WO2017163181A1

WO2017163181A1 - Composição vacinal contra as leishmanioses tegumentar e visceral, e uso

Info

Publication number: WO2017163181A1
Application number: PCT/IB2017/051631
Authority: WO
Inventors: Eduardo ANTONIO FERRAZ COELHO; Carlos ALBERTO PEREIRA TAVARES; Mariana COSTA DUARTE; Daniela PAGLIARA LAGE; Vívian TAMIETTI MARTINS; Daniel MENEZES SOUZA; Bruno MENDES ROATT
Original assignee: Universidade Federal De Minas Gerais - Ufmg
Priority date: 2016-03-22
Filing date: 2017-03-21
Publication date: 2017-09-28
Also published as: BR102016006219A2

Abstract

A presente invenção trata de uma composição vacinal composta por duas proteínas imunogênicas, definidas pelas SEQ ID N° 1 e 2, e seu uso no tratamento e/ou prevenção das leishmanioses tegumentar e visceral no cão e no homem.

Description

COMPOSIÇÃO VACINAL CONTRA AS LEISHMANIOSES

TEGUMENTAR E VISCERAL, E USO_

[001 ] A presente invenção trata de uma composição vacinai composta por duas proteínas imunogênicas, definidas pelas SEQ ID N° 1 e 2, e seu uso no tratamento e/ou prevenção das leishmanioses tegumentar e visceral no cão e no homem.

[002] A leishmaniose é uma doença infecciosa que tem como agentes etiológicos parasitas do género Leishmania. De acordo com a Organização Mundial de Saúde, a incidência das leishmanioses está concentrada no Afeganistão, Argélia, Arábia Saudita, Irã, Sudão, Síria, Brasil e Peru. Estima-se que 380 milhões de pessoas encontram-se expostas ao risco de contrair a doença e que aproximadamente 0,5 a 1 ,0 e 1 ,5 a 2,0 milhões de novos casos de leishmaniose visceral (LV) e leishmaniose tegumentar (LT) ocorram a cada ano, respectivamente. O Brasil é responsável por cerca de 95% dos casos de LV nas Américas, fato que torna a doença um importante problema de Saúde Pública e que requer, dessa forma, atenção especial por autoridades competentes (World Health Organization. Control of the leishmaniasis: report of a meeting of the WHO Expert Committee on the Control of Leishmaniases, WHO Technical Report series. (949), Geneva, 22-26,2010. ).

[003] As lesões no hospedeiro mamífero variam desde uma lesão cutânea local até a forma visceral, que pode ser fatal se não tratada. Problemas como a ineficácia das medidas de controle, a toxicidade elevada dos tratamentos convencionais e a dificuldade em se obter um diagnóstico rápido e específico fazem com que o desenvolvimento de vacinas contra a doença torne-se uma opção desejável (Tesh RB. Control of zoonotic visceral leishmaniasis: is it time to change strategies? Am J Trop Med Hyg. 52;287-92, 1995). [004] Em modelos experimentais murinos, os animais apresentam memória imunológica duradoura após a cura da doença, adquirindo assim imunidade contra reinfecções. Tal fato tem estimulado o desenvolvimento de antígenos vacinais para prevenção das leishmanioses. De forma ideal, uma vacina contra leishmaniose deverá conter antígenos que sejam conservados entre as diferentes espécies do parasita. Entretanto, a maioria dos estudos atuais envolvem antígenos únicos, o que reflete no quadro atual da saúde pública, não sendo encontrada uma única vacina completamente eficaz no combate às diferentes espécies do parasita Leishmania (Afonso LC e Scott P. Immune responses associated with susceptibility of C57BL/10 mice to Leishmania amazonensis. Infect. & Immun. 61 ;2952^"59, 1993; Chávez-Fumagalli MA, et al. Vaccination with the Leishmania infantum ribosomal proteins induces protection in BALB/c mice against Leishmania chagasi and Leishmania amazonensis challenge. Microbes Infect. 12;967^"77, 2010; Agallou M, et al. Vaccination with Leishmania histone H1 -pulsed dendritic cells confers protection in murine visceral leishmaniasis. Vaccine. 30;5086^"93, 2012).

[005] A resposta imune eficaz contra infecção por Leishmania se dá através do perfil inflamatório Th1 , o qual é estimulado através da modulação proveniente de citocinas como, por exemplo, IFN- .\ e IL-12, produzidas por células da resposta imune inata. Em contrapartida, o mecanismo de susceptibilidade à doença está associado ao perfil de resposta Th2, via produção de IL-10 e IL-4. Dessa forma, procura-se a associação de que os animais considerados como protegidos apresentem baixa carga parasitária em relação aos controles do experimento e que seus esplenócitos produzam e secretem níveis elevados de IFN- .-.e IL-12, e baixos níveis de IL-4 e IL-10, após a estimulação in vitro dos mesmos (Sacks D e Noben-Trauth N. The immunology of susceptibility and resistance to Leishmania major in mice. Nat Rev Immunol. 2; 845-58, 2002). [006] Pelo fato de não existir, até o presente momento, uma vacina comercial que seja composta por diferentes imunógenos em uma mesma formulação vacinai, quer seja como proteínas recombinantes ou composta por partes de tais imunógenos, no caso, epítopos específicos de linfócitos T, novos estudos se fazem necessários. Soma-se o fato de que vacinas multiproteicas e/ou polipeptídicas poderiam ofertar proteção mais efetiva e contra mais de uma espécie de Leishmania; problemas importantes que atualmente encontram-se como grandes desafios. Cabe ressaltar que a Organização Mundial de Saúde tem preconizado o desenvolvimento de pesquisas objetivando a descoberta de vacinas multiproteicas e/ou polipeptídicas para proteção contra as leishmanioses, ao invés de vacinas compostas por proteínas recombinantes ou peptídeos sintéticos isolados.

[007] A utilização de ferramentas biotecnológicas modernas tem levado à identificação de novos produtos com potencial para o emprego no desenvolvimento de vacinas contra diversas doenças. Recentemente, proteínas da espécie Leishmania braziliensis foram reconhecidas por anticorpos presentes nos soros de pacientes com LT (Duarte MC et al. Proteins selected in Leishmania (Viannia) braziliensis by an immunoproteomic approach with potential serodiagnosis applications for tegumentary leishmaniasis. Clin Vaccine Immunol. 22(1 1 ):1 187-96, 2015). Dentre essas proteínas, alvos diagnósticos, vacinais e/ou terapêuticos foram identificados. Duas elas, uma proteína hipotética (LiHyp; LbrM30.3350) e o fator de iniciação eucariotico 5a {eukaryotic initiation factor 5a, EiF5a; LbrM25.0580), quando utilizadas individualmente e associadas à saponina, como adjuvante, mostraram-se eficazes na indução de proteção de camundongos BALB/c contra a infecção experimental por L. amazonensis (dados não publicados), uma espécie diretamente relacionada com a espécie L. braziliensis, aquela na qual as proteínas foram originalmente identificadas. [008] O documento de patente WO2014160987, intitulado ^{^}Vaccines comprising leishmania polypeptides for the treatment and diagnosis of leishmaniasis_ refere-se a composições imunogênicas e métodos para prevenção, tratamento e diagnósticos de leishmanioses. Essas composições são provenientes de antígenos de Leishmania, assim como os polinucleotídeos codificantes. Essa tecnologia se difere da presente invenção por compreender proteínas diferentes, não relacionadas àquelas descritas no presente pedido.

[009] O documento de patente WO2014091463, intitulado ^{^}Method for producing leishmania recombinant proteins and use in a diagnostic kit and vaccine against leishmaniases_ trata do uso das proteínas antigênicas do género Leishmania HSP 83-1 , MAPK e MAPK3 para a produção de vacinas e kit diagnóstico de leishmanioses em humanos e/ou cães. Essa tecnologia se difere do presente pedido por se tratar de outras proteínas, não sendo observadas similaridades.

[0010] No estado da arte, não foi encontrada tecnologia similar à presente invenção, no sentido do desenvolvimento de um novo produto composto por duas proteínas imunogênicas que foram capazes de induzir proteção heteróloga contra a infecção por espécies de Leishmania causadoras de LV e LT.

[001 1 ] A presente tecnologia trata de uma composição vacinai composta pela associação de quantidades equimolares de duas proteínas (LiHyp, LbrM30.3350 e EiF5a, LbrM25.0580), preferencialmente associadas à saponina, e seu uso no tratamento e/ou prevenção das leishmanioses visceral e tegumentar. Tal formulação mostrou-se eficaz na indução de proteção contra a infecção causada pelas espécies L. infantum e L. amazonensis, espécies causadoras de leishmaniose visceral e tegumentar, respectivamente, no mundo. A composição vacinai proposta apresentou resultados superiores em relação àqueles encontrados utilizando as proteínas isoladamente, no que tange à imunogenicidade induzida antes e após a infecção experimental, bem como na redução da carga parasitária em diferentes órgãos, em animais experimentais.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA TECNOLOGIA

[0012] A presente invenção trata de uma composição vacinai composta por duas proteínas imunogênicas, EiF5a e proteína hipotética (LiHyp), de Leishmania, definidas pelas SEQ ID N° 1 e 2, e seu uso no tratamento e/ou prevenção das leishmanioses tegumentar e visceral no cão e no homem.

[0013] Mais especificamente, a composição vacinai proposta apresenta uma combinação equimolar das duas proteínas, além de adjuvantes farmacêutica e farmacologicamente aceitáveis.

[0014] Os adjuvantes farmacêutica e farmacologicamente aceitáveis, de acordo com a presente invenção, podem ser selecionados, sem qualquer limitação, dentre aqueles citados na seguinte literatura: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing, Farmacopéia Européia ou Brasileira ou novos excipientes a serem desenvolvidos, sendo preferencialmente as saponinas. É importante que tais moléculas ou produtos sejam capazes de induzir ao desenvolvimento de uma resposta imune celular do tipo Th1 , que seja primada pela produção das citocinas IFN-γ θ IL-12.

[0015] A composição vacinai proposta pode ser administrada pelas vias intradérmica, intramuscular, oral, nasal, intravenosa, subcutânea e/ou como dispositivo que possa ser implantado e/ou injetado.

[0016] A composição vacinai proposta foi capaz de induzir proteção em modelos murinos contra as leishmanioses tegumentar e visceral, tendo apresentado eficácia significativamente superior àquela alcançada pelas proteínas administradas de forma isolada.

[0017] A presente invenção pode ser mais bem compreendida através dos seguintes exemplos, não limitantes da tecnologia. EXEMPLO 1 - Clonagem das proteínas LiHyp e EiF5a

[0018] A cepa de L. braziliensis foi utilizada para a extração do DNA genômico e para a clonagem das proteínas. As sequências das proteínas foram previamente analisadas e apresentaram elevada homologia (>90%) de aminoácidos com as sequências das proteínas das outras espécies de Leishmania. A soma de 1 x 10⁹ parasitos na forma promastigota foi utilizada para a extração do DNA genômico. Os parasitos foram centrifugados (2.500 x g por 20 minutos) e lavados em 3 mL de PBS 1 x estéril, por duas vezes. O precipitado final foi ressuspendido em tampão Tris-EDTA (TE, o qual foi constituído por Tris-HCI 10 milimolar (mM) pH 7,0 e EDTA 1 mM) e novamente centrifugado. Em seguida, o pellet foi ressuspendido em solução de lise (150 mM NaCI, 250 mM EDTA, dodecil sulfato de sódio (SDS) 10%, 0,5% sarcosil e 10 μg/mL RNase) e incubado por 30 minutos a 50 °C, seguido de imersão em banho de gelo por 10 minutos, sob agitação constante. A suspensão foi submetida a duas extrações com fenokclorofórmio na proporção de 1 :1 e, em seguida, foi tratada com clorofórmio:álcool isoamílico, na proporção de 24:1 . Para a precipitação do DNA, foram adicionados 2 vezes o volume de etanol absoluto (Merck) resfriado e 1 mL de NaCI 2 molar (M). A suspensão foi incubada a 4°C por 16 horas (h) e, posteriormente, recuperada por centrifugação (1 1 .500 x g por 30 minutos). O precipitado foi ressuspendido em 1 mL de etanol 70% resfriado e acetato de sódio 0,3 M, recuperado por centrifugação nas mesmas condições anteriores e seco a 37°C. O DNA foi então ressuspendido em 50 μL· de tampão TE. Para verificar a qualidade do material obtido, uma eletroforese em gel de agarose 1 % peso por volume (p/v) (Sigma) em tampão TAE foi realizada. O gel foi corrido a 80 volts (V) e corado em brometo de etídio (10 μς/ιηί). A dosagem foi realizada em espectrofotômetro nos comprimentos de onda de 260 e 280 nm, e a amostra armazenada a -80°C. [0019] A região codificadora das proteínas foi amplificada por PCR, utilizando-se oligonucleotídeos iniciadores complementares aos fragmentos, que apresentam 957, 633, 1587 e 513 pares de bases (pb), respectivamente, tendo sido inseridos sítios de restrição para as enzimas BamHI e Hindlll. Para a reação de amplificação dos genes de interesse, foram utilizados aproximadamente 100 nanogramas (ng) do DNA genômico, 0,2 mM dNTPs, 0,1 % BSA, 0,4 =M de cada um dos iniciadores, tampão da GoTaq Green 1 x (Tris-HCI 20mM pH8,4; 50 mM KCI, Invitrogen); e 1 .25 U de GoTaq DNA Polimerase (Promega), em volume de reação final de 25 =L. A termociclagem foi realizada em um ciclador térmico (Tonegen Palm, Tonederm), utilizando-se o seguinte programa:

Passo 1 ^" desnaturação a 95°C por 5 min.

Passo 2 ^" desnaturação a 95°C por 45 seg;

anelamento a 55°C por 45 seg; 30 ciclos

extensão a 72°C por 120 seg.

Passo 3 ^" extensão final a 72°C por 5 min.

[0020] Após a reação, os produtos da PCR foram aplicados em um gel de agarose 1 %, corado com brometo de etídio e os fragmentos de interesse identificados. Os produtos da PCR foram dosados em 260 nm, no aparelho NanoDrop® 2000 (Thermo Scientific, USA).

[0021 ] Os produtos das amplificações dos genes codificantes das proteínas foram ligados individualmente ao vetor de clonagem pGEM^®-T Easy Vector Systems (Promega). Para realizar a ligação de cada gene no vetor, foram utilizados 50 ng do vetor pGEM^®-T Easy Vector, 3 U da enzima T4 DNA ligase, 50 ng do inserto do gene, 5 =L de tampão de rápida ligação 1 x (30 mM Tris-HCI pH 7,8, 10 mM MgCI2, 10 mM DTT, 1 mM ATP, e 5% de polietilenoglicol) e água ultra pura (Milli-Q), para completar o volume final de reação para 10 =L. A ligação de cada inserto ao vetor ocorreu a 4°C, por 16 horas.

[0022] Células competentes E. coli XLI blue foram preparadas através da técnica de cloreto de cálcio. Para a transformação de bactérias E. coli XL1 blue com o plasmídeo pGEM, foram utilizados 2 =L da reação de ligação para cada 50 =L de células competentes. O material foi incubado em gelo durante 15 minutos, seguindo de choque térmico a 42 DC por 90 segundos, e ocorreu nova incubação em gelo por mais 5 minutos. Foram adicionados 250 =L de meio de cultura Luria Bertani (LB) estéril em cada tubo de transformação e ocorreu a incubação a 37°C por 1 hora e 30 minutos, em constante agitação. Placas constituídas por 20 mL de meio de cultura LB sólido autoclavado (5 gramas (g) de extrato de levedura, 10 g de triptona bacteriológica, 5 g de NaCI e 15 g de ágar bacteriológico, para cada 1 L de solução, pH 7,4) suplementado com 20 =L de ampicilina 100 mg/ml_, 100 mM de Isopropil f-D-1 -tiogalactopiranosideo (IPTG) e 20 =L de 5-bromo-4- cloro-indolil-f-D-galactopiranosideo (X-Gal, 50 mg/ml_) foram utilizadas para plaquear 150 =L de cada bactéria transformada. As placas foram mantidas a 37°C por 16 horas.

[0023] Após a incubação das placas, colónias brancas resistentes (clones positivos) foram selecionadas para a extração dos DNAs plasmidiais. As colónias selecionadas foram colocadas individualmente em tubos estéreis contendo 5 mL de meio de cultura LB e 5 =L de ampicilina (100 mg/mL). Os tubos foram incubados a 37°C por 16 horas, em constante agitação. As células crescidas tiveram seus DNAs plasmidiais extraídos através do kit Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification System (Promega). A digestão dos plasmídeos foi realizada utilizando-se 5 =g do DNA, 15 U das endonucleases de restrição Hindlll e BamHI (Promega) além de tampão específico para as endonucleases (Promega) e água milli-Q estéril. A digestão ocorreu a 37°C durante 2 horas e, em seguida, os produtos foram aplicados em gel de agarose 1 %, corados com brometo de etídio. As respectivas bandas obtidas foram excisadas e purificadas com o kit Invisorb^® Fragment CleanUp (Invitek), para as ligações dos insertos no plasmídeo de expressão pET21 a (Novagen). Após a clonagem em vetor pGEM-T^®, amostras dos plasmídeos purificados foram separadas para a realização do sequenciamento automático de DNA de alta qualidade, e para a confirmação das identidades dos insertos e do vetor. O sistema utilizado para o sequenciamento foi o MegaBACE 1000 DNA Sequencing System (GE Healthcare), no qual as reações de sequenciamento são feitas utilizando o DYEnamicu ET Dye Terminator Kit Cycle Sequencing e as corridas são realizadas utilizando o MegaBACETM Long Read Matrix. As sequências foram analisadas pelo software Sequence Analyser versão 3.0.

[0024] Os insertos de cada gene codificante de cada proteína foram digeridos e purificados a partir dos vetores pGEM, e armazenados a -20 DC para realização de uma nova ligação em vetor de expressão. O plasmídeo pET21 a foi digerido através de uma reação que contem 15 U das endonucleases de restrição Hindlll e BamHI (Promega), tampão específico para as endonucleases, 5 =g de cada plasmídeo e água milli-Q estéril. A reação ocorreu a 37°C por 2 horas. Para a realização das novas ligações, foram feitas reações contendo aproximadamente 100 ng de cada plasmídeo específico para cada gene, 1 U da enzima de ligação T4 DNA ligase (Invitrogen) e tampão 1 x (50 mM Tris-HCI, pH 7,6, 10 mM MgCI₂, 1 mM ATP, 1 mM DTT, 5% p/v polietilenoglicol). As reações de ligação ocorreram a 4°C por 16 horas, levando à formação dos vetores de expressão. Bactérias E. coli BL21 e BL21 AI foram transformadas seguindo o mesmo protocolo citado para a transformação das células XL1 blue por pGEM e plaqueadas em meio de cultura LB sólido acrescido com o antibiótico ampicilina (100 =g/ml_). Colónias crescidas na placa foram selecionadas e replicadas individualmente em 5 mL de meio de cultura LB com o respectivo antibiótico. Alíquotas das bactérias transformadas foram estocadas em glicerol 16%, a -80°C. Para confirmar a presença dos insertos, os plasmídeos foram extraídos pelo método de lise alcalina e os DNAs das colónias recombinantes submetidos à digestão enzimática com as endonucleases específicas, sendo que um novo gel de agarose a 1 % foi realizado para a confirmação dos insertos.

[0025] Para verificar a cinética de expressão das proteínas recombinantes, foi realizado um experimento utilizando 50 mL de meio de cultura de cada bactéria transformada. Para tal, foram preparados pré-inóculos de clones positivos em 5 mL de meio de cultura LB e antibióticos específicos, os quais foram incubados a 37°C por 16 horas, em constante agitação. Após, para cada proteína, 20 mL de meio de cultura LB, acrescido dos antibióticos específicos, foram inoculados com 400 =L de cada pré-inóculo. A incubação ocorreu a 37°C, sob constante agitação, até as células atingirem a densidade óptica (DO) de aproximadamente 0.500, em comprimento de onda de 600 nm. Neste ponto, alíquotas de 1 mL, correspondentes ao tempo 0 (TO), foram retiradas e, em seguida, foi adicionado 1 mM de IPTG em cada frasco para a indução da expressão das proteínas. As células foram novamente incubadas a 37°C, em constante agitação, sendo retiradas alíquotas de 1 mL das culturas em 1 , 2, 3 e 4 horas após a indução. As células foram recuperadas por centrifugação (10.500 x g por 2 minutos), ressuspendidas em 50 =L de água destilada e 10 =L tampão de amostra [125 mM Tris-HCI, pH 6,8, azul de bromofenol a 0,08% (p/v), glicerol a 60% (v/v), f-mercaptoetanol a 10% (v/v) e SDS a 2% (p/v)], deixadas em banho de 100^QC por 5 minutos e aplicadas em eletroforese SDS-PAGE, para a análise da expressão das proteínas. As proteínas foram expressas em maiores concentrações após um período de 3 horas de indução e em temperatura de 37°C. Para a purificação em larga escala, a expressão das proteínas foi realizada nas mesmas condições, entretanto, usando 2 L de cultura. Para a lise das bactérias, os pellets foram ressuspendidos em 40 mL de tampão de ligação [20 mM de uma solução fosfato de sódio, pH 8,0 (77,4 mL de uma solução fosfato dibásico 1 M em 22,6 mL de uma solução fosfato monobásico 1 M), 500 mM NaCI, 5 mM imidazol, 1 mM f-mercaptoetanol e 8 M uréia], submetidos a 5 ciclos de ultrassom (15 segundos cada, 90 MHz) e centrifugadas a 13.000 rpm durante 20 minutos a 4^QC, sendo que os sobrenadantes foram analisados por SDS-PAGE. As proteínas foram então transferidas para colunas empacotadas com Níquel e lavadas com tampão de ligação seguido por tampão de lavagem (20mM solução fosfato pH 8,0, 500 mM NaCI, 5mM imidazol e 1 mM f-mercaptoethanol). As eluições foram realizadas em tampão de eluição (20 mM solução fosfato, pH 8.0, 500 mM NaCI, 500 mM imidazol, e 1 mM f-mercaptoethanol) e as mesmas foram dialisadas com PBS 1 x. As amostras foram concentradas a vácuo (eppendorf Vacufuge®) e submetidas à purificação por gel filtração (SuperdexTM 200). Após a purificação, as proteínas recombinantes foram passadas em coluna de agarose-polimixina (Sigma), para a remoção de eventuais endotoxinas bacterianas. As proteínas purificadas foram dosadas pelo método de Bradford e aplicadas em gel de eletroforese SDS-PAGE 12%. As mesmas foram aliquotadas e armazenadas a -80°C, até o momento do uso.

[0026] EXEMPLO 2 - Avaliação da eficácia protetora da composição vacinai

[0027] Para a composição/formulação da vacina multiproteica, partes equimolares das proteínas rLiHyp e rEiF5a (10 μg de cada proteína) foram misturadas com saponina (25 μς), durante 30 minutos e sob agitação constante. Em relação aos esquemas de imunização, grupos de camundongos BALB/c (n=8 por grupo) foram imunizados por via subcutânea, com as proteínas individuais (20 μg de cada proteína) ou com a vacina multiproteica (20 μg por dose) associados à saponina (25 μg por dose), no coxim plantar esquerdo. Três doses dos imunógenos foram administradas, em intervalos de 1 5 dias, em um volume final de 20 μΙ_, por animal. Como grupos controles, salina e saponina foram administradas nos animais.

[0028] A infecção desafio foi realizada 30 dias após a 3^§ e última dose da vacina. Para a mesma, 1 x 10⁶ ou 1 x 10⁷ formas promastigotas em fase estacionária de crescimento de L. amazonensis ou L. infantum foram utilizadas. Os parasitas foram cultivados em meio Schneider s completo, a 24°C, quantificados em câmara de Newbauer e administrados no coxim plantar direito dos animais.

[0029] A avaliação da carga parasitária foi realizada pela técnica da diluição limitante em fragmentos da lesão (infecção por L. amazonensis), bem como no baço, fígado, linfonodo poplíteo e medula óssea dos animais infectados. Para tal, os mesmos foram retirados após 10 semanas da infecção desafio, pesados e macerados em meio de Schneider^'s completo. O macerado foi submetido a uma diluição seriada em placas de 96 poços, quando as mesmas foram incubadas durante 7 e a 24^QC, sendo que a maior diluição na qual parasitas viáveis podiam ser visualizados foi determinada pela visualização utilizando um microscópio trinocular invertido.

[0030] Camundongos foram sacrificados para a coleta do baço, que foi macerado em meio DMEM (Sigma) completo, o qual foi composto pelo meio DMEM, 20% de soro fetal bovino inativado, 4.5 g/L de glicose, 20 μg/mL de gentamicina, 100 U/mL de penicilina e 50 μg/mL de estreptomicina, pH 7.4. O macerado foi centrifugado a 1 .200 x g por 1 0 minutos e o sobrenadante foi descartado. As hemácias foram lisadas com 3 mL de tampão de lise (17 mM Tris-HCI pH 7.4 e 144 mM cloreto de amónio) por 4 minutos, quando foi então acrescentado meio DMEM para um volume final de 10 mL. O material foi centrifugado a 1 .200 x g por 10 minutos e, posteriormente, o sobrenadante foi descartado. O pellet foi ressuspendido em 1 ml_ de DMEM completo, o qual foi acrescentado 20% de soro fetal bovino inativado. Os esplenócitos foram quantificados em câmara de Newbauer e 2 x 10⁶ células por mL foram plaqueadas em placas de 24 poços (Nunc), em meio DMEM completo. Os esplenócitos foram estimulados individualmente com as proteínas rLiHyp, rEiFõa ou com o mix das proteínas (10 μς, em todos os casos), ou com uma mistura dos extratos proteicos dos parasitas (50 μς) ou incubadas sem estímulo (meio). A incubação foi feita a 37^QC, com 5% de C02 por 48 horas e, após esse período, o sobrenadante foi coletado para a dosagem das citocinas. As citocinas IFN-γ, IL-12, GM-CSF, IL-4 e IL-10 foram quantificadas por ELISA de captura nos sobrenadantes das culturas dos esplenócitos, utilizando-se kits comerciais obtidos junto à Pharmingen (USA).

EXEMPLO 3- Avaliação da resposta celular induzida pela vacina multiproteica antes da infecção desafio

[0031 ] A imunogenicidade da vacina multiproteica recombinante foi avaliada em camundongos BALB/c imunizados, por meio da dosagem das citocinas IFN-γ, IL-12, GM-CSF, IL-4 e IL-10 produzidas pelos esplenócitos dos animais, 30 dias após a administração da última dose do imunógeno. Após o estímulo in vitro com as proteínas específicas ou com uma mistura de extratos dos dois parasitas (SLA), observou-se a produção de níveis significativamente elevados de IFN-γ, IL-12 e GM-CSF no grupo dos animais vacinados, em relação aos níveis produzidos pelos esplenócitos dos grupos controle, constituídos por animais que receberam saponina ou salina (Tabela 1 ). O grupo imunizado com a vacina multiproteica produziu maiores níveis de IFN-γ, IL-12 e GM-CSF em relação aos níveis dessas citocinas obtidos nos grupos imunizados com as proteínas rLiHyp ou rEiFõa mais saponina. Nenhum aumento foi observado na produção de IL-4 e IL- 10 em qualquer um dos grupos avaliados. [0032] Tabela 1- Níveis de produção das citocinas IFN-γ, IL-12 e GM-CSF (em pg/mL). As citocinas foram quantificadas em sobrenadantes de cultura de esplenócitos dos animais, que foram coletados 30 dias após a administração da última dose do imunógeno, e estimulados com as proteínas usadas nas imunizações ou com uma mistura de extratos dos dois parasitas (SLA). A média ± desvio padrão dos grupos é mostrada.

EXEMPLO 4 - Avaliação da eficácia de proteção da vacina multiproteica recombinante contra a infecção com L. infantum ou L. amazonensis

[0033] A carga parasitária nos diversos grupos foi avaliada na pata infectada {L. amazonensis), no fígado, baço, linfonodo drenante e medula óssea dos animais infectados com L. infantum (Tabela 2) ou L. amazonensis (Tabela 3), 10 semanas após a infecção desafio. Na avaliação dos resultados, pode-se observar que, ainda que os animais imunizados com as proteínas individuais mais saponina tenham apresentado redução da carga parasitária em relação aos grupos salina e saponina, os animais imunizados com a vacina multiproteica recombinante apresentaram reduções mais significativas no parasitismo quando comparado a todos os outros grupos experimentais.

[0034] Tabela 2. Resultados da carga parasitária dos animais imunizados e desafiados com L. infantum. A carga parasitária foi determinada por uma técnica de diluição limitante, 10 semanas após a infecção desafio. A média ± desvio padrão dos grupos é mostrada.

Carga parasitária (em log)

Baço Fígado Linfonodos Medula óssea

Salina 6,4±0,4 5,5±0,6 7,1 ±0,6 4,0±0,2 Saponina 6,0±0,7 5,1 ±0,5 6,6±0,3 3,7±0,4 rLiHyp/saponina 3,3±0,2 2,9±0,4 3,4±0,6 2,0±0,3 rEiFõa/saponina 2,7±0,4 2,5±0,3 2,5±0,5 1 ,5±0,4 Vacina 1 ,0±0,2 1 ,1 ±0,3 0,5±0,1

1 ,4±0,3

muliproteica

[0035] Tabela 3. Resultados da carga parasitária dos animais imunizados e desafiados com L. amazonensis. A carga parasitária foi determinada por uma técnica de diluição limitante, 10 semanas após a infecção desafio. A média ± desvio padrão dos grupos é mostrada.

Pata Baço Fígado Linfonodos Medula infectada óssea

Salina 9,0±0,6 7,1 ±0,5 5,2±0,4 7,8±0,5 3,5±0,5

Saponina 8,5±0,2 6,6±0,4 4,7±0,3 7,4±0,3 3,2±0,4 rLiHyp/saponina 4,1 ±0,4 3,0±0,3 3,1 ±0,4 3,6±0,6 2,5±0,4 rEiFõa/saponina 2,5±0,2 2,3±0,4 2,2±0,2 2,4±0,3 1 ,4±0,2

Vacina 1 ,2±0,2 0,9±0,2 1 ,1 ±0,4 0,4±0,2

1 ,0±0,3

muliproteica

EXEMPLO 5 - Avaliação da resposta imune celular após a infecção desafio

[0036] A avaliação da resposta imune celular após a infecção desafio foi também realizada. As culturas de esplenocitos dos animais imunizados e infectados foram estimuladas com as proteínas específicas usadas nas imunizações ou com uma mistura de extratos dos dois parasitas (SLA) e se procedeu à dosagem das citocinas IFN-γ, IL-12, GM-CSF, IL-4 e IL-10. Nos resultados, observou-se a produção de níveis significativamente elevados de IFN-γ, IL-12 e GM-CSF no grupo dos animais vacinados, quando comparada aos níveis produzidos dessas citocinas nos esplenocitos dos grupos controle (Tabela 4). Como observado antes da infecção, o grupo imunizado com a vacina multiproteica produziu maiores níveis de IFN-γ, IL- 12 e GM-CSF em relação aos níveis dessa citocina obtidos nos grupos imunizados com as proteínas rLiHypl ou rEiFõa mais saponina. Entretanto, os animais dos grupos controles (salina e saponina) produziram níveis significativamente maiores de IL-4 e IL-10 em relação aos demais grupos avaliados (Tabela 5).

[0037] Tabela 4- Níveis de produção das citocinas IFN-γ, IL-12 e GM-CSF (em pg/mL). As citocinas foram quantificadas em sobrenadantes de cultura de esplenocitos dos animais, que foram coletados 30 dias após a administração da última dose do imunógeno, e estimulados com as proteínas usadas nas imunizações ou com uma mistura de extratos dos dois parasitas (SLA). A média ± desvio padrão dos grupos é mostrada.

Citocinas (em pg/mL)

Estímulo IFN-gama IL-12 GM-CSF

Meio 56±4 5512 5014

Salina Mix proteínas 66±4 6713 5814

SLA 72±6 7015 6414

Meio 69±3 5616 6315

Saponina Mix proteínas 77±5 6718 7715

SLA 88±9 7815 8013

Meio 60±3 6617 7013 rLiHyp/saponina rLiHyp 1 .5541144 466142 343153

SLA 788155 343137 254133 Meio 5715 6617 6018 rEiFõa/saponina rEiFõa 1 .776166 655157 488142

SLA 1 .109135 477136 354133

Meio 6617 5714 6415

Vac. Mix proteínas 3.21 11135 1 .012190 655150 Multiproteica 677160 488140

SLA

1 .6561120

[0038] Tabela 5- l\ íveis de produção das citocinas IL-4 e IL- 1 0 (em pg/mL).

As citocinas foram quantificadas em sobrenadantes de cultura de esplenócitos dos animais, que foram coletados 30 dias após a administração da última dose do imunógeno, e estimulados com as proteínas usadas nas imunizações ou com uma mistura de extratos dos dois parasitas (SLA). A média ± desvio padrão dos grupos é mostrada.

Citocinas (em pg/mL)

Estímulo IL-4 11-10

Meio 6614 7615

Salina Mix proteínas 90110 8717

SLA 565178 522155

Meio 5716 6615

Saponina Mix proteínas 6016 7716

SLA 334140 404136

Meio 6514 5516 rLiHyp/saponina rLiHyp 8017 7718

SLA 8819 8916

Meio 6014 6512 rEiF5a/saponina rEiF5a 7014 8416

SLA 8917 8014

Meio 6613 5815

Vac. multiproteica Mix proteínas 7614 6816

SLA 8418 7713

Claims

REIVINDICAÇÕES

1- COMPOSIÇÃO VACINAL contra as leishmanioses tegumentar e visceral, caracterizada por compreender duas proteínas, definidas pelas SEQ ID N° 1 e 2, e adjuvantes farmacêutica e farmacologicamente aceitáveis.

2- COMPOSIÇÃO VACINAL contra as leishmanioses tegumentar e visceral, de acordo com a reivindicação 1 , caracterizada por apresentar uma combinação equimolar das duas proteínas.

3- COMPOSIÇÃO VACINAL contra as leishmanioses tegumentar e visceral, de acordo com a reivindicação 1 , caracterizada pelos adjuvantes serem, preferencialmente, compostos capazes de induzir ao desenvolvimento de uma resposta imunológica do tipo Th1 , primada pela produção das citocinas IFN-γ e IL-12, como as saponinas.

4- COMPOSIÇÃO VACINAL contra leishmaniose tegumentar e visceral, de acordo com a reivindicação 1 , caracterizada por ser administrada pelas vias intradérmica, oral, nasal, intramuscular, intravenosa, subcutânea e/ou como dispositivo que possa ser implantado e/ou injetado.

5- USO da composição vacinai definida na reivindicação 1 , caracterizado por ser para o tratamento e/ou prevenção das leishmanioses tegumentar e visceral em cães e humanos.