WO2017163715A1 - 高感度バイオセンサおよびその製造方法 - Google Patents

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平 加治佐
康伸 関水
利弥 坂田
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株式会社Ｐｒｏｖｉｇａｔｅ
国立大学法人東京大学
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Definitions

  • the present invention relates to a biosensor for detecting a detection target substance in a test sample.
  • a biosensor recognizes external information (for example, chemical elements) as some physical signal by utilizing the excellent molecular discrimination power of living organisms, and has various principles and measurement objects. More specifically, a biosensor is a type of chemical sensor that uses a chemical substance as a measurement target. The biosensor is a molecular identification element that recognizes only the measurement target substance, and a physical signal such as an electrical signal indicating that the information is recognized. And a signal conversion element for converting the signal into the signal. In general, biosensors such as enzymes, antibodies, DNA, cells, microorganisms, and compounds that capture biomolecules are used for the molecular identification element, so these sensors are called biosensors.
  • an ordinary electronic device or chemical sensor such as an electrode, thermistor, crystal resonator, surface plasmon resonance, or semiconductor element is used.
  • a field effect transistor FET
  • Research on the biosensor used has become active.
  • biosensors using FETs when a molecular identification element recognizes a chemical substance to be measured, physical changes such as heat, mass, and charge, and chemical changes such as decomposition of the target substance and generation of the substance occur. The change is converted into an electric signal by the FET which is a signal conversion element, and the target substance is measured.
  • Biosensors using FETs can (1) be able to electrically detect charges inherent to ions and molecules, (2) do not require time and effort until measurement, (3) enable real-time measurement, (4) non-measurement It has features such as labeling and non-invasive electrical measurement, and (5) miniaturization and integration by semiconductor microfabrication technology.
  • the biosensor described in Patent Document 1 was an epoch-making invention in that a trace amount of a measurement target substance contained in a body fluid can be measured.
  • various substances other than the measurement target substance are contained in the body fluid, in practical use of such a biosensor, not only the detection sensitivity for the measurement target substance is increased, but also There was a need to prevent false detection (ie, increase detection specificity).
  • the present inventors allow substantially all substances other than the detection target substance to interact with the gate electrode. It was found that it becomes possible to prevent.
  • the molecular template polymer refers to a polymer in which a “molecular template” having a structure complementary to the molecular structure of the detection target substance is formed on the polymer surface or in the polymer by a predetermined production method. Only the substance to be detected can be incorporated into the molecular template.
  • the present inventors have further studied for the practical application of a biosensor in which a molecular template polymer is applied to a gate electrode. Then, the present inventors have found that a biosensor in which a molecular template polymer produced by a simple method is applied to a gate electrode, although the specificity to a detection target substance is improved as compared with the prior art, the molecular template polymer A new technical problem was encountered in that the detection sensitivity and detection stability for the detection target substance were slightly reduced by the thickness of the layer.
  • the inventors control the film thickness of the molecular template polymer layer applied to the gate electrode by applying the polymer control technology mainly used in the field of polymer chemistry to this technical field.
  • the molecular template polymer layer can be made an ultrathin film layer.
  • a gate electrode having an ultra-thin molecular template polymer layer has not only detection specificity for a detection target substance but also extremely high detection sensitivity (see also the results of Examples of the present application).
  • the molecular template polymer layer applied to the gate electrode is an ultra-thin film layer, so that the time from when the device is energized until the potential of the gate electrode surface is stabilized (that is, measured) The time from when the device is turned on until the device is ready to start measurement) has been greatly reduced, and the time from the start of measurement to the end of measurement has also been greatly reduced (in the embodiment of this application). See also results).
  • the biosensor of the present invention is a device that has both high detection sensitivity and detection specificity for a detection target substance, and is excellent in practicality.
  • the present invention includes an identification substance that can bind to a detection target substance, and an electrode that charges a charge of the identification substance, and is generated by binding the detection target substance to the identification substance.
  • a polymer layer in which a molecular template having a structure complementary to the molecular structure of the detection target substance is formed on all or part of the surface of the electrode is formed on all or part of the surface of the electrode.
  • the present invention relates to a biosensor, wherein the polymer layer contains the identification substance, and the polymer layer is an ultrathin film layer.
  • the ultra thin film layer is a thin film layer having a thickness of 1 ⁇ m or less.
  • the polymer layer is (A): A monomer solution containing one or a plurality of types of monomers, the detection target substance, and the identification substance is polymerized on all or a part of the surface of the electrode, whereby all or one of the surfaces of the electrode is polymerized. Forming a polymer layer that is an ultra-thin layer on the part; and (B): After the step (a), by removing the detection target substance from the polymer layer, forming a molecular template having a structure complementary to the molecular structure of the detection target substance in the polymer layer , It is formed by the method containing.
  • the polymerization of the monomer solution is a living radical polymerization or an electrolytic polymerization.
  • the living radical polymerization is atom transfer radical polymerization (ATRP), reversible addition-cleavage chain transfer polymerization (RAFT), or nitroxide-mediated polymerization (NMP). It is characterized by.
  • the living radical polymerization is atom transfer radical polymerization (ATRP), and prior to the step (a), the polymerization initiating molecules are preliminarily formed on all or part of the surface of the electrode. It is characterized by being connected.
  • ATRP atom transfer radical polymerization
  • a monomer solution containing one or more types of monomers, the detection target substance, and the identification substance is applied to the surface of the electrode using spin coating. And a polymer layer of an ultrathin film layer is formed on all or part of the surface of the electrode by polymerizing the applied monomer solution.
  • the electrode is a gold electrode, a silver electrode, a copper electrode, or a platinum electrode.
  • the monomer solution comprises an acrylamide derivative, a methacrylamide derivative, an acrylate derivative, a methacrylate derivative, acrylonitrile, 2-vinylpyridine, 4-vinylpyridine, N-vinyl-2-pyrrolidone, and acetic acid. It contains at least one monomer selected from the group consisting of vinyl.
  • the electrode is electrically connected to a gate insulating film of a field effect transistor.
  • the electrode is disposed away from the field effect transistor, and the electrode is connected to another metal electrode provided on the gate insulating film and a wiring, It is electrically connected to the gate insulating film.
  • the electrode is placed directly on the gate insulating film, thereby being electrically connected to the gate insulating film.
  • the detection target substance is a substance derived from a living body, a substance in the environment, or a substance in food.
  • the living body-derived substance is a body fluid-derived substance.
  • the body fluid is a group consisting of blood, lymph fluid, tissue fluid, body cavity fluid, digestive fluid, sweat, tears, nasal discharge, saliva, urine, semen, vaginal fluid, amniotic fluid, and milk. It is selected from these.
  • another embodiment of the present invention is an electrode used in a biosensor, wherein the biosensor detects a change in charge density of the electrode caused by binding of a detection target substance to an identification substance.
  • a sensor and the electrode is an electrode that charges a charge of the identification substance that can bind to the detection target substance, and the whole or a part of the surface of the electrode is complementary to a molecular structure of the detection target substance.
  • the present invention relates to an electrode, in which a polymer layer having a molecular template having a typical structure is formed, the polymer layer includes the identification substance, and the polymer layer is an ultrathin film layer.
  • Another embodiment of the present invention is a method of manufacturing an electrode for use in a biosensor, the biosensor comprising a change in charge density of the electrode caused by binding of a substance to be detected to an identification substance.
  • the electrode is an electrode that charges the charge of the identification substance that can bind to the detection target substance,
  • the method (A): by polymerizing a monomer solution containing one or more types of monomers, the substance to be detected, and the identification substance on all or part of the surface of the electrode, Forming a polymer layer that is an ultra-thin layer in part; and (B): After the step (a), by removing the detection target substance from the polymer layer, forming a molecular template having a structure complementary to the molecular structure of the detection target substance in the polymer layer And a method comprising:
  • the living radical polymerization is atom transfer radical polymerization (ATRP), and prior to the step (a), the polymerization initiating molecules are preliminarily formed on all or part of the surface of the electrode. It is characterized by including the process to combine.
  • ATRP atom transfer radical polymerization
  • a monomer solution containing one or more types of monomers, the detection target substance, and the identification substance is applied to the electrode using spin coating. It is a step of forming a polymer layer of an ultra-thin film layer on all or part of the surface of the electrode by applying to all or part of the surface and polymerizing the applied monomer solution.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a schematic configuration of a glucose sensor according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 shows the results of measuring the film thickness of the polymer layer produced by the method of Production Example 1 with an atomic force microscope.
  • FIG. 3 is a graph comparing the time from the start of energization to the stabilization of the gate surface potential in the apparatus of Production Example 1 or Comparative Production Example 1.
  • FIG. 4 shows changes in the gate surface potential when a glucose solution is added in the apparatus of Production Example 1 or Comparative Production Example 1.
  • FIG. 5 is a graph comparing detection of low-concentration glucose in the apparatus of Production Example 2 or Production Example 3.
  • FIG. 6 is a graph comparing detection of low-concentration glucose in the devices of Production Example 4 and Production Example 5.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a schematic configuration of a glucose sensor according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 shows the results of measuring the film thickness of the polymer layer produced by the method of Production Example 1 with an atomic force
  • FIG. 7 is a graph showing the amount of change in the gate surface potential when each concentration of glucose is added in the devices of Production Example 4 and Production Example 5.
  • FIG. 8 is a graph comparing detection of low-concentration dopamine in the apparatus of Production Example 6.
  • FIG. 9 is a graph showing the amount of change in gate surface potential when each concentration of dopamine is added in the apparatus of Production Example 6.
  • the biosensor of the present invention detects an electrical change caused by the binding between a detection target substance and an identification substance that can specifically or selectively bind to the detection target substance as a change in the charge density of the electrode. Based on the basic principle (details will be described later).
  • the “detection target substance” in the present invention is not limited as long as it can produce a molecular template polymer corresponding to the substance, and those skilled in the art can detect various substances based on common general technical knowledge.
  • the biosensor of the present invention can be used for detection of a very small amount of substance in various test samples.
  • a biological substance, an environmental substance, or a food The substance in it can be detected.
  • the present invention can be detected even if the concentration of the detection target substance in the test sample is extremely low.
  • body fluid blood, lymph, tissue fluid, body cavity fluid, digestive fluid, sweat, tears, nasal discharge, saliva, urine
  • Semen vaginal fluid, amniotic fluid, milk, etc.
  • substances in body fluid include, for example, body fluid components (for example, alkaline phosphatase, AST, ALT, lactate dehydrogenase, leucine aminopeptidase, ⁇ -GTP, creatine kinase, cholinesterase, bilirubin, bile acid, albumin, urea nitrogen Creatinine, uric acid, HDL cholesterol, LDL cholesterol, neutral fat, glucose, amylase, lipase, sodium, potassium, chlor, calcium, inorganic phosphorus, magnesium, zinc, iron, ferritin, C-reactive protein, ⁇ 2-microglobulin, Hemoglobin A1C, glycoalbumin, ammonia, various hormones, various neurotransmitters (for example, monoamines such as dopamine, adrenaline, noradrenaline, serotonin, melatonin, histamine; asparagi Components such as amino acids such as acid, glutamic acid, ⁇ -aminobutyric acid, g
  • the “discriminating substance capable of binding to the detection target substance” in the present invention can be appropriately selected by those skilled in the art depending on the detection target substance, and the identification substance may specifically bind to the detection target substance.
  • the substance may be a substance that can bind selectively to the substance to be detected.
  • Examples of the “discriminating substance capable of binding to the detection target substance” in the present invention include, for example, a pair of substances known to cause specific or selective interaction (for example, glucose and phenylboronic acid). Lactic acid and phenylboronic acid, histamine and carboxyl group monomer, uric acid and carboxyl group monomer, creatinine and carboxyl group monomer, sialic acid and phenylboronic acid & amino group monomer, dopamine and phenylboronic acid & amino group monomer, Biotin or streptavidin), aptamer that specifically binds to a specific molecule (eg, nucleic acid aptamer, peptide aptamer), receptor-ligand (or agonist) combination, specific to the substance to be detected Antibody (eg, a monoclonal antibody that specifically binds to the detection target substance) or an antigen-binding fragment thereof, or a nucleic acid that specifically binds to the detection target substance (eg,
  • the method for forming a molecular template having a structure complementary to the molecular structure of the detection target substance on the polymer layer is not limited, and various methods known to those skilled in the art as the molecular template polymer forming method are used. Can do. Specifically, after a monomer solution containing a detection target substance is polymerized to form a polymer, a molecular template polymer can be produced by removing the detection target substance from the polymer.
  • the monomer solution for producing the molecular template polymer contains one type or two or more types of monomers.
  • monomers contained in the monomer solution include, for example, acrylamide derivatives (acrylamide, dimethylacrylamide, N-isopropylacrylamide, N-methylolacrylamide, acryloylmorpholine, etc.), methacrylamide derivatives (methacrylamide, dimethylmethacrylamide, N-isopropyl).
  • the method for removing the detection target substance from the polymer containing the detection target substance is not limited, and can be appropriately selected by those skilled in the art depending on the type of the detection target substance and the type of monomer used.
  • Non-limiting examples of the detection target substance-identification substance-removal method combination include the following.
  • the molecular template polymer layer applied to the electrode surface position is an ultrathin film layer.
  • the method for controlling the thickness of the polymer layer is not limited, and various methods known in the field of polymer chemistry can be used.
  • a method of controlling the thickness of the polymer layer a method of controlling the thickness of the polymer layer using a chemical method or a method of producing a thin polymer layer using a physical method can be used.
  • the thickness of the polymer layer As a method for chemically controlling the thickness of the polymer layer that can be used in the present invention, for example, living radical polymerization or electrolytic polymerization can be used.
  • living radical polymerization since the thickness of the polymer layer can be controlled by the polymerization time, it can be suitably used for producing a polymer layer having a uniform nano-order thickness.
  • Examples of the living radical polymerization method include nitroxide-mediated polymerization (NMP); for example, JP-A-60-89452, atom transfer radical polymerization (ATRP); 509475), reversible addition-fragmentation chain transfer polymerization (Reversible Addition / Fragmentation Chain Transfer Polymerization (RAFT); for example, International Publication No. 98/01478 pamphlet).
  • NMP nitroxide-mediated polymerization
  • ATRP atom transfer radical polymerization
  • 509475 reversible addition-fragmentation chain transfer polymerization
  • RAFT Reversible Addition / Fragmentation Chain Transfer Polymerization
  • an appropriate one of these polymerization methods can be selected and used according to the property of the substance to be detected and the necessary detection procedure.
  • Activator ReGenerated by Electron Transfer which reduces the divalent copper produced in the ATRP system to continuously active monovalent copper by adding a reducing agent for the purpose of improving the polymerization rate and ease of operation.
  • the ATRP method has been reported (for example, Angew Chem, Int Ed, 45 (27), 4482 (2006)). This method can be suitably used in the present invention because the thickness of the polymer layer can be controlled without requiring a strict vacuum state.
  • Polymerization can be carried out without solvent or in various solvents.
  • Preferred examples of the solvent include anisole, toluene, ethylbenzene, tetrahydrofuran, dimethylformamide, dimethyl sulfoxide and the like.
  • the amount of the polymerization solvent to be used is not particularly limited, but is preferably in the range of 0 to 2000 parts by mass, more preferably in the range of 10 to 1000 parts by mass with respect to 100 parts by mass of the monomer.
  • the upper limits of these ranges are significant in terms of suppressing polymerization rate reduction and controlling polymerization.
  • a compound having a group generally known as a polymerization initiating molecule for living radical polymerization can be suitably used.
  • a polymerization initiating molecule for living radical polymerization a compound having a group generally known as a polymerization initiating molecule for living radical polymerization.
  • an alkyl halide organic substance, an organic peroxide, an azo compound, an inorganic peroxide, a redox type polymerization initiator, and the like can be used.
  • a catalyst for the polymerization It is preferable to use a catalyst for the polymerization.
  • the type of the catalyst can be appropriately selected from various commonly known types according to the polymerization method.
  • a metal catalyst containing a metal such as Cu (0), Cu + , Cu 2+ , Fe + , Fe 2+ , Fe 3+ , Ru 2+ , Ru 3+ is used. it can.
  • monovalent copper compounds containing Cu + or zero-valent copper are particularly preferable. Specific examples thereof include Cu (0), CuCl, CuBr, Cu 2 O and the like.
  • organic ligands are usually used for the above-described metal catalyst.
  • the coordination atom to the metal include a nitrogen atom, an oxygen atom, a phosphorus atom, and a sulfur atom. Of these, a nitrogen atom and a phosphorus atom are preferable.
  • Specific examples of organic ligands include 2,2′-bipyridine and its derivatives, 1,10-phenanthroline and its derivatives, tetramethylethylenediamine, pentamethyldiethylenetriamine, tris (dimethylaminoethyl) amine (Me6TREN), triphenyl Examples include phosphine and tributylphosphine.
  • An example of a physical control method for the thickness of the polymer layer that can be used in the present invention is a method using spin coating. Specifically, a monomer solution is applied to the target surface, and unnecessary polymer solution is removed by rotating at high speed using a spin coater, and then polymerized to form a polymer layer having a nano-order thickness. Can be produced. Moreover, the thickness of the polymer layer by this method can be adjusted by the rotational speed of the spin coater.
  • the thickness of the molecular template polymer layer used in the biosensor of the present invention is preferably 1 ⁇ m or less.
  • the preferable upper limit and lower limit of the thickness of the molecular template polymer layer used in the biosensor of the present invention vary depending on the substance to be detected.
  • the upper limit is 1 ⁇ m, 500 nm, 400 nm, 300 nm, 200 nm, 100 nm or 50 nm
  • the lower limit is 1 nm, 3 nm. It may be 5 nm, 8 nm, 10 nm, 15 nm, 20 nm, or 30 nm.
  • the thickness of the polymer layer may be 1 nm to 1 ⁇ m, preferably 3 nm to 500 nm, more preferably 5 nm to 100 nm, and most preferably 5 nm to 50 nm.
  • the thickness of the molecular template polymer layer used in the biosensor of the present invention does not have to be strictly uniform in all the regions, and the thickness is within the above range on average. I just need it.
  • the method for measuring the thickness of the molecular template polymer layer is not particularly limited, and can be measured using any method known in the art.
  • the thickness of the molecular template polymer layer can be measured using a commercially available ellipsometer or atomic force microscope (AFM).
  • FIG. 1 shows an example of a biosensor according to an embodiment of the present invention, and the configuration will be described.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a schematic configuration of a glucose sensor 100 according to an embodiment of the present invention.
  • the detection target substance is glucose
  • a case where a so-called extended-gate FET is used as a detection element will be described as an example.
  • the biosensor according to the present invention is not limited to this. It is not limited to such an example.
  • a normal FET in which the gate electrode is directly placed on the insulating film may be used.
  • the biosensor according to the present invention is not limited to one using FET as a detection element.
  • An essential feature of the present invention resides in that the presence of a substance to be detected in a test sample is detected as an electrical signal at an electrode portion having an ultra-thin molecular template polymer layer.
  • Vacuum tubes, transistors, operational amplifiers, magamps, etc. can also be used as biosensors.
  • a glucose sensor 100 is a biosensor for detecting a detection target substance (glucose) using an FET device 101 as a detection element, and includes a molecular identification member (in FIG. 1, a metal gate electrode 106). And the molecular template polymer layer 107 are collectively referred to as “molecular identification member”) and the detection element 101.
  • the metal electrode 106 is sputtered on the substrate 105, and the molecular template polymer layer 107 is provided on the metal electrode 106.
  • the metal electrode 106 is electrically connected to the metal electrode 103 on the insulating film 102 via the wiring 104.
  • the molecular identification member is connected to the FET device through the insulating film 102 and also serves as a gate electrode in the FET.
  • the molecular template polymer layer 107 contains phenylboronic acid, and a molecular template having a structure complementary to the molecular structure of glucose is formed on the surface and inside thereof.
  • a glass ring 109 is fixed on the substrate 105 so as to surround the molecular identification member, and the buffer solution 110 is filled in the glass ring 109.
  • a reference electrode 108 may be provided as necessary.
  • the reference electrode 108 is provided in the buffer solution 110 and forms a closed circuit together with the source electrode and the drain electrode of the FET device 101.
  • the reference electrode 108 is an electrode that serves as a reference potential for voltage measurement in the FET, and may be grounded. Practically, it is necessary when measuring the voltage in the FET, but the reference electrode 108 may not be provided if it can be replaced by another known method.
  • the semiconductor substrate of the FET device 101 is, for example, a p-type semiconductor, and a source electrode and a drain electrode are provided in an n-type semiconductor portion formed by locally doping a part (for example, two places) of the semiconductor device. That is, the FET used in the glucose sensor 100 is a so-called n-channel MOSFET (Metal Oxide Semiconductor Field Effect Transistor).
  • the FET used in the biosensor according to the present invention is not limited to the n-channel MOSFET (n-MOS) described above, but a p-channel MOSFET (p-MOS), an n-channel junction FET, and a p-channel junction FET. It may be.
  • the material of the semiconductor substrate is not particularly limited, but Si, GaAs, transparent oxide semiconductor (for example, ITO, IGZO, IZO), organic semiconductor, carbon semiconductor (for example, carbon nanotube, graphene semiconductor, A known semiconductor such as a diamond semiconductor) can be appropriately selected and used. If a carbon semiconductor is used as the material for the semiconductor substrate, the measurement sensitivity of the glucose sensor 100 can be made higher than when Si is used (measurement can be performed with high accuracy even if the concentration of the detection target substance in the test sample is low). can do).
  • the measurement principle of the glucose sensor 100 according to one embodiment of the present invention shown in FIG. 1 will be described.
  • the test sample is added to the buffer solution 110, only the glucose molecules in the test sample are incorporated into the molecular template formed on the surface and inside of the molecular template polymer layer 107.
  • the molecular template polymer layer 107 contains phenylboronic acid that specifically reacts with glucose
  • the glucose that has entered the molecular template polymer layer 107 reacts with the phenylboronic acid. Due to the reaction between phenylboronic acid in the molecular template polymer layer 107 and glucose, at least one of the charge density and capacitance in the molecular identification member changes, and this is detected by the FET as a change in potential. The presence or concentration of a substance can be measured.
  • the extended gate type FET is used as the detection element as described above.
  • the molecular identification member is separated from the FET body (the FET device 101 including the semiconductor substrate provided with the source electrode and the drain electrode). Can be detachably connected.
  • the molecular identification member and the FET device can be separately prepared and combined.
  • the molecular identification member can be modified to specifically detect various detection target substances.
  • a molecular identification member corresponding to various detection target substances can be detected by a detection device.
  • a detection device By configuring as a chip that can be attached to and detached from the main body (FET device), various factors can be detected by a single detection device.
  • the glucose sensor which is one embodiment of the present invention used in this example was prepared as described below.
  • a junction FET manufactured by Toshiba, 2SK246Y
  • MOSFET manufactured by NXP, 2N7002
  • an electrode for detecting the charge of the object a gold electrode sputtered on a glass substrate is used, and a molecular template having a structure complementary to the molecular structure of glucose is formed on the gold electrode by a method described later.
  • an ultra-thin polymer layer was prepared.
  • the gold electrode was an expanded gate electrode (expanded gate electrode) by being electrically connected through a wiring from a metal electrode that was in direct contact with the junction FET.
  • the polymer layer contains a substance that specifically binds to glucose (phenylboronic acid) as a component, and when glucose fits into a molecular template formed in the polymer layer, the glucose is combined with phenylboronic acid in the polymer layer.
  • the glucose sensor which is one Embodiment of this invention determines the presence of glucose in a target object by detecting the change of the charge density of the electrode which arises by the said coupling
  • the polymer layer and the gate electrode are collectively referred to as “molecular identification member”.
  • the gate surface potential after the start of energization is measured for a glucose sensor including an ultrathin molecular template polymer layer manufactured by the method of the present invention and a glucose sensor including a polymer layer manufactured by a conventional method. Stabilization speed, detection speed, and detection sensitivity were compared.
  • HEMA hydroxyethyl methacrylate
  • N-3- (dimethylamino) propyl methacrylamide 0.02 g of vinylphenylboronic acid
  • N, N′-methylenebisacrylamide 0.02 g
  • glucose was adjusted to a total amount of 1 g with 6.7% (wt / wt) sodium acrylate (pH 6.8)
  • 1 g of dimethylformamide was added and completely dissolved, and then 10 mM copper bromide ( II) and 100 ⁇ l of 20 mM 2 ′, 2 ′ bipyridyl aqueous solution were added, followed by 50 ⁇ l of 200 mM ascorbic acid.
  • a hydrogel was produced on the gold electrode by immersing a glass substrate provided with a gold electrode to which a polymerization initiating molecule was bonded in this solution and performing a polymerization reaction at 40 ° C. for 24 hours under vacuum. After completion of the polymerization reaction, the gate electrode is immersed in a 0.1M hydrochloric acid / methanol solution overnight to remove the monomer component and glucose, whereby the molecular template having a structure complementary to the molecular structure of glucose is formed on the gold gate electrode. An ultra-thin polymer layer was formed. When the thickness of the produced polymer layer was measured visually, it was determined to be about 300 nm.
  • the gate electrode After completion of the polymerization reaction, the gate electrode is immersed in a 0.1M hydrochloric acid / methanol solution overnight to remove the monomer component and glucose, whereby the molecular template having a structure complementary to the molecular structure of glucose is formed on the gold gate electrode. An ultra-thin polymer layer was formed. When the thickness of the produced polymer layer was measured visually, it was determined to be approximately 200 nm.
  • Biosensors produced by the methods described in Production Examples 1 to 3 and Comparative Production Example 1 selectively detected glucose (data not shown).
  • FIG. 2 shows an AFM image and a cross-sectional profile of the polymer layer and the gold substrate in Production Example 1.
  • the part shown by (a) is the gold substrate part exposed by removing the polymer layer, and (b) shows the polymer layer formed. From the cross-sectional profile, the level difference between the polymer layer and the gold substrate was about 30 nm on average. As a result of measuring the polymer layers obtained in Production Examples 2 and 3 in the same manner, the average thickness of the polymer layers was about 30 nm.
  • Example 1 In Example 1, a glucose sensor comprising an ultrathin molecular template polymer layer produced by the method described in Production Example 1 and a glucose sensor comprising a molecular template polymer layer produced by the method described in Comparative Production Example 1 were used. The experiment was conducted.
  • FIG. 3 is a graph comparing the time from the start of energization to the stabilization of the gate surface potential in the apparatus of Production Example 1 or Comparative Production Example 1.
  • the vertical axis in FIG. 3 indicates the change (V) in the surface potential of the molecular identification member, and the horizontal axis indicates the measurement time (seconds).
  • V change in the surface potential of the molecular identification member
  • seconds measurement time
  • the biosensor of the present invention having an ultra-thin molecular template polymer layer has a longer period of time from energization to stabilization of the gate surface potential than a biosensor having a molecular template polymer layer produced by a conventional method ( In other words, the time from when the measuring device was turned on until the device was ready to start measurement was extremely short, indicating that the device was excellent in practicality.
  • FIG. 4 shows changes in the gate surface potential when a glucose solution is added in the apparatus of Production Example 1 or Comparative Production Example 1.
  • the change in the gate surface potential was completed by 200 seconds, and then stabilized.
  • the gate surface potential continued to change even after 600 seconds.
  • the biosensor of the present invention having an ultra-thin molecular template polymer layer has an extremely short time from the start of measurement to the completion of measurement compared to a biosensor having a molecular template polymer layer produced by a conventional method. Also from the point, it was shown that the apparatus was excellent in practicality.
  • Example 2 In Example 2, a glucose sensor provided with an ultrathin molecular template polymer layer produced by the method described in Production Example 2 and a glucose sensor provided with an ultrathin molecular template polymer layer produced by the method described in Production Example 3 were used. The experiment was conducted. Production Example 2 and Production Example 3 differ from the molecular template polymer layer of Production Example 1 in the composition of the monomers used to produce the polymer layer.
  • FIG. 5 shows the response results when low concentration glucose is added.
  • the glucose sensor including the ultrathin molecular template polymer layer produced by the method described in Production Example 2 and Production Example 3 a change in the gate surface potential was observed even at the lowest concentration of 10 ⁇ M. .
  • the biosensor of the present invention having an ultra-thin molecular template polymer layer has extremely high measurement sensitivity of a measurement object compared to a biosensor having a molecular template polymer layer produced by a conventional method. It was.
  • the glucose concentration in each body fluid is known to be about 2.8 mM to 28 mM for blood, about 140 ⁇ M to 220 ⁇ M for sweat, 6.7 mM or more for urine, and about 50 ⁇ M to 500 ⁇ M for saliva. That is, by using the present invention, it was shown that a trace amount of substance (for example, glucose) contained in these body fluids can be detected.
  • substance for example, glucose
  • HEMA hydroxyethyl methacrylate
  • N-3- (dimethylamino) propyl methacrylamide 0.02 g of vinylphenylboronic acid
  • N, N′-methylenebisacrylamide 0.02 g
  • glucose was adjusted to a total amount of 1 g with 6.7% (wt / wt) sodium acrylate (pH 6.8)
  • 1 g of dimethylformamide was added and completely dissolved, and then 10 mM copper bromide ( II) and 100 ⁇ l of 20 mM 2 ′, 2 ′ bipyridyl aqueous solution were added, followed by 50 ⁇ l of 200 mM ascorbic acid.
  • a glass substrate provided with a gold electrode to which a polymerization initiating molecule is bonded is immersed downward in the solution, and a hydrogel is produced on the gold electrode by carrying out a polymerization reaction at 40 ° C. under vacuum for 6 hours. did.
  • the gate electrode is immersed in a 0.1M hydrochloric acid / methanol solution overnight to remove the monomer component and glucose, whereby the molecular template having a structure complementary to the molecular structure of glucose is formed on the gold gate electrode.
  • An ultra-thin polymer layer was formed. When the thickness of the produced polymer layer was measured using an ellipsometer, it was about 10 nm.
  • the gate electrode After completion of the polymerization reaction, the gate electrode is immersed in a 0.1M hydrochloric acid / methanol solution overnight to remove the monomer component and glucose, whereby the molecular template having a structure complementary to the molecular structure of glucose is formed on the gold gate electrode. An ultra-thin polymer layer was formed. When the thickness of the produced polymer layer was measured using an ellipsometer, it was about 10 nm.
  • Example 3 Production Examples 4 and 5 differ from Production Examples 1 to 3 in the monomer composition used to produce the polymer layer.
  • the gold substrate provided with the thin film molecular template polymer layer produced in Production Examples 4 and 5 was connected to the FET by wiring to obtain a glucose sensor used in Example 3 (other configurations of the sensor are the same as in Examples 1 and 2).
  • FIG. 6 shows the results of changes in the gate surface potential in the FET when each concentration of glucose was added.
  • FIG. 6 is a graph plotting the gate surface potential over time in the apparatus of Production Example 4 or 5.
  • the vertical axis in FIG. 6 indicates the change in surface potential (mV) of the molecular identification member, and the horizontal axis indicates the measurement time (seconds).
  • FIG. 7 is a graph in which the amount of change in the gate surface potential of the FET in response to each concentration of glucose in FIG. 6 is plotted for each concentration and approximated to the Langmuir adsorption isotherm. As shown in FIG. 7, the measurement results in this experiment were approximated with few variations and errors in the nanomol / liter order. That is, it was found that the glucose sensor of the present invention also has a quantitative property for extremely low concentrations of glucose.
  • the biosensor of the present invention has sufficient sensitivity to detect extremely dilute glucose contained in bodily fluids such as tears and saliva, compared to a biosensor provided with a molecular template polymer layer produced by a conventional method. It was shown that this was an apparatus with excellent practicality.
  • the film thicknesses of the polymer layers obtained in Production Example 4 and Production Example 5 were measured using an ellipsometer (M2000, manufactured by JA Woollam Co.). As a result, the film thickness when the polymerization initiating molecule was bonded onto the gold electrode was 1 to 1.5 nm, and the film thickness of the molecular template polymer layer by the ATRP method was 8 to 25 nm.
  • the glass substrate on which the gold electrode was sputtered was immersed in a 1 mM bis [2- (2-bromoisobutyryloxy) undecyl] disulfide / ethanol solution to bond a polymerization initiating molecule on the gold electrode.
  • 0.05 ml of N-3- (dimethylamino) propylmethacrylamide, 0.476 g of ethylene glycol dimethacrylate, 0.044 g of vinylphenylboronic acid, 0.057 g of dopamine, 1 ml of ultrapure water and 2 ml of dimethylformamide. was added and dissolved, and deaeration was performed by passing nitrogen.
  • a hydrogel was produced on the gold electrode by immersing a glass substrate provided with a gold electrode to which a polymerization initiating molecule was bonded in this solution and performing a polymerization reaction at room temperature under vacuum for 18 hours. After completion of the polymerization reaction, a molecular template having a structure complementary to the molecular structure of dopamine on the gold gate electrode is obtained by immersing the gate electrode in a 0.1M hydrochloric acid / methanol solution overnight to remove monomer components and glucose. An ultra-thin polymer layer was formed.
  • Example 4 The gold substrate provided with the thin film molecular template polymer layer produced in Production Example 6 was connected to the FET by wiring to obtain a dopamine sensor used in Example 4 (other configurations of the sensor are the same as in Examples 1 and 2). As a comparative example, a sensor having a polymer layer without a molecular template on the gold gate electrode obtained by removing dopamine from the monomer solution in Production Example 6 was prepared.
  • phosphate buffered saline pH 7.4
  • the gold gate electrode is connected to the MOSFET, and a gate voltage of 0 V and a source-drain current of 90 ⁇ A are applied using an FET real-time measuring device. Assuming that the gate surface potential after the start of energization was stabilized, dopamine solutions of various concentrations were added.
  • FIG. 8 shows the results of changes in the gate surface potential in the FET when each concentration of dopamine is added.
  • FIG. 8 is a graph plotting the gate surface potential over time in the sensor having the molecular template polymer using dopamine as a template and the sensor having the polymer layer without the molecular template (Comparative Example), which was prepared in Production Example 6. is there.
  • the vertical axis in FIG. 8 indicates the change in surface potential (mV) of the molecular identification member, and the horizontal axis indicates the measurement time (seconds).
  • FIG. 9 is a graph in which the amount of change in the gate surface potential of the FET in response to each concentration of dopamine in FIG. 8 is plotted for each concentration. As shown in FIG. 9, as the dopamine addition concentration increases, there is a difference between the gate surface potential change amount in the sensor with the molecular template polymer and the gate surface potential change amount in the sensor with the gel without the template. It became clear.
  • the biosensor of the present invention is a highly practical device that can selectively detect biomolecules other than glucose with high sensitivity.
  • glucose sensor 101 FET device 102: gate insulating film 103: metal electrode 104: wiring 105: substrate 106: metal gate electrode 107: molecular template polymer layer 108: reference electrode 109: glass ring 110: buffer solution

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Abstract

【課題】　高い検出感度と検出特異性を有するバイオセンサを提供する。　【解決手段】　検出対象物質と結合することができる識別物質と、前記識別物質の電荷を帯電する電極とを備え、前記検出対象物質が前記識別物質に結合することにより生じる前記電極の電荷密度の変化を検出するバイオセンサにおいて、前記電極の表面の全部又は一部には、検出対象物質の分子構造と相補的な構造を有する分子鋳型が形成されたポリマー層が形成されており、前記ポリマー層には前記識別物質を含み、前記ポリマー層は超薄膜層であることを特徴とする、バイオセンサを提供する。

Description

高感度バイオセンサおよびその製造方法
　本発明は、被験試料中の検出対象物質を検出するための、バイオセンサに関する。
　近年、様々なバイオセンサが研究・開発され、医療、創薬、臨床検査等の分野で利用されている。バイオセンサは、生物の持つ優れた分子識別力を利用して外界の情報（例えば、化学的要素）を何らかの物理的な信号として認識するもので、様々な原理や測定対象がある。より詳細には、バイオセンサは、化学物質を測定対象とする化学センサの一種であり、測定対象物質のみを認識する分子識別素子と、認識したという情報を電気的な信号等の物理的な信号に変換する信号変換素子とで構成される。一般には、分子識別素子には、酵素、抗体、ＤＮＡ、細胞、微生物等の生体分子や生体分子を捉える化合物を用いるため、これらのセンサはバイオセンサと呼ばれる。
　また、信号変換素子としては、電極、サーミスタ、水晶振動子、表面プラズモン共鳴、半導体素子等の通常の電子機器や化学センサが使用されるが、最近では電界効果トランジスタ（ＦＥＴ：Ｆｉｅｌｄ　Ｅｆｆｅｃｔ　Ｔｒａｎｓｉｓｔｏｒ）を用いたバイオセンサの研究が盛んになってきている。ＦＥＴを用いたバイオセンサでは、分子識別素子が測定対象となる化学物質を認識すると、熱、質量、電荷等の物理的変化や対象物質の分解、物質の生成等の化学的変化が起こり、この変化を信号変換素子であるＦＥＴで電気信号に変換して対象物質を測定する。ＦＥＴを用いたバイオセンサは、（１）イオンや分子固有の電荷を電気的に検出できる、（２）測定までの手間や時間がかからない、（３）リアルタイム測定が可能である、（４）非標識、非侵襲での電気的計測が可能である、（５）半導体の微細加工技術により小型化、集積化が可能である、等の特徴を有する。
　これまでに、非侵襲的に採取した微量の体液試料を使用可能であり、且つ、微量の試料を用いた場合や試料中の測定対象物質の濃度が低い場合であっても対象物質を高精度に測定可能な、高感度のバイオセンサが提案されている（例えば特許文献１）。
ＷＯ２０１４／１７８２３７
　上記特許文献１に記載のバイオセンサは、体液中に含まれる微量の測定対象物質を測定可能とした点において画期的な発明であった。しかし、体液中には測定対象物質以外の様々な物質が含まれているため、このようなバイオセンサを実用化するにあたっては、測定対象物質に対する検出感度を高めるのみならず、測定対象物質以外の誤検出を防ぐ（すなわち、検出特異性を高める）必要があった。
　本発明者らは、バイオセンサのゲート電極上に分子鋳型ポリマー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｉｍｐｒｉｎｔｅｄ　Ｐｏｌｙｍｅｒ：　ＭＩＰ）の層を積層することにより、検出対象物質以外の実質的に全ての物質がゲート電極と相互作用することを防ぐことが可能となることを見出した。本明細書において、分子鋳型ポリマーとは、所定の作成方法によって、当該ポリマー表面やポリマー中において、検出対象物質の分子構造と相補的な構造を有する“分子鋳型”が形成されたものをいい、当該分子鋳型には、当該検出対象物質のみが組み込まれることができる。
　さらに、本発明者らは、分子鋳型ポリマーをゲート電極に適用したバイオセンサの実用化に向けてさらに研究を重ねた。すると、本発明者らは、簡易的な方法により作製した分子鋳型ポリマーをゲート電極に適用したバイオセンサは、確かに従来技術と比較して検出対象物質に対する特異性は向上するものの、分子鋳型ポリマー層の厚みにより、検出対象物質に対する検出感度と検出の安定性がやや低下するという新たな技術的課題に遭遇した。
　ここで、本発明者らは、主に高分子化学の分野において用いられるポリマーの制御技術を本技術分野に応用することにより、ゲート電極に適用される分子鋳型ポリマー層の膜厚を制御することに成功し、これにより、分子鋳型ポリマー層を超薄膜層とすることを可能とした。超薄膜の分子鋳型ポリマー層を有するゲート電極は、検出対象物質に対する検出特異性のみならず、極めて高い検出感度も兼ね備える（本願の実施例の結果も参照のこと）。
　さらに、驚くべきことに、本発明では、ゲート電極に適用される分子鋳型ポリマー層を超薄膜層としたことにより、装置の通電からゲート電極表面の電位が安定化するまでの時間（すなわち、測定装置のスイッチをオンにしてから、装置が測定開始可能な状態になるまでの時間）が大幅に短縮され、また、測定開始から測定終了までの時間も大幅に短縮された（本願の実施例の結果も参照のこと）。
　すなわち、本発明のバイオセンサは、検出対象物質に対する高い検出感度と検出特異性を兼ね備え、さらに実用性にも優れた装置である。
　すなわち本発明は、一実施形態において、検出対象物質と結合することができる識別物質と、前記識別物質の電荷を帯電する電極とを備え、前記検出対象物質が前記識別物質に結合することにより生じる前記電極の電荷密度の変化を検出するバイオセンサにおいて、前記電極の表面の全部又は一部には、検出対象物質の分子構造と相補的な構造を有する分子鋳型が形成されたポリマー層が形成されており、前記ポリマー層には前記識別物質を含み、前記ポリマー層は超薄膜層であることを特徴とする、バイオセンサに関する。
　また、本発明の一実施形態においては、前記超薄膜層は、厚さが１μｍ以下の薄膜層であることを特徴とする。
　また、本発明の一実施形態においては、前記ポリマー層が、
　（ａ）：１または複数種のモノマー、前記検出対象物質、および、前記識別物質、を含むモノマー溶液を前記電極の表面の全部又は一部において重合させることにより、前記電極の表面の全部または一部に超薄膜層であるポリマー層を形成させるステップ、および、
　（ｂ）：前記ステップ（ａ）の後、前記ポリマー層から前記検出対象物質を除去することにより、前記ポリマー層に前記検出対象物質の分子構造と相補的な構造を有する分子鋳型を形成させるステップ、
を含む方法によって形成されることを特徴とする。
　また、本発明の一実施形態においては、前記モノマー溶液の重合が、リビングラジカル重合、または、電解重合であることを特徴とする。
　また、本発明の一実施形態においては、前記リビングラジカル重合は、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）、可逆的付加－開裂連鎖移動重合（ＲＡＦＴ）、または、ニトロキシドを介した重合（ＮＭＰ）であることを特徴とする。
　また、本発明の一実施形態においては、前記リビングラジカル重合は、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）であり、前記ステップ（ａ）に先立って、重合開始分子が電極の表面の全部又は一部にあらかじめ結合されていることを特徴とする。
　また、本発明の一実施形態においては、前記ステップ（ａ）が、１または複数種のモノマー、前記検出対象物質、および、前記識別物質、を含むモノマー溶液を、スピンコートを用いて電極の表面の全部又は一部に適用し、適用されたモノマー溶液を重合させることにより、前記電極の表面の全部または一部に超薄膜層のポリマー層を形成させるステップ、であることを特徴とする。
　また、本発明の一実施形態においては、前記電極が、金電極、銀電極、銅電極、または、白金電極であることを特徴とする。
　また、本発明の一実施形態においては、前記モノマー溶液が、アクリルアミド誘導体、メタクリルアミド誘導体、アクリレート誘導体、メタクリレート誘導体、アクリロニトリル、２－ビニルピリジン、４－ビニルピリジン、Ｎ－ビニル－２－ピロリドンおよび酢酸ビニルからなる群から選択される少なくとも１種類のモノマーを含むことを特徴とする。
　また、本発明の一実施形態においては、前記電極が、電界効果トランジスタのゲート絶縁膜に電気的に接続されていることを特徴とする。
　また、本発明の一実施形態においては、前記電極は、前記電界効果トランジスタから離れて配置されており、前記電極は、前記ゲート絶縁膜上に設けられた別の金属電極と配線を介して、前記ゲート絶縁膜に電気的に接続されていることを特徴とする。
　また、本発明の一実施形態においては、前記電極が、前記ゲート絶縁膜上に直接に載置されることにより、前記ゲート絶縁膜に電気的に接続されていることを特徴とする。
　また、本発明の一実施形態においては、前記検出対象物質が生体由来の物質、環境中の物質、または、食品中の物質であることを特徴とする。
　また、本発明の一実施形態においては、前記生体由来の物質が、体液由来の物質であることを特徴とする。
　また、本発明の一実施形態においては、前記体液が、血液、リンパ液、組織液、体腔液、消化液、汗、涙、鼻汁、唾液、尿、精液、膣液、羊水、および、乳汁からなる群から選択されることを特徴とする。
　また、本発明の他の実施形態は、バイオセンサにおいて使用される電極であって、前記バイオセンサは、検出対象物質が識別物質に結合することにより生じる前記電極の電荷密度の変化を検出するバイオセンサであり、前記電極は、前記検出対象物質と結合することができる前記識別物質の電荷を帯電する電極であり、前記電極の表面の全部又は一部には、検出対象物質の分子構造と相補的な構造を有する分子鋳型が形成されたポリマー層が形成されており、前記ポリマー層には前記識別物質を含み、前記ポリマー層は超薄膜層であることを特徴とする、電極に関する。
　また、本発明の他の実施態様は、バイオセンサにおいて使用するための電極の製造方法であって、前記バイオセンサは、検出対象物質が識別物質に結合することにより生じる前記電極の電荷密度の変化を検出するバイオセンサであり、前記電極は、前記検出対象物質と結合することができる前記識別物質の電荷を帯電する電極であり、
　前記方法は、
　（ａ）：１または複数種のモノマー、前記検出対象物質、および、前記識別物質、を含むモノマー溶液を、前記電極の表面の全部または一部において重合させることにより、前記電極の表面の全部または一部に超薄膜層であるポリマー層を形成させるステップ、および、
　（ｂ）：前記ステップ（ａ）の後、前記ポリマー層から前記検出対象物質を除去することにより、前記ポリマー層に前記検出対象物質の分子構造と相補的な構造を有する分子鋳型を形成させるステップ、を含むことを特徴とする、方法に関する。
　また、本発明の一実施態様においては、前記リビングラジカル重合は、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）であり、前記ステップ（ａ）に先立って、重合開始分子を電極の表面の全部又は一部にあらかじめ結合させる工程を含むことを特徴とする。
　また、本発明の一実施態様においては、前記ステップ（ａ）が、１または複数種のモノマー、前記検出対象物質、および、前記識別物質、を含むモノマー溶液を、スピンコートを用いて前記電極の表面の全部または一部に適用し、適用されたモノマー溶液を重合させることにより、前記電極の表面の全部または一部に超薄膜層のポリマー層を形成させるステップ、であることを特徴とする。
　なお、上記に挙げた本発明の一または複数の特徴を任意に組み合わせた発明も本発明の範囲に含まれる。
図１は、本発明の一実施形態であるグルコースセンサの概略的な構成を示す模式図である。 図２は、製造例１の方法で作製したポリマー層の膜厚を原子間力顕微鏡で測定した結果を示す。 図３は、製造例１または比較製造例１の装置において、通電開始からゲート表面電位の安定化までの時間を比較したグラフである。 図４は、製造例１または比較製造例１の装置において、グルコース溶液を添加した際のゲート表面電位の変化を示す。 図５は、製造例２または製造例３の装置において、低濃度のグルコースの検出を比較したグラフである。 図６は、製造例４および製造例５の装置において、低濃度のグルコースの検出を比較したグラフである。 図７は、製造例４および製造例５の装置における、各濃度グルコース添加時のゲート表面電位変化量を示したグラフである。 図８は、製造例６の装置において、低濃度のドーパミンの検出を比較したグラフである。 図９は、製造例６の装置における、各濃度ドーパミン添加時のゲート表面電位変化量を示したグラフである。
　本発明のバイオセンサは、検出対象物質と、当該検出対象物質に特異的あるいは選択的に結合することができる識別物質との結合により生じる電気的な変化を、電極の電荷密度の変化として検出するという基本的な原理に基づく（詳細は後述する）。本発明における「検出対象物質」は、当該物質に対応する分子鋳型ポリマーを製造可能なものであれば限定されず、当業者が技術常識に基づいて様々な物質を検出対象とすることができる。
　本発明のバイオセンサを用いれば、様々な被験試料中の微量な物質の検出に利用可能であり、例えば、本発明のバイオセンサを用いて、生体由来の物質、環境中の物質、または、食品中の物質を検出することができる。特に、本発明は、被験試料中の検出対象物質の濃度が極めて薄くても検出可能であるため、例えば体液（血液、リンパ液、組織液、体腔液、消化液、汗、涙、鼻汁、唾液、尿、精液、膣液、羊水、乳汁など）中の物質の検出に好適に利用することができる。体液中の物質の例示としては、例えば、体液成分（例えば、アルカリフォスファターゼ、ＡＳＴ、ＡＬＴ、乳酸脱水素酵素、ロイシンアミノペプチダーゼ、γ－ＧＴＰ、クレアチンキナーゼ、コリンエステラーゼ、ビリルビン、胆汁酸、アルブミン、尿素窒素、クレアチニン、尿酸、ＨＤＬコレステロール、ＬＤＬコレステロール、中性脂肪、グルコース、アミラーゼ、リパーゼ、ナトリウム、カリウム、クロール、カルシウム、無機リン、マグネシウム、亜鉛、鉄、フェリチン、Ｃ反応性蛋白、β２－マイクログロブリン、ヘモグロビンＡ１Ｃ、グリコアルブミン、アンモニア、各種ホルモン、各種神経伝達物質（例えば、ドーパミン、アドレナリン、ノルアドレナリン、セロトニン、メラトニン、ヒスタミン等のモノアミン類；アスパラギン酸、グルタミン酸、γ―アミノ酪酸、グリシン、タウリン等のアミノ酸；アセチルコリン；神経ペプチド類）等の一般的な血液生化学検査の検査項目となる成分）、疾患関連バイオマーカー（例えば、腫瘍マーカー、自己免疫疾患マーカー、中枢神経疾患マーカー、心疾患バイオマーカー、等）、病原体（例えば、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫、等）およびその関連因子、事前に投与された薬剤の薬剤分子、が挙げられる。
　本発明における「検出対象物質と結合することができる識別物質」は、検出対象物質に応じて当業者が適宜選択することができ、当該識別物質は、検出対象物質に特異的に結合することができる物質であってよく、検出対象物質に選択的に結合することができる物質であってもよい。
　本発明における「検出対象物質と結合することができる識別物質」の例示としては、例えば、特異的または選択的な相互作用が生じることが知られている物質のペア（例えば、グルコースとフェニルボロン酸、乳酸とフェニルボロン酸、ヒスタミンとカルボキシル基モノマー、尿酸とカルボキシル基モノマー、クレアチニンとカルボキシル基モノマー、シアル酸とフェニルボロン酸＆アミノ基モノマー、ドーパミンとフェニルボロン酸＆アミノ基モノマー、
ビオチンとストレプトアビジン）のいずれか片方、特定の分子と特異的に結合するアプタマー（例えば、核酸アプタマー、ペプチドアプタマー）、受容体－リガンド（またはアゴニスト）の組み合わせのいずれか片方、検出対象物質に特異的に結合する抗体（例えば、検出対象物質に特異的に結合するモノクローナル抗体）またはその抗原結合断片、検出対象物質に特異的に結合する核酸（例えば、目的とする核酸に相補的な配列を有する核酸）を挙げることができる。
　本発明において、ポリマー層に検出対象物質の分子構造と相補的な構造を有する分子鋳型を形成させる方法は限定されず、分子鋳型ポリマーの形成方法として当業者に知られた様々な方法を用いることができる。具体的には、検出対象物質を含むモノマー溶液を重合させ、ポリマーとした後、当該ポリマーから検出対象物質を除去することによって、分子鋳型ポリマーを作製することができる。
　本発明において、分子鋳型ポリマーを作製するためのモノマー溶液は、１種類または２種類以上のモノマーを含む。モノマー溶液に含まれるモノマーの例としては、例えば、アクリルアミド誘導体（アクリルアミド、ジメチルアクリルアミド、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド、Ｎ－メチロールアクリルアミド、アクリロイルモルホリン等）、メタクリルアミド誘導体（メタクリルアミド、ジメチルメタクリルアミド、Ｎ－イソプロピルメタクリルアミド、Ｎ－メチロールメタクリルアミド、メタクリロイルモルホリン等）、アクリレート誘導体（ヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシプロピルアクリレート、ジメチルアミノエチルアクリレート、ジメチルアミノプロピルアクリレート等）、メタクリレート誘導体（ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリレート、ジメチルアミノエチルメタクリレート、ジメチルアミノプロピルメタクリレート等）、アクリロニトリル、２－ビニルピリジン、４－ビニルピリジン、Ｎ－ビニルピロリドン、または、酢酸ビニルからなる群から選択される１または複数のモノマーが挙げられる。
　本発明において、検出対象物質を含むポリマーから検出対象物質を除去する方法は限定されず、検出対象物質の種類、用いたモノマーの種類に応じて当業者が適宜選択することができる。検出対象物質－識別物質－除去方法の組み合わせの限定されない例示としては、以下を挙げることができる。
・グルコース－フェニルボロン酸－塩酸／メタノール
・乳酸－フェニルボロン酸－塩酸／メタノール
・ヒスタミン－カルボキシル基モノマー－酢酸／メタノール／アセトニトリル
・尿酸－カルボキシル基モノマー－酢酸／メタノール／アセトニトリル
・クレアチニン－カルボキシル基モノマー－酢酸／メタノール／アセトニトリル
・シアル酸－フェニルボロン酸＆アミノ基モノマー－塩酸／メタノール
・ドーパミン－フェニルボロン酸＆アミノ基モノマー－塩酸／メタノール
　本発明のバイオセンサにおいては、電極表面位に適用される分子鋳型ポリマー層が超薄膜層であることを特徴とする。ポリマー層の厚みを制御する方法は限定されず、高分子化学分野において公知の様々な方法を用い得る。例えば、ポリマー層の厚みを制御する方法として、化学的な方法を用いてポリマー層の厚みを制御する方法や、物理的な方法を用いて薄いポリマー層を作製する方法を用いることができる。
　本発明に用いることができる、ポリマー層の厚みの化学的な制御方法としては、例えばリビングラジカル重合や電解重合を用いることができる。特に、リビングラジカル重合では、重合時間でポリマー層の厚みを制御することができるため、ナノオーダーの厚さの均一なポリマー層の作製に好適に用いることができる。
　リビングラジカル重合法としては、ニトロキドを介した重合（Ｎｉｔｒｏｘｉｄｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ（ＮＭＰ）；例えば特開昭６０－８９４５２号公報）、原子移動ラジカル重合（Ａｔｏｍ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　Ｒａｄｉｃａｌ　Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ（ＡＴＲＰ）；例えば特表平１０－５０９４７５号公報）、可逆的付加‐開裂連鎖移動重合（Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ　Ａｄｄｉｔｉｏｎ／　Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ　Ｃｈａｉｎ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ（ＲＡＦＴ）；例えば国際公開第９８／０１４７８号パンフレット）が知られている。本発明においては、検出対象物質の性質や必要な検出手順に応じて、これらのいずれかの重合方法のうち適切なものを選択して用いることができる。
　また、重合速度の改善、操作の簡便性などを目的として還元剤を添加し、ＡＴＲＰ系中に生成した２価銅を連続的に活性な１価銅に還元するＡｃｔｉｖａｔｏｒ　ＲｅＧｅｎｅｒａｔｅｄ　ｂｙ　Ｅｌｅｃｔｒｏｎ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ（ＡＲＧＥＴ）ＡＴＲＰ法が報告されている（例えば、Ａｎｇｅｗ　Ｃｈｅｍ，Ｉｎｔ　Ｅｄ，４５（２７），４４８２（２００６））。この方法では、厳密な真空状態を必要とせずにポリマー層の厚さを制御できるため、本発明においても好適に用いることができる。
　重合は、無溶媒で行うこともできるし、各種の溶媒中で行うこともできる。好ましい溶媒としては、アニソール、トルエン、エチルベンゼン、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等を挙げることができる。
　重合溶媒の使用量は特に限定されないが、モノマー１００質量部に対して０～２０００質量部の範囲内が好ましく、１０～１０００質量部の範囲内がより好ましい。これら各範囲の上限値は、重合速度低下の抑制、重合制御の点で意義がある。
　重合開始分子は、一般的にリビングラジカル重合の重合開始分子として知られている基を有する化合物が好適に使用できる。例えば、ハロゲン化アルキル有機物、有機過酸化物、アゾ系化合物、無機過酸化物、レドックス型重合開始剤等を用いることができる。
　重合には触媒を使用することが好ましい。触媒の種類は、一般的に知られている各種のものの中から、重合法に応じて適宜選択することができる。例えば、重合法としてＡＴＲＰを用いる場合は、Ｃｕ（０）、Ｃｕ+、Ｃｕ2+、Ｆｅ+、Ｆｅ2+、Ｆｅ3+、Ｒｕ2+、Ｒｕ3+等の金属を含む金属触媒を使用できる。分子量や分子量分布の高度な制御を達成する為には、特にＣｕ+を含む１価の銅化合物あるいは０価の銅が好ましい。その具体例としては、Ｃｕ（０）、ＣｕＣｌ、ＣｕＢｒ、Ｃｕ2Ｏ等が挙げられる。
　また、上述した金属触媒には、通常は有機配位子が使用される。金属への配位原子としては、例えば、窒素原子、酸素原子、リン原子、硫黄原子等が挙げられる。中でも、窒素原子、リン原子が好ましい。有機配位子の具体例としては、２，２’－ビピリジンおよびその誘導体、１，１０－フェナントロリンおよびその誘導体、テトラメチルエチレンジアミン、ペンタメチルジエチレントリアミン、トリス（ジメチルアミノエチル）アミン（Ｍｅ６ＴＲＥＮ）、トリフェニルホスフィン、トリブチルホスフィン等が挙げられる。
　本発明に用いることができる、ポリマー層の厚みの物理的な制御方法の例としては、スピンコートを用いた方法が挙げられる。具体的には、対象とする面にモノマー溶液を適用し、スピンコート装置を用いて高速回転させることにより不要なモノマー溶液を除去し、その後重合させることによって、ナノオーダーの厚さのポリマー層を作製することができる。また、この方法によるポリマー層の厚さは、スピンコート装置の回転速度によって調節することができる。
　検出感度を高める観点から、本発明のバイオセンサにおいて用いる分子鋳型ポリマー層の厚さは１μｍ以下であることが好ましい。本発明のバイオセンサにおいて用いる分子鋳型ポリマー層の厚さの好ましい上限および下限は検出対象物質によって異なるが、例えば、上限を１μｍ、５００ｎｍ、４００ｎｍ、３００ｎｍ、２００ｎｍ、１００ｎｍまたは５０ｎｍ、下限を１ｎｍ、３ｎｍ、５ｎｍ、８ｎｍ、１０ｎｍ、１５ｎｍ、２０ｎｍまたは３０ｎｍとしてもよい。例えば、ポリマー層の厚さは１ｎｍ～１μｍであってよく、好ましくは３ｎｍ～５００ｎｍであってよく、さらに好ましくは５ｎｍ～１００ｎｍであってよく、最も好ましくは５ｎｍ～５０ｎｍであってよい。なお、当然のことながら、本発明のバイオセンサにおいて用いる分子鋳型ポリマー層の厚さは、その全ての領域において厳密に均一な厚さである必要はなく、平均して上記範囲内の厚さであればよい。
　本発明において、分子鋳型ポリマー層の厚さの測定方法は特に限定されず、当技術分野において公知の任意の方法を用いて測定することができる。例えば、市販のエリプソメータや原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）を用いて分子鋳型ポリマー層の厚さを測定することができる。
[バイオセンサの構成]
　図１に、本発明の一実施形態に係るバイオセンサの一例を示し、その構成について説明する。図１は、本発明の一実施形態であるグルコースセンサ１００の概略的な構成を示す模式図である。なお、以下の説明では、検出対象物質をグルコースとし、検出素子としていわゆる拡張ゲート（Ｅｘｔｅｎｄｅｄ－ｇａｔｅ）型のＦＥＴを使用した場合を例に挙げて説明するが、本発明に係るバイオセンサは、このような例に限定されるものではない。例えば、ゲート電極が絶縁膜上に直接に載置される通常のＦＥＴを用いてもよい。
　また、本発明に係るバイオセンサは、検出素子としてＦＥＴを用いるものに限定されない。本発明の本質的な特徴は、超薄膜の分子鋳型ポリマー層を備える電極部分において被験試料中の検出対象物質の存在を電気的な信号として検出することにあり、例えば当該電極を信号増幅器（例えば、真空管、トランジスタ、オペアンプ、マグアンプ、等）に接続することによっても、バイオセンサとして使用することができる。
　図１に示すように、グルコースセンサ１００は、検出素子としてＦＥＴデバイス１０１を用いて検出対象物質（グルコース）を検出するためのバイオセンサであって、分子識別部材（図１において、金属ゲート電極１０６と分子鋳型ポリマー層１０７とまとめて「分子識別部材」と呼ぶこととする）と、検出素子１０１とを主に備える。金属電極１０６は基板１０５上にスパッタされており、分子鋳型ポリマー層１０７は金属電極１０６上に設けられている。また、金属電極１０６は、絶縁膜１０２上の金属電極１０３と配線１０４を介して電気的に接続されている。分子識別部材は、絶縁膜１０２を介してＦＥＴデバイスに接続され、ＦＥＴにおけるゲート電極としての役割も有している。ここで、分子鋳型ポリマー層１０７は、フェニルボロン酸を含んでおり、その表面および内部において、グルコースの分子構造と相補的な構造を有する分子鋳型が形成されている。
　また、基板１０５上には、分子識別部材を囲うようにガラスリング１０９が固定されており、ガラスリング１０９内には緩衝液１１０が満たされている。
　なお、図１に示すように、必要に応じて参照電極１０８を設けてもよい。参照電極１０８は、緩衝液１１０中に設けられ、ＦＥＴデバイス１０１のソース電極及びドレイン電極とともに閉回路を形成する。参照電極１０８はＦＥＴにおける電圧測定の基準電位となる電極であり、アースされることもある。実用上は、ＦＥＴにおける電圧測定の際に必要となるが、他の公知の方法により代替可能であれば参照電極１０８を設けなくてもよい。
　ＦＥＴデバイス１０１の半導体基板は、例えば、ｐ型半導体であり、その一部（例えば２箇所）が局所的にドーピングされて形成されたｎ型半導体部分にソース電極及びドレイン電極が設けられる。すなわち、グルコースセンサ１００で使用されるＦＥＴは、所謂ｎチャネル型ＭＯＳＦＥＴ（Ｍｅｔａｌ　Ｏｘｉｄｅ　Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ　Ｆｉｅｌｄ　Ｅｆｆｅｃｔ　Ｔｒａｎｓｉｓｔｏｒ）である。なお、本発明に係るバイオセンサで使用するＦＥＴは、上記のｎチャネル型ＭＯＳＦＥＴ（ｎ－ＭＯＳ）に限られず、ｐチャネル型ＭＯＳＦＥＴ（ｐ－ＭＯＳ）、ｎチャネル接合型ＦＥＴ、ｐチャネル接合型ＦＥＴであってもよい。
　また、半導体基板の素材としては、特に制限されるものではないが、Ｓｉ、ＧａＡｓ、透明酸化物半導体（例えば、ＩＴＯ、ＩＧＺＯ、ＩＺＯ）、有機半導体、炭素半導体（例えば、カーボンナノチューブ、グラフェン半導体、ダイヤモンド半導体等）等、公知の半導体を適宜選択して用いることができる。なお、半導体基板の素材として炭素半導体を用いると、Ｓｉを使用した場合よりもグルコースセンサ１００の測定感度をより高くすることができる（被験試料中の検出対象物質濃度が低くても高精度に測定することができる）。
　次に、図１に示した本発明の一実施形態に係るグルコースセンサ１００の測定原理について説明する。緩衝液１１０に被験試料が添加されると、被験試料中のグルコース分子のみが、分子鋳型ポリマー層１０７の表面および内部に形成された分子鋳型に組み込まれる。分子鋳型ポリマー層１０７には、グルコースに特異的に反応するフェニルボロン酸が含まれているため、分子鋳型ポリマー層１０７に入り込んだグルコースは、当該フェニルボロン酸に反応する。分子鋳型ポリマー層１０７中のフェニルボロン酸と、グルコースとの反応によって、分子識別部材における電荷密度とキャパシタンスの少なくともいずれか一方が変化し、これをＦＥＴが電位の変化として検出することで、検出対象物質の存在あるいは濃度を測定することができる。
　また、グルコースセンサ１００においては、検出素子として、上述したように拡張ゲート型のＦＥＴを使用している。拡張ゲート型のＦＥＴを用いたグルコースセンサ１００では、分子識別部材がＦＥＴ本体（ソース電極およびドレイン電極が設けられた半導体基板を含むＦＥＴデバイス１０１）から分離しており、分子識別部材をＦＥＴデバイス１０１から着脱自在に接続することができる。
　すなわち、分子識別部材とＦＥＴデバイスとを別々に準備して、組み合わせることが可能である。本願明細書に開示されているとおり、分子識別部材は様々な検出対象物質を特異的に検出するように改変可能であるため、例えば、様々な検出対象物質に対応した分子識別部材を、検出装置本体（ＦＥＴデバイス）に着脱可能なチップとして構成することにより、１台の検出装置で多様な因子の検出が可能となる。
　本明細書において用いられる用語は、特に定義されたものを除き、特定の実施態様を説明するために用いられるのであり、発明を限定する意図ではない。
　また、本明細書において用いられる「含む」との用語は、文脈上明らかに異なる理解をすべき場合を除き、記述された事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを意図するものであり、それ以外の事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを排除しない。
　異なる定義が無い限り、ここに用いられるすべての用語（技術用語及び科学用語を含む。）は、本発明が属する技術の当業者によって広く理解されるのと同じ意味を有する。ここに用いられる用語は、異なる定義が明示されていない限り、本明細書及び関連技術分野における意味と整合的な意味を有するものとして解釈されるべきであり、理想化され、又は、過度に形式的な意味において解釈されるべきではない。
　以下において、本発明を、実施例を参照してより詳細に説明する。しかしながら、本発明はいろいろな態様により具現化することができ、ここに記載される実施例に限定されるものとして解釈されてはならない。
（グルコースセンサの作製）
　本実施例において用いた、本発明の一実施形態であるグルコースセンサは、以下に説明するように作成した。
　本実施例および比較例では、検出素子としてジャンクションＦＥＴ（東芝社製、２ＳＫ２４６Ｙ）またはＭＯＳＦＥＴ（ＮＸＰ社製、２Ｎ７００２）を用いた。対象物の電荷を検出するための電極としては、ガラス基板にスパッタした金電極を用い、金電極上に、後述する方法にて、グルコースの分子構造と相補的な構造を有する分子鋳型が形成された、超薄膜のポリマー層を作製した。前記金電極は、前記ジャンクションＦＥＴに直接接触している金属電極から、配線を介して電気的に接続させることにより、拡張型のゲート電極（拡張ゲート電極）とした。前記ポリマー層は、その成分に、グルコースに特異的に結合する物質（フェニルボロン酸）を含み、ポリマー層に形成された分子鋳型にグルコースが嵌ると、当該グルコースはポリマー層中のフェニルボロン酸と結合する。本発明の一実施形態であるグルコースセンサは、当該結合により生じる電極の電荷密度の変化を検出することにより、対象物中のグルコースの存在を判定する。
　本実施例においては、便宜上、前記ポリマー層とゲート電極を含めて「分子識別部材」と呼ぶ。
　次に、本実施例では溶液中での測定を行うため、上述のようにして得られた分子識別部
材上に、外径２０ｍｍ、内径１８ｍｍ、高さ１０ｍｍのガラスリングもしくは外形１２ｍｍ、内径１０ｍｍ、高さ１０ｍｍのガラスリングを、エポキシ樹脂を用いて固定した。
　以下の実施例および比較例では、本発明の方法によって作製した超薄膜分子鋳型ポリマー層を備えるグルコースセンサと、従来法によって作製されたポリマー層を備えるグルコースセンサについて、通電開始後のゲート表面電位の安定化速度、検出速度、および、検出感度を比較した。
（製造例１：ＡＴＲＰ法による超薄膜分子鋳型ポリマー層の作製）
　１ｍＭビス［２－（２－ブロモイソブチリロキシ）ウンデシル］ジスルフィド／エタノール溶液に、金電極がスパッタされたガラス基板を浸漬させることで、金電極上に重合開始分子を結合させた。
　次に、ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）０．２ｇと、Ｎ－３－（ジメチルアミノ）プロピルメタクリルアミド０．１ｇと、ビニルフェニルボロン酸０．０２ｇと、Ｎ，Ｎ′－メチレンビスアクリルアミド０．０２ｇと、グルコース０．００９ｇを６．７％（ｗｔ／ｗｔ）アクリル酸ナトリウム（ｐＨ６．８）で全量１ｇに調整した後、１ｇのジメチルホルムアミドを加え、完全に溶解した後、１０ｍＭ臭化銅（ＩＩ）および２０ｍＭ２’，２’ビピリジル水溶液を１００μｌ加え、次に２００ｍＭアスコルビン酸５０μｌを加えた。
　この溶液中に、重合開始分子が結合された金電極を備えるガラス基板を浸漬させ、真空下、４０℃にて２４時間重合反応させることで金電極上にハイドロゲルを作製した。重合反応終了後、ゲート電極を０．１Ｍ塩酸／メタノール溶液に一晩浸漬させ、モノマー成分およびグルコースを除去することで、金ゲート電極上に、グルコースの分子構造と相補的な構造を有する分子鋳型が形成された、超薄膜のポリマー層を作製した。
　作製されたポリマー層の厚さを目視にて測定したところ、およそ３００ｎｍと判断された。
（比較製造例１：従来法による分子鋳型ポリマー層の作製）
　ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）０．２ｇと、Ｎ－３－（ジメチルアミノ）プロピルメタクリルアミド０．１ｇと、ビニルフェニルボロン酸０．０２ｇと、Ｎ，Ｎ′－メチレンビスアクリルアミド０．０２ｇと、グルコース０．００９ｇを６．７％（ｗｔ／ｗｔ）アクリル酸ナトリウム（ｐＨ６．８）で全量１ｇに調整、溶解した後、重合開始剤としてペルオキソ二硫酸カリウム（５０ｍｇ／ｍｌ、和光純薬工業社製）を１０μｌ、テトラメチレンジアミン（東京化成社製）２μｌ加え、モノマー溶液とした。
　次に、拡張型ゲート電極の金ゲート電極上にモノマー溶液を１０μｌ加え、ＰＥＴフィルムで覆い、窒素雰囲気下、室温にて１２時間重合反応させることで、金電極上にハイドロゲルを作製した。重合反応終了後、ゲート電極を０．１Ｍ塩酸／メタノール溶液に一晩浸漬させることでモノマー成分およびグルコースを除去することで、金ゲート電極上に、グルコースの分子構造と相補的な構造を有する分子鋳型が形成された、ポリマー層を作製した。
　作製されたポリマー層の厚さを測定したところ、およそ２μｍであった。
（製造例２：ＡＴＲＰ法による超薄膜分子鋳型ポリマー層の作成）
　１ｍＭビス［２－（２－ブロモイソブチリロキシ）ウンデシル］ジスルフィド／エタノール溶液に、金電極がスパッタされたガラス基板を浸漬させることで、金電極上に重合開始分子結合させた。
　次に、Ｎ－３－（ジメチルアミノ）プロピルメタクリルアミド０．１ｇと、エチレングリコールジメタクリレート０．４ｇと、ビニルフェニルボロン酸０．４ｇと、グルコース０．２ｇを超純水で全量２ｇに調整後、ジメチルホルムアミドを２ｇ加え、溶解させ、窒素を通すことで脱気を行った。その後、１０ｍＭ臭化銅（ＩＩ）および６０ｍＭトリス［２－（ジメチルアミノ）エチル］アミンを４００μｌ加え、次に２００ｍＭアスコルビン酸５０μｌを加えた。
　この溶液中に、重合開始分子が結合された金電極を備えるガラス基板を浸漬させ、真空下、４０℃にて１８時間重合反応させることで金電極上にハイドロゲルを作製した。重合反応終了後、ゲート電極を０．１Ｍ塩酸／メタノール溶液に一晩浸漬させ、モノマー成分およびグルコースを除去することで、金ゲート電極上に、グルコースの分子構造と相補的な構造を有する分子鋳型が形成された、超薄膜のポリマー層を作製した。
　作製されたポリマー層の厚さを目視にて測定したところ、およそ２００ｎｍと判断された。
（製造例３：ＡＴＲＰ法による超薄膜分子鋳型ポリマー層の作成）
　１ｍＭビス［２－（２－ブロモイソブチリロキシ）ウンデシル］ジスルフィド／エタノール溶液に電極を浸漬させることで重合開始分子を金基板上に作製した。次にＮ－３－（ジメチルアミノ）プロピルメタクリルアミド０．４ｇと、Ｎ，Ｎ′－メチレンビスアクリルアミド０．０４ｇと、ビニルフェニルボロン酸０．４ｇと、グルコース０．２ｇを超純水で全量２ｇに調整後、ジメチルホルムアミドを２ｇ加え、溶解させ、窒素を通すことで脱気を行った。その後、１０ｍＭ臭化銅（ＩＩ）および６０ｍＭトリス［２－（ジメチルアミノ）エチル］アミンを４００μｌ加え、次に２００ｍＭアスコルビン酸５０μｌを加えた。この溶液中に重合開始分子が導入された金基板を浸漬し、真空下、４０℃にて１８時間重合反応させることで金電極上にハイドロゲルを作製した。重合反応終了後、ゲート電極を０．１Ｍ塩酸／メタノール溶液に一晩浸漬させ、モノマー成分およびグルコースを除去することで、金ゲート電極上に、グルコースの分子構造と相補的な構造を有する分子鋳型が形成された、ポリマー層を作製した。
　作製されたポリマー層の厚さを目視にて測定したところ、およそ２００ｎｍと判断された。
　製造例１～３、比較製造例１に記載の方法によって製造されたバイオセンサは、いずれもグルコースを選択的に検出した（データ図示せず）。
（原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）を用いたポリマー層の膜厚測定）
　製造例１、２および３で得られたポリマー層の厚さを正確に測定するため、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）を用いた膜厚測定を行った。製造例１、２および３で得られたポリマー層を付与した金基板に対してナイフで傷をつけ、ポリマー層と金基板表面の段差を、大気中で、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）を用いて測定した。結果を図２に示す。
　図２は、製造例１のポリマー層と金基板のＡＦＭ画像および断面プロファイルである。図５に示すように、（ａ）で示される部分がポリマー層を除去し露出した金基板部分であり（ｂ）が形成したポリマー層を示している。断面プロファイルからポリマー層と金基板の段差は平均３０ｎｍ程度であった。製造例２、３で得られたポリマー層についても同様に測定した結果、ポリマー層の厚さは平均３０ｎｍ程度であった。
実施例１
　実施例１においては、製造例１に記載の方法で作製した超薄膜分子鋳型ポリマー層を備えるグルコースセンサと、比較製造例１に記載の方法で作製した分子鋳型ポリマー層を備えるグルコースセンサを用いて実験を行った。
（通電開始後のゲート表面電位の安定化時間の評価）
　まずは、上記グルコースセンサのゲート部分に１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）１５００μｌ加え、金ゲート電極とジャンクションＦＥＴを接続し、ＦＥＴリアルタイム計測装置（オプトジェネシス社製）にてゲート電圧０Ｖ、ソース－ドレイン電流７００μＡを一定として、通電を開始してからのゲート表面電位が安定するまでの時間を測定した。
　通電開始からのゲート表面電位の安定化までの時間についての結果を図３に示す。図３は、製造例１または比較製造例１の装置において、通電開始からゲート表面電位の安定化までの時間を比較したグラフである。図３の縦軸は、分子識別部材の表面電位の変化（Ｖ）を示し、横軸は、計測時間（秒）を示している。
　図３に示すように、実施例１に示したゲート表面電位は数秒～数十秒で一定の値に安定することが分かった。一方で比較例１に示したデバイスにおいてはゲート表面電位が安定するまでに１０００秒から１５００秒要することが分かった。
　すなわち、超薄膜の分子鋳型ポリマー層を備える本発明のバイオセンサは、従来法によって作製された分子鋳型ポリマー層を備えるバイオセンサと比較して、通電からゲート表面電位が安定化するまでの時間（すなわち、測定装置のスイッチをオンにしてから、装置が測定開始可能な状態になるまでの時間）が極めて短く、実用性に優れた装置であることが示された。
（検出速度の評価結果）
　次に、各グルコースセンサにおいて、リン酸ナトリウム緩衝液に、濃度１００ｍＭのグルコース溶液を１５μｌ加え、ゲート電極表面電位の変化を観察した。
　図４は、製造例１または比較製造例１の装置において、グルコース溶液を添加した際のゲート表面電位の変化を示す。
　図４に示すように、製造例１の方法で作製した超薄膜分子鋳型ポリマー層を含むグルコースセンサにおいては、ゲート表面電位の変化が２００秒までに完了し、その後は安定した。一方、比較製造例１の方法で作製した分子鋳型ポリマー層を含むグルコースセンサにおいては、６００秒経過してもゲート表面電位が変化し続けた。
　すなわち、超薄膜の分子鋳型ポリマー層を備える本発明のバイオセンサは、従来法によって作製された分子鋳型ポリマー層を備えるバイオセンサと比較して、測定開始から測定完了までの時間が極めて短く、この点からも、実用性に優れた装置であることが示された。
実施例２
　実施例２においては、製造例２に記載の方法で作製した超薄膜分子鋳型ポリマー層を備えるグルコースセンサと、製造例３に記載の方法で作製した超薄膜分子鋳型ポリマー層を備えるグルコースセンサを用いて実験を行った。製造例２および製造例３は、製造例１の分子鋳型ポリマー層と、ポリマー層の作製に用いたモノマーの組成が異なる。
（低濃度グルコースの検出）
　上記グルコースセンサのゲート部分に１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）５００μｌ加え、金ゲート電極とジャンクションＦＥＴを接続し、ＦＥＴリアルタイム計測装置（オプトジェネシス社製）にてゲート電圧０Ｖ、ソース－ドレイン電流７００μＡを一定として、ゲート表面電位が安定化するまで静置した。ゲート表面電位が安定化した後、リン酸ナトリウム緩衝液に、各濃度のグルコース溶液を添加した。
　低濃度グルコースを添加した時の応答結果を図５に示す。図５に示すように、製造例２および製造例３に記載の方法で作製された超薄膜分子鋳型ポリマー層を備えるグルコースセンサでは、最も低い濃度である１０μＭにおいてもゲート表面電位変化が観察された。
　すなわち、超薄膜の分子鋳型ポリマー層を備える本発明のバイオセンサは、従来法によって作製された分子鋳型ポリマー層を備えるバイオセンサと比較して、測定対象物の測定感度が極めて高いことが示された。
　なお、各体液中のグルコース濃度は、血液では２．８ｍＭ～２８ｍＭ程度、汗では１４０μＭ～２２０μＭ程度、尿では６．７ｍＭ以上、唾液５０μＭ～５００μＭ程度であることが知られている。すなわち、本発明を用いることにより、これらの体液に含まれる微量の物質（例えばグルコース）を検出可能であることが示された。
（製造例４：ＡＴＲＰ法による超薄膜分子鋳型ポリマー層の作製）
　１ｍＭビス［２－（２－ブロモイソブチリロキシ）ウンデシル］ジスルフィド／エタノール溶液に、金電極がスパッタされたガラス基板を浸漬させることで、金電極上に重合開始分子を結合させた。
　次に、ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）０．２ｇと、Ｎ－３－（ジメチルアミノ）プロピルメタクリルアミド０．１ｇと、ビニルフェニルボロン酸０．０２ｇと、Ｎ，Ｎ′－メチレンビスアクリルアミド０．０２ｇと、グルコース０．００９ｇを６．７％（ｗｔ／ｗｔ）アクリル酸ナトリウム（ｐＨ６．８）で全量１ｇに調整した後、１ｇのジメチルホルムアミドを加え、完全に溶解した後、１０ｍＭ臭化銅（ＩＩ）および２０ｍＭ２’，２’ビピリジル水溶液を１００μｌ加え、次に２００ｍＭアスコルビン酸５０μｌを加えた。
　この溶液中に、重合開始分子が結合された金電極を備えるガラス基板を溶液に対して下向きに浸漬させ、真空下、４０℃にて６時間重合反応させることで金電極上にハイドロゲルを作製した。重合反応終了後、ゲート電極を０．１Ｍ塩酸／メタノール溶液に一晩浸漬させ、モノマー成分およびグルコースを除去することで、金ゲート電極上に、グルコースの分子構造と相補的な構造を有する分子鋳型が形成された、超薄膜のポリマー層を作製した。
　作製されたポリマー層の厚みを、エリプソメータを用いて測定したところ、およそ１０ｎｍであった。
（製造例５：ＡＴＲＰ法による超薄膜分子鋳型ポリマー層の作成）
　１ｍＭビス［２－（２－ブロモイソブチリロキシ）ウンデシル］ジスルフィド／エタノール溶液に、金電極がスパッタされたガラス基板を浸漬させることで、金電極上に重合開始分子結合させた。
　次に、Ｎ－３－（ジメチルアミノ）プロピルメタクリルアミド０．１ｇと、エチレングリコールジメタクリレート０．４ｇと、ビニルフェニルボロン酸０．４ｇと、グルコース０．２ｇを超純水で全量２ｇに調整後、ジメチルホルムアミドを２ｇ加え、溶解させ、窒素を通すことで脱気を行った。その後、１０ｍＭ臭化銅（ＩＩ）および６０ｍＭトリス［２－（ジメチルアミノ）エチル］アミンを４００μｌ加え、次に２００ｍＭアスコルビン酸５０μｌを加えた。
　この溶液中に、重合開始分子が結合された金電極を備えるガラス基板を浸漬させ、真空下、４０℃にて６時間重合反応させることで金電極上にハイドロゲルを作製した。重合反応終了後、ゲート電極を０．１Ｍ塩酸／メタノール溶液に一晩浸漬させ、モノマー成分およびグルコースを除去することで、金ゲート電極上に、グルコースの分子構造と相補的な構造を有する分子鋳型が形成された、超薄膜のポリマー層を作製した。
　作製されたポリマー層の厚みを、エリプソメータを用いて測定したところ、およそ１０ｎｍであった。
実施例３
　製造例４および５は、製造例１～３と、ポリマー層の作製に用いたモノマー組成が異なる。
　製造例４および５において作製した薄膜分子鋳型ポリマー層を備える金基板をＦＥＴと配線で接続し、実施例３において用いるグルコースセンサとした（センサの他の構成は実施例１、２と同様）。
　まずは、上記グルコースセンサのゲート部分に１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）５００μｌ加え、ＦＥＴリアルタイム計測装置にてゲート電圧０Ｖ、ソース－ドレイン電流９０μＡを一定として、通電を開始してからのゲート表面電位が安定した後、各濃度のグルコース溶液を添加した。
　グルコースを各濃度添加した際のＦＥＴにおけるゲート表面電位変化についての結果を図６に示す。図６は、製造例４または５の装置において、経時的なゲート表面電位をプロットしたグラフである。図６の縦軸は、分子識別部材の表面電位の変化（ｍＶ）を示し、横軸は、計測時間（秒）を示している。
　図６に示すように、製造例４および５において作製した分子鋳型ポリマー層を備えるグルコースセンサは、２０ｎＭという極めて低濃度のグルコースに対しても応答を示すことが分かった。
　図７は、図６において各濃度のグルコースに応答したＦＥＴのゲート表面電位の変化量を濃度ごとにプロットし、ラングミューワーの吸着等温式に近似させたグラフである。図７に示すように、今回の実験における測定結果は、ナノモル／リットルオーダーにおいてバラツキや誤差が少なく近似されていた。すなわち、本発明のグルコースセンサは、極めて低濃度のグルコースに対する定量性も有することが分かった。
　すなわち、本発明のバイオセンサは、従来法によって作製された分子鋳型ポリマー層を備えるバイオセンサと比較して、涙や唾液中等の体液に含まれる極めて希薄なグルコースを検出するに十分な感度を有する、実用性に優れた装置であることが示された。
　なお、製造例４および製造例５で得られたポリマー層の膜厚はエリプソメータ(Ｍ２０００、ジェイ・エー・ウーラム社製)を用いて測定された。その結果、重合開始分子を金電極上に結合させたときの膜厚が１～１．５ｎｍであり、ＡＴＲＰ法による分子鋳型ポリマー層の膜厚は８～２５ｎｍであった。
（製造例６：ＡＴＲＰ法による超薄膜分子鋳型ポリマー層の作成）
　本製造例においては、ドーパミンを鋳型とした超薄膜分子鋳型ポリマー層を作製した例を示す。
　１ｍＭビス［２－（２－ブロモイソブチリロキシ）ウンデシル］ジスルフィド／エタノール溶液に、金電極がスパッタされたガラス基板を浸漬させることで、金電極上に重合開始分子結合させた。
　次に、Ｎ－３－（ジメチルアミノ）プロピルメタクリルアミド０．０５１ｇと、エチレングリコールジメタクリレート０．４７６ｇと、ビニルフェニルボロン酸０．０４４ｇと、ドーパミン０．０５７ｇを超純水１ｍｌとジメチルホルムアミド２ｍｌを加えて溶解させ、窒素を通すことで脱気を行った。その後、臭化銅（ＩＩ）１．４ｍｇおよびトリス［２－（ジメチルアミノ）エチル]アミン１８ｍｇ、そしてアスコルビン酸１１ｍｇを加えた。
　この溶液中に、重合開始分子が結合された金電極を備えるガラス基板を浸漬させ、真空下、室温にて１８時間重合反応させることで金電極上にハイドロゲルを作製した。重合反応終了後、ゲート電極を０．１Ｍ塩酸／メタノール溶液に一晩浸漬させ、モノマー成分およびグルコースを除去することで、金ゲート電極上に、ドーパミンの分子構造と相補的な構造を有する分子鋳型が形成された、超薄膜のポリマー層を作製した。
実施例４
　製造例６において作製した薄膜分子鋳型ポリマー層を備える金基板をＦＥＴと配線で接続し、実施例４において用いるドーパミンセンサとした（センサの他の構成は実施例１、２と同様）。比較例として、上記製造例６におけるモノマー溶液からドーパミンを除いた、分子鋳型なしのポリマー層を金ゲート電極上に有するセンサを作製した。
　まずは、上記のドーパミンセンサのゲート部分にリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）を５００μｌ加え、金ゲート電極とＭＯＳＦＥＴを接続し、ＦＥＴリアルタイム計測装置にてゲート電圧０Ｖ、ソース－ドレイン電流９０μＡを一定として、通電を開始してからのゲート表面電位が安定した後、各濃度のドーパミン溶液を添加した。
　ドーパミンを各濃度添加した際のＦＥＴにおけるゲート表面電位変化についての結果を図８に示す。図８は、製造例６で作成した、ドーパミンを鋳型とする分子鋳型ポリマーを有するセンサと、分子鋳型なしのポリマー層を有するセンサ（比較例）における、経時的なゲート表面電位をプロットしたグラフである。図８の縦軸は、分子識別部材の表面電位の変化（ｍＶ）を示し、横軸は、計測時間（秒）を示している。
　図８に示すように、製造例６において作製した分子鋳型ポリマーを備えるドーパミンセンサは、１０ｎＭという極めて低濃度のドーパミンに対しても応答を示すことが分かった。
　図９は、図８において各濃度のドーパミンに応答したＦＥＴのゲート表面電位の変化量を濃度ごとにプロットしたグラフである。図９に示すように、ドーパミン添加濃度が上昇するにつれて、分子鋳型ポリマーを備えるセンサにおけるゲート表面電位変化量と、鋳型無しのゲルを備えるセンサにおけるゲート表面電位変化量に差が生じていることが明らかとなった。
　すなわち、本発明のバイオセンサは、グルコース以外の生体分子も選択的にかつ高感度に検出することができる、実用性に優れた装置であることが示された。
１００：グルコースセンサ
１０１：ＦＥＴデバイス
１０２：ゲート絶縁膜
１０３：金属電極
１０４：配線
１０５：基板
１０６：金属ゲート電極
１０７：分子鋳型ポリマー層
１０８：参照電極
１０９：ガラスリング
１１０：緩衝液

 
 

Claims (22)

  1. 　検出対象物質と結合することができる識別物質と、前記識別物質の電荷を帯電する電極とを備え、前記検出対象物質が前記識別物質に結合することにより生じる前記電極の電荷密度の変化を検出するバイオセンサにおいて、
    　前記電極の表面の全部又は一部には、検出対象物質の分子構造と相補的な構造を有する分子鋳型が形成されたポリマー層が形成されており、
    　前記ポリマー層には前記識別物質を含み、
    　前記ポリマー層は超薄膜層であることを特徴とする、
    バイオセンサ。
  2. 　請求項１に記載のバイオセンサであって、
    　前記超薄膜層は、厚さが１μｍ以下の薄膜層であることを特徴とする、
    バイオセンサ。
  3. 　請求項１または２に記載のバイオセンサであって、
    　前記ポリマー層は、
    　（ａ）：１または複数種のモノマー、前記検出対象物質、および、前記識別物質、を含むモノマー溶液を前記電極の表面の全部又は一部において重合させることにより、前記電極の表面の全部または一部に超薄膜層であるポリマー層を形成させるステップ、および、
    　（ｂ）：前記ステップ（ａ）の後、前記ポリマー層から前記検出対象物質を除去することにより、前記ポリマー層に前記検出対象物質の分子構造と相補的な構造を有する分子鋳型を形成させるステップ、
    を含む方法によって形成されることを特徴とする、
    バイオセンサ。
  4. 　請求項３に記載のバイオセンサであって、
    　前記モノマー溶液の重合が、リビングラジカル重合、または、電解重合であることを特徴とする、
    バイオセンサ。
  5. 　請求項４に記載のバイオセンサであって、
    　前記リビングラジカル重合は、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）、可逆的付加－開裂連鎖移動重合（ＲＡＦＴ）、または、ニトロキシドを介した重合（ＮＭＰ）であることを特徴とする、
    バイオセンサ。
  6. 　請求項５に記載のバイオセンサであって、
    　前記リビングラジカル重合は、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）であり、
    　前記ステップ（ａ）に先立って、重合開始分子が電極の表面の全部又は一部にあらかじめ結合されていることを特徴とする、
    バイオセンサ。
  7. 　請求項３に記載のバイオセンサであって、
    　前記ステップ（ａ）が、１または複数種のモノマー、前記検出対象物質、および、前記識別物質、を含むモノマー溶液を、スピンコートを用いて電極の表面の全部又は一部に適用し、適用されたモノマー溶液を重合させることにより、前記電極の表面の全部または一部に超薄膜層のポリマー層を形成させるステップ、であることを特徴とする、
    バイオセンサ。
  8. 　請求項１～７のいずれか１項に記載のバイオセンサであって、
    　前記電極が、金電極、銀電極、銅電極、または、白金電極であることを特徴とする、
    バイオセンサ。
  9. 　請求項３～８のいずれか１項に記載のバイオセンサであって、
    　前記モノマー溶液が、アクリルアミド誘導体、メタクリルアミド誘導体、アクリレート誘導体、メタクリレート誘導体、アクリロニトリル、２－ビニルピリジン、４－ビニルピリジン、Ｎ－ビニル－２－ピロリドンおよび酢酸ビニルからなる群から選択される少なくとも１種類のモノマーを含むことを特徴とする、
    バイオセンサ。
  10. 　請求項１～９のいずれか１項に記載のバイオセンサであって、
    　前記電極が、電界効果トランジスタのゲート絶縁膜に電気的に接続されている
    ことを特徴とするバイオセンサ。
  11. 　請求項１０に記載のバイオセンサであって、
    　前記電極は、前記電界効果トランジスタから離れて配置されており、
    　前記電極は、前記ゲート絶縁膜上に設けられた別の金属電極と配線を介して、前記ゲート絶縁膜に電気的に接続されている
    ことを特徴とするバイオセンサ。
  12. 　請求項１０に記載のバイオセンサであって、
    　前記電極が、前記ゲート絶縁膜上に直接に載置されることにより、
    前記ゲート絶縁膜に電気的に接続されている
    ことを特徴とするバイオセンサ。
  13. 　請求項１～１２のいずれか１項に記載のバイオセンサであって、
    　前記検出対象物質が生体由来の物質、環境中の物質、または、食品中の物質であることを特徴とする、
    バイオセンサ。
  14. 　請求項１３に記載のバイオセンサであって、
    　前記生体由来の物質が、体液由来の物質であることを特徴とする、
    バイオセンサ。
  15. 　請求項１４に記載のバイオセンサであって、
    　前記体液が、血液、リンパ液、組織液、体腔液、消化液、汗、涙、鼻汁、唾液、尿、精液、膣液、羊水、および、乳汁からなる群から選択されることを特徴とする、
    バイオセンサ。
  16. 　バイオセンサにおいて使用される電極であって、
    　前記バイオセンサは、検出対象物質が識別物質に結合することにより生じる前記電極の電荷密度の変化を検出するバイオセンサであり、
    　前記電極は、前記検出対象物質と結合することができる前記識別物質の電荷を帯電する電極であり、
    　前記電極の表面の全部又は一部には、検出対象物質の分子構造と相補的な構造を有する分子鋳型が形成されたポリマー層が形成されており、
    　前記ポリマー層には前記識別物質を含み、
    　前記ポリマー層は超薄膜層である
    ことを特徴とする、
    電極。
  17. 　バイオセンサにおいて使用するための電極の製造方法であって、
    　前記バイオセンサは、検出対象物質が識別物質に結合することにより生じる前記電極の電荷密度の変化を検出するバイオセンサであり、
    　前記電極は、前記検出対象物質と結合することができる前記識別物質の電荷を帯電する電極であり、
    　前記方法は、
    　（ａ）：１または複数種のモノマー、前記検出対象物質、および、前記識別物質、を含むモノマー溶液を、前記電極の表面の全部または一部において重合させることにより、前記電極の表面の全部または一部に超薄膜層であるポリマー層を形成させるステップ、および、
    　（ｂ）：前記ステップ（ａ）の後、前記ポリマー層から前記検出対象物質を除去することにより、前記ポリマー層に前記検出対象物質の分子構造と相補的な構造を有する分子鋳型を形成させるステップ、
    を含むことを特徴とする、
    方法。
  18. 　請求項１７に記載の方法であって、
    　前記超薄膜は、厚さが１μｍ以下の薄膜であることを特徴とする、
    方法。
  19. 　請求項１７または１８に記載の方法であって、
    　前記ステップ（ａ）におけるモノマー溶液の重合が、リビングラジカル重合、または、電界重合であることを特徴とする、
    方法。
  20. 　請求項１９に記載の方法であって、
    　前記リビングラジカル重合は、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）、可逆的付加－開裂連鎖移動重合（ＲＡＦＴ）、または、ニトロキシドを介した重合（ＮＭＰ）であることを特徴とする、
    方法。
  21. 　請求項２０に記載の方法であって、
    　前記リビングラジカル重合は、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）であり、
    　前記ステップ（ａ）に先立って、重合開始分子を電極の表面の全部又は一部にあらかじめ結合させる工程を含むことを特徴とする、
    方法。
  22. 　請求項１７～２１のいずれか１項に記載の方法であって、
    　前記ステップ（ａ）が、１または複数種のモノマー、前記検出対象物質、および、前記識別物質、を含むモノマー溶液を、スピンコートを用いて前記電極の表面の全部または一部に適用し、適用されたモノマー溶液を重合させることにより、前記電極の表面の全部または一部に超薄膜層のポリマー層を形成させるステップ、であることを特徴とする、
    方法。
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