CN107141349B

CN107141349B - 促性腺激素重组蛋白Alu-HCG及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN107141349B
Application number: CN201710377777.3A
Authority: CN
Inventors: 邓成; 陈海迪; 武云娥
Original assignee: Nanjing Normal University
Current assignee: Nanjing Normal University
Priority date: 2017-05-25
Filing date: 2017-05-25
Publication date: 2020-11-20
Anticipated expiration: 2037-05-25
Also published as: CN107141349A

Abstract

本发明公开了一种促性腺激素重组蛋白Alu‑HCG及其编码基因和应用。该促性腺激素重组蛋白Alu‑HCG，包括氨基酸序列SEQ ID NO：1。重组蛋白Alu‑HCG的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明的重组蛋白Alu‑HCG具有高效促进排卵的功能。该促性腺激素重组蛋白Alu‑HCG相比较HCG有着更长的半衰期，能更长时间发挥作用，排卵效果显著高于HCG，同时细胞迁移能力和细胞侵袭的影响上比HCG效果更显著，可用于制备促进雌性排卵、促性腺激素的蛋白多肽药物，对于治疗不育症起到一定的贡献，同时重组蛋白Alu‑HCG是一种新的早孕marker分子。

Description

促性腺激素重组蛋白Alu-HCG及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于生物医学领域，具体涉及一种促性腺激素重组蛋白Alu-HCG及其编码基因和应用。

背景技术

不育症的定义是一年尝试不能受孕。不育症虽非致命性疾病，但对个人的生活质量和家庭幸福有着重要影响，已成为全球的医学和社会问题。资料显示：全世界育龄夫妇中约有百分之八存在生殖障碍，近千万人不能正常生育。据不完全统计，中国的不孕不育症发病率为百分之十，约有近一千万对夫妇存在生殖障碍，其中约十分之一既近百万对夫妇愿意借助试管婴儿等辅助生殖技术，实现做父母的愿望。而随着技术的发展和人们对这项技术的了解，希望得到治疗的患者比预期还要多。

不育症治疗中蛋白多肽药物占有重要地位。生物技术药物的进展对不育症的治疗做出重要贡献。自从1932年FDA批准药物波热尼乐Pergonal(促性腺激素)，用于治疗不育症和造成临床怀孕率的改善，在遍及世界范围使用，是最早用于治疗疾病的蛋白多肽药物。促性腺激素药物产品被批准的适应症：主要是(1)在慢性无排卵妇女中诱导排卵；(2)在辅助生殖(ART)中促使多个卵泡发育。在四十年以上期间尿源促性腺素(HCG)曾帮助成千上万不育症的配偶实现有小孩的梦想。使用重组DNA技术将继续以更安全和更有效地使梦想成真，具有明显的进步表现在重组蛋白纯度与耐受性、有效性、安全性等方面。我国不育症生物技术药物处在明显落后情况，与需求存在巨大差异。截至至2007年底只有广东天普生化医药股份有限公司可提供以下规格的人绒毛膜促性腺激素(HCG)原料和尿促性激素(HMG)，是从绝经妇女的尿液中提取而得到的糖蛋白促性腺激素原料。但是现有的促性腺激素半衰期短，排卵效果一般。

发明内容

发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种促性腺激素重组蛋白Alu-HCG，该新的促性腺激素重组蛋白Alu-HCG相比较HCG有这更长的半衰期，能更长时间发挥作用，可以更好的促进排卵，对不育症起到一定的贡献。

本发明还提供促性腺激素重组蛋白Alu-HCG的编码基因、特异性扩增引物、重组表达载体、重组菌。

本发明最后还提供促性腺激素重组蛋白Alu-HCG在促进雌性排卵中的应用，以及该重组蛋白Alu-HCG在制备促进雌性排卵、促性腺激素的蛋白多肽药物中的应用。

技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述一种促性腺激素重组蛋白Alu-HCG，包括氨基酸序列SEQ ID NO：1。

本发明所述的促性腺激素重组蛋白Alu-HCG的编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：2所示。

其中，所述核苷酸序列SEQ ID NO：2的特异性扩增引物包括正向引物SEQ ID NO：3和反向引物SEQ ID NO：4。

本发明所述一种重组表达载体，它包括核苷酸序列SEQ ID NO：2。

其中，所述重组表达载体为在载体pSec Tag2C的多克隆位点插入核苷酸序列SEQID NO：2得到。

本发明所述一种重组菌，它包括权利要求4的重组表达载体，用于表达重组蛋白Alu-HCG。

本发明所述的促性腺激素重组蛋白Alu-HCG在促进雌性排卵中的应用。

本发明所述的促性腺激素重组蛋白Alu-HCG在制备促进雌性排卵、促性腺激素的蛋白多肽药物中的应用。

本发明所述的根据氨基酸序列SEQ ID NO:1制备新抗体anti-Alu，特异性识别重组蛋白Alu-HCG。

有益效果：与现有技术相比，本发明的重组蛋白Alu-HCG具有促进排卵的功能。该新的促性腺激素重组蛋白Alu-HCG相比较HCG有这更长的半衰期，能更长时间发挥作用，排卵效果显著高于HCG，同时细胞迁移能力和细胞侵袭的影响上比HCG效果更显著，可用于制备促进雌性排卵、促性腺激素的蛋白多肽药物，治疗女性少排卵或不排卵造成的不育症，改善我国治疗不育症的落后情况，同时重组蛋白Alu-HCG是一种新的早孕marker分子。

附图说明

图1为重组表达载体pSecTag2C结构示意图；

图2为人绒毛组织免疫组化图；

图3为人绒毛组织免疫荧光图；

图4为本发明重组促性腺激素蛋白Alu-HCG和蛋白HCG半衰期图；

图5为本发明重组促性腺激素蛋白Alu-HCG和蛋白HCG的促超排的作用图；

图6为本发明重组促性腺激素蛋白Alu-HCG和蛋白HCG对jeg-3细胞迁移的影响图；

图7为本发明重组促性腺激素蛋白Alu-HCG和蛋白HCG对jeg-3细胞侵袭的影响图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

限制性内切酶、RNaseA、T4Ligase等购自Takara。

Lip2000，DMEM，zeo+等购自Life公司。

多功能DNA纯化回收试剂盒(Cat#DP1502)购自BioTeke公司。

高纯质粒小量制备试剂盒(Cat#DP1002)购自BioTeke公司。

大肠杆菌DH5α购自Transgene公司。

pSecTag2C购自invitrogen(lot no：1555977)。

实施例1

基因的制备

1.组织RNA提取

人流产后的绒毛组织样本储存于RNA保护液中，并于冰上运输，到达实验室后立即提取RNA。总RNA提取所用枪头，离心管均购自Axygen。以下操作均在超净工作台进行：

1)将存在于RNA保护液中的绒毛组织样品(1.5ml Eppendorf管)离心，4℃，12000rpm/min，离心5min，尽量吸走保护试剂；

2)将离心管置于冰上，加1ml RNAiso Plus样品充分研磨。冰上放置5min；

3)加入200μl 4℃预冷的氯仿，剧烈震荡30s，直至溶液乳化成淡粉色悬浮液，冰上静置20min，移入离心机4℃，12000rpm/min，离心15min；

4)从离心机小心取出，液体分3层：无色上清，中间白色为蛋白质，下层为有机相。小心取上清液于新的离心管中，加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀3-4次，冰上放置20min。4℃，12000rpm/min，离心10min；

5)弃去上清，加入DEPC谁配制的75％的乙醇1ml，涡旋洗涤沉淀，7500rpm/min，4℃，离心5min，弃去上清；

6)打开离心管盖，室温干燥15min，使乙醇挥发，加入50μl RNase-free water溶解沉淀，-80℃保存备用，并取少量检测浓度。

2.cDNA的合成

严格按照Primerscript^TM RT reagents kit(TaKaRa,Japan)逆转录试剂盒操作说明操作，反应体系如下：

反转录条件：37℃15min；85℃5sec，得到人工合成的cDNA模板。

3.PCR扩增Alu-HCG、HCGA与HCGB基因

1)引物设计

分别设计Alu-HCG基因、HCG基因(SEQ ID NO：5)的特异性扩增引物，其中HCG是由hcga和hcgb两个亚基组成，因为Alu片段是在hcga中间部位插入，HCG与Alu-HCG开端与结尾序列相同，因而可以使用同一对引物。在Alu-HCGA基因和HCG基因下游引物5’端添加Xho I酶切位点和保护碱基，去除终止密码子继续表达载体上的6x His标签，在HCG基因上游引物5’端添加Hind III酶切位点和保护碱基。去除基因本身自带的信号肽，使用载体上的信号肽和标签。特异性扩增基因引物如下：

SEQ ID 3：5’-TTTAAGCTTTATCCAAGGAGCCGCTTCGG-3’。

SEQ ID 4：5’-AAACTCGAGTCAGTGGTGATGGTGATGATGA

GATTTGTGATAATAACA-3’。

2)以第2步人工合成cDNA为模板，用引物SEQ ID 5、6进行PCR扩增。

PCR反应体系如下：

反应条件：

94℃预变性2min，94℃变性20s，58℃(根据引物的退火温度进行适当调整)退火30s，72℃延伸30s-1min，循环35次，循环结束后72℃延伸10min。

4.PCR产物的切胶纯化

PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳(120V，10min后，85V，50min)后切胶回收，按照Axygen的切胶纯化试剂盒操作说明纯化产物。得到促性腺激素重组蛋白Alu-HCG的编码基因SEQ ID NO：2。

实施例2

重组表达载体的制备

用限制性内切酶Hind III和Xho I酶切pSecTag2C，回收载体大片段；用限制性内切酶Hind III和Xho I酶切实施例1的PCR产物，回收目的基因片段；将所述载体大片段与所述目的基因片段连接，得到重组载体Alu-HCG。同时，用限制性内切酶Hind III和Xho I酶切HCG基因，将所述载体大片段与HCG目的基因片段连接得到重组载体HCG作为对照。其中，重组载体pSecTag2C结构示意图如图1所示。

将重组载体转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，氨苄抗性筛选培养，挑取单克隆；将单克隆进行液体培养，提取质粒进行测序，结果证明Hind III和Xho I酶切位点之间插入的基因序列如SEQ ID NO：2(Alu-HCG)和SEQ ID NO：5(HCG)所示。

实施例3

蛋白的纯化

1、稳定表达细胞系的筛选

将实施例2得到两个重组载体转染人胚胎肾细胞-293细胞，zeo抗生素筛选稳定高效表达目的基因的细胞株，转移到96孔板中筛选单克隆。

将上述筛选出的单克隆细胞进行饥饿表达，将长满6cm培养皿的细胞换成无血清培养基2ml培养4天，将培养基上清进行目的蛋白的检测。

将选取的稳定表达的细胞进行扩大培养。扩大至50个15cm培养皿，长满后换无血清培养基培养进行饥饿表达目的蛋白。

2、蛋白纯化

将收集的培养基吸取至50ml EP管中，3000r/min离心5min(室温)。

抽滤培养基上清(0.22um)，置于冰上。

取2.5ml镍柱介质与培养基混合，置于4°磁力搅拌2h，转速不可太快。后静置30min。

去离子水润洗空柱，剪去柱底部的节点，使水流出，将空柱垂直固定，下置一烧杯。

将介质与蛋白混合物填充进纯化柱，将烧杯中的混合物尽量转移至柱中。

取40ml(5个介质体积)的Binding buffer(10mM咪唑溶于1x TBS pH7.4)洗脱未结合在镍柱上的蛋白，Binding buffer需要现配现用。

取6ml Elution buffer(500mM咪唑溶于1x TBS pH7.4)加入柱中，需等Bindingbuffer尽量流尽但镍柱不能干(2ml洗脱一次，分3次洗脱，可增加洗脱效率)。将镍柱下端出口堵住，放置10min，保存洗脱液。

将Elution buffer进行透析。透析后的蛋白即为纯化后的蛋白，分装-80保存，可用于后续实验。经过检测两种蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1(Alu-HCG)和SEQ ID NO：6(HCG)所示。

实施例4

免疫组化

新鲜的刚流产的人绒毛组织预冷的PBS清洗后放入4％PFA中室温固定2h；

将固定后的绒毛组织放入PBS配制的30％蔗糖溶液中4℃过夜脱水；

组织包埋剂(OCT)：30％蔗糖比例1:1浸埋组织30min。

锡箔纸包裹住OCT包埋的组织，写明怀孕时间，液氮速冻后放入负80℃冰箱备用。

将冰冻的组织使用冷冻切片机切成7μm厚度的切片，粘于防脱片载玻片；

将切片放入预冷的冰丙酮中固定30min；

1x PBS快速洗3次，每次3min；

0.2％TritonX洗3次，每次10min；

10％山羊血清室温湿盒封闭1h；

Anti-Alu-HCG alpha抗体、Anti-HCG alpha抗体兔源一抗1:200稀释4℃孵育过夜(对照组不孵育一抗，直接封闭过夜)；

将切片从4℃拿出放置30min恢复至室温；

1x PBS洗3次，每次10min；

山羊抗兔二抗1:200稀释室温湿盒孵育3-4h；

1x PBS洗3次，每次10min；

DAB避光显色5min，放入水中终止显色；

苏木素染核1min，水洗3次，每次3min；

滴加中性树脂加盖玻片封片，封片是注意一定不能出现气泡；

倒置显微镜观察并拍摄照片。

图2为人绒毛组织免疫组化图其中st：合体滋养层，Vctb：绒毛细胞滋养层。由图2可见，Alu-HCG与HCG(包括hcga和hcgb)一样可以在组织中被检测到，从免疫组化结果来看HCG和Alu-HCG同样定位于滋养层。显示Alu-HCG与HCG在体内表达并无太大差异。

实施例5

免疫荧光

将切片放入预冷的冰丙酮中固定30min；

1x PBS快速洗3次，每次3min；

0.2％TritonX洗3次，每次10min；

10％山羊血清室温湿盒封闭1h；

Anti-Alu-HCG alpha抗体(兔源)+Anti-Alu-HCG beta抗体(鼠源)、Anti-HCGalpha抗体(兔源)+Anti-Alu-HCG beta抗体1:200稀释4℃孵育过夜(对照组不孵育一抗，直接封闭过夜)；

将切片从4℃拿出放置30min恢复至室温；

1x PBS洗3次，每次10min；

Goat anti-mouse IgG(H+L)Second Antibody，Alexa fluor 488conjugate(1：200)、Goat anti-Rabbit IgG(H+L)Second Antibody，Alexa fluor 594conjugate(1:200)加DAPI室温避光孵育1h；

避光1x PBS洗3次，每次10min；

滴加中性树脂封片，注意一定不能有气泡，过程要避光，封片后用锡箔纸将切片封好，一定要注意避光；

倒置荧光显微镜拍摄图片。

图3为人绒毛组织免疫荧光图。由图3可见，疫荧光结果与免疫组化结果相同，显示Alu-HCG和HCG定位重合，从而更加证明HCG与Alu-HCG在组织中分布相同，从而为其功能的研究提供了帮助，以上免疫组化和免疫荧光这两个实验证明Alu-HCG和HCG一样表达，说明Alu-HCG同样可以作为早孕marker分子。

实施例6

半衰期检测

取多只200g SD雌鼠，分成两组每支尾静脉分别注射HCG，Alu-HCG蛋白，500ul，注射后不同时间点尾尖取血。

取血清用于HCG ELISA检测hcgb浓度，计算HCG，Alu-HCG蛋白半衰期。通过试剂盒检测的hcgb浓度(即HCG浓度)，此Alu-HCG和HCG的中hcgb浓度一样，即代表Alu-HCG和HCG的浓度。

图4为本发明重组促性腺激素蛋白半衰期图或者为重组促性腺激素蛋白Alu-HCG和蛋白HCG在大鼠体内的消失曲线。半衰期是指蛋白浓度消失到原始浓度一半时所用的时间，半衰期越长说明其在体内停留的时间越长。由图4可见，Alu-HCG比HCG明显有着更长的半衰期，使其能在体内作用更长的时间，从而延长其效期。

实施例7

超排实验

4-5周C57/BL6雌鼠腹腔注射10IU PMSG。

48h后不同组分别腹腔注射等量的HCG、Alu-HCG。

14-16h后断颈椎处死，取卵巢，子宫与输卵管。体视镜下分离出输卵管，将膨大的壶腹部破开流出卵冠丘复合体，经透明质酸酶37℃消化5min，即可得到清晰的卵细胞，体视镜下即可计数。图5为本发明重组促性腺激素蛋白超排的作用图。由图5可见，同等剂量下Alu-HCG作用后的鼠排卵效果显著高于HCG。从而证明Alu-HCG有着更高效的促排卵作用，其在治疗不育症有着更明显的作用。

实施例8

细胞迁移实验

24孔板transwell小室，jeg-3细胞接种5x10⁵，下室加入500ul完全培养基，贴壁后上室换无血清培养基加不同浓度的HCG、Alu-HCG刺激24h后弃培养基，结晶紫染色小室背面膜上迁移的细胞计算不同蛋白对细胞迁移能力的影响。图6为本发明重组促性腺激素蛋白Alu-HCG和HCG对jeg-3细胞迁移的影响图。由图6可见，在对细胞迁移能力影响上Alu-HCG比HCG效果更显著。

实施例9

细胞侵袭实验

24孔板transwell小室，铺基质胶，30min后将jeg-3细胞接种5x10⁵，下室加入500ul完全培养基，贴壁后上室换无血清培养基加不同浓度的HCG、Alu-HCG刺激24h后弃培养基，结晶紫染色小室背面膜上侵袭的细胞计算不同蛋白对该细胞侵袭能力的影响。图7为本发明重组促性腺激素蛋白Alu-HCG和HCG对jeg-3细胞侵袭的影响图。由图7可见，同等浓度下Alu-HCG对细胞侵袭的影响要明显高于HCG。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京师范大学

<120> 促性腺激素重组蛋白Alu-HCG及其编码基因和应用

<130> 2017

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 274

<212> PRT

<213> Alu-HCG

<400> 1

Ser Lys Glu Pro Leu Arg Pro Arg Cys Arg Pro Ile Asn Ala Thr Leu

1 5 10 15

Ala Val Glu Lys Glu Gly Cys Pro Val Cys Ile Thr Val Asn Thr Thr

20 25 30

Ile Cys Ala Gly Tyr Cys Pro Thr Met Thr Arg Val Leu Gln Gly Val

35 40 45

Leu Pro Ala Leu Pro Gln Val Val Cys Asn Tyr Arg Asp Val Arg Phe

50 55 60

Glu Ser Ile Arg Leu Pro Gly Cys Pro Arg Gly Val Asn Pro Val Val

65 70 75 80

Ser Tyr Ala Val Ala Leu Ser Cys Gln Cys Ala Leu Cys Arg Arg Ser

85 90 95

Thr Thr Asp Cys Gly Gly Pro Lys Asp His Pro Leu Thr Cys Asp Asp

100 105 110

Pro Arg Phe Gln Asp Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu

115 120 125

Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro

130 135 140

Gln Ala Pro Asp Val Gln Glu Thr Gly Phe His His Val Ala Gln Ala

145 150 155 160

Ala Leu Lys Leu Leu Ser Ser Ser Asn Pro Pro Thr Lys Ala Ser Gln

165 170 175

Ser Ala Arg Ile Thr Asp Cys Pro Glu Cys Thr Leu Gln Glu Asn Pro

180 185 190

Phe Phe Ser Gln Pro Gly Ala Pro Ile Leu Gln Cys Met Gly Cys Cys

195 200 205

Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro Leu Arg Ser Lys Lys Thr Met Leu

210 215 220

Val Gln Lys Asn Val Thr Ser Glu Ser Thr Cys Cys Val Ala Lys Ser

225 230 235 240

Tyr Asn Arg Val Thr Val Met Gly Gly Phe Lys Val Glu Asn His Thr

245 250 255

Ala Cys His Cys Ser Thr Cys Tyr Tyr His Lys Ser His His His His

260 265 270

His His

<210> 2

<211> 825

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

tccaaggagc cgcttcggcc acggtgccgc cccatcaatg ccaccctggc tgtggagaag 60

gagggctgcc ccgtgtgcat caccgtcaac accaccatct gtgccggcta ctgccccacc 120

atgacccgcg tgctgcaggg ggtcctgccg gccctgcctc aggtggtgtg caactaccgc 180

gatgtgcgct tcgagtccat ccggctccct ggctgcccgc gcggcgtgaa ccccgtggtc 240

tcctacgccg tggctctcag ctgtcaatgt gcactctgcc gccgcagcac cactgactgc 300

gggggtccca aggaccaccc cttgacctgt gatgaccccc gcttccagga ctcctcttcc 360

tcaaaggccc ctccccccag ccttccaagc ccatcccgac tcccggggcc ctcggacacc 420

ccgatcctcc cacaagctcc tgatgtgcag gagacagggt ttcaccatgt tgcccaggct 480

gctctcaaac tcctgagctc aagcaatcca cccactaagg cctcccaaag tgctaggatt 540

acagattgcc cagaatgcac gctacaggaa aacccattct tctcccagcc gggtgcccca 600

atacttcagt gcatgggctg ctgcttctct agagcatatc ccactccact aaggtccaag 660

aagacgatgt tggtccaaaa gaacgtcacc tcagagtcca cttgctgtgt agctaaatca 720

tataacaggg tcacagtaat ggggggtttc aaagtggaga accacacggc gtgccactgc 780

agtacttgtt attatcacaa atctcatcat caccatcacc actaa 825

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

tttaagcttt atccaaggag ccgcttcgg 29

<210> 4

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

aaactcgagt cagtggtgat ggtgatgatg agatttgtga taataaca 48

<210> 5

<211> 732

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

tccaaggagc cgcttcggcc acggtgccgc cccatcaatg ccaccctggc tgtggagaag 60

gagggctgcc ccgtgtgcat caccgtcaac accaccatct gtgccggcta ctgccccacc 120

atgacccgcg tgctgcaggg ggtcctgccg gccctgcctc aggtggtgtg caactaccgc 180

gatgtgcgct tcgagtccat ccggctccct ggctgcccgc gcggcgtgaa ccccgtggtc 240

tcctacgccg tggctctcag ctgtcaatgt gcactctgcc gccgcagcac cactgactgc 300

gggggtccca aggaccaccc cttgacctgt gatgaccccc gcttccagga ctcctcttcc 360

tcaaaggccc ctccccccag ccttccaagc ccatcccgac tcccggggcc ctcggacacc 420

ccgatcctcc cacaagctcc tgatgtgcag gattgcccag aatgcacgct acaggaaaac 480

ccattcttct cccagccggg tgccccaata cttcagtgca tgggctgctg cttctctaga 540

gcatatccca ctccactaag gtccaagaag acgatgttgg tccaaaagaa cgtcacctca 600

gagtccactt gctgtgtagc taaatcatat aacagggtca cagtaatggg gggtttcaaa 660

gtggagaacc acacggcgtg ccactgcagt acttgttatt atcacaaatc tcatcatcac 720

catcaccact aa 732

<210> 6

<211> 243

<212> PRT

<213> HCG

<400> 6

Ser Lys Glu Pro Leu Arg Pro Arg Cys Arg Pro Ile Asn Ala Thr Leu

1 5 10 15

Ala Val Glu Lys Glu Gly Cys Pro Val Cys Ile Thr Val Asn Thr Thr

20 25 30

Ile Cys Ala Gly Tyr Cys Pro Thr Met Thr Arg Val Leu Gln Gly Val

35 40 45

Leu Pro Ala Leu Pro Gln Val Val Cys Asn Tyr Arg Asp Val Arg Phe

50 55 60

Glu Ser Ile Arg Leu Pro Gly Cys Pro Arg Gly Val Asn Pro Val Val

65 70 75 80

Ser Tyr Ala Val Ala Leu Ser Cys Gln Cys Ala Leu Cys Arg Arg Ser

85 90 95

Thr Thr Asp Cys Gly Gly Pro Lys Asp His Pro Leu Thr Cys Asp Asp

100 105 110

Pro Arg Phe Gln Asp Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu

115 120 125

Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro

130 135 140

Gln Ala Pro Asp Val Gln Glu Cys Pro Glu Cys Thr Leu Gln Glu Asn

145 150 155 160

Pro Phe Phe Ser Gln Pro Gly Ala Pro Ile Leu Gln Cys Met Gly Cys

165 170 175

Cys Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro Leu Arg Ser Lys Lys Thr Met

180 185 190

Leu Val Gln Lys Asn Val Thr Ser Glu Ser Thr Cys Cys Val Ala Lys

195 200 205

Ser Tyr Asn Arg Val Thr Val Met Gly Gly Phe Lys Val Glu Asn His

210 215 220

Thr Ala Cys His Cys Ser Thr Cys Tyr Tyr His Lys Ser His His His

225 230 235 240

His His His

Claims

1.一种促性腺激素重组蛋白Alu-HCG，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种如权利要求1所述的促性腺激素重组蛋白Alu-HCG的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.根据权利要求1所述的促性腺激素重组蛋白Alu-HCG，其特征在于，其编码基因的核苷酸序列SEQ ID NO：2的特异性扩增引物包括正向引物SEQ ID NO：3和反向引物SEQ IDNO：4。

4.一种重组表达载体，其特征在于，它包括核苷酸序列SEQ ID NO：2。

5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体为在载体pSecTag2 C的多克隆位点插入核苷酸序列SEQ ID NO：2得到。

6.一种重组菌，其特征在于，它包括权利要求4的重组表达载体，用于表达重组蛋白Alu-HCG。

7.一种如权利要求1所述的促性腺激素重组蛋白Alu-HCG在制备促进雌性排卵中药物中的应用。

8.一种如权利要求1所述的促性腺激素重组蛋白Alu-HCG在制备促进雌性排卵、促性腺激素的多肽药物中的应用。