times of 8 hours, 16 hours, 24 hours, 48 hours, 72 hours, 96 hours) were performed, and biocompatible polymer block (CBE3 block) )
  • E the porous body-derived block of Condition A that has been crosslinked for 48 hours
  • F the porous body-derived block of Condition B that has been crosslinked for 48 hours
  • E and F are small temperature difference blocks made from a porous material produced by a freezing process with a small temperature difference. Since the difference in the crosslinking time did not affect the performance in the evaluation of this example, the cross-linked one after that for 48 hours was used as a representative. Moreover, in E and F, there was no difference in performance. In the following examples, a biocompatible polymer block prepared under condition A, size 53 to 106 ⁇ m, and crosslinking time 48 hours was used.
  • Example 4 Measurement of tap density of biocompatible polymer block The tap density is a value indicating how many blocks can be densely packed in a certain volume. It can be said that the structure is complicated.
  • the tap density was measured as follows. First, a funnel with a cap (diameter 6 mm, length 21.8 mm cylindrical: capacity 0.616 cm 3 ) was prepared, and the mass of the cap alone was measured. After that, a cap was attached to the funnel, and the block was poured from the funnel so that the block accumulated in the cap. After putting a sufficient amount of blocks, the cap part was struck 200 times on a hard place such as a desk, the funnel was removed, and it was rubbed with a spatula. The mass was measured with the cap fully filled. The mass of only the block was calculated from the difference from the mass of only the cap, and the tap density was determined by dividing by the volume of the cap. As a result, the tap density of the biocompatible polymer block of Example 3 was 98 mg / cm 3 .
  • Example 5 Measurement of degree of cross-linking of biocompatible polymer block The degree of cross-linking of the block cross-linked in Example 3 (number of cross-links per molecule) was calculated. The measurement used the TNBS (2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid) method.
  • sample preparation> A glass vial, the sample (about 10 mg), was added 4 wt% NaHCO 3 solution (1 mL) and 1% by weight of TNBS solution (2 mL), the mixture was reacted for 3 hours shaking at 37 ° C.. Then, after adding 37 mass% hydrochloric acid (10 mL) and pure water (5 mL), the mixture was allowed to stand at 37 ° C. for 16 hours or more to prepare a sample.
  • Example 6 Measurement of water absorption rate of biocompatible polymer block The water absorption rate of the biocompatible polymer block prepared in Example 3 was calculated. At 25 ° C., a 15 cm ⁇ 3 cm nylon mesh bag was filled with about 15 mg of the biocompatible polymer block, swollen in ion-exchanged water for 2 hours, and then air-dried for 10 minutes. The mass was measured at each stage, and the water absorption was determined according to (Equation 4).
  • the water absorption rate of the block of Example 3 was 786%.
  • Example 7 Preparation of mosaic cell mass Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSC: Human Mesenchymal Stem Cells) were suspended in a growth medium (Takara Bio: MSCGM BulletKit (trademark)), and prepared in Example 3 there. A biocompatible polymer block (53-106 ⁇ m) was added, and finally hMSC (1.2 ⁇ 10 6 cells) and a biocompatible polymer block (1 mg) were suspended in 4 mL of medium.
  • hMSC Human Mesenchymal Stem Cells
  • EZSPHERE registered trademark
  • dish 35 mm Type 903 spheroid well diameter 800 ⁇ m, spheroid well depth 300 ⁇ m, number of spheroid wells to about 1000 wells, manufactured by AGC Techno Glass), which is a non-cell-adhesive 35 mm dish having a dent on the bottom Sowing.
  • a plurality of mosaic cell masses could be recovered as a sphere having a diameter of about 0.4 mm composed of hMSC and a biocompatible polymer block.
  • the dish is Type 900 (well diameter 400 to 500 ⁇ m, well depth 100 to 200 ⁇ m), Type 902 (well diameter 500 ⁇ m, well depth 200 ⁇ m), Type 904 (well diameter 800 ⁇ m, well depth 400 ⁇ m), or Type 905 (well diameter). It was confirmed that a spherical mosaic cell mass can be obtained in the same manner as described above when using any of 1400 ⁇ m and well depth 600 ⁇ m.
  • hMSC Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells
  • a growth medium Tekara Bio: MSCGM BulletKit (trademark)
  • hMSC 1.2 ⁇ 10 6
  • EZSPHERE registered trademark
  • dish 35mm Type903 spheroid well diameter 800 ⁇ m, spheroid well depth 300 ⁇ m, spheroid
  • a number of wells to about 1000 wells were seeded.
  • Example 8 Measurement of released amount of tropic factor The mosaic cell mass of Example 7 and the cell mass of Comparative Example 1 were cultured, and the amount of tropic factor released into the culture supernatant after 3 days was measured. For the measurement, a kit of Human Angiogenesis Antibody Array C1 (# AAH-ANG-1-8, RayBio) was used. As a result, it was found that the amount of tropic factor released from the mosaic cell mass was increased as compared with the amount released from the cell mass. Specifically, ANG is 1.74 times, EGF is 1.92 times, ENA-78 is 2.22 times, bFGF is 1.09 times, IFN ⁇ is 1.11 times, and IGF-1 is 1.44 times.
  • IL-6 is 1.37 times
  • IL-8 is 1.86 times
  • MCP-1 is 1.29 times
  • PDGF-BB is 3.60 times
  • TGF ⁇ is 1.40 times
  • TIMP-1 is 1. 13 times
  • TIMP-2 was 1.33 times
  • THPO was 1.43 times
  • VEGF was 1.37 times
  • VEGF-D was 2.54 times, and it was found to increase by making a mosaic cell mass. From the above results, it was clarified that the production and release of tropic factor was increased by using a mosaic cell mass (Table 1).
  • Example 9 Production of mosaic cell mass (hMSC)
  • hMSC Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSC) were adjusted to 100,000 cells / mL with DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) + 10% FBS (Fetal Bovine Serum) medium.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • FBS Fetal Bovine Serum
  • Example 10 Production of mosaic cell mass (hADSC) Human adipose-derived stem cells (hADSC) (Human Adipose Derived Stem Cells) were adjusted to 100,000 cells / mL in DMEM + 10% FBS medium, and 0.1-mg / mL of the biocompatible polymer block 53-106 ⁇ m prepared in Example 3 was used. After adding so as to be mL, 200 ⁇ L is seeded on a Sumilon Celtite X96U plate (Sumitomo Bakelite, bottom is U-shaped), centrifuged (600 g, 5 minutes) with a desktop plate centrifuge, and allowed to stand for 24 hours.
  • hADSC Human Adipose Derived Stem Cells
  • a spherical mosaic cell block consisting of a biocompatible polymer block having a diameter of 1 mm and hADSC cells was prepared (0.001 ⁇ g block per cell).
  • the mosaic cell mass was spherical because it was prepared in a U-shaped plate.
  • hMSC Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells
  • DMEM + 10% FBS medium 200 ⁇ L was seeded on Sumilon Celtite X96U plate (Sumitomo Bakelite, bottom U-shaped), and desktop plate centrifuged The mixture was centrifuged (600 g, 5 minutes) and allowed to stand for 24 hours to prepare a cell mass consisting only of hMSC cells.
  • the cell mass was spherical because it was produced in a U-shaped plate.
  • hADSC Human adipose-derived stem cells
  • DMEM + 10% FBS medium 200 ⁇ L is seeded on Sumilon Celtite X96U plate (Sumitomo Bakelite, bottom is U-shaped), and centrifuged with a desktop plate centrifuge ( 600 g, 5 minutes), and allowed to stand for 24 hours to prepare a cell mass composed solely of hADSC cells.
  • the cell mass was spherical because it was produced in a U-shaped plate.
  • Example 11 Release test of anti-inflammatory cytokine TSG-6
  • the mosaic cell mass obtained in Examples 9 and 10 and the cell mass obtained in Comparative Examples 2 and 3 were cultured, respectively, and cultured after 3 days.
  • the amount of TSG-6 released into the clear was quantified.
  • RayBio Human TSG-6 ELISA Kit catalog #: ELH-TSG6 (RayBiotech)
  • the results of quantification of TSG-6 are shown in FIG. 4 (see the FBS (+) column).
  • FIG. 4 see the FBS (+) column).
  • Example 12 Inflammatory stimulation TNF ⁇ (Tumor Necrosis Factor ⁇ ) -dependent TSG-6 production release amount test About the mosaic cell mass obtained in Examples 9 and 10 and the cell mass obtained in Comparative Examples 2 and 3, After replacing with a DMEM medium not containing FBS, the cells were further cultured in a DMEM medium containing TNF ⁇ for 48 hours, and TSG-6 released into the culture supernatant was quantified. For the determination, RayBio Human TSG-6 ELISA Kit (cat #: ELH-TSG6 (RayBiotech)) was used.
  • TSG-6 The results of quantification of TSG-6 are shown in FIG. 4 (see the column for TNF ⁇ (+)). As a result, it was found that the mosaic cell mass was released 5.7 times more than the cell mass in hMSC, and the mosaic cell mass was 3.1 times more released than the cell mass in hADSC. In addition, significant TSG-6 production and release were observed by stimulation with TNF ⁇ as compared to the case without stimulation with TNF ⁇ (see FIG. 4: TNF ⁇ ( ⁇ ) and TNF ⁇ (+) columns). . In addition, the same thing was recognized also in the production
  • TNF ⁇ stimulation promotes TSG-6 production
  • TSG-6 not only increases the production release amount but also improves the responsiveness to TNF ⁇ stimulation by using a mosaic cell mass. This indicates that the mosaic cell mass is highly responsive to inflammatory stimuli and releases many anti-inflammatory cytokines, indicating that the mosaic cell mass is very useful as an anti-inflammatory therapeutic agent. .
  • Example 13 Production of mosaic cell mass (hADSC) Human adipose-derived stem cells (hADSC) were suspended in a growth medium (Lonza: ADSC-Bullet Kit (trademark), hereinafter also referred to as ADSC medium), and the biocompatible polymer block prepared in Example 3 (53-106 ⁇ m) In a state where hADSC (1.2 ⁇ 10 6 cells) and biocompatible polymer block (1 mg) are suspended in 4 mL of medium, a non-cell-adhesive 35 mm dish having a depression on the bottom surface An EZSPHERE (registered trademark) dish 35 mm Type 903 (spheroid well diameter 800 ⁇ m, spheroid well depth 300 ⁇ m, several spheroid wells to about 1000 wells, manufactured by AGC Techno Glass) was seeded.
  • a growth medium Lionza: ADSC-Bullet Kit (trademark), hereinafter also referred to as ADSC medium
  • Example 14 Production and evaluation of 2.5% by mass dextran sulfate sodium (DSS) -induced mouse colitis model
  • the mice were 6-7 weeks old and 17-21 g in weight, SPF C57BL / 6n female mice (Charles River Japan ( Co.)) was used.
  • DSS dextran sulfate sodium
  • the 2.5 mass% DSS aqueous solution was allowed to drink freely for 7 days from the induction start date, the 2.5 mass% DSS aqueous solution was exchanged with distilled water on the 7th day, and distilled water was allowed to drink freely for 7 days.
  • the body weight of each mouse was measured 0, 1, 2, 5, 6, 7, 8, 9, 12, 13 and 14 days after the induction start date.
  • the colitis was evaluated based on body weight and the length of the large intestine on the last day (the 14th day from the start of induction). In addition, the weight decreases when inflammation progresses, and the weight increases when it recovers. In addition, the length of the large intestine is used as a morphological parameter for the degree of inflammation, and the shorter the colon, the shorter the inflammation (JIN SEOK PARK et al., J.CLIN. BIOCHEM.NUTR, 2015; 57: 192 -203).
  • the body weight was evaluated by calculating the body weight ratio (%) relative to the normal mouse for each mouse. In addition, the weight ratio with respect to a normal mouse
  • the body weight recovery rate (%) was determined according to (Equation 7).
  • Weight ratio (%) of each mouse to Day0 (Wt / W0) ⁇ 100
  • W0 represents a weight measurement value on the induction start date
  • Wt represents a weight measurement value t days after the induction start date, where t is 1, 2, 5, 6, 7, 8, 9, 12, 13 Or 14 and W0 and Wt are the weight of the same individual.
  • Weight ratio of each mouse to normal mouse (%) (Wt / W0) ⁇ 100 ⁇ (100 / At) (W0 represents a weight measurement value on the induction start date and Wt represents a weight measurement value t days after the induction start date.
  • Xt represents the average value of “weight ratio relative to normal mice” in each mouse group t days after the start date of induction, where t is 1, 2, 5, 6, 7, (8, 9, 12, 13 or 14.
  • the weight recovery rate of the normal mouse group is 100%, and the weight recovery rate of the ADSC medium mouse group is 0%.
  • Short bowel recovery rate (%) ((Lx ⁇ L2) ⁇ 100) / (L1 ⁇ L2) (In the formula, L1 represents the median length of the large intestine of the normal mouse group, L2 represents the median length of the large intestine of the ADSC medium mouse group, and Lx represents the median length of the large intestine of each mouse group. )
  • Example 15 Administration of mosaic cell mass of hADSC to 2.5% by mass DSS colitis model mouse 1% from the induction start date to 2.5% by mass DSS colitis model mouse prepared in Example 14 One day later, the ADSC mosaic cell mass produced in Example 13 was intraperitoneally administered. 1000 hADSC mosaic cell mass (hADSC 1.2 ⁇ 10 6 cells + biocompatible polymer block 1 mg / animal), or 5000 hADSC mosaic cell mass (hADSC 6.0 ⁇ 10 6 cells + bioaffinity polymer block 5 mg / animal) was administered.
  • Example 4 Administration of hADSC cell suspension or ADSC medium to 2.5% by mass DSS colitis model mouse
  • Example 14 One day after the start of induction, the same cells as in Example 13 were suspended intraperitoneally in a suspension of hADSC cells in a suspension of 200 ⁇ L of ADSC medium or 200 ⁇ L of ADSC medium.
  • the number of cells contained in the hADSC cell suspension was 1.2 ⁇ 10 6 cells / animal.
  • FIG. 6 shows an average value of the weight ratio (%) of each mouse group to normal mice in Example 15 and Comparative Example 4.
  • the hADSC mosaic cell mass 1000 mouse group had a higher “weight ratio relative to normal mice” than the ADSC medium mouse group as a comparative example after 12, 13 and 14 days from the induction start date. It was. It was shown that the 1000 hADSC mosaic cell cluster mouse group recovered body weight faster than the ADSC medium mouse group.
  • the hADSC mosaic cell mass 5000 mouse group is more “weight to normal mice” than the ADSC medium mouse group of Comparative Example 2, 5, 6, 7, 8, 9, 12, 13 and 14 days after the induction start date. The ratio was high.
  • the hADSC mosaic cell mass 5000 mouse group was able to suppress weight loss more than the ADSC medium mouse group, and that the weight recovery was faster than that of the ADSC medium mouse group.
  • the weight recovery rate was 39% in the hADSC mosaic cell mass 1000 mouse group and the weight recovery rate was 96% in the hADSC mosaic cell mass 5000 mouse group.
  • an effect of improving weight loss was observed.
  • the effect of this improvement was higher when the number of mosaic cell masses was larger.
  • FIG. 7 shows an average value of the weight ratio (%) of each mouse group to normal mice in Comparative Example 4.
  • the hADSC cell suspension mouse group showed the same change in body weight as the ADSC medium mouse group after 2, 5, 6, 7, 8 and 9 days after the induction start day. .
  • 12 days, 13 days and 14 days after the start of induction the “weight ratio relative to normal mice” was lower than that of the ADSC medium mice group.
  • the hADSC cell suspension mouse group On the last day (14 days after the start of induction), the hADSC cell suspension mouse group had a body weight recovery rate of -44%. From the above, it was shown that the hADSC cell suspension does not improve weight loss of 2.5% by mass DSS colitis model mice.
  • Example 15 the recovery rate of short intestine was 75% in the group of 1000 hADSC mosaic cell mass mice, and the recovery rate of short intestine was 50% in the 5000 hADSC mosaic cell mass mouse group. It was confirmed that 1000 hADSC mosaic cell masses and 5000 hADSC mosaic cell masses improved the shortening of the large intestine of 2.5% by mass DSS colitis model mice.
  • Example 16 Preparation and evaluation of 3.0% by weight dextran sulfate sodium (DSS) -induced mouse colitis model
  • the mice were 6-7 weeks old and weighed 17-21 g of SPF C57BL / 6n female mice (Charles River Japan ( Co.)) was used.
  • the free water start date was taken as the induction start date (Day 0).
  • the 3.0 mass% DSS aqueous solution was allowed to drink freely for 7 days from the induction start date, the 3.0 mass% DSS aqueous solution was exchanged with distilled water on the 7th day, and distilled water was allowed to drink freely for 6 days.
  • the body weight of each mouse was measured 0, 1, 2, 5, 6, 7, 8, 9, 12, and 13 days after the start of induction.
  • the colitis was evaluated in the same manner as in Example 14 based on the body weight and the length of the large intestine on the last day (the 13th day from the start of induction).
  • Example 17 Administration of mosaic cell mass of hADSC to 3.0% by mass DSS colitis model mouse 1% from the start date of induction to the 3.0% by mass DSS colitis model mouse prepared in Example 16 A day later, the hADSC mosaic cell mass prepared in Example 13 was intraperitoneally administered. 1000 hADSC mosaic cell mass (hADSC 1.2 ⁇ 10 6 cells + biocompatible polymer block 1 mg / animal), or 5000 hADSC mosaic cell mass (hADSC 6.0 ⁇ 10 6 cells + bioaffinity polymer block 5 mg / animal) was administered.
  • FIG. 8 shows the average value of the weight ratio (%) of each mouse group to normal mice in Example 17 and Comparative Example 5.
  • the 1000 hADSC mosaic cell mass mouse group had a higher “weight ratio relative to normal mice” than the ADSC medium mouse group of Comparative Example 12 and 13 days after the induction start date. It was shown that the 1000 hADSC mosaic cell cluster mouse group recovered body weight faster than the ADSC medium mouse group.
  • the hADSC mosaic cell mass 5000 mouse group had a higher “weight ratio relative to normal mice” than the ADSC medium mouse group of Comparative Example 12 and 13 days after the induction start date, and the hADSC mosaic cell mass 1000 mouse group. A higher percentage of body weight was shown.
  • the weight recovery rate of the hADSC mosaic cell mass 1000 mouse group was 20%, and the weight recovery rate of the hADSC mosaic cell mass 5000 mouse group was 69%.
  • an effect of improving weight loss was observed.
  • the effect of this improvement was higher when the number of mosaic cell masses was larger.
  • Example 17 and Comparative Example 5 the recovery rate of shortened bowel was 68% in the group of 1000 hADSC mosaic cell mass mice, and the recovery rate of shortened bowel was 81% in the 5000 mouse group of hADSC mosaic cell mass. It was confirmed that 1000 hADSC mosaic cell masses and 5000 hADSC mosaic cell masses improved shortening of the large intestine of 3.0% by mass DSS colitis model mice. From the results of the above body weight and the length of the large intestine, an inflammation improving effect on the 3.0% by mass DSS colitis model mouse by the hADSC mosaic cell mass was recognized.
  • DSS dextran sulfate sodium
  • the 3.0 mass% DSS aqueous solution was allowed to drink freely for 7 days from the induction start date, the 3.0 mass% DSS aqueous solution was exchanged with distilled water on the 7th day, and distilled water was allowed to drink freely for 7 days.
  • the body weight of each mouse was measured 0, 1, 4, 5, 6, 7, 8, 11, 12, 13 and 14 days after the induction start date.
  • the colitis was evaluated by weight, the length of the large intestine on the last day (14 days from the start of induction), and the pathological evaluation of the large intestine on the last day.
  • the body weight and the length of the large intestine were evaluated in the same manner as in Example 14.
  • the large intestine tissue excised on the final day was fixed in formalin, embedded in paraffin, sliced, and stained with hematoxylin and eosin (HE staining).
  • the prepared specimens were evaluated for ulcer depth, ulcer width, edema, and inflammatory cell infiltration using an optical microscope. Evaluation of depth of ulcer: 0 point: complete epithelium, 1 point: damage to lamina intestinal, 2 points: damage to submucosa, 3 points: damage to serosa, It was.
  • Evaluation of the size of the ulcer is as follows: 0 point: the area ratio with injury is 0%, 1 point: the area ratio with injury is greater than 0% and 25% or less, 2 points: the area ratio with injury is greater than 25% 50% or less, 3 points: Injured area ratio is greater than 50% and 75% or less, 4 points: Injured area ratio is greater than 75%.
  • the evaluation of edema and inflammatory cell infiltration was 0 point: no edema and inflammatory cell infiltration were observed, 1 point: mild, 2 points: moderate, 3 points: high, 4 points: further high.
  • each mouse was evaluated for the three areas of the upper colon, the lower colon, and the rectum, and the total score of the three positions was comprehensively evaluated as a pathological score. The pathological score is higher as inflammation occurs.
  • Example 19 Administration of mosaic cell mass of hADSC to 3.0% by mass DSS colitis model mouse 7% from the start date of induction to the 3.0% by mass DSS colitis model mouse prepared in Example 18 One day later, 1000 hADSC mosaic cell masses prepared in Example 13 (hADSC 1.2 ⁇ 10 6 cells + biocompatible polymer block 1 mg) / animal were intraperitoneally administered in a state suspended in 400 ⁇ L of ADSC medium.
  • FIG. 9 shows the average value of the weight ratio (%) of each mouse group to normal mice in Example 19 and Comparative Example 6.
  • a group of 1000 hADSC mosaic cell mass mice is a comparative example of an ADSC medium mouse group and a hADSC cell suspension after 11, 12, 13, and 14 days from the start of induction.
  • the “weight ratio relative to normal mice” was higher than that of the mouse group. It was shown that the 1000 hADSC mosaic cell mass mouse group recovered body weight faster than the ADSC medium mouse group and the hADSC cell suspension mouse group. Therefore, 1000 hADSC mosaic cell masses were found to have an effect of improving weight loss.
  • the hADSC cell suspension mouse group showed a change in body weight similar to that of the ADSC medium mouse group after 11, 12, 13 and 14 days after the start of induction. Therefore, hADSC cell suspension did not show an effect of improving weight loss.
  • the length of the large intestine in each mouse group in Example 19 and Comparative Example 6 is shown as a box plot in FIG. 10 (*: P ⁇ 0.05 (t test) in the figure). As shown in FIG. 10, it was shown that the colon length of the ADSC medium mouse group was significantly shorter than that of the normal mouse group. In Example 19, it was shown that the length of the large intestine of the group of 1000 hADSC mosaic cell cluster mice was significantly longer than that of the ADSC medium mouse group as a comparative example. Therefore, it was recognized that 1000 hADSC mosaic cell masses improved shortening of the large intestine of 3.0% by mass DSS colitis model mice.
  • Comparative Example 6 it was shown that the length of the large intestine of the hADSC cell suspension mouse group was not different from that of the ADSC medium mouse group as the comparative example. Therefore, it was confirmed that the hADSC cell suspension does not improve shortening of the large intestine of the 3.0% by mass DSS colitis model mouse.
  • the median length of the large intestine of each mouse group was 7.4 cm for the normal mouse group, 6.0 cm for the ADSC medium mouse group, 5.5 cm for the hADSC cell suspension mouse group, and 1000 hADSC mosaic cell mass 1000.
  • the group of individual mice was 7.1 cm.
  • the pathological score of each mouse group in Example 19 and Comparative Example 6 is shown in FIG. 11 as a box plot (*: P ⁇ 0.05 (t test) in the figure).
  • the pathological score of the 1000 hADSC mosaic cell mass mouse group was significantly higher than that of the comparative ADSC medium mouse group and the hADSC cell suspension mouse group. It was shown to be low. Therefore, it was recognized that 1000 hADSC mosaic cell clusters improved inflammation of the large intestine of 3.0% by mass DSS colitis model mouse.
  • Comparative Example 6 it was shown that the pathological score of the hADSC cell suspension mouse group was not different from that of the ADSC medium mouse group as the comparative example.
  • the median pathological score of each mouse group was 0 points for the normal mouse group, 13.0 points for the ADSC medium mouse group, 18.0 points for the hADSC cell suspension mouse group, and 1000 hADSC mosaic cell masses.
  • the mouse group scored 7.0 points.
  • Table 2 shows the median pathological scores at each location (upper colon, lower colon, and rectum) of each mouse group.
  • FIGS. 12 and 13 Representative HE tissue stained images of each mouse group in Example 19 and Comparative Example 6 are shown in FIGS. 12 and 13. As shown in FIGS. 12 and 13, ulcers, inflammatory cell infiltration, and edema were not observed in the normal mouse group. In the comparative ADSC medium mouse group, ulcers, inflammatory cell infiltration, and edema were widely observed. Similar to the ADSC medium mouse group, ulcers, inflammatory cell infiltration, and edema were extensively observed in the hADSC cell suspension mouse group. On the other hand, in Example 19, in the group of 1000 hADSC mosaic cell mass mice, the range of ulcer and inflammatory cell infiltration was narrow. No edema was observed.
  • hBMSC Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells
  • a growth medium Tekara Bio: MSCGM BulletKit (trademark)
  • the biocompatible polymer block 53-106 ⁇ m
  • hBMSC 2.0 ⁇ 10 5 cells
  • biocompatible polymer block 0.2 mg
  • EZSPHERE registered trademark
  • dish 35mm Type903 spheroid well diameter 800 ⁇ m, spheroid well depth 300 ⁇ m, number of spheroid wells to about 1000 wells, which is a non-cell-adhesive 35 mm dish having a depression on the bottom surface in a clouded state.
  • AGC Techno Glass AGC Techno Glass
  • a plurality of mosaic cell masses could be recovered as a sphere having a diameter of about 0.2 mm composed of hBMSC and a biocompatible polymer block.
  • hBMSC Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells
  • Example 21 T cell proliferation inhibition test (hBMSC mosaic cell mass) The hBMSC mosaic cell mass produced in Example 20 was evaluated for its ability to suppress the proliferation of T cells. On 24 well plate, hBMSC mosaic cell mass (hBMSC5.0 ⁇ 10 4 cells + bioaffinity polymer block 0.2 mg / well) and T cell labeled with CFSE (cat #: 565082 (BD Biosciences)) (1 (0 ⁇ 10 5 cells / well) was co-cultured for 5 days.
  • CFSE cat #: 565082 (BD Biosciences)
  • the culture was carried out using RPMI1640 medium containing 2 mM glutamine, 100 IU / mL penicillin, 100 ug / ml streptomycin, 10% FBS, and 50 uM monothioglycerol, anti-CD3CD28 antibody beads (Dynabeads TM: Human T-Activator CD3 /
  • the test was carried out in a culture medium (hereinafter also referred to as T cell medium) supplemented with CD28 (cat #: DB11161 (Veritas)), and anti-CD3CD28 antibody beads were prepared according to the method of use of the product. 10 ⁇ l of anti-CD3CD28 antibody beads were used per 10 5 cells.
  • the average number of divisions of T cells co-cultured with hBMSC mosaic cell mass was measured using CFSE fluorescence intensity as an index. Since the fluorescence signal of CFSE stained before co-culture decays with cell division, the number of cell divisions can be identified by measuring the fluorescence intensity of CFSE. The average number of T cell divisions was calculated according to Equation 9.
  • the measurement results of the average number of divisions of T cells are shown in FIG. 14 (in the figure, ***: P ⁇ 0.001 (t test)).
  • the mean number of divisions of T cells when cocultured with hBMSC mosaic cell mass and hBMSC cell mass was significantly reduced as compared with the case where the cells were cultured with T cells alone.
  • the average number of divisions of T cells when co-cultured with hBMSC mosaic cell mass was reduced as compared with the case where co-cultured with hBMSC cell mass. Therefore, the hBMSC mosaic cell mass and the hBMSC cell mass showed the ability to suppress the proliferation of T cells, and the effect was higher in the hBMSC mosaic cell mass.
  • the average number of divisions of T cells under each culture condition was 3.87 ⁇ 2.60 when cultured with T cells alone, 1.00 ⁇ 0.12 when cocultured with hBMSC cell mass, hBMSC The number of times of co-culture with the mosaic cell mass was 0.77 ⁇ 0.10 times.
  • Example 22 Preparation of hADSC mosaic cell mass Human adipose-derived stem cells (hADSC) were suspended in a growth medium (Lonza: ADSC-BulletKit (trademark), hereinafter also referred to as ADSC medium) and prepared in Example 3.
  • the biocompatible polymer block 53-106 ⁇ m was added, and hADSC (2.0 ⁇ 10 5 cells) and the biocompatible polymer block (0.2 mg) were suspended in 4 mL of the medium.
  • Seed in EZSPHERE (registered trademark) dish 35mm Type903 spheroid well diameter 800 ⁇ m, spheroid well depth 300 ⁇ m, number of spheroid wells up to about 1000 wells, manufactured by AGC Techno Glass) did.
  • a plurality of mosaic cell masses could be recovered as a sphere having a diameter of about 0.2 mm composed of hADSC and a biocompatible polymer block.
  • T cell activation inhibition test (IL-2 release test) Mosaic cell clusters (5.0 ⁇ 10 4 cells + biocompatible polymer block 0.2 mg / well) obtained in Examples 20 and 22 were co-cultured with T cells, respectively, and released into the culture supernatant after 48 hours. IL-2 was quantified. Since IL-2 is secreted when T cells are activated, the degree of activation of T cells can be identified by quantifying IL-2. The culture was performed in the same T cell medium as in Example 21. The number of T cells per well was 1.0 ⁇ 10 5 cells / well. For the quantification, Human IL-2 ELISA Kit (cat #: RAB0286 (SIGMA-ALDRICH)) was used.
  • T cell activation inhibition test (IL-2 release test) The same cells (5.0 ⁇ 10 4 cells / well) as in Examples 20 and 22 cultured in an adherent state were co-cultured with T cells, and IL-2 released into the culture supernatant after 48 hours was quantified. The culture was performed in the same T cell medium as in Example 21. The number of T cells per well was 1.0 ⁇ 10 5 cells / well. For the quantification, Human IL-2 ELISA Kit (cat #: RAB0286 (SIGMA-ALDRICH)) was used.
  • hBMSC mosaic cell mass and hBMSC showed the ability to suppress activation of T cells, and the effect was higher in hBMSC mosaic cell mass.
  • the amount of IL-2 released when co-cultured with hADSC mosaic cell mass and hADSC was also significantly reduced compared to when cultured with T cells alone.
  • the amount of IL-2 secretion of T cells co-cultured with hADSC mosaic cell mass was significantly reduced as compared with the case of co-culture with hADSC (adhered state). Therefore, hADSC mosaic cell mass and hADSC (adhesion state) showed the ability to suppress the activation of T cells, and the effect was higher in the hADSC mosaic cell mass.
  • Example 24 Production of canine-derived cell mosaic cell mass DMEM medium containing 10% FBS and 1% penicillin streptomycin (hereinafter also referred to as a cADSC medium) canine adipose derived stem cells (cADSC).
  • cADSC canine adipose derived stem cells
  • EZSPHERE registered trademark
  • dish 35mm Type 903 spheroid well diameter 800 ⁇ m, spheroid well depth 300 ⁇ m, number of spheroid wells, about ⁇ well
  • 1000 wells manufactured by AGC Techno Glass.
  • a plurality of mosaic cell masses could be recovered as a sphere having a diameter of about 0.2 mm composed of cADSC and a biocompatible polymer block.
  • Example 25 Inflammation treatment effect in canine-derived cell mosaic cell cluster
  • the 3.0 mass% DSS colitis model mouse of Example 18 was 7 days after the start of inflammation induction.
  • the cADSC mosaic cell mass (cADSC 1.2 ⁇ 10 6 cells + biocompatible polymer block 0.25 mg / animal) prepared in Example 24 was intraperitoneally administered in a state suspended in 400 ⁇ L of cADSC medium.
  • Example 10 Inflammation treatment effect in cADSC cell suspension or ADSC medium
  • the 3.0 mass% DSS colitis model mouse of Example 18 was treated from the start of induction. Seven days later, 100 ⁇ L of cADSC medium or cADSC cell suspension in which the same cells as in Example 25 were suspended in 100 ⁇ L of cADSC medium was administered via the tail vein. The number of cells contained in the cADSC cell suspension was 4.0 ⁇ 10 4 cells / animal or 1.2 ⁇ 10 6 cells / animal.
  • FIG. 16 shows an average value of the body weight ratio (%) of each mouse group with respect to normal mice in Example 25 and Comparative Example 10.
  • the cADSC mosaic cell mass mouse group is a cADSC medium mouse group and a cADSC cell suspension mouse group, which are comparative examples, after 11, 12, 13, and 14 days after the induction start date.
  • the “weight ratio relative to normal mice” was higher. It was shown that the weight recovery of the cADSC mosaic cell mass mouse group was faster than that of the ADSC medium mouse group and the cADSC cell suspension mouse group. Therefore, the cADSC mosaic cell mass was recognized to have an effect of improving weight loss.
  • the cADSC cell suspension mouse group showed a transition of lower body weight than the cADSC medium mouse group after 11, 12, 13 and 14 days after the induction start date. Therefore, the cADSC cell suspension did not show an effect of improving weight loss.
  • cADSC mosaic cell mass has an effect of improving weight loss of 3.0% by mass DSS colitis model mice.
  • the effect of improving the weight loss of 3.0% by mass DSS colitis model mice was not observed in the cADSC cell suspension.
  • the length of the large intestine in each mouse group in Example 25 and Comparative Example 10 is shown in FIG. 17 as a box plot (in the figure, *: P ⁇ 0.05, **: P ⁇ 0.01 (t test) ).
  • the length of the large intestine of the cADSC medium mouse group was significantly shorter than that of the normal mouse group.
  • Example 25 it was shown that the length of the large intestine of the cADSC mosaic cell cluster mouse group was significantly longer than that of the cADSC medium mouse group as a comparative example. Therefore, it was confirmed that the cADSC mosaic cell mass improved shortening of the large intestine of the 3.0% by mass DSS colitis model mouse.
  • Comparative Example 10 it was shown that the length of the large intestine of the cADSC cell suspension mouse group was not different from that of the cADSC medium mouse group as the comparative example. Therefore, it was confirmed that the cADSC cell suspension does not improve shortening of the large intestine of the 3.0% by mass DSS colitis model mouse.
  • the median length of the large intestine of each mouse group was 7.50 cm for the normal mouse group, 6.64 cm for the cADSC medium mouse group, 6.48 cm for the 40,000 cADSC cell suspension mouse group, and 1.2 million cADSC.
  • the cell suspension mouse group was 6.14 cm, and the cADSC mosaic cell mass mouse group was 7.98 cm.
  • the cADSC mosaic cell mass has an effect of improving the shortening of the short intestine of the 3.0% by mass DSS colitis model mouse.
  • the effect of improving the shortening of the intestine of 3.0% by mass DSS colitis model mouse was not observed in the cADSC cell suspension. From the results of the above body weight and length of the large intestine, an inflammation improving effect was observed in the 3.0% by mass DSS colitis model mouse by the cADSC mosaic cell mass.

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Abstract

本発明の課題は、細胞移植治療等において細胞が放出するトロフィックファクタの量を増大させたトロフィックファクタ放出剤、および炎症疾患処置剤を提供することである。本発明によれば、生体親和性高分子ブロックと細胞とを含み、複数個の細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックが配置されている、細胞構造体を含む、トロフィックファクタ放出剤であって、上記生体親和性高分子ブロック一つの大きさが２０μｍ以上２００μｍ以下であり、上記細胞からトロフィックファクタが放出される、トロフィックファクタ放出剤が提供される。

Description

トロフィックファクタ放出剤および炎症疾患処置剤
　本発明は、トロフィックファクタ放出剤および炎症疾患処置剤に関する。詳しくは、本発明は、生体親和性高分子ブロックと細胞とを含み、複数個の細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックが配置されている、細胞構造体を含む、トロフィックファクタ放出剤、並びに炎症疾患処置剤に関する。
　現在、細胞を局所投与し、細胞が産生するトロフィックファクタにより治療を行うトロフィックファクタ療法の検討がなされている。トロフィックファクタ療法としては、細胞を局所投与した際に、投与部に細胞を留まらせて生着させるために、局所投与する細胞を細胞塊として投与することが試みられる。
　非特許文献１には、スフェロイドとして培養されたヒト間葉系幹／間質細胞は自己活性化し、プロスタグランジンＥ２を産生することが記載されている。非特許文献２には、ヒト間葉系間質細胞のスフェロイドは、抗炎症タンパク質であるＴＳＧ－６を分泌することが記載されている。
　特許文献１には、生体適合性かつ生分解性材料を主成分とする微小粒子が記載されている。上記の生体適合性かつ生分解性材料は移植細胞を表面に有し、上記の微小粒子は、微小粒子中に取り込まれ、埋め込みの際に細胞またはその環境に対して活性である少なくとも１つの作用物質を含む。また上記微小粒子は１０～５００μｍの直径を有し、そして細胞接着性化合物のコーティングをさらに含む。上記の作用物質は、成長因子、ホルモンおよびサイトカインからなる群より選択され、微小粒子によって持続して、かつ制御されて放出される。
　近年、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を用いた再生医療および細胞治療の研究が盛んになされている。中でも、その対象として難治性炎症疾患への治療効果が注目され、多種多様な研究が行われている。例えば、特許文献２にはＭＳＣを経静脈的に投与することによって、炎症性腸疾患を予防・治療するための方法が開示されている。いくつかの臨床研究や臨床試験も実施されている。しかしながら、現実的には十分な治療効果を示せていないことが分かってきた（非特許文献３）。ＭＳＣ自体に遺伝子導入することにより抗炎症能力を高めるための研究も行われている。（非特許文献４）しかしながら、細胞自体に遺伝子を導入することは、その有効性や安全性への影響を考えると必ずしも望ましい選択肢ではない。
　特許文献３には、生体親和性を有する高分子ブロックと細胞とを含み、上記複数個の細胞間の隙間に複数個の上記高分子ブロックが配置されている細胞構造体が記載されている。特許文献３に記載の細胞構造体においては、外部から細胞構造体の内部への栄養送達が可能である。特許文献４には、生体親和性を有する高分子ブロックと少なくとも一種類の細胞とを含み、上記複数個の細胞間の隙間に複数個の上記高分子ブロックが配置されている細胞移植用細胞構造体が記載されている。特許文献４の実施例においては、細胞移植用細胞構造体を用いて血管形成できることが記載されている。
JONI H. YLOSTALO,他、STEM CELLS 2012;30:2283-2296 Thomas J. Bartosh他、PNAS, August 3, 2010, vol. 107, no. 31, 13724-13729 Aliment Pharmacol Ther 2017; 45: 205-221 Inflamm. Res. (2015) 64:671-681
特許第４８１９３５６号 特開２００９－７３２１号公報 国際公開ＷＯ２０１１／１０８５１７号 特開２０１５－１３４１９３号公報
　細胞移植治療としては、移植した細胞が放出するトロフィックファクタ（サイトカイン等）により宿主の再生を促進することによる治療が幾つか知られている。例えば、間葉系幹細胞は抗炎症効果を有するサイトカインを放出することが知られている。しかし、細胞だけの移植ではサイトカインが十分に放出されず、目的の効果を得られない場合が頻繁にある。本発明は、細胞塊を使用する場合と比較して、細胞が放出するトロフィックファクタの量を増大させたトロフィックファクタ放出剤を提供することを解決すべき課題とした。さらに本発明は、炎症疾患処置剤を提供することを解決すべき課題とした。
　本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討した結果、生体親和性高分子ブロックと細胞とを含み、複数個の細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックが配置されている細胞構造体においては、細胞が放出するトロフィックファクタの量が、生体親和性高分子ブロックを含まない細胞塊の場合と比較して増大すること、並びに上記細胞構造体が炎症疾患の処置に有用であることを見出し、本発明を完成するに至った。
　即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
＜１＞　生体親和性高分子ブロックと細胞とを含み、複数個の細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックが配置されている、細胞構造体を含む、トロフィックファクタ放出剤であって、上記生体親和性高分子ブロック一つの大きさが２０μｍ以上２００μｍ以下であり、上記細胞からトロフィックファクタが放出される、トロフィックファクタ放出剤。
＜２＞　上記生体親和性高分子ブロック一つの大きさが５０μｍ以上１２０μｍ以下である、＜１＞に記載のトロフィックファクタ放出剤。
＜３＞　上記生体親和性高分子ブロックにおいて、生体親和性高分子が熱、紫外線または酵素により架橋されている、＜１＞または＜２＞に記載のトロフィックファクタ放出剤。
＜４＞　上記生体親和性高分子ブロックが不定形である、＜１＞から＜３＞の何れか一に記載のトロフィックファクタ放出剤。
＜５＞　上記細胞構造体が、細胞１個当り０．００００００１μｇ以上１μｇ以下の生体親和性高分子ブロックを含む、＜１＞から＜４＞の何れか一に記載のトロフィックファクタ放出剤。
＜６＞　上記細胞が、体性幹細胞である、＜１＞から＜５＞の何れか一に記載のトロフィックファクタ放出剤。
＜７＞　上記トロフィックファクタが、サイトカインである、＜１＞から＜６＞の何れか一に記載のトロフィックファクタ放出剤。
＜８＞　生体親和性高分子が、ゼラチン、コラーゲン、アテロコラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、プロネクチン、ラミニン、テネイシン、フィブリン、フィブロイン、エンタクチン、トロンボスポンジン、レトロネクチン（登録商標）、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸・グリコール酸コポリマー、ヒアルロン酸、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、コンドロイチン、セルロース、アガロース、カルボキシメチルセルロース、キチン、またはキトサンである、＜１＞から＜７＞の何れか一に記載のトロフィックファクタ放出剤。
＜９＞　生体親和性高分子が、リコンビナントゼラチンである、＜１＞から＜８＞の何れか一に記載のトロフィックファクタ放出剤。
＜１０＞　リコンビナントゼラチンが、下記式１で示される、＜９＞に記載のトロフィックファクタ放出剤。
式１：Ａ－［（Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ）n］m－Ｂ
式中、Ａは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示し、ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎは３～１００の整数を示し、ｍは２～１０の整数を示す。なお、ｎ個のＧｌｙ－Ｘ－Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。
＜１１＞　リコンビナントゼラチンが、
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド；
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；または
（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；
である、＜９＞または＜１０＞に記載のトロフィックファクタ放出剤。
＜１２＞　＜１＞から＜１１＞の何れか一に記載のトロフィックファクタ放出剤を含む、炎症疾患処置剤。
＜１３＞　生体親和性高分子ブロックと間葉系幹細胞とを含み、複数個の間葉系幹細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックが配置されている、細胞構造体を含む、炎症疾患処置剤であって、上記生体親和性高分子ブロック一つの大きさが２０μｍ以上２００μｍ以下である、炎症疾患処置剤。
＜１４＞　上記生体親和性高分子ブロック一つの大きさが５０μｍ以上１２０μｍ以下である、＜１３＞に記載の炎症疾患処置剤。
＜１５＞　上記生体親和性高分子ブロックにおいて、生体親和性高分子が熱、紫外線または酵素により架橋されている、＜１３＞または＜１４＞に記載の炎症疾患処置剤。
＜１６＞　上記生体親和性高分子ブロックが不定形である、＜１３＞から＜１５＞の何れか一に記載の炎症疾患処置剤。
＜１７＞　上記細胞構造体が、細胞１個当り０．００００００１μｇ以上１μｇ以下の生体親和性高分子ブロックを含む、＜１３＞から＜１６＞の何れか一に記載の炎症疾患処置剤。
＜１８＞　上記間葉系幹細胞が、脂肪由来間葉系幹細胞または骨髄由来間葉系幹細胞である、＜１３＞から＜１７＞の何れか一に記載の炎症疾患処置剤。
＜１９＞　生体親和性高分子が、ゼラチン、コラーゲン、アテロコラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、プロネクチン、ラミニン、テネイシン、フィブリン、フィブロイン、エンタクチン、トロンボスポンジン、レトロネクチン（登録商標）、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸・グリコール酸コポリマー、ヒアルロン酸、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、コンドロイチン、セルロース、アガロース、カルボキシメチルセルロース、キチン、またはキトサンである、＜１３＞から＜１８＞の何れか一に記載の炎症疾患処置剤。
＜２０＞　生体親和性高分子が、リコンビナントゼラチンである、＜１３＞から＜１９＞の何れか一に記載の炎症疾患処置剤。
＜２１＞　リコンビナントゼラチンが、下記式１で示される、＜２０＞に記載の炎症疾患処置剤。
式１：Ａ－［（Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ）n］m－Ｂ
式中、Ａは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示し、ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎは３～１００の整数を示し、ｍは２～１０の整数を示す。なお、ｎ個のＧｌｙ－Ｘ－Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。
＜２２＞　リコンビナントゼラチンが、
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド；
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；または
（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；
である、＜２０＞または＜２１＞に記載の炎症疾患処置剤。
＜２３＞　上記間葉系幹細胞がヒトまたは犬由来の間葉系幹細胞である、＜１３＞から＜２２＞の何れか一に記載の炎症疾患処置剤。
　さらに本発明によれば、以下の発明が提供される。
（Ａ）　生体親和性高分子ブロックと細胞とを含み、複数個の細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックが配置されている、細胞構造体であって、上記生体親和性高分子ブロック一つの大きさが２０μｍ以上２００μｍ以下である細胞構造体を、トロフィックファクタを必要とする対象者に移植する工程を含むトロフィックファクタの放出方法。
（Ｂ）　生体親和性高分子ブロックと細胞とを含み、複数個の細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックが配置されている、細胞構造体であって、上記生体親和性高分子ブロック一つの大きさが２０μｍ以上２００μｍ以下である細胞構造体を、炎症疾患の処置を必要とする対象者に移植する工程を含む炎症疾患の処置方法。
（Ｃ）　トロフィックファクタ放出のための、および／またはトロフィックファクタ放出による処置のための、生体親和性高分子ブロックと細胞とを含み、複数個の細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックが配置されている、細胞構造体であって、上記生体親和性高分子ブロック一つの大きさが２０μｍ以上２００μｍ以下である細胞構造体。
（Ｄ）　炎症疾患の処置のための、生体親和性高分子ブロックと細胞とを含み、複数個の細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックが配置されている、細胞構造体であって、上記生体親和性高分子ブロック一つの大きさが２０μｍ以上２００μｍ以下である細胞構造体。
（Ｅ）　トロフィックファクタ放出剤の製造のための、生体親和性高分子ブロックと細胞とを含み、複数個の細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックが配置されている、細胞構造体であって、上記生体親和性高分子ブロック一つの大きさが２０μｍ以上２００μｍ以下である細胞構造体の使用。
（Ｆ）　炎症疾患処置剤の製造のための、生体親和性高分子ブロックと細胞とを含み、複数個の細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックが配置されている、細胞構造体であって、上記生体親和性高分子ブロック一つの大きさが２０μｍ以上２００μｍ以下である細胞構造体の使用。
　本発明のトロフィックファクタ放出剤およびそれを含む炎症疾患処置剤によれば、細胞塊を使用する場合と比較して、細胞が放出するトロフィックファクタの量を増大することができる。また、本発明の炎症疾患処置剤によれば、細胞塊を使用する場合と比較して、炎症疾患処置効果を増大することができる。
図１は、条件Ａに記載した実験の液温プロファイリングを示す。 図２は、条件Ｂに記載した実験の液温プロファイリングを示す。 図３は、条件Ｃに記載した実験の液温プロファイリングを示す。 図４は、炎症刺激ＴＮＦαに依存的なＴＳＧ－６産生放出量を測定した結果を示す。 図５は、炎症刺激ＴＮＦαに依存的なＴＳＧ－６産生放出量を一細胞当たりの産生放出量として求めた結果を示す。 図６は、２．５質量％デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘発マウスの体重を測定した結果を示す。 図７は、２．５質量％デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘発マウスの体重を測定した結果を示す。 図８は、３．０質量％デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘発マウスの体重を測定した結果を示す。 図９は、３.０質量％デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘発マウスの体重を測定した結果を示す。 図１０は、３.０質量％デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘発マウスの大腸の長さを測定した結果を示す。 図１１は、３.０質量％デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘発マウスの病理スコアを示す。 図１２は、各マウス群の代表的なＨＥ組織染色像を示す。 図１３は、各マウス群の代表的なＨＥ組織染色像を示す。 図１４は、Ｔ細胞の平均分裂回数の測定結果を示す。 図１５は、ＩＬ－２の定量結果を示す。 図１６は、各マウス群の正常マウスに対する体重割合（％）の平均値を示す。 図１７は、各マウス群の大腸の長さを測定した結果を示す。
　以下、本発明を実施するための形態を、詳細に説明する。
　本発明において使用する細胞構造体は、本明細書中において、モザイク細胞塊（モザイク状になっている細胞塊）と称する場合もある。また本明細書において「～」は、その前後に記載される数値をそれぞれ最小値および最大値として含む範囲を示すものとする。
　本発明は、生体親和性高分子ブロックと細胞とを含み、複数個の細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックが配置されている、細胞構造体を含む、トロフィックファクタ放出剤であって、上記生体親和性高分子ブロック一つの大きさが２０μｍ以上２００μｍ以下であり、上記細胞からトロフィックファクタが放出される、トロフィックファクタ放出剤に関する。
　後記する実施例に示す通り、モザイク細胞塊と細胞塊を用いて、放出された各種トロフィックファクタ量を測定した結果、細胞塊からの放出量に対して、モザイク細胞塊から放出されるトロフィックファクタが増大した（実施例８）。本発明は如何なる理論によっても拘束されるものではないが、トロフィックファクタの種類により放出量の増加の程度が異なることから、トロフィックファクタの放出量が増加する要因としては、モザイク細胞塊とすることによる生細胞数の増加のみではなく、その他の要因によっても放出量の増加効果が発揮されていることが推測される。
　後記する実施例に示す通り、モザイク細胞塊と細胞塊を用いて、放出されたＴＳＧ－６量を測定したところ、細胞塊からの放出量に対して、モザイク細胞塊から放出されるトロフィックファクタが増大した（実施例１１）。また。モザイク細胞塊と細胞塊を用いて、ＴＮＦα刺激後に、放出されたＴＳＧ－６量を測定したところ、細胞塊からの放出量に対して、モザイク細胞塊から放出されるトロフィックファクタが極めて増大した（実施例１２）。
　非特許文献１または非特許文献２には、ヒト間葉系幹／間質細胞のスフェロイド（細胞塊）がトロフィックファクタを産生することが記載されているが、モザイク細胞塊については記載がない。特許文献１には、生体適合性かつ生分解性材料を主成分とする微小粒子が、成長因子、ホルモンおよびサイトカインからなる群より選択される作用物質を含むことが記載されているが、上記作用物質は、細胞から放出されるものではなく、特許文献１には、細胞がトロフィックファクタを産生することについての記載はない。特許文献２にはモザイク細胞塊が記載されているが、細胞からトロフィックファクタが放出されることについての記載はない。
　また非特許文献１の図６、および非特許文献２の図６には、平面培養と比較してスフェロイドの方がトロフィックファクタの産生量が大きいことが示されている。一般的には、平面培養の方がスフェロイドよりも細胞の栄養状態は良好であると考えられるので、トロフィックファクタ産生量は、細胞の栄養状態に依存するものではないものと推測される。特許文献２には、モザイク細胞塊の方がスフェロイドよりも栄養状態が良好であることが記載されているが、トロフィックファクタ産生量は、細胞の栄養状態に依存するものではないものと推測されていることから、本発明の効果は、非特許文献１および２、並びに特許文献１の記載から予想できるものではない。
　上記の通り、生体親和性高分子ブロックと細胞とを含み、複数個の細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックが配置されている、細胞構造体において、細胞からのトロフィックファクタの放出量が、細胞塊の場合と比較して増大することは、従来技術からは全く予想できない効果である。
（１）生体親和性高分子ブロック
（１－１）生体親和性高分子
　生体親和性とは、生体に接触した際に、長期的かつ慢性的な炎症反応などのような顕著な有害反応を惹起しないことを意味する。本発明で用いる生体親和性高分子は、生体に親和性を有するものであれば、生体内で分解されるか否かは特に限定されないが、生分解性高分子であることが好ましい。非生分解性材料として具体的には、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリウレタン、ポリプロピレン、ポリエステル、塩化ビニル、ポリカーボネート、アクリル、ステンレス、チタン、シリコーン、およびＭＰＣ（2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）などが挙げられる。生分解性材料としては、具体的には、天然由来のペプチド、リコンビナントペプチドまたは化学合成ペプチドなどのポリペプチド（例えば、以下に説明するゼラチン等）、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸・グリコール酸コポリマー（ＰＬＧＡ）、ヒアルロン酸、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、コンドロイチン、セルロース、アガロース、カルボキシメチルセルロース、キチン、およびキトサンなどが挙げられる。上記の中でも、リコンビナントペプチドが特に好ましい。これら生体親和性高分子には細胞接着性を高める工夫がなされていてもよい。具体的には、「基材表面に対する細胞接着基質（フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン）や細胞接着配列（アミノ酸一文字表記で表される、ＲＧＤ配列、ＬＤＶ配列、ＲＥＤＶ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＲＹＶＶＬＰＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ配列、ＩＫＶＡＶ配列、ＬＲＥ配列、ＤＧＥＡ配列、およびＨＡＶ配列）ペプチドによるコーティング」、「基材表面のアミノ化、カチオン化」、または「基材表面のプラズマ処理、コロナ放電による親水性処理」といった方法を使用できる。
　リコンビナントペプチドまたは化学合成ペプチドを含むポリペプチドの種類は生体親和性を有するものであれば特に限定されないが、例えば、ゼラチン、コラーゲン、アテロコラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、プロネクチン、ラミニン、テネイシン、フィブリン、フィブロイン、エンタクチン、トロンボスポンジン、レトロネクチン（登録商標）が好ましく、最も好ましくはゼラチン、コラーゲン、アテロコラーゲンである。本発明で用いるためのゼラチンとしては、好ましくは、天然ゼラチン、リコンビナントゼラチンまたは化学合成ゼラチンであり、さらに好ましくはリコンビナントゼラチンである。ここでいう天然ゼラチンとは天然由来のコラーゲンより作られたゼラチンを意味する。
　化学合成ペプチドまたは化学合成ゼラチンとは、人工的に合成したペプチドまたはゼラチンを意味する。ゼラチン等のペプチドの合成は、固相合成でも液相合成でもよいが、好ましくは固相合成である。ペプチドの固相合成は当業者に公知であり、例えば、アミノ基の保護としてＦｍｏｃ基（Fluorenyl-Methoxy-Carbonyl基）を使用するＦｍｏｃ基合成法、並びにアミノ基の保護としてＢｏｃ基（tert-Butyl Oxy Carbonyl基）を使用するＢｏｃ基合成法などが挙げられる。なお、化学合成ゼラチンの好ましい態様は、本明細書中後記するリコンビナントゼラチンに記載した内容を当てはめることができる。
　本発明で用いる生体親和性高分子の親水性値「１／ＩＯＢ」値は、０から１．０が好ましい。より好ましくは、０から０．６であり、さらに好ましくは０から０．４である。ＩＯＢとは、藤田穆により提案された有機化合物の極性/非極性を表す有機概念図に基づく、親疎水性の指標であり、その詳細は、例えば、"Pharmaceutical Bulletin", vol.2, 2, pp.163-173（1954）、「化学の領域」vol.11, 10, pp.719-725（1957）、「フレグランスジャーナル」, vol.50, pp.79-82（1981）等で説明されている。簡潔に言えば、全ての有機化合物の根源をメタン（ＣＨ4）とし、他の化合物はすべてメタンの誘導体とみなして、その炭素数、置換基、変態部、環等にそれぞれ一定の数値を設定し、そのスコアを加算して有機性値（ＯＶ）、無機性値（ＩＶ）を求め、この値を、有機性値をＸ軸、無機性値をＹ軸にとった図上にプロットしていくものである。有機概念図におけるＩＯＢとは、有機概念図における有機性値（ＯＶ）に対する無機性値（ＩＶ）の比、すなわち「無機性値（ＩＶ）／有機性値（ＯＶ）」をいう。有機概念図の詳細については、「新版有機概念図－基礎と応用－」（甲田善生等著、三共出版、２００８）を参照されたい。本明細書中では、ＩＯＢの逆数をとった「１／ＩＯＢ」値で親疎水性を表している。「１／ＩＯＢ」値が小さい（０に近づく）程、親水性であることを表す表記である。
　本発明で用いる高分子の「１／ＩＯＢ」値を上記範囲とすることにより、親水性が高く、かつ、吸水性が高くなることから、栄養成分の保持に有効に作用し、結果として、本発明にかかる細胞構造体（モザイク細胞塊）における細胞の安定化・生存しやすさに寄与するものと推定される。
　本発明で用いる生体親和性高分子がポリペプチドである場合は、Grand average of hydropathicity（GRAVY）値で表される親疎水性指標において、０．３以下、マイナス９．０以上であることが好ましく、０．０以下、マイナス７．０以上であることがさらに好ましい。Grand average of hydropathicity（GRAVY）値は、『Gasteiger E., Hoogland C., Gattiker A., Duvaud S., Wilkins M.R., Appel R.D., Bairoch A.;Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server;(In) John M. Walker (ed): The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press (2005). pp. 571-607』および『Gasteiger E., Gattiker A., Hoogland C., Ivanyi I., Appel R.D., Bairoch A.; ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis.; Nucleic Acids Res. 31:3784-3788(2003).』の方法により得ることができる。
　本発明で用いる高分子のＧＲＡＶＹ値を上記範囲とすることにより、親水性が高く、かつ、吸水性が高くなることから、栄養成分の保持に有効に作用し、結果として、本発明にかかる細胞構造体（モザイク細胞塊）における細胞の安定化・生存しやすさに寄与するものと推定される。
（１－２）架橋
　本発明で用いる生体親和性高分子は、架橋されているものでもよいし、架橋されていないものでもよいが、架橋されているものが好ましい。架橋されている生体親和性高分子を使用することにより、培地中で培養する際および生体に移植した際に瞬時に分解してしまうことを防ぐという効果が得られる。一般的な架橋方法としては、熱架橋、アルデヒド類（例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドなど）による架橋、縮合剤（カルボジイミド、シアナミドなど）による架橋、酵素架橋、光架橋、紫外線架橋、疎水性相互作用、水素結合、およびイオン性相互作用などが知られており、本発明においても上記の架橋方法を使用することができる。本発明で使用する架橋方法としては、さらに好ましくは熱架橋、紫外線架橋、または酵素架橋であり、特に好ましくは熱架橋である。
　酵素による架橋を行う場合、酵素としては、高分子材料間の架橋作用を有するものであれば特に限定されないが、好ましくはトランスグルタミナーゼまたはラッカーゼ、最も好ましくはトランスグルタミナーゼを用いて架橋を行うことができる。トランスグルタミナーゼで酵素架橋するタンパク質の具体例としては、リジン残基およびグルタミン残基を有するタンパク質であれば特に制限されない。トランスグルタミナーゼは、哺乳類由来のものであっても、微生物由来のものであってもよく、具体的には、味の素（株）製アクティバシリーズ、試薬として販売されている哺乳類由来のトランスグルタミナーゼ、例えば、オリエンタル酵母工業（株）製、Upstate USA Inc.製、Biodesign International製などのモルモット肝臓由来トランスグルタミナーゼ、ヤギ由来トランスグルタミナーゼ、ウサギ由来トランスグルタミナーゼなど、並びにヒト由来の血液凝固因子（Factor XIIIa、Haematologic Technologies， Inc.社）などが挙げられる。
　架橋（例えば、熱架橋）を行う際の反応温度は、架橋ができる限り特に限定されないが、好ましくは、－１００℃～５００℃であり、より好ましくは０℃～３００℃であり、更に好ましくは５０℃～３００℃であり、特に好ましくは１００℃～２５０℃であり、最も好ましくは１２０℃～２００℃である。
（１－３）リコンビナントゼラチン
　本発明で言うリコンビナントゼラチンとは、遺伝子組み換え技術により作られたゼラチン類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくは蛋白様物質を意味する。本発明で用いることができるリコンビナントゼラチンは、コラーゲンに特徴的なＧｌｙ－Ｘ－Ｙで示される配列（ＸおよびＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す）の繰り返しを有するものが好ましい。ここで、複数個のＧｌｙ－Ｘ－Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。好ましくは、細胞接着シグナルが一分子中に２配列以上含まれている。本発明で用いるリコンビナントゼラチンとしては、コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するリコンビナントゼラチンを用いることができる。例えばＥＰ１０１４１７６、米国特許６９９２１７２号、国際公開ＷＯ２００４／８５４７３、国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１等に記載のものを用いることができるが、これらに限定されるものではない。本発明で用いるリコンビナントゼラチンとして好ましいものは、以下の態様のリコンビナントゼラチンである。
　リコンビナントゼラチンは、天然のゼラチン本来の性能から、生体親和性に優れ、且つ天然由来ではないことで牛海綿状脳症（ＢＳＥ）などの懸念がなく、非感染性に優れている。また、リコンビナントゼラチンは天然ゼラチンと比べて均一であり、配列が決定されているので、強度および分解性においても架橋等によってブレを少なく精密に設計することが可能である。
　リコンビナントゼラチンの分子量は、特に限定されないが、好ましくは２０００以上１０００００以下（２ｋＤａ（キロダルトン）以上１００ｋＤａ以下）であり、より好ましくは２５００以上９５０００以下（２．５ｋＤａ以上９５ｋＤａ以下）であり、さらに好ましくは５０００以上９００００以下（５ｋＤａ以上９０ｋＤａ以下）であり、最も好ましくは１００００以上９００００以下（１０ｋＤａ以上９０ｋＤａ以下）である。
　リコンビナントゼラチンは、コラーゲンに特徴的なＧｌｙ－Ｘ－Ｙで示される配列の繰り返しを有することが好ましい。ここで、複数個のＧｌｙ－Ｘ－Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ において、Ｇｌｙはグリシンを表し、ＸおよびＹは、任意のアミノ酸（好ましくは、グリシン以外の任意のアミノ酸）を表す。コラーゲンに特徴的なＧｌｙ－Ｘ－Ｙで示される配列とは、ゼラチン・コラーゲンのアミノ酸組成および配列における、他のタンパク質と比較して非常に特異的な部分構造である。この部分においてはグリシンが全体の約３分の１を占め、アミノ酸配列では３個に１個の繰り返しとなっている。グリシンは最も簡単なアミノ酸であり、分子鎖の配置への束縛も少なく、ゲル化に際してのヘリックス構造の再生に大きく寄与している。ＸおよびＹで表されるアミノ酸はイミノ酸（プロリン、オキシプロリン）が多く含まれ、全体の１０％～４５％を占めることが好ましい。好ましくは、リコンビナントゼラチンの配列の８０％以上、更に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上のアミノ酸が、Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙの繰り返し構造である。
　一般的なゼラチンは、極性アミノ酸のうち電荷を持つものと無電荷のものが１：１で存在する。ここで、極性アミノ酸とは具体的にシステイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシンおよびアルギニンを指し、このうち極性無電荷アミノ酸とはシステイン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニンおよびチロシンを指す。本発明で用いるリコンビナントゼラチンにおいては、構成する全アミノ酸のうち、極性アミノ酸の割合が１０～４０％であり、好ましくは２０～３０％である。且つ上記極性アミノ酸中の無電荷アミノ酸の割合が５％以上２０％未満、好ましくは５％以上１０％未満であることが好ましい。さらに、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシンおよびシステインのうちいずれか１アミノ酸、好ましくは２以上のアミノ酸を配列上に含まないことが好ましい。
　一般にポリペプチドにおいて、細胞接着シグナルとして働く最小アミノ酸配列が知られている（例えば、株式会社永井出版発行「病態生理」Ｖｏｌ．９、Ｎｏ．７（１９９０年）５２７頁）。本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、これらの細胞接着シグナルを一分子中に２以上有することが好ましい。具体的な配列としては、接着する細胞の種類が多いという点で、アミノ酸一文字表記で現わされる、ＲＧＤ配列、ＬＤＶ配列、ＲＥＤＶ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＲＹＶＶＬＰＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ配列、ＩＫＶＡＶ配列、ＬＲＥ配列、ＤＧＥＡ配列、およびＨＡＶ配列の配列が好ましい。さらに好ましくはＲＧＤ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＩＫＶＡＶ配列およびＨＡＶ配列、特に好ましくはＲＧＤ配列である。ＲＧＤ配列のうち、好ましくはＥＲＧＤ配列である。細胞接着シグナルを有するリコンビナントゼラチンを用いることにより、細胞の基質産生量を向上させることができる。
　本発明で用いるリコンビナントゼラチンにおけるＲＧＤ配列の配置としては、ＲＧＤ間のアミノ酸数が０～１００の間で均一でないことが好ましく、ＲＧＤ間のアミノ酸数が２５～６０の間で均一でないことがより好ましい。
　この最小アミノ酸配列の含有量は、細胞接着・増殖性の観点から、タンパク質１分子中に好ましくは３～５０個であり、さらに好ましくは４～３０個であり、特に好ましくは５～２０個であり、最も好ましくは１２個である。
　本発明で用いるリコンビナントゼラチンにおいて、アミノ酸総数に対するＲＧＤモチーフの割合は少なくとも０．４％であることが好ましい。リコンビナントゼラチンが３５０以上のアミノ酸を含む場合、３５０のアミノ酸の各ストレッチが少なくとも１つのＲＧＤモチーフを含むことが好ましい。アミノ酸総数に対するＲＧＤモチーフの割合は、より好ましくは少なくとも０．６％であり、更に好ましくは少なくとも０．８％であり、更に一層好ましくは少なくとも１．０％であり、特に好ましくは少なくとも１．２％であり、最も好ましくは少なくとも１．５％である。リコンビナントペプチド内のＲＧＤモチーフの数は、２５０のアミノ酸あたり、好ましくは少なくとも４、より好ましくは６、更に好ましくは８、特に好ましくは１２以上１６以下である。ＲＧＤモチーフの０．４％という割合は、２５０のアミノ酸あたり、少なくとも１つのＲＧＤ配列に対応する。ＲＧＤモチーフの数は整数であるので、０．４％の特徴を満たすには、２５１のアミノ酸からなるゼラチンは、少なくとも２つのＲＧＤ配列を含まなければならない。好ましくは、本発明のリコンビナントゼラチンは、２５０のアミノ酸あたり、少なくとも２つのＲＧＤ配列を含み、より好ましくは２５０のアミノ酸あたり、少なくとも３つのＲＧＤ配列を含み、さらに好ましくは２５０のアミノ酸あたり、少なくとも４つのＲＧＤ配列を含む。本発明のリコンビナントゼラチンのさらなる態様としては、好ましくは少なくとも４つのＲＧＤモチーフを含み、より好ましくは６つのＲＧＤモチーフを含み、さらに好ましくは８つのＲＧＤモチーフを含み、特に好ましくは１２以上１６以下のＲＧＤモチーフを含む。
　リコンビナントゼラチンは部分的に加水分解されていてもよい。
　好ましくは、本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、式１：Ａ－［（Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ）n］m－Ｂで示されるものである。ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。ｍは好ましくは２～１０の整数を示し、より好ましくは３～５の整数を示す。ｎは３～１００の整数が好ましく、１５～７０の整数がさらに好ましく、５０～６５の整数が最も好ましい。Ａは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示す。なお、ｎ個のＧｌｙ－Ｘ－Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。
　より好ましくは、本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－［（Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ）63］3－Ｇｌｙ（式中、６３個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、６３個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。なお、６３個のＧｌｙ－Ｘ－Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。）で示されるものである。
　繰り返し単位には天然に存在するコラーゲンの配列単位を複数結合することが好ましい。ここで言う天然に存在するコラーゲンとは天然に存在するものであればいずれでも構わないが、好ましくはＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、またはＶ型コラーゲンである。より好ましくは、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型コラーゲンである。別の形態によると、上記コラーゲンの由来は好ましくは、ヒト、ウシ、ブタ、マウスまたはラットであり、より好ましくはヒトである。
　本発明で用いるリコンビナントゼラチンの等電点は、好ましくは５～１０であり、より好ましくは６～１０であり、さらに好ましくは７～９．５である。リコンビナントゼラチンの等電点の測定は、等電点電気泳動法（Ｍａｘｅｙ，Ｃ．Ｒ．（１９７６；Ｐｈｉｔｏｇｒ．Ｇｅｌａｔｉｎ ２，Ｅｄｉｔｏｒ Ｃｏｘ，Ｐ．Ｊ．Ａｃａｄｅｍｉｃ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｅｎｇｌ．参照）に記載されたように、１質量％ゼラチン溶液をカチオンおよびアニオン交換樹脂の混晶カラムに通したあとのｐＨを測定することで実施することができる。
　好ましくは、リコンビナントゼラチンは脱アミン化されていない。
　好ましくは、リコンビナントゼラチンはテロペプタイドを有さない。
　好ましくは、リコンビナントゼラチンは、アミノ酸配列をコードする核酸により調製された実質的に純粋なポリペプチドである。
　本発明で用いるリコンビナントゼラチンとして特に好ましくは、
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド；
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；または
（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上（さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；
の何れかである
　本発明における配列同一性は、以下の式で計算される値を指す。
％配列同一性＝［（同一残基数）／（アラインメント長）］×１００
　２つのアミノ酸配列における配列同一性は当業者に公知の任意の方法で決定することができ、ＢＬＡＳＴ（(Basic Local Alignment Search Tool)）プログラム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０，１９９０）等を使用して決定することができる。
　「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」における「１若しくは数個」とは、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個、さらに好ましくは１～５個、特に好ましくは１～３個を意味する。
　本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、当業者に公知の遺伝子組み換え技術によって製造することができ、例えばＥＰ１０１４１７６Ａ２号公報、米国特許第６９９２１７２号公報、国際公開ＷＯ２００４／８５４７３号、国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１号等に記載の方法に準じて製造することができる。具体的には、所定のリコンビナントゼラチンのアミノ酸配列をコードする遺伝子を取得し、これを発現ベクターに組み込んで、組み換え発現ベクターを作製し、これを適当な宿主に導入して形質転換体を作製する。得られた形質転換体を適当な培地で培養することにより、リコンビナントゼラチンが産生されるので、培養物から産生されたリコンビナントゼラチンを回収することにより、本発明で用いるリコンビナントゼラチンを調製することができる。
（１－４）生体親和性高分子ブロック
　本発明では、上記した生体親和性高分子からなるブロック（塊）を使用する。
　本発明における生体親和性高分子ブロックの形状は特に限定されるものではない。例えば、不定形、球状、粒子状（顆粒）、粉状、多孔質状、繊維状、紡錘状、扁平状およびシート状であり、好ましくは、不定形、球状、粒子状（顆粒）、粉状および多孔質状である。不定形とは、表面形状が均一でないもののことを示し、例えば、岩のような凹凸を有する物を示す。なお、上記の形状の例示はそれぞれ別個のものではなく、例えば、粒子状（顆粒）の下位概念の一例として不定形となる場合もある。
　本発明における生体親和性高分子ブロックの形状は上記の通り特に限定されるものではないが、タップ密度が、好ましくは１０ｍｇ／ｃｍ3以上５００ｍｇ／ｃｍ3以下であり、より好ましくは２０ｍｇ／ｃｍ3以上４００ｍｇ／ｃｍ3以下であり、さらに好ましくは４０ｍｇ／ｃｍ3以上２２０ｍｇ／ｃｍ3以下であり、特に好ましくは５０ｍｇ／ｃｍ3以上１５０ｍｇ／ｃｍ3以下である。
　タップ密度は、ある体積にどれくらいのブロックを密に充填できるかを表す値であり、値が小さいほど、密に充填できない、すなわちブロックの構造が複雑であることが分かる。生体親和性高分子ブロックのタップ密度とは、生体親和性高分子ブロックの表面構造の複雑性、および生体親和性高分子ブロックを集合体として集めた場合に形成される空隙の量を表していると考えられる。タップ密度が小さい程、生体親和性高分子ブロック間の空隙が多くなり、細胞の生着領域が多くなる。また、小さ過ぎないことで、細胞同士の間に適度に生体親和性高分子ブロックが存在でき、細胞構造体とした場合に同構造体内部への栄養分送達を可能とすることから、上記の範囲に収まることが好適であると考えられる。
　本明細書でいうタップ密度は、以下のように測定できる。測定のために（直径６ｍｍ、長さ２１．８ｍｍの円筒状：容量０．６１６ｃｍ3）の容器（以下、キャップと記載する）を用意する。まず、キャップのみの質量を測定する。その後、キャップにロートを付け、ブロックがキャップに溜まるようにロートから流し込む。十分量のブロックを入れた後、キャップ部分を２００回机などの硬いところにたたきつけ、ロートをはずし、スパチュラですりきりにする。このキャップにすりきり一杯入った状態で質量を測定する。キャップのみの質量との差からブロックのみの質量を算出し、キャップの体積で割ることで、タップ密度を求めることができる。
　本発明における生体親和性高分子ブロックの架橋度は、特に限定されないが、好ましくは２以上であり、さらに好ましくは２以上３０以下であり、さらに好ましくは４以上２５以下であり、特に好ましくは４以上２２以下である。
　生体親和性高分子ブロックの架橋度（１分子当たりの架橋数）の測定方法は、特に限定されないが、生体親和性高分子がＣＢＥ３の場合には、例えば、後記実施例に記載のＴＮＢＳ（2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸）法で測定することができる。具体的には、生体親和性高分子ブロック、ＮａＨＣＯ3水溶液およびＴＮＢＳ水溶液を混合して３７℃で３時間反応させた後に反応停止したサンプルと、生体親和性高分子ブロック、ＮａＨＣＯ3水溶液およびＴＮＢＳ水溶液を混合した直後に反応停止させたブランクとをそれぞれ調製し、純水で希釈したサンプルおよびブランクの吸光度（３４５nm）を測定し、以下の（式２）、および（式３）から架橋度（１分子当たりの架橋数）を算出することができる。
（式２）　（As-Ab）／１４６００×V／ｗ
（式２）は、生体親和性高分子ブロック１ｇ当たりのリジン量（モル等量）を示す。
（式中、Asはサンプル吸光度、Abはブランク吸光度、Vは反応液量（ｇ）、ｗは生体親和性高分子ブロック質量（ｍｇ）を示す。）
（式３）　１－（サンプル（式２）/未架橋の高分子（式２））×３４
（式３）は、１分子あたりの架橋数を示す。
　本発明における生体親和性高分子ブロックの吸水率は、特に限定されないが、好ましくは３００％以上、より好ましくは４００％以上、さらに好ましくは５００％以上、特に好ましくは６００％以上、最も好ましくは７００％以上である。なお吸水率の上限は特に限定されないが、一般的には４０００％以下、または２０００％以下である。
　生体親和性高分子ブロックの吸水率の測定方法は、特に限定されないが、例えば、後記実施例に記載の方法により測定することができる。具体的には、２５℃において３ｃｍ×３ｃｍのナイロンメッシュ製の袋の中に、生体親和性高分子ブロック約１５ｍｇを充填し、２時間イオン交換水中で膨潤させた後、１０分風乾させ、それぞれの段階において質量を測定し、（式４）に従って吸水率を求めることができる。
（式４）
　吸水率＝（ｗ２－ｗ１－ｗ０）／ｗ０
（式中、ｗ０は、吸水前の材料の質量、ｗ１は吸水後の空袋の質量、ｗ２は吸水後の材料を含む袋全体の質量を示す。）
　本発明における生体親和性高分子ブロック一つの大きさは、２０μｍ以上２００μｍ以下であり、好ましくは２０μｍ以上１５０μｍ以下であり、より好ましくは５０μｍ以上１２０μｍ以下であり、さらに好ましくは５３μｍ以上１０６μｍ以下である。
　生体親和性高分子ブロック一つの大きさを上記の範囲内にすることにより、外部から細胞構造体の内部への栄養送達を良好にすることができる。なお、生体親和性高分子ブロック一つの大きさとは、複数個の生体親和性高分子ブロックの大きさの平均値が上記範囲にあることを意味するものではなく、複数個の生体親和性高分子ブロックを篩にかけて得られる、一つ一つの生体親和性高分子ブロックのサイズを意味するものである。
　ブロック一つの大きさは、ブロックを分ける際に用いたふるいの大きさで定義することができる。例えば、１８０μｍのふるいにかけ、通過したブロックを１０６μｍのふるいにかけた際にふるいの上に残るブロックを、１０６～１８０μｍの大きさのブロックとすることができる。次に、１０６μｍのふるいにかけ、通過したブロックを５３μｍのふるいにかけた際にふるいの上に残るブロックを、５３～１０６μｍの大きさのブロックとすることができる。次に、５３μｍのふるいにかけ、通過したブロックを２５μｍのふるいにかけた際にふるいの上に残るブロックを、２５～５３μｍの大きさのブロックとすることができる。
（１－５）生体親和性高分子ブロックの製造方法
　生体親和性高分子ブロックの製造方法は、特に限定されないが、例えば、生体親和性高分子を含有する固形物（生体親和性高分子の多孔質体など）を、粉砕機（ニューパワーミルなど）を用いて粉砕することにより、生体親和性高分子ブロックを得ることができる。生体親和性高分子を含有する固形物（多孔質体など）は、例えば、生体親和性高分子を含有する水溶液を凍結乾燥して得ることができる。
　上記の通り、生体親和性高分子を含有する固形物を粉砕することにより、表面形状が均一でない不定形の生体親和性高分子ブロックを製造することができる。
　生体親和性高分子の多孔質体を製造する方法としては、特に限定されないが、生体親和性高分子を含む水溶液を凍結乾燥させることによっても得ることができる。例えば、溶液内で最も液温の高い部分の液温（内部最高液温）が、未凍結状態で「溶媒融点－３℃」以下となる凍結工程を含めることによって、形成される氷は球状とすることができる。この工程を経て、氷が乾燥されることで、球状の等方的な空孔（球孔）を持つ多孔質体が得られる。溶液内で最も液温の高い部分の液温（内部最高液温）が、未凍結状態で「溶媒融点－３℃」以上となる凍結工程を含まずに、凍結されることで、形成される氷は柱／平板状とすることができる。この工程を経て、氷が乾燥されると、一軸あるいは二軸上に長い、柱状あるいは平板状の空孔（柱／平板孔）を持つ多孔質体が得られる。生体親和性高分子の多孔質体を、粉砕し、生体親和性高分子ブロックを製造する場合には、粉砕前の多孔質体の空孔が、得られる生体親和性高分子ブロックの形状に影響を与えるため、上記の通り、凍結乾燥の条件を調整することにより、得られる生体親和性高分子ブロックの形状を調整することができる。
　生体親和性高分子の多孔質体の製造方法の一例としては、
（ａ）溶液内で最も液温の高い部分の温度と溶液内で最も液温の低い部分の温度との差が２．５℃以下であり、かつ、溶液内で最も液温の高い部分の温度が溶媒の融点以下で、生体親和性高分子の溶液を、未凍結状態に冷却する工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られた生体親和性高分子の溶液を凍結する工程、および
（ｃ）工程（ｂ）で得られた凍結した生体親和性高分子を凍結乾燥する工程
を含む方法を挙げることができるが、上記方法に限定されるわけではない。
　生体親和性高分子の溶液を未凍結状態に冷却する際に、最も液温の高い部分の温度と溶液内で最も液温の低い部分の温度との差が２．５℃以下（好ましくは２．３℃以下、より好ましくは２．１℃以下）、つまり温度の差を小さくすることによって、得られる多孔質のポアの大きさのばらつきが少なくなる。なお最も液温の高い部分の温度と溶液内で最も液温の低い部分の温度との差の下限は特に限定されず、０℃以上であればよく、例えば０．１℃以上、０．５℃以上、０．８℃以上、または０．９℃以上でもよい。これにより、製造された多孔質体を用いて製造した生体親和性高分子ブロックを用いた細胞構造体は、高い細胞数を示すという効果が達成される。
　工程（ａ）の冷却は、例えば、水よりも熱伝導率の低い素材（好ましくは、テフロン（登録商標））を介して冷却することが好ましく、溶液内で最も液温の高い部分は、冷却側から最も遠い部分と擬制することができ、溶液内で最も液温の低い部分は、冷却面の液温と擬制することができる。
　好ましくは、工程（ａ）において、凝固熱発生直前の、溶液内で最も液温の高い部分の温度と溶液内で最も液温の低い部分の温度との差が２．５℃以下であり、より好ましくは２．３℃以下であり、さらに好ましくは２．１℃以下である。ここで「凝固熱発生直前の温度差」とは、凝固熱発生時の１秒前～１０秒前の間で最も温度差が大きくなるときの温度差を意味する。
　好ましくは、工程（ａ）において、溶液内で最も液温の低い部分の温度は、溶媒融点－５℃以下であり、より好ましくは溶媒融点－５℃以下かつ溶媒融点－２０℃以上であり、更に好ましくは溶媒融点－６℃以下かつ溶媒融点－１６℃以上である。なお、溶媒融点の溶媒とは、生体親和性高分子の溶液の溶媒である。
　工程（ｂ）においては、工程（ａ）で得られた生体親和性高分子の溶液を凍結する。工程（ｂ）にて凍結するための冷却温度は、特に制限されるものではなく、冷却する機器にもよるが、好ましくは、溶液内で最も液温の低い部分の温度より、３℃から３０℃低い温度であり、より好ましくは、５℃から２５℃低い温度であり、更に好ましくは、１０℃から２０℃低い温度である。
　工程（ｃ）においては、工程（ｂ）で得られた凍結した生体親和性高分子を凍結乾燥する。凍結乾燥は、常法により行うことができ、例えば、溶媒の融点より低い温度で真空乾燥を行い、さらに室温（２０℃）で真空乾燥を行うことにより凍結乾燥を行うことができる。
　本発明では好ましくは、上記工程（ｃ）で得られた多孔質体を粉砕することによって、生体親和性高分子ブロックを製造することができる。
（２）細胞
　本発明で使用する細胞は、その種類は特に限定されるものではなく、本発明の目的である、トロフィックファクタ放出する細胞を好適に用いることができ、実際の治療目的に応じて、任意の細胞を使用することができる。また、使用する細胞は１種でもよいし、複数種の細胞を組合せて用いてもよい。使用する細胞として、好ましくは、動物細胞であり、より好ましくは脊椎動物由来細胞、特に好ましくはヒト由来細胞である。脊椎動物由来細胞（特に、ヒト由来細胞）の種類は、万能細胞、体性幹細胞、前駆細胞、または成熟細胞の何れでもよく、特に好ましくは体性幹細胞である。
　万能細胞としては、例えば、胚性幹（ＥＳ）細胞、生殖幹（ＧＳ）細胞、または人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を使用することができる。体性幹細胞としては、例えば、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、造血幹細胞、羊膜細胞、臍帯血細胞、骨髄由来細胞（例えば、骨髄由来間ＭＳＣ等）、心筋幹細胞、脂肪由来幹細胞、または神経幹細胞を使用することができる。前駆細胞および成熟細胞としては、例えば、皮膚、真皮、表皮、筋肉、心筋、神経、骨、軟骨、内皮、脳、上皮、心臓、腎臓、肝臓、膵臓、脾臓、口腔内、角膜、骨髄、臍帯血、羊膜、または毛に由来する細胞を使用することができる。ヒト由来細胞としては、例えば、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、ＭＳＣ、軟骨細胞、骨芽細胞、骨芽前駆細胞、間充織細胞、筋芽細胞、心筋細胞、心筋芽細胞、神経細胞、肝細胞、ベータ細胞、線維芽細胞、角膜内皮細胞、血管内皮細胞、角膜上皮細胞、羊膜細胞、臍帯血細胞、骨髄由来細胞、または造血幹細胞を使用することができる。また、細胞の由来は、自家細胞または他家細胞の何れでも構わない。上記の中でも、細胞としては、間葉系幹細胞を使用することが好ましい。間葉系幹細胞としては、脂肪由来間葉系幹細胞または骨髄由来間葉系幹細胞が好ましい。間葉系幹細胞の由来としては、ヒト由来または犬由来が好ましい。
（３）細胞構造体
　本発明の細胞構造体は、上記した本発明にかかる生体親和性高分子ブロックと、少なくとも一種類の細胞とを含み、複数個の細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックが配置されている細胞構造体である。本発明においては、上記した生体親和性高分子ブロックと上記した細胞とを用いて、複数個の細胞間の隙間に複数個の高分子ブロックをモザイク状に３次元的に配置させることによって、生体親和性高分子ブロックと細胞とがモザイク状に３次元配置されることにより、構造体中で細胞が均一に存在する細胞３次元構造体が形成され、前述したように、物質透過能を有することとなる。
　本発明の細胞構造体は、複数個の細胞間の隙間に複数個の高分子ブロックが配置されているが、ここで、「細胞間の隙間」とは、構成される細胞により、閉じられた空間である必要はなく、細胞により挟まれていればよい。なお、すべての細胞間に隙間がある必要はなく、細胞同士が接触している箇所があってもよい。高分子ブロックを介した細胞間の隙間の距離、即ち、ある細胞とその細胞から最短距離に存在する細胞を選択した際の隙間距離は特に制限されるものではないが、高分子ブロックの大きさであることが好ましく、好適な距離も高分子ブロックの好適な大きさの範囲である。
　また、本発明にかかる高分子ブロックは、細胞により挟まれた構成となるが、すべての高分子ブロック間に細胞がある必要はなく、高分子ブロック同士が接触している箇所があってもよい。細胞を介した高分子ブロック間の距離、即ち、高分子ブロックとその高分子ブロックから最短距離に存在する高分子ブロックを選択した際の距離は特に制限されるものではないが、使用される細胞が１～数個集まった際の細胞の塊の大きさであることが好ましく、例えば、１０μｍ以上１０００μｍ以下であり、好ましくは１０μｍ以上１００μｍ以下であり、より好ましくは１０μｍ以上５０μｍ以下である。
　なお、本明細書中、「構造体中で細胞が均一に存在する細胞３次元構造体」等、「均一に存在する」との表現を使用しているが、完全な均一を意味するものではない。
　本発明の細胞構造体の厚さまたは直径は、所望の厚さとすることができるが、下限としては、２１５μｍ以上であることが好ましく、４００μｍ以上がさらに好ましく、７３０μｍ以上であることが最も好ましい。厚さまたは直径の上限は特に限定されないが、使用上の一般的な範囲としては３ｃｍ以下が好ましく、２ｃｍ以下がより好ましく、１ｃｍ以下であることが更に好ましい。また、細胞構造体の厚さまたは直径の範囲として、好ましくは、４００μｍ以上３ｃｍ以下、より好ましくは５００μｍ以上２ｃｍ以下、更に好ましくは７２０μｍ以上１ｃｍ以下である。
　本発明の細胞構造体は、好ましくは、高分子ブロックからなる領域と細胞からなる領域がモザイク状に配置されている。尚、本明細書中における「細胞構造体の厚さまたは直径」とは、以下のことを示すものとする。細胞構造体中のある一点Ａを選択した際に、その点Ａを通る直線の内で、細胞構造体外界からの距離が最短になるように細胞構造体を分断する線分の長さを線分Ａとする。細胞構造体中でその線分Ａが最長となる点Ａを選択し、その際の線分Ａの長さのことを「細胞構造体の厚さまたは直径」とする。
　本発明の細胞構造体においては、細胞と高分子ブロックの比率は特に限定されないが、好ましくは細胞1個当りの高分子ブロックの質量が０．００００００１μｇ以上１μｇ以下であることが好ましく、より好ましくは０．０００００１μｇ以上０．１μｇ以下、さらに好ましくは０．００００１μｇ以上０．０１μｇ以下、最も好ましくは０．００００２μｇ以上０．００６μｇ以下である。上記範囲とすることにより、より細胞を均一に存在させることができる。また、下限を上記範囲とすることにより、上記用途に使用した際に細胞の効果を発揮することができ、上限を上記範囲とすることにより、任意で存在する高分子ブロック中の成分を細胞に供給できる。ここで、高分子ブロック中の成分は特に制限されないが、後記する培地に含まれる成分が挙げられる。
（４）細胞構造体の製造方法
　本発明で用いる細胞構造体は、生体親和性高分子ブロックと、少なくとも一種類の細胞とを混合することによって製造することができる。より具体的には、本発明の細胞構造体は、生体親和性高分子ブロック（生体親和性高分子からなる塊）と、細胞とを交互に配置することにより製造できる。製造方法は特に限定されないが、好ましくは高分子ブロックを形成したのち、細胞を播種する方法である。具体的には、生体親和性高分子ブロックと細胞含有培養液との混合物をインキュベートすることによって、細胞構造体を製造することができる。例えば、容器中、容器に保持される液体中で、細胞と、予め作製した生体親和性高分子ブロックをモザイク状に配置する。配置の手段としては、自然凝集、自然落下、遠心、攪拌を用いることで、細胞と生体親和性基材からなるモザイク状の配列形成を、促進、制御することが好ましい。
　用いられる容器としては、細胞低接着性材料、細胞非接着性材料からなる容器が好ましく、より好ましくはポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ガラス、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレートからなる容器である。容器底面の形状は平底型、Ｕ字型、Ｖ字型であることが好ましい。
　上記の方法で得られたモザイク状細胞構造体は、例えば、（ａ）別々に調整したモザイク状細胞塊同士を融合させる、または（ｂ）分化培地または増殖培地下でボリュームアップさせる、などの方法により所望の大きさの細胞構造体を製造することができる。融合の方法、ボリュームアップの方法は特に限定されない。
　例えば、生体親和性高分子ブロックと細胞含有培養液との混合物をインキュベートする工程において、培地を分化培地または増殖培地に交換することによって、細胞構造体をボリュームアップさせることができる。好ましくは、生体親和性高分子ブロックと細胞含有培養液との混合物をインキュベートする工程において、生体親和性高分子ブロックをさらに添加することによって、所望の大きさの細胞構造体であって、細胞構造体中に細胞が均一に存在する細胞構造体を製造することができる。
　上記別々に調整したモザイク状細胞塊同士を融合させる方法とは、具体的には、複数個の生体親和性高分子ブロックと、複数個の細胞とを含み、上記複数の細胞により形成される複数個の隙間の一部または全部に、一または複数個の上記生体親和性高分子ブロックが配置されている細胞構造体を複数個融合させる工程を含む、細胞構造体の製造方法である。
　本発明で用いる細胞構造体の製造方法における「生体親和性高分子ブロック（種類、大きさ等）」、「細胞」、「細胞間の隙間」、「得られる細胞構造体（大きさ等）」、「細胞と高分子ブロックの比率」等の好適な範囲は、本明細書中上記と同様である。
（５）トロフィックファクタ放出剤
　本発明のトロフィックファクタ放出剤によれば、細胞構造体の細胞からトロフィックファクタが放出される。細胞からトロフィックファクタが放出されるとは、細胞内においてトロフィックファクタが産生し、細胞内で産生されたトロフィックファクタが細胞外に分泌されることを意味する。
　トロフィックファクタとは、生理活性または生物活性を有する物質（特に細胞が産生する物質）を意味する。トロフィックファクタとしては、サイトカイン、ホルモンおよび増殖因子および酵素等が挙げられる。
　サイトカインとは、細胞から放出され、細胞間相互作用を媒介するタンパク質性因子を意味する。
　ホルモンとは、動物体内（一般的には内分泌腺）で産生され、体液中に分泌されて、特定の器官、組織または細胞等の活動に一定の変化を与える化学物質を意味する。
　増殖因子とは、細胞の増殖を促進または制御する物質を意味する。
　酵素とは、生体内の種々の化学反応を触媒するタンパク質を意味する。
　なお、サイトカイン、ホルモンおよび増殖因子および酵素は、互いに排他的な意味を有するわけではない。
　トロフィックファクタの具体例としては、ＴＳＧ－６（TNF-stimulated gene 6 protein）（TNFはTumor Necrosis Factor）、ＡＮＧ（Angiogenin）、ＥＧＦ（Epidermal Growth Factor）、ＥＮＡ－７８（epithelial-derived neutrophil-activating peptide 78）、ｂＦＧＦ（Basic fibroblast growth factor）、ＩＧＦ（Insulin-like growth factors）（ＩＧＦ－１等）、ＭＣＰ（Membrane Cofactor Protein）（ＭＣＰ－１等）、ＰＤＧＦ（Platelet-Derived Growth Factor）（ＰＤＧＦ－ＢＢ等）、ＴＧＦ（Transforming growth factor）（ＴＧＦβ等）、ＴＩＭＰ（tissue inhibitors of matrix metalloproteinase）（ＴＩＭＰ－１、ＴＩＭＰ－２等）、ＴＨＰＯ（Thrombopoietin）、ＶＥＧＦ（vascular endothelial growth factor）、ＶＥＧＦ－Ｄ（vascular endothelial growth factor D）、ＮＧＦ(nerve growth factor)、ＢＤＮＦ(Brain-derived neurotrophic factor)、Ｇ－ＣＳＦ（granulocyte-colony stimulating factor）、ＧＭ－ＣＳＦ（Granulocyte Macrophage colony-stimulating Factor）、ＥＰＯ（Erythropoietin）、ＴＰＯ（Thrombopoietin）、ＨＧＦ（Hepatocyte growth factor）、ＢＭＰ（(Bone Morphogenetic Protein）、ＦＧＦ（Fibroblast growth factor）、インターロイキン（ＩＬ－６（Interleukin-6）、ＩＬ－８（Interleukin-8）等）、ケモカイン、インターフェロン（ＩＦＮγ（Interferon gamma）等）、ＴＮＦ（Tumor Necrosis Factor）、アディポカイン、インヒビン、副甲状腺ホルモン、カルシトニン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、バソプレッシン、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン、性腺刺激ホルモン放出ホルモン、性腺刺激ホルモン、プロオラクチン、メラトニン、オキシトシン、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、成長ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン、甲状腺ホルモン、サイロキシン、副腎髄質ホルモン、アドレナリン、ノルアドレナリン、アンドロゲン、テストステロン、エストロゲン、プロゲステロン、アルドステロンおよびコルチゾール等が挙げられる。
　トロフィックファクタは好ましくは、ＴＳＧ－６、ＡＮＧ、ＥＧＦ、ＥＮＡ－７８、ｂＦＧＦ、ＩＦＮγ、ＩＧＦ－１、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＭＣＰ－１、ＰＤＧＦ－ＢＢ、ＴＧＦβ、ＴＩＭＰ－１、ＴＩＭＰ－２、ＴＨＰＯ、ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦ－Ｄの何れか１種以上である。
　トロフィックファクタはより好ましくは、ＴＳＧ－６、ＡＮＧ、ＥＧＦ、ＥＮＡ－７８、ＩＧＦ－１、ＩＬ－８、ＰＤＧＦ－ＢＢ、ＴＧＦβ、ＴＨＰＯ、およびＶＥＧＦ－Ｄの何れか１種以上である。
　トロフィックファクタは特に好ましくは、ＴＳＧ－６である。
　別の態様において、トロフィックファクタは好ましくは、サイトカインであり、より好ましくは抗炎症サイトカインであり、特に好ましくは、ＴＳＧ－６である。
　抗炎症サイトカインとは、抗炎症効果を有するサイトカインを意味する。抗炎症サイトカインとしては、ＴＳＧ－６、ＴＧＦβ、ＩＬ－４ 、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、ＩＬ－２２、ＩＬ－２７、ＩＬ－３３、ＩＬ－３７、ＩＬ－３８、インターロイキン-1レセプター・アンタゴニスト（IL-1ra（ Interleukin-1 Receptor Antagonist））、Fasリガンド(FasL（Fas ligand）)、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（TRAIL (TNF-ralated apotosis-inducing ligand)）、I型インターフェロン（IFNα(Interferon alfa)、IFNβ(Interferon beta)）ヒト白血球型抗原-G5（HLA-G5（human leukocyte antigen G)、インドールアミン-2,3-ジオキシゲナーゼ（IDO（indoleamine-2,3-dioxigenase））およびプロスタグランジンE2（PGE2(Prostaglandin E2)）が挙げられる。
　なお、トロフィックファクタとしては、細胞塊における産生放出量とモザイク細胞塊における産生放出量の比が１．１倍以上のものが好ましく、１．２倍以上のものがより好ましく、１．３倍以上のものがさらに好ましく、１．４倍以上のものが特に好ましい。
　産生放出量は、モザイク細胞塊と細胞塊をそれぞれ培養し３日後に培養上清へ放出されたトロフィックファクタ量を定量することにより測定することができる。トロフィックファクタ量の定量は、トロフィックファクタの種類に応じて市販のキット等を用いて常法により行うことができる。
　本発明のトロフィックファクタ放出剤は、生体に移植して使用することができる。移植方法としては、切開、注射、内視鏡といったものが使用可能である。本発明のトロフィックファクタ放出剤は、細胞シートといった細胞移植物とは異なり、構造体のサイズを小さくすることができるため、注射による移植といった低侵襲の移植方法が可能となる。
　本発明のトロフィックファクタ放出剤を移植する際の量は、移植対象者の状態などに応じて適宜選択することができるが、移植する細胞数としては、１．０×１０5 cells/kg以上２．０×１０9cells/kg以下が好ましく、１．０×１０6 cells/kg以上２．０×１０8cells/kg以下がより好ましい。
　本発明のトロフィックファクタ放出剤の移植回数は、１回だけ移植してもよいし、必要に応じ２回以上の移植を行うこともできる。
（６）炎症疾患処置剤
　後記の実施例１２に示す炎症刺激ＴＮＦα依存的なＴＳＧ－６産生放出量試験の結果から分かるように、本発明のトロフィックファクタ放出剤においては、ＴＮＦαでの刺激を行わなかった場合と比べて、ＴＮＦα刺激を行うことで顕著なＴＳＧ－６産生放出が認められた。即ち、本発明のトロフィックファクタ放出剤は、炎症刺激への応答性が高く、抗炎症サイトカインを多く放出することができることから、炎症疾患処置剤として有用である。本発明によれば、上記した本発明のトロフィックファクタ放出剤を含む、炎症疾患処置剤が提供される。
　さらに後記の実施例に示す通り、生体親和性高分子ブロックと間葉系幹細胞とを含み、複数個の間葉系幹細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックが配置されている、細胞構造体は、炎症疾患処置効果を発揮することができる。本発明の炎症疾患処置剤は、抗炎症サイトカインの放出またはＴ細胞の増殖もしくは活性化の抑制等によって、炎症疾患処置効果を発揮すると考えられる。
　炎症疾患とは、生体中での炎症反応が認められることで病態を表す疾患のことである。
　炎症疾患としては、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、腎炎、急性腎炎、慢性腎炎、糸球体腎炎、ＩｇＡ腎症、糖尿病性腎症、膜性腎症、水腎症、造影剤腎症、腎盂腎炎、腎不全、急性腎炎、慢性腎炎、間質性腎炎、腎障害、ネフローゼ症候群、高血圧性腎硬化症、糖尿病性糸球体硬化症、腎結石、アミロイド腎、腎静脈血栓症、Ａｌｐｏｒｔ症候群、肝炎、肝硬変、膵炎、肺炎、副鼻腔炎、鼻炎、関節炎、関節リウマチ、周期性発熱・アフタ性口内炎・咽頭炎・リンパ節炎症候群（ＰＦＡＰＡ）、成人発症型スティル病、ベーチェット病、痛風、偽痛風、Ｓｃｈｎｉｔｚｌｅｒ症候群、慢性再発性多発性骨髄炎（ＣＲＭＯ）、クリオピリン関連周期熱症候群（ＣＡＰＳ）、家族性寒冷蕁麻疹、Ｍｕｃｋｌｅ－Ｗｅｌｌｓ症候群、慢性乳児神経皮膚関節炎症候群（ＣＩＮＣＡ症候群）／新生児発症多臓器炎症疾患（ＮＯＭＩＤ）、ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）受容体関連周期性症候群（ＴＲＡＰＳ）、高ＩｇＤ症候群（メバロン酸キナーゼ欠損症）、ブラウ症候群／若年発症サルコイドーシス、家族性地中海熱、ＰＡＰＡ（化膿性関節炎・壊疽性膿皮症・座瘡）症候群、中條－西村症候群、Ｍａｊｅｅｄ症候群、ＮＬＲＰ１２関連周期熱症候群（ＮＡＰＳ１２）、インターロイキン１受容体アンタゴニスト欠損症（ＤＩＲＡ）、インターロイキン３６受容体アンタゴニスト欠損症（ＤＩＴＲＡ）、フォスフォリパーゼＣγ２関連抗体欠損・免疫異常症（ＰＬＡＩＤ）、ＨＯＩＬ－１欠損症、ＳＬＣ２９Ａ３欠損症、ＣＡＲＤ１４異常症、ＡＤＡ２（アデノシンデアミナーゼ２）欠損症、ＳＴＩＮＧ-Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　Ｖａｓｃｕｌｏｐａｔｈｙ　ｗｉｔｈ　Ｏｎｓｅｔ　ｉｎ　Ｉｎｆａｎｃｙ（ＳＡＶＩ）およびＮＬＲＣ４異常症が挙げられ、炎症性腸疾患が好ましい。
　処置とは、各種疾患に対する予防または治療などを意味する。
　予防とは、対象となる疾患に特有な症状の進行を予め抑制することを意味し、発症の阻害、発症リスクの低減または発症の遅延などが含まれる。進行の抑制の程度は何ら限定されず、程度がごくわずかであっても進行が抑制され得る限り、予防に含まれる。
　治療とは、対象となる疾患または状態の改善または進行の抑制などを意味する。
　処置剤とは、処置の目的で供せられる物質を意味する。
　本発明の炎症疾患処置剤は、生体に移植して使用することができる。移植方法としては、切開、注射、内視鏡といったものが使用可能である。本発明の炎症疾患処置剤は、細胞シートといった細胞移植物とは異なり、構造体のサイズを小さくすることができるため、注射による移植といった低侵襲の移植方法が可能となる。
　本発明の炎症疾患処置剤を移植する際の量は、移植対象者の状態などに応じて適宜選択することができるが、移植する細胞数としては、１．０×１０5 cells/kg以上２．０×１０9cells/kg以下が好ましく、１．０×１０6 cells/kg以上２．０×１０8cells/kg以下がより好ましい。本発明の炎症疾患処置剤の移植回数は、１回だけ移植してもよいし、必要に応じ２回以上の移植を行うこともできる。
（７）各種の用途
　本発明によれば、本発明で規定する細胞構造体を、トロフィックファクタを必要とする対象者に移植する工程を含むトロフィックファクタの放出方法が提供される。本発明によれば、本発明で規定する細胞構造体を、炎症疾患の処置を必要とする対象者に移植する工程を含む炎症疾患の処置方法が提供される。上記方法において、細胞構造体およびトロフィックファクタの好ましい範囲は、前述と同様である。
　本発明によれば、トロフィックファクタ放出のための、および／またはトロフィックファクタ放出による処置のための、本発明で規定する細胞構造体が提供される。本発明によれば、炎症疾患の処置のための、本発明で規定する細胞構造体が提供される。上記細胞構造体において、細胞構造体およびトロフィックファクタの好ましい範囲は、前述と同様である。
　本発明によれば、トロフィックファクタ放出剤の製造のための、本発明で規定する細胞構造体の使用が提供される。本発明によれば、炎症疾患処置剤の製造のための、本発明で規定する細胞構造体の使用が提供される。上記使用において、細胞構造体およびトロフィックファクタの好ましい範囲は、前述と同様である。
　以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
［実施例１］リコンビナントペプチド（リコンビナントゼラチン）
　リコンビナントペプチド（リコンビナントゼラチン）として以下のＣＢＥ３を用意した（国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１号公報に記載）。
ＣＢＥ３：
分子量：５１．６ｋＤａ
構造：　ＧＡＰ［（ＧＸＹ）63］3Ｇ
アミノ酸数：５７１個
ＲＧＤ配列：１２個
イミノ酸含量：３３％
ほぼ１００％のアミノ酸がＧＸＹの繰り返し構造である。ＣＢＥ３のアミノ酸配列には、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシンおよびシステインは含まれていない。ＣＢＥ３はＥＲＧＤ配列を有している。
等電点：９．３４
ＧＲＡＶＹ値：－０．６８２
１／ＩＯＢ値：０．３２３
アミノ酸配列（配列表の配列番号１）（国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１号公報の配列番号３と同じ。但し末尾のＸは「Ｐ」に修正）
GAP(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP)3G
[実施例２] リコンビナントペプチド多孔質体の作製
[PTFE厚・円筒形容器]
　底面厚さ３ｍｍ、直径５１ｍｍ、側面厚さ８ｍｍ、高さ２５ｍｍのポリテトラフルオロエチレン（PTFE）製円筒カップ状容器を用意した。円筒カップは曲面を側面としたとき、側面は８ｍｍのPTFEで閉鎖されており、底面（平板の円形状）も３ｍｍのPTFEで閉鎖されている。一方、上面は開放された形をしている。よって、円筒カップの内径は４３ｍｍになっている。以後、この容器のことをPTFE厚・円筒形容器と呼称する。
 [アルミ（アルミニウム）硝子板・円筒形容器]
　厚さ１ｍｍ、直径４７ｍｍのアルミ製円筒カップ状容器を用意した。円筒カップは曲面を側面としたとき、側面は１ｍｍのアルミで閉鎖されており、底面（平板の円形状）も１ｍｍのアルミで閉鎖されている。一方、上面は開放された形をしている。また、側面の内部にのみ、肉厚１ｍｍのテフロン（登録商標）を均一に敷き詰め、結果として円筒カップの内径は４５ｍｍになっている。また、この容器の底面にはアルミの外に２．２ｍｍの硝子板を接合した状態にしておく。以後、この容器のことをアルミ硝子・円筒形容器と呼称する。
[温度差の小さい凍結工程、および乾燥工程]
　PTFE厚・円筒形容器またはアルミ硝子板・円筒形容器にＣＢＥ３水溶液を流し込み、真空凍結乾燥機（ＴＦ５－８５ＡＴＮＮＮ：宝製作所）内で冷却棚板を用いて底面からＣＢＥ３水溶液を冷却した。この際の容器、ＣＢＥ３水溶液の最終濃度、液量、および棚板温度の設定の組み合わせは、以下に記載の通りで用意した。
条件Ａ：
　ＰＴＦＥ厚・円筒形容器、ＣＢＥ３水溶液の最終濃度４質量％、水溶液量４ｍＬ。棚板温度の設定は、－１０℃になるまで冷却し、－１０℃で１時間、その後－２０℃で２時間、さらに－４０℃で３時間、最後に－５０℃で１時間凍結を行った。本凍結品はその後、棚板温度を－２０℃設定に戻してから－２０℃で２４時間の真空乾燥を行い、２４時間後にそのまま真空乾燥を続けた状態で棚板温度を２０℃へ上昇させ、十分に真空度が下がる（１．９×１０5Ｐａ）まで、さらに２０℃で４８時間の真空乾燥を実施した後に、真空凍結乾燥機から取り出した。上記により多孔質体を得た。
条件Ｂ：
　アルミ・硝子板・円筒形容器、ＣＢＥ３水溶液の最終濃度４質量％、水溶液量４ｍＬ。　棚板温度の設定は、－１０℃になるまで冷却し、－１０℃で１時間、その後－２０℃で２時間、さらに－４０℃で３時間、最後に－５０℃で１時間凍結を行った。本凍結品はその後、棚板温度を－２０℃設定に戻してから－２０℃で２４時間の真空乾燥を行い、２４時間後にそのまま真空乾燥を続けた状態で棚板温度を２０℃へ上昇させ、十分に真空度が下がる（１．９×１０5Ｐａ）まで、さらに２０℃で４８時間の真空乾燥を実施した後に、真空凍結乾燥機から取り出した。上記により多孔質体を得た。
条件Ｃ：
　ＰＴＦＥ厚・円筒形容器、ＣＢＥ３水溶液の最終濃度４質量％、水溶液量１０ｍＬ。棚板温度の設定は、－１０℃になるまで冷却し、－１０℃で１時間、その後－２０℃で２時間、さらに－４０℃で３時間、最後に－５０℃で１時間凍結を行った。本凍結品はその後、棚板温度を－２０℃設定に戻してから－２０℃で２４時間の真空乾燥を行い、２４時間後にそのまま真空乾燥を続けた状態で棚板温度を２０℃へ上昇させ、十分に真空度が下がる（１．９×１０5Ｐａ）まで、さらに２０℃で４８時間の真空乾燥を実施した後に、真空凍結乾燥機から取り出した。上記により多孔質体を得た。
[各凍結工程での温度測定]
　条件Ａ～条件Ｃのそれぞれについて、溶液内で冷却側から最も遠い場所の液温（非冷却面液温）として容器内の円中心部の水表面液温を、また、溶液内で冷却側に最も近い液温（冷却面液温）として容器内の底部の液温を測定した。
　その結果、それぞれの温度とその温度差のプロファイルは図１～図３の通りとなった。
　図１、図２、図３から条件Ａ、条件Ｂ、条件Ｃでは棚板温度－１０℃設定区間（－２０℃に下げる前）において液温が融点である０℃を下回り、かつその状態で凍結が起こっていない（未凍結・過冷却）状態であることがわかる。また、この状態で、冷却面液温と非冷却面液温の温度差が２．５℃以下となっていた。なお、本明細書において、「温度差」とは、「非冷却面液温」－「冷却面液温」を意味する。その後、棚板温度を－２０℃へ更に下げていくことによって、液温が０℃付近へ急激に上昇するタイミングが確認され、ここで凝固熱が発生し凍結が開始されたことが分かる。また、そのタイミングで実際に氷形成が始まっていることも確認できた。その後、温度は０℃付近を一定時間経過していく。ここでは、水と氷の混合物が存在する状態となっていた。最後０℃から再び温度降下が始まるが、この時、液体部分はなくなり氷となっている。従って、測定している温度は氷内部の固体温度となり、つまり液温ではなくなる。
　以下に、条件Ａ、条件Ｂ、条件Ｃについて、非冷却面液温が融点（０℃）になった時の温度差、棚板温度を－１０℃から－２０℃へ下げる直前の温度差と、凝固熱発生直前の温度差を記載する。なお、本発明で言う「直前の温度差」とは、イベント（凝固熱発生等）の１秒前～２０秒前までの間で検知可能な温度差の内、最も高い温度のことを表している。
条件Ａ
非冷却面液温が融点（０℃）になった時の温度差：１．１℃
－１０℃から－２０℃へ下げる直前の温度差：０．２℃
凝固熱発生直前の温度差：１．１℃
条件Ｂ
非冷却面液温が融点（０℃）になった時の温度差：１．０℃
－１０℃から－２０℃へ下げる直前の温度差：０．１℃
凝固熱発生直前の温度差：０．９℃
条件Ｃ
非冷却面液温が融点（０℃）になった時の温度差：１．８℃
－１０℃から－２０℃へ下げる直前の温度差：１．１℃
凝固熱発生直前の温度差：２．１℃
 [実施例３] 生体親和性高分子ブロックの作製（多孔質体の粉砕と架橋）
　実施例２で得られた条件Ａおよび条件ＢのＣＢＥ３多孔質体をニューパワーミル（大阪ケミカル、ニューパワーミルＰＭ－２００５）で粉砕した。粉砕は、最大回転数で１分間×５回、計５分間の粉砕で行った。得られた粉砕物について、ステンレス製ふるいでサイズ分けし、２５～５３μｍ、５３～１０６μｍ、１０６～１８０μｍの未架橋ブロックを得た。その後、減圧下１６０℃で熱架橋（架橋時間は８時間、１６時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間の６種類を実施した）を施して、生体親和性高分子ブロック（ＣＢＥ３ブロック）を得た。
　以下、４８時間架橋を施した条件Ａの多孔質体由来ブロックをＥ、４８時間架橋を施した条件Ｂの多孔質体由来ブロックをＦと称する。ＥおよびＦは温度差の小さい凍結工程により製造した多孔質体から作られた温度差小ブロックである。なお、架橋時間の違いは本実施例の評価においては性能に影響が見られなかったため、以後、４８時間架橋したものを代表として使用した。また、ＥおよびＦでは性能に差が見られなかった。以下の実施例では、条件Ａ、サイズ５３～１０６μｍ、架橋時間４８時間で作製した生体親和性高分子ブロックを使用した。
[実施例４] 生体親和性高分子ブロックのタップ密度測定
　タップ密度は、ある体積にどれくらいのブロックを密に充填できるかを表す値であり、値が小さいほど、密に充填できない、すなわちブロックの構造が複雑であると言える。　タップ密度は、以下のように測定した。まず、ロートの先にキャップ（直径６ｍｍ、長さ２１．８ｍｍの円筒状：容量０．６１６ｃｍ3）が付いたものを用意し、キャップのみの質量を測定した。その後、ロートにキャップを付け、ブロックがキャップに溜まるようにロートから流し込んだ。十分量のブロックを入れた後、キャップ部分を２００回、机などの硬いところにたたきつけ、ロートをはずし、スパチュラですりきりにした。このキャップにすりきり一杯入った状態で質量を測定した。キャップのみの質量との差からブロックのみの質量を算出し、キャップの体積で割ることで、タップ密度を求めた。
　その結果、実施例３の生体親和性高分子ブロックのタップ密度は９８ｍｇ/ｃｍ3であった。
[実施例５] 生体親和性高分子ブロックの架橋度測定
　実施例３で架橋したブロックの架橋度（１分子当たりの架橋数）を算出した。測定はＴＮＢＳ（2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸）法を用いた。
＜サンプル調製＞
　ガラスバイアルに、サンプル（約１０ｍｇ）、４質量％ＮａＨＣＯ3水溶液（１ｍＬ）および１質量％のＴＮＢＳ水溶液（２ｍＬ）を添加し、混合物を３７℃で３時間振とうさせた。その後、３７質量％塩酸（１０ｍＬ）および純水（５ｍＬ）を加えた後、混合物を３７℃で１６時間以上静置し、サンプルとした。
＜ブランク調整＞
　ガラスバイアルに、サンプル（約１０ｍｇ）、４質量％ＮａＨＣＯ3水溶液（１ｍＬ）および１質量％ＴＮＢＳ水溶液（２ｍＬ）を添加し、直後に３７質量％塩酸（３ｍＬ）を加え、混合物を３７℃で３時間振とうした。その後、３７質量％塩酸（７ｍＬ）および純水（５ｍＬ）を加えた後、混合物を３７℃で１６時間以上静置し、ブランクとした。
　純水で１０倍希釈したサンプル、および、ブランクの吸光度（３４５nm）を測定し、以下の（式２）、および（式３）から架橋度（１分子当たりの架橋数）を算出した。
（式２）　（As-Ab）／１４６００×V／ｗ
（式２）は、リコンビナントペプチド１ｇ当たりのリジン量（モル等量）を示す。
（式中、Asはサンプル吸光度、Abはブランク吸光度、Vは反応液量（ｇ）、ｗはリコンビナントペプチド質量（ｍｇ）を示す。）
（式３）　１－（サンプル（式２）/未架橋リコンビナントペプチド（式２））×３４
（式３）は、１分子あたりの架橋数を示す。
　その結果、実施例３の生体親和性高分子ブロックの架橋度は、４．２であった。
[実施例６] 生体親和性高分子ブロックの吸水率測定
　実施例３で作製した生体親和性高分子ブロックの吸水率を算出した。
　２５℃において、３ｃｍ×３ｃｍのナイロンメッシュ製の袋の中に、生体親和性高分子ブロック約１５ｍｇを充填し、２時間イオン交換水中で膨潤させた後、１０分風乾させた。それぞれの段階において質量を測定し、（式４）に従って、吸水率を求めた。
（式４）
　吸水率＝（ｗ２－ｗ１－ｗ０）／ｗ０
（式中、ｗ０は吸水前の材料の質量、ｗ１は吸水後の空袋の質量、ｗ２は吸水後の材料を含む袋全体の質量を示す。）
　その結果、実施例３のブロックの吸水率は、７８６％であった。
[実施例７]　モザイク細胞塊の作製
　ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ：Human Mesenchymal Stem Cells）を増殖培地（タカラバイオ：MSCGM BulletKit（商標））に懸濁し、そこに実施例３で作製した生体親和性高分子ブロック（５３－１０６μｍ）を加えて、最終的にｈＭＳＣ（１．２×１０6cells）と生体親和性高分子ブロック（１ｍｇ）が４ｍＬの培地に懸濁された状態で、底面に窪み部を有する細胞非接着性の３５ｍｍディッシュであるEZSPHERE（登録商標）ディッシュ35mm Type903（スフェロイドウェル口径８００μｍ、スフェロイドウェル深さ３００μｍ、スフェロイドウェル数ウエル～約１０００ウェル。ＡＧＣテクノグラス製）に播種した。
　ＣＯ2インキュベーターにて３７℃で２０時間静置したところ、ｈＭＳＣと生体親和性高分子ブロックから成る直径０．４ｍｍ程度の球状としてモザイク細胞塊を複数個回収することができた。
　尚、ディッシュとしてはＴｙｐｅ９００（ウェル口径４００～５００μｍ、ウェル深さ１００～２００μｍ）、Ｔｙｐｅ９０２（ウェル口径５００μｍ、ウェル深さ２００μｍ）、Ｔｙｐｅ９０４（ウェル口径８００μｍ、ウェル深さ４００μｍ）、またはＴｙｐｅ９０５（ウェル口径１４００μｍ、ウェル深さ６００μｍ）のいずれを使用した場合にも、上記と同様に球状のモザイク細胞塊を得られることが確認された。
 [比較例１]  細胞のみの細胞塊の作製
　ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を増殖培地（タカラバイオ：MSCGM BulletKit（商標））に懸濁し、最終的にｈＭＳＣ（１．２×１０6cells）が４ｍＬの培地に懸濁された状態で、底面に窪み部を有する細胞非接着性の３５ｍｍディッシュであるEZSPHERE（登録商標）ディッシュ35mm Type903（スフェロイドウェル口径８００μｍ、スフェロイドウェル深さ３００μｍ、スフェロイドウェル数ウエル～約１０００ウェル。ＡＧＣテクノグラス製）に播種した。
　ＣＯ2インキュベーターにて３７℃で２０時間静置したところ、ｈＭＳＣのみから成る細胞塊を複数個回収することができた。
[実施例８]トロフィックファクタの放出量の測定
　実施例７のモザイク細胞塊と比較例１の細胞塊をそれぞれ培養し３日後に培養上清へ放出されたトロフィックファクタ量を測定した。測定にあたってはHuman Angiogenesis Antibody Array C1 (#AAH-ANG-1-8, RayBio)のキットを使用した。その結果、細胞塊からの放出量と比較して、モザイク細胞塊から放出されるトロフィックファクタの量が増大することが分かった。具体的には、ＡＮＧが１．７４倍、ＥＧＦが１．９２倍、ＥＮＡ－７８が２．２２倍、ｂＦＧＦが１．０９倍、ＩＦＮγが１．１１倍、ＩＧＦ－１が１．４４倍、ＩＬ－６が１．３７倍、ＩＬ－８が１．８６倍、ＭＣＰ－１が１．２９倍、ＰＤＧＦ－ＢＢが３．６０倍、ＴＧＦβが１．４０倍、ＴＩＭＰ－１が１．１３倍、ＴＩＭＰ－２が１．３３倍、ＴＨＰＯが１．４３倍、ＶＥＧＦが１．３７倍、ＶＥＧＦ－Ｄが２．５４倍、モザイク細胞塊とすることで増大することが分かった。上記の結果から、モザイク細胞塊とすることでトロフィックファクタの産生放出量が増大することが明らかとなった（表１）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
［実施例９］　モザイク細胞塊の作製（ｈＭＳＣ）
　ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）をＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle Medium：ダルベッコ改変イーグル培地）＋１０％ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum：ウシ胎児血清）培地にて１０万ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整し、実施例３で作製した生体親和性高分子ブロック５３－１０６μｍを０．１ｍｇ／ｍＬとなるように加えた後、２００μＬをスミロンセルタイトＸ９６Ｕプレート（住友ベークライト、底がＵ字型）に播種し、卓上プレート遠心機で遠心（６００ｇ、５分）し、２４時間静置し、直径１ｍｍの球状の、生体親和性高分子ブロックとｈＭＳＣ細胞からなるモザイク細胞塊を作製した（細胞1個当たり０．００１μｇのブロック）。なお、Ｕ字型のプレート中で作製したため、本モザイク細胞塊は球状であった。
［実施例１０］　モザイク細胞塊の作製（ｈＡＤＳＣ）
　ヒト脂肪由来幹細胞（ｈＡＤＳＣ）（Human Adipose Derived Stem Cells）をＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培地にて１０万ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整し、実施例３で作製した生体親和性高分子ブロック５３－１０６μｍを０．１ｍｇ／ｍＬとなるように加えた後、２００μＬをスミロンセルタイトＸ９６Ｕプレート（住友ベークライト、底がＵ字型）に播種し、卓上プレート遠心機で遠心（６００ｇ、５分）し、２４時間静置し、直径１ｍｍの球状の、生体親和性高分子ブロックとｈＡＤＳＣ細胞からなるモザイク細胞塊を作製した（細胞1個当たり０．００１μｇのブロック）。なお、Ｕ字型のプレート中で作製したため、本モザイク細胞塊は球状であった。
［比較例２］　細胞塊の作製（ｈＭＳＣ）
　ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）をＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培地にて１０万ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整し、２００μＬをスミロンセルタイトＸ９６Ｕプレート（住友ベークライト、底がＵ字型）に播種し、卓上プレート遠心機で遠心（６００ｇ、５分）し、２４時間静置しｈＭＳＣ細胞のみからなる細胞塊を作製した。なお、Ｕ字型のプレート中で作製したため、本細胞塊は球状であった。
［比較例３］　細胞塊の作製（ｈＡＤＳＣ）
　ヒト脂肪由来幹細胞（ｈＡＤＳＣ）をＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培地にて１０万ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整し２００μＬをスミロンセルタイトＸ９６Ｕプレート（住友ベークライト、底がＵ字型）に播種し、卓上プレート遠心機で遠心（６００ｇ、５分）し、２４時間静置しｈＡＤＳＣ細胞のみからなる細胞塊を作製した。なお、Ｕ字型のプレート中で作製したため、本細胞塊は球状であった。
 [実施例１１]  抗炎症サイトカインＴＳＧ－６の放出量試験
　実施例９および１０で得られたモザイク細胞塊、並びに比較例２および３で得られた細胞塊をそれぞれ培養し、３日後に培養上清に放出されるＴＳＧ－６を定量した。定量に当たってはRayBio Human TSG-6 ELISA Kit（cat#: ELH-TSG6　(RayBiotech社)）を使用した。
　ＴＳＧ－６の定量の結果を図４（ＦＢＳ（＋）の欄を参照）に示す。その結果、ｈＭＳＣではモザイク細胞塊の方が細胞塊よりも１．４倍放出量が多く、ｈＡＤＳＣではモザイク細胞塊の方が細胞塊よりも１．８倍放出量が多いことが分かった。これによりＴＳＧ－６についてもモザイク細胞塊とすることで産生放出量が増大することが明らかとなった。
[実施例１２]  炎症刺激ＴＮＦα（Tumor Necrosis Factorα）依存的なＴＳＧ－６産生放出量試験
　実施例９および１０で得られたモザイク細胞塊、並びに比較例２および３で得られた細胞塊について、ＦＢＳを含まないＤＭＥＭ培地に置換後、さらにＴＮＦα含有のＤＭＥＭ培地で４８時間培養を実施して、培養上清に放出されるＴＳＧ－６を定量した。定量に当たってはRayBio Human TSG-6 ELISA Kit（cat#: ELH-TSG6　(RayBiotech社)）を使用した。
　ＴＳＧ－６の定量の結果を図４（ＴＮＦα（＋）の欄を参照）に示す。
　その結果、ｈＭＳＣではモザイク細胞塊の方が細胞塊よりも５．７倍放出量が多く、ｈＡＤＳＣではモザイク細胞塊の方が細胞塊よりも３．１倍放出量が多いことが分かった。また、ＴＮＦαでの刺激を行わなかった場合と比べて、ＴＮＦα刺激を行うことで顕著なＴＳＧ－６産生放出が認められた（図４：ＴＮＦα（－）とＴＮＦα（＋）の欄を参照）。
　なお、放出量を生細胞数で除した一細胞当たりの産生放出量でも同じことが認められた（図５）。
　ＴＮＦα刺激がＴＳＧ－６産生を促進することは既知の事実であるが、このＴＮＦα刺激への応答性について、モザイク細胞塊にすると飛躍的に応答性が高くなることは全く想定外であった。これらのことから、ＴＳＧ－６については、モザイク細胞塊とすることで産生放出量が増大するだけでなく、ＴＮＦα刺激への応答性までも向上することが明らかとなった。このことは、モザイク細胞塊は、炎症刺激への応答性が高く、抗炎症サイトカインを多く放出することを示しており、モザイク細胞塊が抗炎症治療剤として非常に有用であることを示している。
［実施例１３］　モザイク細胞塊の作製（ｈＡＤＳＣ）
　ヒト脂肪由来幹細胞（ｈＡＤＳＣ）を増殖培地（Ｌｏｎｚａ社：ＡＤＳＣ－ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（商標）、以下、ＡＤＳＣ用培地ともいう）に懸濁し、実施例３で作製した生体親和性高分子ブロック（５３－１０６μｍ）を加えて、ｈＡＤＳＣ（１．２×１０6ｃｅｌｌｓ）と生体親和性高分子ブロック（１ｍｇ）が４ｍＬの培地に懸濁された状態で、底面に窪み部を有する細胞非接着性の３５ｍｍディッシュであるEZSPHERE（登録商標）ディッシュ35mm Type903（スフェロイドウェル口径８００μｍ、スフェロイドウェル深さ３００μｍ、スフェロイドウェル数ウエル～約１０００ウェル。ＡＧＣテクノグラス製）に播種した。
［実施例１４］２．５質量％デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘発マウス大腸炎モデルの作製と評価
　マウスは、６－７週齢、体重１７－２１ｇのＳＰＦ　Ｃ５７ＢＬ／６ｎ雌性マウス（チャールスリバージャパン（株））を使用した。Ｃ５７ＢＬ／６ｎ雌性マウス６週齢に対して、２．５質量％ＤＳＳ（MP Biomedicals社:Dextran Sodium Sulfate, 分子量(MW) = 36,000-50,000）水溶液を自由飲水させ、自由飲水開始日を誘導開始日（Ｄａｙ０）とした。誘導開始日から７日間２．５質量％ＤＳＳ水溶液を自由飲水させ、７日目に上記２．５質量％ＤＳＳ水溶液を蒸留水に交換し、さらに７日間蒸留水を自由飲水させた。誘導開始日から０、１、２、５、６、７、８、９、１２、１３および１４日後に各マウスの体重を計測した。
　大腸炎の評価は、体重および最終日（誘導開始から１４日目）の大腸の長さにより評価した。なお、炎症が進行すると体重が減少し、回復すれば体重が増加する。また、大腸の長さは炎症の程度の形態学的パラメーターとして利用されており、炎症が生じるほど大腸の短小化が生じる（JIN SEOK PARK他、J.CLIN. BIOCHEM.NUTR,2015;57:192-203）。
　体重の評価は、各マウスについて正常マウスに対する体重割合（％）を算出し、評価した。なお、正常マウスに対する体重割合は以下の（式５）、および（式６）に従って求めた。また、体重回復率（％）を、（式７）に従って求めた。
（式５）　各マウスのＤａｙ０に対する体重比（％）＝（Ｗｔ／Ｗ０）×１００
（式中、Ｗ０は誘導開始日の体重計測値、Ｗｔは誘導開始日からｔ日後の体重計測値を示す。ただし、ｔは１、２、５、６、７、８、９、１２、１３または１４であり、Ｗ０とＷｔは同一個体の体重とする。）
（式６）　各マウスの正常マウスに対する体重割合（％）＝（Ｗｔ／Ｗ０）×１００×（１００／Ａｔ）
（式中、Ｗ０は誘導開始日の体重計測値、Ｗｔは誘導開始日からｔ日後の体重計測値を示す。Ａｔは、誘導開始日からｔ日後の各正常マウスについて、Ｄａｙ０に対する体重比（％）を（式５）に従ってそれぞれ算出し、それらの平均値を示す。ただし、ｔは１、２、５、６、７、８、９、１２、１３または１４であり、Ｗ０とＷｔは同一個体の体重とする。）
（式７）　体重回復率（％）＝（（Ｖｔ－Ｄｔ）－（Ｖｔ－Ｘｔ））／（Ｖｔ－Ｄｔ）
（式中、Ｖｔは誘導開始日からｔ日後の、正常マウスの「正常マウスに対する体重割合」の平均値を示す。Ｄｔは誘導開始日からｔ日後の、ＡＤＳＣ用培地マウス群の「正常マウスに対する体重割合」の平均値を示す。Ｘｔは誘導開始日からｔ日後の、各マウス群の「正常マウスに対する体重割合」の平均値を示す。ただし、ｔは１、２、５、６、７、８、９、１２、１３または１４である。正常マウス群の体重回復率は１００％、ＡＤＳＣ用培地マウス群の体重回復率は０％となる。）
　大腸の長さは、各マウスの肛門先端から盲腸までの長さを計測し、（式８）に従って短腸化回復率を求めた。（正常マウス群の短腸化回復率は１００％、ＡＤＳＣ用培地群の短腸化回復率は０％となる。）
（式８）　短腸化回復率（％）＝（（Ｌｘ－Ｌ２）×１００）／（Ｌ１－Ｌ２）
（式中、Ｌ１は正常マウス群の大腸の長さの中央値、Ｌ２はＡＤＳＣ用培地マウス群の大腸の長さの中央値、Ｌｘは各マウス群の大腸の長さの中央値を示す。）
［実施例１５］　２．５質量％ＤＳＳ大腸炎モデルマウスへの、ｈＡＤＳＣのモザイク細胞塊の投与
　実施例１４で作製した２．５質量％ＤＳＳ大腸炎モデルマウスに対して、誘導開始日から１日後に、実施例１３で作製したＡＤＳＣモザイク細胞塊を腹腔内投与した。ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊１０００個（ｈＡＤＳＣ１．２×１０6ｃｅｌｌｓ＋生体親和性高分子ブロック１ｍｇ／匹）、またはｈＡＤＳＣモザイク細胞塊５０００個（ｈＡＤＳＣ６．０×１０6ｃｅｌｌｓ＋生体親和性高分子ブロック　５ｍｇ／匹）を投与した。
［比較例４］　２．５質量％ＤＳＳ大腸炎モデルマウスへの、ｈＡＤＳＣ細胞懸濁液、またはＡＤＳＣ用培地の投与
　実施例１４で作製した２．５質量％ＤＳＳ大腸炎モデルマウスに対して、誘導開始日から１日後に、実施例１３と同じ細胞をＡＤＳＣ用培地２００μＬに懸濁した状態のｈＡＤＳＣ細胞懸濁液、またはＡＤＳＣ用培地２００μＬを腹腔内投与した。ｈＡＤＳＣ細胞懸濁液中に含まれる細胞数は、１．２×１０6ｃｅｌｌｓ／匹とした。
　実施例１５および比較例４における、各マウス群の正常マウスに対する体重割合（％）の平均値を図６に示す。図６に示されているように、ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊１０００個マウス群は、誘導開始日の１２、１３および１４日後において、比較例であるＡＤＳＣ培地マウス群より「正常マウスに対する体重割合」が高かった。ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊１０００個マウス群は、ＡＤＳＣ培地マウス群より体重の回復が早いことが示された。また、ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊５０００個マウス群は、誘導開始日の２、５、６、７、８、９、１２、１３および１４日後において、比較例であるＡＤＳＣ培地マウス群より「正常マウスに対する体重割合」が高かった。ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊５０００個マウス群は、ＡＤＳＣ培地マウス群より体重の減少が抑えられ、さらにＡＤＳＣ培地マウス群より体重の回復が早いことが示された。最終日（誘導開始日の１４日後）において、ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊１０００個マウス群では体重回復率が３９％、ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊５０００個マウス群では体重回復率が９６％であった。ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊１０００個およびｈＡＤＳＣモザイク細胞塊５０００個では、体重減少の改善効果が見られた。また、この改善の効果はモザイク細胞塊の数が多い方が高かった。
　比較例４における、各マウス群の正常マウスに対する体重割合（％）の平均値を図７に示す。図７に示されているように、ｈＡＤＳＣ細胞懸濁液マウス群は、誘導開始日の２、５、６、７、８および９日後において、ＡＤＳＣ培地マウス群と同様の体重の推移を示した。また、誘導開始日の１２、１３および１４日後において、ＡＤＳＣ培地マウス群より「正常マウスに対する体重割合」が低かった。最終日（誘導開始日の１４日後）において、ｈＡＤＳＣ細胞懸濁液マウス群では体重回復率が－４４％であった。以上のことから、ｈＡＤＳＣ細胞懸濁液は、２．５質量％ＤＳＳ大腸炎モデルマウスの体重減少を改善しないことが示された。
　以上の体重の評価結果をまとめると、ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊１０００個マウス群およびｈＡＤＳＣモザイク細胞塊５０００個マウス群では、２．５質量％ＤＳＳ大腸炎モデルマウスの体重減少を改善する効果が認められる。一方で、ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊１０００個マウス群と同じ細胞数のｈＡＤＳＣ細胞懸濁液マウス群では、２．５質量％ＤＳＳ大腸炎モデルマウスの体重減少を改善する効果が認められなかった。
　実施例１５において、ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊１０００個マウス群では短腸化回復率７５％、ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊５０００個マウス群では短腸化回復率５０％であった。ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊１０００個および、ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊５０００個は、２．５質量％ＤＳＳ大腸炎モデルマウスの大腸の短腸化を改善したことが認められた。
　比較例４において、ｈＡＤＳＣ細胞懸濁液マウス群では短腸化回復率１４％であった。ｈＡＤＳＣ細胞懸濁液は２．５質量％ＤＳＳ大腸炎モデルマウスの大腸の短腸化を改善することが認められたものの、同じ細胞数を投与しているｈＡＤＳＣモザイク細胞塊１０００個より大腸の短腸化への改善効果が低いことが示された。
　以上の大腸の長さの評価結果をまとめると、ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊１０００個およびｈＡＤＳＣモザイク細胞塊５０００個は、２．５質量％ＤＳＳ大腸炎モデルマウスの短腸化を改善する効果が認められ、それはｈＡＤＳＣ細胞懸濁液の短腸化を改善する効果より効果が高いことが示された。
　以上の体重および大腸の長さの結果は、ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊による２．５質量％ＤＳＳ大腸炎モデルマウスへの炎症改善効果を示すものであり、さらにその効果はｈＡＤＳＣ細胞懸濁液よりも効果が高いこと示している。
［実施例１６］　３．０質量％デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘発マウス大腸炎モデルの作製と評価
　マウスは、６－７週齢、体重１７－２１ｇのＳＰＦ　Ｃ５７ＢＬ／６ｎ雌性マウス（チャールスリバージャパン（株））を使用した。
　Ｃ５７ＢＬ／６ｎ雌性マウス６週齢に対して、３．０質量％ＤＳＳ（MP Biomedicals社:Dextran Sodium Sulfate, MW = 36,000-50,000）水溶液を自由飲水させた。自由飲水開始日を誘導開始日（Ｄａｙ０）とした。誘導開始日から７日間３．０質量％ＤＳＳ水溶液を自由飲水させ、７日目に上記３．０質量％ＤＳＳ水溶液を蒸留水に交換し、さらに６日間蒸留水を自由飲水させた。誘導開始日から０、１、２、５、６、７、８、９、１２および１３日後に各マウスの体重を計測した。大腸炎の評価は、実施例１４と同様にして、体重と、最終日（誘導開始から１３日目）の大腸の長さにより評価した。
［実施例１７］　３．０質量％ＤＳＳ大腸炎モデルマウスへの、ｈＡＤＳＣのモザイク細胞塊の投与
　実施例１６で作製した３．０質量％ＤＳＳ大腸炎モデルマウスに対して、誘導開始日から１日後に、実施例１３で作製したｈＡＤＳＣモザイク細胞塊を腹腔内投与した。ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊１０００個（ｈＡＤＳＣ１．２×１０6ｃｅｌｌｓ＋生体親和性高分子ブロック１ｍｇ／匹）、またはｈＡＤＳＣモザイク細胞塊５０００個（ｈＡＤＳＣ６．０×１０6ｃｅｌｌｓ＋生体親和性高分子ブロック　５ｍｇ／匹）を投与した。
［比較例５］　３．０質量％ＤＳＳ大腸炎モデルマウスへの、ＡＤＳＣ用培地の投与
　実施例１６で作製した３．０質量％ＤＳＳ大腸炎モデルマウスに対して、誘導開始日から１日後に、ＡＤＳＣ用培地２００μＬを腹腔内投与した。
　実施例１７および比較例５における、各マウス群の正常マウスに対する体重割合（％）の平均値を図８に示す。図８に示されているように、ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊１０００個マウス群は、誘導開始日の１２および１３日後において、比較例であるＡＤＳＣ培地マウス群より「正常マウスに対する体重割合」が高かった。ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊１０００個マウス群は、ＡＤＳＣ培地マウス群より体重の回復が早いことが示された。また、ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊５０００個マウス群は、誘導開始日の１２および１３日後において、比較例であるＡＤＳＣ培地マウス群より「正常マウスに対する体重割合」が高く、さらにｈＡＤＳＣモザイク細胞塊１０００個マウス群より体重割合が高いことが示された。最終日（誘導開始日の１３日後）において、ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊１０００個マウス群の体重回復率は２０％、ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊５０００個マウス群の体重回復率は６９％であった。ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊１０００個およびＡＤＳＣモザイク細胞塊５０００個では、体重減少の改善効果が認められた。また、この改善の効果はモザイク細胞塊の数が多い方が高かった。
　実施例１７および比較例５において、ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊１０００個マウス群では短腸化回復率６８％、ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊５０００個マウス群では短腸化回復率８１％であった。ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊１０００個および、ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊５０００個は、３．０質量％ＤＳＳ大腸炎モデルマウスの大腸の短腸化を改善したことが認められた。
　以上の体重および大腸の長さの結果から、ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊による３．０質量％ＤＳＳ大腸炎モデルマウスへの炎症改善効果が認められた。
［実施例１８］　３.０質量％デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘発マウス大腸炎モデルの作製と評価
　マウスは、６－７週齢、体重１７－２１ｇのＳＰＦ　Ｃ５７ＢＬ／６ｎ雌性マウス（チャールスリバージャパン（株））を使用した。
　Ｃ５７ＢＬ／６ｎ雌性マウス６週齢に対して、３．０質量％ＤＳＳ（MP Biomedicals社:Dextran Sodium Sulfate, MW = 36,000-50,000）水溶液を自由飲水させた。自由飲水開始日を誘導開始日（Ｄａｙ０）とした。誘導開始日から７日間３．０質量％ＤＳＳ水溶液を自由飲水させ、７日目に上記３．０質量％ＤＳＳ水溶液を蒸留水に交換し、さらに７日間蒸留水を自由飲水させた。誘導開始日から０、１、４、５、６、７、８、１１、１２、１３および１４日後に各マウスの体重を計測した。大腸炎の評価は、体重、最終日（誘導開始から１４日目）の大腸の長さ、および最終日の大腸の病理学的評価により評価した。
体重および大腸の長さの評価は、実施例１４と同様にして評価した。
　病理学的評価は、最終日に摘出した大腸組織をホルマリン固定し、パラフィン包埋、薄切、ヘマトキシリン・エオジン染色(ＨＥ染色)を施した。
　作製した標本について光学顕微鏡を用い、潰瘍の深度、潰瘍の広さ、浮腫、および炎症性細胞浸潤について評価した。潰瘍の深度の評価は、０点：上皮が完全である、１点：粘膜固有層に傷害がある、２点：粘膜下層まで傷害が達している、３点：漿膜まで傷害が達している、とした。潰瘍の広さの評価は、０点：傷害のある面積割合が０％、１点：傷害のある面積割合が０％より大きく２５％以下、２点：傷害のある面積割合が２５％より大きく５０％以下、３点：傷害のある面積割合が５０％より大きく７５％以下、４点：傷害のある面積割合が７５％より大きい、とした。浮腫、および炎症性細胞浸潤の評価は、０点：浮腫および炎症性細胞浸潤が認められない、１点：軽度、２点：中程度、３点：高度、４点：さらに高度、とした。以上の方法で、各マウスの結腸上部、結腸下部、直腸の３箇所について評価し、上記３箇所の合計スコアを病理スコアとして総合評価した。なお、病理スコアは炎症が生じるほどスコアが高い。
［実施例１９］　３．０質量％ＤＳＳ大腸炎モデルマウスへの、ｈＡＤＳＣのモザイク細胞塊の投与
　実施例１８で作製した３．０質量％ＤＳＳ大腸炎モデルマウスに対して、誘導開始日から７日後に、実施例１３で作製したｈＡＤＳＣモザイク細胞塊１０００個（ｈＡＤＳＣ１．２×１０6ｃｅｌｌｓ＋生体親和性高分子ブロック１ｍｇ）／匹をＡＤＳＣ用培地４００μＬに懸濁した状態で腹腔投与した。
［比較例６］　３．０質量％ＤＳＳ大腸炎モデルマウスへの、ｈＡＤＳＣ細胞懸濁液、またはＡＤＳＣ用培地の投与
　実施例１８で作製した３．０質量％ＤＳＳ大腸炎モデルマウスに対して、実施例１３と同じ細胞をＡＤＳＣ用培地４００μＬに懸濁した状態のｈＡＤＳＣ細胞懸濁液、またはＡＤＳＣ用培地４００μＬを腹腔内投与した。ｈＡＤＳＣ細胞懸濁液中に含まれる細胞数は、１．２×１０6ｃｅｌｌｓ／匹とした。
　実施例１９および比較例６における、各マウス群の正常マウスに対する体重割合（％）の平均値を図９に示す。図９に示されているように、ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊１０００個マウス群は、誘導開始日の１１、１２、１３、および１４日後において、比較例であるＡＤＳＣ用培地マウス群およびｈＡＤＳＣ細胞懸濁液マウス群より「正常マウスに対する体重割合」が高かった。ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊１０００個マウス群は、ＡＤＳＣ用培地マウス群およびｈＡＤＳＣ細胞懸濁液マウス群より体重の回復が早いことが示された。従って、ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊１０００個は、体重減少の改善効果が認められた。
　一方、図９に示されているように、ｈＡＤＳＣ細胞懸濁液マウス群は、誘導開始日の１１、１２、１３および１４日後において、ＡＤＳＣ用培地マウス群と同様の体重の推移を示した。従って、ｈＡＤＳＣ細胞懸濁液は、体重減少の改善効果が認められなかった。
　以上の体重の評価結果をまとめると、ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊１０００個は３．０質量％ＤＳＳ大腸炎モデルマウスの体重減少を改善する効果が認められる。一方で、ｈＡＤＳＣ細胞懸濁液では、３．０質量％ＤＳＳ大腸炎モデルマウスの体重減少を改善する効果が認められなかった。
　実施例１９および比較例６における、各マウス群の大腸の長さを箱ひげ図として図１０に示す（図中、*:Ｐ＜０．０５　（ｔ検定））。
　図１０に示されているように、ＡＤＳＣ用培地マウス群の大腸の長さは正常マウス群に対して有意に短いことが示された。
　実施例１９において、ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊１０００個マウス群の大腸の長さは、比較例であるＡＤＳＣ用培地マウス群に対して有意に長いことが示された。従って、ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊１０００個は、３．０質量％ＤＳＳ大腸炎モデルマウスの大腸の短腸化を改善したことが認められた。
　一方、比較例６において、ｈＡＤＳＣ細胞懸濁液マウス群の大腸の長さは、比較例であるＡＤＳＣ用培地マウス群に対して差がないことが示された。従って、ｈＡＤＳＣ細胞懸濁液は、３．０質量％ＤＳＳ大腸炎モデルマウスの大腸の短腸化を改善しないことが認められた。
　なお、各マウス群の大腸の長さの中央値は、正常マウス群が７．４ｃｍ、ＡＤＳＣ用培地マウス群が６．０ｃｍ、ｈＡＤＳＣ細胞懸濁液マウス群が５．５ｃｍ、ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊１０００個マウス群が７．１ｃｍであった。
　以上の大腸の長さの評価結果をまとめると、ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊１０００個は、３．０質量％ＤＳＳ大腸炎モデルマウスの短腸化を改善する効果が認められた。一方で、ｈＡＤＳＣ細胞懸濁液は３．０質量％ＤＳＳ大腸炎モデルマウスの短腸化を改善する効果が認められなかった。
　実施例１９および比較例６における、各マウス群の病理スコアを箱ひげ図として図１１に示す（図中、*:Ｐ＜０．０５　（ｔ検定））。図１１に示されているように、実施例１９において、ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊１０００個マウス群の病理スコアは、比較例であるＡＤＳＣ用培地マウス群、およびｈＡＤＳＣ細胞懸濁液マウス群に対して有意に低いことが示された。従って、ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊１０００個は、３．０質量％ＤＳＳ大腸炎モデルマウスの大腸の炎症を改善したことが認められた。
　一方、比較例６において、ｈＡＤＳＣ細胞懸濁液マウス群の病理スコアは、比較例であるＡＤＳＣ用培地マウス群に対して差がないことが示された。従って、ｈＡＤＳＣ細胞懸濁液は、３．０質量％ＤＳＳ大腸炎モデルマウスの大腸の炎症を改善しないことが認められた。
　なお、各マウス群の病理スコアの中央値は、正常マウス群が０点、ＡＤＳＣ用培地マウス群が１３．０点、ｈＡＤＳＣ細胞懸濁液マウス群が１８．０点、ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊１０００個マウス群が７．０点であった。
　また、各マウス群の各箇所（結腸上部、結腸下部、および直腸）の病理スコアの中央値を表２に示す。
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　実施例１９および比較例６における、各マウス群の代表的なＨＥ組織染色像を図１２および図１３に示す。図１２および図１３に示されているように、正常マウス群で潰瘍、炎症性細胞浸潤、および浮腫は認められなかった。比較例であるＡＤＳＣ用培地マウス群では、潰瘍、炎症性細胞浸潤、および浮腫が広範囲に認められた。ＡＤＳＣ用培地マウス群と同様に、ｈＡＤＳＣ細胞懸濁液マウス群では、潰瘍、炎症性細胞浸潤、および浮腫が広範囲に認められた。
　一方、実施例１９において、ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊１０００個マウス群では、潰瘍、および炎症性細胞浸潤の範囲が狭かった。また、浮腫は認められなかった。
　以上の病理学的評価の結果をまとめると、ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊１０００個は、３．０質量％ＤＳＳ大腸炎モデルマウスの炎症に対する治療効果が認められた。一方で、ｈＡＤＳＣ細胞懸濁液は、３．０質量％ＤＳＳ大腸炎モデルマウスの炎症に対する治療効果が認められなかった。
　以上の体重、大腸の長さ、および病理学的評価の結果から、ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊による３．０質量％ＤＳＳ大腸炎モデルマウスへの炎症改善効果が認められた。
[実施例２０]　 ｈＢＭＳＣモザイク細胞塊の作製
　ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＢＭＳＣ：Human Bone Marrow Derived Mesenchymal Stem Cells）を増殖培地（タカラバイオ：MSCGM BulletKit（商標））に懸濁し、そこに実施例３で作製した生体親和性高分子ブロック（５３－１０６μｍ）を加えて、最終的にｈＢＭＳＣ（２．０×１０5cells）と生体親和性高分子ブロック（０．２ｍｇ）が４ｍＬの培地に懸濁された状態で、底面に窪み部を有する細胞非接着性の３５ｍｍディッシュであるEZSPHERE（登録商標）ディッシュ35mm Type903（スフェロイドウェル口径８００μｍ、スフェロイドウェル深さ３００μｍ、スフェロイドウェル数ウエル～約１０００ウェル。ＡＧＣテクノグラス製）に播種した。
　ＣＯ2インキュベーターにて３７℃で２０時間静置したところ、ｈＢＭＳＣと生体親和性高分子ブロックから成る直径０．２ｍｍ程度の球状としてモザイク細胞塊を複数個回収することができた。
 [比較例７]  ｈＢＭＳＣ細胞塊の作製
　ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＢＭＳＣ）を増殖培地（タカラバイオ：MSCGM BulletKit（商標））に懸濁し、最終的にｈＢＭＳＣ（２．０×１０5cells）が４ｍＬの培地に懸濁された状態で、底面に窪み部を有する細胞非接着性の３５ｍｍディッシュであるEZSPHERE（登録商標）ディッシュ35mm Type903（スフェロイドウェル口径８００μｍ、スフェロイドウェル深さ３００μｍ、スフェロイドウェル数ウエル～約１０００ウェル。ＡＧＣテクノグラス製）に播種した。
　ＣＯ2インキュベーターにて３７℃で２０時間静置したところ、ｈＢＭＳＣのみから成る細胞塊を複数個回収することができた。
 [実施例２１]  Ｔ細胞の増殖抑制試験（ｈＢＭＳＣモザイク細胞塊）
　実施例２０で作製したｈＢＭＳＣモザイク細胞塊について、Ｔ細胞の増殖抑制能を評価した。２４wellプレート上で、ｈＢＭＳＣモザイク細胞塊（ｈＢＭＳＣ５．０×１０4ｃｅｌｌｓ＋生体親和性高分子ブロック０．２ｍｇ／well）、およびＣＦＳＥ(cat#:565082（BD Biosciences社）)で標識したＴ細胞（１．０×１０5ｃｅｌｌｓ／well）を5日間共培養した。培養は、2 mM glutamine,100 IU/mL  penicillin,100 ug/ml streptomycin,10%FBS,および50uMモノチオグリセロールを含有したＲＰＭＩ１６４０培地に抗ＣＤ３ＣＤ２８抗体ビーズ(Dynabeads(商標)：Human T-Activator CD3/CD28(cat#:DB11161（ベリタス社）)を添加した培養液（以下、Ｔ細胞培地ともよぶ）中で実施した。なお、抗ＣＤ３ＣＤ２８抗体ビーズは、製品の使用方法に従い、Ｔ細胞１．０×１０5ｃｅｌｌｓにつき１０μｌの抗ＣＤ３ＣＤ２８抗体ビーズを使用した。
　５日間の共培養後、ｈＢＭＳＣモザイク細胞塊と共培養したＴ細胞の平均分裂回数を、ＣＦＳＥの蛍光強度を指標に測定した。共培養前に染色したＣＦＳＥの蛍光シグナルは、細胞分裂に伴い減衰するため、ＣＦＳＥの蛍光強度を測定することで、細胞分裂回数を同定できる。Ｔ細胞の平均分裂回数は、式９に従って算出した。
（式９）Ｔ細胞の平均分裂回数（回）＝（((０回分裂したＴ細胞数)×０)＋((１回分裂したＴ細胞数)×１)＋((２回分裂したＴ細胞数)×２) ＋((３回分裂したＴ細胞数)×３) ＋((４回分裂したＴ細胞数)×４) ＋((５回分裂したＴ細胞数)×５) ＋((６回分裂したＴ細胞数)×６)）／（０、１、２、３、４、５、および６回分裂したＴ細胞数の合計値）
[比較例８]  Ｔ細胞の増殖抑制試験（ｈＢＭＳＣ細胞塊）
　実施例２１と同様に、比較例７で作製したｈＢＭＳＣ細胞塊について、Ｔ細胞の増殖抑制能を評価した。
　２４wellプレート上で、ｈＢＭＳＣ細胞塊（ｈＢＭＳＣ５．０×１０4ｃｅｌｌｓ／well）、およびＣＦＳＥで標識したＴ細胞（１．０×１０5ｃｅｌｌｓ／well）を5日間共培養した。培養は、実施例２１と同様のＴ細胞培地中で行った。
　５日間の共培養後、ｈＢＭＳＣ細胞塊と共培養したＴ細胞のＣＦＳＥ蛍光強度を測定し、式９に従ってＴ細胞の平均分裂回数を算出した。
　Ｔ細胞の平均分裂回数の測定結果を図１４に示す（図中、***:Ｐ＜０．００１（ｔ検定））。その結果、Ｔ細胞のみで培養した場合に対して、ｈＢＭＳＣモザイク細胞塊、およびｈＢＭＳＣ細胞塊と共培養した場合のＴ細胞の平均分裂回数が有意に減少した。また、ｈＢＭＳＣ細胞塊と共培養した場合と比べて、ｈＢＭＳＣモザイク細胞塊と共培養した場合のＴ細胞の平均分裂回数は減少した。従って、ｈＢＭＳＣモザイク細胞塊、およびｈＢＭＳＣ細胞塊はＴ細胞の増殖抑制能を示し、その効果はｈＢＭＳＣモザイク細胞塊の方が高かった。
なお、各培養条件のＴ細胞の平均分裂回数は、Ｔ細胞のみで培養した場合が３．８７±２．６０回、ｈＢＭＳＣ細胞塊と共培養した場合が１．００±０．１２回、ｈＢＭＳＣモザイク細胞塊と共培養した場合が０．７７±０．１０回であった。
 [実施例２２]　ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊の作製
　ヒト脂肪由来幹細胞（ｈＡＤＳＣ）を増殖培地（Ｌｏｎｚａ社：ＡＤＳＣ－ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（商標）、以下、ＡＤＳＣ用培地ともいう）に懸濁し、実施例３で作製した生体親和性高分子ブロック（５３－１０６μｍ）を加えて、ｈＡＤＳＣ（２．０×１０5ｃｅｌｌｓ）と生体親和性高分子ブロック（０．２ｍｇ）が４ｍＬの培地に懸濁された状態で、底面に窪み部を有する細胞非接着性の３５ｍｍディッシュであるEZSPHERE（登録商標）ディッシュ35mm Type903（スフェロイドウェル口径８００μｍ、スフェロイドウェル深さ３００μｍ、スフェロイドウェル数ウエル～約１０００ウェル。ＡＧＣテクノグラス製）に播種した。
　ＣＯ2インキュベーターにて３７℃で２０時間静置したところ、ｈＡＤＳＣと生体親和性高分子ブロックから成る直径０．２ｍｍ程度の球状としてモザイク細胞塊を複数個回収することができた。
 [実施例２３]  Ｔ細胞活性化抑制試験（ＩＬ－２放出量試験）
　実施例２０および２２で得られたモザイク細胞塊（５．０×１０4ｃｅｌｌｓ＋生体親和性高分子ブロック０．２ｍｇ／well）をそれぞれT細胞と共培養し、４８時間後に培養上清に放出されるＩＬ－２を定量した。T細胞が活性化状態になるとＩＬ－２を分泌するため、ＩＬ－２を定量することでT細胞の活性化の程度を同定することができる。培養は、実施例２１と同様のＴ細胞培地中で行った。また、１wellあたりのT細胞数は、１．０×１０5ｃｅｌｌｓ／wellとした。
　定量に当たってはHuman IL-2 ELISA Kit（cat#: RAB0286  (SIGMA-ALDRICH社)）を使用した。
 [比較例９]   Ｔ細胞活性化抑制試験（ＩＬ－２放出量試験）
　接着状態で培養した実施例２０および２２と同一細胞（５．０×１０4ｃｅｌｌｓ／well）をそれぞれT細胞と共培養し、４８時間後に培養上清に放出されるＩＬ－２を定量した。培養は、実施例２１と同様のＴ細胞培地中で行った。また、１wellあたりのT細胞数は、１．０×１０5ｃｅｌｌｓ／wellとした。
　定量に当たってはHuman IL-2 ELISA Kit（cat#: RAB0286  (SIGMA-ALDRICH社)）を使用した。
　実施例２３および比較例９で測定したＩＬ－２の定量結果を図１５に示す（図中、*:Ｐ＜０．０５、***:Ｐ＜０．００１（ｔ検定））。その結果、ｈＢＭＳＣモザイク細胞塊およびｈＢＭＳＣ（接着状態）と共培養した場合ではＴ細胞のＩＬ－２放出量は、T細胞のみで培養した場合と比較して有意に減少した。また、ｈＢＭＳＣ（接着状態）と共培養した場合と比べて、ｈＢＭＳＣモザイク細胞塊と共培養したＴ細胞のＩＬ－２放出量は有意に減少した。従って、ｈＢＭＳＣモザイク細胞塊、およびｈＢＭＳＣ（接着状態）はＴ細胞の活性化抑制能を示し、その効果はｈＢＭＳＣモザイク細胞塊の方が高かった。
　同様に、ｈADSCのモザイク細胞塊およびｈADSＣ（接着状態）と共培養した場合のＩＬ－２放出量も、T細胞のみで培養した場合と比較して有意に減少した。また、ｈADSＣ（接着状態）と共培養した場合と比べて、ｈADSCモザイク細胞塊と共培養したＴ細胞のＩＬ－２分泌量は有意に減少した。従って、ｈＡＤＳＣモザイク細胞塊、およびｈＡＤＳＣ（接着状態）はＴ細胞の活性化抑制能を示し、その効果はｈＡＤＳＣモザイク細胞塊の方が高かった。
［実施例２４］犬由来細胞モザイク細胞塊の作製
　イヌ脂肪由来幹細胞（ｃＡＤＳＣ：Canine Adipose Derived Stem Cells）を、１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリンストレプトマイシンを含有したＤＭＥＭ培地（以下、ｃＡＤＳＣ用培地ともよぶ）に懸濁し、実施例３で作製した生体親和性高分子ブロック（５３－１０６μｍ）を加えて、ｃＡＤＳＣ（１．２×１０6ｃｅｌｌｓ）と生体親和性高分子ブロック（０．２５ｍｇ）が４ｍＬの培地に懸濁された状態で、底面に窪み部を有する細胞非接着性の３５ｍｍディッシュであるEZSPHERE（登録商標）ディッシュ35mm Type903（スフェロイドウェル口径８００μｍ、スフェロイドウェル深さ３００μｍ、スフェロイドウェル数ウエル～約１０００ウェル。ＡＧＣテクノグラス製）に播種した。
　ＣＯ2インキュベーターにて３７℃で６９時間静置したところ、ｃＡＤＳＣと生体親和性高分子ブロックから成る直径０．２ｍｍ程度の球状としてモザイク細胞塊を複数個回収することができた。
［実施例２５］　犬由来細胞モザイク細胞塊での炎症治療効果
　実施例１９と同様にして、実施例１８の３．０質量％ＤＳＳ大腸炎モデルマウスに対して、炎症誘導開始日から７日後に、実施例２４で作製したｃＡＤＳＣモザイク細胞塊（ｃＡＤＳＣ１．２×１０6ｃｅｌｌｓ＋生体親和性高分子ブロック０．２５ｍｇ／匹）をｃＡＤＳＣ用培地４００μＬに懸濁した状態で腹腔投与した。
［比較例１０］ｃＡＤＳＣ細胞懸濁液、またはＡＤＳＣ用培地での炎症治療効果
　実施例２５と同様にして、実施例１８の３．０質量％ＤＳＳ大腸炎モデルマウスに対して、誘導開始日から７日後に、ｃＡＤＳＣ用培地１００μＬ、または実施例２５と同じ細胞をｃＡＤＳＣ用培地１００μＬに懸濁した状態のｃＡＤＳＣ細胞懸濁液を尾静脈投与した。ｃＡＤＳＣ細胞懸濁液中に含まれる細胞数は、４．０×１０4ｃｅｌｌｓ／匹または１．２×１０6ｃｅｌｌｓ／匹とした。
　実施例２５および比較例１０における、各マウス群の正常マウスに対する体重割合（％）の平均値を図１６に示す。図１６に示されているように、ｃＡＤＳＣモザイク細胞塊マウス群は、誘導開始日の１１、１２、１３、および１４日後において、比較例であるｃＡＤＳＣ用培地マウス群およびｃＡＤＳＣ細胞懸濁液マウス群より「正常マウスに対する体重割合」が高かった。ｃＡＤＳＣモザイク細胞塊マウス群は、ＡＤＳＣ用培地マウス群およびｃＡＤＳＣ細胞懸濁液マウス群より体重の回復が早いことが示された。従って、ｃＡＤＳＣモザイク細胞塊は、体重減少の改善効果が認められた。
　一方、図１６に示されているように、ｃＡＤＳＣ細胞懸濁液マウス群は、誘導開始日の１１、１２、１３および１４日後において、ｃＡＤＳＣ用培地マウス群より低い体重の推移を示した。従って、ｃＡＤＳＣ細胞懸濁液は、体重減少の改善効果が認められなかった。
　以上の体重の評価結果をまとめると、ｃＡＤＳＣモザイク細胞塊は３．０質量％ＤＳＳ大腸炎モデルマウスの体重減少を改善する効果が認められる。一方で、ｃＡＤＳＣ細胞懸濁液では、３．０質量％ＤＳＳ大腸炎モデルマウスの体重減少を改善する効果が認められなかった。
　実施例２５および比較例１０における、各マウス群の大腸の長さを箱ひげ図として図１７に示す（図中、*:Ｐ＜０．０５、**:Ｐ＜０．０１（ｔ検定））。図１７に示されているように、ｃＡＤＳＣ用培地マウス群の大腸の長さは正常マウス群に対して有意に短いことが示された。
　実施例２５において、ｃＡＤＳＣモザイク細胞塊マウス群の大腸の長さは、比較例であるｃＡＤＳＣ用培地マウス群に対して有意に長いことが示された。従って、ｃＡＤＳＣモザイク細胞塊は、３．０質量％ＤＳＳ大腸炎モデルマウスの大腸の短腸化を改善したことが認められた。
　一方、比較例１０において、ｃＡＤＳＣ細胞懸濁液マウス群の大腸の長さは、比較例であるｃＡＤＳＣ用培地マウス群に対して差がないことが示された。従って、ｃＡＤＳＣ細胞懸濁液は、３．０質量％ＤＳＳ大腸炎モデルマウスの大腸の短腸化を改善しないことが認められた。
　なお、各マウス群の大腸の長さの中央値は、正常マウス群が７．５０ｃｍ、ｃＡＤＳＣ用培地マウス群が６．６４ｃｍ、４万ｃＡＤＳＣ細胞懸濁液マウス群が６．４８ｃｍ、１２０万ｃＡＤＳＣ細胞懸濁液マウス群が６．１４ｃｍ、ｃＡＤＳＣモザイク細胞塊マウス群が７．９８ｃｍであった。
　以上の大腸の長さの評価結果をまとめると、ｃＡＤＳＣモザイク細胞塊は、３．０質量％ＤＳＳ大腸炎モデルマウスの短腸化を改善する効果が認められた。一方で、ｃＡＤＳＣ細胞懸濁液は３．０質量％ＤＳＳ大腸炎モデルマウスの短腸化を改善する効果が認められなかった。
　以上の体重、および大腸の長さの結果から、ｃＡＤＳＣモザイク細胞塊による３．０質量％ＤＳＳ大腸炎モデルマウスへの炎症改善効果が認められた。

Claims (23)

  1. 生体親和性高分子ブロックと細胞とを含み、複数個の細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックが配置されている、細胞構造体を含む、トロフィックファクタ放出剤であって、前記生体親和性高分子ブロック一つの大きさが２０μｍ以上２００μｍ以下であり、前記細胞からトロフィックファクタが放出される、トロフィックファクタ放出剤。
  2. 前記生体親和性高分子ブロック一つの大きさが５０μｍ以上１２０μｍ以下である、請求項１に記載のトロフィックファクタ放出剤。
  3. 前記生体親和性高分子ブロックにおいて、生体親和性高分子が熱、紫外線または酵素により架橋されている、請求項１または２に記載のトロフィックファクタ放出剤。
  4. 前記生体親和性高分子ブロックが不定形である、請求項１から３の何れか一項に記載のトロフィックファクタ放出剤。
  5. 前記細胞構造体が、細胞１個当り０．００００００１μｇ以上１μｇ以下の生体親和性高分子ブロックを含む、請求項１から４の何れか一項に記載のトロフィックファクタ放出剤。
  6. 前記細胞が、体性幹細胞である、請求項１から５の何れか一項に記載のトロフィックファクタ放出剤。
  7. 前記トロフィックファクタが、サイトカインである、請求項１から６の何れか一項に記載のトロフィックファクタ放出剤。
  8. 生体親和性高分子が、ゼラチン、コラーゲン、アテロコラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、プロネクチン、ラミニン、テネイシン、フィブリン、フィブロイン、エンタクチン、トロンボスポンジン、レトロネクチン（登録商標）、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸・グリコール酸コポリマー、ヒアルロン酸、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、コンドロイチン、セルロース、アガロース、カルボキシメチルセルロース、キチン、またはキトサンである、請求項１から７の何れか一項に記載のトロフィックファクタ放出剤。
  9. 生体親和性高分子が、リコンビナントゼラチンである、請求項１から８の何れか一項に記載のトロフィックファクタ放出剤。
  10. リコンビナントゼラチンが、下記式１で示される、請求項９に記載のトロフィックファクタ放出剤。
    式１：Ａ－［（Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ）n］m－Ｂ
    式中、Ａは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示し、ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎは３～１００の整数を示し、ｍは２～１０の整数を示す。なお、ｎ個のＧｌｙ－Ｘ－Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。
  11. リコンビナントゼラチンが、
    （１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド；
    （２）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；または
    （３）配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；
    である、請求項９または１０に記載のトロフィックファクタ放出剤。
  12. 請求項１から１１の何れか一項に記載のトロフィックファクタ放出剤を含む、炎症疾患処置剤。
  13. 生体親和性高分子ブロックと間葉系幹細胞とを含み、複数個の間葉系幹細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックが配置されている、細胞構造体を含む、炎症疾患処置剤であって、前記生体親和性高分子ブロック一つの大きさが２０μｍ以上２００μｍ以下である、炎症疾患処置剤。
  14. 前記生体親和性高分子ブロック一つの大きさが５０μｍ以上１２０μｍ以下である、請求項１３に記載の炎症疾患処置剤。
  15. 前記生体親和性高分子ブロックにおいて、生体親和性高分子が熱、紫外線または酵素により架橋されている、請求項１３または１４に記載の炎症疾患処置剤。
  16. 前記生体親和性高分子ブロックが不定形である、請求項１３から１５の何れか一項に記載の炎症疾患処置剤。
  17. 前記細胞構造体が、細胞１個当り０．００００００１μｇ以上１μｇ以下の生体親和性高分子ブロックを含む、請求項１３から１６の何れか一項に記載の炎症疾患処置剤。
  18. 前記間葉系幹細胞が、脂肪由来間葉系幹細胞または骨髄由来間葉系幹細胞である、請求項１３から１７の何れか一項に記載の炎症疾患処置剤。
  19. 生体親和性高分子が、ゼラチン、コラーゲン、アテロコラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、プロネクチン、ラミニン、テネイシン、フィブリン、フィブロイン、エンタクチン、トロンボスポンジン、レトロネクチン（登録商標）、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸・グリコール酸コポリマー、ヒアルロン酸、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、コンドロイチン、セルロース、アガロース、カルボキシメチルセルロース、キチン、またはキトサンである、請求項１３から１８の何れか一項に記載の炎症疾患処置剤。
  20. 生体親和性高分子が、リコンビナントゼラチンである、請求項１３から１９の何れか一項に記載の炎症疾患処置剤。
  21. リコンビナントゼラチンが、下記式１で示される、請求項２０に記載の炎症疾患処置剤。
    式１：Ａ－［（Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ）n］m－Ｂ
    式中、Ａは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示し、ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎは３～１００の整数を示し、ｍは２～１０の整数を示す。なお、ｎ個のＧｌｙ－Ｘ－Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。
  22. リコンビナントゼラチンが、
    （１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド；
    （２）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；または
    （３）配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；
    である、請求項２０または２１に記載の炎症疾患処置剤。
  23. 前記間葉系幹細胞がヒトまたは犬由来の間葉系幹細胞である、請求項１３から２２の何れか一項に記載の炎症疾患処置剤。
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