WO2021140789A1 - キチンの分解方法及びキチンオリゴ糖含有組成物の製造方法 - Google Patents

キチンの分解方法及びキチンオリゴ糖含有組成物の製造方法 Download PDF

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oligosaccharide
carbon catalyst
decomposing
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福岡　淳
小林　広和
拓矢 佐川
齋藤　信
藤田　一郎
学 ▲桑▼島
内田　博
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国立大学法人北海道大学
昭和電工株式会社
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    • C08B37/0027—2-Acetamido-2-deoxy-beta-glucans; Derivatives thereof
    • C08B37/003—Chitin, i.e. 2-acetamido-2-deoxy-(beta-1,4)-D-glucan or N-acetyl-beta-1,4-D-glucosamine; Chitosan, i.e. deacetylated product of chitin or (beta-1,4)-D-glucosamine; Derivatives thereof
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    • C13—SUGAR INDUSTRY
    • C13K—SACCHARIDES OBTAINED FROM NATURAL SOURCES OR BY HYDROLYSIS OF NATURALLY OCCURRING DISACCHARIDES, OLIGOSACCHARIDES OR POLYSACCHARIDES
    • C13K13/00—Sugars not otherwise provided for in this class

Definitions

  • the present invention relates to a method for decomposing chitin and a method for producing a chitin oligosaccharide-containing composition.
  • Chitin is a linear nitrogen-containing polysaccharide polymer in which N-acetylglucosamine (hereinafter, may be abbreviated as "NAG”) is ⁇ -1,4-glycosidic bonded to crustaceans such as shrimp and crab. It is a naturally abundant macromolecule contained in fungi such as insects and chitin.
  • NAG N-acetylglucosamine
  • NAG which is a monomer
  • glucosamine which exhibits similar effects, and has high utilization efficiency, it is expected to be used as a functional food, a pharmaceutical-related raw material, and a beauty-related raw material in recent years.
  • Chitin oligosaccharide is a compound in which about 2 to 7 NAGs are polymerized, and is a useful component as a precursor for obtaining NAGs. Furthermore, chitin oligosaccharides have been reported to have antitumor, immunostimulatory, or antibacterial effects, intestinal environment-regulating effects due to the growth of bifidobacteria, and elicitor activity, which is a plant biological defense mechanism activating effect. It is also attracting attention as a functional food and agricultural material.
  • Patent Document 1 describes a method for hydrolyzing chitin using two or more kinds of acids at the same time.
  • Patent Document 2 describes a method for decomposing chitin using a microorganism capable of producing a chitin-degrading enzyme.
  • Patent Document 3 describes a method of hydrolyzing chitin using a pulverizer such as a ball mill in the presence of an acid catalyst.
  • Non-Patent Document 1 describes a method for pulverizing chitin together with kaolinite.
  • Patent Document 1 has problems such as using a large amount of acid and requiring treatment of the acid after the reaction.
  • the method described in Patent Document 2 has a problem that the decomposition efficiency of chitin is low and the productivity is low.
  • the method described in Non-Patent Document 1 has a problem that the reaction rate is slow and the productivity is poor.
  • Patent Document 3 Although the method described in Patent Document 3 is excellent as a method for obtaining NAG, it is not efficient as a method for obtaining chitin oligosaccharides.
  • a branched product is formed in which the hydroxyl group at the 6-position reacts with the ⁇ -1,4-glycosidic bond, and the straight chain is connected by the ⁇ -1,4-glycosidic bond.
  • a large amount of by-products such as dehydrated chitin oligosaccharides are produced.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and provides a method for decomposing chitin, which has few by-products and can efficiently obtain a linear chitin oligosaccharide, and a method for producing a chitin oligosaccharide-containing composition.
  • the challenge is to provide.
  • the present inventors have conducted extensive research in order to solve the above problems. As a result, they have found that by pulverizing a mixture of chitin and a carbon catalyst, by-products can be reduced and a linear chitin oligosaccharide can be efficiently obtained, and the present invention has been conceived.
  • the present invention includes the following [1] to [12].
  • [1] A method for decomposing chitin, which comprises pulverizing a mixture of chitin and a carbon catalyst.
  • [3] The method for decomposing chitin according to any one of [1] and [2], wherein the pulverization treatment time is 10 to 100 hours.
  • [4] The method for decomposing chitin according to any one of [1] to [3], wherein the carbon catalyst is activated carbon.
  • [8] Production of chitin oligosaccharide-containing composition including a step of pulverizing a mixture of chitin and a carbon catalyst to obtain a pulverized product, and a step of adding water to the pulverized product to separate a water-soluble component and a solid component.
  • the method for decomposing chitin of the present invention is a method for pulverizing a mixture of chitin and a carbon catalyst, which has few by-products and can efficiently obtain a linear chitin oligosaccharide.
  • the method for producing a chitin oligosaccharide-containing composition of the present invention is a method including a step of pulverizing a mixture of chitin and a carbon catalyst, and in the step of decomposing chitin, there are few by-products and a linear chitin oligosaccharide is produced.
  • the composition containing the mixture can be efficiently obtained.
  • 6 is an HPLC chromatogram of the chitin oligosaccharide-containing composition obtained in Example 1.
  • 6 is a 1 H NMR spectrum of the chitin oligosaccharide-containing composition obtained in Example 1. It is an HPLC chromatogram of the chitin oligosaccharide-containing composition obtained in Comparative Example 2.
  • 6 is a 1 H NMR spectrum of the chitin oligosaccharide-containing composition obtained in Comparative Example 2.
  • 6 is an HPLC chromatogram of the chitin oligosaccharide-containing composition obtained in Comparative Example 3.
  • 6 is a 1 H NMR spectrum of the chitin oligosaccharide-containing composition obtained in Comparative Example 3.
  • Chitin is a substance contained in biomass, for example, crustaceans such as shrimp and crab, arthropods, insects, squid, shellfish, shells such as krill, and cell walls of fungi such as mushrooms.
  • Chitin may be a purified product or an unrefined product, but it is preferably a purified product.
  • purified chitin can be obtained by performing treatments such as dissolution of protein with alkali and dissolution of calcium with acid, followed by treatments such as neutralization, solid-liquid separation, and washing with water.
  • the purified chitin industrially prepared ones are easily available.
  • an unrefined product it can be used as long as the substance that hinders the decomposition of chitin in the present invention is removed from the chitin obtained from nature.
  • Chitin may be dry or wet, and may be crystalline or amorphous. Chitin is preferably coarsely ground prior to the reaction. Coarse pulverization increases the contact with the carbon catalyst and promotes decomposition. Therefore, it is preferable that the shape and size of chitin are suitable for pulverization. Examples of such a shape and size include a powder having a particle size of 20 to 1000 ⁇ m.
  • the rough crushing process includes, for example, a rough crusher such as a shredder, a jaw crusher, a gyre crusher, a cone crusher, a hammer crusher, a roll crusher, and a roll mill, or a stamp mill, an edge runner, a cutting / shearing process.
  • a rough crusher such as a shredder, a jaw crusher, a gyre crusher, a cone crusher, a hammer crusher, a roll crusher, and a roll mill, or a stamp mill, an edge runner, a cutting / shearing process.
  • Medium crushers such as mills, rod mills, self-made crushers, and roller mills can be used.
  • the time of the coarse pulverization treatment is not particularly limited as long as the treated chitin is uniformly pulverized.
  • Carbon catalyst examples include activated carbon, carbon black, graphite, air-oxidized wood powder and the like. These carbon catalysts may be used alone or in combination of two or more.
  • carbon catalysts wood-based materials such as coconut husk, eucalyptus, bamboo, pine, walnut husk, and bagas, coke, phenol, etc. are treated at high temperature using gas such as water vapor, carbon dioxide, and air (physical method), or Activated carbon prepared by a method (chemical method) of high-temperature treatment using a chemical such as alkali or zinc chloride is preferable.
  • the carbon catalyst is more preferably one in which activated carbon is uniformly heat-treated (air-oxidized) in the presence of air.
  • the air oxidation treatment is usually carried out by treating in air at 400 ° C. to 450 ° C. for about 10 hours.
  • the carbon catalyst preferably has a functional group such as a phenolic hydroxyl group, a carboxy group, a sulfonic acid group, or a phosphoric acid group on its surface because the presence of acid points promotes hydrolysis.
  • the shape of the carbon catalyst is preferably porous, fine particles, or a combination thereof in terms of expanding the contact area with chitin and improving the reactivity.
  • One embodiment of the method for decomposing chitin is characterized in that a mixture of chitin and a carbon catalyst is pulverized.
  • Chitin may be pulverized while being mixed with a carbon catalyst, or chitin and a carbon catalyst may be pulverized in advance in a separate device. It is more convenient and preferable to carry out the pulverization treatment while mixing chitin and the carbon catalyst in the pulverizer.
  • the mass ratio of chitin to the carbon catalyst is 6.5 or less, hydrolysis proceeds at a rate at which there is no practical problem.
  • the mass ratio of chitin to the carbon catalyst is 0.1 or more, the carbon catalyst after the reaction and the product can be efficiently separated.
  • the mass of chitin here is the true mass of chitin (dry mass) excluding the water contained in the raw material. Normally, chitin contains physically adsorbed water, so the amount of water adhering to these is analyzed, and the mass ratio of chitin to the carbon catalyst is determined by the mass of chitin excluding water.
  • Examples of the method for analyzing the amount of adhering water include a method in which the raw material chitin is placed in a constant temperature dryer at 100 ° C. to 120 ° C. and dried until the mass loss disappears. In order to prevent the influence of side reactions such as dehydration reaction during drying, it is more desirable to dry at a lower temperature using a vacuum dryer and quantify.
  • the mixture of chitin and the carbon catalyst before the pulverization treatment contains about 1 to 3% by mass of the physically adsorbed water
  • the physically adsorbed water is used to hydrolyze the chitin.
  • the water content of chitin used as a raw material is preferably 0.1% by mass to 10% by mass, and more preferably 2% by mass to 8% by mass.
  • the sum of the water physically adsorbed on chitin and the added water is regarded as the water content of chitin, and the water can be added so that the water content of chitin is 0.1% by mass to 10% by mass. preferable.
  • Examples of the crushing device used for the crushing process include rolling ball mills such as pot mills, tube mills, and conical mills; jet crushers such as swirling flow type jet mills, collision type jet mills, fluidized layer type jet mills, and wet type jet mills; Shear mills such as crushers (crushers) and ong mills; colloidal mills such as dairy bowls and stone thins; impact crushers such as hammer mills, cage mills, pin mills, disintegrators, screen mills, turbo mills, and centrifugal classification mills; A vibration mill that moves and crushes the medium inside by vibrating a drum; a planetary ball mill, which is a type of crusher that employs rotation and revolutionary motion, and the like.
  • the crushing device is preferably a ball mill or a vibration mill in which a strong compressive force is applied to chitin and tensile stress is applied in both directions of the main chain.
  • the crushing device is more preferably a planetary ball mill, a rolling ball mill, or a vibration mill.
  • a planetary ball mill At the laboratory level, it is preferable to use a planetary ball mill. Industrially, it is preferable to use a vibration mill.
  • the vibration mill does not rotate the drum (crushing cylinder) in which the crushing medium is inserted, but moves the medium inside by vibrating the drum, which is 1/10 to 1/20 of that of the drum rotary ball mill. It can be crushed in about a certain amount of time.
  • the temperature of the crushing treatment is preferably room temperature to 110 ° C. When it is at room temperature or higher, the progress of decomposition does not slow down, and the time required for decomposition does not become too long. In order to further accelerate the decomposition rate, the pulverization treatment can be performed at a high temperature. When the temperature of the pulverization treatment is 110 ° C. or lower, the elimination of the acetamide group of the decomposition product or the dehydration reaction can be suppressed. If the temperature exceeds 110 ° C., a dehydration reaction is likely to occur and volatilization of water may be promoted.
  • the crushing process can be carried out continuously or intermittently. It is preferable that the pulverization treatment is performed intermittently in order to suppress the temperature rise of the object to be treated due to the pulverization treatment.
  • the optimum value varies greatly depending on the crushing device. For example, in the case of the planetary ball mill used in the example, every 5 to 15 minutes of the crushing treatment is performed for 5 to 15 minutes. This can be done by repeating the cycle with an interval in between.
  • the pulverization treatment is continuously performed, it is preferable to carry out the pulverization treatment while maintaining an appropriate temperature by cooling.
  • the pulverization treatment time is preferably 10 hours to 100 hours, more preferably 15 hours to 70 hours, further preferably 20 hours to 60 hours, and particularly preferably 30 hours to 50 hours.
  • the pulverization treatment time is 10 hours or more, the decomposition of chitin is promoted.
  • the pulverization treatment time is 100 hours or less, the chitin oligosaccharide can be obtained more efficiently.
  • the crushing treatment time means the net crushing treatment time excluding the interval.
  • the progress of chitin decomposition can be confirmed by collecting a small amount of the object to be treated over time and measuring the amount of water-soluble components contained in the collected material.
  • the pulverized product obtained after the pulverization treatment includes a decomposed product of chitin, an undecomposed product of chitin, a carbon catalyst, and the like. Unlike the conventional method for decomposing chitin, it does not contain a high concentration of acid, so that the obtained pulverized product can be used as it is in the next step.
  • decomposition of chitin occurs by pulverizing a mixture of chitin and a carbon catalyst.
  • mechanical stress is applied to the mixture by milling. Due to the mechanical stress, a small amount of water contained in the mixture of chitin and the carbon catalyst reacts with chitin, and chitin is hydrolyzed.
  • the effects of the pulverization treatment are that the chitin and the carbon catalyst can be mixed well, that the carbon catalyst is pulverized to diffuse uniformly, that the increase in the specific surface area improves the transfer efficiency of physical stress, and that the chitin is amorphized. It is conceivable that the efficiency of hydrolysis will be improved.
  • Chitin has two hydrolyzable properties: the ⁇ -1,4-glycosidic bond that forms the polymer backbone of NAG and the amide bond of the acetamide group (-NHCOCH 3) that forms the side chain at the 2-position. There is a bond.
  • the ⁇ -1,4-glycosidic bond in the main chain is selectively hydrolyzed instead of the acetamide group in the side chain.
  • the ratio of the decomposition product of chitin remaining in the water-soluble chitin oligosaccharide and being decomposed into NAG is relatively low. Such decomposition into chitin oligosaccharides without being decomposed into NAG is referred to as "partial hydrolysis" in the present disclosure.
  • partial hydrolysis of chitin produces a large amount of linear chitin oligosaccharides in which 2 to 7 NAGs are ⁇ -1,4-glycosidic bonded.
  • Linear chitin oligosaccharides are expected to have various activities against living organisms.
  • by-products can be reduced and a linear chitin oligosaccharide can be efficiently obtained.
  • the "by-product” refers to a product other than NAG and a linear chitin oligosaccharide.
  • Specific examples of by-products include branched oligosaccharides, dehydrated products, and other unidentified products.
  • the rate at which chitin is decomposed to NAG is high.
  • the hydroxyl group at the 6-position of the NAG unit has a ⁇ -1,4-glycosidic bond as shown in the following formula.
  • the reaction produces ⁇ -1,6-glycosidic bonds.
  • Such a recombination reaction occurs between NAGs or chitin oligosaccharides produced by the decomposition of chitin, and some products linked by ⁇ -1,6-glycosidic bond are also produced.
  • such products are referred to as "branched oligosaccharides" to distinguish them from straight-chain chitin oligosaccharides.
  • the hydroxyl group at the 6-position of N-acetylglucosamine at the terminal may undergo a dehydration reaction with the hydroxyl group at the 1-position hemiacetal to form a cyclic ether.
  • a product having such a cyclic ether at the end is referred to as a "dehydrated product" in the present disclosure.
  • N-acetyl groups are hydrolyzed, hydroxyl groups in N-acetylglucosamine undergo a dehydration reaction, and terminal hemiacetals are partially converted to aldehyde groups. It is presumed that those that have undergone a retroaldol reaction will also be produced when they return.
  • the production of such by-products is suppressed, and a linear chitin oligosaccharide can be efficiently obtained. Therefore, the influence of such impurities on the biological activity expected of the linear chitin oligosaccharide can be reduced.
  • the method for producing the chitin oligosaccharide-containing composition of one embodiment includes a step of pulverizing a mixture of chitin and a carbon catalyst to obtain a pulverized product, and adding water to the pulverized product to combine a water-soluble component and a solid component. Includes a step of separation.
  • the step of pulverizing the mixture of chitin and the carbon catalyst is a step of obtaining a pulverized product by carrying out the above-mentioned method for decomposing chitin.
  • the chitin oligosaccharide contained in the obtained pulverized product has water solubility unlike the raw material chitin. Therefore, a composition containing a high proportion of chitin oligosaccharide can be obtained by adding water to the pulverized product, performing an operation such as stirring, and then performing a step of separating the water-soluble component and the solid component.
  • the obtained chitin oligosaccharide-containing composition may contain a water-soluble component such as NAG in addition to the chitin oligosaccharide.
  • the water added to the pulverized product is not particularly limited, but distilled water is usually used. In addition to distilled water, a solution containing a salt, a buffer solution, or the like may be used. An organic solvent miscible with water can be added as long as it does not affect the dissolution of the chitin oligosaccharide.
  • the water-soluble component and the solid component can be separated by a commonly used method for removing the solid content from the suspension. For example, filtration may be performed using a filter paper, a filter cloth, a membrane filter, or the like, and natural sedimentation or centrifugal sedimentation may be performed.
  • the chitin oligosaccharide-containing composition obtained by the production method of one embodiment does not contain acid and alkali. Therefore, it can be used as it is for agricultural materials and the like without neutralization treatment. Further, in order to increase the degree of purification of the chitin oligosaccharide, it is possible to further perform operations such as reprecipitation with an alcohol solvent and HPLC fractionation.
  • composition of the obtained chitin oligosaccharide-containing composition can be confirmed by NMR measurement or HPLC measurement. The measurement conditions will be described in Examples described later.
  • the production method of one embodiment can provide a chitin oligosaccharide-containing composition containing a small proportion of by-products such as branched oligosaccharides and dehydrated products and a high proportion of linear chitin oligosaccharides. Therefore, the chitin oligosaccharide-containing composition obtained by the production method of the present embodiment is expected to be highly effective in its expected application field (for example, agricultural use utilizing elicitor activity), and has high economic value.
  • the method for producing 1-O-alkyl-N-acetylglucosamine of one embodiment is characterized in that alcohol is added to a chitin oligosaccharide-containing composition and alcohol-decomposed.
  • the chitin oligosaccharide-containing composition is dissolved in an alcohol solvent and then heated for reaction to produce a NAG derivative 1-O-alkyl-N-acetylglucosamine from the chitin oligosaccharide.
  • Alcohols used as solvents include monohydric alcohols such as methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, 1-butanol, 2-butanol, 2-methyl-1-propanol and 2-methyl-2-propanol. preferable. From the viewpoint of dissolving the raw material and increasing the reaction efficiency, methanol or ethanol is more preferable, and methanol is further preferable.
  • the amount of alcohol used in the reaction is preferably an amount capable of decomposing at least the entire amount of chitin oligosaccharides.
  • the amount of alcohol is preferably 1 to 500 parts by mass, more preferably 2 to 350 parts by mass, still more preferably 1 part by mass with respect to 1 part by mass of the chitin oligosaccharide-containing composition. Is 2 to 200 parts by mass.
  • the alcohol-added decomposition reaction can be carried out in a container sealed at normal pressure in the presence of the chitin oligosaccharide-containing composition as a raw material and alcohol.
  • the reaction temperature is preferably 120 to 280 ° C, more preferably 150 to 250 ° C, and even more preferably 170 to 230 ° C.
  • the reaction temperature is the temperature of the solution at the time of reaction. By setting the reaction temperature within the above range, the production yield of the target product can be increased.
  • the time from room temperature to the reaction temperature is preferably 5 to 60 minutes, more preferably 5 to 30 minutes, and even more preferably 5 to 20 minutes.
  • the reaction Since the reaction is usually carried out in a closed container such as an autoclave, even if the pressure is normal at the start of heating, when the reaction system is heated at the above temperature, it becomes a pressurized state. Further, the reaction can be carried out by pressurizing the inside of the closed container before or during the reaction.
  • the pressure to pressurize is, for example, 0.1 to 30 MPa, preferably 1 to 20 MPa, and more preferably 2 to 10 MPa.
  • the reaction form may be any reaction form such as a batch type or a continuous type.
  • Example 1 5.00 g of chitin (Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Wako 1st grade, moisture content 6.7% by mass) and 4.00 g of AC-Air were placed in an alumina pot having a capacity of 250 mL together with 100 g of alumina balls having a diameter of 5 mm.
  • This pot was set in a planetary ball mill (PULVERISETTE (registered trademark) 6 manufactured by Fritsch), treated at 500 rpm for 10 minutes, and then cycled with an interval of 10 minutes for 24 hours at room temperature. Therefore, the net milling time excluding the interval is 12 hours.
  • PULVERISETTE registered trademark
  • Fritsch planetary ball mill
  • sample amount 0.1 ⁇ ⁇ (mass of raw material chitin) + (mass of AC-Air) ⁇ / (mass of raw material chitin)
  • the reagent NAG (Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Wako 1st grade) was separately measured by HPLC, and the peak area and the mass of NAG were measured. A calibration curve showing the proportional relationship was created. The calibration factor was determined using this calibration curve, and the NAG content was determined. Since the area value per mass of chitin oligosaccharide is almost the same as that of NAG, the content was determined by applying the calibration factor of NAG.
  • the residue obtained by filtration was dried overnight with an oil rotary vacuum pump (manufactured by ULVAC Co., Ltd., GLD-137CC), and then the mass was measured to be 0.142 g. From this value, the amount remaining as a solid content after the pulverization treatment was determined to be 7.10 g (0.142 g ⁇ 50).
  • the above results are shown in Table 1.
  • the yield of each component in Table 1 represents the ratio (%) of the mass to the mass (dry mass) of true chitin.
  • the total yield of chitin oligosaccharides is the total yield of each chitin oligosaccharide having 2 sugars, 3 sugars, 4 sugars, 5 sugars, 6 sugars and 7 sugars or more.
  • These chitin oligosaccharides may contain by-products such as branched oligosaccharides or dehydrated products, but the content is so low that the former cannot be confirmed by 1 H NMR analysis, and the latter is contained.
  • Example 1 the yield of NAG was 2.7%, and the total yield of chitin oligosaccharides was 28% (disaccharide 3.9%, trisaccharide 5.3%, tetrasaccharide 5.4%, 5 sugar 4). It was 8.8%, 6 sugars 3.7%, 7 sugars or more 5.2%).
  • FIG. 1 shows the results of HPLC measurement. Analysis by HPLC confirmed sharp, shoulderless peaks attributed to NAG and chitin oligosaccharides. The symbols in FIG. 1 indicate the following peaks, respectively.
  • NAG1 1 sugar
  • NAG2 2 sugar
  • NAG3 3 sugar
  • NAG4 4 sugar
  • NAG5 5 sugar
  • NAG6 6 sugar
  • NAG7 ⁇ 7 sugar or more
  • ECX-600 manufactured by JEOL RESONANCE Co., Ltd.
  • the internal standard was DSS.
  • the number of integrations was 32, and the analysis was performed at room temperature.
  • FIG. 2 shows the results of 1 H NMR measurement.
  • 1 4.2 ppm ((A) in FIG. 2), 4.6 ppm ((B) in FIG. 2), 4.8 ppm ((C) in FIG. 2), 5.2 ppm ((D) in FIG. 2) in the 1 H NMR spectrum. )),
  • the peaks of 5.4 ppm ((E) in FIG. 2) were assigned as follows.
  • A Hydrogen at position 6 of dehydrated product (integral strength 1.00)
  • B Hydrogen at position 1 of ⁇ -1,4-glycosidic bond site of linear oligosaccharide (integral strength 18.05)
  • C Hydrogen at the 1-position of the reducing end ( ⁇ -type anomer) of NAG and chitin oligosaccharide and hydrogen at the 3-position of the dehydrated product (integral intensity 4.32)
  • D Hydrogen at the 1st position of the reducing end ( ⁇ -type anomer) of NAG and chitin oligosaccharide (integral strength 5.66)
  • E Hydrogen at the 1-position of the ⁇ -1,6-glycosidic bond site of the branched oligosaccharide and hydrogen at the 1-position of the dehydrated product (integral strength 1.01)
  • total integrated intensity of hydrogen at the 1st position was calculated as follows.
  • the degree of bifurcation was calculated by the following formula.
  • Table 1 shows the type and amount of catalyst used, pulverization treatment time, dissolution rate, yield of each product, degree of branching of chitin oligosaccharide and dehydration rate.
  • the "crushing treatment time” in Table 1 is the net crushing treatment time excluding the interval.
  • Example 2 to 9 Chitin was pulverized by the same method as in Example 1 except that the amount of AC-Air used and the pulverization treatment time were changed as shown in Table 1. The results are shown in Table 1.
  • Example 2 Chitin was pulverized by the same method as in Example 1 except that 4.00 g of kaolinite (manufactured by Sigma-Aldrich) was used instead of AC-Air. The results are shown in Table 1.
  • FIG. 3 shows the results of HPLC measurement.
  • the symbols in FIG. 3 indicate the following peaks, respectively.
  • NAG1 1 sugar
  • NAG2 2 sugar
  • NAG3 3 sugar
  • NAG4 4 sugar
  • NAG5 5 sugar
  • NAG6 6 sugar
  • NAG7 ⁇ 7 sugar or more
  • FIG. 4 shows the results of 1 H NMR measurement.
  • the peaks (A) to (E) in FIG. 4 were assigned as follows.
  • Chitin was pulverized by the same method as in Example 1 except that sulfuric acid-impregnated chitin was used instead of chitin and a cycle of 10 minutes after treatment with a planetary ball mill was performed for 12 hours. went. Therefore, the net milling time excluding the interval is 6 hours.
  • Table 1 The results are shown in Table 1.
  • FIG. 5 shows the results of HPLC measurement.
  • the symbols in FIG. 5 indicate the following peaks, respectively.
  • NAG1 1 sugar
  • NAG2 2 sugar
  • NAG3 3 sugar
  • NAG4 4 sugar
  • NAG5 5 sugar
  • NAG6 6 sugar
  • NAG7 ⁇ 7 sugar or more
  • FIG. 6 shows the results of 1 H NMR measurement.
  • the peaks (A) to (E) in FIG. 6 were assigned as follows.

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Abstract

副生成物を低減し、直鎖のキチンオリゴ糖を効率的に得る方法を提供する。キチンと炭素触媒の混合物を粉砕処理することを特徴とする、キチンの分解方法。キチンと炭素触媒の混合物を粉砕処理し粉砕処理物を得る工程と、前記粉砕処理物に水を加え、水溶性成分と固形成分とを分離する工程と、を含むキチンオリゴ糖含有組成物の製造方法。

Description

キチンの分解方法及びキチンオリゴ糖含有組成物の製造方法
　本発明は、キチンの分解方法、及びキチンオリゴ糖含有組成物の製造方法に関する。
　キチンは、Ｎ－アセチルグルコサミン（以下、「ＮＡＧ」と略記することがある。）がβ－１，４－グリコシド結合した直鎖の含窒素多糖高分子であり、エビ、カニなどの甲殻類、昆虫類、キノコなどの真菌に含まれる、自然界に豊富に存在するバイオマスである。
　キチンの加水分解生成物には、様々な効果効能を有し各種機能素材として利用できるものがある。例えば、単量体であるＮＡＧは、体内に取り込まれることによりヒアルロン酸などのムコ多糖類の生合成を促進して、ひざ・関節痛の改善や美肌・保湿などの効果が認められる成分である。ＮＡＧは、同様の効果を示すグルコサミンより苦みがなく、利用効率が高いことから、近年、機能性食品、医薬関連原料、及び美容関連原料としての利用が期待されている。キチンオリゴ糖は、ＮＡＧが２～７個程度重合した化合物であり、ＮＡＧ取得のための前駆体として有用な成分である。さらに、キチンオリゴ糖は、抗腫瘍、免疫賦活、又は抗菌の作用、ビフィズス菌増殖による腸内環境調整作用、及び植物生体防御機構活性化作用であるエリシター活性が報告されており、医薬用素材、機能性食品、及び農業資材としても注目されている。
　これまでにキチンの分解方法、及びキチンオリゴ糖含有組成物の製造方法が、多数報告されている。例えば、特許文献１には、２種類以上の酸を同時に使用してキチンを加水分解する方法が記載されている。特許文献２には、キチン分解酵素生産能を有する微生物を利用してキチンを分解する方法が記載されている。
　また、粉砕装置を用いたキチンの分解方法も知られている。特許文献３には、酸触媒の存在下、ボールミル等の粉砕装置を用いてキチンを加水分解する方法が記載されている。非特許文献１には、キチンをカオリナイトと共に粉砕処理する方法が記載されている。
特許第４５８８２０５号公報 特開２００４－４１０３５号公報 特開２０１７－１９７４６８号公報
ＡＣＳ　Ｓｕｓｔａｉｎａｂｌｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　＆　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２０１８，６，１６６２－１６６９
　しかしながら、特許文献１に記載の方法では、大量の酸を用いること、反応後の酸の処理が必要なことなどの問題があった。特許文献２に記載の方法では、キチンの分解効率が低く、生産性が低いという問題があった。非特許文献１に記載の方法では、反応速度が遅く、生産性が悪いという問題があった。
　特許文献３に記載の方法は、ＮＡＧを得る方法としては優れるものの、キチンオリゴ糖を得る方法としては効率的ではなかった。キチンオリゴ糖を得ようとする場合には、６位の水酸基がβ－１，４－グリコシド結合と反応した分岐体が生成してしまい、β－１，４－グリコシド結合でつながった、直鎖のキチンオリゴ糖を高選択的に得ることが難しいという問題があった。さらに、キチンオリゴ糖の脱水物など、副生成物が多く生成するという問題があった。
　本発明は上記事情を鑑みてなされたものであり、副生成物が少なく、直鎖のキチンオリゴ糖を効率的に得ることができるキチンの分解方法、及びキチンオリゴ糖含有組成物の製造方法を提供することを課題とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために、鋭意研究を重ねた。その結果、キチンと炭素触媒の混合物を粉砕処理することによって、副生成物を低減し、直鎖のキチンオリゴ糖を効率的に得ることができることを見出し、本発明を想到した。
　すなわち、本発明は以下の［１］～［１２］を包含する。
［１］
　キチンと炭素触媒の混合物を粉砕処理することを特徴とする、キチンの分解方法。
［２］
　前記炭素触媒に対する前記キチンの質量比が、キチン／炭素触媒＝０．１～６．５である、［１］に記載のキチンの分解方法。
［３］
　前記粉砕処理の時間が１０～１００時間である、［１］又は［２］のいずれかに記載のキチンの分解方法。
［４］
　前記炭素触媒が活性炭である、［１］～［３］のいずれかに記載のキチンの分解方法。
［５］
　前記活性炭が空気酸化処理を行った活性炭である、［４］に記載のキチンの分解方法。
［６］
　前記キチンの含水率が０．１～１０質量％である、［１］～［５］のいずれかに記載のキチンの分解方法。
［７］
　前記粉砕処理を遊星ボールミル又は振動ミルにより行う、［１］～［６］のいずれかに記載のキチンの分解方法。
［８］
　キチンと炭素触媒の混合物を粉砕処理し粉砕処理物を得る工程と、前記粉砕処理物に水を加え、水溶性成分と固形成分とを分離する工程と、を含むキチンオリゴ糖含有組成物の製造方法。
［９］
　前記炭素触媒に対する前記キチンの質量比が、キチン／炭素触媒＝０．１～６．５である、［８］に記載のキチンオリゴ糖含有組成物の製造方法。
［１０］
　前記粉砕処理の時間が１０～１００時間である、［８］又は［９］のいずれかに記載のキチンオリゴ糖含有組成物の製造方法。
［１１］
　前記炭素触媒が活性炭である、［８］～［１０］のいずれかに記載のキチンオリゴ糖含有組成物の製造方法。
［１２］
　前記粉砕処理を遊星ボールミル又は振動ミルにより行う、［８］～［１１］のいずれかに記載のキチンオリゴ糖含有組成物の製造方法。
　本発明のキチンの分解方法は、キチンと炭素触媒の混合物を粉砕処理する方法であり、副生成物が少なく、直鎖のキチンオリゴ糖を効率的に得ることができる。
　本発明のキチンオリゴ糖含有組成物の製造方法は、キチンと炭素触媒の混合物を粉砕処理する工程を含む方法であり、キチンを分解する工程において副生成物が少なく、直鎖のキチンオリゴ糖を含む組成物を効率的に得ることができる。
実施例１で得られたキチンオリゴ糖含有組成物のＨＰＬＣクロマトグラムである。 実施例１で得られたキチンオリゴ糖含有組成物の１Ｈ　ＮＭＲスペクトルである。 比較例２で得られたキチンオリゴ糖含有組成物のＨＰＬＣクロマトグラムである。 比較例２で得られたキチンオリゴ糖含有組成物の１Ｈ　ＮＭＲスペクトルである。 比較例３で得られたキチンオリゴ糖含有組成物のＨＰＬＣクロマトグラムである。 比較例３で得られたキチンオリゴ糖含有組成物の１Ｈ　ＮＭＲスペクトルである。
　以下、本発明の実施態様について説明する。なお、以下に説明する実施態様は本発明の代表的な例を示したものであり、それらに限定されるものではない。
［キチン］
　キチンは、例えば、エビ、カニなどの甲殻類、節足動物、昆虫類、イカ、貝、沖アミなどの殻又は表皮、キノコなどの菌類の細胞壁などの、バイオマスに含有される物質である。
　キチンは精製物であっても、未精製物であってもよいが、精製物であることが好ましい。精製キチンは、例えばカニ殻の場合、アルカリによるタンパク質の溶解、酸によるカルシウムの溶解などの処理をした後に、中和、固液分離、水洗などの処理を行うことにより、得ることができる。精製キチンとしては、工業的に調製されたものが容易に入手可能である。未精製物の場合は、自然界から得られるキチンから、本発明におけるキチンの分解を妨げるような物質が除去されていれば、使用することができる。
　キチンは、乾体でも湿体でもよく、結晶性でも非結晶性でもよい。キチンは反応に先立ち、粗粉砕されることが好ましい。粗粉砕により炭素触媒との接触性が増加して、分解が促進される。したがって、キチンの形状及び大きさは、粉砕に適していることが好ましい。そのような形状及び大きさとしては、例えば粒径が２０～１０００μｍの粉体状が挙げられる。
　キチンを粗粉砕する場合、粗粉砕処理には、例えば、シュレッダー、ジョークラッシャー、ジャイレトリクラッシャー、コーンクラッシャー、ハンマークラッシャー、ロールクラッシャー、及びロールミルなどの粗粉砕機、又はスタンプミル、エッジランナ、切断・せん断ミル、ロッドミル、自生粉砕機、及びローラミルなどの中粉砕機を用いることができる。粗粉砕処理の時間は、処理後のキチンが均一に微粉化されれば、特に限定されない。
［炭素触媒］
　炭素触媒としては、例えば活性炭、カーボンブラック、グラファイト、空気酸化した木粉などが挙げられる。これら炭素触媒は、単独で使用しても、２種以上を併用してもよい。
　炭素触媒の中でも、ヤシガラ、ユーカリ、竹、松、くるみガラ、バガスなどの木質材料、コークス、フェノールなどを、水蒸気、二酸化炭素、空気などのガスを用いて高温処理する方法（物理法）、又はアルカリ、塩化亜鉛などの薬剤を用いて高温処理する方法（化学法）により調製した活性炭が好ましい。炭素触媒は、活性炭を空気存在下で均一に加熱処理した（空気酸化処理した）ものがより好ましい。空気酸化処理は、通常４００℃～４５０℃で１０時間程度、空気中で処理することによって実施される。
　炭素触媒は、酸点の存在により加水分解を促進させるという点で、その表面にフェノール性水酸基、カルボキシ基、スルホン酸基、リン酸基などの官能基を有することが好ましい。
　炭素触媒の形状は、キチンとの接触面積を拡大して反応性を向上させるという点で、多孔性若しくは微粒子又はそれらの組み合わせであることが好ましい。
［キチンの分解方法］
　一実施形態のキチンの分解方法は、キチンと炭素触媒の混合物を、粉砕処理することを特徴とする。
　キチンは、炭素触媒と混合しながら粉砕処理してもよいし、キチンと炭素触媒をあらかじめ別装置で混合したものを粉砕処理することもできる。キチンと炭素触媒を粉砕装置内で混合しながら粉砕処理することが、より簡便であり好ましい。
　キチンと炭素触媒の混合物において、炭素触媒に対するキチンの質量比は、キチン／炭素触媒＝０．１～６．５であることが好ましく、キチン／炭素触媒＝０．３～４．０であることがより好ましく、キチン／炭素触媒＝０．４～２．５であることがさらに好ましく、０．５～２．０であることが特に好ましい。炭素触媒に対するキチンの質量比が６．５以下であると、加水分解が実用上問題のない速度で進行する。炭素触媒に対するキチンの質量比が０．１以上であると、反応後の炭素触媒と生成物との分離を効率的に行うことができる。
　なお、ここでいうキチンの質量は、原料に含有される水分を除いた、真のキチンの質量（乾燥質量）である。通常、キチンには物理吸着した水分が含まれているので、これらの付着水分量を分析して、水分を除いたキチンの質量により、炭素触媒に対するキチンの質量比を求める。付着水分量の分析方法としては、原料キチンを１００℃から１２０℃の恒温乾燥機に入れ、質量減少がなくなるまで乾燥させて定量する方法が挙げられる。乾燥時に脱水反応等の副反応による影響を防ぐために、真空乾燥機を用いてより低温で乾燥させ定量することがより望ましい。
　前述のように、粉砕処理を行う前のキチンと炭素触媒の混合物の中には、物理吸着した水分が１～３質量％程度含有されているので、物理吸着した水分を用いてキチンの加水分解を進行させることができる。通常は水を添加しなくても水分量が十分な場合が多いが、乾燥度の高いキチンに対しては、水を添加して粉砕処理を行うこともできる。水を添加しない場合、原料として用いるキチンの含水率は０．１質量％～１０質量％であることが好ましく、２質量％～８質量％であることがより好ましい。水を添加する場合、キチンに物理吸着した水分と添加した水の合計をキチンの含水率とみなし、キチンの含水率が０．１質量％～１０質量％となるように水を添加することが好ましい。
　粉砕処理に用いる粉砕装置としては、例えば、ポットミル、チューブミル、コニカルミルなどの転動ボールミル；旋回流型ジェットミル、衝突タイプジェットミル、流動層型ジェットミル、湿式タイプジェットミルなどのジェット粉砕機；らいかい機（擂潰機）、オングミルなどのせん断ミル；乳鉢、石うすなどのコロイドミル；ハンマーミル、ケージミル、ピンミル、ディスインテグレータ、スクリーンミル、ターボ型ミル、遠心分級ミルなどの衝撃式粉砕機；ドラムを振動させることで中の媒体を運動させ粉砕する振動ミル；自転及び公転の運動を採用した種類の粉砕機である遊星ボールミル、などが挙げられる。
　粉砕装置は、キチンに圧縮力が強く加わり、主鎖の両方向に引っ張り応力が加えられる、ボールミル又は振動ミルが好ましい。粉砕装置は、より好ましくは、遊星ボールミル、転動ボールミル、又は振動ミルである。
　実験室レベルでは、遊星ボールミルを用いることが好ましい。工業的には、振動ミルを用いることが好ましい。振動ミルは、粉砕媒体が挿入されているドラム（粉砕筒）を回転させるのではなく、ドラムを振動させることで中の媒体を運動させることにより、ドラム回転式ボールミルより１／１０～１／２０程度の時間で粉砕が可能になる。
　粉砕処理の温度は、常温～１１０℃であることが好ましい。常温以上であれば、分解の進行が遅くなることがなく、分解に要する時間が長くなりすぎることがない。より分解速度を加速するために、高温で粉砕処理を行うこともできる。粉砕処理の温度が１１０℃以下であれば、分解生成物のアセトアミド基の脱離、又は脱水反応を抑制することができる。１１０℃超であると、脱水反応が起こりやすくなる上、水の揮散も促進される場合がある。
　粉砕処理は、連続的に実施することもできるし、断続的に実施することもできる。粉砕処理に伴う処理対象物の昇温を抑制するため、粉砕処理は断続的に行うことが好ましい。粉砕処理を断続的に行う場合は、粉砕装置により最適値は大きく異なるが、例えば実施例に用いた遊星ボールミルの場合には、５～１５分の粉砕処理を行うごとに、５～１５分のインターバルを挟むサイクルを繰り返す方法により、行うことができる。粉砕処理を連続して行う場合は、冷却することにより適当な温度を維持しながら粉砕処理を行うことが好ましい。
　粉砕処理の時間は、１０時間～１００時間が好ましく、１５時間～７０時間がより好ましく、２０時間～６０時間がさらに好ましく、３０時間～５０時間が特に好ましい。粉砕処理の時間が１０時間以上であると、キチンの分解が促進される。粉砕処理の時間が１００時間以下であると、キチンオリゴ糖をより効率的に得ることができる。なお、粉砕処理を断続的に行う場合、粉砕処理の時間とは、インターバルを除いた正味の粉砕処理時間をいう。
　キチンの分解の進行状況は、経時的に処理対象物を少量採取し、その採取物に含まれる水溶性成分の量を測定することで確認することができる。
　粉砕処理後に得られる粉砕処理物には、キチンの分解物のほか、キチンの未分解物及び炭素触媒などが含まれる。従来のキチンの分解方法と異なり、高濃度の酸は含まれないため、得られた粉砕処理物をそのまま次の工程に使用することができる。
　本発明のキチンの分解方法では、キチンと炭素触媒の混合物を粉砕処理することにより、キチンの分解が起こる。一実施形態のキチンの分解方法では、粉砕処理により混合物に機械応力が加えられる。機械応力により、キチンと炭素触媒の混合物に含有される少量の水分とキチンが反応し、キチンが加水分解される。粉砕処理の効果としては、キチンと炭素触媒をよく混合できること、炭素触媒が微粉化されることにより均一に拡散すること、比表面積の増大により物理応力の伝達効率が向上すること、キチンのアモルファス化により加水分解の効率が向上すること、などが考えられる。
　キチンには、ＮＡＧのポリマー主鎖を形成するβ－１，４－グリコシド結合と、２位に側鎖を形成しているアセトアミド基（－ＮＨＣＯＣＨ３）のアミド結合の、２つの加水分解性の結合が存在する。一実施形態のキチンの分解方法によれば、側鎖のアセトアミド基ではなく、主鎖のβ－１，４－グリコシド結合が選択的に加水分解される。また、一実施形態のキチンの分解方法では、キチンの分解生成物が、水溶性のキチンオリゴ糖に留まり、ＮＡＧにまで分解される割合が比較的低い。このようにＮＡＧまで分解されず、キチンオリゴ糖へと分解されることを、本開示では「部分加水分解」と呼ぶ。
　一実施形態のキチンの分解方法では、キチンの部分加水分解によって、２～７個のＮＡＧがβ－１，４－グリコシド結合した、直鎖のキチンオリゴ糖が多く生成する。直鎖のキチンオリゴ糖は、生物に対する様々な活性を持つことが期待される。
　本発明のキチンの分解方法によれば、副生成物を低減し、直鎖のキチンオリゴ糖を効率的に得ることができる。本開示において「副生成物」とは、ＮＡＧ及び直鎖のキチンオリゴ糖以外の生成物を指す。副生成物として具体的には、分岐オリゴ糖、脱水物、その他の未同定物が含まれる。
　従来知られている、強酸を用いるキチンの分解方法では、キチンがＮＡＧまで分解される速度が速い。また、キチンの分解が進行するだけでなく、同時にＮＡＧ単位中の他の水酸基も活性化されるため、例えば下式のようにＮＡＧ単位の６位の水酸基がβ－１，４－グリコシド結合と反応してα－１，６－グリコシド結合が生成する。このような再結合反応が、キチンの分解により生成したＮＡＧ又はキチンオリゴ糖の間で起こり、一部、α－１，６－グリコシド結合で結合した生成物も生じる。本開示ではこのような生成物を「分岐オリゴ糖」と呼び、直鎖のキチンオリゴ糖と区別する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　一方、例えば下式のように末端のＮ－アセチルグルコサミンの６位の水酸基が１位のヘミアセタールの水酸基と脱水反応を起こし環状エーテルが生成する場合もある。このような末端に環状エーテルをもつ生成物を、本開示では「脱水物」と呼ぶ。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　また、従来のキチンの分解方法では、その他に、Ｎ－アセチル基が加水分解されたもの、Ｎ－アセチルグルコサミン中の水酸基同士が脱水反応を起こしたもの、末端のヘミアセタールが一部アルデヒド基に戻った段階でレトロアルドール反応を起こしたものなども生成すると推定される。
　本発明のキチンの分解方法では、このような副生成物の生成が抑制され、直鎖のキチンオリゴ糖を効率的に得ることができる。したがって、直鎖のキチンオリゴ糖に期待される生物活性に対して、このような不純物による影響を低減することができる。
［キチンオリゴ糖含有組成物の製造方法］
　一実施形態のキチンオリゴ糖含有組成物の製造方法は、キチンと炭素触媒の混合物を粉砕処理し粉砕処理物を得る工程と、前記粉砕処理物に水を加え、水溶性成分と固形成分とを分離する工程と、を含む。
　キチンと炭素触媒の混合物を粉砕処理する工程は、上述のキチンの分解方法を実施することにより、粉砕処理物を得る工程である。
　得られた粉砕処理物に含まれるキチンオリゴ糖は、原料のキチンとは異なり水溶性を有する。このため、粉砕処理物に水を加え、撹拌などの操作の後、水溶性成分と固形成分とを分離する工程を行うことにより、キチンオリゴ糖を高割合で含む組成物を得ることができる。得られたキチンオリゴ糖含有組成物は、キチンオリゴ糖の他に、ＮＡＧなどの水溶性成分を含んでもよい。
　粉砕処理物に加える水は特に限定されないが、通常、蒸留水が用いられる。蒸留水のほか、塩を含む溶液、又は緩衝液などを用いてもよい。キチンオリゴ糖の溶解に影響を与えない範囲で、水と混和可能な有機溶媒を加えることもできる。
　水溶性成分と固形成分の分離は、一般的に用いられる、懸濁液からの固形分の除去方法により行うことができる。例えば、ろ紙、ろ布、メンブレンフィルターなどを用いてろ過を行ってもよく、自然沈降又は遠心沈降を行うこともできる。
　一実施形態の製造方法によって得られるキチンオリゴ糖含有組成物は、酸及びアルカリを含まない。このため、中和処理を行うことなく、そのまま農業資材などの用途に使用することが可能である。また、キチンオリゴ糖の精製度を高めるために、アルコール溶媒での再沈殿、ＨＰＬＣ分取などの操作をさらに行うことも可能である。
　得られたキチンオリゴ糖含有組成物の組成は、ＮＭＲ測定、又はＨＰＬＣ測定により確認することができる。測定条件は、後述の実施例において説明する。
　一実施形態の製造方法は、分岐オリゴ糖、脱水物などの副生成物の割合が少なく、直鎖のキチンオリゴ糖を高割合で含むキチンオリゴ糖含有組成物を提供することができる。したがって、本実施形態の製造方法により得られたキチンオリゴ糖含有組成物は、その期待される応用分野（例えば、エリシター活性を利用する農業用途）において高い効果が見込まれ、経済的価値が高い。
［１－Ｏ－アルキル－Ｎ－アセチルグルコサミンの製造方法］
　一実施形態の１－Ｏ－アルキル－Ｎ－アセチルグルコサミンの製造方法は、キチンオリゴ糖含有組成物にアルコールを加え、加アルコール分解することを特徴とする。
　キチンオリゴ糖含有組成物をアルコール溶媒に溶解した後、加熱して反応を行うことで、キチンオリゴ糖からＮＡＧ誘導体である１－Ｏ－アルキル－Ｎ－アセチルグルコサミンが製造される。
　溶媒として使用するアルコールは、例えば、メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、２－メチル－１－プロパノール、２－メチル－２－プロパノールなどの１価アルコールが好ましい。原料を溶解させ反応効率を高めるという観点から、メタノール又はエタノールがより好ましく、メタノールがさらに好ましい。
　反応に用いるアルコールの量は、少なくともキチンオリゴ糖を全量、加アルコール分解できる量であることが好ましい。反応物の流動性及び撹拌性などの観点から、アルコールの量は、キチンオリゴ糖含有組成物１質量部に対して、好ましくは１～５００質量部、より好ましくは２～３５０質量部、さらに好ましくは２～２００質量部である。アルコールの量を上記範囲内とすることにより、加アルコール分解において高い生成物収率と生成物濃度を両立することができる。
　加アルコール分解反応は、原料であるキチンオリゴ糖含有組成物とアルコールの存在下、常圧で密閉した容器内で行うことができる。反応温度は、好ましくは１２０～２８０℃、より好ましくは１５０～２５０℃、さらに好ましくは１７０～２３０℃である。なお、反応温度は反応時の溶液の温度である。反応温度を上記範囲内とすることで、目的生成物の製造収率を高めることができる。反応における加熱では、室温から反応温度に到達するまでの時間は、好ましくは５～６０分、より好ましくは５～３０分、さらに好ましくは５～２０分である。
　反応は、通常はオートクレーブなどの密閉容器内で実施されるため、加熱開始時は常圧であっても、上記温度で反応系が加熱されると加圧状態となる。また、反応前又は反応中に密閉容器内を加圧し、反応を行うこともできる。加圧する圧力は、例えば０．１～３０ＭＰａ、好ましくは１～２０ＭＰａ、さらに好ましくは２～１０ＭＰａである。
　加アルコール分解は、反応物を撹拌しながら行うことが好ましい。反応形式は、バッチ式、連続式などのいずれの反応形式でもよい。
　以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
［炭素触媒の調製］
　活性炭（味の素ファインテクノ株式会社製、ホクエツＢＡ）４．０ｇをガラス製の皿（ＡＧＣテクノグラス株式会社製、高さ２ｍｍ、φ１３０ｍｍ）に広げ、卓上マッフル炉（デンケン・ハイデンタル株式会社製、ＫＤＦ　Ｓ９０）内で処理した。室温から５℃ｍｉｎ－１の速さで１２０℃まで昇温させ、１時間温度を一定にして活性炭を乾燥させた後、５℃ｍｉｎ－１の速さで４２５℃まで昇温した。４２５℃で１０時間保持したあと室温まで自然冷却することで黒色粉末２．０ｇを得た。この黒色粉末を「ＡＣ－Ａｉｒ」と表記する。
［実施例１］
　キチン（富士フイルム和光純薬株式会社、和光１級、含水率６．７質量％）５．００ｇとＡＣ－Ａｉｒ４．００ｇを直径５ｍｍのアルミナボール１００ｇとともに容量２５０ｍＬのアルミナポットに入れた。このポットを遊星ボールミル（フリッチュ社製、ＰＵＬＶＥＲＩＳＥＴＴＥ（登録商標）６）にセットして５００ｒｐｍで１０分間処理した後に１０分間のインターバルを置くサイクルを２４時間、常温で行った。したがって、インターバルを除いた正味の粉砕処理の時間は１２時間である。
　粉砕装置の中のキチン分解物とＡＣ－Ａｉｒの混合物から、０．１８ｇの粉砕処理混合物をサンプルとして取り出した。サンプル量は、下記式でその量を決めた。
　サンプル量（ｇ）＝０．１×｛（原料キチンの質量）＋（ＡＣ－Ａｉｒの質量）｝／（原料キチンの質量）
　このサンプル量であれば、原料キチン０．１ｇ相当の分解物を採取したことになる。これは、原料キチンの質量の５０分の１に相当する。
　このサンプルに対し、蒸留水１０ｍＬを加え、１０分間の超音波処理を行うことで水溶性キチンオリゴ糖を溶解させた。この懸濁液を孔径０．１μｍのメンブレンフィルター（アドバンテック東洋株式会社製、ＰＴＦＥ、２５ｍｍφ、孔径０．１μｍ）を使用してろ過した。得られたキチンオリゴ糖を含むろ液は生成物の確認のためにＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフ）分析を行った。その際、ＨＰＬＣ用のポンプＬＣ―１０ＡＴ（島津製作所製）を用い、水を移動相とした。ＨＰＬＣのカラムにはＳＢ８０２．５ＨＱ（昭和電工株式会社製、８．０ｍｍφ、長さ３００ｍｍ）を３本直列に接続して用い、カラム温度はカラムオーブン（島津製作所製、ＣＴＯ－２０Ａ）により５５℃一定とした。インジェクションはオートインジェクタ（島津製作所製、ＳＩＬ－２０Ａ）を用いて１０μＬとした。検出器は示差屈折率検出器（島津製作所製、ＲＩＤ－２０Ａ）を用いた。
　ＨＰＬＣによる分析から、ＮＡＧとキチンオリゴ糖の収率を算出するため、別途、試薬のＮＡＧ（富士フィルム和光純薬株式会社、和光１級）をＨＰＬＣで測定し、そのピーク面積とＮＡＧの質量の比例関係を示す検量線を作成した。この検量線を用いてキャリブレーションファクターを決定し、ＮＡＧの含有量を求めた。キチンオリゴ糖の質量当たりの面積値はＮＡＧの場合とほぼ同じであるため、ＮＡＧのキャリブレーションファクターを適用して含有量を求めた。
　ろ過によって得られた残渣は油回転真空ポンプ（株式会社ＵＬＶＡＣ製、ＧＬＤ－１３７ＣＣ）で終夜乾燥させた後、質量を測定すると０．１４２ｇであった。この値から粉砕処理後に固形分として残った量を７．１０ｇ（０．１４２ｇ×５０）と決定した。
　ＡＣ－Ａｉｒを４．００ｇ使用したので、原料キチン由来の固形分は、３．１０ｇとなる。また、原料キチンの含水率は６．７質量％であったため、原料キチン中の真のキチンの質量（乾燥質量）は４．６７ｇとなる。ゆえに、キチンが水溶性の分解物に変化した割合を溶解率とすると、実施例１の溶解率は３４％であった。
　溶解率（％）＝１００×（４．６７ｇ－３．１０ｇ）／４．６７ｇ
　　　　　　　＝３４％
　以上の結果を表１に示す。表１における各成分の収率は、真のキチンの質量（乾燥質量）に対する質量の割合（％）を表す。キチンオリゴ糖の合計収率は、２糖、３糖、４糖、５糖、６糖及び７糖以上の各キチンオリゴ糖の収率の合計値である。これらのキチンオリゴ糖には分岐オリゴ糖又は脱水物などの副生成物が含まれている可能性もあるが、１Ｈ　ＮＭＲでの分析で前者は確認できないくらいに含有量が少なく、後者の含有量も少ない（脱水率３．５％）ので、ピーク面積値を全てキチンオリゴ糖のものとして収率を計算した。また、未同定物の割合を以下の計算により算出した。
　未同定物の割合（％）＝溶解率（％）－｛（ＮＡＧの収率（％））＋（キチンオリゴ糖の収率（％））｝
　実施例１では、ＮＡＧの収率が２．７％、キチンオリゴ糖の合計収率が２８％（２糖３．９％、３糖５．３％、４糖５．４％、５糖４．８％、６糖３．７％、７糖以上５．２％）であった。
　図１にＨＰＬＣ測定の結果を示す。ＨＰＬＣによる分析では、ＮＡＧとキチンオリゴ糖に帰属される、シャープでショルダーの無いピークが確認された。図１中の符号は、それぞれ以下のピークを示す。
ＮＡＧ１：１糖、ＮＡＧ２：２糖、ＮＡＧ３：３糖、ＮＡＧ４：４糖、ＮＡＧ５：５糖、ＮＡＧ６：６糖、ＮＡＧ７～：７糖以上
　次に、以下の測定条件により１Ｈ　ＮＭＲ分析を行った。ろ過で得られたキチンオリゴ糖を含むろ液２ｍＬを油回転真空ポンプ（株式会社ＵＬＶＡＣ製、ＧＬＤ－１３７ＣＣ）で終夜乾燥させた後、重水（シグマアルドリッチ社製、ＮＭＲ用溶媒）１ｍＬ及び３－（トリメチルシリル）－１－プロパンスルホン酸ナトリウム塩（ＤＳＳ）（シグマアルドリッチ社製）を加えて溶解させ、ＮＭＲサンプルチューブ（アズワン株式会社製、ＡＳ１ＮＭＲ）に入れた。これをＮＭＲサンプルとし、１Ｈ　ＮＭＲ（核磁気共鳴）スペクトルを測定した。その際、ＦＴ－ＮＭＲ装置はＥＣＸ－６００（株式会社ＪＥＯＬ　ＲＥＳＯＮＡＮＣＥ製）を用い、内部標準をＤＳＳとした。積算回数を３２回とし、室温で分析を行った。
　図２に１Ｈ　ＮＭＲ測定の結果を示す。１Ｈ　ＮＭＲスペクトルにおける４．２ｐｐｍ（図２の（Ａ））、４．６ｐｐｍ（図２の（Ｂ））、４．８ｐｐｍ（図２の（Ｃ））、５．２ｐｐｍ（図２の（Ｄ））、５．４ｐｐｍ（図２の（Ｅ））のピークはそれぞれ、以下のように帰属した。
（Ａ）脱水物の６位の水素（積分強度１．００）
（Ｂ）直鎖オリゴ糖のβ－１，４－グリコシド結合部位の１位の水素（積分強度１８．０５）
（Ｃ）ＮＡＧとキチンオリゴ糖の還元末端（β型アノマー）の１位の水素と脱水物の３位の水素（積分強度４．３２）
（Ｄ）ＮＡＧとキチンオリゴ糖の還元末端（α型アノマー）の１位の水素（積分強度５．６６）
（Ｅ）分岐オリゴ糖のα－１，６－グリコシド結合部位の１位の水素と脱水物の１位の水素（積分強度１．０１）
　脱水率は以下の計算式で求めた。
　脱水率（％）＝１００×（脱水物の６位の水素の積分強度）／（１位の水素の積分強度の合計）
　ここで、１位の水素の積分強度の合計は以下のように求めた。
　（１位の水素の積分強度の合計）
＝（直鎖オリゴ糖の１位の水素の積分強度）＋（分岐オリゴ糖の１位の水素と脱水物の１位の水素の積分強度）＋（ＮＡＧとキチンオリゴ糖の還元末端（β型アノマー）の１位の水素と脱水物の３位の水素の積分強度）－（脱水物の６位の水素の積分強度）＋（ＮＡＧとキチンオリゴ糖の還元末端（α型アノマー）の１位の水素の積分強度）
＝１８．０５＋１．０１＋４．３２－１．００＋５．６６
＝２８．０４
　よって、脱水率＝１００×１．００／２８．０４＝３．５％であった。
　分岐度は以下の計算式で求めた。
　分岐度（％）
＝１００×｛（分岐オリゴ糖の１位の水素と脱水物の１位の水素の積分強度）－（脱水物の６位の水素の積分強度）｝／（１位の水素の積分強度の合計）
＝１００×（１．０１－１．００）／２８．０４
＝０．０３５
　よって、分岐度は０．１％未満であった。
　表１に、触媒の種類と使用量、粉砕処理時間、溶解率、各生成物の収率、キチンオリゴ糖の分岐度及び脱水率を示す。なお、表１中の「粉砕処理時間」は、インターバルを除いた正味の粉砕処理の時間である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
［実施例２～９］
　ＡＣ－Ａｉｒの使用量及び粉砕処理時間を表１に記載のとおり変えた以外は、実施例１と同様の方法によりキチンの粉砕処理を行った。結果を表１に示す。
［比較例１］
　ＡＣ－Ａｉｒを使用しなかったこと以外は、実施例１と同様の方法によりキチンの粉砕処理を行った。結果を表１に示す。
　比較例１の結果から、部分加水分解はほとんど進行していないことが確認された。
［比較例２］
　ＡＣ－Ａｉｒの代わりにカオリナイト（シグマアルドリッチ社製）４．００ｇを使用したこと以外は、実施例１と同様の方法によりキチンの粉砕処理を行った。結果を表１に示す。
　図３にＨＰＬＣ測定の結果を示す。図３中の符号は、それぞれ以下のピークを示す。
ＮＡＧ１：１糖、ＮＡＧ２：２糖、ＮＡＧ３：３糖、ＮＡＧ４：４糖、ＮＡＧ５：５糖、ＮＡＧ６：６糖、ＮＡＧ７～：７糖以上
　図４に１Ｈ　ＮＭＲ測定の結果を示す。図４中の（Ａ）～（Ｅ）のピークはそれぞれ、以下のように帰属した。
（Ａ）脱水物の６位の水素（積分強度１．００）
（Ｂ）直鎖オリゴ糖のβ－１，４－グリコシド結合部位の１位の水素（積分強度９．４１）
（Ｃ）ＮＡＧとキチンオリゴ糖の還元末端（β型アノマー）の１位の水素と脱水物の３位の水素（積分強度２．８０）
（Ｄ）ＮＡＧとキチンオリゴ糖の還元末端（α型アノマー）の１位の水素（積分強度１．７２）
（Ｅ）分岐オリゴ糖のα－１，６－グリコシド結合部位の１位の水素と脱水物の１位の水素（積分強度１．０２）
　表１の結果より、比較例２におけるＮＡＧの収率は１．３％、キチンオリゴ糖の合計収率（副生成物を含む収率）は１３％であり、実施例１～８と比べて低かった。さらに、比較例２においては未同定物の割合が７％と高いことから、キチンオリゴ糖の選択率が低いことが確認された。また、１Ｈ　ＮＭＲ分析の結果から、キチンオリゴ糖の脱水率が７．２％と高いことが確認された。
［比較例３］
　キチン５．００ｇ（真のキチンの質量（乾燥質量）４．６７ｇ、ＮＡＧ単位として２３．０ｍｍｏｌ）を硫酸０．５７ｇ（富士フイルム和光純薬製　精密分析用、５．５８ｍｍｏｌ、キチンに対するモル比１／４．１）を含むジエチルエーテル１５ｍＬに分散させた。その後、ジエチルエーテルを留去し、乾燥することで粉末を得た。この粉末を「硫酸含浸キチン」と表記する。
　キチンの代わりに硫酸含浸キチンを使用したことと、遊星ボールミルで１０分間処理した後に１０分間のインターバルを置くサイクルを１２時間行ったこと以外は、実施例１と同様の方法によりキチンの粉砕処理を行った。したがって、インターバルを除いた正味の粉砕処理の時間は６時間である。結果を表１に示す。
　図５にＨＰＬＣ測定の結果を示す。図５中の符号は、それぞれ以下のピークを示す。
ＮＡＧ１：１糖、ＮＡＧ２：２糖、ＮＡＧ３：３糖、ＮＡＧ４：４糖、ＮＡＧ５：５糖、ＮＡＧ６：６糖、ＮＡＧ７～：７糖以上
　図６に１Ｈ　ＮＭＲ測定の結果を示す。図６中の（Ａ）～（Ｅ）のピークはそれぞれ、以下のように帰属した。
（Ａ）脱水物の６位の水素（積分強度１．００）
（Ｂ）直鎖オリゴ糖のβ－１，４－グリコシド結合部位の１位の水素（積分強度６．６０）
（Ｃ）ＮＡＧとキチンオリゴ糖の還元末端（β型アノマー）の１位の水素と脱水物の３位の水素（積分強度２．１６）
（Ｄ）ＮＡＧとキチンオリゴ糖の還元末端（α型アノマー）の１位の水素（積分強度２．４７）
（Ｅ）分岐オリゴ糖のα－１，６－グリコシド結合部位の１位の水素と脱水物の１位の水素（積分強度１．２８）
　表１の結果より、比較例３におけるＮＡＧの収率は２０％、キチンオリゴ糖の合計収率（副生成物を含む収率）は４５％であった。しかし、比較例３においては未同定物の割合が３６％と高いことから、キチンオリゴ糖の選択率が低いことが確認された。
　図５に示すＨＰＬＣ測定の結果から、各オリゴ糖のピークのシフトやブロード化が確認され、脱水物や分岐オリゴ糖などが生成していることが分かった。さらに、１Ｈ　ＮＭＲ分析の結果から、キチンオリゴ糖の分岐度が２．４％と高く、直鎖のキチンオリゴ糖の選択率が低いことが確認された。また、キチンオリゴ糖の脱水率が８．７％と高いことが確認された。
　以上の結果より、実施例１～９では、比較例１～３と比較して、脱水物及び分岐オリゴ糖などの副生成物が少なく、直鎖のキチンオリゴ糖を高割合で効率的に得られることが明らかとなった。
　本発明のキチンの分解方法、及びキチンオリゴ糖含有組成物の製造方法により、副生成物を低減し、直鎖のキチンオリゴ糖を効率的に得ることができる。

Claims (12)

  1. 　キチンと炭素触媒の混合物を粉砕処理することを特徴とする、キチンの分解方法。
  2. 　前記炭素触媒に対する前記キチンの質量比が、キチン／炭素触媒＝０．１～６．５である、請求項１に記載のキチンの分解方法。
  3. 　前記粉砕処理の時間が１０～１００時間である、請求項１又は２のいずれかに記載のキチンの分解方法。
  4. 　前記炭素触媒が活性炭である、請求項１～３のいずれか一項に記載のキチンの分解方法。
  5. 　前記活性炭が空気酸化処理を行った活性炭である、請求項４に記載のキチンの分解方法。
  6. 　前記キチンの含水率が０．１～１０質量％である、請求項１～５のいずれか一項に記載のキチンの分解方法。
  7. 　前記粉砕処理を遊星ボールミル又は振動ミルにより行う、請求項１～６のいずれか一項に記載のキチンの分解方法。
  8. 　キチンと炭素触媒の混合物を粉砕処理し粉砕処理物を得る工程と、前記粉砕処理物に水を加え、水溶性成分と固形成分とを分離する工程と、を含むキチンオリゴ糖含有組成物の製造方法。
  9. 　前記炭素触媒に対する前記キチンの質量比が、キチン／炭素触媒＝０．１～６．５である、請求項８に記載のキチンオリゴ糖含有組成物の製造方法。
  10. 　前記粉砕処理の時間が１０～１００時間である、請求項８又は９のいずれかに記載のキチンオリゴ糖含有組成物の製造方法。
  11. 　前記炭素触媒が活性炭である、請求項８～１０のいずれか一項に記載のキチンオリゴ糖含有組成物の製造方法。
  12. 　前記粉砕処理を遊星ボールミル又は振動ミルにより行う、請求項８～１１のいずれか一項に記載のキチンオリゴ糖含有組成物の製造方法。
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