WO2017159422A1 - 細胞分取装置 - Google Patents

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WO2017159422A1
WO2017159422A1 PCT/JP2017/008722 JP2017008722W WO2017159422A1 WO 2017159422 A1 WO2017159422 A1 WO 2017159422A1 JP 2017008722 W JP2017008722 W JP 2017008722W WO 2017159422 A1 WO2017159422 A1 WO 2017159422A1
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cell
flow
flow path
channel
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Inventor
臣耶 佐久間
健 早川
新井　史人
Original Assignee
国立大学法人名古屋大学
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
    • C12M47/04—Cell isolation or sorting

Definitions

  • the present invention relates to a cell sorting apparatus.
  • Cell materials differ from other materials in that there are large individual differences for each cell, so in cell biology and cell engineering, it is becoming more important to understand and manipulate / select the individual differences.
  • Patent Literature 1 describes a particle sorting system provided with a side passage communicating with a measurement conduit and a branch conduit.
  • an actuator provided in a side passage is actuated to deflect a liquid flow, and selected particles (cells) to be selected are flowed into a branch conduit for selection.
  • an object of the present invention is to provide a cell sorting apparatus capable of sorting target cells at a higher speed with a higher success rate.
  • the cell sorting apparatus is configured to flow in a cell separation region in which a liquid containing a substrate and a cell array including the target cell flows and separates the target cell from the cell array.
  • the separation liquid is the The pair of liquid flow generating members so as to form a liquid flow in a first direction from the one end of the flow path toward the other end and a liquid flow in a second direction opposite to the first direction. Are operated in conjunction with each other.
  • the cell sorting apparatus has a sub-flow path through which the separation liquid flows, intersecting with the main flow path through which the liquid containing the target cells flows. Since the separation liquid can flow in the sub channel in both directions, the target cells can be efficiently separated.
  • the liquid flow of the separation liquid in the sub flow path is generated by a pair of liquid flow generating members provided at both ends of the sub flow path. Since the pair of liquid flow generating members operate in conjunction with each other, target cells can be separated at a higher speed. When separating the target cells, the liquid flow of the separation liquid does not excessively disturb the flow of the liquid flowing through the main flow path.
  • the target cells can be sorted at a higher speed.
  • FIG. 7A is a schematic diagram for explaining the liquid flow of the separation liquid inside the sub-channel
  • FIG. 7A shows the liquid flow in the first direction
  • FIG. 7B shows the liquid flow in the second direction.
  • a cell sorting apparatus 10 shown in FIG. 1 is connected to a substrate 12 having a flow path formed therein, a pair of liquid flow generating members 22 disposed on the substrate 12, and a pair of liquid flow generating members 22. And a drive control member 23.
  • the substrate 12 includes a flow path layer 34, a support layer 36 provided on the lower surface of the flow path layer 34, and a deformable coating layer 38 that covers the upper surface of the flow path layer 34.
  • the thickness of the substrate 12 can be set to, for example, about 0.3 to 2 mm.
  • the flow path layer 34 is made of silicon.
  • the flow path layer 34 is formed with the main flow path 14 through which a liquid (not shown) containing a cell row containing target cells flows.
  • the width of the main channel 14 can be appropriately set according to the size of the cells contained in the liquid. For example, when the cell size is about 50 to 100 ⁇ m, the width of the main channel 14 can be about 50 to 500 ⁇ m.
  • the liquid containing the cell train including the target cell can circulate in the main channel 14 at a flow rate of about 0.01 to 10 m / sec.
  • the flow rate of the liquid flowing through the main channel 14 can be controlled by, for example, a syringe pump, a rotary pump, a centrifugal pump, a pneumatic pump, or the like (not shown).
  • the main channel 14 has a sample inlet 24 into which a liquid containing target cells is injected at the upstream end.
  • a disposal port 32 for collecting non-target cells is provided at the downstream end of the main channel 14.
  • the sample injection port 24 and the disposal port 32 are substantially circular holes having a diameter of about 1.5 mm.
  • the main channel 14 has a cell separation region (not shown) for separating the target cell from the cell row in the middle of the flow direction.
  • a sub flow channel 18 is formed so as to intersect the main flow channel 14 in the cell separation region.
  • a separation liquid (hereinafter also referred to as a buffer solution) for separating the target cell from the cell array flows in the sub-flow path 18.
  • the first liquid reservoir 20a and the second liquid reservoir 20b are respectively provided at one end and the other end of the sub flow path 18.
  • a pair of liquid flow generating members 22 are disposed above the first and second liquid reservoirs 20a and 20b.
  • the size and shape of the first and second liquid reservoirs 20a and 20b should be appropriately set according to the size and shape of the liquid flow generating member so that the action of the pair of liquid flow generating members 22 is sufficiently transmitted. Is desired.
  • the distance between the first liquid reservoir 20a and the second liquid reservoir 20b is It can be about 0.1 to 10 mm.
  • the sorting channel 16 is branched from the main channel 14.
  • the target cell separated from the cell row in the cell separation region is pushed out to the sorting channel 16.
  • the width of the sorting channel 16 can be appropriately selected according to the size of the target cell.
  • the distance from the cell separation region to the sorting channel 16 can also be appropriately selected according to the size of the target cell.
  • the sorting channel 16 is composed of two branch channels (a first branch channel 16a and a second branch channel 16b). First and second branch flow paths 16a. 16b is provided symmetrically on both sides of the main flow path 14, and merges downstream.
  • a sorting port 30 for collecting target cells is provided at the downstream end of the sorting channel 16 where the first and second branch channels 16a and 16b merge.
  • the sorting port 30 is a substantially circular opening having a diameter of about 1.5 mm.
  • the flow path layer 34 is further provided with a sheath liquid inlet 26, a sheath liquid path 27, a buffer liquid inlet 28, and a buffer liquid path 29.
  • the sheath liquid inlet 26 and the buffer liquid inlet 28 are substantially circular holes having a diameter of about 1.5 mm.
  • the sheath liquid is supplied to the main flow path 14 via the sheath liquid flow path 27, and wraps and conveys the cells. By supplying the sheath liquid, the cells in the liquid are aligned in the flow direction to form a cell row.
  • the buffer solution is supplied to the first and second liquid reservoirs 20 a and 20 b at both ends of the sub-channel 18 through the buffer channel 29.
  • the buffer circulates in the subchannel 18 between the first liquid reservoir 20a and the second liquid reservoir 20b as a separation liquid for separating the target cells.
  • the sheath liquid and the buffer solution As the sheath liquid and the buffer solution, the same liquid as the liquid flowing through the main channel 14 can be used. A liquid different from the liquid flowing through the main flow path 14 may be used as the sheath liquid and the buffer liquid as long as the target cells are not adversely affected.
  • the thickness of the flow path layer 34 is not particularly limited.
  • the thickness of the flow path layer 34 can be set to, for example, about 0.1 to 0.5 mm.
  • the covering layer 38 is preferably elastically deformable.
  • the coating layer 38 is made of borosilicate glass.
  • the coating layer 38 is provided with a sample injection port 24, a sheath liquid injection port 26, a buffer solution injection port 28, a sorting port 30, and a disposal port 32 so as to coincide with each other when laminated with the flow path layer 34. ing.
  • the sample, sheath liquid, and buffer solution can be injected into the respective injection ports (sample injection port 24, sheath liquid injection port 26, buffer solution injection port 28) from the coating layer 38 side of the substrate 12.
  • the target cells collected in the sorting port 30 can be collected from the coating layer 38 side.
  • the covering layer 38 is preferably as thin as possible within a range in which strength and elasticity can be maintained.
  • the thickness of the coating layer 38 can be set to, for example, about 0.1 to 1 mm.
  • the support layer 36 is a plate-like member having a flat surface and is not particularly processed.
  • the support layer 36 is made of borosilicate glass.
  • the support layer 36 can be formed in any thickness as long as it can support the flow path layer 34 and the coating layer 38.
  • the pair of liquid flow generating members 22 includes a first liquid flow generating member 22a provided on the surface of the substrate 12 on the first liquid reservoir 20a and a first liquid flow generating member 22 provided on the surface of the substrate 12 on the second liquid reservoir 20b. 2 liquid flow generating members 22b.
  • the pair of liquid flow generating members 22 operate in conjunction with a drive signal from the drive control member 23 (see FIG. 1).
  • a first-direction liquid flow from the first liquid reservoir 20a toward the second liquid reservoir 20b and a second-direction liquid flow from the second liquid reservoir 20b toward the first liquid reservoir 20a, and Is generated inside the sub-flow path 18.
  • piezoelectric elements are used as the first liquid flow generating member 22a and the second liquid flow generating member 22b.
  • a piezoelectric actuator (model number: PAC166J) manufactured by Nippon Ceratech Co., Ltd. is used as the piezoelectric element.
  • a drive signal is sent to each of the first liquid flow generating member 22a and the second liquid flow generating member 22b from a high voltage power source (not shown).
  • a high-voltage power source (model number: HAS-4014) manufactured by NF Circuit Design Block Co., Ltd. is used.
  • a control signal is sent from the drive control member 23 to the pair of high voltage power sources.
  • a function generator (model number: WF1968) manufactured by NF Circuit Design Block Co., Ltd. is used as the drive control member 23.
  • a liquid containing a cell row containing target cells flows through the main flow path 14.
  • the cell array includes non-target cells as well as target cells. As shown in FIG. 3, the non-target cells 42 among the cells included in the cell row in the liquid 40 are transported downstream of the main flow path 14 and collected in the waste port 32 (see FIG. 1).
  • first and second liquid flow generating members 22 a and 22 b are provided at one end and the other end of the auxiliary flow path 18.
  • the first liquid flow generating member 22a on the one end 18a side receives the signal from the drive control member 23, and the first liquid pool 20a is separated.
  • a part of the working liquid acts to be pushed toward the second liquid reservoir 20b.
  • the second liquid flow generating member 22b on the side of the other end 18b acts to draw a part of the separation liquid in the first liquid reservoir 20a toward the second liquid reservoir 20b.
  • a part of the separation liquid in the first liquid reservoir 20a is pushed into the sub-flow path 18 and further pulled toward the second liquid reservoir 20b.
  • a liquid flow of the separation liquid is generated from the one end 18a side to the other end 18b side of the sub flow path 18 and crosses the liquid 40 flowing through the main flow path 14.
  • the target cell 42a deviates from the cell row in the cell separation region 13 where the main flow path 14 and the sub flow path 18 intersect, and is pushed out to the second branch flow path 16b.
  • the target cell 42a pushed out to the second branch channel 16b is collected in the sorting port 30 (see FIG. 1).
  • a liquid flow (not shown) of the separation liquid is generated from the other end 18b of the sub-channel 18 toward the one end 18a in the second direction opposite to the first direction.
  • the second liquid flow generation member 22b on the other end 18b side removes a part of the separation liquid in the second liquid reservoir 20b. It acts to push in toward the liquid reservoir 20a.
  • the first liquid flow generating member 22a on the one end 18a side acts to draw a part of the separation liquid in the second liquid reservoir 20b toward the first liquid reservoir 20a.
  • the separation liquid in the second liquid reservoir 20b is pushed into the sub-channel 18 and further pulled toward the first liquid reservoir 20a.
  • the cell sorting apparatus 10 it is ideal that all of the plurality of cells collected in the sorting port 30 are target cells 42 a and the non-target cells 42 are collected in the waste port 32. If the probability of separating the target cell 42a from the cell row is high, the ratio of the target cell 42a in the plurality of sorted cells is increased. In order to separate the adjacent non-target cell 42 and the target cell 42a, a predetermined interval is required between these two cells.
  • the shortest distance at which the non-target cell 42 and the target cell 42a can be separated is shown in FIG. 6 as the spatial resolution SR. As the distance of the spatial resolution SR is shorter, the target cell 42a can be separated in a state where a plurality of cells are arranged close to each other. Accordingly, the sorting throughput of the target cell 42a is improved.
  • the separation liquid is pushed and drawn in the first and second liquid reservoirs 20 a and 20 b at both ends of the sub-channel 18. It is generated by being done. Since the separation liquid is pushed in and pulled out in the auxiliary flow path 18, the range in which the pressure propagates to the liquid 40 flowing in the main flow path 14 when the liquid flow of the separation liquid crosses the main flow path 14 is limited. Is done. The flow of the liquid 40 flowing through the main flow path 14 due to the liquid flow of the separation liquid affects the area where the main flow path 14 and the sub flow path 18 intersect and the vicinity thereof.
  • the target cell 42a can be separated from the cell array without interfering with other cells upstream and downstream of the cell separation region 13. As a result, the shortest distance at which the target cell 42a can be separated from the non-target cell 42 is shortened, leading to an improvement in the spatial resolution SR.
  • the amount of the separation liquid pushed into the sub-channel 18 can be made equal to the amount of the separation liquid drawn out from the sub-channel 18.
  • the amount of the separation liquid flowing into the cell separation region 13 is equal to the amount of the separation liquid flowing out from the cell separation region 13. This makes it possible to limit the region that affects the flow of the liquid flowing through the main flow channel 14 to only a region where the main flow channel 14 and the sub flow channel 18 intersect each other.
  • the sub-flow channel 18 that intersects the main flow channel 14 there are two directions of liquid flow, a first direction from the one end 18a to the other end 18b and a second direction from the other end 18b to the one end 18a. Can be generated.
  • the target cell 42a is recognized, the liquid flow of the separation liquid crosses the main channel 14 in either direction, so that the target cell 42a in the cell row is placed in one of the two branch channels 16a and 16b. Led.
  • the target cell 42 a is not recognized, the liquid flow of the separation liquid does not cross the main channel 14, so that the non-target cell 42 in the cell row is conveyed downstream of the main channel 14.
  • the direction of the liquid flow of the separation liquid inside the sub-channel 18 is changed every time the target cells 42a are recognized. Change. Since the target cell 42a is guided to one of the two branch flow paths 16a and 16b, it can be reliably collected in the sorting port 30. As a result, the target cells 42a can be sorted with a higher success rate.
  • the drive control member 23 operates the pair of liquid flow generation members 22 in conjunction with each other.
  • the coating layer 38 on the first liquid reservoir 20a is pressed downward to be concave.
  • a voltage is applied in advance to the second liquid flow generating member (piezoelectric element) 22b, and the coating layer 38 on the second liquid reservoir 20b is pressed downward to form a concave shape.
  • the voltage application to the second liquid flow generation member 22b is released.
  • the shape of the coating layer 38 on the second liquid reservoir 20b that has been recessed is restored by elasticity.
  • the separation liquid is pushed into the secondary flow path 18 from the first liquid reservoir 20a, and a force for drawing the separation liquid from the secondary flow path 18 to the second liquid reservoir 20b acts.
  • a liquid flow of the separation liquid is generated in the first direction from one end to the other end in about 10 to 500 ⁇ s.
  • the target cell 42 a in the liquid 40 flowing in the main flow path 14 is second as shown in FIG. 4. Is pushed out into the branch flow path 16b.
  • the liquid flow of the separation liquid can be generated within the sub-channel 18 within about 1 ⁇ s from the recognition of the target cell 42a.
  • the liquid flow of the separation liquid has a flow rate of about 0.01 to 10 m / s.
  • the separation liquid is pushed into the secondary flow path 18 from the second liquid reservoir 20b, and a force for pulling the separation liquid from the secondary flow path 18 to the first liquid reservoir 20a acts.
  • a liquid flow of the separation liquid is generated in a second direction opposite to the first direction for about 10 to 500 ⁇ s.
  • the target cell 42 a in the liquid 40 flowing in the main flow path 14 is in the first direction as shown in FIG. 5. It is pushed out into the branch flow path 16a.
  • the liquid flow of the separation liquid is generated in the first direction in the first direction in the first direction.
  • the target cell 42a is pushed out to the second branch channel 16b.
  • the piezoelectric elements as the liquid flow generating members 22a and 22b are provided on the surface of the substrate 12 on the liquid reservoirs 20a and 20b at both ends of the sub flow path 18, so that the liquid for separation is highly responsive inside the sub flow path 18. It became possible to generate the liquid flow.
  • a first-direction liquid flow from one end to the other end of the sub-channel 18 and a second-direction liquid flow opposite to the first direction are formed.
  • the pair of liquid flow generating members 22 in conjunction with each other, it becomes possible to sort the target cells 42a at a higher speed with a higher success rate.
  • the present invention is not limited to the above-described embodiment, and can be appropriately changed within the scope of the gist of the present invention.
  • borosilicate glass is used as the material of the covering layer 38 in the substrate 12, but it can be changed to another material having elasticity.
  • the material of the coating layer 38 for example, other glass selected from blue plate glass, white plate glass, non-alkali glass, synthetic quartz glass, and alumina borate glass can be used. Further, quartz, quartz, silicon, silicon carbide, sapphire, or gallium nitride may be used as the coating layer 38.
  • the coating layer 38 can be formed of a piezoelectric material, a resin, or a metal. Examples of the piezoelectric material include artificial ceramics such as lead zirconate titanate and lithium niobate.
  • Examples of the resin include polydimethylsiloxane, polymethyl methacrylate resin, polytetrafluoroethylene, polypropylene, and polyvinyl chloride.
  • Examples of the metal include aluminum, stainless steel, brass, titanium, and other alloys. These materials can also be used as the support layer 36.
  • the material of the flow path layer 34 is selected from, for example, a glass material such as borosilicate glass, a resin material such as polydimethylsiloxane, polymethyl methacrylate resin, polytetrafluoroethylene, polypropylene, and polyvinyl chloride, and a thin film metal material. be able to.
  • the two branch channels 16a and 16b provided in the channel layer 34 and constituting the sorting channel 16 do not necessarily have to be joined downstream.
  • the target cell 42a can be collected by providing the sorting port 30 at the downstream end of each of the first branch channel 16a and the second branch channel 16b.
  • each flow path main flow path 14, sub flow path 18, sorting flow path 16
  • each inlet sample inlet 24, sheath liquid inlet 26, buffer inlet 28
  • each port sorting port 30
  • the size and shape of the disposal port 32) can be appropriately set in consideration of the size and type of the target cell, the size of the entire cell sorting apparatus, and the like.
  • piezoelectric actuators are used as the first and second liquid flow generating members 22a and 22b.
  • Arbitrary members that generate a liquid flow in the sub-channel 18 by being driven in conjunction with each other are used as the first and second liquid-flow generating members 22a and 22b and are arranged at both ends of the sub-channel 18 Can do.
  • the liquid flow generating members 22a and 22b other types of actuators selected from, for example, electromagnetic actuators, electrostatic actuators, thermal actuators, pneumatic actuators, hydraulic actuators, and ultrasonic actuators can be used.
  • a syringe pump may be used as the first and second liquid flow generating members 22a and 22b.
  • the drive control member 23 that operates the pair of liquid flow generation members 22 can be appropriately selected according to the liquid flow generation members 22a and 22b.
  • the pushing and withdrawing of the separation liquid do not necessarily have to be performed in perfect agreement, and there may be a difference of about 1 to 100 ⁇ s in the start timing of each.
  • the separation liquid can be drawn before the separation liquid is pushed.
  • a sub flow path 18 through which the liquid flow of the separation liquid flows in two directions is provided to intersect with the main flow path 14, and a pair of liquid flow generating members 22 that operate in conjunction with each other are disposed at both ends of the sub flow path 18. If so, the effect of the present invention can be obtained.

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Abstract

基板(12)に形成され、目的細胞を含む細胞列を含有する液体が流通し、目的細胞を細胞列から分離する細胞分離領域を流れ方向の途中に備えた主流路(14)と、細胞分離領域の下流で主流路から分岐して基板に形成され、目的細胞が主流路から押し出される選別流路(16)と、細胞分離領域で主流路と交差して基板に形成され、目的細胞を細胞列から分離して選別流路へ押し出す分離用液体が流通する副流路(18)と、副流路の一端および他端にそれぞれ設けられ、副流路内に分離用液体の液流を発生させる一対の液流発生部材(22)と、一対の液流発生部材を作動させる駆動制御部材(23)とを備え、駆動制御部材は、分離用液体が、副流路の一端から他端に向かう第１の向きの液流と、第１の向きとは逆の第２の向きの液流とを形成するように、一対の液流発生部材を連動して作動させることを特徴とする。

Description

細胞分取装置
　本発明は、細胞分取装置に関する。
　細胞材料は、他の材料と異なり、細胞ごとの個体差が大きいため、細胞生物学および細胞工学において、その個体差を理解し、操作・選別することの重要性が高まっている。
　ガラス等の基板にマイクロ流路を設けたマイクロチップを用い、目的の細胞を含む液体をマイクロ流路に流し、細胞の特性に応じて流路を変えて分取する技術が知られている。例えば、特許文献１には、測定導管と連通したサイド通路および分岐導管を設けた粒子選別システムが記載されている。特許文献１では、サイド通路に設けたアクチュエータを作動させて液体の流れを偏向させ、選択された対象となる粒子（細胞）を分岐導管に流入させて選別している。
特開２００８－１２２３９６号公報
　分取した細胞のうち、目的の細胞が含まれる割合（ソーティングの成功率）をより高めるとともに、目的の細胞をより高速に分取することが求められている。
　そこで本発明は、より高い成功率で、より高速に目的細胞を分取することが可能な細胞分取装置を提供することを目的とする。
　本発明に係る細胞分取装置は、基板と、前記基板に形成され、目的細胞を含む細胞列を含有する液体が流通し、前記目的細胞を前記細胞列から分離する細胞分離領域を流れ方向の途中に備えた主流路と、前記細胞分離領域の下流で前記主流路から分岐して前記基板に形成され、前記目的細胞が前記主流路から押し出される選別流路と、前記細胞分離領域において前記主流路と交差して前記基板に形成され、前記目的細胞を前記細胞列から分離して前記選別流路へ押し出す分離用液体が流通する副流路と、前記副流路の一端および他端にそれぞれ設けられ、前記副流路内に前記分離用液体の液流を発生させる一対の液流発生部材と、前記一対の液流発生部材を作動させる駆動制御部材とを備え、前記駆動制御部材は、前記分離用液体が、前記副流路の前記一端から前記他端に向かう第１の向きの液流と、前記第１の向きとは逆の第２の向きの液流とを形成するように、前記一対の液流発生部材を連動して作動させることを特徴とする。
　本発明によれば、細胞分取装置は、目的細胞を含んだ液体が流れる主流路と交差して、分離用液体が流通する副流路を有している。分離用液体は、副流路内部を両方向に流通することができるので、目的細胞を効率よく分離することができる。
　副流路内における分離用液体の液流は、副流路の両端に設けられた一対の液流発生部材によって発生する。一対の液流発生部材は連動して作動することから、より高速に目的細胞を分離することができる。目的細胞を分離する際、分離用液体の液流は、主流路を流通する液体の流れを過度に乱すことはない。
　このように、主流路と交差する副流路の両端に、連動して作動する一対の液流発生部材を設けて、分離用液体の液流を両方向に発生させることによって、より高い成功率で、より高速に目的細胞を分取することができる。
実施形態に係る細胞分取装置の構成を説明する斜視図である。 実施形態に係る細胞分取装置における基板の構成を説明する分解斜視図である。 細胞分取装置内での非目的細胞の流れを説明する模式図である。 細胞分取装置内での目的細胞の流れの一例を説明する模式図である。 細胞分取装置内での目的細胞の流れの他の例を説明する模式図である。 空間分解能（ＳＲ）を説明する模式図である。 副流路内部での分離用液体の液流を説明する模式図であり、図７Ａは第１の向きの液流、図７Ｂは第２の向きの液流を示す。
　以下、図面を参照して本発明の実施形態について詳細に説明する。
（全体構成）
　図１に示す細胞分取装置１０は、内部に流路が形成された基板１２と、基板１２上に配置された一対の液流発生部材２２と、一対の液流発生部材２２に接続された駆動制御部材２３とを備えている。基板１２は、図２に示すように、流路層３４と、流路層３４の下面に設けられた支持層３６と、流路層３４の上面を覆う変形可能な被覆層３８とから構成される。基板１２の厚さは、例えば０．３～２ｍｍ程度とすることができる。
　本実施形態においては、流路層３４はシリコン製である。流路層３４には、目的細胞を含む細胞列を含有する液体（図示せず）が流通する主流路１４が形成されている。主流路１４の幅は、液体に含まれる細胞の大きさに応じて適宜設定することができる。例えば、細胞の大きさが５０～１００μｍ程度の場合には、主流路１４の幅は５０～５００μｍ程度とすることができる。この場合、目的細胞を含む細胞列を含有する液体は、０．０１～１０ｍ／ｓｅｃ程度の流速で主流路１４内を流通することができる。主流路１４内を流通する液体の流速は、例えば図示しないシリンジポンプ、ロータリーポンプ、遠心ポンプ、あるいは空気圧ポンプ等によって制御することができる。
　主流路１４は、目的細胞を含む液体が注入されるサンプル注入口２４を、上流端部に有している。主流路１４の下流端部には、非目的細胞を回収する廃棄ポート３２が設けられている。本実施形態においては、サンプル注入口２４および廃棄ポート３２は、直径１．５ｍｍ程度の略円形の開孔である。また、主流路１４は、目的細胞を細胞列から分離するための細胞分離領域（図示せず）を流れ方向の途中に有している。
　流路層３４には、細胞分離領域で主流路１４と交差するように、副流路１８が形成されている。副流路１８内には、目的細胞を細胞列から分離するための分離用液体（以下、緩衝液とも称する）が流通する。
　副流路１８の一端および他端には、第１の液溜り２０ａおよび第２の液溜り２０ｂがそれぞれ設けられている。本実施形態においては、後述するように第１，第２の液溜り２０ａ，２０ｂの上方に一対の液流発生部材２２が配置される。第１，第２の液溜り２０ａ，２０ｂの大きさや形状は、一対の液流発生部材２２の作用が十分に伝達するように、液流発生部材の大きさや形状に応じて適切に設定することが望まれる。
　第１の液溜り２０ａと第２の液溜り２０ｂとの間の距離は、短いほど好ましい。例えば、主流路１４の幅が１００～２００μｍ程度で、副流路１８の幅が５０～２００μｍ程度の場合には、第１の液溜り２０ａと第２の液溜り２０ｂとの間の距離は、０．１～１０ｍｍ程度とすることができる。
　細胞分離領域の下流では、選別流路１６が主流路１４から分岐している。選別流路１６には、細胞分離領域で細胞列から分離された目的細胞が押し出される。選別流路１６の幅は、目的細胞の大きさに応じて適宜選択することができる。細胞分離領域から選別流路１６までの距離もまた、目的細胞の大きさ等に応じて適宜選択することができる。本実施形態においては、選別流路１６は、２つの分岐流路（第１の分岐流路１６ａと第２の分岐流路１６ｂ）から構成される。第１，第２の分岐流路１６ａ．１６ｂは、主流路１４の両側に対称に設けられ、下流で合流している。
　第１，第２の分岐流路１６ａ，１６ｂが合流した選別流路１６の下流端部には、目的細胞を回収する分取ポート３０が設けられている。本実施形態においては、分取ポート３０は、直径１．５ｍｍ程度の略円形の開孔である。
　流路層３４には、シース液注入口２６、シース液流路２７、緩衝液注入口２８、および緩衝液流路２９がさらに設けられている。本実施形態においては、シース液注入口２６および緩衝液注入口２８は、直径１．５ｍｍ程度の略円形の開孔である。シース液は、シース液流路２７を介して主流路１４に供給され、細胞を包み込んで搬送する。シース液が供給されることにより、液体中の細胞が流れ方向に沿って整列して細胞列が形成される。緩衝液は、緩衝液流路２９を介して副流路１８の両端の第１，第２の液溜り２０ａ，２０ｂに供給される。緩衝液は、目的細胞を分離するための分離用液体として、第１の液溜り２０ａと第２の液溜り２０ｂとの間の副流路１８の内部を流通する。
　シース液および緩衝液としては、主流路１４を流通する液体と同様の液体を用いることができる。目的細胞に悪影響を及ぼさなければ、主流路１４を流通する液体とは異なる液体を、シース液および緩衝液として用いてもよい。
　上述したような流路（主流路１４、副流路１８、選別流路１６）、注入口（サンプル注入口２４、シース液注入口２６、緩衝液注入口２８）、ポート（分取ポート３０、廃棄ポート３２）が形成できれば、流路層３４の厚さは特に限定されない。流路層３４の厚さは、例えば０．１～０．５ｍｍ程度とすることができる。
　被覆層３８は、弾性変形可能であることが好ましい。本実施形態においては、被覆層３８はホウケイ酸ガラス製である。被覆層３８には、流路層３４と積層された際に一致するように、サンプル注入口２４、シース液注入口２６、緩衝液注入口２８、分取ポート３０、および廃棄ポート３２が設けられている。これによって、基板１２の被覆層３８側から、サンプル、シース液、緩衝液をそれぞれの注入口（サンプル注入口２４、シース液注入口２６、緩衝液注入口２８）に注入することができる。分取ポート３０内に回収された目的細胞は、被覆層３８側から採取することができる。
　被覆層３８は、強度および弾性が維持できる範囲で、可能な限り薄いことが好ましい。被覆層３８の厚さは、例えば０．１～１ｍｍ程度とすることができる。
　支持層３６は、平坦な表面を有する板状部材であり、特に加工は施されていない。本実施形態においては、支持層３６は、ホウケイ酸ガラス製である。支持層３６は、流路層３４および被覆層３８を支持可能であれば、任意の厚さで形成することができる。
　一対の液流発生部材２２は、第１の液溜り２０ａ上で基板１２表面に設けられた第１の液流発生部材２２ａと、第２の液溜り２０ｂ上で基板１２表面に設けられた第２の液流発生部材２２ｂとから構成される。一対の液流発生部材２２は、駆動制御部材２３（図１参照）からの駆動信号により連動して作動する。これによって、第１の液溜り２０ａから第２の液溜り２０ｂに向かう第１の向きの液流と、第２の液溜り２０ｂから第１の液溜り２０ａに向かう第２の向きの液流とを、副流路１８の内部に発生させる。
　本実施形態においては、第１の液流発生部材２２ａ，第２の液流発生部材２２ｂとしては、圧電素子を用いる。具体的には、圧電素子としては、（株）日本セラテック製の圧電アクチュエータ（型番：ＰＡＣ１６６Ｊ）を用いる。第１の液流発生部材２２ａ，第２の液流発生部材２２ｂのそれぞれには、図示しない高電圧電源から駆動信号が送られる。高電圧電源としては、（株）エヌエフ回路設計ブロック製の（型番：ＨＡＳ－４０１４）を用いる。
　一対の高電圧電源には、駆動制御部材２３から制御信号が送られる。本実施形態においては、駆動制御部材２３としては、（株）エヌエフ回路設計ブロック製のファンクションジェネレータ（型番：ＷＦ１９６８）を用いる。
（作用および効果）
　上記のように構成された細胞分取装置１０においては、目的細胞を含む細胞列を含有する液体が主流路１４内部を流通する。細胞列には、目的細胞とともに非目的細胞も含まれている。図３に示すように、液体４０中の細胞列に含まれる細胞のうちの非目的細胞４２は、主流路１４の下流に搬送されて廃棄ポート３２（図１参照）に回収される。
　液体４０に含まれる細胞列の中に目的細胞４２ａが認識された場合には、例えば図４に示すように、副流路１８の一端１８ａ側から他端１８ｂ側に向かう第１の向きで、分離用液体の液流（図示せず）が発生する。
　図１に示したように、副流路１８の一端および他端には、第１，第２の液流発生部材２２ａ，２２ｂが設けられている。細胞列の中に目的細胞４２ａが認識された際には、駆動制御部材２３からの信号を受けて、一端１８ａ側の第１の液流発生部材２２ａが、第１の液溜り２０ａ内の分離用液体の一部を、第２の液溜り２０ｂに向けて押し込むように作用する。これと連動して、他端１８ｂ側の第２の液流発生部材２２ｂが、第１の液溜り２０ａ内の分離用液体の一部を、第２の液溜り２０ｂに向けて引き出すように作用する。第１の液溜り２０ａ内の分離用液体の一部は、副流路１８内に押し込まれ、さらに第２の液溜り２０ｂ側に引っ張られることになる。
　このようにして、副流路１８の一端１８ａ側から他端１８ｂ側に向かう分離用液体の液流が発生し、主流路１４を流通する液体４０を横切る。その結果、目的細胞４２ａは、主流路１４と副流路１８とが交差する細胞分離領域１３で細胞列から逸れて、第２の分岐流路１６ｂに押し出される。第２の分岐流路１６ｂに押し出された目的細胞４２ａは、分取ポート３０（図１参照）に回収される。
　あるいは、図５に示すように第１の向きとは逆の第２の向きで、副流路１８の他端１８ｂから一端１８ａに向けて分離用液体の液流（図示せず）が発生する。この場合には、駆動制御部材２３からの信号を受けて、他端１８ｂ側の第２の液流発生部材２２ｂが、第２の液溜り２０ｂ内の分離用液体の一部を、第１の液溜り２０ａに向けて押し込むように作用する。これと連動して、一端１８ａ側の第１の液流発生部材２２ａが、第２の液溜り２０ｂ内の分離用液体の一部を、第１の液溜り２０ａに向けて引き出すように作用する。第２の液溜り２０ｂ内の分離用液体は、副流路１８内に押し込まれ、さらに第１の液溜り２０ａ側に引っ張られることになる。
　このようにして、副流路１８の他端１８ｂ側から一端１８ａ側に向かう分離用液体の液流が発生し、主流路１４を流通する液体４０を横切る。その結果、目的細胞４２ａは、細胞分離領域１３で細胞列から逸れて、第１の分岐流路１６ａに押し出される。第１の分岐流路１６ａに押し出された目的細胞４２ａもまた、分取ポート３０（図１参照）に回収される。
　細胞分取装置１０においては、分取ポート３０に回収された複数の細胞の全てが目的細胞４２ａであって、非目的細胞４２は廃棄ポート３２に回収されることが理想的である。目的細胞４２ａを細胞列から分離する確率が高ければ、分取した複数の細胞における目的細胞４２ａの割合は高められる。隣接する非目的細胞４２と目的細胞４２ａとを分離するには、これらの２つの細胞の間に所定の間隔が必要とされる。ここで、非目的細胞４２と目的細胞４２ａとを分離できる最短の距離を、空間分解能ＳＲとして図６に示す。空間分解能ＳＲの距離が短いほど、複数の細胞が近接して並んだ状態で目的細胞４２ａを分離することができる。したがって、目的細胞４２ａの分取のスループットが向上する。
　上述したように、副流路１８内部における分離用液体の液流は、副流路１８の両端の第１，第２の液溜り２０ａ，２０ｂにおいて、分離用液体の押し込みと引き出しとが連動して行なわれることによって発生する。副流路１８で分離用液体の押し込みとともに引き出しが行なわれているので、分離用液体の液流が主流路１４を横切る際、主流路１４内を流通する液体４０に圧力が伝播する範囲は制限される。分離用液体の液流によって主流路１４内を流通する液体４０の流れに影響が及ぶのは、主流路１４と副流路１８とが交差する領域およびその近傍となる。
　このような分離用液体の液流が用いられるので、細胞分離領域１３の上流側および下流側の他の細胞に干渉することなく、目的細胞４２ａを細胞列から分離することができる。その結果、目的細胞４２ａを非目的細胞４２から分離できる最短の距離は短くなり、空間分解能ＳＲの向上につながる。
　なお、一対の液流発生部材２２を制御することによって、副流路１８内に押し込まれる分離用液体の量と、副流路１８から引き出される分離用液体の量とを等しくすることができる。この場合には、細胞分離領域１３に流入する分離用液体の量と、細胞分離領域１３から流出する分離用液体の量とが等しくなる。これによって、主流路１４内を流通する液体の流れに影響を及ぼす領域を、実質的に主流路１４と副流路１８とが交差する領域のみに制限することが可能となる。
　しかも、主流路１４と交差する副流路１８の内部には、一端１８ａから他端１８ｂに向かう第１の方向と、他端１８ｂから一端１８ａに向かう第２の方向との２方向の液流を発生させることができる。目的細胞４２ａが認識されると、分離用液体の液流がいずれかの方向で主流路１４を横切り、これによって、細胞列中の目的細胞４２ａが２つの分岐流路１６ａ，１６ｂのいずれかに導かれる。目的細胞４２ａが認識されない場合には、分離用液体の液流が主流路１４を横切らないので、細胞列中の非目的細胞４２は主流路１４の下流に搬送される。
　例えば、細胞列の中に目的細胞４２ａが２つ以上連続して認識された場合には、目的細胞４２ａが認識される毎に、副流路１８の内部の分離用液体の液流の向きを変化させる。目的細胞４２ａは、２つの分岐流路１６ａ，１６ｂのいずれかに導かれるので、確実に分取ポート３０に回収することができる。その結果、より高い成功率で目的細胞４２ａを分取することが可能となる。
　液流発生部材２２ａ，２２ｂとして圧電素子を用いることによって、副流路１８内部に、応答性よく分離用液体の液流を発生させることができる。上述したとおり、細胞分取装置１０においては、目的細胞４２ａが認識されると、駆動制御部材２３は、一対の液流発生部材２２を連動して作動させる。
　例えば、図７Ａに示すように、第１の液流発生部材（圧電素子）２２ａに電圧が印加されると、第１の液溜り２０ａ上の被覆層３８が下向きに押し付けられて凹状となる。図面には示されていないが、第２の液流発生部材（圧電素子）２２ｂには、予め電圧を印加して、第２の液溜り２０ｂ上の被覆層３８を下向きに押し付けて凹状としておく。第１の液流発生部材２２ａへの電圧印加と連動して、第２の液流発生部材２２ｂへの電圧印加が解除される。凹状となっていた第２の液溜り２０ｂ上の被覆層３８は、弾性により形状が復元する。
　この瞬間、第１の液溜り２０ａから副流路１８内に分離用液体が押し込まれるとともに、分離用液体を副流路１８から第２の液溜り２０ｂに引き出す力が作用する。副流路１８の内部には、一端から他端に向かう第１の向きで分離用液体の液流が１０～５００μｓ程度発生する。副流路１８の内部に第１の向きで分離用液体の液流が発生することによって、図４に示したように、主流路１４内を流通する液体４０中の目的細胞４２ａは、第２の分岐流路１６ｂに押し出される。
　液流発生部材２２ａ，２２ｂとして圧電素子を用いているので、目的細胞４２ａの認識から１μｓ程度以内で、副流路１８内部に分離用液体の液流を発生させることができる。分離用液体の液流は、０．０１～１０ｍ／ｓ程度の流速を有する。
　次の目的細胞４２ａが認識されるまでは、液流発生部材２２ａ，２２ｂには駆動制御部材２３からの信号が送られないので、そのまま待機状態となる。引き続き、目的細胞４２ａ（図示せず）が認識されると、図７Ｂに示すように第１の液流発生部材２２ａへの電圧印加が解除され、これと連動して第２の液流発生部材２２ｂに電圧が印加される。第１の液溜り２０ａ上では、弾性により被覆層３８の形状が復元し、第２の液溜り２０ｂ上の被覆層３８は下向きに押し付けられて凹状となる。
　この瞬間、第２の液溜り２０ｂから副流路１８内に分離用液体が押し込まれるとともに、分離用液体を副流路１８から第１の液溜り２０ａに引き出す力が作用する。副流路１８の内部には、第１の向きとは逆の第２の向きで分離用液体の液流が１０～５００μｓ程度発生する。副流路１８の内部に第２の向きで分離用液体の液流が発生することによって、図５に示したように、主流路１４内を流通する液体４０中の目的細胞４２ａは、第１の分岐流路１６ａに押し出される。
　再度、目的細胞４２ａが認識された場合には、図７Ａを参照して説明したように、第１の向きで副流路１８内部に分離用液体の液流が第１の向きで発生して、目的細胞４２ａは第２の分岐流路１６ｂに押し出される。
　液流発生部材２２ａ，２２ｂとしての圧電素子を、副流路１８の両端の液溜り２０ａ，２０ｂ上の基板１２の表面に設けたことによって、副流路１８内部に高い応答性で分離用液体の液流を発生させることが可能となった。
　上述したように、本実施形態においては、副流路１８の一端から他端に向かう第１の向きの液流と、第１の向きとは逆の第２の向きの液流が形成されるように、一対の液流発生部材２２を連動して作動させることによって、より高い成功率で、より高速に目的細胞４２ａを分取することが可能となった。
（変形例）
　本発明は上記実施形態に限定されるものではなく、本発明の趣旨の範囲内で適宜変更することが可能である。
　上記実施形態においては、基板１２における被覆層３８の材料としてホウケイ酸ガラスを用いたが、弾性を有する他の材料に変更することができる。被覆層３８の材料は、例えば、青板ガラス、白板ガラス、無アルカリガラス、合成石英ガラス、およびアルミナホウ酸ガラスから選択される他のガラスを用いることもできる。また、水晶、石英、シリコン、シリコンカーバイド、サファイア、またはガリウムナイトライドを、被覆層３８として用いてもよい。さらには、圧電材料、樹脂、または金属によって被覆層３８を形成することもできる。圧電材料としては、例えば、チタン酸ジルコン酸鉛およびニオブ酸リチウム等の人工セラミックスが挙げられる。樹脂としては、例えば、ポリジメチルシロキサン、ポリメタクリル酸メチル樹脂、ポリテトラフルオロエチレン、ポリプロピレン、およびポリ塩化ビニルが挙げられる。金属としては、例えば、アルミニウム、ステンレス、真鍮、チタン、およびその他合金が挙げられる。これらの材料は、支持層３６として用いることもできる。
　基板１２における流路層３４の材料としてシリコンを用いたが、所定の流路等をパターニングできれば、他の材料に変更することができる。流路層３４の材料は、例えば、ホウケイ酸ガラス等のガラス材料やポリジメチルシロキサン、ポリメタクリル酸メチル樹脂、ポリテトラフルオロエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル等の樹脂材料、および薄膜金属材料から選択することができる。
　流路層３４に設けられて選別流路１６を構成する２つの分岐流路１６ａ，１６ｂは、必ずしも下流で合流していなくてもよい。この場合には、第１の分岐流路１６ａおよび第２の分岐流路１６ｂのそれぞれの下流端部に、分取ポート３０を設けて目的細胞４２ａを回収することができる。
　各流路（主流路１４、副流路１８、選別流路１６）の幅、各流入口（サンプル注入口２４、シース液注入口２６、緩衝液注入口２８）および各ポート（分取ポート３０、廃棄ポート３２）の大きさや形状は、目的細胞の大きさや種類、細胞分取装置全体の大きさ等を考慮して、適宜設定することができる。
　また、上記実施形態においては、第１，第２の液流発生部材２２ａ，２２ｂとして、圧電アクチュエータを用いたが、これに限定されない。連動して駆動することで副流路１８内に液流を発生する任意の部材を、第１，第２の液流発生部材２２ａ，２２ｂとして用いて、副流路１８の両端に配置することができる。液流発生部材２２ａ，２２ｂは、例えば電磁アクチュエータ、静電アクチュエータ、熱アクチュエータ、空気圧アクチュエータ、油圧アクチュエータ、超音波アクチュエータから選択される他のタイプのアクチュエータを用いることができる。さらには、シリンジポンプを第１，第２の液流発生部材２２ａ，２２ｂとして用いてもよい。
　一対の液流発生部材２２を作動させる駆動制御部材２３は、液流発生部材２２ａ，２２ｂに応じて適宜選択することができる。
　分離用液体の押し込みと引き出しは、必ずしも完全に一致して行なわれる必要はなく、それぞれの開始のタイミングに１～１００μｓ程度の差があってもよい。液流発生部材によっては、例えば、分離用液体の押し込みに先立って、分離用液体の引き出しを行なうことができる。
　分離用液体の液流が２方向に流通する副流路１８が主流路１４と交差して設けられるとともに、連動して作動する一対の液流発生部材２２が副流路１８の両端に配置されていれば、本発明の効果が得られる。
１０　　　　　　細胞分取装置
１２　　　　　　基板
１４　　　　　　主流路
１６ａ，１６ｂ　分岐流路
１８　　　　　　副流路
２２ａ，２２ｂ　液流発生部材
２３　　　　　　駆動制御部材

Claims (8)

  1. 　基板と、
    　前記基板に形成され、目的細胞を含む細胞列を含有する液体が流通し、前記目的細胞を前記細胞列から分離する細胞分離領域を流れ方向の途中に備えた主流路と、
    　前記細胞分離領域の下流で前記主流路から分岐して前記基板に形成され、前記目的細胞が前記主流路から押し出される選別流路と、
    　前記細胞分離領域において前記主流路と交差して前記基板に形成され、前記目的細胞を前記細胞列から分離して前記選別流路へ押し出す分離用液体が流通する副流路と、
    　前記副流路の一端および他端にそれぞれ設けられ、前記副流路内に前記分離用液体の液流を発生させる一対の液流発生部材と、
    　前記一対の液流発生部材を作動させる駆動制御部材と
    を備え、
    　前記駆動制御部材は、前記分離用液体が、前記副流路の前記一端から前記他端に向かう第１の向きの液流と、前記第１の向きとは逆の第２の向きの液流とを形成するように、前記一対の液流発生部材を連動して作動させる
    ことを特徴とする細胞分取装置。
  2. 　前記選別流路は、前記主流路の両側に分岐した２つの分岐流路を含むことを特徴とする請求項１記載の細胞分取装置。
  3. 　前記２つの分岐流路は、前記主流路に対して対称に設けられていることを特徴とする請求項２記載の細胞分取装置。
  4. 　前記２つの分岐流路は、下流で合流していることを特徴とする請求項２または３記載の細胞分取装置。
  5. 　前記基板は、前記主流路、前記選別流路、および前記副流路を有する流路層と、前記流路層の上面を覆って設けられた変形可能な被覆層とを含むことを特徴とする請求項１～４のいずれか１項記載の細胞分取装置。
  6. 　前記一対の液流発生部材のそれぞれは、前記被覆層の上に設けられた圧電素子であることを特徴とする請求項５記載の細胞分取装置。
  7. 　前記被覆層はホウケイ酸ガラス製であることを特徴とする請求項５または６記載の細胞分取装置。
  8. 　前記駆動制御部材は、前記細胞分離領域に流入する前記分離用液体の量と、前記細胞分離領域から流出する前記分離用液体の量とが等しくなるように前記一対の液流発生部材を作動させることを特徴とする請求項１～７のいずれか１項記載の細胞分取装置。
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