WO2017187672A1 - キチンオリゴマー、ｎ－アセチルグルコサミン及び１－ｏ－アルキル－ｎ－アセチルグルコサミンの製造方法 - Google Patents

キチンオリゴマー、ｎ－アセチルグルコサミン及び１－ｏ－アルキル－ｎ－アセチルグルコサミンの製造方法 Download PDF

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Hokkaido University NUC
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Definitions

  • the present invention relates to chitin oligomers, N-acetylglucosamine (NAG) and 1-O-alkyl-N-acetylglucosamine from chitin-containing biomass by a hydrolysis reaction of chitin using a catalyst with low environmental impact and handling risk. It relates to a method of manufacturing.
  • NAG N-acetylglucosamine
  • 1-O-alkyl-N-acetylglucosamine from chitin-containing biomass by a hydrolysis reaction of chitin using a catalyst with low environmental impact and handling risk. It relates to a method of manufacturing.
  • Chitin is a nitrogen-containing polysaccharide polymer in which NAG is ⁇ -1,4-glycoside-linked, and is a biomass that exists in abundance in nature, including crustaceans such as shrimps and crabs, insects, and fungi such as mushrooms. .
  • solvolysis products such as chitin hydrolysis products and alcoholysis decomposition products have various effects and effects and can be used as various functional materials.
  • a chitin oligomer obtained by polymerizing about 2 to 7 NAG hydrolyzed products is a useful component as a precursor for obtaining NAG, and has antitumor, immunostimulatory and antibacterial actions (Trend Food Sci. Technol., 1999, 10, 37-51; Non-patent document 1), and the elicitor activity, which is an action to adjust the intestinal environment by the growth of bifidobacteria and the action to activate the plant defense mechanism, has been reported. It is also attracting attention as a functional food and agricultural material.
  • chitin oligomers have been recognized to have elicitor activity, which is an action of activating the plant biological defense mechanism, and are desired to be used as agricultural materials.
  • elicitor activity which is an action of activating the plant biological defense mechanism
  • purification is necessary to obtain agricultural materials. Therefore, there is a demand for a material that does not adversely affect the cultivated land for a long time.
  • NAG which is a monomer of the hydrolysis product, promotes biosynthesis of mucopolysaccharides such as hyaluronic acid by being taken into the body, and has effects such as improvement of knee and joint pain, skin beautification and moisturizing.
  • NAG which is a monomer of the hydrolysis product, promotes biosynthesis of mucopolysaccharides such as hyaluronic acid by being taken into the body, and has effects such as improvement of knee and joint pain, skin beautification and moisturizing.
  • it is expected to be used as a functional food, a pharmaceutical-related raw material, and a beauty-related raw material because it is a recognized ingredient, has less bitterness than glucosamine, which exhibits the same effect, and has high utilization efficiency.
  • MeNAG 1-O-methyl-N-acetylglucosamine
  • MeNAG 1-O-methyl-N-acetylglucosamine
  • It has attracted attention as a pharmaceutical raw material because of its inhibitory effect (Arch.rchBiochem. Biophys., 1987, 259, 79-88; Non-Patent Document 2, J. Biol. Chem., 1989, 264, 173- 177; Non-Patent Document 3), further organic catalyst (J. Org. Chem., 2012, 6390-6406; Non-Patent Document 4), Ligand (J. Org. Chem., 1997, 62, 6012-6028; Nonpatent Document 5), a substance that has been shown to have potential for use in gelling agents (Tetrahedron, 2010, 66, 962-5971; Non-Patent Document 6).
  • MeNAG 1-O-methyl-N-acetylglucosamine
  • chitin As a method for producing chitin oligomers or NAG from chitin using acid, chitin is reacted with concentrated hydrochloric acid for 3 to 4 hours under a heating condition of about 40 ° C. to partially hydrolyze to generate oligomers.
  • a method for performing a post-process has been developed (Japanese Patent Publication No. 5-33037; Patent Document 1, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2009-167140; Patent Document 2, Japanese Patent No. 55420099; Patent Document 3).
  • Patent Documents 1 and 2 an enzyme reaction is introduced into the subsequent process, and in Patent Document 3, cooling crystallization is introduced into the subsequent process to generate NAG.
  • the ratio of the number of moles of N-acetylglucosamine units (C 8 H 13 NO 5 ) in chitin as a substrate to the number of moles of acid catalyst (hereinafter abbreviated as S / C ratio). 0.08 to 0.14, and a large amount of concentrated hydrochloric acid is used with respect to the substrate, and the yield of the produced oligomer or NAG with respect to chitin is low.
  • S / C ratio the ratio of the number of moles of N-acetylglucosamine units (C 8 H 13 NO 5 ) in chitin as a substrate to the number of moles of acid catalyst
  • MeNAG is manufactured by a methanol decomposition method in which methanol is added to a chitin oligomer prepared by partial hydrolysis of chitin with hydrochloric acid and heated. There is a problem of using a large amount of acid.
  • An object of the present invention is to provide a method for producing chitin oligomers, N-acetylglucosamine and 1-O-alkyl-N-acetylglucosamine by hydrolysis reaction of chitin-containing biomass using a small amount of an easy-to-handle acid catalyst as compared with the conventional method. It is to provide.
  • the present inventors use an acid catalyst with a low handling risk and use it in a smaller amount compared to the conventional method, and chitin in the presence of water. It has been found that chitin oligomers can be produced by partially hydrolyzing the contained biomass by physical grinding. In addition, N-acetylglucosamine can be produced by adding water to this chitin oligomer and heating it to hydrolyze it. Furthermore, by adding alcohol to the chitin oligomer and heating it to cause alcoholysis, 1-O-alkyl The inventors have found that —N-acetylglucosamine can be produced, and have completed the present invention.
  • the present invention provides the following methods for producing chitin oligomers [1] to [9], methods for producing N-acetylglucosamine [10] to [11], and 1-O— of [12] to [15].
  • the present invention relates to a method for producing alkyl-N-acetylglucosamine.
  • an acid catalyst selected from phosphoric acid, nitrous acid, and an organic acid and water.
  • chitin oligomers, N-acetylglucosamine and 1-O-alkyl-N-acetylglucosamine can be produced at low cost from chitin-containing biomass using an acid catalyst with a low environmental load.
  • Chitin-containing biomass (solid substrate): Biomass generally refers to “renewable biological organic resources excluding fossil resources”, but “chitin-containing biomass” used in the present invention (hereinafter sometimes referred to as solid substrate). Is a biomass mainly containing chitin such as crustaceans such as shrimps and crabs, arthropods, insects, squids, shellfish, shells such as offshore mites, and cell walls of fungi such as mushrooms.
  • crustaceans such as shrimps and crabs, arthropods, insects, squids, shellfish, shells such as offshore mites, and cell walls of fungi such as mushrooms.
  • the chitin-containing biomass can be used whether it has been purified or not. For those that have undergone purification treatment, after processing such as protein dissolution with alkali and calcium dissolution with acid, neutralization, solid-liquid separation, washing with water, etc. are performed to remove impurities such as protein and calcium. And those containing chitin. Furthermore, industrially prepared chitin may be used.
  • the chitin-containing biomass may contain raw material-derived protein, phosphoric acid, iron, copper, zinc, molybdenum, silicon, aluminum, calcium, magnesium, potassium, sodium, and the like as impurities.
  • the form of the chitin-containing biomass may be dry or wet, and may be crystalline or non-crystalline.
  • the chitin-containing biomass is desirably coarsely pulverized prior to the reaction. Coarse pulverization increases the contact with the catalyst and promotes the hydrolysis reaction. Therefore, the shape and size of the chitin-containing biomass is preferably suitable for pulverization. Examples of such shapes and sizes include powders having a particle size of 20 to 1000 ⁇ m.
  • Coarse pulverization processing includes, for example, shredders, jaw crushers, gyratory crushers, cone crushers, hammer crushers, roll crushers, and roll mills, etc. It can be carried out using a medium pulverizer.
  • the pulverization treatment time is not particularly limited as long as the raw material after treatment is uniformly finely pulverized.
  • the acid catalyst used in the present invention is not particularly limited as long as it is a catalyst capable of hydrolyzing chitin.
  • a catalyst capable of hydrolyzing chitin For example, the ⁇ -1,4 glycosidic bond forming the main chain of chitin as the main component is hydrolyzed.
  • the acid catalyst it is preferable to use phosphoric acid and / or organic acid from the viewpoint of environmental load and safety in handling.
  • inorganic acid such as phosphoric acid and nitrous acid, formic acid, acetic acid, oxalic acid, propion, etc.
  • Organic acids such as acid, citric acid and succinic acid can be used. These can also be used in combination.
  • phosphoric acid, acetic acid, citric acid and nitrous acid are more preferred, Most preferred is phosphoric acid.
  • a chitin oligomer in a solid substrate is partially hydrolyzed to produce a chitin oligomer (Method 1), and the chitin oligomer produced in Method 1 is hydrolyzed in water to form N
  • Method 2 A method for producing acetylglucosamine (method 2) and a method for producing 1-O-alkyl-N-acetylglucosamine by hydrolyzing the chitin oligomer produced in method 1 in an alcohol solvent (method 3) .
  • Method 1 Partial hydrolysis reaction: Partial hydrolysis of a solid substrate is performed by impregnating the substrate with an acid catalyst and then applying mechanical stress due to grinding.
  • the partial hydrolysis refers to a hydrolysis reaction in which most of the depolymerized product of chitin remains in the water-soluble oligomer unit and there is little depolymerization reaching the monomer unit.
  • Chitin consists of two bonds that are subject to hydrolysis, the ⁇ -1,4 glycosidic bond that forms the polymer main chain of NAG, and the amide bond of the acetamide group (—NHCOCH 3 ) that forms the side chain at the C2 position.
  • the ⁇ -1,4 glycosidic bond of the main chain is selectively hydrolyzed.
  • the ratio of the acid catalyst (C) to the solid substrate (S) is not particularly limited, but the molar ratio of S / C is 0 from the viewpoint of partial hydrolysis efficiency during the reaction and reduction of the substrate residue after the reaction. 2 to 20, preferably 0.5 to 15, and more preferably 1 to 10.
  • the impregnation method of the acid catalyst into the solid substrate can be carried out by directly mixing each of them. Further, after the solvent in which the acid catalyst is dissolved and the substrate are mixed, the solvent can be removed by distillation or heating.
  • the solvent used is not particularly limited as long as it does not denature the substrate, does not inhibit or deactivate the acid catalyst activity, and is not nonvolatile (that is, can be removed by heating and distillation). For example, water, diethyl ether, hexane, benzene and the like are suitable.
  • partial hydrolysis can be sufficiently provided.
  • Water can also be added.
  • Partial hydrolysis can be achieved by grinding a solid substrate impregnated with an acid catalyst.
  • the effects of finely pulverizing the solid substrate by pulverization include more uniform diffusion of the impregnated acid catalyst, improvement in the transmission efficiency of physical stress accompanying an increase in specific surface area, and hydrolysis of the solid substrate by amorphization of chitin The improvement of the property can be considered.
  • Equipment used for pulverization treatment includes rolling mills such as pot mills, tube mills and conical mills, swirling flow jet mills, impingement type jet mills, fluidized bed jet mills, wet type jet mills and other jet crushers, and large machines (Crusher), shearing mills such as ong mills, colloidal mills such as mortars and stones, hammer mills, cage mills, pin mills, disintegrators, screen mills, turbo mills, centrifugal classifiers, and other impact-type crushers, and even rotation And a planetary ball mill which is a kind of pulverizer adopting a revolving motion.
  • rolling mills such as pot mills, tube mills and conical mills, swirling flow jet mills, impingement type jet mills, fluidized bed jet mills, wet type jet mills and other jet crushers, and large machines (Crusher), shearing mills such as ong mills, colloidal mills such as mortars and stones, hammer mills
  • the grinding device used is a ball mill in which a compressive force is strongly applied to the solid substrate and tensile stress is applied in both directions of the main chain.
  • planetary ball mills and rolling ball mills are more preferred, and planetary ball mills are most preferred.
  • the temperature of the pulverization treatment is not particularly limited as long as the ⁇ -1,4 glycosidic bond of the main chain can be selectively hydrolyzed without detaching the side chain acetamide group. preferable. More preferably, it is 45 to 90 ° C, and further preferably 60 to 80 ° C.
  • the time for the pulverization treatment is not particularly limited as long as partial hydrolysis of the solid substrate proceeds and becomes water-soluble. In order to determine the treatment end point, it is preferable to confirm the water solubility of the sample obtained over time.
  • the reaction product obtained by partial hydrolysis (Method 1) can be used as a raw material for Method 2 for subsequent hydrolysis and Method 3 for alcoholysis, as well as purification treatment such as neutralization and desalting. It can also be used as a chitin oligomer.
  • Method 2 hydrolysis reaction
  • Method 3 alcohol decomposition reaction:
  • the reaction product obtained by partial hydrolysis in Method 1 can be used as a raw material.
  • the raw material is dissolved in a solvent (water or alcohol) and then heated to carry out the reaction.
  • NAG is produced from chitin oligomers using water as a solvent.
  • 1-O-alkyl-N-acetylglucosamine which is a NAG derivative, is produced from a chitin oligomer using alcohol as a solvent.
  • the solvent used in Method 3 is preferably a monohydric alcohol such as methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, 1-butanol, 2-butanol, 2-methyl-1-propanol, 2-methyl-2-propanol. From the viewpoint of obtaining the efficiency and uniformity of the reaction by dissolving the raw materials, the solvent is more preferably methanol or ethanol, and most preferably methanol.
  • the reaction is usually carried out in a sealed container at normal pressure in the presence of raw materials and solvent.
  • the solvent is water
  • it is performed at a temperature at which the water vapor partial pressure is in a pressurized state of 0.1 MPa or more.
  • the heating temperature at which the pressure is applied is preferably 100 to 260 ° C., more preferably 130 to 230 ° C., and still more preferably 150 to 210 ° C. in the hydrolysis reaction of Method 2.
  • the alcoholysis reaction of Method 3 is preferably 120 to 280 ° C., more preferably 150 to 250 ° C., and further preferably 170 to 230 ° C.
  • the heating temperature is the temperature of the solution during the reaction.
  • the manufacture yield of a target product can be raised. Since the reaction in the production method of the present invention is usually carried out in a closed container such as an autoclave, even if it is normal pressure at the start of heating, it is in a pressurized state when the reaction system is heated at the above temperature.
  • reaction can be carried out by pressurizing the inside of the sealed container before or during the reaction.
  • the pressure to be applied is, for example, 0.1 to 30 MPa, preferably 1 to 20 MPa, and more preferably 2 to 10 MPa.
  • the time to reach the reaction temperature from room temperature is preferably 5 to 60 minutes, more preferably 5 to 30 minutes, and further preferably 5 to 20 minutes.
  • the heating is preferably stopped and cooled. By doing in this way, the manufacturing yield of NAG can be raised.
  • the amount of water used for the decomposition is an amount capable of solvolytic decomposition of at least the biomass chitin oligomer, but preferably 1 in consideration of the fluidity and agitation of the reaction mixture. It is ⁇ 500 parts by mass, more preferably 2 to 350 parts by mass, and still more preferably 2 to 200 parts by mass. By setting it as the said range, a high product yield and product concentration can be made compatible in a decomposition reaction.
  • the reaction is preferably performed while stirring the reaction mixture.
  • the reaction format may be either batch type or continuous type.
  • Comparative Example 2 Phosphoric acid impregnated chitin 1 10 g of untreated chitin (average particle size 73 ⁇ m) (49.2 mmol as NAG unit) was dispersed in 30 mL of water containing 2.4 g of phosphoric acid (24.6 mmol, S / C ratio 2.0), and then the vacuum was dried. Thus, a powder having a water content of 2.5% by mass was obtained. This sample is designated as phosphoric acid-impregnated chitin 1.
  • Comparative Example 3 Phosphoric acid impregnated chitin 2 After dispersing 10 g of untreated chitin (average particle size 73 ⁇ m) (49.2 mmol as NAG unit) in 30 mL of water containing 4.8 g of phosphoric acid (49.2 mmol, S / C ratio 1.0), The reduced pressure was dried to obtain a powder having a water content of 4.5% by mass. This sample is referred to as phosphoric acid-impregnated chitin 2.
  • Comparative Example 4 Crushed product of chitin 5.0 g of untreated chitin (average particle size 73 ⁇ m) was placed in an alumina pot having a capacity of 250 mL together with 100 g of alumina balls having a diameter of 5 mm. This pot was set in a planetary ball mill (Purverisete (registered trademark) 6 manufactured by Fritsch) and treated at 500 rpm for 6 hours continuously. As a result, a powder containing 4.2% by mass of physically adsorbed water was obtained. Let this sample be a chitin ground material (average particle diameter of 42 micrometers).
  • Example 1 Phosphoric acid impregnated chitin pulverized product 1 5 g of sulfuric acid-impregnated chitin 1 was placed in an alumina pot having a capacity of 250 mL together with 100 g of alumina balls having a diameter of 5 mm. The pot was set on a planetary ball mill (Purverisete 6 manufactured by Fritsch) and treated at 500 rpm for 6 hours continuously. As a result, a powder containing 3.1% by mass of physically adsorbed water was obtained. This sample is designated as phosphoric acid-impregnated chitin pulverized product 1.
  • Example 2 Phosphoric acid impregnated chitin pulverized product 2 5 g of sulfuric acid-impregnated chitin 2 was placed in an alumina pot having a capacity of 250 mL together with 100 g of alumina balls having a diameter of 5 mm. This pot was set in a planetary ball mill (Fritch, PULVERISETTE 6) and treated at 500 rpm for 6 hours continuously. As a result, a powder containing 5.3% by mass of physically adsorbed water was obtained. This sample is designated as phosphoric acid-impregnated chitin pulverized product 2.
  • Comparative Example 5 Sulfur-impregnated chitin pulverized product 10.0 g (49.2 mmol as NAG unit) of chitin (average particle size 73 ⁇ m) was added to 30 mL of water containing 2.4 g (24.6 mmol, S / C ratio 2.0) of sulfuric acid. After dispersion, 5 g of the powder obtained by drying under reduced pressure was collected and put into an alumina pot having a capacity of 250 mL together with 100 g of alumina balls having a diameter of 5 mm. This pot was set in a planetary ball mill (Fritch, PULVERISETTE 6) and treated at 500 rpm for 6 hours continuously. As a result, a powder containing 3.1% by mass of physically adsorbed water was obtained. Let this sample be a sulfuric acid impregnation chitin ground material.
  • the planetary ball mill can solubilize chitin even if phosphoric acid, which is a weak acid with a lower risk than a strong acid and has a high environmental load, is used instead of sulfuric acid, which is a strong acid.
  • phosphoric acid which is a weak acid with a lower risk than a strong acid and has a high environmental load
  • sulfuric acid which is a strong acid.
  • Comparative Example 2 and Comparative Example 3 the solubilization rate and the total yield of the product are reversed because the phosphoric acid supported on chitin is not completely removed by washing and apparent solubilization This is probably because the rate was low.
  • HPLC analysis of aqueous suspension filtrate of partial hydrolysis reaction sample of chitin The aqueous suspension filtrates of the samples of Examples 1-2 and Comparative Examples 2-5 were HPLC (high performance liquid chromatograph) (apparatus: LC-10ATVP manufactured by Shimadzu Corporation, column: Phenomenex Rezex RPM-Monosaccharide Pb ++ ⁇ 7.8 Analysis was performed with ⁇ 300 mm, mobile phase: water, 0.6 mL / min, 70 ° C., detection: differential refractive index, and the yields of NAG and oligosaccharide (degree of polymerization 2 to 8) were calculated by the following formula.
  • the sample ball milled in the presence of acid was phosphoric acid impregnated ground chitin 1 (Example 1) NAG 3.3%, oligosaccharide 70%, phosphoric acid impregnated chitin 2 (Example 2) NAG 5.1%, Oligosaccharide 61%, sulfuric acid-impregnated ground chitin (Comparative Example 5) was NAG 10.0% and oligosaccharide 60%, indicating a high oligomer yield. From this result, it was confirmed that the chitin oligomer can be obtained in a high yield by pulverizing the acid-impregnated chitin regardless of whether phosphoric acid or sulfuric acid is used.
  • the obtained chitin oligomer has been reported to activate the plant defense mechanism and is expected to be used as an agricultural material.
  • a chitin oligomer produced using sulfuric acid is sprayed for a long time, there is a risk of acidification due to the accumulation of sulfate radicals, so a purification process is required.
  • the phosphate group contained is used as a nutrient source for plants, so there is a possibility that it can be applied to fields and the like without refining. The benefits are great.
  • the product of the liquid phase sample from which the solid content was removed was HPLC (apparatus: LC-10ATVP manufactured by Shimadzu Corporation, column: Phenomenex Rezex RPM-Monosaccharide Pb ++ ⁇ 7.8 ⁇ 300 mm, mobile phase: water, 0.6 mL / min, 70
  • the NAG was quantitatively analyzed by: ° C and column: Shodex (registered trademark) SUGAR SH-1011 ⁇ 8 ⁇ 300 mm, mobile phase: water, 0.5 mL / min, 50 ° C., detection: differential refractive index.
  • NAG was hardly produced under the conditions in which untreated chitin was reacted at 190 ° C. (Comparative Example 6), whereas NAG yield of hydrolysis reaction of phosphoric acid-impregnated chitin pulverized product 1 having an S / C ratio of 2.0. Was 26% at 170 ° C. (Example 3), 36% at 180 ° C. (Example 4), and 34% at 190 ° C. (Example 5).
  • the phosphoric acid-impregnated chitin pulverized product 2 having an S / C ratio of 1.0 it was 40% at 170 ° C. (Example 6) and 44% at 180 ° C. (Example 7).
  • the NAG yield was generally higher in the phosphoric acid-impregnated chitin pulverized product 2, and it was confirmed that the temperature for obtaining the maximum NAG yield was 180 ° C.
  • chitin oligomer, N-acetylglucosamine and 1-O-alkyl N-acetylglucosamine are obtained from chitin using a weak acid catalyst that is easy to handle and using less acid catalyst than existing production methods. Therefore, it is possible to efficiently produce at low cost with reduced environmental load, and to provide a highly functional material useful in the fields of medicine, cosmetics, food, agriculture and feed.

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Abstract

本発明はキチン含有バイオマスを、リン酸、亜硝酸及び有機酸から選択される酸触媒と水の共存下で粉砕装置を用い粉砕しながら部分加水分解することを特徴とするキチンオリゴマーの製造方法（方法１）、方法１により得られたキチンオリゴマーに水を加えて加熱し加水分解することを特徴とするＮ－アセチルグルコサミンの製造方法（方法２）、及びキチンオリゴマーにアルコールを加えて加アルコール分解することを特徴とする１－Ｏ－アルキル－Ｎ－アセチルグルコサミンの製造方法（方法３）に関する。

Description

キチンオリゴマー、Ｎ－アセチルグルコサミン及び１－Ｏ－アルキル－Ｎ－アセチルグルコサミンの製造方法
　本発明は、環境負荷と取扱い上の危険度が低い触媒を用いたキチンの加水分解反応により、キチン含有バイオマスからキチンオリゴマー、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＮＡＧ）及び１－Ｏ－アルキル－Ｎ－アセチルグルコサミンを製造する方法に関する。
　キチンは、ＮＡＧがβ－１，４－グリコシド結合した含窒素多糖高分子であり、エビ、カニなどの甲殻類、昆虫類、キノコなどの真菌に含まれる、自然界に豊富に存在するバイオマスである。
　キチンの加水分解生成物や加アルコール分解生成物などの加溶媒分解生成物には、様々な効果効能を有し各種機能素材として利用できるものがある。
　例えば、加水分解生成物であるＮＡＧが２～７個程度重合したキチンオリゴマーは、ＮＡＧ取得のための前駆体として有用な成分であることに加え、抗腫瘍、免疫賦活、抗菌の作用（Trend Food Sci. Technol., 1999, 10, 37-51；非特許文献１）や、ビフィズス菌増殖による腸内環境調整作用、植物生体防御機構活性化作用であるエリシター活性が報告されており、医薬用素材、機能性食品、農業資材としても注目されている。特に近年の研究では、キチンオリゴマーに植物生体防御機構活性化作用であるエリシター活性が認められており、農業資材としての活用が望まれている。しかし、加水分解生成物に硫酸根等が残留している場合、農業資材とするためには精製が必要となる。そのため、長期にわたり耕地に散布しても悪影響が生じない素材が求められている。
　また、加水分解生成物の単量体であるＮＡＧは、体内に取り込まれることによりヒアルロン酸などのムコ多糖類の生合成を促進して、ひざ・関節痛の改善や美肌・保湿などの効果が認められる成分であり、同様の効果を示すグルコサミンより苦みがなく、利用効率が高いことから、近年、機能性食品、医薬関連原料、美容関連原料としての利用が期待されている。
　さらに、加メタノール分解生成物であり、ＮＡＧ誘導体である１－Ｏ－メチル－Ｎ－アセチルグルコサミン（以下、ＭｅＮＡＧと略記することがある。）は、血球凝集を阻害することによるインフルエンザ及びがんの抑制効果を有していることから医薬品原料として注目されており（Arch. Biochem. Biophys., 1987, 259, 79-88；非特許文献２、J. Biol. Chem., 1989, 264, 173-177；非特許文献３）、さらに有機触媒（J. Org. Chem., 2012, 6390-6406；非特許文献４）、リガンド（J. Org. Chem., 1997, 62, 6012-6028；非特許文献５）、ゲル化剤（Tetrahedron, 2010, 66, 962-5971；非特許文献６）などへの用途展開の可能性が示されている物質である。
　酸を用いる、キチンからのキチンオリゴマーやＮＡＧの製造方法としては、キチンに濃塩酸を用いて４０℃前後の加熱条件で３～４時間の反応を行い部分加水分解してオリゴマーを生成させ、引き続き後工程を行う方法が開発されている（特公平５－３３０３７号公報；特許文献１、特開２００９－１６７１４０号公報；特許文献２、特許５４２６０９９号公報；特許文献３）。特許文献１及び２では、後工程に酵素反応を導入し、特許文献３では後工程に冷却晶析を導入してＮＡＧの生成している。しかしながら、これらの方法は、酸触媒のモル数に対する、基質であるキチン中のＮ－アセチルグルコサミン単位（Ｃ8Ｈ13ＮО5）のモル数の比（以下、Ｓ／Ｃ比と略記する。）が０．０８～０．１４であって、基質に対して大量の濃塩酸が使用されている上、製造されるオリゴマーやＮＡＧのキチンに対する収率が低いという問題がある。また別の酸では、硫酸を用いて０～５０℃で５分～２時間の処理をする方法も開発されている（特開２００２－８８０９３；特許文献４）が、この方法もＳ／Ｃは０．０５～０．５であり大量の硫酸を使用している。
　このように現在開発されている酸を用いる製造方法は、いずれも取扱いにくい強酸を大量に用いるため、環境負荷とコストがかかるという問題がある。
　一方、酸を用いず、キチンに対してキチン分解酵素生産能を有する微生物を利用する方法が提案されている（特開２００４－４１０３５号公報；特許文献５、特開２００８－２５３２５２号公報；特許文献６）。しかし、これらの方法は、４～５日の長時間を要し、キチンの分解効率も低く、生産性が低いという問題を抱えている。
　また、ＭｅＮＡＧは、特許文献１～３に記載の通り、塩酸でキチンを部分加水分解して作成したキチンオリゴマーに、メタノールを加えて加熱する加メタノール分解法により製造されているが、この場合も大量の酸を使用する問題がある。
　以上のことから、取扱い易い酸を少ない使用量で用いる環境負荷の低い、キチンオリゴマー、Ｎ－アセチルグルコサミン及び１－Ｏ－アルキル－Ｎ－アセチルグルコサミンの効率的な製造方法の確立が望まれている。
特公平５－３３０３７号公報 特開２００９－１６７１４０号公報 特許５４２６０９９号公報 特開２００２－８８０９３公報 特開２００４－４１０３５号公報 特開２００８－２５３２５２号公報
Ｔｒｅｎｄ　Ｆｏｏｄ　Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９９，１０，３７－５１ Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，１９８７，２５９，７９－８８ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８９，２６４，１７３－１７７ Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２０１２，６３９０－６４０６ Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９７，６２，６０１２－６０２８ Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，２０１０，６６、，９６２－５９７１
　本発明の目的は、取扱い易い酸触媒を従来法に比べて少量用いたキチン含有バイオマスの加水分解反応による、キチンオリゴマー、Ｎ－アセチルグルコサミン及び１－Ｏ－アルキル－Ｎ－アセチルグルコサミンの製造方法を提供することにある。
　本発明者らは、酸触媒を用いるキチン含有バイオマスの加水分解反応において、酸触媒を取扱い上の危険度が低い酸にして、従来法に比べて少ない量で使用し、水の存在下でキチン含有バイオマスを物理的に粉砕することにより部分加水分解してキチンオリゴマーを製造できることを見出した。また、このキチンオリゴマーに水を加えて加熱し、加水分解することによりＮ－アセチルグルコサミンを製造できること、さらに、キチンオリゴマーにアルコールを加えて加熱し、加アルコール分解することにより、１－Ｏ－アルキル－Ｎ－アセチルグルコサミンを製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下の［１］～［９］のキチンオリゴマーの製造方法、［１０］～［１１］のＮ－アセチルグルコサミンの製造方法、及び［１２］～［１５］の１－Ｏ－アルキル－Ｎ－アセチルグルコサミンの製造方法に関する。
［１］　キチン含有バイオマスを、リン酸、亜硝酸及び有機酸から選択される酸触媒と水の共存下で粉砕装置を用い粉砕しながら部分加水分解することを特徴とするキチンオリゴマーの製造方法。
［２］　前記酸触媒がリン酸である前項１に記載のキチンオリゴマーの製造方法。
［３］　前記酸触媒のモル数（Ｃ）に対するキチン中のＮ－アセチルグルコサミン単位（Ｃ8Ｈ13ＮО5）のモル数（Ｓ）の比（Ｓ／Ｃ）が０．２～２０である前項２に記載のキチンオリゴマーの製造方法。
［４］　予め酸触媒を含浸させたキチン含有バイオマスを水の存在下で粉砕する前項１～３のいずれかに記載のキチンオリゴマーの製造方法。
［５］　酸触媒を溶解した溶媒とキチン含有バイオマスを混合し、その後溶媒を除去して酸触媒をキチン含有バイオマスに含浸させ、得られた酸触媒を含浸させたキチン含有バイオマスを水の存在下で粉砕する前項４に記載のキチンオリゴマーの製造方法。
［６］　前記溶媒が、キチン含有バイオマスを変性させず、酸触媒活性を阻害せず、かつ加熱あるいは蒸留で除去できるものである前項５に記載のキチンオリゴマーの製造方法。
［７］　前記溶媒が、水、ジエチルエーテル、ヘキサン、及びベンゼンから選択される前項６に記載のキチンオリゴマーの製造方法。
［８］　粉砕装置がボールミルである前項１～７のいずれかに記載のキチンオリゴマーの製造方法。
［９］　ボールミルが、遊星ボールミルまたは転動ボールミルである前項８に記載のキチンオリゴマーの製造方法。
［１０］　前項１～９のいずれかに記載の方法により得られたキチンオリゴマーに水を加えて加熱し加水分解することを特徴とするＮ－アセチルグルコサミンの製造方法。
［１１］　加熱温度が１００～２６０℃である請求項１０に記載のＮ－アセチルグルコサミンの製造方法。
［１２］　前項１～９のいずれかに記載の方法により得られたキチンオリゴマーにアルコールを加えて加アルコール分解することを特徴とする１－Ｏ－アルキル－Ｎ－アセチルグルコサミンの製造方法。
［１３］　アルコールが１価アルコールである前項１２に記載の１－Ｏ－アルキル－Ｎ－アセチルグルコサミンの製造方法。
［１４］　前記アルコールがメタノールであり、前記１－Ｏ－アルキル－Ｎ－アセチルグルコサミンが１－Ｏ－メチル－Ｎ－アセチルグルコサミンである前項１２または１３に記載の１－Ｏ－アルキル－Ｎ－アセチルグルコサミンの製造方法。
［１５］　加熱温度が１２０～２８０℃である前項１２～１４のいずれかに記載の１－Ｏ－アルキル－Ｎ－アセチルグルコサミンの製造方法。
　本発明によれば、キチン含有バイオマスから、環境負荷の低い酸触媒を用いてキチンオリゴマー、Ｎ－アセチルグルコサミン及び１－Ｏ－アルキル－Ｎ－アセチルグルコサミンを低コストで製造することができる。
酸触媒と物理的な力の相乗効果によるキチンのグリコシド結合のみの切断を示す図である。 反応温度１９０℃で実施したキチンオリゴマーの加水分解反応（実施例５）の温度プロファイルを示す。 本発明によるキチンからの、キチンオリゴマー、Ｎ－アセチルグルコサミン、及び１－Ｏ－アルキル－Ｎ－アセチルグルコサミンの合成のスキームを示す。
　以下、本発明方法の実施形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は本発明の代表的な例を示したものであり、本発明はそれらに限定されるものではない。
キチン含有バイオマス（固体基質）：
　バイオマスとは一般的には「再生可能な生物由来の有機性資源で化石資源を除いたもの」を指すが、本発明で使用する「キチン含有バイオマス」（以下、固体基質ということがある。）は、例えば、エビ、カニなどの甲殻類、節足動物、昆虫類、イカ、貝、沖アミなどの殻や表皮、キノコなどの菌類の細胞壁など主にキチンを含むバイオマスである。
　キチン含有バイオマスは、精製処理してあるものでも、精製処理してないものでも用いることができる。精製処理してあるものとしては、アルカリによるタンパク質の溶解、酸によるカルシウムの溶解などの処理をした後に、中和、固液分離、水洗などの処理をしてタンパク質やカルシウムなどの不純物の除去を行い、キチンを含有するものが挙げられる。さらに、工業的に調製したキチンなどでもよい。
　キチン含有バイオマスは、不純物として原料由来のタンパク質、リン酸、鉄、銅、亜鉛、モリブデン、珪素、アルミニウム、カルシウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウムなどを含有するものでもかまわない。
　キチン含有バイオマスの形態は、乾体でも湿体でもかまわず、結晶性でも非結晶性でもかまわない。キチン含有バイオマスは反応に先立ち粗粉砕することが望ましい。粗粉砕により触媒との接触性が増加して、加水分解反応が促進される。したがって、キチン含有バイオマスの形状・大きさは、粉砕するのに適していることが好ましい。そのような形状・大きさとしては、例えば粒径が２０～１０００μｍの粉体状が挙げられる。
　粗粉砕処理は、例えば、シュレッダー、ジョークラッシャー、ジャイレトリクラッシャー、コーンクラッシャー、ハンマークラッシャー、ロールクラッシャー、及びロールミルなどの粗粉砕機、スタンプミル、エッジランナ、切断・せん断ミル、ロッドミル、自生粉砕機及びローラミルなどの中粉砕機を用いて実施することができる。粉砕処理時間は、処理後原料が均一に微粉化されればよく、特に限定されるものではない。
酸触媒：
　本発明において用いる酸触媒は、キチンを加水分解できる触媒であれば特に限定されるものではなく、例えば、主成分であるキチンの主鎖を形成しているβ－１，４グリコシド結合を加水分解する活性を有する触媒が好ましい。
　酸触媒としては、環境負荷と取扱い上の安全性の観点からリン酸及び／または有機酸を用いることが好ましく、例えば、リン酸、亜硝酸などの無機酸や、ギ酸、酢酸、シュウ酸、プロピオン酸、クエン酸、コハク酸などの有機酸を用いることができる。また、これらを併用することも可能である。さらに酸触媒によるキチン含有バイオマスの加水分解速度を高めることができること、分解産物と一緒に農業資材として使うことができることから、リン酸、酢酸、クエン酸、亜硝酸がより好ましく、植物の栄養源となるリン酸が最も好ましい。
　本発明は、図３のスキームに示すように、固体基質中のキチンを部分加水分解してキチンオリゴマーを製造する方法（方法１）、方法１で製造したキチンオリゴマーを水中で加水分解してＮ－アセチルグルコサミンを製造する方法（方法２）、及び方法１で製造したキチンオリゴマーをアルコール溶媒中で加アルコール分解して１－Ｏ－アルキル－Ｎ－アセチルグルコサミンを製造する方法（方法３）からなる。以下、各方法を説明する。
方法１（部分加水分解反応）：
　固体基質の部分加水分解は、基質に酸触媒を含浸させた後、粉砕による機械応力を掛けることにより行う。なお部分加水分解とは、キチンの解重合生成物の大部分が水溶性のオリゴマー単位に留まり、モノマー単位まで達する解重合が少ない加水分解反応のことを言う。
　キチンは、ＮＡＧのポリマー主鎖を形成するβ－１，４グリコシド結合と、Ｃ２位に側鎖を形成しているアセトアミド基（－ＮＨＣＯＣＨ3）のアミド結合の２つの加水分解対象となる結合を有するが、本発明の目的化合物はいずれも、側鎖のアセトアミド基を有するものであるため、主鎖のβ－１，４グリコシド結合が選択的に加水分解されることが重要である。
　酸触媒（Ｃ）と固体基質（Ｓ）の比率は、特に限定されるものではないが、反応時の部分加水分解効率、反応後の基質残渣低減の観点から、Ｓ／Ｃのモル比が０．２～２０で行うことができ、０．５～１５が好ましく、１～１０がより好ましい。
　固体基質への酸触媒の含浸方法は、それぞれを直接混合して行うことができる。また酸触媒を溶解した溶媒と基質を混合したのち、溶媒を蒸留や加熱することにより除去することもできる。使用する溶媒は、基質を変性せず、酸触媒活性を阻害も失活もせず、不揮発性でない（すなわち、加熱・蒸留で除去できる）ものであれば特に限定されない。例えば、水、ジエチルエーテル、ヘキサン、ベンゼンなどが適当である。
　部分加水分解時の水分は、酸触媒を含浸した固体基質に物理吸着した水分が１～３質量％程度あれば十分に部分加水分解を賄えるので、通常は水を添加しなくても問題ないが、水を添加することもできる。
　酸触媒を含浸した固体基質を粉砕することにより、部分加水分解を実現することができる。ここで粉砕により固体基質が微粉化されることによる効果としては、含浸した酸触媒のより均一な拡散、比表面積増大に伴う物理応力の伝達効率の向上、キチンのアモルファス化による固体基質の加水分解性の向上が考えられる。
　粉砕処理に用いる装置としては、ポットミル、チューブミル、コニカルミルなどの転動ボールミル、旋回流型ジェットミル、衝突タイプジェットミル、流動層型ジェットミル、湿式タイプジェットミルなどのジェット粉砕機、らいかい機（擂潰機）、オングミルなどのせん断ミル、乳鉢、石うすなどのコロイドミル、ハンマーミル、ケージミル、ピンミル、ディスインテグレータ、スクリーンミル、ターボ型ミル、遠心分級ミルなどの衝撃式粉砕機、さらには自転及び公転の運動を採用した種類の粉砕機である遊星ボールミルなどが挙げられる。
　本発明の目的である、主鎖のグリコシド結合の選択的な加水分解の実現の観点からは、用いる粉砕装置は、固体基質に圧縮力が強く加わり、主鎖の両方向に引っ張り応力が加えられるボールミルが好ましく、遊星ボールミル、転動ボールミルがより好ましく、遊星ボールミルが最も好ましい。
　粉砕処理の温度は、側鎖のアセトアミド基を脱離させずに、主鎖のβ－１，４グリコシド結合を選択的に加水分解できれば、特に限定されるものではないが、常温～１００℃が好ましい。より好ましくは４５～９０℃、さらに好ましくは６０～８０℃である。
　粉砕処理の時間は、固体基質の部分加水分解が進み、水溶性になるのであれば、特に限定されるものではない。処理終点を見極めるために、経時的に取得したサンプルの水溶性を確認することが好ましい。
　部分加水分解（方法１）で得られた反応生成物は、引き続き、後述の加水分解を行う方法２や加アルコール分解を行う方法３の原料として使用できる他、中和や脱塩などの精製処理を行いキチンオリゴマーとして使用することもできる。
方法２（加水分解反応）及び方法３（加アルコール分解反応）：
　方法２の加水分解反応、及び方法３の加アルコール分解反応では、いずれも方法１の部分加水分解で得られた反応生成物を原料として用いることができる。実際には、原料を溶媒（水またはアルコール）に溶解した後、加熱して反応を行う。方法２では溶媒に水を使用し、キチンオリゴマーからＮＡＧが製造される。方法３では溶媒にアルコールを使用し、キチンオリゴマーからＮＡＧ誘導体である１－Ｏ－アルキル－Ｎ－アセチルグルコサミンが製造される。
　方法３で使用する溶媒には、メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、２メチル－１プロパノール、２－メチル－２－プロパノールなどの１価アルコールが好ましい。原料を溶解させて反応の効率や均一性を得るという観点から、溶媒は、メタノール、エタノールがより好ましく、メタノールが最も好ましい。
　反応は、通常は、原料と溶媒の存在下、常圧で密閉した容器中で行う。例えば、溶媒が水の場合、水蒸気分圧が０．１ＭＰａ以上の加圧状態となる温度で行う。加圧状態となる加熱温度は、方法２の加水分解反応は、好ましくは１００～２６０℃、より好ましくは１３０～２３０℃、さらに好ましくは１５０～２１０℃である。また、方法３の加アルコール分解反応は、好ましくは１２０～２８０℃、より好ましくは１５０～２５０℃、さらに好ましくは１７０～２３０℃である。なお、加熱温度は反応時の溶液の温度である。当該範囲とすることで、目的生成物の製造収率を高めることができる。本発明の製造方法における反応は、通常はオートクレーブなどの密閉容器内で実施されるため、加熱開始時は常圧であっても、上記温度で反応系が加熱されると加圧状態となる。
　さらに、反応前または反応中に密閉容器内を加圧し、反応することもできる。加圧する圧力は、例えば０．１～３０ＭＰａ、好ましくは１～２０ＭＰａ、さらに好ましくは２～１０ＭＰａである。
　反応における加熱では、室温から反応温度に到達する時間は、好ましくは５～６０分、より好ましくは５～３０分、さらに好ましくは５～２０分である。反応温度までに到達すると同時に、加熱を止めて冷却することが好ましい。このようにすることで、ＮＡＧの製造収率を高めることができる。
　分解に用いる水の量（原料１質量部に対する質量比）は、少なくともバイオマスのキチンオリゴマーを全量加溶媒分解できる量であるが、反応混合物の流動性や撹拌性などを考慮して、好ましくは１～５００質量部、より好ましくは２～３５０質量部、さらに好ましくは２～２００質量部である。当該範囲とすることにより、分解反応において高い生成物収率と生成物濃度を両立できる。
　反応は反応混合物を撹拌しながら行うことが好ましい。反応形式は、バッチ式または連続式などのいずれでもよい。
　以下、実施例及び比較例を挙げて本発明をさらに説明するが、本発明はこれらの記載により限定されるものではない。
［使用原料］
　カニ殻を乾燥、粉砕し、高温の希水酸化ナトリウム水溶液と室温の希塩酸水溶液にそれぞれ数時間浸漬することにより、タンパク質、炭酸カルシウムを除去して精製したキチンを用いた。
［キチンの部分加水分解反応（方法１）］
比較例１：未処理キチン
　精製したキチン(平均粒径７３μｍ)をそのまま用いた。このサンプルを未処理キチンとする。
比較例２：リン酸含浸キチン１
　未処理キチン（平均粒径７３μｍ）１０ｇ（ＮＡＧ単位として４９．２ｍｍｏｌ）をリン酸２．４ｇ（２４．６ｍｍｏｌ、Ｓ／Ｃ比２．０）を含む水３０ｍＬに分散させた後、減圧を乾燥して、含水率２．５質量％の粉末を得た。このサンプルをリン酸含浸キチン１とする。
比較例３：リン酸含浸キチン２
　未処理キチン（平均粒径７３μｍ）１０ｇ（ＮＡＧ単位として４９．２ｍｍｏｌ）をリン酸の量を４．８ｇ（４９．２ｍｍｏｌ、Ｓ／Ｃ比１．０）を含む水３０ｍＬに分散させた後、減圧を乾燥して、含水率４．５質量％の粉末を得た。このサンプルをリン酸含浸キチン２とする。
比較例４：キチン粉砕物
　未処理キチン（平均粒径７３μｍ）５．０ｇを直径５ｍｍのアルミナボール１００ｇと共に容量２５０ｍＬのアルミナポットに入れた。このポットを遊星ボールミル（フリッチュ社製、ＰＵＬＶＥＲＩＳＥＴＴＥ（登録商標）６）にセットして５００ｒｐｍで連続６時間処理した。その結果、４．２質量％の物理吸着水を含有する粉末を得た。このサンプルをキチン粉砕物（平均粒径４２μｍ）とする。
実施例１：リン酸含浸キチン粉砕物１
　５ｇの硫酸含浸キチン１を、直径５ｍｍのアルミナボール１００ｇと共に容量２５０ｍＬのアルミナポットに入れた。このポットを遊星ボールミル（フリッチュ社製、ＰＵＬＶＥＲＩＳＥＴＴＥ６）にセットして５００ｒｐｍで連続６時間処理した。その結果、３．１質量％の物理吸着水を含有する粉末を得た。このサンプルをリン酸含浸キチン粉砕物１とする。
実施例２：リン酸含浸キチン粉砕物２
　５ｇの硫酸含浸キチン２を、直径５ｍｍのアルミナボール１００ｇと共に容量２５０ｍＬのアルミナポットに入れた。このポットを遊星ボールミル（フリッチュ、ＰＵＬＶＥＲＩＳＥＴＴＥ６）にセットして５００ｒｐｍで連続６時間処理した。その結果、５．３質量％の物理吸着水を含有する粉末を得た。このサンプルをリン酸含浸キチン粉砕物２とする。
比較例５：硫酸含浸キチン粉砕物
　キチン（平均粒径７３μｍ）１０．０ｇ（ＮＡＧ単位として４９．２ｍｍｏｌ）を硫酸２．４ｇ（２４．６ｍｍｏｌ、Ｓ／Ｃ比２．０）を含む水３０ｍＬに分散させた後、減圧乾燥して取得した粉末を５ｇ分取し、直径５ｍｍのアルミナボール１００ｇと共に容量２５０ｍＬのアルミナポットに入れた。このポットを遊星ボールミル（フリッチュ、ＰＵＬＶＥＲＩＳＥＴＴＥ６）にセットして５００ｒｐｍで連続６時間処理した。その結果、３．１質量％の物理吸着水を含有する粉末を得た。このサンプルを硫酸含浸キチン粉砕物とする。
［キチンの部分加水分解反応サンプルの溶解度測定］
　実施例１～２及び比較例１～５の各サンプル１００ｍｇを秤量して、蒸留水５０ｍＬに添加し振とうした後、１０分間の超音波処理を行い、可溶分を溶解させた。一連の処理は温度２５℃で行い、得られた懸濁液は、０．１μｍのポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）のフィルターでろ過して、固体残渣はさらに５ｍＬの蒸留水でろ過洗浄し、１１０℃のオーブンに入れて一晩乾燥した後、質量を測定し、以下の計算式で溶解度を算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
　溶解度の測定結果を表１に示す。未処理キチン（比較例１）は０％で全く溶解性を示さなかった。処理を施したものにおいても、酸添加のみ行ったリン酸含浸キチン１（比較例２）は１．２％、リン酸含浸キチン２（比較例３）は４．４％となり、またボールミル粉砕のみ行ったキチン粉砕物サンプル（比較例４）は５．２％となり、いずれも大幅に低い溶解度しか示さなかった。
　一方、酸含浸したキチンを酸存在下でボールミル粉砕したリン酸含浸キチン粉砕物（実施例１～２）及び硫酸含浸キチン粉砕物（比較例５）は、いずれも９９％の溶解度を示し殆ど溶解した。
　これらの結果より、酸触媒の添加や遊星ボールミル粉砕の単一処理では、キチンを可溶化する効果は殆どなかったが、酸存在下で機械的応力付与する粉砕処理を実施することにより格段の相乗効果が得られ、キチンの可溶化を大幅に促進することが確認された。
さらに、強酸である硫酸の代わりに、危険性が強酸より低く、環境負荷が高い弱酸であるリン酸を使用しても遊星ボールミルによりキチンを可溶化させることが確認された。
　なお、比較例２及び比較例３において、可溶化率と生成物の合計収率が逆転しているのは、キチンに担持されたリン酸が洗浄で完全に除かれず、見かけ上の可溶化率が低くなったためであると考えられる。
［キチンの部分加水分解反応サンプルの水懸濁液ろ液の酢酸測定］
　実施例１～２及び比較例１～５の各サンプルの水懸濁液ろ液を、高速液体クロマトグラフ（装置：島津製作所製ＬＣ－１０ＡＴＶＰ、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（登録商標）　Ｓｙｎｅｒｇｉ　４μｍ　Ｈｙｄｒｏ－ＲＰ　８０Å　φ４．６×２５０ｍｍ、移動相：４０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ２．９、０．８ｍＬ／分、３０℃、検出：示差屈折率）により酢酸を定量分析した。その結果、いずれのサンプルも酢酸は検出されなかった。
　これにより、酸触媒共存下のボールミル粉砕によるキチンの部分加水分解では、キチンを構成するＮＡＧユニットのＣ２位にあるアセトアミド基（－ＮＨＣＯＣＨ3）のアミド結合は保持され、ＮＡＧユニット同士を繋ぐグリコシド結合が選択的に切断されることが示唆された。これは、少量の酸触媒が共存し加水分解しやすい系において、ボールミル粉砕による機械的応力がキチンを押しつぶして重合の両方向に引き伸ばす作用、すなわち主鎖を形成するグリコシド結合を引っ張る作用を及ぼすことにより、従来の酸添加のみで行う加水分解では得られなかったグリコシド結合の選択的な加水分解を加速させる相乗効果が得られるものと推測される（図１参照）。
［キチンの部分加水分解反応サンプルの水懸濁液ろ液のＨＰＬＣ分析］
　実施例１～２及び比較例２～５の各サンプルの水懸濁液ろ液をＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフ）（装置：島津製作所製ＬＣ－１０ＡＴＶＰ、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ　Ｒｅｚｅｘ　ＲＰＭ－Ｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ Ｐｂ＋＋　φ７．８×３００ｍｍ、移動相：水、０．６ｍＬ／分、７０℃、検出：示差屈折率）で分析し、ＮＡＧ及びオリゴ糖（重合度２～８）の収率を以下の計算式により算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
　結果を表１に示す。酸添加のみ行ったリン酸含浸キチン１（比較例２）はＮＡＧ１．２％、オリゴ糖１．４％、リン酸含浸キチン２（比較例３）はＮＡＧ２．６％、オリゴ糖３．９％となり、ボールミル粉砕のみ行ったキチン粉砕物サンプル（比較例４）はＮＡＧ０．１％、オリゴ糖１．３％となり、いずれも大幅に低い収率しか得られなかった。
　一方、酸存在下でボールミル粉砕したサンプルは、リン酸含浸粉砕キチン１（実施例１）はＮＡＧ３．３％、オリゴ糖７０％、リン酸含浸キチン２（実施例２）はＮＡＧ５．１％、オリゴ糖６１％、硫酸含浸粉砕キチン（比較例５）はＮＡＧ１０．０％、オリゴ糖６０％となり高いオリゴマー収率を示した。この結果より、リン酸、硫酸のいずれを用いても、酸含侵キチンを粉砕することにより、収率よくキチンオリゴマーを得られることが確認できた。また、得られたキチンオリゴマーは植物生体防御機構活性化作用が報告されており農業資材としての用途が期待される物質である。農業資材の用途を考えた場合、硫酸を使用して製造したキチンオリゴマーを長期的に散布すると、硫酸根の蓄積による酸性土化のリスクがあるため、精製の工程が必要となる。一方、リン酸を使用して製造したキチンオリゴマーでは、含有するリン酸根が植物の栄養源として活用されるため、精製を行わずに畑などへの散布ができる可能性があり、その経済的なメリットも大きいと言える。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
［方法２（加水分解反応）］
実施例３～７及び比較例６：
　表２に記載した各サンプルをキチンとして４０６ｍｇ分（ＮＡＧ単位として２ｍｍｏｌ）と、水４０ｍＬを、高圧反応器（内容積１００ｍＬ，オーエムラボテック（株）製オートクレーブ，ハステロイ（登録商標）Ｃ２２製）に入れた後、６００ｒｐｍで撹拌しながら室温から表２に記載した反応温度まで約１６分加熱した。反応温度に到達した時点で加熱を止め、反応器を風冷し、冷却後、反応液を遠心分離装置により液体と固体に分離して上清サンプルの分析を行った。反応温度１９０℃の場合の温度プロファイルは図２に示す通りである。
　固形分を除去した液相サンプルの生成物は、ＨＰＬＣ（装置：島津製作所製ＬＣ－１０ＡＴＶＰ、カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ　Ｒｅｚｅｘ　ＲＰＭ－Ｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ Ｐｂ＋＋　φ７．８×３００ｍｍ、移動相：水、０．６ｍＬ／分、７０℃、及びカラム：Ｓｈｏｄｅｘ（登録商標）　ＳＵＧＡＲ　ＳＨ－１０１１　φ８×３００ｍｍ、移動相：水、０．５ｍＬ／分、５０℃、検出：示差屈折率）によりＮＡＧを定量分析した。
　以下に生成物の収率の計算式を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000004
　分析結果を表２に示す。未処理キチンを１９０℃で反応した条件（比較例６）では殆どＮＡＧが生成しなかったのに対し、Ｓ／Ｃ比２．０のリン酸含浸キチン粉砕物１の加水分解反応のＮＡＧ収率は、１７０℃（実施例３）で２６％、１８０℃（実施例４）で３６％、１９０℃（実施例５）で３４％となった。またＳ／Ｃ比１．０のリン酸含浸キチン粉砕物２では、１７０℃（実施例６）で４０％、１８０℃（実施例７）で４４％となった。ＮＡＧ収率はリン酸含浸キチン粉砕物２の方が全般的に高く、最大のＮＡＧ収率を得る温度はいずれも１８０℃であることが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　本発明の方法によれば、キチンから、取扱い易い弱酸触媒を用いて、既存の製造方法よりも少ない酸触媒の使用量でキチンオリゴマー、Ｎ－アセチルグルコサミン及び１－Ｏ－アルキルＮ－アセチルグルコサミンを、環境負荷を低減し低コストで効率的に製造でき、医薬、化粧品、食品、農業、飼料分野に有用な高機能素材を提供することができる。

Claims (15)

  1. 　キチン含有バイオマスを、リン酸、亜硝酸及び有機酸から選択される酸触媒と水の共存下で粉砕装置を用い粉砕しながら部分加水分解することを特徴とするキチンオリゴマーの製造方法。
  2. 　前記酸触媒がリン酸である請求項１に記載のキチンオリゴマーの製造方法。
  3. 　前記酸触媒のモル数（Ｃ）に対するキチン中のＮ－アセチルグルコサミン単位（Ｃ8Ｈ13ＮО5）のモル数（Ｓ）の比（Ｓ／Ｃ）が０．２～２０である請求項２に記載のキチンオリゴマーの製造方法。
  4. 　予め酸触媒を含浸させたキチン含有バイオマスを水の存在下で粉砕する請求項１～３のいずれかに記載のキチンオリゴマーの製造方法。
  5. 　酸触媒を溶解した溶媒とキチン含有バイオマスを混合し、その後溶媒を除去して酸触媒をキチン含有バイオマスに含浸させ、得られた酸触媒を含浸させたキチン含有バイオマスを水の存在下で粉砕する請求項４に記載のキチンオリゴマーの製造方法。
  6. 　前記溶媒が、キチン含有バイオマスを変性させず、酸触媒活性を阻害せず、かつ加熱あるいは蒸留で除去できるものである請求項５に記載のキチンオリゴマーの製造方法。
  7. 　前記溶媒が、水、ジエチルエーテル、ヘキサン、及びベンゼンから選択される請求項６に記載のキチンオリゴマーの製造方法。
  8. 　粉砕装置がボールミルである請求項１～７のいずれかに記載のキチンオリゴマーの製造方法。
  9. 　ボールミルが、遊星ボールミルまたは転動ボールミルである請求項８に記載のキチンオリゴマーの製造方法。
  10. 　請求項１～９のいずれかに記載の方法により得られたキチンオリゴマーに水を加えて加熱し加水分解することを特徴とするＮ－アセチルグルコサミンの製造方法。
  11. 　加熱温度が１００～２６０℃である請求項１０に記載のＮ－アセチルグルコサミンの製造方法。
  12. 　請求項１～９のいずれかに記載の方法により得られたキチンオリゴマーにアルコールを加えて加アルコール分解することを特徴とする１－Ｏ－アルキル－Ｎ－アセチルグルコサミンの製造方法。
  13. 　アルコールが１価アルコールである請求項１２に記載の１－Ｏ－アルキル－Ｎ－アセチルグルコサミンの製造方法。
  14. 　前記アルコールがメタノールであり、前記１－Ｏ－アルキル－Ｎ－アセチルグルコサミンが１－Ｏ－メチル－Ｎ－アセチルグルコサミンである請求項１２または１３に記載の製造方法。
  15. 　加熱温度が１２０～２８０℃である請求項１２～１４のいずれかに記載の１－Ｏ－アルキル－Ｎ－アセチルグルコサミンの製造方法。
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