WO2017161427A1 - Processo de produção e purificação de hormônios glicoproteicos recombinantes híbridos ou não-híbridos, hormônios glicoproteicos recombinantes híbridos ou náo-híbridos, vetores de expressão, e usos dos hormônios glicoproteicos recombinantes - Google Patents

Processo de produção e purificação de hormônios glicoproteicos recombinantes híbridos ou não-híbridos, hormônios glicoproteicos recombinantes híbridos ou náo-híbridos, vetores de expressão, e usos dos hormônios glicoproteicos recombinantes Download PDF

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WO2017161427A1 PCT/BR2016/000051 BR2016000051W WO2017161427A1 WO 2017161427 A1 WO2017161427 A1 WO 2017161427A1 BR 2016000051 W BR2016000051 W BR 2016000051W WO 2017161427 A1 WO2017161427 A1 WO 2017161427A1
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recombinant
hybrid
hormones
ecg
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PCT/BR2016/000051
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Marcelo Dias Baruffi
Camillo del Cistia ANDRADE
Rubens Eduardo da SILVA
Robinson Antonio Martins de OLIVEIRA
Daniel Roberto CALLEJON
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Universidade De São Paulo - Usp
Lcr Kimera Biotecnologia Ltda - Me
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Definitions

  • HYBRID OR NON-HYBRID RECOMBINANT GLYCOPROTEICS HYBRID OR NON-HYBRID RECOMBINANT GLYCOPROTEIC HORMONES, EXPRESSION VECTORS, AND USES
  • the present invention belongs to the field of peptide hormone production processes; specifically, in the field of peptide hormone production processes containing more than 20 amino acids; and describes a process of producing and purifying hybrid or non-hybrid recombinant glycoprotein hormones, hybrid or non-hybrid recombinant glycoprotein hormones, including their expression vectors, and uses thereof.
  • glycoprotein produced in the pregnant mares trophoblast consisting of 2 subunits (ae ⁇ ), with action similar to follicle stimulating hormone (FSH) and luteinizing hormone (LH), both from the pituitary and with an important action on follicular growth induction events. and fight, respectively (Murphy, 2012).
  • FSH follicle stimulating hormone
  • LH luteinizing hormone
  • This bifunctional hormonal activity occurs after eCG administration in mammalian species other than horses, such as cattle, pigs, sheep and goats (Murphy, 2012).
  • the eCG alpha chain N-glycosylation sites are critical for the manifestation of its LH activity (Min et al. 1996; Min et al., 2004; Bousfield et al., 2004; Murphy, 2012).
  • the loop region of the protein structure of eCG and a sequence of amino acid residues (104-109) of the C-terminal region of the beta chain of this hormone are associated with eCG bifunctional action (LH and FSH activity) and its function. FSH, respectively (Moyle et al. 1994; Galei et al. 2009).
  • ECG is used in different protocols of assisted animal reproduction.
  • the use of eCG in other mammals may induce the production of anti-eCG antibodies and these may decrease the biological actions of this hormone in these animals (Hervé et al. 2004, Forcada et al. 201 1).
  • the alpha chain of the eCG molecule is the major antigenic portion of this hormone (Chopineau et al., 1993).
  • the eCG gene is present on chromosome 10 in the species Equus caballus, and its expression generates the subunits, (i) gonadotropin alpha 1 subunit (c r 0: 39937900-39940069; Gene lD: 100034174), its
  • MRNA methylcholine
  • ORF open reading frame
  • choriogonadotropin subunit beta chr10: 18963366-18964444; Gene ID : 100054774
  • your transcript spies out from 3 exons generating an approximately 520 kb mRNA and its 510-nucleotide open reading frame (ORF) translates into a mature 169 amino acid protein of approximately 17.8 kDa (http://qenome.ucsc.edu, http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
  • the CGA gene of Bos taurus species is present on chromosome 9 at position chr9: 63692501-63694585, and its expression generates the subunit, gonadotropin alpha 1 subunit (Gene ID: 280749), its transcription is spliced 4 exons generating a mRNA of
  • the CGA gene Sus scrofa species is present on chromosome 10 at position chr10: 62246069-62248001, and its expression generates the subunit, gonadotropin alpha 1 subunit (Gene ID: 406869), its transcription spliced 3 exons generating a mRNA of
  • the CGA gene of the species Ovis aries is present on chromosome 8 at position chr8: 49919904-49921988, and its expression generates the subunit, gonadotropin alpha 1 subunit (Gene ID: 443538), its transcription is spliced 4 exons generating a mRNA of
  • the CGA gene of Capra hircus species is present in the
  • chromosome 8 at position Chr8: 499 9901 -49921988, and its expression generates the subunit, gonadotropin alpha 1 subunit (Gene ID: 100860817), its transcription is spliced from 3 exons generating a mRNA of approximately 366 bp (provisional to date) and open reading frame (ORF) of 363 nucleotides translated into a mature protein of 120 amino acids and approximately 13.5 kDa
  • EP0974599 describes a recombinant equine chorionic gonadotropin hormone in which the ⁇ and ⁇ chains of equine chorionic gonadotropin are linked. This patent also claims veterinary uses of this recombinant molecule.
  • the document PI 0108556-5 describes a process of
  • rhCG human Chorionic Gonadotropin
  • PI 9814880-0 and PI 9914670-3 deal with recombinant single chain glycoprotein hormones, the process of their production without the use of affinity chromatography purification system, fluorescent label and a characteristic cell secretion polypeptide.
  • US5260421 discloses a method of promoting site-directed mutagenesis in glycoproteins generally aimed at the production of hormones such as luteinizing hormone, follicle stimulating hormone, thyroid stimulating hormone, and chorionic gonadotropin.
  • US6469139 describes a human chorionic gonadotropin modified at specific amino acid sequence sites, and its medical use as an immunological contraceptive.
  • W09532216 discloses a method of producing biologically active glycoprotein hormones in prokaryotic cells, which employs a redox thiol buffer to form subunits
  • JPH1036398 and JPH1036399 deal with production processes of recombinant equine chorionic gonadotropin, in which the ⁇ and ⁇ subunits are not fused to a single chain. The difference between them is due to the fact that the first claims the use of r-eCG in AI or superovulation procedures in cattle, while the second claims the activity of stimulating FSH production.
  • WO2014183175 discloses methods for the production and purification of follicle stimulating hormone (FSH) using a platform of parent or mutant HEK 293 cells.
  • FSH follicle stimulating hormone
  • the present invention aims to propose a process of production and purification of hybrid or non-hybrid recombinant glycoprotein hormones.
  • r-eCG recombinant glycoproteins of equine origin
  • ⁇ chain equine origin
  • target mammalian a chain
  • the present invention further proposes the use of hybrid and non-hybrid recombinant glycoprotein hormones obtained from the use of their expression vectors and their pharmaceutical compositions in assisted animal reproduction of target species of commercial or commercial interest.
  • mammals in general such as cattle, sheep, goats, pigs, horses, mules, buffaloes, bison, antelopes, domestic and wild canine and feline species, cetaceans, ursids and primates.
  • FIG. 1 shows the electrophoretic analysis with the SEQ gene fragment amplification procedure. ID 16;
  • FIG. 2 shows the electrophoretic analysis of cleavage products of recurrent clones (SEQ. ID. 16) from SEQ. ID 38;
  • FIG. 3 shows the electrophoretic analysis of recombinant clone cleavage products (SEQ. ID. 16) from SEQ. ID 39;
  • FIG. 4 shows analysis of GFP molecule expression in CHO-K1 cells transfected with SEQ. ID 39, by fluorescence microscopy, where (A) and (C) illustrate the Differential Interference Contrasf (DIC) images and show a similar cell growth pattern between the two cell populations, while (B) and (D) illustrate the related fluorescence. the presence of GFP protein;
  • A and (C) illustrate the Differential Interference Contrasf (DIC) images and show a similar cell growth pattern between the two cell populations, while (B) and (D) illustrate the related fluorescence. the presence of GFP protein;
  • DIC Differential Interference Contrasf
  • FIG. 5 shows the electrophoretic analysis of cell culture supernatant containing SEQ. ID 17 (recombinant r-eCG not fused to GFP molecule); where you can look in MM - Marker
  • FIG. 6 shows the electrophoretic analysis of purified SEQ preparation. ID 19. 12% SDS-PAGE where it can be observed in MM - Molecular Marker; C- Culture Medium (DMEM containing 0% fetal bovine serum); S + - Cell culture supernatant; FT - Flow
  • FIG. 7 shows purified preparations of SEQ. ID 9 inducing release of estradiol and progesterone in rat serum
  • FIG. 8 shows in vivo activity analysis of SEQ. ID 17 corresponding to GFP non-fused recombinant eCG purified from the culture supernatant of HEK 293 cells cultured in the absence of fetal bovine serum using the Freestyle Serum Free culture medium;
  • FIG. 9 shows the comparative functional analysis between recombinant control molecule forms (SEQ. ID: 49), native eCG and SEQ. ID 19, where (A) represents images of rat ovaries
  • FIG. 1 1 shows the graphic representation of vectors for SEQ. ID 38 and SEQ. ID 39, which represent all vectors described in this invention.
  • FIG. 12 shows the organization chart of the steps of the production and purification process of recombinant glycoprotein hormones of this invention.
  • the present invention relates to a process for producing and purifying recombinant glycoprotein hormones comprising the steps of:
  • Recombinant glycoprotein hormone (r-eCG), whether or not fused to the GFP molecule, and its hybrid forms of the present invention are selected from the group consisting of recombinant equine chorionic gonadotropin (r-eCG), recombinant bovine chorionic gonadotropin (r-bCG) , Recombinant porcine chorionic gonadotropin (r-sCG), Recombinant ovine chorionic gonadotropin (r-oCG), Recombinant caprine chorionic gonadotropin (r-cCG), Recombinant thyroid hormone (r-LRH) Recombinant stimulating follicle hormone (r-FSH).
  • r-eCG equine chorionic gonadotropin
  • r-bCG bovine chorionic gonadotropin
  • r-sCG Recombinant porcine chorionic gonadotropin
  • r-oCG Recombinant ovine chorionic gonadotrop
  • the eCG glycoprotein hormone, whether or not fused to the GFP molecule, and its hybrid forms obtained represent, respectively, the recombinant equine chorionic gonadotropin (r-eCG) nucleotide and glycoprotein and their hybrid forms.
  • r-eCG equine chorionic gonadotropin
  • the PCR amplification step of the r-eCG (SEQ.ID. 16) or r-eCG-GFP (SEQ.ID. 18) gene fragments by PCR comprises the use of primer oligonucleotides of SEQ. ID 1, SEQ. ID 2 and SEQ. ID 3 complement the different forms of native chorionic gonadotropin to obtain a fusion gene fragment fusion between the native eCG beta subunit DNA sequence (SEQ. ID. 6) and the native eCG alpha subunit DNA sequence (SEQ ID 04), wherein SEQ. ID 6 and 4 correspond to eCG ⁇ and ⁇ subunits and additional sequences, which correspond to their total in SEQ, ID. 16 or in SEQ. ID.18 validated by agarose gel electrophoresis.
  • T ⁇ V-Tag Tobacco Etch Virus
  • Amplification occurs by PCR, obtaining the SEQ polynucleotide. ID 16, which is then purified on chelating resin (Sambrook et al, 1989).
  • Construction of vectors for the expression of recombinant glycoprotein hormones in eukaryotic cells begins by cloning SEQ. ID 16 or SEQ. ! D. 18 in prokaryotic cells (E coli DH5a). This cloning step begins with the insertion of SEQ sequences. ID 16 or SEQ. ID 18 into a commercial cloning vector that is used to transform heat shock competent DH5a cells. Finally, selection of recombinant bacterial clones containing the recombinant cloning vector with SEQ sequences is performed. ID 16 or SEQ. ID 18, whose presence is validated by agarose gel electrophoresis and
  • Expression vectors obtained after the cloning step of hybrid and non-hybrid hormones are then used to transiently transformant eukaryotic cells with the aid of liposomes.
  • recombinant hormone gene sequences used in the composition of expression vectors for unstable transformation of eukaryotic cells may be used in the construction of expression vectors for stable transformation of these cells using SEQ sequences. ID 16 or SEQ. ID 18, via lentiviral vectors or biologically safe systems of non-random gene integration and without the need for selective agents (antibiotics and other
  • TALENs Transcription Activator-Like Effector Nucleases
  • CRISPR Palindromic Repeats
  • Purification occurs by collecting supernatant from the mammalian cell culture medium transfected with SEQ sequences. ID 16 or SEQ. ID 18 and secretory sequences of SEQ. ID 17 or SEQ. ID 19, transiently or stablely followed by centrifugation between 1200 and 1800 g for 7 to 15 minutes at 4 ° C for removal of suspended cells and further purification of SEQ. ID 17 or SEQ. ID 19 by affinity chromatography on nickel resins and after elution, an approximate yield of 15 to 17 mg of purified normone is obtained for each liter of culture.
  • the final step for obtaining recombinant glycoprotein hormones is performed by concentrator dialysis and / or by tangential centrifugation (cut off 10 to 60 kDa), where the buffer used in the hormone production and purification steps is changed.
  • the invention also relates to a recombinant glycoprotein hormone comprising the ⁇ and ⁇ subunits fused to a single chain and chain modifying agents at the amino and carboxy terminal moieties, such as a fluorescein fusion site, such as GFP ; a purification marker such as the poly-His tail; molecule secretion signaling peptide; dimerization interface peptide and a specific proteolytic site, such as the proteolytic cleavage with the TEV (Tobacco etch virus) proteolytic enzyme, and optionally a fluorescent marker.
  • a fluorescein fusion site such as GFP
  • a purification marker such as the poly-His tail
  • molecule secretion signaling peptide dimerization interface peptide
  • a specific proteolytic site such as the proteolytic cleavage with the TEV (Tobacco etch virus) proteolytic enzyme
  • TEV tobacco etch virus
  • this production process is used for the production of SEQ. ID 17 and SEQ. ID 19, referring to recombinant equine chorionic gonadotropin which, in in vivo tests showed a bioactivity of approximately 10,000 IU / mg and close to the bioactivity of native eCG preparations.
  • the elaborate gene fragment referring to SEQ. ID 16 was commercially synthesized and PCR amplified (FIG. 1) using oligonucleotides (SEQ. ID. 1, SEQ: ID. 2 and SEQ. ID. 3).
  • the electrophoretic run of the amplification procedure was done on an agarose gel (1%) and using a 1 Kb molecular size marker.
  • the samples tested were: negative PCR reaction control (lane B); amplified gene fragment (SEQ. ID. 16) of approximately 847bp (lanes 1, 2 and 3).
  • SEQ. ID 16 was cleaved into a plasmid vector (CloneJet - Thermo) and used to transform heat shock competent E. coli DH6a cells, and after confirmation of selection of recombinant clones, confirmation of the SEQ; sequence was performed. ID 16, by chemical nucleotide sequencing method.
  • Recombinants were cleaved with the enzymes Xho1 and EcoRI for removal of the SEQ fragment. ID 16, and cloned for the generation of SEQ. ID 38 and SEQ. ID 39. Selection of recombinant clones was done by cleavage of SEQ. ID 38 and SEQ. ID 39. Clone cleavage products were electrophoresed on an agarose gel (1%) using a 1 Kb molecular marker. As noted in FIG. 2, the clone after cleavage with Xho ⁇ and EcoRI is in lane 1, where the SEQ band is observed. ID 16. In FIG. 3, the samples tested were: negative control of PCR reaction (lane B); where clones after cleavage of SEQ. ID 39 are on lanes 1 and 2), where it is
  • Transfected cells were selected within 3 weeks, with variations in geneticin concentration (G418) to eliminate untransfected clones. The cells were then analyzed using a fluorescence microscope for SEQ expression. ID 19 is from SEQ. ID 49. The analysis was made by observing the change in fluorescence of cells and culture medium, since SEQ. ID 19 is exported to medium because of its signal peptide present between amino acids 1-20 (SEQ. ID. 21). Control cells showed the presence of fluorescence only within the cells due to SEQ expression. ID 49 (FIG. 4).
  • Cells transfected with SEQ. ID 39 express and export to SEQ. ID 19 for the culture medium (FIG. 4 (B)). the cells
  • SEQ. ID, 48 express GFP protein (SEQ. ID. 49) within cells ⁇ FIG. 4 (D)).
  • the selected HEK 293 cells were transferred to Spinner with 100 ml Freestyle culture medium (Thermo) containing 400 mg / ml geneticin for propagation, increased number of cells in larger culture volume and consequently the concentration of recombinant protein expressed during 96 hours
  • Selected CHO-K1 cells were transferred to 75 cm 2 culture bottles containing DEMEN (Sigma) containing 10% fetal bovine serum and 4Q0mg / ml geneticin for propagation, increased number of cells in larger culture volume and consequently concentration of recombinant protein 1 expressed during 8 days of propagation with supernatant collections (culture medium) every 48 hours.
  • the culture media was centrifuged (1500xg / 10 minJ4 ° C) for removal of suspended cells, concentration and dialysis in appropriate concentrators and further purification of SEQ. . ID 17 and SEQ.
  • FIG. 7 illustrates the induction of road production! (17p-Estradioi)
  • SEQ capacity assessment. ID 17 and SEQ. ID 19 to promote, in vivo, activity related to the hormonal function of Chorionic gonadotropin was analyzed by measuring the ovarian mass of rats treated with SEQ. ! D. 17 [r-eCG without GFP (10 pg)] and SEQ. ID 19 [r-eCG with GFP (20 Mg)].
  • the effects of SEQ. JD. 17 in the ovarian growth induction were then evaluated by measuring the ovarian mass of rats (Wistar) 21 days old after injection.
  • FIG. 9 illustrates the comparative functional analysis (ovarian mass induction) between the recombinant forms of the Green Fluorescent Protein molecule (GFP, SEQ. ID. 49), the native form of eCG (SEQ. ID. 5 and SEQ. ID. 7 ) and SEQ. ID 19.
  • GFP Green Fluorescent Protein molecule
  • SEQ. ID. 49 the Green Fluorescent Protein molecule
  • SEQ. ID. 5 and SEQ. ID. 7 the native form of eCG
  • SEQ. ID. 19 SEQ. ID 19.
  • Each experimental group contained 04 animals (total of 8 ovaries per group) and only 02 ovaries from each experimental group, taken at random, are represented. The scale associated with the images is scaled in centimeters.
  • Results are expressed as ovarian mass in grams (g) and indicate that recombinant forms of eCG (SEQ. ID. 17 and SEQ. ID. 19) exhibit in vivo bioactivity similar to native eCG (SEQ. ID. 5 and SEQ. ID 7).
  • SEQ. ID. 17 and 19 show gene similarity above 97% and structural similarities with hybrid forms, which may be indicated for use in several mammalian species.
  • SEQ. ID 7 The hormonal activity of SEQ. ID 7 was evaluated in estrus synchronization protocols (IATF) in large mammals (Bovines) by Ultrasound (GE-Logiq and Transducer Transducer rnod I-739, 8-12 Mhz), in estrus-induced females by hormonal protocols performed by the administration of eCG 300 Ul and SEQ. ID 17 30 pg.
  • the TAI protocol consisted of the introduction of the vaginal progesterone release device (day 1), administration of eCG 300 Ul and SEQ doses. ID 17 30 pg and uterine evaluation by ultrasound (day 8). Insemination was performed after ultrasound analysis and follicular wave observation, where at least one follicle showed growth (1.4 mm / day) for each animal in both groups (day 0).
  • FIG. 10 shows a comparison of the pregnancy rate that was performed 30 days after trans-rectal ultrasound insemination in animals belonging to the IATF protocol-inseminated groups using eCG and SEQ. ID.17. The results showed a pregnancy rate of 50.23% for eCG and 48% for SEQ. ID.17, where the national average IATF pregnancy rate is 42%.
  • the analyzes showed cyst formation in 5.5% and twin formation in 1.59% in the eCG group, where the SEQ group. ID.17 did not present cyst and twin formation.
  • compositions are used for animal assisted reproduction comprising an effective amount of recombinant glycoprotein hormones.
  • Such compositions will be used in ovulation induction; superovulation induction; follicular growth; estrus induction; anestrus reversal; puberty induction in animals of commercial or non-commercial interest, mammals in general such as cattle, sheep, goats, pigs, horses, mules, buffaloes, bison, antelopes, domestic and wild canine and feline species, cetaceans, ursids and primates .
  • ovulation induction kits for use in IATF (Fixed Time Artificial Insemination) FIV (In vitro Fertilization), TETF (Fixed Time Embryo Transfer) protocols in animals of commercial or non-commercial interest.
  • chorionic gonadotropins can be immunogenic (induce antibody production) and antigenic (be recognized by antibodies) (Hervé et al. 2004, Forcada et al. 201 1; Chopineau et al., 1993) it is possible to propose that hormones recombinant glycoproteins in question may be used to obtain native (monoclonal and / or polyclonal) or recombinant (Phage Display) antibodies and that both these antibodies and recombinant glycoprotein hormones, and their derivatives (enzyme-conjugated, radiolabeling and / or fluorochromes), can compose detection kits of these two categories of molecules (hormones and anti-hormones) in biological samples or not.
  • Gaiet C Gaiet C, Guillou F, Foulon-Gauze F, Combarnous Y, Chopineau M.
  • the betai 04-109 sequence is essential for the secretion of cprrectly folded single-chain alpha horse LH / CG and for its FSH activity. J Endocrinol, 203 (1): 167-174, 2009.
  • eCG Antiequine chorionicgonadotropin

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Abstract

A presente invenção refere-se a um processo de produção de hormônios glicoproteicos recombinantes híbridos ou não-híbridos, por exemplo, a gonadotrofina coriônica equina recombinante (r-eCG), a gonadotrofína coriônica recombinante híbrida, o hormônio tireoestimulante recombinante (r-TSH), o hormônio luteinizante recombinante (r-LH), o hormônio luteinizante, e o hormônio folículo estimulante recombinante (r-FSH). Adicionalmente, a presente invenção refere-se aos hormônios glicoproteicos recombinantes compreendendo as subunidades α e β equinas e outros, as subunidades α de mamíferos ê β equina, onde as duas subunidades serão fusionadas em uma cadeia simples, e agentes modificadores de cadeia que apresenta maior facilidade de purificação, homogeneidade, facilidade de escalonamento industrial e sem o uso de animais, quando comparado ao hormônio glicõproteico selvagem. Além disso, a presente invenção refere-se ao uso de tais hormônios na reprodução animal assistida, indução da ovulação; indução de superovulação; crescimento folicular; indução de cio; reversão de anestro; indução de puberdade em animais de interesse comercial ou não.

Description

PROCESSO DE PRODUÇÃO E PURIFICAÇÃO DE HORMÔNIOS
GLICOPROTEICOS RECOMBINANTES HÍBRIDOS OU NÃO- HÍBRIDOS, HORMÔNIOS GLICOPROTEICOS RECOMBINANTES HÍBRIDOS OU NÂO-HÍBRIDOS, VETORES DE EXPRESSÃO, E USOS
DOS HORMÔNIOS GLICOPROTEICOS RECOMBINANTES CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção pertence ao campo dós processos de produção de hormônios peptídicos; especificamente, ao campo dos processos de produção de hormônios peptídeos contendo mais de 20 aminoácidos; e descreve um processo de produção e purificação de hormônios glicoproíeicos recombinantes híbridos ou não-híbridos, hormônios glicoproteicos recombinantes híbridos ou não-híbridos, incluindo seus vetores de expressão, e usos dos mesmos.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
Nos últimos anos inúmeros processos biotecnológicos de produção e purificação de hormônios de natureza proteica e glicoproteica foram desenvolvidos. Todos os processos até então desenvolvidos possuem estratégias próprias que variam de acordo com o hormônio a ser produzido e que visam o aumento da produção do hormônio, ou visam facilitar a etapa de purificação.
Na produção de glicoproteínas recombinantes, o estado da técnica emprega células de mamíferos devido a sua capacidade de promover um correto dobramento e processamento pós-traducional. Diversos fatores estão envolvidos na otimização da expressão proteica em células de mamíferos. Um desses fatores são os vetores de expressão para geração de linhagens celulares recombinantes que utilizam promotores fortes de origem virai ou celular, cómò por exemplo, o promotor de citomegalovírus (CMV) (Gopalkrishnan ei a/;, 1999). Atuaímeníe a maioria dos processos de alta produção de proteínas para a indústria Biofarmacêutica (cerca de 60-70%) é baseada em células cultivadas em suspensão (Moritz, et al, 2015). A Gonadotrofina Coriônica Equina (eCG) é um hormônio
glicoproteico produzido no trofoblasto de éguas prenhas, constituído por 2 subunidades (a e β), com ação similar ao hormônio folículo estimulante (FSH) e ao hormônio luteinizante (LH), ambos oriundos da hipófise e com ação importante nos eventos de indução de crescimento folicular e lute nização, respectivamente (Murphy, 2012). Esta atividade hormonal bi- funcional ocorre após á administração da eCG em espécies de mamíferos distintas dos equinos, como por exemplo em bovinos, suínos, ovinos e caprinos (Murphy, 2012). Os sítios de N-glicosilação da cadeia alfa da eCG é fundamental para a manifestação da sua atividade LH (Min et al. 1996; Min et al., 2004; Bousfield et al., 2004; Murphy, 2012). A região de loops da estrutura proteica da eCG e uma sequência de resíduos de aminoácidos (104-109) da região C-terminal da cadeia beta deste hormônio estão associadas à ação bi-funcional da eCG (atividade LH e FSH) e à sua função FSH, respectivamente (Moyle et al. 1994; Galei et al. 2009).
A eCG é utilizada em diferentes protocolos de da reprodução animal assistida. O uso da eCG em outros mamíferos pode induzir a produção de anticorpos anti-eCG e estes podem diminuir as ações biológicas deste hormônio nestes animais (Hervé et al. 2004, Forcada et al. 201 1). A cadeia alfa da molécula eCG é a principal porção antigênica deste hormônio (Chopineau et ai., 1993).
O gene eCG está presente no cromossomo 10 na espécie Equus caballus, e sua expressão gera as subunidades, (i) gonadotropin alpha 1 subunit (c r 0:39937900-39940069; Gene lD: 100034174), sua
transcrição sofre spiicing de 3 exons gerando um RNA mensageiro
(RNAm) de aproximadamente 2 kb e fase aberta de leitura (ORF) de 363 nucleotídeos traduzidos em uma proteína madura de 120 aminoácidos e aproximadamente 13,8 kDa, e a (ii) choriogonadotropin subunit beta (chr10:18963366-18964444; Gene ID: 100054774), sua transcrição sofre spiicing de 3 exons gerando um RNAm de aproximadamente 520 kb e sua fase aberta de leitura (ORF) de 510 nucleotídeos é traduzida uma proteína madura de 169 aminoácidos e aproximadamente 17,8 kDa (http://qenome.ucsc.edu, http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
O gene CGA da espécie Bos taurus, está presente no cromossomo 9 na posição chr9: 63692501-63694585, e sua expressão gera a subunidade, gonadotropin alpha 1 subunit (Gene ID: 280749), sua transcrição sofre splicing de 4 exons gerando um RNAm de
aproximadamente 742 pares de bases (pb) (provisional até a presente data) e fase aberta de leitura (ORF) de 363 nucleotídeos traduzidos em uma proteína madura de 120 aminoácidos e aproximadamente 13,6 kDa (http://genome.ucsc.edu, http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
O gene CGA espécie Sus scrofa, está presente no cromossomo 10 na posição chr10: 62246069-62248001 , e sua expressão gera a subunidade, gonadotropin alpha 1 subunit (Gene ID: 406869), sua transcrição sofre splicing de 3 exons gerando um RNAm de
aproximadamente 363 pb (provisional até a presente data) e fase aberta de leitura (ORF) de 363 nucleotídeos traduzidos em uma proteína madura de 120 aminoácidos e aproximadamente 13,5 kDa
(http://genome.ucsc.edu, http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
O gene CGA da espécie Ovis aries, está presente no cromossomo 8 na posição chr8: 49919904-49921988, e sua expressão gera a subunidade, gonadotropin alpha 1 subunit (Gene ID: 443538), sua transcrição sofre splicing de 4 exons gerando um RNAm de
aproximadamente 716 pb (provisional até a presente data) e fase aberta de leitura (ORF) de 363 nucleotídeos traduzidos em uma proteína madura de 120 aminoácidos e aproximadamente 13,5 kDa
(http://genome.ucsc.edu, http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
O gene CGA da espécie Capra hircus, está presente no
cromossomo 8 na posição Chr8:499 9901 -49921988, e sua expressão gera a subunidade, gonadotropin alpha 1 subunit (Gene ID: 100860817), sua transcrição sofre splicing de 3 exons gerando um RNAm de aproximadamente 366 pb (provisional até a presente data) e fase aberta de leitura (ORF) de 363 nucleotídeos traduzidos em uma proteína madura de 120 aminoácidos e aproximadamente 13,5 kDa
(http://genome.ucsc.edu, http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
ESTADO DA TÉCNICA
Diversos documentos de patente tratam de processos de produção da gonadotrofina coriônica equina e de outros mamíferos. Por exemplo:
O documento EP0974599, descreve um hormônio da gonadotrofina coriônica equina recombinante na qual as cadeias□ e□ da gonadotrofina coriônica equina estão ligadas. Essa patente também reivindica os usos veterinários desta molécula recombinante.
Já o documento PI 0108556-5 descreve um processo de
purificação da Gonadotropina Coriônica humana recombinante (rhCG) produzida em culturas de células CHO, que compreende o uso
combinado de cromatografia de troca iônica e HPLC de fase inversa. Tal documento também reivindica uma composição farmacêutica contendo rhCG para administração subcutânea.
Os documentos PI 9814880-0 e PI 9914670-3 tratam de hormônios glicoproteicos recombinantes de cadeia única, o processo de produção destes sem o uso de sistema de purificação por cromatografia de afinidade, de marcador fluorescente e de um polipeptídeo característico de secreção celular.
O documento US5260421 revela um método de promoção da mutagênese sítio dirigido em glicoproteínas em geral, voltado para a produção de hormônios, como por exemplo, hormônio luteinizante, hormônio do folículo estimulante, hormônio estimulante da tireóide, e a gonadotrofina coriônica. US6469139 descreve uma gonadotrofina coriônica humana modificada em sítios específicos da sequência de aminoácidos, e seu uso médico como contraceptivo imunológico.
O documento W09532216 revela um método de produção de hormônios glicoproteicos biologicamente ativos em células procariontes, que emprega um tampão redox tiol para formar subunidades
estruturalmente ativas do hormônio.
Os documentos JPH1036398 e JPH1036399 tratam de processos de produção da gonadotrofina coriônica equina recombinante, nos quais as subunidades□ e□ não são fusionadas em cadeia única. A diferença entre elas deve-se ao fato que a primeira reivindica o uso da r-eCG em procedimentos de IA ou superovulação em bovinos, enquanto a segunda reivindica a atividade de estimular a produção de FSH.
O documento WO2014183175 revela métodos para a produção e purificação do hormônio folículo estimulante (FSH) que utiliza uma plataforma de células HEK 293 parentais ou mutantes destas.
Assim, não foram encontrados relatos no estado da técnica referentes aos métodos de obtenção e ao uso em protocolos de inseminação artificial e superovulação relativos às formas híbridas de gonadotrofina coriônica compostas pela associação de cadeias alfa não equina e cadeia beta equina.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A presente invenção tem por objetivo propor um processo de produção e purificação de hormônios glicoproteicos recombinantes híbrido ou não-híbrido.
Adicionalmente, a presente invenção propõe hormônios
glicoproteicos recombinantes de origem equina (r-eCG) e outros híbridos contendo porções de origem equina (cadeia β) e de mamíferos alvo (cadeia a), resultando em hormônios glicoproteicos quiméricos e específicos ao tratamento da espécie alvo, visando à obtenção de uma composição hormonal que possua as atividades LH e FSH sem imunotoxicidade para a espécie alvo.
Além disso, a presente invenção propõe ainda o uso de hormônios glicoproteicos recombinantes, híbrido e não-híbrido, obtidos com o uso de seus vetores de expressão e suas composições farmacêuticas, na reprodução animal assistida de espécies alvo de interesse comercial ou 1
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não, mamíferos em geral, tais como, bovinos, ovinos, caprinos, suínos, equinos, muares, bubalinos, bisontes, antílopes, espécies domésticas e selvagens de caninos e felinos, cetáceos, ursídeos e primatas.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
A FIG. 1 mostra a análise eletroforéticá cfo procedimento de amplificação do fragmento gênico referente à SEQ. ID. 16;
A FIG. 2 mostra a análise eletroforéticá de produtos de clivagem de clones recorri binantes (SEQ. ÍD. 16) da SEQ. ID. 38;
A FIG. 3 mostra a análise eletroforéticá de produtos de clivagem de clones recombínantes (SEQ. ID. 16) da SEQ. ID. 39;
A FIG. 4 mostra a análise da expressão da molécula GFP em células CHO-K1 transfectadas com a SEQ. ID. 39, por microscopia de fluorescência, onde (A) e (C) ilustram as imagens DIC (Differential tnterference Contrasf) e mostram um padrão dè crescimento celular semelhante entre as duas populações celulares, enquanto (B) e (D) ilustram a fluorescência relacionada à presença da proteína GFP;
A FIG. 5 mostra a análise eletroforéticá de sobrenadante de cultura celular contendo a SEQ. ID. 17 (r-eCG recombinante não fusionada a molécula GFP); em que é possível observar em MM - Marcador
Molecular; MC - Meio de Cultura (Freestyle Sèrum Free); C - Células HEK 293 após cultivo de 48 horas; SB - Sobrenadante da cultura de células HEK 293 após cultivo de 48 horas, onde é possível observar a banda referente à SEQ. ID. 17;
A FIG. 6 mostra a análise eletroforéticá de preparação purificada de SEQ. ID. 19. SDS-PAGE 12% onde é possível observar em MM - Marcador Molecular; C- - Meio de Cultura (DMEM contendo 0% de soro fetal bovino); S+ - Sobrenadante do cultivo das células; FT - Flow
Through, proteínas que não se ligaram à coluna His-Trap; E a 5 - Frações eluídas da coluna, onde é possível obervar a banda referente à r a SEQ. ID. 19;
A FIG. 7 mostra preparações purificadas de SEQ. ID. 9 induzindo a liberação de estradiol e progesterona no soro de ratas;
A FIG. 8 mostra a análise da atividade in vivo de SEQ. ID. 17 correspondente a eCG recombinante não fusionada a GFP e purificada do sobrenadanté de cultura de células HEK 293 cultivadas na ausência de soro fetal bovino com o uso do meio de cultura Freestyle Serum Free;
A FIG. 9 mostra a análise comparativa funcional entre as formas recombinantes da molécula controle (SEQ. ID: 49), do eCG nativo e da SEQ. ID. 19, onde (A) representa imagens dos ovários de ratas
impúberes tratadas por via intramuscular com PBS (controle negativo), SEQ. ID. 49, eCG nativo e SEQ. ID. 19;
A FIG. 10 mostra a análise comparativa da taxa de prenhez em fêmeas, para a avaliação da atividade de SEQ. ID. 17 em animais de grande porte (Bovinos). Representação gráfica da porcentagem de taxa de prenhez de fêmeas induzidas ao cio através de protocolos hormonais realizados pela administração de eCG 300 Ul e de SEQ. ID. 17 30 pg. A Análise foi realizada por ultrassonografia após 30 dias da inseminação de fêmeas Bos taurus indicus, com grupos homogéneos quanto a categoria animal (raça, idade, paridas pelo menos 1 vez), com n=127 para o grupo eCG e n-50 para o grupo SEQ. ID. 17,
A FIG. 1 1 mostra a representação gráfica de vetores referentes às SEQ. ID. 38 e SEQ. ID. 39, que representam todos os vetores descritos nesta invenção.
A FIG. 12 mostra o organograma das etapas do procésso de produção e purificação de hormônios glicopróíeicos recombinantes desta invenção.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
A presente invenção se refere a um processo de produção e purificação de hormônios glicoproteicos recombinantes compreendendo as etapas de:
(a) amplificação, modificação e clonagem das moléculas híbridas ou não híbridas; (b) construção dos vetores de expressão de hormônios glicoproteicos recombinantes;
(c) transfecção, expressão e análise das células que expressam os hormônios glicoproteicos recombinantes;
(d) purificação de hormônios glicoproteicos recombinantes por cromatografia de afinidade;
(e) diálise e esterilização dos hormônios glicoproteicos recombinantes.
O hormônio glicoproteico recómbinante (r-eCG), fusionado ou não à molécula GFP, e as suas formas híbridas da presente invenção são seiecionados do grupo consistido em gonadotrofina coriônica equina recómbinante (r-eCG), gonadotrofina coriônica bovina recómbinante (r- bCG), gonadotrofina coriônica suína recómbinante (r-sCG), gonadotrofina coriônica ovina recómbinante (r-oCG), gonadotrofina coriônica caprina recómbinante (r-cCG), hormônio tireoèstimulante recómbinante (r-TSH), hormônio luteinizante recómbinante (r-LH) e, o hormônio folículo estimulante recómbinante (r-FSH). Preferencialmente, o hormônio glicoproteico eCG, fusionado ou não à molécula GFP, e suas formas híbridas obtidas representam, respectivamente o nucleotídeo e a glicoproteína correspondentes à gonadotrofina coriônica equina recómbinante (r-eCG) e as suas formas híbridas.
(a) Amplificação, modificação e clonagem das moléculas híbridas ou não-híbridas
A etapa de amplificação por PCR dos fragmentos gênicos da r-eCG (SEQ.ID. 16) ou da r-eCG-GFP (SEQ.ID. 18), por PCR (Muiíis et aí, 1986) compreende o uso dos oligonucleotídeos iniciadores das SEQ. ID. 1 , SEQ. ID. 2 e SEQ. ID. 3 complementares as diferentes formas de gonadotrofina coriônica nativa para a obtenção de um fragmento gênico referente à fusão entre a sequência de DNA da subunidade beta da eCG nativa (SEQ. ID. 6) e a sequência de DNA da subunidade alfa da eCG nativa (SEQ. ID. 04), em que as SEQ. ID. 6 e 4, correspondem às subunidades α e β da eCG e sequências adicionais, que correspondem ao seu total na SEQ, ID. 16 ou na SEQ. ID.18 validado por eletroforese em gel de agarose.
As SEQ. ID. 1 , SEQ. ID. 2 e SEQ. ID. 3, além de promoverem a amplificação dos genes referentes às subunidades□ e□ da eCG, apresentam sequências de nucleotídeos adicionais associadas a sítios de clivagem para enzimas de restrição e sequências codificadoras para uma cauda de histidina para a tradução de sequência de poii-histidina (6xHis- Tag), e um sítio proteolítico, ta! como o sítio para a protease do Tobacco Etch Vírus (TÈV-Tag), associadas a clonagem das sequências gênicas, purificação dos hormônios recombinantes e edição proteica destes hormônios, respectivamente, gerando assim um fragmento de DNA com 847 pb.
A amplificação ocorre por PCR, sendo obtido o poli-nucleotídeo da SEQ. ID. 16, que é então purificado em resina quelante (Sambrook et ai, 1989).
(b) Construção dos vetores para a expressão de hormônios qlicoproteicos recombinantes em células eucarióticas (CHO-K1 e HEK 293)
A construção dos vetores para a expressão de hormônios glicoproteicos recombinantes em células eucarióticas (CHO-K1 e HEK 293) tem início pela clonagem da SEQ. ID. 16 ou da SEQ. !D. 18 em células procarióticas (E coli DH5a). Esta etapa de clonagem inicia-se com a inserção das sequências SEQ. ID. 16 ou SEQ. ID. 18 em um vetor de clonagem comercial que é utilizado para transformar as células DH5a competentes por choque térmico. Finalmente, executa-se a seleção dos clones recombinantes bacterianos contendo o- vetor de clonagem recombinado com as sequências SEQ. ID. 16 ou SEQ. ID. 18, cujas presenças são validadas por eletroforese em gel de agarose e
sequenciamento químico de DNA. Deve estar claro para um técnico no assunto que diversas técnicas e reagentes podem ser utilizados sem que a diferença entre as técnicas e reagentes possam gerar diferenças significativas no processo final. Na presente invenção, a transformação de células procariontes de E. coli DH5a competentes é feita pela introdução de vetores de clonagem por choque térmico e, a seleção de clones recombinantes é realizada por clivagem para a detecção da SEQ. 1D. 16 e confirmação da sequência por método químico de sequenciamento de nucleotídeos, descrito na literatura (Sanger et al, 1997).
(c) Transfecção. expressão e análise das células produtoras dos hormônios glicoproteicos recombinantes.
Os vetores de expressão obtidos após a etapa de clonagem dos hormônios híbridos e não-híbridos são então usados para transfôctar células eucarióticas de modo transiente com o auxílio de lipossomos. Alternativamente, as sequências gênicas dos hormônios recombinantes utilizadas na composição dos vetores de expressão para transformação instável de células eucariontes poderão ser utilizadas na construção de vetores de expressão para transformação estável destas células com o uso das sequências SEQ. ID. 16 ou SEQ. ID. 18, via vetores lentivirais ou sistemas biologicamente seguros, de integração gênica não aleatória e sem a necessidade de agentes seletivos (antibióticos e outras
substâncias químicas) tais como o Transcription Activator-Like Effector Nucleases (TALENs), o Clustered Regularly Interspaced Short
Palindromic Repeats (CRISPR] e outros sistemas com estas
propriedades, para a geração de linhagens celulares de expressão e suas análises por microscopia de fluorescência para a visualização da expressão da proteína da SEQ. ID. 19 e/ou por outras metodologias (imunodetecção ou sequenciamento gênico) para detecção da expressão da proteína da SEQ. ID. 17 e SEQ. ID.19. Por outro lado, poderão ser utilizados sistemas de integração estável como o uso de vetores lentivirais para estes mesmos fins.
Na análise em microscópio de fluorescência é possível detectar a alteração da fluorescência das células è do meio de cultivo, uma vez que a SEQ. ID. 19 é exportada para meio de cultura, devido ao seu peptídeo de sinalização da SEQ. ID. 21 , presente entre os aminoácidos 1 -20 da SEQ. ID. 19. Nas células controle, transfectadas com a SEQ. ID. 48, a presença da fluorescência é detectável apenas no citoplasma celular.
(d) Purificação de hormônios glicoproteicos
recombinantes
A purificação ocorre pela coleta do sobrenadante do meio de cultura de células de mamíferos transfectadas com as sequências SEQ. ID. 16 ou SEQ. ID. 18 e secretoras das sequências SEQ. ID. 17 ou SEQ. ID. 19, por via transiente ou estável, seguido de centrifugação entre 1200 e 1800 g entre 7 e 1 5 minutos a 4 °C para a remoção de células em suspensão e posterior purificação da SEQ. ID 17 ou SEQ. ID 19 por cromatografia de afinidade em resinas de níquel e após eluição, obtém-se um rendimento aproximado de 15 a 17 mg de normônio purificado para cada litro de cultura.
(e) Diálise e esterilização dos hormônios glicoproteicos recombinantes.
O passo final para a obtenção dos hormônios glicoproteicos recombinantes é realizado por diálise em concentradores e/ou por centrifugação tangencial (cut off 10 a 60 kDa), onde há a troca do tampão utilizado nas etapas de produção e purificação de hormônios
glicoproteicos em PBS pH 7,4, seguido da esterilização da solução contendo os hormônios produzidos com o auxílio de filtros (0,22 pm) próprios para o volume final.
A invenção também se refere a um hormônio glicoproteico recombinante que compreende as subunidades□ e□ fusionadas em uma cadeia simples e agentes modificadores de cadeia nas porções amino e carboxi-terminais, tais como, um sítio de fusão a uma fluoresceína, tal como a GFP; um marcador de purificação, tai çomo a cauda poli-His; peptídeo de sinalização da secreção da molécula; peptídeo de interface de dimerização e um sítio proteolítico específico, tal como o sítio proteolítico de clivagem com a enzima proteo!itica TEV (de Tobacco etch vírus), e opcionalmente um marcador fluorescente. Estas modificações proporcionam à molécula recombinante características não apresentadas pelos hormônios selvagens, como afinidade ao níquel, fusão das cadeias alfa e beta e/ou emissão de fluorescência, as quais favorecem seus processos de obtenção e purificação.
Todas as etapas de clonagem, expressão e purificação descritas nas etapas (a) a (d) referentes à obtenção da r-eCG foram eficientes e eficazes e deverão ser utilizadas também nas etapas de clonagem, expressão e purificação das formas híbridas destes hormônios
recombínantes glicoproteicos.
Preferencialmente, este processo de produção é utilizado para a produção da SEQ. ID. 17 e SEQ. ID. 19, referentes à gonadotrofina coriônica equina recombinante que, em testes in vivo apresentaram uma bioatividade de aproximadamente 10.000 Ul/mg e próximo a bioatividade de preparações de eCG nativo.
Visando uma redução da imunogenicidade da SEQ. ID. 17 e SEQ. ID. 19 para outras espécies, foi prevista nesta invenção a obtenção de formas híbridas destes hormônios glicoproteicos compostos pela cadeia alfa da espécie alvo e pela cadeia beta equina com e/ou sem a fusão com a molécula GFP.
Exemplos referentes a obtenção e análise funcional da r-eCG
Exemplo 1- Construção do vetor de clonagem da SEQ., ID. 16:
O fragmento gênico elaborado e referente à SEQ. ID. 16 foi sintetizado comercialmente e amplificado por PCR (FIG, 1), utilizando-se os oligonucleotídeos (SEQ. ID. 1 , SEQ: ID. 2 ê SÊQ. ID. 3). A corrida eleíroforética do procedimento de amplificação foi feita em gel de agarose (1 %) e com o uso de marcador de tamanho molecular de 1 Kb. As amostras testadas foram: controle negativo da reação de PCR (pista B); fragmento gênico (SEQ. ID. 16) amplificado de aproximadamente 847pb (pistas 1 , 2 e 3). A SEQ. ID. 16, foi clohada em vetor plasmidial (CloneJet - Thermo) e utilizada para transformar células de E. coli DHõa competentes por choque térmico, e, após a seleção de clones recombinantes por clivagem foi realizada a confirmação da sequência SEQ;. ID. 16, através de método químico de sequenciamento de nucleotídeos.
Exemplo 2 - Construção dos vetores de expressão SEQ. ID. 38 e SEQ. ID. 39:
Uma vez confirmada a sequência SEQ.J ID. 16, os clones
recombinantes foram clivados com as enzimas Xho\ e EcoRI, para a remoção do fragmento da SEQ. ID. 16, e clonado para a geração da SEQ. ID. 38 e SEQ. ID. 39. A seleção de clones recombinantes foi feita por clivagem das SEQ. ID. 38 e SEQ. ID. 39. A eletroforese de produtos de clivagem de clones foi feita em gel de agarose (1 %) com o uso de marcador molecular de 1 Kb. Conforme observado na FIG. 2, o clone após clivagem com Xho\ e EcoRI encontra-se ná pista 1 , onde é observada a banda referente à SÉQ. ID. 16. Na FIG. 3, as amostras testadas foram: controle negativo da reação de PCR (pista B); onde os clones após clivagem da SEQ. ID. 39 encontram-se nas pistas 1 e 2), onde é
observada a banda referente à SÉQ. ID. 16. Fòi realizada a confirmação da sequência perfeita da SEQ. ID. 6, por sequenciamento químico de DNA.
Exemplo 3 - Tra sfecção.de células de mamífero:
Para a geração de linhagens celulares de expressão (HEK 293 e CHO-K1 ), foram utilizadas placas de 6 poços de 500 pl (placas de 24 poços) para a transfecção de 800ng da SEQ. ID. 38 e da SEQ. ID. 39, utilizando 2 μΙ de lipofectamina 2000 (Thermo). Como controle, foram transfectadas células nas mesmas condições com SEQ. ID. 48. As células foram cultivadas em meio Freestyle Seru Free (Thermo) ou em meto DMEM (Sigma) contendo 10% de soro fetal bovino e solução 1x de antibiótico/antimicótico durante 24 horas para posterior adição de 400 Mg/ml de geneticina (G4 8, Sigma-Aidrich). Exemplo 4 - Seleção de clones de células de mamíferos
transfectadas:
As células transfectadas foram selecionadas no período de 3 semanas, com variações da concentração de geneticina (G418) para eliminação de clones não transfectados. As células foram então analisadas com o uso de microscópio de fluorescência quanto à expressão da SEQ. ID. 19 é da SEQ. ID. 49. A análise foi feita pela observação da alteração da fluorescência das células e do meio de cultivo, uma vez que a SEQ. ID. 1 9 é exportada para meio, devido ao seu peptídeo de sinalização presente entre os aminoácidos 1 -20 (SEQ. ID. 21 ). As células controle apresentaram a presença da fluorescência apenas no interior das células, devido à expressão da SEQ. ID. 49 (FIG. 4).
As células transfectadas com a SEQ. ID. 39 expressam e exportam a SEQ. ID. 19 para o meio de cultura (FÍG. 4 (B)). As células
transfectadas com SEQ. ID, 48 expressam a proteína GFP (SEQ. ID. 49) no interior das células {FIG. 4 (D)).
Exemplo 5 - Purificação e análise eletroforética da SEQ. ID. 17 e da SEQ. ID. 19:
As células HEK 293 selecionadas foram transferidas para Spinner com 1 00 ml de meio de cultivo Freestyle (Thermo) contendo geneticina 400mg/ml para a propagação, aumento do número de células em maior volume de cultura e consequentemente da concentração de proteína recombinante expressa durante 96 horas.
As células CHO-K1 selecionadas foram transferidas para garrafas de cultura de 75 cm2 contendo DEMEN (Sigma) conténdo 10% de soro fetal bovino e geneticina 4Q0mg/ml para a propagação, aumento do número de células em maior volume de cultura e consequentemente da concentração de proteína1 recombinante expressa durante 8 dias de propagação com coletas do sobrenadante (meio de cultura) a cada 48 horas. Após o cultivo das células HEK 293 e CHO-K1 , procedeu-se a centrifugação (1500xg/10 minJ4°C) dos meios de cultura para a remoção dé células em suspensão, concentração e diálise em concentradores apropriados, e, posterior purificação da SEQ. ÍD. 17 e SEQ. ID. 19 por cromatografia de afinidade em coluna His-Trap em cromatógrafo adequado/Após eluição com gradiente de imidazol (Sigma) (5 a 500 mM), as frações foram analisadas em SDS-PAGE 12%, como observado na F!G. 6. Após a concentração das frações eluídas, quantificação por medida da absorbância em 280 nm e correção pelo Fator de correção (calculado pelo coeficiente de extinção molar), de 1 ,29 para á SEQ. iD. 17 e 1 ,34 para a SEQ. ID. 19, estipulou-se um rendimento aproximado de 15 mg da SEQ. ID. 17 purificada e de 17 mg da SEQ. ID. 19 purificada, para cada litro de cultura.
Exemplo 6 - Verificação da capacidade da SEQ. ID. 19 de induzir a produção de hormônios in vivo:
Os efeitos hormonais da SEQ. ID. 19 fóram avaliados por ensaios em ratas e quantificados pela técnica de quimiluminescência. A FIG. 7 ilustra a indução da produção de estradio! (17p-Estradioi) e de
progesterona medida no soro de ratas (Wistar) imaturas, com 4-6 semanas de idade, após 6 e 18 horas, respectivamente, da injeção intramuscular de doses decrescentes de SEQi ID. 19 (0,012 a 20 pg), utilizando como controle, ratas imaturas com 4-6 semanas de idade injetadas com salina tamponada com fosfato, pH= 7,4 (PBS)'; Os
procedimentos utilizados nos experimentos de indução hormonal em ratas foram aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais do Campus de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (CEUA) - (Protocolo n° 14.1.479.53.0).
Exemplo 7 - Análise da capacidade da SEQ. ID. 17 e de SEQ. ID.19 de induzir o aumento da massa ovariana em ratas:
A avaliação da capacidade da SEQ. ID. 17 e SEQ. ID. 19 de promover, in vivo, atividade relacionada à função hormonal da gonadotrofina coriônica foi analisada pela medida da massa ovarína de ratas tratadas com a SEQ. !D. 17 [r-eCG sem GFP (10 pg)] e SEQ. ID. 19 [r-eCG com GFP (20 Mg)]. Os efeitos da SEQ. JD. 17 na indução de crescimento ovariano foram então avaliados, mensurando a massa ovariana de ratas (Wistar) com 21 dias de vida, após injeção
intramuscular de 10 pg da SEQ. ID. 17 (FIG. 8). Cada grupo experimental continha 04 animais (total de 8 ovários por grupo). Os procedimentos utilizados nos experimentos de indução de aumento de massa ovariana em ratas foram aprovados pela CEUA (Protocolo n° 14.1.479.53.0).
Da mesma forma, a FIG. 9 ilustra a análise funcional (indução do aumento da massa ovariana) comparativa entre as formas recombinantes da molécula Green Fluorescent Protein (GFP, SEQ. ID. 49), a forma nativa da eCG (SEQ. ID. 5 e SEQ. ID. 7) e da SEQ. ID. 19. Cada grupo experimental continha 04 animais (total de 8 ovários por grupo) e apenas 02 ovários de cada grupo experimental, tomados de modo aleatório, estão representados. A escala associada às imagens está dimensionada em centímetros.
Os resultados estão expressos como massa ovariana em gramas (g) e indicam que as formas recombinantes da eCG (SEQ. ID. 17 e SEQ. ID. 19) apresentam bioativídade in vivo semelhante ao eCG nativo (SEQ. ID. 5 e SEQ. ID. 7). Estes exemplos auxiliam na fundamentação da inclusão de formas híbridas do hormônio (composto pela cadeia alfa de animais alvo e beta equina) nesta patente de invenção, pois a SEQ.ID. 17 e 19 apresentam similaridade gênica acima de 97% e semelhanças estruturais com as formas híbridas, as quais poderão ser indicadas para uso em diversas espécies de mamíferos.
Exemplo 8 - Testes a campo para a avaliação da atividade de SEQ. ID. 17 em animais de grande porte (Bovinos):
A atividade hormonal da SEQ. ID. 7 foi avaliada em protocolos de sincronização de cio (IATF) em mamíferos de grande porte (Bovinos) por Ultrassom (GE-Logiq e Transdutor transretal rnod I-739, 8-12 Mhz), em fêmeas induzidas ao cio através de protocolos hormonais realizados pela administração de eCG 300 Ul e de SEQ. ID. 17 30 pg.
O modelo experimental foi baseado em fêmeas da espécie bovina Bos taurus indicus, em grupos homogéneos quanto a categoria animal (raça, idade, paridas pelo menos 1 vez), com n=127 para o grupo eCG e n=50 pára o grupo SEQ. |D. 17. Os sinais de cio foram verificados por avaliação clínica e por comparação das ondas foliculares e ovulação (Ultrassom).
O protocolo de IATF consistiu na introdução do dispositivo vaginal para liberação de progesterona (dia 1 ), administração de doses de eCG 300 Ul e de SEQ. ID. 17 30 pg e avaliação uterina por ultrassonografia (dia 8). A inseminação foi realizada após a análise por ultrassonografia e observação de onda folicular, onde pelo menos um folículo apresentou crescimento (1 ,4 mm/dia) para cada animal dè ambos os grupos (dia 0).
A FIG. 10 mostra comparação da taxa de prenhez que foi realizada 30 dias pós-inseminação por ultrassonografia trans-retal nos animais pertencentes aos grupos inseminados a partir -de protocolo de IATF utilizando a eCG e SEQ. ID.17. Os resultados obtidos mostraram uma taxa de prenhez de 50,23% para o eCG, e de 48% para a SEQ. ID.17, onde a média nacional da taxa de prenhez por IATF é de 42%.
As análises mostraram a formação de cistos em 5,5% e formação de gemelar em 1 ,59% no grupo eCG, onde o grupo SEQ. ID.17 não apresentou a formação de cistos e de gemelares.
Aplicações
A partir de uma quantidade eficaz dos hormônios glicoproteicos recombinantes das SEQ. ID. 17 e SEQ. ID. 19, por exemplo, de 0,001 a 10.000 pg, em conjunto com adjuvantes farmáceuticamente aceitáveis, tais como cárreadores hormonais ou permeádores e sistemas de liberação baseados em nanotecnologia é possível propor uma
composição farmacêutica. Esses adjuvantes visam garantir a qualidade da farmacocinética e farmacodinâmíca assegurando a adequada bioatividade destes hormônios recombinantes nos diferentes protocolos da reprodução animal. Tal composição é utilizada para a reprodução assistida animal compreendendo uma quantidade eficaz de hormônios glicoproteicos recombinantes. Tais composições serão utilizadas na indução da ovulação; indução de superovulação; crescimento folicular; indução de cio; reversão de anestro; indução de puberdade em animais de interesse comercial ou não, mamíferos em geral, tais como, bovinos, ovinos, caprinos, suínos, equinos, muares, bubálinos, bisontes, antílopes, espécies domésticas e selvagens de caninos e felinos, cetáceos, ursídeos e primatas.
Além disso, há ainda a possibilidade da elaboração de kits para indução da ovulação; indução de superovulação; crescimento folicular; indução de cio; reversão de anestro; indução de puberdade; para utilização em protocolos dè IATF (Inseminação Artificial em Tempo Fixo) FIV (Fertilização in vitro), TETF (Transferência de Embriões por Tempo Fixo) em animais de interesse comercial ou não.
Considerando que as gonadotrofinas coriônicas podem ser imunogênicas (induzir a produção de anticorpòs) e antigênicas (serem reconhecidas por anticorpos) (Hervé et al. 2004, Forcada et al. 201 1 ; Chopineau et al., 1993) é possível propor que os hormônios glicoproteicos recombinantes, em questão, possam ser usados na obtenção de anticorpos nativos (monoclonais e/ou policlonáis) ou recombinantes (Phage Display) e que tanto estes anticorpos quanto os hormônios glicoproteicos recombinantes, e seus derivativos (conjugados a enzimas, radiomarcadores e/ou fluorocromos), possam compor kits de detecção destas duas categorias de moléculas (hormônios e anti-hormônios) em amostras biológicas ou não.
Embora a invenção tenha sido amplamente descrita; é óbvio para aqueles versados na técnica que várias alterações e modificações podem ser feitas sem que as referidas alterações não estejam cobertas pelo escopo da invenção. REFERÊNCIAS
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Claims

REIVINDICAÇÕES
1. Processo de produção e purificação de hormônios glicoproteicos recombinantes híbridos ou não-híbridos caracterizado pelo fato de compreender as etapas de:
(a) amplificação, modificação e clonagem das moléculas híbridas ou não híbridas;
(b) construção dos vetores de expressão de hormônios glicoproteicos recombinantes;
(c) transfecçao, expressão e análise das células que expressam os hormônios glicoproteicos recombinantes;
(d) purificação de hormônios glicoproteicos recombinantes por cromatografia de afinidade;
(e) diálise e esterilização dos hormônios glicoproteicos recombinantes;
èm que o hormônio glicoproteico recombinante (r-eCG) e a suas formas híbridas são selecionados do grupo consistido em gonadotrofina coriônica equina recombinante (r-eCG), gonadotrofina coriônica bovina recombinante (r-bCG), gonadotrofina coriônica suína recombinante (r- sCG), gonadotrofina coriônica ovina recombinante (r-oCG), gonaddtrofina coriônica caprina recombinante (r-cCG), hormônio tiroestimulante recombinante (r-TSH), hormônio luteinizante recombinante (r-LH) e, o hormônio folículo estimulante recombinante (r-FSH).
2. Processo, de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado pelo fato de o hormônio glicoproteico recombinante (r-eCG) e suas formas híbridas serem preferencialmente a gonadotrofina coriônica equina recombinante (r-eCG) e as suas formas híbridas.
3. Processo, de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado pelo fato de a amplificação dos fragmentos gênicos da r-eCG (SEQ.ID. 16) ou da r-eCG-GFP (SEQ.ID. 18), por PCR, usar oligonucieotídeos iniciadores (SEQ. ID. 1 , SEQ. ID. 2 e SEQ. ID. 3) complementares as diferentes formas de gonadotrofina coriônica nativa para a obtenção de um fragmento gênico referente à fusão entre a sequência de DNA da subunidade beta da eCG nativa (SEQ. ID. 6) e a sequência de DNA da subunidade alfa da eCG nativa (SEQ.ID.4), em que tais SEQ. ID. 6 e 4 correspondem às subunidades α e β da eCG e sequências adicionais, que correspondem ao seu total na SEQ. ID. 16 ou na SEQ. ID.18 validado por eletroforese em gel de agarose.
4. Processo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de as SEQ. !D. 1 , SEQ. ID. 2 e SEQ. ID. 3 ainda apresentarem sequências de nucleotídeos adicionais associadas a sítios de clivagem para enzimas de restrição e sequências codificadoras para uma cauda de histidina e um sítio proteolítico para a protease TEV-Tag, associadas a clonagem das sequências gênicas, purificação dos hormônios
recombinantes e edição proteica destes hormônios, respectivamente.
5. Processo, de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado pelo fato de a construção de vetores para a expressão de hormônios glicoproteicos recombinantes em células eucarióticas (CHO-K1 e HEK 293) ser iniciada pela clonagem da SEQ. ID. 16 ou da SEQ. ID. 18 em células prdcarióticas (E. coli DH5a).
6. Processo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de a etapa de clonagem iniciar-se com a inserção das sequências SEQ. ID. 6 ou SEQ. !D. 18 em um vetor comercial que é utilizado para transformar as células DH5a competentes por choque térmico, seguida da seíeção dos clones bacterianos contendo o vetor de clonagem
recombinado com as sequências SEQ. ID. 16 ou SEQ. ID. 18, cujas presenças são validadas pòr eletroforese em gel de agarose e
sequenciamento químico de DNA.
7. Processo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de os vetores de expressão serem usados para transfectar células eucarióticas de modo transiente com o auxílio de lipossomos e de modo estável, com o uso das sequências SEQ. ID. 16 ou SEQ. ID. 18, via vetores lentívirais ou sistemas biologicamente seguros, de integração gênica não aleatória e sem a necessidade de agentes seletivos.
8. Processo, de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado pelo fato de a purificação dos hormônios glicoproteicos ocorrer pela coleta do sobrenadante de cultura de células de mamíferos transfectadas com as sequências SEQ. ID. 16 ou SEQ. ID. 18 e secretoras das sequências SEQ. ID. 17 ou SEQ. ID. 19, por via transiente ou estável, seguida de cromatografia de afinidade em resinas de níquel.
9. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de ser para a produção dos polipeptídeos SEQ. ID. 17, SEQ. ID. 19, SEQ. ID. 23, SEQ. ID. 25, SEQ. ID. 27, SEQ. ID. 29, SEQ. ID. 31 , SEQ. ID. 33, SEQ. ID. 35 e SEQ. ID. 37, referentes à gonadotrofina coriônica equina recombinante e suas formas híbridas, a partir das suas respectivas sequências de DNA e com o uso de
sequências nucleotídeos de iniciadores das diferentes formas de gonadotrofina coriônica e dé sítios de clivagem para enzimas de restrição e de sequências de DNA codificadoras para uma cauda de histidina e um sítio proteolítico para a protease TEV-Tag
10. Hormônios glicoproteicos recombinantes híbridos ou não- híbridos produzido pelo processo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizados pelo fato de compreenderem subunidades α e β equinas ou subunidade α de mamíferos e β equina, um marcador de purificação, peptídeo de sinalização da secreção da molécula, peptídeo de interface de dimerização, um sítio proteolítico específico, e opcionalmente um marcador fluorescente.
11. Hormônios, de acordo com a reivindicação 10,
caracterizados pelo fato de as duas subunidades serem fusionadas em uma cadeia simples, e agentes modificadores de cadeia nas porções amino e carboxi-terminais.
12. Hormônios, de acordo com a reivindicação 0,
caracterizados peio fato de os agentes modificadores de cadeia conterem ou não fusão a uma molécula emissora de fluorescência, tal como a GFP.
13. Hormônios, de acordo com a reivindicação 10,
caracterizados pelo fato de o marcador de purificação ser tal como as sequências de afinidade, tal como a cauda de.histidina.
14. Hormônios, de acordo com qualquer uma das
reivindicações 10 a 13, caracterizados pelo fato de serem administrados em uma quantidade de 0,001 a 10.000 pg, observando-se o peso corpóreo dos animais alvo.
15. Hormônios, de acordo com qualquer uma das
reivindicações 10 a 14, caracterizados pelo fato de serem conforme as SEQ. ID. 1 a SEQ. ID. 49.
16. Vetores de expressão dos hormônios glicoproteicos recombinantes (híbridos e não-híbridos) caracterizados pelo fato de serem para transfecção de células de eucariontes, via sistemas de transfecção transiente ou estável e usadas como fonte de obtenção de preparações homogéneas e bioativas destes hormônios, em que tais vetores são as SEQ. ID. 1 a SEQ. ID. 49, conforme definidas nas reivindicações 10 a 14, associadas à produção e purificação destes hormônios glicoproteicos recombinantes.
17. Uso dos hormônios glicoproteicos recombinantes, conforme definido nas reivindicações 10 a 15, caracterizado pelo fato de ser para o preparo de composições farmacêuticas.
18. Uso dos h.ormônios glicoproteicos recombinantes conforme definidos em qualquer uma das reivindicações 10 a 15,
caracterizado pelo fato de ser na reprodução animal assistida em espécies de mamíferos em geral de interesse comercial ou não tais como, bovinos, ovinos, caprinos, suínos, equinos, muares, bubalinos, bisontes, antílopes, espécies domésticas e selvagens de caninos e felinos, cetáceos, ursídeos e primatas.
19. Uso, de acordo com a reivindicação 17 ou 18,
caracterizadò pelo fato de ser ainda na indução da ovulação; indução de superõvulação; crescimento folicular; indução de cio; reversão de anestro; indução de puberdade; utilização em protocolos de IATF (Inseminação Artificial em Tempo Fixo) protocolos de F1V (Fertilização ín vítro), protocolos de TETF (Transferência de Embriões por Tempo Fixo) em animais de interesse comercial ou não.
20. Uso, de acordo com qualquer ;uma das reivindicações 16 a 19, caracterizado pelo fato de os hormônios glicoproteícos
recombinantes serem ainda utilizados na obtenção de anticorpos nativos (monoclonais ou pofíclonais) ou recombinantes (Phage Display) contra estes hormônios (nativos e/ou recombinantes).
21. Uso, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de tantos os anticorpos quantos os hormônios glicoproteícos recombinantes, e seus derivativos comporem kits de detecção de hormônios e anti-hormônios em amostras biológicas ou não.
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