WO2017188355A1 - イオウ原子を同位体標識したシステイン及びシステイン誘導体の合成法の確立 - Google Patents

イオウ原子を同位体標識したシステイン及びシステイン誘導体の合成法の確立 Download PDF

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澤　智裕
勝彦 小野
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Kumamoto University NUC
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    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)

Definitions

  • the present invention relates to a method for synthesizing cysteine and cysteine derivatives in which a sulfur atom is labeled with an isotope.
  • the present invention also relates to a kit for use in the synthesis method.
  • the method known so far as a method for synthesizing an amino acid in which a sulfur atom is labeled with an isotope is based on organic chemical synthesis or biosynthesis.
  • the biosynthetic technique is a technique in which a microorganism such as Escherichia coli is cultured in a medium containing an isotope-labeled sulfur-containing substrate as a sole sulfur source, and cysteine or methionine produced by the microorganism is recovered (non-native).
  • Patent Document 2 The yield of cysteine labeled with an isotope-labeled sulfur atom obtained by a biosynthetic technique is about 10%, which is not a sufficiently high yield.
  • the present invention provides a method for efficiently synthesizing cysteine and a cysteine derivative in which a sulfur atom is isotopically labeled and a kit used in the method.
  • cysteine synthase As a result of intensive studies, it was found that cysteine and cysteine derivatives in which sulfur atoms are isotopically labeled can be efficiently synthesized by an enzymatic reaction using cysteine synthase. Based on this finding, the present invention has been completed.
  • the present invention may be as follows.
  • a method for synthesizing cysteine in which a sulfur atom is isotopically labeled, wherein O-acetyl-L-serine and a sulfur atom are isotopically labeled in the presence of cysteine synthase (EC: 2.5.1.47) Reacting the substrate, wherein the isotopically labeled substrate for the sulfur atom is sodium hydrogen sulfide (NaHS), sodium sulfide (Na 2 S), or hydrogen sulfide (H 2 S); and Wherein said sulfur atom isotope label is selected from the group consisting of stable isotope 32 S, stable isotope 34 S, radioactive isotope 33 S and radioactive isotope 35 S.
  • cysteine synthase is cysteine synthase A (CysK) or cysteine synthase B (CysM).
  • cysteine synthase is a recombinant protein containing a histidine tag.
  • a method for synthesizing cystine in which a sulfur atom is isotopically labeled comprising synthesizing a cysteine labeled with an isotopically sulfur atom in accordance with the method described in [1] or [2] above, and using the cysteine as an oxidizing agent. Said method comprising the step of obtaining cystine by oxidation in the presence.
  • a method for synthesizing a cysteine derivative (I) the cysteine derivative is a sulfocysteine in which a sulfur atom is isotope-labeled, and comprises reacting O-acetyl-L serine and sodium sulfite (Na 2 SO 3 ) in the presence of cysteine synthase,
  • the sulfur atom is selected from the group consisting of a stable isotope 32 S, a stable isotope 34 S, a radioactive isotope 33 S and a radioactive isotope 35 S;
  • the cysteine derivative is S-sulfocysteine in which a sulfur atom is isotopically labeled, and O-acetyl-L-serine and sodium thiosulfate (Na 2 S 2 O 3 ) are reacted in the presence of cysteine synthase B.
  • the sulfur atom is selected from the group consisting of a stable isotope 32 S, a stable isotope 34 S, a radioactive isotope 33 S and a radioactive isotope 35 S;
  • the cysteine derivative is a cysteine persulfide in which a sulfur atom is isotope-labeled, and includes a step of reacting O-acetyl-L-serine and sodium disulfide (Na 2 S 2 ) in the presence of cysteine synthase.
  • the cysteine derivative is a cysteine persulfide in which a sulfur atom is isotopically labeled.
  • A In the presence of cysteine synthase, an O-acetyl-L-serine and a substrate that is isotopically labeled with a sulfur atom are reacted.
  • a cysteine having an isotope-labeled sulfur atom wherein the substrate isotope-labeled for the sulfur atom is sodium hydrogen sulfide (NaHS) or sodium sulfide (Na 2 S), wherein the sulfur atom Isotope label is selected from the group consisting of stable isotope 32 S, stable isotope 34 S, radioactive isotope 33 S and radioactive isotope 35 S, and (b) the sulfur atom obtained in step (a) Reacting isotope-labeled cysteine with sodium disulfide; or (v) a cysteine derivative is seleno A stain in the presence of a cysteine synthase, comprising the step of reacting O- acetyl -L- serine and sodium selenide (Na 2 Se); Said method.
  • NaHS sodium hydrogen sulfide
  • Na 2 S sodium sulfide
  • cysteine synthase is cysteine synthase A (CysK) or cysteine synthase B (CysM).
  • cysteine synthase is a recombinant protein containing a histidine tag.
  • NaHS sodium hydrogen sulfide
  • Na 2 S sodium sulfide
  • Na 2 SO 3 sodium sulfite
  • Na 2 S 2 O 3 sodium thios
  • a method for synthesizing a cysteine derivative (I) the cysteine derivative is a cystine polysulfide in which a sulfur atom is isotopically labeled, and (a) a step of synthesizing a cysteine in which a sulfur atom is isotopically labeled according to the method described in [1] or [2] above, b) reacting the cysteine labeled with an isotope-labeled sulfur atom obtained in step (a) with an oxidizing agent, and (c) further reacting by adding sodium sulfide (Na 2 S); or ( ii) the cysteine derivative is N-acetylcysteine obtained by isotopically labeling a sulfur atom, and (a) a step of synthesizing a cysteine labeled with an isotopically labeled sulfur atom according to the method described in [1] or [2] above, And (b) reacting cysteine labeled with an is
  • the present invention is useful in that cysteine and cysteine derivatives labeled with a sulfur atom isotope-labeled can be synthesized with few steps and high yield.
  • Cysteine Synthase Cysteine synthase (EC: 2.5.1.47) is an enzyme involved in cysteine biosynthesis in vivo, and has the following chemical reaction: It is an enzyme that catalyzes. That is, this enzyme produces L-cysteine and acetic acid using O3-acetyl-L-serine and hydrogen sulfide as substrates. Cysteine transferase belongs to the family of transferases, and there are two types, cysteine synthase A (CysK) and cysteine synthase B (CysM), based on differences in substrate specificity for sulfur sources such as hydrogen sulfide.
  • CysK cysteine synthase A
  • CysM cysteine synthase B
  • the cysteine synthase used in the present invention is not particularly limited as long as it is an enzyme that catalyzes the above reaction. Cysteine synthase A or cysteine synthase B is preferable, and cysteine synthase A is more preferable.
  • the origin of cysteine synthase is not particularly limited, but examples include those derived from Gram-negative bacteria such as Escherichia coli and Salmonella, and Gram-positive bacteria such as Staphylococcus and Streptococcus. Preferably, it is cysteine synthase A derived from Salmonella enterica serover Typhimurium.
  • the cysteine synthase used in the present invention may be extracted from a microorganism or may be prepared by genetic recombination.
  • cysteine synthase prepared by gene recombination one modified with a histidine tag (a tag comprising 6 to 11 consecutive histidine residues) or the like may be used. Since the histidine tag has a high affinity for metal ions such as nickel, a recombinant protein modified with a histidine tag can be supported on a resin on which a metal such as nickel is immobilized.
  • the enzyme By supporting a cysteine synthase containing a histidine tag on a resin in which a metal such as nickel is immobilized, the enzyme can be easily recovered from the reaction system, so that it can be easily separated from the product. It can be reused. In this regard, it is advantageous to use a recombinant cysteine synthase containing a histidine tag.
  • cysteine synthase A When cysteine synthase A (CysK) is used, it is known that the enzyme activity of CysK requires pyridoxal phosphate (PLP), which is a coenzyme.
  • PLP pyridoxal phosphate
  • CysK is produced from recombinant E. coli, PLP is purified while bound to CysK. Therefore, in the present invention, when recombinant cysteine synthase A is used, it is not always necessary to add PLP to the reaction system during the enzymatic reaction.
  • Serine-O-acetyltransferase (EC: 2.3.3.10) is a reaction that produces O-acetyl-L-serine and CoA using L-serine and acetyl CoA as substrates.
  • the serine-O-acetyltransferase used in the present invention is not particularly limited as long as it is an enzyme that catalyzes the above-mentioned reaction.
  • the thing derived from a microbe is mentioned.
  • Serine-O-acetyltransferase may be extracted from microorganisms or may be prepared by genetic recombination. When serine-O-acetyltransferase prepared by gene recombination is used, it is modified with a histidine tag (a tag comprising 6 to 11 consecutive histidine residues) or the like for the reason described in (1) cysteine synthase above. A thing may be used.
  • isotope-labeled isotope refers to a relationship between nuclides having the same atomic number but different numbers of neutrons.
  • isotopically labeled means a state in which a specific nuclide of a compound is substituted with an isotope other than the isotope having the highest natural abundance ratio.
  • isotope labeling means an isotope other than the isotope having the highest natural abundance ratio for a specific nuclide of a compound.
  • the isotope label may be a stable isotope or a radioisotope.
  • the radioisotope has a radioactivity for emitting radiation by decay, and the stable isotope is a stable isotope that does not cause decay.
  • Isotope label used for sulfur atoms in the present invention is not particularly limited as long as the isotope of sulfur, preferably, stable isotopes 32 S, stable isotope 34 S, radioisotope 33 S and radioactive isotopes 35 S Selected from the group consisting of More preferably, the isotope label used for sulfur atoms in the present invention are stable isotope 34 S.
  • the isotope label used for the selenium atom in the present invention is not particularly limited as long as it is an isotope of selenium, but is preferably selected from the group consisting of stable isotope 78 Se, stable isotope 77 Se and stable isotope 76 Se.
  • the More preferably, the isotope label used for the selenium atom is the stable isotope 78 Se.
  • Cysteine and cysteine derivatives Cysteine is a kind of natural amino acid and is L-cysteine unless otherwise specified.
  • cysteine in which a sulfur atom is isotopically labeled means a cysteine in which the sulfur atom of the mercapto group (—SH) of cysteine is isotopically labeled.
  • cysteine derivatives include the following: (I) a compound that is cystine (Cys-SS-Cys), wherein at least one sulfur atom in the molecule is isotopically labeled; (Ii) a compound having sulfocysteine (Cys-SO 3 H) or S-sulfocysteine (Cys-SSO 3 H), in which a sulfur atom in the molecule is isotopically labeled; (Iii) Cysteine persulfide (Cys-SSH), a compound in which at least one sulfur atom in the molecule is isotopically labeled; (Iv) selenocysteine (Cys-SeH), wherein the selenium atom may or may not be isotopically labeled; (V) a cystine polysulfide (Cys-SS ( 1-3) -S-Cys), wherein at least one sulfur atom in the molecule is isotopically labeled
  • the method for synthesizing cysteine labeled with an isotopically labeled sulfur atom comprising the step of reacting O-acetyl-L-serine and a substrate labeled with an isotope labeled with a sulfur atom in the presence of cysteine synthase. ,I will provide a.
  • the isotopically labeled substrate for the sulfur atom is sodium hydrogen sulfide (NaHS), sodium sulfide (Na 2 S), or hydrogen sulfide (H 2 S), which may be derived from sodium sulfide.
  • NaHS sodium hydrogen sulfide
  • Na 2 S sodium sulfide
  • H 2 S hydrogen sulfide
  • the types of isotope labeling of sulfur atoms are as described above in the section “Isotope labeling”.
  • the reaction conditions are not particularly limited as long as the enzyme activity of cysteine synthase is maintained.
  • 25 to 37 ° C., pH 7 to 8 and the like can be mentioned.
  • the following steps (I) reacting isotope-labeled substrates for O-acetyl-L-serine and sulfur atoms in the presence of cysteine synthase; (Ii) Cystine is obtained by oxidizing the cysteine labeled with the isotope-labeled sulfur atom obtained in step (i) with an oxidizing agent; A method for synthesizing a cystine labeled with an isotope of a sulfur atom is provided.
  • Cystine is 3,3′-dithiobis (2-aminopropionic acid) and has a structure in which two molecules of cysteine in the cysteine are linked by forming a disulfide bond.
  • cystine is sometimes referred to as Cys-SS-Cys for convenience.
  • the step (i) can be performed as described in the above item “Method for synthesizing cysteine”.
  • the oxidizing agent used in the step (ii) is not particularly limited as long as it is a reagent that can promote the formation of a disulfide bond by oxidizing a mercapto group.
  • iodine (I 2 ) heavy metal, hydrogen peroxide ( H 2 O 2) or the like can be preferably used.
  • the oxidizing agent is iodine.
  • reaction conditions in the above step (ii) are not particularly limited as long as they are suitable for the formation of disulfide bonds, and examples include conditions such as 25 ° C. to 37 ° C. and pH 7 to 8.
  • a sulfur atom is reacted with O-acetyl-L-serine and sodium sulfite (Na 2 SO 3 ) isotopically labeled for sulfur atom in the presence of cysteine synthase.
  • a method of synthesizing isotopically labeled sulfocysteine is provided.
  • the type of isotope labeling of the sulfur atom is as described above in the section “Isotope labeling”.
  • sulfocysteine can be represented by the following formula: H 2 N—CH (CH 2 —SO 3 H) —COOH.
  • sulfocysteine is sometimes referred to as Cys-SO 3 H for convenience.
  • the reaction conditions are not particularly limited as long as the enzyme activity of cysteine synthase is maintained.
  • 25 to 37 ° C., pH 7 to 8 and the like can be mentioned.
  • S-sulfocysteine can be represented by the following formula: H 2 N—CH (CH 2 —SSO 3 H) —COOH.
  • S-sulfocysteine is sometimes referred to as Cys-SSO 3 H for convenience.
  • the reaction conditions are not particularly limited as long as the enzyme activity of cysteine synthase B is maintained.
  • 25 to 37 ° C., pH 7 to 8 and the like can be mentioned.
  • sulfur comprising the step of reacting O-acetyl-L-serine and isotopically labeled sodium disulfide (Na 2 S 2 ) with respect to a sulfur atom in the presence of cysteine synthase.
  • a method for synthesizing cysteine persulfide having an isotope-labeled atom is as described above in the section “Isotope labeling”.
  • cysteine persulfide can be represented by the following formula: H 2 N—CH (CH 2 —SSH) —COOH.
  • cysteine persulfide may be referred to as Cys-SSH for convenience.
  • the reaction conditions are not particularly limited as long as the enzyme activity of cysteine synthase is maintained. Examples thereof include 30 to 42 ° C., pH 7 to 8 and the like.
  • a sulfur atom isotope-labeled cysteine par comprising the step of reacting a sulfur atom isotopically labeled with a sulfur atom obtained by the method described in the above-mentioned section of “Method for synthesizing cysteine” and sodium disulfide.
  • a method for the synthesis of sulfides is provided.
  • the sulfur atom bonded to the ⁇ carbon of cysteine is isotopically labeled, but the terminal SH group may be an isotope having the highest natural abundance ratio.
  • the conditions for reacting cysteine labeled with an isotope with sulfur atoms and sodium disulfide are not particularly limited as long as they allow persulfide to be formed. An example is 30 to 42 ° C.
  • a method for synthesizing selenocysteine comprises the step of reacting O-acetyl-L-serine and sodium selenide (Na 2 Se) in the presence of cysteine synthase.
  • Sodium selenide may or may not be isotopically labeled.
  • selenocysteine in which the selenium atom is isotopically labeled is obtained.
  • the type of isotope labeling of the selenium atom is as described above in the section “Isotope labeling”.
  • selenocysteine can be represented by the following formula: H 2 N—CH (CH 2 —SeH) —COOH. That is, selenocysteine has a structure in which the sulfur atom of cysteine is substituted with selenium. In the present specification, selenocysteine is sometimes expressed as Cys-SeH for convenience.
  • the reaction conditions are not particularly limited as long as the enzyme activity of cysteine synthase is maintained.
  • 25 to 37 ° C., pH 7 to 8 and the like can be mentioned.
  • cystine polysulfide in one embodiment, (I) reacting isotope-labeled substrates for O-acetyl-L-serine and sulfur atoms in the presence of cysteine synthase; (Ii) reacting the cysteine labeled with an isotope of the sulfur atom obtained in step (i) with an oxidizing agent sodium nitrite (NaNO 2 ); (Iii) A method for synthesizing a cystine polysulfide in which a sulfur atom is isotopically labeled is provided, which further comprises adding sodium sulfide (Na 2 S) to react to obtain a cystine polysulfide.
  • Na 2 S sodium sulfide
  • cystine polysulfide can be represented by the following formula: HN 2 —CH (COOH) —CH 2 —SS (1-3) —S—CH 2 —CH (COOH) —NH 2 .
  • the cystine polysulfide is sometimes referred to as Cys-SS (1-3) -S-Cys for convenience.
  • the step (i) can be carried out as described in the item “Method for synthesizing cysteine” above.
  • the oxidizing agent used in the above step (ii) is not particularly limited as long as it is a reagent that can promote the reaction of extracting a hydrogen atom from a mercapto group.
  • the oxidizing agent is sodium nitrite (NaNO 2 ).
  • the sodium sulfide (Na 2 S) used in the above step (iii) may be an isotope-labeled sulfur atom or an unisotopically labeled sulfur atom.
  • reaction conditions (ii) and (iii) are not particularly limited as long as they are suitable for forming a polysulfide bond, and examples thereof include 25 to 37 ° C.
  • the following steps (I) reacting isotope-labeled substrates for O-acetyl-L-serine and sulfur atoms in the presence of cysteine synthase; (Ii) N-acetylcysteine is obtained by reacting the cysteine labeled with an isotopically labeled sulfur atom obtained in step (i) with an acetylating agent; A method for synthesizing N-acetylcysteine labeled with an isotope of a sulfur atom is provided.
  • N-acetylcysteine can be represented by the following formula: CH 3 —CONH—C (CH 2 —SH) —COOH.
  • the step (i) can be carried out as described in the item “Method for synthesizing cysteine” above.
  • the acetylating agent used in the above step (ii) is not particularly limited as long as it is a reagent capable of acetylating the amino group of cysteine.
  • acetyl CoA acetic anhydride and the like can be preferably used.
  • the acetylating agent is acetyl CoA.
  • reaction conditions in the above step (ii) are not particularly limited as long as they are suitable for the acetylation reaction, and examples include conditions such as 25 ° C. to 37 ° C. and pH 7 to 8.
  • O-acetyl-L-serine is isotopically labeled for nitrogen and / or carbon atoms in the presence of the following steps: serine-O-acetyltransferase.
  • a method further comprising: Isotope labels for nitrogen and / or carbon atoms may be stable isotopes 15 N and / or 13 C, respectively.
  • cysteine and cysteine derivatives labeled with a sulfur atom, or cysteine labeled with nitrogen and / or carbon and sulfur, obtained by the above synthesis method or the above reaction
  • the cysteine derivative can be recovered and purified by techniques known to those skilled in the art such as chromatography.
  • kits for synthesizing cysteine or cystine or a cysteine derivative isotopically labeled with a sulfur atom includes a cysteine synthase; and a substrate that is isotopically labeled for a sulfur atom, or sodium selenide (Na 2 Se), wherein the selenium atom of sodium selenide may or may not be isotopically labeled. May be).
  • the cysteine synthase included in the kit is as described in the item “Cysteine synthase” above.
  • a substrate that is isotopically labeled with a sulfur atom may be sodium hydrogen sulfide (NaHS), sodium sulfide (Na 2 S), or sodium sulfite (Na 2 SO) that is isotopically labeled with a sulfur atom.
  • NaHS sodium hydrogen sulfide
  • Na 2 S sodium sulfide
  • Na 2 SO sodium sulfite
  • the types of isotope labeling of sulfur atoms are as described above in the section of “isotope labeling”.
  • isotope labeling of selenium atoms are as described in the “Isotope labeling” section above.
  • Example 1 34 S-labeled cysteine (Cys- 34 SH) in the synthesis 100mM phosphate buffer (pH 7.6) in, so that 20 mM O-acetyl -L- serine, 20 mM sodium hydrogen sulfide (Na 2 34 S) Dissolved.
  • 0.05 mg / ml of cysteine synthase (CysK) prepared by the method of Reference Example 1 was added and reacted at 37 ° C. for 1 hour.
  • methanol and an excess amount of monobromobiman (MBB) were added to the reaction solution after the above reaction and incubated at 37 ° C. for 15 minutes.
  • the reaction product was analyzed by high performance liquid chromatography (column: YMC Triat C18 plus (4.6 mm ⁇ 150 mm) (YMC Co., Ltd.); column temperature: 35 ° C; injection volume: 10 ⁇ l; moving bed: solution A / 0.1 % Formic acid and B solution / acetonitrile; Gradient: 5% B solution (0 min)-80% B solution (22 min)-80% B solution (23 min)-5% B solution (24 min)-5% B Liquid (30 minutes); flow rate 0.8 ml / min).
  • the peak of the target product (cysteine-biman) was confirmed at an elution time of 9 to 10 minutes. From the peak area, it was confirmed that a product of 15 mM was generated. Since 20 mM O-acetylserine and sodium hydrogen sulfide were used as starting materials, this means a reaction yield of 75%.
  • Example 2 34 S-labeled cystine synthesis 100mM phosphate buffer (pH 7.6) in (Cys- 34 S- 34 S-Cys ), 20mM O- acetyl -L- serine, 20 mM sodium hydrogen sulfide (Na 2 34 S ) was dissolved. To this solution, 0.05 mg / ml of cysteine synthase (CysK) prepared by the method of Reference Example 1 was added and reacted at 37 ° C. for 1 hour.
  • cysteine synthase cysteine synthase
  • iodine (I 2 ) was added to the reaction solution to 40 mM and incubated at 37 ° C. for 10 minutes.
  • the reaction product was analyzed by high performance liquid chromatography (column: Intrada Amino Acid (100 ⁇ 3 mm) (Intact Corporation); column temperature: 35 ° C .; injection volume: 10 ⁇ l; moving bed: solution A / acetonitrile and solution B / 20 mM ammonium formate; Gradient: 14% solution B (0 minutes)-14% solution B (3 minutes)-100% solution B (20 minutes)-14% solution B (20.5 minutes)-14% solution B ( 30 minutes); flow rate 0.6 ml / min). The peak of the target product (cystine) was confirmed at an elution time of about 18 minutes. The reaction yield was almost 100%.
  • Example 3 Synthesis of 15 N-labeled / 34 S-labeled cysteine ([ 15 N] Cys- 34 SH) 1 mM 15 N-labeled L-serine, 1 mM acetyl CoA, 1 mM hydrogen sulfide in 100 mM phosphate buffer (pH 7.6) It was dissolved at a sodium (Na 2 34 S). To this solution, 0.05 mg / ml of cysteine synthase (CysK) prepared by the method of Reference Example 1 and serine-O-acetyltransferase (CysE) prepared by the method of Reference Example 2 were added and reacted at 37 ° C. for 5 minutes. I let you. In order to facilitate confirmation of cysteine production, methanol and an excess amount of monobromobiman (MBB) were added to the reaction solution after the above reaction, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 15 minutes.
  • MMBB monobromobiman
  • the reaction product was analyzed by high performance liquid chromatography (column: YMC Triat C18 plus (4.6 mm ⁇ 150 mm) (YMC Co., Ltd.); column temperature: 35 ° C .; injection volume: 10 ⁇ l; moving bed: solution A / 0.1 % Formic acid and B solution / acetonitrile; Gradient: 5% B solution (0 min)-80% B solution (22 min)-80% B solution (23 min)-5% B solution (24 min)-5% B Liquid (30 minutes); flow rate 0.8 ml / min). The peak of the target product (cysteine-biman) was confirmed at an elution time of 9 to 10 minutes.
  • Example 4 Synthesis of 15 N-labeled sulfocysteine ([ 15 N] Cys-SO 3 H) In 100 mM phosphate buffer (pH 7.6), 1 mM 15 N-labeled L-serine, 1 mM acetyl CoA, 1 mM sodium sulfite ( Na 2 SO 3 ) was dissolved. To this solution, 0.05 mg / ml of cysteine synthase (CysK) prepared by the method of Reference Example 1 and serine-O-acetyltransferase (CysE) prepared by the method of Reference Example 2 were added and reacted at 37 ° C. for 30 minutes. I let you.
  • reaction product was analyzed by a mass spectrometer (column: Imtakt Scherzo SS-C18 (2.0 mm ⁇ 150 mm) (Intact Corporation); column temperature: 45 ° C .; injection volume: 3 ⁇ l; moving bed: solution A / 0.2 % Formic acid, 0.2% acetic acid, and B solution / 100 mM ammonium acetate, 50% methanol; Gradient: 0% solution B (0 minutes)-0% solution B (1 minute)-2% solution B (4 minutes)- 45% solution B (15 minutes)-0% solution B (15.1 minutes)-0% solution B (20 minutes); flow rate 0.3 ml / min); mass analysis conditions: precursor ion 168, product ion 81, flag Mentor voltage 90V, collision energy 21, polarity negative.
  • mass analysis conditions precursor ion 168, product ion 81, flag Mentor voltage 90V, collision energy 21, polarity negative.
  • a peak of the target product (sulfocysteine) was confirmed at an elution time of 3 to 4 minutes.
  • the product detected a peak at m / z: 169, while a peak at m / z: 168 was detected for the product of this product which was not isotopically labeled with sulfocysteine. This indicates that the product is a compound isotopically labeled with 15 N.
  • Example 5 Synthesis of 15 N-labeled S-sulfocysteine ([ 15 N] Cys-SSO 3 H) In 100 mM phosphate buffer (pH 7.6), 1 mM 15 N-labeled L-serine, 1 mM acetyl CoA, 1 mM thio It was dissolved at a sodium sulphate (Na 2 S 2 O 3) . To this solution, 0.05 mg / ml of cysteine synthase (CysM) prepared by the method of Reference Example 1 and serine-O-acetyltransferase (CysE) prepared by the method of Reference Example 2 were added and reacted at 37 ° C. for 30 minutes. I let you.
  • cysteine synthase CysM
  • CysE serine-O-acetyltransferase
  • reaction product was analyzed by a mass spectrometer (column: Imtakt Scherzo SS-C18 (2.0 mm ⁇ 150 mm) (Intact Corporation); column temperature: 45 ° C .; injection volume: 3 ⁇ l; moving bed: solution A / 0.2 % Formic acid, 0.2% acetic acid, and B solution / 100 mM ammonium acetate, 50% methanol; Gradient: 0% solution B (0 minutes)-0% solution B (1 minute)-2% solution B (4 minutes)- 45% solution B (15 minutes)-0% solution B (15.1 minutes)-0% solution B (20 minutes); flow rate 0.3 ml / min); mass analysis conditions: precursor ion 201, product ion 136, flag Mentor voltage 90V, collision energy 9, polarity negative.
  • mass analysis conditions precursor ion 201, product ion 136, flag Mentor voltage 90V, collision energy 9, polarity negative.
  • a peak of the target product (S-sulfocysteine) was confirmed at an elution time of 4 to 5 minutes. Further, for this product, a peak at m / z: 200 was detected for the sample not labeled with S-sulfocysteine, while the product detected a peak at m / z: 201. This indicates that the product is a compound isotopically labeled with 15 N.
  • Example 6 Synthesis of 15 N-labeled selenocysteine ([ 15 N] Cys-SeH) In 100 mM phosphate buffer (pH 7.6), 1 mM 15 N-labeled L-serine, 1 mM acetyl CoA, 1 mM sodium selenide (Na 2 Se). To this solution, 0.05 mg / ml of cysteine synthase (CysK) prepared by the method of Reference Example 1 and serine-O-acetyltransferase (CysE) prepared by the method of Reference Example 2 were added and reacted at 37 ° C. for 30 minutes. I let you.
  • reaction product was analyzed by a mass spectrometer (column: Imtakt Scherzo SS-C18 (2.0 mm ⁇ 150 mm) (Intact Corporation); column temperature: 45 ° C .; injection volume: 3 ⁇ l; moving bed: solution A / 0.2 % Formic acid, 0.2% acetic acid, and B solution / 100 mM ammonium acetate, 50% methanol; Gradient: 0% solution B (0 minutes)-0% solution B (1 minute)-2% solution B (4 minutes)- 45% solution B (15 minutes) ⁇ 0% solution B (15.1 minutes) ⁇ 0% solution B (20 minutes); flow rate 0.3 ml / min); mass analysis conditions: precursor ion 336.9, product ion 247 .8, fragmentor voltage 90V, collision energy 9, polarity positive.
  • mass analysis conditions precursor ion 336.9, product ion 247 .8, fragmentor voltage 90V, collision energy 9, polarity positive.
  • Selenocysteine was detected because almost all selenocysteine was oxidized in the reaction solution to form selenocystine (Cys-Se-Se-Cys) in which the molecules were linked by a disulfide bond.
  • a peak of selenocystine, an oxidant of the target product was confirmed at an elution time of 4 to 5 minutes. Further, for this product, a peak at m / z: 336.9 was detected for the sample not labeled with selenocystine, whereas the product detected a peak at m / z: 338.9. This indicates that the product is a compound isotopically labeled with 15 N.
  • Example 7 Synthesis of 34 S-labeled cysteine persulfide (Cys- 34 SSH) 0.1 mM 34 S-labeled cysteine and 0.1 mM disulfide prepared by the procedure of Example 1 in 100 mM phosphate buffer (pH 7.6) Sodium (Na 2 S 2 ) was mixed and reacted at 37 ° C. for 30 minutes.
  • Cys- 34 SSH 34 S-labeled cysteine persulfide
  • the reaction product was analyzed by a mass spectrometer (column: YMC Triat C18 plus (2.1 mm ⁇ 150 mm) (YMC Co., Ltd.); column temperature: 45 ° C .; injection volume: 1 ⁇ l; moving bed: solution A / 0.1% Formic acid and B solution / acetonitrile; 0.2% B solution isocratic; flow rate 0.2 ml / min); mass analysis conditions: precursor ion 153.9, product ion 73.1, fragmentor voltage 50 V, collision energy 10 Positive polarity. A peak of the target product (cysteine persulfide) was confirmed at an elution time of 3 to 4 minutes.
  • the product detected a peak at m / z: 155.9, whereas the product detected a peak at m / z: 153.9 for an unlabeled sample of cysteine persulfide. . This indicates that the product is a compound isotopically labeled with 34 S.
  • Example 8 34 S labeled-sulfocysteine during the synthesis 100mM phosphate buffer (pH 7.6) in (Cys- 34 SO 3 H), 1mM O- acetyl -L- serine, 1 mM 34 S labeled sodium sulfite (Na 2 34 SO 3 ).
  • 0.05 mg / ml of cysteine synthase (CysK) prepared by the method of Reference Example 1 was added and reacted at 37 ° C. for 30 minutes. Under the same conditions as described in Example 4, the reactants were analyzed with a mass spectrometer. A peak of the target product (sulfocysteine) was confirmed at an elution time of 3 to 4 minutes.
  • the product detected a peak at m / z: 170, whereas a peak at m / z: 168 was detected for the product of the product, which was not isotopically labeled with sulfocysteine. This indicates that the product is a compound isotopically labeled with 34 S.
  • Example 9 Synthesis of 34 S-labeled S-sulfocysteine (Cys-S 34 SO 3 H) 1 mM O-acetyl-L-serine, 1 mM 34 S-labeled thiosulfate in 100 mM phosphate buffer (pH 7.6) was dissolved at a sodium (Na 2 S 34 sO 3) . To this solution, 0.05 mg / ml of cysteine synthase (CysM) prepared by the method of Reference Example 1 was added and reacted at 37 ° C. for 30 minutes. Under the same conditions as described in Example 5, the reactants were analyzed with a mass spectrometer.
  • a peak of the target product (S-sulfocysteine) was confirmed at an elution time of 4 to 5 minutes.
  • a peak at m / z: 200 was detected for the sample not labeled with an isotope of S-sulfocysteine, whereas the product detected a peak at m / z: 202. This indicates that the product is a compound isotopically labeled with 34 S label.
  • Example 10 34 S-labeled-cystine polysulfide (Cys 34 S- 34 S (1-3 ) - 34 SCys) during synthesis 5% formic acid, 5 mM 34 S-labeled L- cysteine, and 25mM sodium nitrite (NaNO 2) And dissolved at 37 ° C. for 15 minutes. To this solution, 6 mM Na 2 34 S was added and further reacted at 37 ° C. for 15 minutes.
  • reaction product was analyzed by a mass spectrometer (column: YMC Triat C18 plus (2.1 mm ⁇ 50 mm) (YMC Co., Ltd.); column temperature: 45 ° C .; injection volume: 3 ⁇ l; moving bed: solution A / 0.1% Formic acid, and B solution / acetonitrile; isocratic: 0.2% B solution; flow rate 0.2 ml / min; mass analysis conditions: MS2 scan (m / z: 200-400), fragmentor voltage 90 V, polarity positive. elution time 2-3 minutes, 4-5 minutes, each product of interest 12-13 minutes.
  • MS2 scan m / z: 200-400
  • Example 11 Synthesis of 34 S-labeled N-acetylcysteine It was dissolved in 100 mM phosphate buffer (pH 7.6) to give 5 mM 34 S-labeled L-cysteine, 5 mM acetyl CoA, and reacted at 37 ° C for 30 minutes. It was.
  • the reaction product was analyzed by a mass spectrometer (column: YMC Triat C18 plus (2.1 mm ⁇ 50 mm) (YMC Co., Ltd.); column temperature: 45 ° C .; injection volume: 3 ⁇ l; moving bed: solution A / 0.1% Formic acid and solution B / acetonitrile; Gradient: 0.2% solution B (0 minutes) ⁇ 10% solution B (10 minutes) ⁇ 0.2% solution B (10.1 minutes) ⁇ 0.2% solution B ( Flow rate: 0.2 ml / min Mass spectrometry conditions: Precursor ion 166.2, Product ion 99.5, Fragmenter voltage 50V, Collision Energy 21, Polarity positive, target product at elution time 2-3 minutes A peak of (N-acetylcysteine) was confirmed, and a peak at m / z: 164 was detected for the product with no N-acetylcysteine isotopically labeled, whereas the product was A peak at m
  • coli was recovered by centrifugation and resuspended in lysis buffer (50 mM phosphate buffer, 300 mM sodium chloride, 10 mM imidazole 1 mg / ml lysozyme, 0.1 ⁇ g / ml DNase I pH 7.8). After standing on ice for 30 minutes, Escherichia coli was crushed with an ultrasonic crusher, centrifuged, and the supernatant was collected.
  • lysis buffer 50 mM phosphate buffer, 300 mM sodium chloride, 10 mM imidazole 1 mg / ml lysozyme, 0.1 ⁇ g / ml DNase I pH 7.8.
  • coli was recovered by centrifugation and resuspended in lysis buffer (50 mM phosphate buffer, 300 mM sodium chloride, 10 mM imidazole 1 mg / ml lysozyme, 0.1 ⁇ g / ml DNase I pH 7.8). After standing on ice for 30 minutes, Escherichia coli was crushed with an ultrasonic crusher, centrifuged, and the supernatant was collected.
  • lysis buffer 50 mM phosphate buffer, 300 mM sodium chloride, 10 mM imidazole 1 mg / ml lysozyme, 0.1 ⁇ g / ml DNase I pH 7.8.
  • cysteine and a cysteine derivative in which a sulfur atom is isotope-labeled can be efficiently synthesized, and this is useful in that the cysteine and the cysteine derivative can be stably supplied.

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Abstract

本発明は、イオウ原子を同位体標識したシステイン及びシステイン誘導体の合成方法に関する。本発明はまた、当該合成方法に使用するためのキットに関する。本発明により、イオウ原子を同位体標識したシステイン及びシステイン誘導体を簡便かつ効率よく合成することが可能になる。

Description

イオウ原子を同位体標識したシステイン及びシステイン誘導体の合成法の確立
　本発明は、イオウ原子を同位体標識したシステイン及びシステイン誘導体の合成方法に関する。本発明はまた、当該合成方法に使用するためのキットに関する。
　近年の質量分析技術の発展により、プロテオミクスやメタボロミクスなどの分析が盛んに行われている。質量分析による精密定量には安定同位体標識された化合物を内部標準として用いることが必要である。しかしながら、炭素原子や窒素原子の安定同位体は市販品が多種多様に存在する一方、イオウ原子の安定同位体は特注品を除きほとんど市販されていない。
　イオウ原子を同位体標識したアミノ酸の合成方法としてこれまでに知られている手法は、有機化学合成又は生合成によるものであった。有機化学合成によってイオウ原子を同位体標識したアミノ酸を合成する場合は、多段階の煩雑な工程を経る必要があり（非特許文献１）、収率についても０．０１％程度といった低いものであった。生合成による手法は、大腸菌等の微生物を、同位体標識されたイオウを含む基質を唯一のイオウ源として含む培地で培養し、当該微生物が産生したシステイン又はメチオニンを回収するという手法である（非特許文献２）。生合成による手法によって得られるイオウ原子が同位体標識されたシステインの収率は１０％程度であり、十分に高い収率とはいえない。
増田　裕一、他、"アミロイドβの毒性に関わるメチオニンラジカルの硫黄３３固体ＮＭＲによる研究"、[online]、平成２６年５月２６日、科学研究費助成事業データベース［平成２８年４月２８日検索］，インターネット（URL: https://kaken.nii.ac.jp/ja/file/KAKENHI-PROJECT-24780108/24780108seika.pdf) Albahari, S. R. and Shakun-Todorovi, M. B., Journal of Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals, Vol. 14, Issue 5, p.727-733, 1978
　上記のように、質量分析による精密定量を行うにあたっては安定同位体標識された化合物が必要である。このため、効率よく、高い収量でイオウ原子を同位体標識したシステイン及びシステイン誘導体を得る手法の確立が求められていた。
　本発明は、効率よくイオウ原子を同位体標識したシステイン及びシステイン誘導体を合成する方法および当該方法に使用するキットを提供する。
　以上に鑑み、本件の発明者らは、システインシンターゼに着目し、研究を開始した。鋭意検討の結果、システインシンターゼを用いる酵素反応により、イオウ原子を同位体標識したシステインおよびシステイン誘導体を効率よく合成できることを見出した。当該知見に基づいて、本発明は完成された。
　すなわち、一態様において、本発明は以下の通りであってよい。
　［１］イオウ原子を同位体標識したシステインの合成方法であって、システインシンターゼ（ＥＣ：２．５．１．４７）の存在下で、Ｏ－アセチル－Ｌ－セリン及びイオウ原子について同位体標識された基質を反応させる工程を含み、ここで当該イオウ原子について同位体標識された基質は硫化水素ナトリウム（ＮａＨＳ）、硫化ナトリウム（Ｎａ２Ｓ）、又は硫化水素（Ｈ２Ｓ）であり、そしてここで当該イオウ原子の同位体標識は、安定同位体３２Ｓ、安定同位体３４Ｓ、放射性同位体３３Ｓ及び放射性同位体３５Ｓからなる群より選択される、前記方法。
　［２］Ｏ－アセチル－Ｌ－セリンを、以下の工程：セリン－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ：２．３．１．３０）の存在下で、窒素および／または炭素原子について同位体標識されたセリンを反応させる；により得ることをさらに含む、上記［１］に記載の方法。
　［３］システインシンターゼが、システインシンターゼＡ（ＣｙｓＫ）又はシステインシンターゼＢ（ＣｙｓＭ）である、上記［１］又は［２］に記載の方法。
　［４］システインシンターゼＡが、サルモネラ属に属する微生物由来である、上記［３］に記載の方法。
　［５］システインシンターゼが、ヒスチジンタグを含む組換えタンパク質である、上記［１］～［４］のいずれか１項に記載の方法。
　［６］イオウ原子を同位体標識したシスチンの合成方法であって、上記［１］又は［２］に記載の方法にしたがってイオウ原子を同位体標識したシステインを合成し、当該システインを酸化剤の存在下で酸化することによりシスチンを得る工程を含む、前記方法。
　［７］酸化剤がヨウ素（Ｉ２）である、上記［６］に記載の方法。
　［８］システイン誘導体の合成方法であって、
（ｉ）システイン誘導体が、イオウ原子を同位体標識したスルホシステインであり、システインシンターゼの存在下で、Ｏ－アセチル－Ｌセリン及び亜硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ３）を反応させる工程を含み、ここでイオウ原子は、安定同位体３２Ｓ、安定同位体３４Ｓ、放射性同位体３３Ｓ及び放射性同位体３５Ｓからなる群より選択される；
（ｉｉ）システイン誘導体が、イオウ原子を同位体標識したＳ－スルホシステインであり、システインシンターゼＢの存在下で、Ｏ－アセチル－Ｌ－セリン及びチオ硫酸ナトリウム（Ｎａ２Ｓ２Ｏ３）を反応させる工程を含み、ここでイオウ原子は、安定同位体３２Ｓ、安定同位体３４Ｓ、放射性同位体３３Ｓ及び放射性同位体３５Ｓからなる群より選択される；
（ｉｉｉ）システイン誘導体が、イオウ原子を同位体標識したシステインパースルフィドであり、システインシンターゼの存在下で、Ｏ－アセチル－Ｌ－セリン及び二硫化ナトリウム（Ｎａ２Ｓ２）を反応させる工程を含み、ここでイオウ原子は、安定同位体３２Ｓ、安定同位体３４Ｓ、放射性同位体３３Ｓ及び放射性同位体３５Ｓからなる群より選択される；
（ｉｖ）システイン誘導体が、イオウ原子を同位体標識したシステインパースルフィドであり、（ａ）システインシンターゼの存在下で、Ｏ－アセチル－Ｌ－セリン及びイオウ原子について同位体標識された基質を反応させてイオウ原子を同位体標識したシステインを得る工程、ここで当該イオウ原子について同位体標識された基質は硫化水素ナトリウム（ＮａＨＳ）、又は硫化ナトリウム（Ｎａ２Ｓ）であり、そしてここで当該イオウ原子の同位体標識は、安定同位体３２Ｓ、安定同位体３４Ｓ、放射性同位体３３Ｓ及び放射性同位体３５Ｓからなる群より選択される、および（ｂ）工程（ａ）で得たイオウ原子を同位体標識したシステインと、二硫化ナトリウムを反応させる工程、を含む；または
（ｖ）システイン誘導体が、セレノシステインであり、システインシンターゼの存在下で、Ｏ－アセチル－Ｌ－セリン及びセレン化ナトリウム（Ｎａ２Ｓｅ）を反応させる工程を含む；
前記方法。
　［９］Ｏ－アセチル－Ｌ－セリンを、セリン－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ：２．３．１．３０）の存在下で、窒素および／または炭素原子について同位体標識されたセリンを反応させる；により得ることをさらに含む、上記［８］に記載の方法。
　［１０］システインシンターゼが、システインシンターゼＡ（ＣｙｓＫ）又はシステインシンターゼＢ（ＣｙｓＭ）である、上記［８］又は［９］に記載の方法。
　［１１］システインシンターゼＡが、サルモネラ属に属する微生物由来である、上記［１０］に記載の方法。
　［１２］システインシンターゼが、ヒスチジンタグを含む組換えタンパク質である、上記［８］～［１１］のいずれか１項に記載の方法。
　［１３］イオウ原子を同位体標識したシステインもしくはシスチン、またはシステイン誘導体を合成するためのキットであって、
システインシンターゼ；及び
イオウ原子について同位体標識された硫化水素ナトリウム（ＮａＨＳ）、硫化ナトリウム（Ｎａ２Ｓ）、亜硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ３）、チオ硫酸ナトリウム（Ｎａ２Ｓ２Ｏ３）、及び二硫化ナトリウム（Ｎａ２Ｓ２）からなる群より選択される少なくとも一つのイオウを含む基質、ここで当該イオウ原子の同位体標識は、安定同位体３２Ｓ、安定同位体３４Ｓ、放射性同位体３３Ｓ及び放射性同位体３５Ｓからなる群より選択される、またはセレン化ナトリウム（Ｎａ２Ｓｅ）；
を含む、前記キット。
　［１４］システイン誘導体の合成方法であって、
（ｉ）システイン誘導体が、イオウ原子を同位体標識したシスチンポリスルフィドであり、（ａ）上記［１］または［２］に記載の方法にしたがってイオウ原子を同位体標識したシステインを合成する工程、（ｂ）工程（ａ）で得たイオウ原子を同位体標識したシステインを酸化剤と反応させる工程、および（ｃ）さらに硫化ナトリウム（Ｎａ２Ｓ）を添加して反応させる工程、を含む；または
（ｉｉ）システイン誘導体が、イオウ原子を同位体標識したＮ－アセチルシステインであり、（ａ）上記［１］または［２］に記載の方法にしたがってイオウ原子を同位体標識したシステインを合成する工程、および（ｂ）工程（ａ）で得たイオウ原子を同位体標識したシステインをアセチル化剤と反応させる工程、を含む；
前記方法。
　本発明は、イオウ原子を同位体標識したシステイン及びシステイン誘導体を少ない工程かつ高収率で合成できる点で有用である。
　以下に本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。本明細書で特段に定義されない限り、本発明に関連して用いられる科学用語及び技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。
　酵素
（１）システインシンターゼ
　システインシンターゼ（ＥＣ：２．５．１．４７）は、生体内においてはシステインの生合成に関わる酵素であり、以下の化学反応：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
 を触媒する酵素である。すなわち、この酵素はＯ３－アセチル－Ｌ－セリンと硫化水素等を基質として、Ｌ－システインと酢酸を生成する。システイントランスフェラーゼは、トランスフェラーゼのファミリーに属しており、硫化水素等の硫黄源に対する基質特異性の差に基づき、システインシンターゼＡ（ＣｙｓＫ）及びシステインシンターゼＢ（ＣｙｓＭ）の２つの型が存在する。
　本発明に用いるシステインシンターゼは、上記の反応を触媒する酵素であれば、特に限定されない。好ましくはシステインシンターゼＡ又はシステインシンターゼＢであり、さらに好ましくはシステインシンターゼＡである。システインシンターゼの由来は特に限定されないが、例えば大腸菌やサルモネラ属などのグラム陰性菌、またスタフィロコッカス属やストレプトコッカス属などのグラム陽性菌由来のものが挙げられる。好ましくは、ネズミチフス菌（Salmonella enterica serover Typhimurium）由来のシステインシンターゼＡである。
　本発明に用いるシステインシンターゼは、微生物より抽出したものを用いてもよく、または遺伝子組換えにより調製したものであってもよい。遺伝子組換えにより調製したシステインシンターゼを用いる場合、ヒスチジンタグ（６～１１個の連続するヒスチジン残基からなるタグ）等で修飾されたものを用いてもよい。ヒスチジンタグは、ニッケル等の金属イオンへ高い親和性を有しているため、ヒスチジンタグで修飾された組換えタンパク質をニッケル等の金属を固定化した樹脂に担持させることができる。ヒスチジンタグを含むシステインシンターゼをニッケル等の金属を固定化した樹脂に担持させることにより、反応系から酵素を容易に回収することができるため、生成物との分離が容易であり、回収した酵素を再利用することも可能となる。この点において、ヒスチジンタグを含む組換えシステインシンターゼを用いることは好都合である。
　システインシンターゼＡ（ＣｙｓＫ）を用いる場合、ＣｙｓＫの酵素活性には補酵素であるピリドキサールリン酸（ＰＬＰ）が必要であることが知られている。ＣｙｓＫを組換え大腸菌から生成した場合、ＰＬＰはＣｙｓＫに結合した状態で精製される。したがって、本発明において、組換えシステインシンターゼＡを用いる場合は、必ずしも酵素反応の際にＰＬＰを反応系に加える必要はない。
　（２）セリン－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼ
　セリン－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ：２．３．１．３０）は、Ｌ－セリンとアセチルＣｏＡを基質としてＯ－アセチル－Ｌ－セリンとＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素であり、以下の化学反応：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
 を触媒する酵素である。
　本発明に用いるセリン－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼは、上記の反応を触媒する酵素であれば特に限定されないが、例えば大腸菌やサルモネラ属などのグラム陰性菌、またスタフィロコッカス属やストレプトコッカス属などのグラム陽性菌由来のものが挙げられる。セリン－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼは、微生物より抽出したものを用いてもよく、また遺伝子組換えにより調製したものであってもよい。遺伝子組換えにより調製したセリン－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼを用いる場合、上記（１）システインシンターゼについて述べた理由から、ヒスチジンタグ（６～１１個の連続するヒスチジン残基からなるタグ）等で修飾されたものを用いてもよい。
　同位体標識
　同位体とは、同一の原子番号を持つものの中性子数が異なる核種の関係をいう。本明細書において「同位体標識された」とは、ある化合物の特定の核種について、天然存在比が最も高い同位体以外の同位体に置換された状態を意味する。また、「同位体標識」は、ある化合物の特定の核種について、置換された天然存在比が最も高い同位体以外の同位体を意味する。同位体標識は、安定同位体であってもよく、放射性同位体であってもよい。ここで、放射性同位体は、崩壊により放射線を出す放射能を有するものであり、安定同位体は崩壊を起こさず安定な同位体である。
　本発明においてイオウ原子について用いる同位体標識は、イオウの同位体である限り特に限定されないが、好ましくは、安定同位体３２Ｓ、安定同位体３４Ｓ、放射性同位体３３Ｓ及び放射性同位体３５Ｓからなる群より選択される。より好ましくは、本発明においてイオウ原子について用いる同位体標識は安定同位体３４Ｓである。
　本発明においてセレン原子について用いる同位体標識は、セレンの同位体である限り特に限定されないが、好ましくは、安定同位体７８Ｓｅ、安定同位体７７Ｓｅ及び安定同位体７６Ｓｅからなる群より選択される。より好ましくはセレン原子について用いる同位体標識は安定同位体７８Ｓｅである。
　システイン及びシステイン誘導体
　システインは、天然アミノ酸の一種であり、特に明記しない限り、Ｌ－システインである。
　本明細書においてイオウ原子を同位体標識したシステイン、とは、システインのメルカプト基（－ＳＨ）のイオウ原子が同位体標識されたシステインを意味する。
　本明細書においてシステイン誘導体には、以下のものが含まれる：
（ｉ）シスチン（Ｃｙｓ－Ｓ－Ｓ－Ｃｙｓ）であって、当該分子内のイオウ原子の少なくとも１つが同位体標識されている化合物；
（ｉｉ）スルホシステイン（Ｃｙｓ－ＳＯ３Ｈ）、またはＳ－スルホシステイン（Ｃｙｓ－ＳＳＯ３Ｈ）であって、当該分子内のイオウ原子が同位体標識されている化合物；
（ｉｉｉ）システインパースルフィド（Ｃｙｓ－ＳＳＨ）であって、当該分子内のイオウ原子の少なくとも１つが同位体標識されている化合物；
（ｉｖ）セレノシステイン（Ｃｙｓ－ＳｅＨ）、ここでセレン原子は同位体標識されていなくてもよく、または同位体標識されていてもよい；
（ｖ）シスチンポリスルフィド（Ｃｙｓ－Ｓ－Ｓ（１－３）－Ｓ－Ｃｙｓ）であって、当該分子内のイオウ原子の少なくとも１つが同位体標識されている化合物；
（ｖｉ）Ｎ－アセチルシステインであって、当該分子内のイオウ原子が同位体標識されている化合物。
　システインの合成方法
　一態様において、システインシンターゼの存在下で、Ｏ－アセチル－Ｌ－セリン及びイオウ原子について同位体標識された基質を反応させる工程を含む、イオウ原子を同位体標識したシステインの合成方法、を提供する。
　イオウ原子について同位体標識された基質は、硫化水素ナトリウム（ＮａＨＳ）、硫化ナトリウム（Ｎａ２Ｓ）、又は硫化ナトリウムにより派生されるものであってもよい硫化水素（Ｈ２Ｓ）である。イオウ原子の同位体標識の種類いついては、先に「同位体標識」の項目において記載したとおりである。
　反応条件は、システインシンターゼの酵素活性が保持される条件であれば特に限定されない。例えば、２５～３７℃、ｐＨ７～８等が挙げられる。
　シスチンの合成方法
　一態様において、以下の工程：
（ｉ）システインシンターゼの存在下で、Ｏ－アセチル－Ｌ－セリン及びイオウ原子について同位体標識された基質を反応させる；
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られたイオウ原子を同位体標識したシステインを酸化剤により酸化させることによりシスチンを得る；
を含む、イオウ原子を同位体標識したシスチンの合成方法を提供する。
　シスチンは、３，３’－ジチオビス（２－アミノプロピオン酸）であり、２分子のシステインにおけるメルカプト基（－ＳＨ）がジスルフィド結合を形成することにより連結された構造を有する。本明細書において、シスチンを便宜上、Ｃｙｓ－Ｓ－Ｓ－Ｃｙｓと表記することがある。
　上記工程（ｉ）は、上記「システインの合成方法」の項目において説明したとおりに行うことができる。
　上記工程（ｉｉ）に用いる酸化剤は、メルカプト基を酸化することによりジスルフィド結合の形成を促進することができる試薬であれば特に限定されないが、例えばヨウ素（Ｉ２）、重金属、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）等を好適に使用できる。好ましい態様において、酸化剤はヨウ素である。
　上記工程（ｉｉ）の反応条件は、ジスルフィド結合の形成に適した条件であれば、特に限定されないが、例えば、２５℃～３７℃、ｐＨ７～８などの条件が挙げられる。
　スルホシステインの合成方法
　一態様において、システインシンターゼの存在下で、Ｏ－アセチル－Ｌ－セリンおよびイオウ原子について同位体標識された亜硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ３）を反応させる工程を含む、イオウ原子を同位体標識したスルホシステインの合成方法、を提供する。イオウ原子の同位体標識の種類については、先に「同位体標識」の項目において記載したとおりである。
　スルホシステインの構造は次式：Ｈ２Ｎ－ＣＨ（ＣＨ２－ＳＯ３Ｈ）－ＣＯＯＨ、で表すことができる。本明細書において、スルホシステインを便宜上、Ｃｙｓ－ＳＯ３Ｈと表記することがある。
　反応条件は、システインシンターゼの酵素活性が保持される条件であれば特に限定されない。例えば、２５～３７℃、ｐＨ７～８等が挙げられる。
　Ｓ－スルホシステインの合成方法
　一態様において、システインシンターゼＢの存在下で、Ｏ－アセチル－Ｌ－セリンおよびイオウ原子について同位体標識されたチオ硫酸ナトリウム（Ｎａ２Ｓ２Ｏ３）を反応させる工程を含む、イオウ原子を同位体標識したＳ－スルホシステインの合成方法、を提供する。イオウ原子の同位体標識の種類については、先に「同位体標識」の項目において記載したとおりである。
　Ｓ－スルホシステインの構造は次式：Ｈ２Ｎ－ＣＨ（ＣＨ２－ＳＳＯ３Ｈ）－ＣＯＯＨ、で表すことができる。本明細書において、Ｓ－スルホシステインを便宜上、Ｃｙｓ－ＳＳＯ３Ｈと表記することがある。
　反応条件は、システインシンターゼＢの酵素活性が保持される条件であれば特に限定されない。例えば、２５～３７℃、ｐＨ７～８等が挙げられる。
　システインパースルフィドの合成方法
　一態様において、システインシンターゼの存在下で、Ｏ－アセチル－Ｌ－セリンおよびイオウ原子について同位体標識された二硫化ナトリウム（Ｎａ２Ｓ２）を反応させる工程を含む、イオウ原子を同位体標識したシステインパースルフィドの合成方法、を提供する。イオウ原子の同位体標識の種類については、先に「同位体標識」の項目において記載したとおりである。
　システインパースルフィドの構造は次式：Ｈ２Ｎ－ＣＨ（ＣＨ２－ＳＳＨ）－ＣＯＯＨ、で表すことができる。本明細書において、システインパースルフィドを便宜上、Ｃｙｓ－ＳＳＨと表記することがある。
　反応条件は、システインシンターゼの酵素活性が保持される条件であれば特に限定されない。例えば、３０～４２℃、ｐＨ７～８等が挙げられる。
　別の態様において、上記「システインの合成方法」の項目に記載した方法により得たイオウ原子を同位体標識したシステインと、二硫化ナトリウムを反応させる工程を含む、イオウ原子を同位体標識したシステインパースルフィドの合成方法を提供する。この場合は特に、システインのβ炭素に結合しているイオウ原子は同位体標識されているが、末端のＳＨ基は天然存在比が最も高い同位体であってもよい。イオウ原子を同位体標識したシステインと、二硫化ナトリウムを反応させる条件は、パースルフィドが形成される条件であれば特に限定されない。例えば、３０～４２℃が挙げられる。
　セレノシステインの合成方法
　一態様において、システインシンターゼの存在下で、Ｏ－アセチル－Ｌ－セリンおよびセレン化ナトリウム（Ｎａ２Ｓｅ）を反応させる工程を含む、セレノシステインの合成方法、を提供する。セレン化ナトリウムは、同位体標識されていてもよく、同位体標識されていなくてもよい。セレン化ナトリウムが同位体標識されている場合、セレン原子が同位体標識されたセレノシステインが得られる。セレン原子の同位体標識の種類については、先に「同位体標識」の項目において記載したとおりである。
　セレノシステインの構造は次式：Ｈ２Ｎ－ＣＨ（ＣＨ２－ＳｅＨ）－ＣＯＯＨ、で表すことができる。すなわち、セレノシステインは、システインのイオウ原子がセレンに置換された構造を有する。本明細書において、セレノシステインを便宜上、Ｃｙｓ－ＳｅＨと表記することがある。
　反応条件は、システインシンターゼの酵素活性が保持される条件であれば特に限定されない。例えば、２５～３７℃、ｐＨ７～８等が挙げられる。
　シスチンポリスルフィドの合成方法
　一態様において、
（ｉ）システインシンターゼの存在下で、Ｏ－アセチル－Ｌ－セリンおよびイオウ原子について同位体標識された基質を反応させる；
（ｉｉ）工程（ｉ）で得たイオウ原子を同位体標識したシステインを酸化剤亜硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ２）と反応させる；
（ｉｉｉ）さらに硫化ナトリウム（Ｎａ２Ｓ）を添加して反応させることにより、シスチンポリスルフィドを得る；を含む、イオウ原子を同位体標識したシスチンポリスルフィドの合成方法を提供する。
　シスチンポリスルフィドの構造は次式：ＨＮ２－ＣＨ（ＣＯＯＨ）－ＣＨ２－Ｓ－Ｓ（１－３）－Ｓ－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＯＯＨ）－ＮＨ２、で表すことができる。本明細書においてシスチンポリスルフィドを便宜上、Ｃｙｓ－Ｓ－Ｓ（１－３）－Ｓ－Ｃｙｓと表記することがある。
　上記工程（ｉ）は、上記「システインの合成方法」の項目において説明した通りに行うことができる。
　上記工程（ｉｉ）に用いる酸化剤は、メルカプト基から水素原子を引き抜く反応を促進することができる試薬であれば特に限定されないが、例えば亜硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ２）、ヨウ素（Ｉ２）、金属塩（例えば、硫化鉄（II）（ＦｅＳＯ４）、塩化鉄（II）（ＦｅＣｌ２）、塩化マンガン（II）（ＭｎＣｌ２）、酢酸マンガン（III）（Ｍｎ（ＯＣＯＣＨ３）３、硫化銅（II）（ＣｕＳＯ４）、塩化亜鉛（ＺｎＣｌ２））、金属を含む酵素（例えば、ヘミン、スーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ）、カタラーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ））等を好適に使用できる。好ましい態様において、酸化剤は亜硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ２）である。
　上記工程（ｉｉｉ）に用いる硫化ナトリウム（Ｎａ２Ｓ）は、イオウ原子について同位体標識されたものであってもよく、イオウ原子について同位体標識されていないものであってもよい。
　上記（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の反応条件は、ポリスルフィド結合の形成に適した条件であれば特に限定されないが、例えば、２５～３７℃が挙げられる。
　Ｎ－アセチルシステインの合成方法
　一態様において、以下の工程：
（ｉ）システインシンターゼの存在下で、Ｏ－アセチル－Ｌ－セリンおよびイオウ原子について同位体標識された基質を反応させる；
（ｉｉ）工程（ｉ）で得たイオウ原子を同位体標識したシステインをアセチル化剤と反応させることにより、Ｎ－アセチルシステインを得る；
を含む、イオウ原子を同位体標識したＮ－アセチルシステインの合成方法を提供する。
　Ｎ－アセチルシステインの構造は次式：ＣＨ３－ＣＯＮＨ－Ｃ（ＣＨ２－ＳＨ）－ＣＯＯＨで表すことができる。
　上記工程（ｉ）は、上記「システインの合成方法」の項目において説明した通りに行うことができる。
　上記工程（ｉｉ）に用いるアセチル化剤は、システインのアミノ基をアセチル化することができる試薬であれば特に限定されない。例えば、アセチルＣｏＡ、無水酢酸等を好適に使用できる。好ましい態様において、アセチル化剤はアセチルＣｏＡである。
　上記工程（ｉｉ）の反応条件は、アセチル化反応に適した条件であれば特に限定されないが、例えば２５℃～３７℃、ｐＨ７～８などの条件が挙げられる。
　窒素及び／又は炭素原子が同位体標識されているＯ－アセチル－Ｌ－セリンの提供
　上記のシステイン、シスチン、スルホシステイン、Ｓ－スルホシステイン、システインパースルフィド、シスチンポリスルフィド、Ｎ－アセチルシステインまたはセレノシステインの合成方法において、窒素および／または炭素原子が同位体標識されているＯ－アセチル－Ｌ－セリンを、システインシンターゼによる反応に用いることにより、窒素および／または炭素ならびにイオウが同位体標識された（すなわち、窒素およびイオウが同位体標識された、炭素およびイオウが同位体標識された、窒素、炭素及びイオウが同位体標識された）システイン、シスチン、スルホシステイン、Ｓ－スルホシステイン、システインパースルフィド、シスチンポリスルフィド、Ｎ－アセチルシステインまたはセレノシステインを得ることができる。
　この目的のため、別の態様において、上記の方法において、Ｏ－アセチル－Ｌ－セリンを、以下の工程：セリン－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼの存在下で、窒素および／または炭素原子について同位体標識されたセリンを反応させる；により得ることをさらに含む方法を提供する。窒素および／または炭素原子についての同位体標識は、それぞれ、安定同位体１５Ｎおよび／または１３Ｃであってよい。
　システインおよびシステイン誘導体の回収および精製
　上記の合成方法または上記の反応により得られた、イオウ原子が同位体標識されたシステインまたはシステイン誘導体、あるいは、窒素および／または炭素ならびにイオウが同位体標識されたシステインまたはシステイン誘導体は、クロマトグラフィーなど当業者に公知の手法により回収・精製することができる。
　キット
　一態様において、イオウ原子を同位体標識したシステインもしくはシスチン、又はシステイン誘導体を合成するためのキットを提供する。当該キットは、システインシンターゼ；及びイオウ原子について同位体標識された基質、又はセレン化ナトリウム（Ｎａ２Ｓｅ）（ここで、セレン化ナトリウムのセレン原子は同位体標識されていてもよく、されていなくてもよい）；を含む。
　キットに含まれるシステインシンターゼは、先に「システインシンターゼ」の項目において記載したとおりである。
　イオウ原子について同位体標識された基質は、合成目的の化合物の種類に応じて、イオウ原子について同位体標識された硫化水素ナトリウム（ＮａＨＳ）、硫化ナトリウム（Ｎａ２Ｓ）、亜硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ３）、チオ硫酸ナトリウム（Ｎａ２Ｓ２Ｏ３）、及び二硫化ナトリウム（Ｎａ２Ｓ２）からなる群より選択される少なくとも一つの基質である。ここでイオウ原子の同位体標識の種類については、先に「同位体標識」の項目において記載したとおりである。
　セレン原子を同位体標識する場合の種類については、先に「同位体標識」の項目において記載した通りである。
　以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
　実施例１： ３４ Ｓ標識システイン（Ｃｙｓ－ ３４ ＳＨ）の合成
　１００ｍＭ　リン酸バッファー（ｐＨ７．６）中、２０ｍＭ　Ｏ－アセチル－Ｌ－セリン、２０ｍＭ　硫化水素ナトリウム（Ｎａ２ ３４Ｓ）となるように溶解した。この溶液に、参考例１の手法で調製したシステインシンターゼ（ＣｙｓＫ）　０．０５ｍｇ／ｍｌを添加し、３７℃で１時間反応させた。
　システイン生成の確認を容易にする目的で、上記の反応後、反応液中にメタノール及び過剰量のモノブロモビマン（ＭＢＢ）を添加し、３７℃で１５分間インキュベートした。
　反応物を高速液体クロマトグラフィーにより分析した（カラム：YMC Triat C18 plus（4.6 mm×150 mm）(株式会社ワイエムシィ）；カラム温度：３５℃；インジェクション容量：１０μｌ；移動層：Ａ液／０．１％ギ酸、及びＢ液／アセトニトリル；グラジエント：５％Ｂ液（０分）－８０％Ｂ液（２２分）－８０％Ｂ液（２３分）－５％Ｂ液（２４分）－５％Ｂ液（３０分）；流速０．８ｍｌ／分）。溶出時間９～１０分に目的の生成物（システイン－ビマン）のピークが確認できた。ピーク面積から、１５ｍＭの生成物が生じていることが確認された。２０ｍＭのＯ－アセチルセリン及び硫化水素ナトリウムを出発原料として用いたので、これは、反応収率７５％であることを意味する。
　また、この生成物について質量分析を行ったところ、システイン－ビマンの同位体標識されていない標品についてｍ／ｚ：３１２．１のピークを検出したのに対し、生成物はｍ／ｚ：３１４．１のピークを検出した。このことは、生成物が、安定同位体３４Ｓで同位体標識された化合物であることを示している。
　実施例２： ３４ Ｓ標識シスチン（Ｃｙｓ－ ３４ Ｓ－ ３４ Ｓ－Ｃｙｓ）の合成
　１００ｍＭ　リン酸バッファー（ｐＨ７．６）中、２０ｍＭ　Ｏ－アセチル－Ｌ－セリン、２０ｍＭ　硫化水素ナトリウム（Ｎａ２ ３４Ｓ）となるように溶解した。この溶液に、参考例１の手法で調製したシステインシンターゼ（ＣｙｓＫ）　０．０５ｍｇ／ｍｌを添加し、３７℃で１時間反応させた。
　上記の反応後、ヨウ素（Ｉ２）を４０ｍＭになるように反応液に添加し、３７℃で１０分間インキュベートした。
　反応物を高速液体クロマトグラフィーにより分析した（カラム：Intrada Amino Acid(100×3 mm)（インタクト株式会社）；カラム温度：３５℃；インジェクション容量：１０μｌ；移動層：Ａ液／アセトニトリル、及びＢ液／２０ｍＭ　ギ酸アンモニウム；グラジエント：１４％Ｂ液（０分）－１４％Ｂ液（３分）－１００％Ｂ液（２０分）－１４％Ｂ液（２０．５分）－１４％Ｂ液（３０分）；流速０．６ｍｌ／分)。溶出時間約１８分に、目的の生成物（シスチン）のピークが確認できた。反応収率はほぼ１００％であった。
　また、この生成物について質量分析を行ったところ、シスチンの同位体標識されていない標品についてｍ／ｚ：２４０．９のピークを検出したのに対し、生成物はｍ／ｚ：２４４．９のピークを検出した。このことは、生成物が安定同位体３４Ｓで同位体標識された化合物であることを示している。
　実施例３： １５ Ｎ標識・ ３４ Ｓ標識システイン（[ １５ Ｎ]Ｃｙｓ－ ３４ ＳＨ）の合成
１００ｍＭ　リン酸バッファー（ｐＨ７．６）中、１ｍＭ　１５Ｎ標識Ｌ－セリン、１ｍＭ　アセチルＣｏＡ、１ｍＭ　硫化水素ナトリウム（Ｎａ２ ３４Ｓ）となるように溶解した。この溶液に、参考例１の手法で調製したシステインシンターゼ（ＣｙｓＫ）　０．０５ｍｇ／ｍｌと参考例２の手法で調製したセリン－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼ（ＣｙｓＥ）を添加し、３７℃で５分反応させた。システイン生成の確認を容易にする目的で、上記の反応後、反応液中にメタノール及び過剰量のモノブロモビマン（ＭＢＢ）を添加し、３７℃で１５分間インキュベートした。
　反応物を高速液体クロマトグラフィーにより分析した（カラム：YMC Triat C18 plus（4.6 mm×150 mm）(株式会社ワイエムシィ)；カラム温度：３５℃；インジェクション容量：１０μｌ；移動層：Ａ液／０．１％ギ酸、及びＢ液／アセトニトリル；グラジエント：５％Ｂ液（０分）－８０％Ｂ液（２２分）－８０％Ｂ液（２３分）－５％Ｂ液（２４分）－５％Ｂ液（３０分）；流速０．８ｍｌ／分）。溶出時間９～１０分に目的の生成物（システイン－ビマン）のピークが確認できた。また、この生成物について質量分析を行ったところ、システイン－ビマンの同位体標識されていない標品についてｍ／ｚ：３１２．１のピークを検出したのに対し、生成物はｍ／ｚ：３１５．１のピークを検出した。このことは、生成物が、安定同位体３４Ｓと１５Ｎで同位体標識された化合物であることを示している。
　実施例４： １５ Ｎ標識・スルホシステイン（[ １５ Ｎ]Ｃｙｓ－ＳＯ ３ Ｈ）の合成
１００ｍＭ　リン酸バッファー（ｐＨ７．６）中、１ｍＭ　１５Ｎ標識Ｌ－セリン、１ｍＭ　アセチルＣｏＡ、１ｍＭ　亜硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ３）となるように溶解した。この溶液に、参考例１の手法で調製したシステインシンターゼ（ＣｙｓＫ）　０．０５ｍｇ／ｍｌと参考例２の手法で調製したセリン－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼ（ＣｙｓＥ）を添加し、３７℃で３０分反応させた。反応物を質量分析機により分析した（カラム：Imtakt Scherzo SS-C18（2.0 mm×150 mm）(インタクト株式会社)；カラム温度：４５℃；インジェクション容量：３μｌ；移動層：Ａ液／０．２％ギ酸、０．２％酢酸、及びＢ液／１００ｍＭ酢酸アンモニウム、５０％メタノール；グラジエント：０％Ｂ液（０分）－０％Ｂ液（１分）－２％Ｂ液（４分）－４５％Ｂ液（１５分）－０％Ｂ液（１５．１分）－０％Ｂ液（２０分）；流速０．３ｍｌ／分）；質量分析条件：プレカーサーイオン１６８、プロダクトイオン８１、フラグメンター電圧９０Ｖ、コリジョンエナジー２１、極性ネガティブ。溶出時間３～４分に目的の生成物（スルホシステイン）のピークが確認できた。また、この生成物のスルホシステインの同位体標識されていない標品についてｍ／ｚ：１６８のピークを検出したのに対し、生成物はｍ／ｚ：１６９のピークを検出した。このことは、生成物が、１５Ｎで同位体標識された化合物であることを示している。
　実施例５： １５ Ｎ標識・Ｓ－スルホシステイン（[ １５ Ｎ]Ｃｙｓ－ＳＳＯ ３ Ｈ）の合成
１００ｍＭ　リン酸バッファー（ｐＨ７．６）中、１ｍＭ　１５Ｎ標識Ｌ－セリン、１ｍＭ　アセチルＣｏＡ、１ｍＭ　チオ硫酸ナトリウム（Ｎａ２Ｓ２Ｏ３）となるように溶解した。この溶液に、参考例１の手法で調製したシステインシンターゼ（ＣｙｓＭ）　０．０５ｍｇ／ｍｌと参考例２の手法で調製したセリン－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼ（ＣｙｓＥ）を添加し、３７℃で３０分反応させた。反応物を質量分析機により分析した（カラム：Imtakt Scherzo SS-C18（2.0 mm×150 mm）(インタクト株式会社)；カラム温度：４５℃；インジェクション容量：３μｌ；移動層：Ａ液／０．２％ギ酸、０．２％酢酸、及びＢ液／１００ｍＭ酢酸アンモニウム、５０％メタノール；グラジエント：０％Ｂ液（０分）－０％Ｂ液（１分）－２％Ｂ液（４分）－４５％Ｂ液（１５分）－０％Ｂ液（１５．１分）－０％Ｂ液（２０分）；流速０．３ｍｌ／分）；質量分析条件：プレカーサーイオン２０１、プロダクトイオン１３６、フラグメンター電圧９０Ｖ、コリジョンエナジー９、極性ネガティブ。溶出時間４～５分に目的の生成物（Ｓ－スルホシステイン）のピークが確認できた。また、この生成物についてＳ－スルホシステインの同位体標識されていない標品についてｍ／ｚ：２００のピークを検出したのに対し、生成物はｍ／ｚ：２０１のピークを検出した。このことは、生成物が、１５Ｎで同位体標識された化合物であることを示している。
　実施例６： １５ Ｎ標識・セレノシステイン（[ １５ Ｎ]Ｃｙｓ－ＳｅＨ）の合成
１００ｍＭ　リン酸バッファー（ｐＨ７．６）中、１ｍＭ　１５Ｎ標識Ｌ－セリン、１ｍＭ　アセチルＣｏＡ、１ｍＭ　セレン化ナトリウム（Ｎａ２Ｓｅ）となるように溶解した。この溶液に、参考例１の手法で調製したシステインシンターゼ（ＣｙｓＫ）　０．０５ｍｇ／ｍｌと参考例２の手法で調製したセリン－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼ（ＣｙｓＥ）を添加し、３７℃で３０分反応させた。反応物を質量分析機により分析した（カラム：Imtakt Scherzo SS-C18（2.0 mm×150 mm）(インタクト株式会社)；カラム温度：４５℃；インジェクション容量：３μｌ；移動層：Ａ液／０．２％ギ酸、０．２％酢酸、及びＢ液／１００ｍＭ酢酸アンモニウム、５０％メタノール；グラジエント：０％Ｂ液（０分）－０％Ｂ液（１分）－２％Ｂ液（４分）－４５％Ｂ液（１５分）－０％Ｂ液（１５．１分）－０％Ｂ液（２０分）；流速０．３ｍｌ／分）；質量分析条件：プレカーサーイオン３３６．９、プロダクトイオン２４７．８、フラグメンター電圧９０Ｖ、コリジョンエナジー９、極性ポジティブ。なお、セレノシステインはほぼ全てが反応液中で酸化され、分子同士がジスルフィド結合で連結したセレノシスチン（Ｃｙｓ－Ｓｅ－Ｓｅ－Ｃｙｓ）を形成するため、セレノシスチンを検出した。溶出時間４～５分に目的の産物の酸化体であるセレノシスチンのピークが確認できた。また、この生成物についてセレノシスチンの同位体標識されていない標品についてｍ／ｚ：３３６．９のピークを検出したのに対し、生成物はｍ／ｚ：３３８．９のピークを検出した。このことは、生成物が、１５Ｎで同位体標識された化合物であることを示している。
　実施例７： ３４ Ｓ標識システインパースルフィド（Ｃｙｓ－ ３４ ＳＳＨ）の合成
　１００ｍＭ　リン酸バッファー（ｐＨ７．６）中、実施例１の手法で調製した０．１ｍＭ ３４Ｓ標識システインと０．１ｍＭ 二硫化ナトリウム（Ｎａ2Ｓ2）を混合し、３７℃で３０分反応させた。
　反応物を質量分析機により分析した（カラム：YMC Triat C18 plus（2.1 mm×150 mm）(株式会社ワイエムシィ)；カラム温度：４５℃；インジェクション容量：１μｌ；移動層：Ａ液／０．１％ギ酸、及びＢ液／アセトニトリル；０.２％Ｂ液イソクラティック；流速０．２ｍｌ／分）；質量分析条件：プレカーサーイオン１５３．９、プロダクトイオン７３．１、フラグメンター電圧５０Ｖ、コリジョンエナジー１０、極性ポジティブ。溶出時間３～４分に目的の生成物（システインパースルフィド）のピークが確認できた。また、この生成物についてシステインパースルフィドの同位体標識されていない標品についてｍ／ｚ：１５３．９のピークを検出したのに対し、生成物はｍ／ｚ：１５５．９のピークを検出した。このことは、生成物が、３４Ｓで同位体標識された化合物であることを示している。
　実施例８： ３４ Ｓ標識・スルホシステイン（Ｃｙｓ－ ３４ ＳＯ ３ Ｈ）の合成
　１００ｍＭ　リン酸バッファー（ｐＨ７．６）中、１ｍＭ　Ｏ－アセチル－Ｌ－セリン、１ｍＭ　３４Ｓ標識・亜硫酸ナトリウム（Ｎａ２ ３４ＳＯ３）となるように溶解した。この溶液に、参考例１の手法で調製したシステインシンターゼ（ＣｙｓＫ）　０．０５ｍｇ／ｍｌを添加し、３７℃で３０分反応させた。実施例４に記載したものと同じ条件で、反応物を質量分析機により分析した。溶出時間３～４分に目的の生成物（スルホシステイン）のピークが確認できた。また、この生成物のスルホシステインの同位体標識されていない標品についてｍ／ｚ：１６８のピークを検出したのに対し、生成物はｍ／ｚ：１７０のピークを検出した。このことは、生成物が、３４Ｓで同位体標識された化合物であることを示している。
　実施例９： ３４ Ｓ標識・Ｓ－スルホシステイン（Ｃｙｓ－Ｓ ３４ ＳＯ ３ Ｈ）の合成
１００ｍＭ　リン酸バッファー（ｐＨ７．６）中、１ｍＭ　Ｏ－アセチル－Ｌ－セリン、１ｍＭ　３４Ｓ標識・チオ硫酸ナトリウム（Ｎａ２Ｓ３４ＳＯ３）となるように溶解した。この溶液に、参考例１の手法で調製したシステインシンターゼ（ＣｙｓＭ）　０．０５ｍｇ／ｍｌを添加し、３７℃で３０分反応させた。実施例５に記載したものと同じ条件で、反応物を質量分析機により分析した。溶出時間４～５分に目的の生成物（Ｓ－スルホシステイン）のピークが確認できた。また、この生成物についてＳ－スルホシステインの同位体標識されていない標品についてｍ／ｚ：２００のピークを検出したのに対し、生成物はｍ／ｚ：２０２のピークを検出した。このことは、生成物が、３４Ｓ標識で同位体標識された化合物であることを示している。
　実施例１０： ３４ S標識・シスチンポリスルフィド（Ｃｙｓ ３４ Ｓ－ ３４ Ｓ (１－３) － ３４ ＳＣｙｓ）の合成
５％ギ酸中、５ｍＭ　34Ｓ標識Ｌ－システイン、２５ｍＭ　亜硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ２）となるように溶解し、３７℃で１５分反応させた。この溶液に、６ｍＭ　Ｎａ２ ３４Ｓを添加し、さらに３７℃で１５分反応させた。反応物を質量分析機により分析した（カラム：YMC Triat C18 plus（2.1 mm×50 mm）(株式会社ワイエムシィ)；カラム温度：４５℃；インジェクション容量：３μｌ；移動層：Ａ液／０．１％ギ酸、及びＢ液／アセトニトリル；イソクラティック：０．２％Ｂ液；流速０．２ｍｌ／分；質量分析条件：ＭＳ２スキャン（ｍ／ｚ：２００－４００）、フラグメンター電圧９０Ｖ、極性ポジティブ。溶出時間２～３分、４～５分、１２～１３分にそれぞれ目的の生成物（シスチンポリスルフィド：Ｃｙｓ３４Ｓ－３４Ｓ(１－３)－３４ＳＣｙｓ）のピークが確認できた。また、この生成物についてシスチンポリスルフィドの同位体標識されていない標品についてｍ／ｚ：２７３．０、３０５．０、３３７．０のピークをそれぞれ検出したのに対し、生成物はｍ／ｚ：２７８．９、３１２．９、３４６．８のピークをそれぞれ検出した。このことは、生成物が、３４Ｓで同位体標識された化合物であることを示している。
　実施例１１： ３４ Ｓ標識　Ｎ-アセチルシステインの合成
１００ｍＭ　リン酸バッファー（ｐＨ７．６）中、５ｍＭ　34Ｓ標識Ｌ－システイン、５ｍＭ　アセチルＣｏＡ、となるように溶解し、３７℃で３０分反応させた。反応物を質量分析機により分析した（カラム：YMC Triat C18 plus（2.1 mm×50 mm）(株式会社ワイエムシィ)；カラム温度：４５℃；インジェクション容量：３μｌ；移動層：Ａ液／０．１％ギ酸、及びＢ液／アセトニトリル；グラジエント：０．２％Ｂ液（０分）－１０％Ｂ液（１０分）－０．２％Ｂ液（１０．１分）－０．２％Ｂ液（１５分）；流速０．２ｍｌ／分。質量分析条件：プレカーサーイオン１６６．２、プロダクトイオン９９．５、フラグメンター電圧５０Ｖ、コリジョンエナジー２１、極性ポジティブ。溶出時間２～３分に目的の生成物（Ｎ-アセチルシステイン）のピークが確認できた。また、この生成物についてＮ-アセチルシステインの同位体標識されていない標品についてｍ／ｚ：１６４のピークを検出したのに対し、生成物はｍ／ｚ：１６６のピークを検出した。このことは、生成物が、３４Ｓで同位体標識された化合物であることを示している。
　参考例１：システインシンターゼ（ＣｙｓＫ、ＣｙｓＭ）の調製
ネズミチフス菌由来のヒスチジンタグ融合ＣｙｓＫおよびＣｙｓＭを発現する大腸菌をＬＢ培地にて３７℃で振盪培養した。大腸菌の濁度がＯＤ.６００＝０．５になってから０．５ｍＭ　ＩＰＴＧを添加し、さらに３０℃で２時間振盪培養した。大腸菌を遠心分離で回収し、リシスバッファー（５０ｍＭ　リン酸バッファー、３００ｍＭ　塩化ナトリウム、１０ｍＭ　イミダゾール　１ｍｇ／ｍｌ　リゾチーム、０．１μｇ／ｍｌ　ＤＮアーゼＩ　ｐＨ７．８）で再懸濁した。氷上で３０分静置後、超音波破砕機にて大腸菌を破砕し、遠心分離し、上清を回収した。上清をニッケル固相化アガロース充填カラムに通した後、洗浄バッファー（５０ｍＭ　リン酸バッファー、３００ｍＭ　塩化ナトリウム、２０ｍＭ　イミダゾール　ｐＨ７．８）にてカラムを２回洗浄した後、溶出バッファー（５０ｍＭ　リン酸バッファー、３００ｍＭ　塩化ナトリウム、３００ｍＭ　イミダゾール　ｐＨ７．８）でヒスチジンタグ融合ＣｙｓＫを溶出した。溶出したヒスチジンタグ融合ＣｙｓＫを５０ｍＭ　リン酸バッファー　ｐＨ７．８で平衡化した脱塩カラムに通し、得られた溶液をシステインシンターゼ（ＣｙｓＫ、ＣｙｓＭ）として使用した。
　参考例２：セリン－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼ（ＣｙｓＥ）の調製
ネズミチフス菌由来のヒスチジンタグ融合ＣｙｓＥを発現する大腸菌をＬＢ培地にて３７℃で振盪培養した。大腸菌の濁度がＯＤ.６００＝０．５になってから０．５ｍＭ　ＩＰＴＧを添加し、さらに３０℃で２時間振盪培養した。大腸菌を遠心分離で回収し、リシスバッファー（５０ｍＭ　リン酸バッファー、３００ｍＭ　塩化ナトリウム、１０ｍＭ　イミダゾール　１ｍｇ／ｍｌ　リゾチーム、０．１μｇ／ｍｌ　ＤＮアーゼＩ　ｐＨ７．８）で再懸濁した。氷上で３０分静置後、超音波破砕機にて大腸菌を破砕し、遠心分離し、上清を回収した。上清をニッケル固相化アガロース充填カラムに通した後、洗浄バッファー（５０ｍＭ　リン酸バッファー、３００ｍＭ　塩化ナトリウム、２０ｍＭ　イミダゾール　ｐＨ７．８）にてカラムを２回洗浄した後、溶出バッファー（５０ｍＭ　リン酸バッファー、３００ｍＭ　塩化ナトリウム、３００ｍＭ　イミダゾール　ｐＨ７．８）でヒスチジンタグ融合ＣｙｓＥを溶出した。溶出したヒスチジンタグ融合ＣｙｓＥを５０ｍＭ　リン酸バッファー　ｐＨ７．８で平衡化した脱塩カラムに通し、得られた溶液をセリン－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼ（ＣｙｓＥ）として使用した。
　本発明により、イオウ原子を同位体標識したシステイン及びシステイン誘導体を効率よく合成することができ、ひいては当該システインおよびシステイン誘導体を安定して供給することが可能となる点において有用である。

Claims (14)

  1. 　イオウ原子を同位体標識したシステインの合成方法であって、システインシンターゼ（ＥＣ：２．５．１．４７）の存在下で、Ｏ－アセチル－Ｌ－セリン及びイオウ原子について同位体標識された基質を反応させる工程を含み、ここで当該イオウ原子について同位体標識された基質は硫化水素ナトリウム（ＮａＨＳ）、硫化ナトリウム（Ｎａ２Ｓ）、又は硫化水素（Ｈ２Ｓ）であり、そしてここで当該イオウ原子の同位体標識は、安定同位体３２Ｓ、安定同位体３４Ｓ、放射性同位体３３Ｓ及び放射性同位体３５Ｓからなる群より選択される、前記方法。
  2. 　Ｏ－アセチル－Ｌ－セリンを、以下の工程：セリン－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ：２．３．１．３０）の存在下で、窒素および／または炭素原子について同位体標識されたセリンを反応させる；により得ることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  3. 　システインシンターゼが、システインシンターゼＡ（ＣｙｓＫ）又はシステインシンターゼＢ（ＣｙｓＭ）である、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　システインシンターゼＡが、サルモネラ属に属する微生物由来である、請求項３に記載の方法。
  5. 　システインシンターゼが、ヒスチジンタグを含む組換えタンパク質である、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　イオウ原子を同位体標識したシスチンの合成方法であって、請求項１又は２に記載の方法にしたがってイオウ原子を同位体標識したシステインを合成し、当該システインを酸化剤の存在下で酸化することによりシスチンを得る工程を含む、前記方法。
  7. 　酸化剤がヨウ素（Ｉ２）である、請求項６に記載の方法。
  8. 　システイン誘導体の合成方法であって、
    　（ｉ）システイン誘導体が、イオウ原子を同位体標識したスルホシステインであり、システインシンターゼの存在下で、Ｏ－アセチル－Ｌセリン及び亜硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ３）を反応させる工程を含み、ここでイオウ原子は、安定同位体３２Ｓ、安定同位体３４Ｓ、放射性同位体３３Ｓ及び放射性同位体３５Ｓからなる群より選択される；
    　（ｉｉ）システイン誘導体が、イオウ原子を同位体標識したＳ－スルホシステインであり、システインシンターゼＢの存在下で、Ｏ－アセチル－Ｌ－セリン及びチオ硫酸ナトリウム（Ｎａ２Ｓ２Ｏ３）を反応させる工程を含み、ここでイオウ原子は、安定同位体３２Ｓ、安定同位体３４Ｓ、放射性同位体３３Ｓ及び放射性同位体３５Ｓからなる群より選択される；
    　（ｉｉｉ）システイン誘導体が、イオウ原子を同位体標識したシステインパースルフィドであり、システインシンターゼの存在下で、Ｏ－アセチル－Ｌ－セリン及び二硫化ナトリウム（Ｎａ２Ｓ２）を反応させる工程を含み、ここでイオウ原子は、安定同位体３２Ｓ、安定同位体３４Ｓ、放射性同位体３３Ｓ及び放射性同位体３５Ｓからなる群より選択される；
    　（ｉｖ）システイン誘導体が、イオウ原子を同位体標識したシステインパースルフィドであり、（ａ）システインシンターゼの存在下で、Ｏ－アセチル－Ｌ－セリン及びイオウ原子について同位体標識された基質を反応させてイオウ原子を同位体標識したシステインを得る工程、ここで当該イオウ原子について同位体標識された基質は硫化水素ナトリウム（ＮａＨＳ）、又は硫化ナトリウム（Ｎａ２Ｓ）であり、そしてここで当該イオウ原子の同位体標識は、安定同位体３２Ｓ、安定同位体３４Ｓ、放射性同位体３３Ｓ及び放射性同位体３５Ｓからなる群より選択される、および（ｂ）工程（ａ）で得たイオウ原子を同位体標識したシステインと、二硫化ナトリウムを反応させる工程、を含む；
    または
    　（ｖ）システイン誘導体が、セレノシステインであり、システインシンターゼの存在下で、Ｏ－アセチル－Ｌ－セリン及びセレン化ナトリウム（Ｎａ２Ｓｅ）を反応させる工程を含む；
    前記方法。
  9. 　Ｏ－アセチル－Ｌ－セリンを、セリン－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ：２．３．１．３０）の存在下で、窒素および／または炭素原子について同位体標識されたセリンを反応させる；により得ることをさらに含む、請求項８に記載の方法。
  10. 　システインシンターゼが、システインシンターゼＡ（ＣｙｓＫ）又はシステインシンターゼＢ（ＣｙｓＭ）である、請求項８又は９に記載の方法。
  11. 　システインシンターゼＡが、サルモネラ属に属する微生物由来である、請求項１０に記載の方法。
  12. 　システインシンターゼが、ヒスチジンタグを含む組換えタンパク質である、請求項８～１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 　イオウ原子を同位体標識したシステインもしくはシスチン、またはシステイン誘導体を合成するためのキットであって、
    　システインシンターゼ；及び
    　イオウ原子について同位体標識された硫化水素ナトリウム（ＮａＨＳ）、硫化ナトリウム（Ｎａ２Ｓ）、亜硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ３）、チオ硫酸ナトリウム（Ｎａ２Ｓ２Ｏ３）、及び二硫化ナトリウム（Ｎａ２Ｓ２）からなる群より選択される少なくとも一つのイオウを含む基質、ここで当該イオウ原子の同位体標識は、安定同位体３２Ｓ、安定同位体３４Ｓ、放射性同位体３３Ｓ及び放射性同位体３５Ｓからなる群より選択される、またはセレン化ナトリウム（Ｎａ２Ｓｅ）；
    を含む、前記キット。
  14. 　システイン誘導体の合成方法であって、
    　（ｉ）システイン誘導体が、イオウ原子を同位体標識したシスチンポリスルフィドであり、（ａ）請求項１または２に記載の方法にしたがってイオウ原子を同位体標識したシステインを合成する工程、（ｂ）工程（ａ）で得たイオウ原子を同位体標識したシステインを酸化剤と反応させる工程、および（ｃ）さらに硫化ナトリウム（Ｎａ２Ｓ）を添加して反応させる工程、を含む；または
    　（ｉｉ）システイン誘導体が、イオウ原子を同位体標識したＮ－アセチルシステインであり、（ａ）請求項１または２に記載の方法にしたがってイオウ原子を同位体標識したシステインを合成する工程、および（ｂ）工程（ａ）で得たイオウ原子を同位体標識したシステインをアセチル化剤と反応させる工程、を含む；
    前記方法。
     
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