WO2017158184A2 - Antivirale immuntherapie durch membranrezeptorligation - Google Patents

Antivirale immuntherapie durch membranrezeptorligation Download PDF

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WO2017158184A2
WO2017158184A2 PCT/EP2017/056443 EP2017056443W WO2017158184A2 WO 2017158184 A2 WO2017158184 A2 WO 2017158184A2 EP 2017056443 W EP2017056443 W EP 2017056443W WO 2017158184 A2 WO2017158184 A2 WO 2017158184A2
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Marius CODREA
Sven NAHNSEN
Herwig KOPPENSTEINER
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    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen

Definitions

  • the present invention relates to a cytotoxic agent for prophylaxis and / or
  • Treatment of a viral infection adapted for selective binding to a membrane receptor of virus-infected T-lymphocytes a pharmaceutical composition containing said cytotoxic agent, the use of the cytotoxic agent for the prophylaxis and / or treatment of viral infection, a method of finding cytotoxic agents which Use of a membrane receptor of virus-infected T lymphocytes overexpressed against uninfected T lymphocytes to diagnose a viral infection, and a method of diagnosing a viral infection.
  • HIV human immunodeficiency virus
  • HIV is an enveloped virus that belongs to the family of the retroviruses and to the genus Lentiviruses.
  • An untreated HIV infection generally leads to AIDS (acquired immunodeficiency syndrome) after a different length of latency phase, usually lasting several years.
  • AIDS immunodeficiency syndrome
  • Worldwide HIV prevalence in adults aged 15-49 years was 0.8 percent in 2010. For Central and Western Europe, it was 0.2 percent. It was above average in Sub-Saharan Africa (5.0 percent) and the Caribbean (0.9 percent). In some states, such as Swaziland, Botswana or Lesotho, about one quarter of those aged 15 to 49 are infected with the HIV virus. In Germany, the prevalence of HIV in 2009 was approximately 0.1 percent.
  • HI virus To increase the HI virus requires host cells that carry the so-called CD4 receptor on the surface. These are mainly CD4-bearing T helper cells, so-called CD4 + cells or CD4 + lymphocytes.
  • the main reservoir for the HI viruses is the follicular T helper cells in the body's lymphoid follicles, which make up about 2% of the CD4 + cells.
  • Latent-infected resting CD4 + T-cells or T-memory cells are long-lasting reservoirs for HIV. These cells are responsible for the fact that, despite the currently available antiretroviral drugs, HIV can not be eradicated so far and it comes after discontinuation of therapy again and again recurrences.
  • the eligible antiviral agents must either prevent the penetration of virions into the host cells, intervene in the cell metabolism to the detriment of virus multiplication or after a possible increase in the virus in the cells to prevent the escape of new viruses from the cells.
  • these sought-after active ingredients must also be tolerable to the body metabolism, the cell structure and / or internal cell metabolism, otherwise not only, for example, the virus replication in the cells comes to a standstill, but in the worst case, the (cell) life of the entire treated organism ,
  • HAART Highly Active Antiretroviral Therapy
  • NRTIs nucleoside and nucleotide analogues
  • NRTIs non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors
  • PI HIV protease inhibitors
  • entry and fusion inhibitors entry and fusion inhibitors
  • integrase inhibitors Several classes of drugs are currently in use: nucleoside and nucleotide analogues (NRTIs), non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors (NNRTIs), HIV protease inhibitors (PI), entry and fusion inhibitors, and integrase inhibitors.
  • NRTIs nucleoside and nucleotide analogues
  • NRTIs non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors
  • PI HIV protease inhibitors
  • entry and fusion inhibitors entry and fusion inhibitors
  • integrase inhibitors integrase inhibitors
  • DAA direct acting antiviral drugs
  • a disadvantage of the currently used antiviral agents is that they are virostatic, but not virotoxic. They inhibit the proliferation of viruses but do not kill them.
  • a cytotoxic agent adapted for selective binding to a membrane receptor of virus-infected T lymphocytes, the membrane receptor being selected from the group consisting of: CD134, CD132, CD71, CD70, CD54, CD39, BTLA, CD97, CD2, CD63, CD50, CD161, CD218, CD226, CD7, CD49d and CD29.
  • the inventors were able to use a novel FACS-based screening method
  • the cytotoxic agent of the invention makes use of the phenomenon recognized by the inventor. It binds selectively to virus-infected T lymphocytes and unfolds there its cytotoxic activity. Uninfected cells are not or significantly weaker bound. Side effects are thus minimized.
  • the cytotoxic agent of the invention is not only virostatic, so not only prevents the spread and multiplication of viruses. Rather, the cytotoxic agent of the present invention is virotoxic, thus has the potential to selectively eliminate the infected T lymphocytes and the viruses and virus precursors present in the cells.
  • the cytotoxic agent of the present invention thus satisfies a long-standing need in the treatment of viral infectious diseases for causally effective therapeutics.
  • agent is understood according to the invention to mean a substance which, on account of its chemical-physical properties, acts on the viability and / or proliferation of the virus-infected T lymphocyte.
  • the agent may be a chemically defined compound, an active agent, a drug, etc.
  • cytotoxic means such an activity which exerts an inhibiting influence on the viability and / or proliferation of the virus-infected T-lymphocyte.
  • a “selective binding” is understood according to the invention to be a targeted and specific coupling of the cytotoxic agent to the membrane receptor, which is based on a selective interaction according to the key-lock principle. It is distinct from non-selective binding, which relies on nonspecific agent-receptor interactions.
  • T lymphocytes form a group of white blood cells which serve the immune response and, according to the invention, comprise all T cells, in particular T helper or memory cells, which carry the CD4 receptor (CD4 + T lymphocytes).
  • CD stands for "clusters of differentiation” and refers to groups of immunophenotypic surface features of cells that can be ordered by biochemical or functional criteria.
  • the CD molecules are usually membrane-bound glycoproteins, which are often cell-specifically expressed and may have a variety of functions: some CDs have receptor or signaling function, while in others could be detected enzymatic activity; moreover, some cluster molecules are thought to play a central role in intercellular communication.
  • CD134 also referred to as Tumor Necrosis Factor Receptor Superfamily Member 4 (TNFRSF4) or OX40, is a member of the TNFR superfamily of receptors that is not constitutively expressed on quiescent naive T cells.
  • TNFRSF4 Tumor Necrosis Factor Receptor Superfamily Member 4
  • OX40 OX40
  • CD134 is a secondary, co-stimulating immune checkpoint molecule. It is assumed that CD134 has no influence on the proliferating activity of CD4 + T cells during the first three days, but after this time the proliferation slows down and the cells die off to a greater extent.
  • CD134 has been described to be involved in the pathological so-called cytokine storm associated with various viral infections, such as H5N1 avian influenza, an immune system overreaction that produces high levels of inflammatory cytokines, which in turn cause leukocytes Induce formation of additional cytokines.
  • CD132 also referred to as the common gamma chain (Y c ) or interleukin-2 receptor subunit gamma (IL-2RG), is a cytokine receptor subunit common to the receptor complexes of at least six different interleukin receptors: IL -2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 and IL-21 receptor. Lymphocytes expressing CD132 can form functional receptors for these cytokines.
  • the art describes diseases associated with dysfunctions or mutations in CD132, such as, for example, X-SCID (Severe Combined Immunodeficiency) or schizophrenia.
  • CD71 also referred to as "transferrin receptor protein 1" (TfR1), is a
  • CD71 Transmembrane protein used for iron transport of transferrin into cells by endocytosis tose is necessary.
  • CD71 is described as a potential target in cases of human leukemia and lymphoma.
  • CD70 is a protein that is activated on highly activated lymphocytes, such as in T and B cell lymphomas. It is therefore believed in the art that anti-CD70 antibodies represent a possible form of therapy for CD70-positive lymphomas.
  • CD54 also referred to as ICAM-1 (Intercellular Adhesion Molecule 1), is a
  • CD54 Transmembrane glycoprotein, which is typically expressed on endothelial cells and cells of the immune system. It is a member of the immunoglobulin superfamily. After cytokine stimulation, there is a strong increase in CD54 concentration. CD54 is indicated by interleukin-1 (IL-1) and tumor necrosis factor (TNF) and is expressed by the vascular endothelium, macrophages and lymphocytes. CD54 plays u.a. an important role in the signal transduction of cells. CD54 is associated with subarachnoid haemorrhage (SAH), in which free blood enters the subarachnoid space filled with cerebrospinal fluid.
  • SAH subarachnoid haemorrhage
  • CD39 also referred to as “ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase-1” (ENTPD1), is a transmembrane protein that catalyzes the hydrolysis of ⁇ - and ⁇ -phosphate residues of triphospho- and diphosphonucleosides to the monophosphonucleoside derivatives.
  • ENTPD1 ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase-1
  • BTLA also referred to as “CD272”
  • CD272 is induced during activation of T cells, causing T cell inhibition via interaction with tumor necrosis factor receptors, and activating BTLA with inhibition of function of human CD8 + cancer specific T cells.
  • CD97 or "BL-Ac [F2]” is a member of the adhesion GPCR family.
  • CD97 is expressed on hematopoietic stem and progenitor cells, immune cells, epithelial cells, muscle cells and their malignant variants.
  • CD97 plays the role of a critical mediator of host defense. Outside the immune system, CD97 is possible. involved in cell-cell interactions.
  • CD97 is found in a variety of tumors, including those of the thyroid, stomach, pancreas, esophagus, colon, and oral squamous cell carcinomas.
  • CD2 is a cell adhesion molecule found on the surface of T cells and Natural Killer (NK) cells. Other designations include T cell surface antigen T1 1 / Leu-5, LFA-2, LFA-3 receptor, erythrocyte receptor and rosette receptor. CD2 interacts with other adhesion molecules. Much of T-cell lymphoma and leukemia express CD2, so the prior art uses CD2 to discriminate these conditions from B-cell neoplasms.
  • CD50 or "Intercellular Adhesion Molecule 3" (ICAM-3) is a transmembrane glycoprotein. It is constitutively and strongly expressed by all leukocytes and is considered to be one of the major ligands for LFA-1 in initiating the immune response.
  • CD161 also referred to as "killer cell-ectin-like receptor subfamily B member 1", "NK1 .1”, “KLRB1”, “NKR-P1A”, is a transmembrane glycoprotein expressed by NK cells and expressed in NK cells the regulation of N K cell function appears to be involved.
  • CD218 or "interleukin-18 receptor alpha” (IL-18 Ra) is a member of the IL-1 receptor superfamily. CD218 is expressed on Th1 cell, a subtype of NK cells, neutrophil and IL-12 stimulated tonsil B cells. CD218 seems to play an important role in the innate immune response and in autoimmune reactions.
  • CD226 also referred to as "PTA1 (" platelet and T cell activation antigen 1 ”) or” DNAM-1 "(" DNAX accessory molecule-1 "), is a transmembrane glycoprotein present on the surface of NK cells, platelets , Monocytes and a fraction of T cells, CD226 mediates cellular adhesion to other cells bearing their ligands, CD1 12 and CD155.
  • CD7 is a transmembrane protein expressed on thymocytes and mature T cells. It plays an important role in T-cell interactions during the early development of the lymphatic system.
  • CD49d is an integrin alpha subunit that forms part of the a4ß1 lymphocyte homing receptor. It interacts with LGALS8 and paxillin.
  • CD29 or "integrin beta-1", respectively, is an integrin subunit that, for example, interacts with the alpha-3 subunit to form the a3 ⁇ 1 complex, which reacts with molecules such as netrin-1 and reelin.
  • CD129 is involved in cell adhesion and cell recognition in a variety of processes, including embryonic development, hemostasis, tissue repair, immune response and metastatic spread of tumor cells.
  • the cytotoxic agent is coupled to a membrane receptor for the selective binding molecule.
  • the invention makes in an advantageous manner the
  • a "binding molecule” comprises any compound capable of selectively and specifically targeting the cytotoxic agent to at least one of the membrane receptors CD134, CD132, CD71, CD70, CD54, CD39, BTLA, CD97, CD2, CD63, CD50, CD161, Coupling or ligating CD218, CD226, CD7, CD49d and CD29.
  • the binding molecule is selected from the group consisting of: immunoglobulin, immunoglobulin fragment, aptamer, low molecular weight compound, receptor, receptor fragment, cytokine.
  • binding molecules are used, which are particularly well suited for the selective and specific coupling of the cytotoxic agent to the found overexpressed membrane receptors.
  • the immunoglobulin may be a
  • Immunoglobulin an antibody, preferably an agonist antibody.
  • the cytotoxic agent can be particularly selected from the group consisting of the cytotoxic agent and the group consisting of the cytotoxic agent and the cytotoxic agent.
  • the immunoglobulin is selected from the group consisting of: MEDI6469 (9B12), MEDI6383, MEDI0562, Hu106-222 / Hu1 19-122 (UTMDACC).
  • Membrane receptor CD134 are directed and therefore particularly suitable as a binding molecule.
  • MEDI6469 is an agonistic murine antibody from Medlmmun, AstraZeneca, which is currently being tested for the treatment of solid tumors in humans in a Phase I clinical trial.
  • anti-CD134 antibodies are described in the prior art, as described, for example, in Weinberg et al. (2006), Anti-OX40 (CD134) Administration to Nonhuman Primates: Immunostimulatory Effects and Toxic- ity Study, J. Immunother., Vol. 29, No. 6, pp. 575-585, but as part of or in combination with one Vaccine or as immunostimulating agent.
  • the anti-CD134 Antibody unlike the invention, does not aim to exert toxic effects on virus-infected cells but rather immunostimulating effects on the whole organism.
  • OX40 is a Potent Immune-Stimulating Target in Late Stage Cancer Patient, Cancer Res. 73 (24), p. 7189-7198; Bulliard et al. (2014), OX40 Engagement Depletes Intratumoral Tregs Via Activating FcyRs, Leading to Antitumor Efficacy, Immunology and Cell Biology 92, pp. 475-480.
  • the virus-infected T lymphocytes are virus-infected CD4 + T lymphocytes.
  • This measure has the advantage that the cytotoxic agent according to the invention purposefully and selectively eliminates those T lymphocytes which serve as long-term reservoirs of the viruses in the case of HIV infection.
  • the elimination of these cells by the cytotoxic agent according to the invention not only leads to a drastic reduction in the viral load, it also prevents recurrences at or after the discontinuation of the therapy.
  • a preferred virus infection to be treated or prevented according to the invention is an HIV infection.
  • the cytotoxic agent to a cytostatic.
  • the cytostatic agent is one selected from the group consisting of: alkylating agents, platinum analogs, intercalants, antibiotics, mitosis inhibitors, taxanes.
  • the cytotoxic agent according to the invention has an antiviral agent.
  • This measure has the advantage that a virostatic is added to the virotoxic inherent effect of the agent according to the invention.
  • the therapeutic effectiveness of the cytotoxic agent according to the invention is thus further increased.
  • the invention also relates to a pharmaceutical
  • a composition comprising the cytotoxic agent of the invention and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Pharmaceutically acceptable carriers are well known in the art. For example, reference is made to the paper by Kibbe A. (2003), Handbook of Pharmaceutical Excipients, 4th Edition, American Pharmaceutical Association and Pharmaceutical Press.
  • Another object of the invention is the use of a cytotoxic agent 'for the prophylaxis and / or treatment of viral infection, which is designed for selective binding to a membrane receptor virus-infected T lymphocytes, wherein the membrane receptor is selected from the group consisting of: CD134, CD132, CD71, CD70, CD54, CD39, BTLA, CD97, CD2, CD63, CD50, CD161, CD218, CD226, CD7, CD49d and
  • the invention also relates to a method for the detection of cytotoxic agents which comprises selecting those compounds which are capable of selectively binding to a membrane receptor of virus-infected T lymphocytes, the membrane receptor being selected from the group consisting of: CD134, CD132, CD71, CD70, CD54, CD39, BTLA, CD97, CD2, CD63, CD50, CD161, CD218, CD226, CD7, CD49d and CD29.
  • the inventors hereby provide a method which not only provides cytotoxic agents already known in the art, such as MEDI6469 (9B12), but also novel compounds previously unknown or characterized.
  • this substance libraries can be screened.
  • the substances are contacted under suitable experimental conditions with the membrane receptors. It is determined whether there is a specific and selective binding between the substances and the membrane receptors. Specifically and selectively binding substances are potential cytotoxic agents of the invention.
  • a further subject matter relates to a method of diagnosing a viral infection comprising determining any overexpression of a membrane receptor of virus-infected T lymphocytes against uninfected T lymphocytes, wherein the membrane receptor is selected from the group consisting of: CD134, CD132, CD71, CD70 , CD54, CD39, BTLA, CD97, CD2, CD63, CD50, CD161, CD218, CD226, CD7, CD49d and CD29.
  • the inventors have recognized that the overexpressed said membrane receptors are diagnostic markers that can reliably detect a virus infection. The detection of overexpression on T lymphocytes correlates with the presence of virus expression.
  • Yet another object of the invention is a method for the determination of surface structures on virus-infected T lymphocytes, preferably membrane receptors, which are suitable as a target of cytostatic agents, the method comprising the infection of T lymphocytes with a virus and the determination of a possible overexpression of the Surface structures on the virus-infected T lymphocytes against uninfected T lymphocytes.
  • the inventors have developed a model in which initially T-lymphocytes are infected with viruses, for example HI viruses.
  • the next step is to analyze which surface structures that are suitable as targets for a cytotoxic agent are overexpressed on the infected T lymphocytes.
  • the stronger the overexpression compared to uninfected T lymphocytes, the more selective and the better suited as the cytotoxic agent according to the invention is a substance which binds highly specifically to this surface structure.
  • Fig. 1 shows schematically the establishment of a screening method for the determination of surface structures in HIV-1 -infected T-lymphocytes, which forms the basis for the discovery of the cytotoxic agents of the invention
  • Figure 2 shows the increase in expression of various membrane receptors on HIV-1 infected versus non-infected primary human CD4 + T lymphocytes (A), and the increased expression of CD134 on HIV isolated CD4 + T cells. Lymphocytes (B).
  • CD4 + T lymphocytes were isolated from the peripheral blood of healthy donors.
  • the isolated CD4 + T lymphocytes were stimulated with phytohemagglutinin (PHA) for three days. Subsequently, the thus stimulated cells were infected with HIV-1 expressing CFP (cyan fluorescent protein) via an internal ribosomal entry site (IRES) together with the nef open reading frame.
  • the surface of the infected CD4 + T lymphocytes was stained 48 to 72 hours after infection with 332 PE-conjugated antibodies presented in four 96-well microtiter plates. To turn off autofluorescence, infected and uninfected cells were filtered against allopycocyanin (APC). For analysis, the PE averages of infected CFP-positive cells and uninfected CFP-negative cells were used.
  • APC allopycocyanin
  • CD4 + T lymphocytes were isolated from the blood of HIV-1 infected individuals. The surface of the cells was analyzed for the expression of CD134 and the interior of the cell for HIV-1 p24. The measurement was carried out by flow cytometry. The result is shown in FIG. 2B.
  • the graph shows the mean fluorescence intensity (MFI) of CD134 in p24 " (not infected) versus p24 + (infected) T cells from ten patients, and a statistical calculation was done with the paired Student T-test CD134- Expression also increases sharply on infected CD4 + T lymphocytes from the blood of HIV-1 patients.
  • MFI mean fluorescence intensity
  • an HIV-1 infected CD4 + T lymphocyte cell can be specifically distinguished from an uninfected cell.
  • CD134 is therefore an ideal target for anti-HIV-1 immunotherapy.
  • the detection of the cytotoxic property is as follows:
  • PBMCs are isolated from the blood of healthy donors.
  • the isolated cells are infected with HIV-1 expressing GFP or CFP. This allows the identification of the infected cell population due to the expression of the chromophore.
  • Various amounts of the anti-CD134 antibody for example, MEDI6469 (9B12), are added.
  • An anti-mouse PE is used as a secondary antibody to detect by flow cytometry cells that bind the antibody. This experiment allows to evaluate that the antibody specifically binds to HIV-1 infected cells due to cellular CD134 expression and not to uninfected cells as well. It also allows to determine if different doses have an effect on the Level of specific or non-specific binding to HIV-1 infected and uninfected cells.
  • Amount of infected cells observed in the HIV-1 infected PBMC population Different amounts of the anti-CD134 antibody are added to the infected cultures. At 2-day intervals, the absolute number of infected CD4 + T cells, uninfected CD4 + T cells, absolute levels of CD3 + cells, and CD8 + T cells expressing cytotoxic T cells. Lymphocytes represent, quantified. T cell activation and proliferation is analyzed by staining for CD69 and Ki67. The levels of monocytes are measured by the expression of the CD14 receptor.
  • virus production is determined by the release of p24 in the
  • Controls include uninfected PBMC cultures with or without anti-CD134 antibody treatment and HIV-1-infected PBMC without any treatment. At least three different donors are analyzed. These experiments allow the conclusion that CD134 ligation on primary cells infected with ex vivo has the potential to eliminate infected cells or suppress viral replication, and that uninfected cells are unaffected or eliminated by the treatment.
  • MEDI6469 9B12

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein zytotoxisches Agens zur Prophylaxe und/oder Behandlung einer Virusinfektion, das zur selektiven Bindung an einen Membranrezeptor virusinfizierter T-Lymphozyten ausgebildet ist, eine dieses zytotoxische Agens enthaltende pharmazeutische Zusammensetzung, die Verwendung des zytotoxischen Agens' zurProphylaxe und/oder Behandlung von Virusinfektion, ein Verfahren zum Auffinden von zytotoxischen Agenzien, die Verwendung eines Membranrezeptors virusinfizierter T-Lymphozyten, der gegenüber nicht-infizierten T-Lymphozyten überexprimiert ist, zur Diagnose einer Virusinfektion, sowie ein Verfahren zur Diagnose einer Virusinfektion.

Description

Antivirale Immuntherapie durch Membranrezeptorligation
[0001] Die vorliegende Erfindung betrifft ein zytotoxisches Agens zur Prophylaxe und/oder
Behandlung einer Virusinfektion, das zur selektiven Bindung an einen Membranrezeptor virusinfizierter T-Lymphozyten ausgebildet ist, eine dieses zytotoxische Agens enthaltende pharmazeutische Zusammensetzung, die Verwendung des zytotoxischen Agens' zur Prophylaxe und/oder Behandlung von Virusinfektion, ein Verfahren zum Auffinden von zytotoxischen Agenzien, die Verwendung eines Membranrezeptors virusinfizierter T- Lymphozyten, der gegenüber nicht-infizierten T-Lymphozyten überexprimiert ist, zur Diagnose einer Virusinfektion, sowie ein Verfahren zur Diagnose einer Virusinfektion.
[0002] Virusinfektionen stellen eine der großen Herausforderungen der Gegenwart an die
Wissenschaft und Medizin dar. Eines der im Fokus stehenden humanpathogenen Viren ist das Humane Immundefizienz-Virus (HIV). HIV ist ein behülltes Virus, das zur Familie der Retroviren und zur Gattung der Lentiviren gehört. Eine unbehandelte HIV-Infektion führt nach einer unterschiedlich langen, meist mehrjährigen symptomfreien Latenzphase in der Regel zu AIDS (engl, acquired immunodeficiency Syndrome, 'erworbenes Immundefizi- enzsyndrom'). Die weltweite HlV-Prävalenz bei Erwachsenen im Alter von 15 bis 49 Jahren lag im Jahr 2010 bei 0,8 Prozent. Für Zentral- und Westeuropa lag sie bei 0,2 Prozent. Im subsaharischen Afrika (5,0 Prozent) und in der Karibik (0,9 Prozent) war sie überdurchschnittlich hoch. In einzelnen Staaten, wie zum Beispiel Swasiland, Botswana oder Lesotho, sind etwa ein Viertel der 15- bis 49-Jährigen mit dem HI-Virus infiziert. In Deutschland lag die HlV-Prävalenz im Jahr 2009 bei ca. 0,1 Prozent.
[0003] Zur Vermehrung benötigt das HI-Virus Wirtszellen, die den sogenannten CD4-Rezeptor auf der Oberfläche tragen. Dies sind vor allem CD4-tragende T-Helferzellen, sogenannte CD4+-Zellen oder CD4+-Lymphozyten. Als hauptsächliches Reservoir für die HI-Viren dienen die follikulären T-Helferzellen in den Lymphfollikeln des Körpers, die rund 2 % der CD4+-Zellen ausmachen. Latent infizierte, ruhende CD4+-T-Zellen bzw. T- Gedächtniszellen stellen langlebige Reservoire für HIV dar. Diese Zellen werden dafür verantwortlich gemacht, dass HIV trotz der derzeit verfügbaren antiretroviralen Medika- mente bisher nicht eradiziert werden kann und es nach Absetzen der Therapie immer wieder zu Rezidiven kommt.
Da die Vermehrung der Viren im Inneren von normalen Zellen stattfindet und sich dort sehr eng an die zentralen biochemischen Zellmechanismen ankoppelt, müssen die in Frage kommenden antiviralen Wirkstoffe entweder das Eindringen der Virionen in die Wirtszellen verhindern, in den Zellstoffwechsel zum Nachteil der Virusvermehrung eingreifen oder nach einer möglichen Virusvermehrung in den Zellen das Austreten der neuen Viren aus den Zellen unterbinden.
Andererseits müssen diese gesuchten Wirkstoffe jedoch auch für den Körperstoffwechsel, den Zellverband und/oder den internen Zellstoffwechsel insgesamt verträglich sein, da sonst nicht nur beispielsweise die Virusvermehrung in den Zellen zum Erliegen kommt, sondern schlimmstenfalls auch das (Zell-)Leben des gesamten behandelten Organismus.
Weil diese Bedingungen sehr schwer zu vereinbaren sind, sind einige der bisher entwickelten antiviralen Medikamente auch oft mit schweren Nebenwirkungsrisiken verbunden.
Die derzeitige Therapie der Wahl bei einer HIV-Infektion bzw. von AIDS wird als hochaktive antiretrovirale Therapie (HAART) bezeichnet. HAART ist eine medikamentöse Kombinationstherapie aus mindestens drei antiretroviralen Wirkstoffen. Zurzeit werden mehrere Wirkstoffklassen angewandt: Nukleosid- und Nukleotidanaloga (NRTI), Nichtnuk- leosidische Reverse-Transkriptase-Inhibitoren (NNRTI), HlV-Proteaseinhibitoren (PI), Entry- und Fusionsinhibitoren sowie Integraseinhibitoren.
Einige der vorgenannten Wirkstoffe werden als 'direct acting antiviral drugs' (DAA) bezeichnet. DAA hemmen spezifisch virale Proteine, nicht aber zelluläre Proteine des Wirtes. Dieses Wirkprinzip solle zu weniger Nebenwirkungen führen. Allerdings kommt es gerade auch bei DAA von Seiten der zu bekämpfenden Viren zu Resistenzentwicklungen, zu der sie auf Grund ihres extrem schnell ablaufenden Vermehrungszyklus und der biochemischen Eigenart dieser Replikation gut in der Lage sind.
Ferner besteht ein Nachteil bei den derzeit eingesetzten antiviralen Wirkstoffen darin, dass sie virostatisch, nicht aber virotoxisch sind. Sie hemmen die Vermehrung der Viren, töten diese aber nicht ab.
Vor diesem Hintergrund ist es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen neuen antiviralen Wirkstoff bereitzustellen, mit dem die Nachteile der derzeit verfügbaren antiviralen Wirkstoffe reduziert, ggf. sogar vermieden werden. Dabei soll möglichst ein solcher Wirkstoff bereitgestellt werden, der das Virus bzw. die virusinfizierte Zelle abtötet, also virotoxisch ist.
Diese Aufgabe wird durch die Bereitstellung eines zytotoxischen Agens gelöst, das zur selektiven Bindung an einen Membranrezeptor virusinfizierter T-Lymphozyten ausgebildet ist, wobei der Membranrezeptor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: CD134, CD132, CD71 , CD70, CD54, CD39, BTLA, CD97, CD2, CD63, CD50, CD161 , CD218, CD226, CD7, CD49d und CD29.
Die Erfinder konnten über ein neuartiges FACS-basiertes Screeningverfahren
überraschenderweise feststellen, dass die vorstehend angegebenen Membranrezeptoren in virusinfizierten T-Lymphozyten gegenüber nicht-virusinfizierten T-Lymphozyten deutlich überexprimiert werden. Diese Membranrezeptoren ermöglichen so zunächst die Identifizierung von virusinfizierten T-Lymphozyten.
Ein Zusammenhang zwischen den vorstehend genannten Membranrezeptoren und der Virusinfektion von T-Lymphozyten ist im Stand der Technik bislang nicht beschrieben worden. Sie stellen folglich einen neuen Biomarker mit therapeutischer Implikation dar.
Das erfindungsgemäße zytotoxische Agens macht sich das von dem Erfinder erkannte Phänomen zunutze. Es bindet selektiv an virus-infizierte T-Lymphozyten und entfaltet dort seine zytotoxische Aktivität. Nicht-infizierte Zellen werden nicht oder deutlich schwächer gebunden. Nebenwirkungen werden damit minimiert.
Im Gegensatz zu den meisten derzeit verfügbaren Therapeutika gegen virale
Erkrankungen, wirkt das erfindungsgemäße zytotoxische Agens nicht lediglich virosta- tisch, verhindert also nicht nur die Ausbreitung und Vermehrung der Viren. Das erfindungsgemäße zytotoxische Agens wirkt vielmehr virotoxisch, hat also das Potenzial zur selektiven Eliminierung der infizierten T-Lymphozyten und der in den Zellen vorliegenden Viren und Virenvorläufer.
Das erfindungsgemäße zytotoxische Agens befriedigt damit einen seit langem in der Behandlung von Virusinfektionskrankheiten bestehenden Bedarf an ursächlichen wirksamen Therapeutika.
Unter einem "Agens" wird erfindungsgemäß ein Stoff verstanden, der aufgrund seiner chemisch-physikalischen Eigenschaften auf die Lebensfähigkeit und/oder Proliferation des virusinfizierten T-Lymphozyten einwirkt. Bei dem Agens kann es sich um eine chemisch definierte Verbindung, einen Wirkstoff, ein Arzneimittel etc. handeln.
Unter "zytotoxisch" wird erfindungsgemäß eine solche Aktivität verstanden, die einen inhibierenden Einfluss auf die Lebensfähigkeit und/oder Proliferation des virusinfizierten T-Lymphozyten ausübt.
Unter einer "selektiven Bindung" wird erfindungsgemäß eine zielgerichtete und spezifische Kopplung des zytotoxischen Agens an den Membranrezeptor verstanden, die auf einer selektiven Wechselwirkung nach dem Schlüssel-Schloss-Prinzip beruht. Sie ist abgegrenzt von einer nicht-selektiven Bindung, die auf unspezifischen Interaktionen zwischen Agens und Rezeptor beruht.
"T-Lymphozyten" bilden eine Gruppe von weißen Blutzellen, die der Immunantwort dienen und umfassen erfindungsgemäß sämtliche T-Zellen, insbesondere T-Helfer- oder Gedächtniszellen, die den CD4-Rezeptor tragen (CD4+-T-Lymphozyten). "CD" steht für 'Cluster of differentiation' ("Unterscheidungsgruppen") und bezeichnet Gruppen immunphänotypischer Oberflächenmerkmale von Zellen, die sich nach biochemischen oder funktionellen Kriterien ordnen lassen. Bei den CD-Molekülen handelt es sich meistens um membrangebundene Glykoproteine, die häufig zellspezifisch exprimiert werden und verschiedenste Funktionen haben können: Einige CDs haben Rezeptor- oder Signalfunktion, während bei anderen enzymatische Aktivität nachgewiesen werden konnte; darüber hinaus wird einigen Clustermolekülen eine zentrale Rolle in der interzellulären Kommunikation zugeschrieben.
"CD134", auch als Tumor-Nekrose-Faktor-Rezeptor-Superfamilie Mitglied 4 (TNFRSF4) oder OX40 bezeichnet, ist ein Mitglied der TNFR-Superfamilie von Rezeptoren, das nicht konstitutiv auf ruhenden naiven T-Zellen exprimiert wird. CD 134 ist ein sekundäres, co- stimulierendes Immun-Checkpunkt-Molekül. Es wird angenommen, dass CD134 während der ersten drei Tage keinen Einfluss auf die proliferierende Aktivität von CD4+-T-Zellen hat, jedoch nach dieser Zeit sich die Proliferation verlangsamt und die Zellen in verstärktem Maße absterben. Für CD134 ist beschrieben worden, dass es in den pathologischen sogenannten Zytokinsturm involviert ist, der mit verschiedenen viralen Infektion einhergeht, wie beispielsweise der H5N1 -Vogelgrippe, also einer Überreaktion des Immunsystems, bei der hohe Konzentrationen von entzündlichen Zytokinen gebildet werden, die wiederum Leukozyten zur Bildung weiterer Zytokine veranlassen.
"CD132", auch als gemeinsame Gamma-Kette (Yc) oder lnterleukin-2-Rezeptor- Untereinheit Gamma (IL-2RG) bezeichnet, ist eine Zytokinrezeptor-Untereinheit, die den Rezeptorkomplexen von zumindest sechs verschiedenen Interleukin-Rezeptoren gemein ist: IL-2-, IL-4-, IL-7-, IL-9-, IL-15- und IL-21 -Rezeptor. Lymphozyten, die CD132 exprimie- ren, können funktionale Rezeptoren für diese Zytokine bilden. Im Stand der Technik sind Krankheiten beschrieben, die mit Funktionsstörungen oder Mutationen in CD132 assoziiert sind, wie bspw. X-SCID (Schwerer kombinierter Immundefekt, "severe combined immunodeficiency") oder Schizophrenie. "CD71 ", auch als "Transferrin-Rezeptor-Protein 1 " (TfR1 ) bezeichnet, ist ein
Transmembranprotein, das für den Eisentransport von Transferrin in Zellen durch Endozy- tose notwendig ist. CD71 wird als eine potenzielle Zielstruktur in Fällen von humanen Leukämien und Lymphomen beschrieben.
[0026] "CD70" ist ein Protein, das auf hoch-aktivierten Lymphozyten, wie in T- und B-Zell- Lymphomen aktiviert wird. Es wird deshalb im Stand der Technik angenommen, dass Anti-CD70-Antikörper eine mögliche Therapieform für CD70-positive Lymphome darstellen.
[0027] "CD54", auch als ICAM-1 (interzelluläres Adhäsionsmolekül 1 ) bezeichnet, ist ein
Transmembranglykoprotein, das typischerweise auf Endothelzellen und Zellen des Immunsystems exprimiert wird. Es ist ein Mitglied der Immunglobulin-Superfamilie. Nach Zytokinstimulation kommt es zu einem starken Anstieg der CD54-Konzentration. CD54 wird indiziert durch lnterleukin-1 (IL-1 ) und Tumor-Nekrose-Faktor (TNF) und wird exprimiert von dem Gefäßendothel, Makrophagen und Lymphozyten. CD54 spielt u.a. eine wichtige Rolle in der Signaltransduktion von Zellen. CD54 wird in Zusammenhang gebracht mit Subarachnoidalblutungen ("subarachnoid hemorrhage", SAH), bei denen freies Blut in den mit Liquor cerebrospinalis gefüllten Subarachnoidalraum gelangt.
"CD39", das auch als "Ektonukleosid-Triphosphat Diphosphohydrolase-1 " (ENTPD1 ) bezeichnet wird, ist ein Transmembranprotein, das die Hydrolyse von γ- and ß- Phosphatresten von Triphospho- und Diphosphonukleosiden an die Monophosphonukleo- sidderivate katalysiert.
"BTLA", auch als "CD272 bezeichnet, wird während der Aktivierung von T-Zellen induziert. Es bewirkt eine T-Zell-Inhibition über die Interaktion mit Rezeptoren des Tumor- Nekrose-Faktors. Eine Aktivierung von BTLA wird mit der Inhibition der Funktion von humanen CD8+ krebsspezifischen T-Zellen in Verbindung gebracht.
"CD97" oder "BL-Ac[F2]" ist ein Mitglied der Adhäsion-GPCR-Familie. CD97 wird u.a. auf hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen, Immunzellen, Epithelzellen, Muskelzellen sowie deren bösartige Varianten exprimiert. Im Immunsystem spielt CD97 die Rolle eines kritischen Mediators der Wirtsabwehr. Außerhalb des Immunsystems ist CD97 möglich- erweise in Zell-Zell-Interaktionen involviert. CD97 wird in einer Vielzahl von Tumoren gefunden, einschließlich solcher der Schilddrüse, des Magens, Pankreas, der Speiseröhre, des Dickdarms und in oralen Plattenepithelkarzinomen.
"CD2" ist ein Zelladhäsionsmolekül, das auf der Oberfläche von T-Zellen und Natürlichen Killerzellen (NK-Zellen) gefunden wird. Andere Bezeichnungen sind T-Zell- Oberflächenantigen T1 1/Leu-5, LFA-2-, LFA-3-Rezeptor, Erythrozytenrezeptor und Rosetten rezeptor. CD2 interagiert mit anderen Adhäsionsmolekülen. Ein Großteil von T- Zell-Lymphomen und Leukämien exprimieren CD2, so dass im Stand der Technik CD2 zur Unterscheidung dieser Zustände von B-Zell-Neoplasmen verwendet wird.
"CD50" bzw. "Interzelluläres Adhäsionsmolekül 3" (ICAM-3) ist ein Transmembranglykoprotein. Es wird konstitutiv und stark von allen Leukozyten exprimiert und gilt als eines der wichtigsten Liganden für LFA-1 in der Einleitung der Immunantwort.
"CD161 ", das auch als "Killerzell-Iektinähnlicher-Rezeptor-Subfamilie B Mitglied 1 ", "NK1 .1 ", "KLRB1 ", "NKR-P1A" bezeichnet wird, ist ein Transmembranglykoprotein, das von NK-Zellen exprimiert und in die Regulation der N K-Zellfunktion involviert zu sein scheint.
"CD218" bzw. "lnterleukin-18-Rezeptor alpha" (IL-18 Ra) ist ein Mitglied der IL-1 - Rezeptor-Superfamilie. CD218 wird auf Th1 -Zelle, eine Untertyp von NK-Zellen, Neutro- philen und IL-12-stimulierten Tonsilen B-Zellen exprimiert. CD218 scheint eine wichtige Rolle in der angeborenen Immunantwort und bei Autoimmunreaktionen zu spielen.
"CD226", auch als "PTA1 ("platelet and T cell activation antigen 1 ") oder "DNAM-1 " ("DNAX accessory molecule-1 ") bezeichnet, ist ein Transmembranglykoprotein, das auf der Oberfläche von NK-Zellen, Plättchen, Monozyten und einer Fraktion von T-Zellen exprimiert wird. CD226 vermittelt die zelluläre Adhäsion zu anderen Zellen, die deren Liganden, CD1 12 und CD155, tragen. "CD7" ist ein Transmembranprotein, das auf Thymozyten und reifen T-Zellen exprimiert wird. Es spielt eine wichtige Rolle in T-Zell-Interaktionen während der frühen Entwicklung des Lymphsystems.
"CD49d" ist eine Integrin-alpha-Untereinheit, die ein Bestandteil des a4ß1 -Lymphozyten- Homing-Rezeptors bildet. Es interagiert mit LGALS8 und Paxillin.
"CD29" bzw. "Integrin beta-1 " ist eine Integrin-Untereinheit, die bspw. mit der Alpha-3- Untereinheit interagiert, um den a3ß1 -Komplex zu bilden, der mit Molekülen wie Netrin-1 und Reelin reagiert. Wie bei anderen Integrinen ist CD129 involviert in Zelladhäsion und Zellerkennung in eine Vielzahl von Prozessen, einschließlich der Embryonalentwicklung, Hämostase, Gewebereparatur, Immunantwort und metastatischen Verbreitung von Tumorzellen.
Die Überexpression der vorstehend genannten Membranrezeptoren in virusinfizierten T- Lymphozyten, bspw. in HlV-infizierten CD4+-T-Lymphozyten, war überraschend und durch den Stand der Technik nicht nahegelegt. Sie war somit nicht zu erwarten.
Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wird hiermit vollkommen gelöst.
Nach einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung ist das zytotoxische Agens an ein für den Membranrezeptor selektives Bindemolekül gekoppelt.
Mit dieser Maßnahme macht sich die Erfindung auf vorteilhafte Art und Weise die
Eigenschaften von Verbindungen zunutze, hochspezifisch und selektiv an die von dem Erfinder erkannten Membranrezeptoren binden zu können. Ein "Bindemolekül" umfasst dabei jede Verbindung, die in der Lage ist, das zytotoxische Agens selektiv und spezifisch an zumindest eines der Membranrezeptoren CD134, CD132, CD71 , CD70, CD54, CD39, BTLA, CD97, CD2, CD63, CD50, CD161 , CD218, CD226, CD7, CD49d und CD29 zu koppeln oder ligieren. [0043] Nach einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung ist das Bindemolekül ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Immunglobulin, Immunglobulinfragment, Aptamer, niedermolekulare Verbindung, Rezeptor, Rezeptorfragment, Zytokin.
[0044] Mit dieser Weiterbildung der Erfindung kommen solche Bindemoleküle zum Einsatz, die sich zur selektiven und spezifischen Ankopplung des zytotoxischen Agens an die aufgefundenen überexprimierten Membranrezeptoren besonders gut eignen.
[0045] Bei dem Immunglobulin kann es sich in einer Ausgestaltung der Erfindung um ein
Immunglobulin, einen Antikörper, vorzugsweise um einen agonistischen Antikörper handeln.
[0046] Nach Erkenntnissen des Erfinders, lässt sich das zytotoxisches Agens besonders
vorteilhaft an ein derartiges Bindemolekül koppeln und zielgerichtet und selektiv an einen der aufgefundenen Membranrezeptoren virusinfizierter T-Lymphozyten binden.
[0047] In einer Ausgestaltung der Erfindung ist das Immunglobulin ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: MEDI6469 (9B12), MEDI6383, MEDI0562, Hu106-222/Hu1 19-122 (UTMDACC).
[0048] Hierbei handelt es sich um erfindungsgemäß bevorzugte Antikörper, die gegen den
Membranrezeptor CD134 gerichtet sind und sich deshalb als Bindemolekül besonders eignen. MEDI6469 ist ein agonistischer muriner Antikörper der Firma Medlmmun, Astra- Zeneca, welcher derzeit für die Behandlung von soliden Tumoren beim Menschen in einer klinischen Studie der Phase I getestet wird.
[0049] Die Eignung der vorstehend genannten Antikörper zu Zwecken der zytotoxischen
Behandlung einer Virusinfektion war überraschend. So sind im Stand der Technik zwar Anti-CD134-Antikörper beschrieben, wie bspw. in Weinberg et al. (2006), Anti-OX40 (CD134) Administration to Nonhuman Primates: Immunostimulatory Effects and Toxoki- netic Study, J. Immunother., Vol. 29, Nr. 6, S. 575-585, jedoch als Bestandteil oder in Kombination mit einem Vakzin bzw. als immunstimulierendes Agens. Der Anti-CD134- Antikörper zielt dort, anders als bei der Erfindung, nicht darauf ab, toxische Effekte auf virusinfizierte Zellen sondern vielmehr immunstimulierende Effekte auf den Gesamtorganismus auszuüben.
Die immunstimulierende Wirkung von Anti-CD134-Antikörpern wird außerdem, vorwiegend im Zusammenhang mit der Behandlung von Krebserkrankungen, offenbart in WO 99/42585, EP 1 997 893, EP 650 020, WO 2013/038191 , Curti et al. (2013), OX40 is a Potent Immune-Stimulating Target in Late-Stage Cancer Patient, Cancer Res. 73(24), S. 7189-7198; Bulliard et al. (2014), OX40 Engagement Depletes Intratumoral Tregs via activating FcyRs, Leading to Antitumor Efficacy, Immunology and Cell Biology 92, S. 475- 480.
Nach einer weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen zytotoxischen Agens handelt es sich bei den virusinfizierten T-Lymphozyten um virusinfizierte CD4+-T-Lymphozyten.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass das erfindungsgemäße zytotoxische Agens zielgerichtet und selektiv solche T-Lymphozyten eliminiert, die bei einer HIV-Infektion als langlebige Reservoire der Viren dienen. Die Eliminierung dieser Zellen durch das erfindungsgemäße zytotoxische Agens führt nicht nur zu einer drastischen Reduzierung der Viruslast, sie verhindert auch, dass es bei oder nach dem Absetzen der Therapie zu Rezidiven kommt.
Vor diesem Hintergrund handelt es sich bei einer bevorzugten erfindungsgemäß zu behandelnden oder vorzubeugenden Virusinfektion um eine HIV-Infektion.
Nach einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung weist das zytotoxische Agens ein Zytostatikum auf.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass zur zielgerichteten Eliminierung der virusinfizierten T-Lymphozyten ein solcher Wirkstoff zum Einsatz kommt, der sich bei anderen Indikationen, wie bspw. einer Krebserkrankung, bewährt hat. Dadurch kann auf Erfahrungswerte in Bezug auf Dosierung, Formulierung, Nebenwirkungsspektren etc. zurückgegriffen werden. In eine weiteren Ausgestaltung handelt es sich bei dem Zytostatikum um ein solches, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Alkylanzien, Platinanaloga, Interkalantien, Antibiotika, Mitosehemmer, Taxane.
Mit den genannten Zytostatika kommen solche Wirkstoffe zum Einsatz, die umfassend erforscht und mit hinreichender Arzneimittelsicherheit verfügbar sind. Sie eignen sich deshalb besonders zur Erreichung des erfindungsgemäßen Zweckes.
Nach einer bevorzugten Ausgestaltung weist das erfindungsgemäße zytotoxische Agens ein Virostatikum auf.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass zu der virotoxischen inhärenten Wirkung des erfindungsgemäßen Agens eine virostatische hinzukommt. Die therapeutische Effektivität des erfindungsgemäßen zytotoxischen Agens wird damit nochmals erhöht.
Vor diesem Hintergrund betrifft die Erfindung außerdem eine pharmazeutische
Zusammensetzung, die das erfindungsgemäße zytotoxische Agens sowie einen pharmazeutisch akzeptablen Träger aufweist.
Pharmazeutisch akzeptable Träger sind im Stand der Technik hinreichend bekannt. Beispielhaft wird auf die Abhandlung von Kibbe A. (2003), Handbook of Pharmaceutical Excipients, 4. Auflage, American Pharmaceutical Association and Pharmaceutical Press, verwiesen.
Die Ausgestaltungen, Weiterbildungen, Merkmale, Eigenschaften und Vorteile des erfindungsgemäßen zytotoxischen Agens gelten für die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung gleichermaßen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung eines zytotoxischen Agens' zur Prophylaxe und/oder Behandlung von Virusinfektion, das zur selektiven Bindung an einen Membranrezeptor virusinfizierter T-Lymphozyten ausgebildet ist, wobei der Membranrezeptor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: CD134, CD132, CD71 , CD70, CD54, CD39, BTLA, CD97, CD2, CD63, CD50, CD161 , CD218, CD226, CD7, CD49d und
Die Ausgestaltungen, Weiterbildungen, Merkmale, Eigenschaften und Vorteile des erfindungsgemäßen zytotoxischen Agens gelten für die erfindungsgemäße Verwendung gleichermaßen.
Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zum Auffinden von zytotoxischen Agenzien, das das Auswählen solcher Verbindungen umfasst, die selektiv an einen Membranrezeptor virusinfizierter T-Lymphozyten binden können, wobei der Membranrezeptor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: CD134, CD132, CD71 , CD70, CD54, CD39, BTLA, CD97, CD2, CD63, CD50, CD161 , CD218, CD226, CD7, CD49d und CD29.
Die Erfinder stellen hiermit ein Verfahren bereit, das nicht nur im Stand der Technik bereits bekannte zytotoxische Agenzien verfügbar macht, wie bspw. MEDI6469 (9B12), sondern auch neue bislang nicht bekannte oder charakterisierte Verbindungen. Dazu können Substanzbibliotheken gescreent werden. Die Substanzen werden unter geeigneten experimentellen Bedingungen mit den Membranrezeptoren in Kontakt gebracht. Es wird ermittelt, ob es zwischen den Substanzen und den Membranrezeptoren zu einer spezifischen und selektiven Bindung kommt. Spezifisch und selektiv bindende Substanzen stellen potenzielle erfindungsgemäße zytotoxische Agenzien dar.
Die Ausgestaltungen, Weiterbildungen, Merkmale, Eigenschaften und Vorteile des erfindungsgemäßen zytotoxischen Agens gelten für das erfindungsgemäße Verfahren gleichermaßen.
Ein weiterer Gegenstand betrifft ein Verfahren zur Diagnose einer Virusinfektion, das die Bestimmung einer etwaigen Überexpression eines Membranrezeptors virusinfizierter T- Lymphozyten gegenüber nicht-infizierten T-Lymphozyten umfasst, wobei der Membranrezeptor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: CD134, CD132, CD71 , CD70, CD54, CD39, BTLA, CD97, CD2, CD63, CD50, CD161 , CD218, CD226, CD7, CD49d und CD29. Die Erfinder haben erkannt, dass die überexprimierten genannten Membranrezeptoren diagnostische Marker darstellen, über die sich eine Virusinfektion zuverlässig nachweisen lässt. Der Nachweis einer Überexpression auf T-Lymphozyten korreliert mit dem Vorliegen einer Virusexpression.
Die Ausgestaltungen, Weiterbildungen, Merkmale, Eigenschaften und Vorteile des erfindungsgemäßen zytotoxischen Agens gelten für das erfindungsgemäße Verfahren gleichermaßen.
Ein noch weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung von Oberflächenstrukturen auf virusinfizierten T-Lymphozyten, vorzugsweise Membranrezeptoren, die als Ziel von zytostatischen Agenzien geeignet sind, wobei das Verfahren die Infektion von T-Lymphozyten mit einem Virus und die Bestimmung einer etwaigen Überexpression der Oberflächenstrukturen auf den virusinfizierten T-Lymphozyten gegenüber nicht-infizierten T-Lymphozyten umfasst.
Die Erfinder haben ein Modell entwickelt, in dem zunächst T-Lymphozyten mit Viren, bspw. HI-Viren, infiziert werden. Im nächsten Schritt wird analysiert, welche Oberflächenstrukturen, die als Angriffspunkte für ein zytotoxisches Agens geeignet sind, auf den infizierten T-Lymphozyten überexprimiert werden. Je stärker die Überexpression im Vergleich zu nicht-infizierten T-Lymphozyten, desto selektiver und umso besser als erfindungsgemäßes zytotoxisches Agens geeignet ist eine Substanz, die hochspezifisch an diese Oberflächenstruktur bindet.
Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
Die vorliegende Erfindung wird nun anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert, aus denen sich weitere Merkmale, Eigenschaften und Vorteile der Erfindung ergeben. Die Ausführungsbeispiele sind dabei nicht einschränkend. Es versteht sich, dass einzelne Merkmale, die in den Ausführungsbeispielen offenbart sind, nicht nur im Kontext der ganz spezifischen Ausführungsform sondern in einer Allgemeingültigkeit offenbart sind und für sich genommenen einen eigenen Beitrag zur Erfindung liefern. Der Fachmann kann deshalb diese Merkmale frei mit anderen Merkmalen der Erfindung kombinieren.
Dabei wird Bezug genommen auf die beigefügten Abbildungen, in denen Folgendes dargestellt ist.
Fig. 1 zeigt schematisch die Etablierung eines Screeningverfahrens zur Ermittlung von Oberflächenstrukturen in HIV-1 -infizierten T-Lymphozyten, das die Grundlage für das Auffinden der erfindungsgemäßen zytotoxischen Agenzien darstellt;
Fig. 2 zeigt die Erhöhung der Expression von verschiedenen Membranrezeptoren auf HIV-1 -infizierten versus nicht-infizierten primären humanen CD4+-T-Lymphozyten (A), und die erhöhte Expression von CD134 auf aus HIV-Patienten isolierten CD4+-T-Lymphozyten (B).
Ausführungsbeispiele
1 . Screening von HIV-1 -infizierten T-Lymphozyten
CD4+-T-Lymphozyten wurden aus dem peripheren Blut von gesunden Spendern isoliert. Die isolierten CD4+-T-Lymphozyten wurden für drei Tage mit Phytohämagglutinin (PHA) stimuliert. Anschließend wurden die so stimulierten Zellen mit HIV-1 infiziert, das CFP ('cyan fluorescent protein') über eine interne ribosomale Eintrittsstelle (IRES) zusammen mit dem nef offenen Leseraster exprimiert. Die Färbung der Oberfläche der infizierten CD4+-T-Lymphozyten erfolgte 48 bis 72 Stunden nach Infektion mit 332 PE-konjugierten Antikörpern, die in vier Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen vorgelegt waren. Zum Ausschalten der Autofluoreszenz wurden infizierte und nicht-infizierte Zellen gegen Allo- phycocyanin (APC) gefiltert. Für die Analyse wurden die PE-Mittelwerte von infizierten CFP-positiven Zellen und nicht-infizierten CFP-negativen Zellen verwendet. Die Etablie- rung des Rezeptoroberflächenscreenings in HIV-1 -infizierten CD4+-T-Lymphozyten ist schematisch in der Fig. 1 dargestellt.
2. Überexpression von Membranrezeptoren in HIV-1 -infizierten T-Lymphozyten
48 bis 72 Stunden nach der Infektion der CD4+-T-Lymphozyten zeigt sich zunächst erwartungsgemäß die Überexpression von Membranrezeptoren, die im Stand der Technik im Zusammenhang mit einer HIV-Infektion bereits beschrieben wurden, wie bspw. von CD45RO, CD25, CD150 und CD279. Diese Ergebnisse bestätigen die Robustheit und Zuverlässigkeit des entwickelten Screeningverfahrens.
Überraschenderweise konnten jedoch die Erfinder auf den infizierten Zellen eine Vielzahl von weiteren bislang nicht beschriebenen überexprimierten Membranrezeptoren finden. Dabei erfolgte der höchste Anstieg der Zelloberflächenexpression für CD134 (OX40), bei dem es sich um ein T-Zell-co-stimulierendes Molekül und Zytokinrezeptor handelt; vgl. Fig. 2A.
Die Werte geben die X-fache Erhöhung der Rezeptorexpression auf infizierten versus nicht-infizierten T-Lymphozyten an (n = 5, p-Wert für alle gezeigten Rezeptormoleküle < 0,01 ). Schwarz markiert sind Rezeptoren, für die eine Erhöhung der Expression bei der HIV-Infektion von CD4+-T-Lymphozyten schon beschrieben wurde. Für alle anderen weiß markierten Rezeptoren war eine Überexpression in HlV-infizierten CD4+-T-Lymphozyten nicht bekannt und damit überraschend.
Aus dem Blut von HIV-1 infizierten Individuen wurden CD4+-T-Lymphozyten isoliert. Die Oberfläche der Zellen wurde auf die Expression von CD134 und das Innere der Zelle auf HIV-1 p24 analysiert. Die Messung erfolgte mittels Durchflusszytometrie. Das Ergebnis ist in der Fig. 2B gezeigt.
Die Grafik zeigt die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) von CD134 in p24" (nicht infiziert) versus p24+ (infiziert) T-Zellen aus zehn Patienten. Eine statistische Berechnung erfolgte mit dem gepaarten Student T-Test. Dadurch konnte bestätigt werden, dass die CD134- Expression auch auf infizierten CD4+-T-Lymphozyten aus dem Blut von HIV-1 -Patienten stark ansteigt.
Folglich kann basierend auf der CD134-Expression eine HIV-1 infizierte CD4+-T- Lymphozytenzelle spezifisch von einer nicht-infizierten Zelle unterschieden werden.
CD134 ist damit ein ideales Ziel für eine Anti-HIV-1 -Immuntherapie.
3. Zytotoxisches Agens zur Behandlung einer HIV-Infektion
Derzeit stehen im Stand der Technik bereits einige Antikörper gegen humanes CD134 zur Verfügung. Ein Beispiel hierfür ist der von dem Unternehmen Medlmmune entwickelte Antikörper mit der Bezeichnung MEDI6469 bzw. 9B12. Dieser agonistische Antikörper wird bislang nur zur Behandlung von soliden Tumoren eingesetzt. Er wurde im Menschen bereits auf Sicherheit und Anti-Tumor-Aktivität getestet (Curti et al., 2013, a.a.O.). Der 9B12-Antikörper wird derzeit in einer klinischen Studie in Bezug auf seine Eignung zur Therapie von Tumoren getestet. Nach Erkenntnissen des Erfinders ist dieser Antikörper potentiell auch dazu geeignet, virusinfizierte CD4+-T-Lymphozyten zu eliminieren und damit die krankmachenden Viren aus dem befallenen Wirt zu entfernen.
Der Nachweis der zytotoxischen Eigenschaft erfolgt folgendermaßen:
PBMCs werden aus dem Blut von gesunden Spendern isoliert. Die isolierten Zellen werden mit HIV-1 , das GFP oder CFP exprimiert, infiziert. Dies ermöglicht die Identifizierung der infizierten Zellpopulation aufgrund der Expression des Chromophors. Verschiedene Mengen des gegen CD134 gerichteten Antikörpers, zum Beispiel MEDI6469 (9B12), werden hinzugegeben. Ein Anti-Maus-PE wird als Sekundärantikörper eingesetzt, um mittels Durchflusszytometrie Zellen zu detektieren, die den Antikörper binden. Dieses Experiment erlaubt es zu evaluieren, dass der Antikörper aufgrund der zellulären CD134- Expression spezifisch an HIV-1 infizierte Zellen bindet und nicht auch an nicht-infizierte Zellen. Es erlaubt auch zu ermitteln, ob unterschiedliche Dosen einen Einfluss auf das Niveau der spezifischen oder unspezifischen Bindung an HIV-1 -infizierte und nicht- infizierte Zellen haben.
[0087] Als nächstes werden über einen Zeitraum von 12 Tagen die virale Replikation und die
Menge der infizierten Zellen in der HIV-1 infizierten PBMC-Population beobachtet. Es werden unterschiedliche Mengen des Anti-CD134-Antikörpers zu den infizierten Kulturen gegeben. In 2-Tage-lntervallen wird die absolute Anzahl von infizierten CD4+-T-Zellen, nicht-infizierten CD4+-T-Zellen, die absoluten Spiegel von CD3+-Zellen sowie von CD8+-T- Zellen, die zytotoxische T-Lymphozyten repräsentieren, quantifiziert. Die T-Zell- Aktivierung und -Proliferierung wird durch Färbung auf CD69 und Ki67 analysiert. Die Spiegel von Monozyten werden durch die Expression des CD14-Rezeptors gemessen.
[0088] Darüber hinaus wird die Virusproduktion bestimmt, indem die Freisetzung von p24 in den
Überstand und die Menge von infektiösen, freigesetzten Virionen an einer Reporterzelllinie quantifiziert werden. Als Kontrollen werden nicht-infizierte PBMC-Kulturen mit oder ohne Behandlung mit einem Anti-CD134-Antikörper sowie HIV-1 -infizierte PBMC ohne jede Behandlung eingeschlossen. Es werden zumindest drei verschiedene Spender analysiert. Diese Experimente erlauben die Schlussfolgerung, dass die CD134-Ligation auf ex vivo infizierten Primärzellen das Potential hat, infizierte Zellen zu eliminieren bzw. die virale Replikation zu unterdrücken, und dass nicht-infizierte Zellen von der Behandlung nicht betroffen oder eliminiert werden.
[0089] In einem etablierten humanisierten Mausmodell für die HIV-1 -Infektion lässt sich die
Effizienz einer Anti-CD134-Behandlung verifizieren. Ein solches Mausmodell wird über das Unternehmen "Transcure" bereitgestellt. Diese Mäuse werden mit HIV-1 infiziert und unbehandelt gelassen (n=5) oder drei verschiedene Dosen des Anti-CD134-Antikörpers verabreicht (n=5, jede Dosis), um CD134 zu ligieren und spezifisch die HIV-1 infizierten Zellen zu eliminieren, die hohe Spiegel von CD134 exprimieren. Die virale Last, die CD4+- T-Lymphozyten-Zählungen sowie der prozentuale Anteil von infizierten Zellen werden beobachtet. Insgesamt zeigen diese Experimente, dass die Ligation von CD134 durch einen hiergegen gerichteten Antikörper, wie bspw. MEDI6469 (9B12), das Potential hat, HIV-1 infizierte Zellen aus einem Organismus zu eliminieren und sie folglich eine neue Anti-HIV-1 -Immuntherapie darstellt.

Claims

Patentansprüche
1 . Zytotoxisches Agens zur Prophylaxe und/oder Behandlung einer Virusinfektion, das zur selektiven Bindung an einen Membranrezeptor virusinfizierter T- Lymphozyten ausgebildet ist, wobei der Membranrezeptor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: CD134, CD132, CD71 , CD70, CD54, CD39, BTLA, CD97, CD2, CD63, CD50, CD161 , CD218, CD226, CD7, CD49d und CD29.
2. Zytotoxisches Agens nach Anspruch 1 , das an ein für den Membranrezeptor selektives Bindemolekül gekoppelt ist.
3. Zytotoxisches Agens nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Bindemolekül ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Immunglobulin, Immunglo- bulinfragment, Aptamer, niedermolekulare Verbindung, Rezeptor, Rezeptorfragment, Zytokin.
4. Zytotoxisches Agens nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Immunglobulin ein agonistischer Antikörper ist.
5. Zytotoxisches Agens nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Immunglobulin ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: MEDI6469 (9B12), MEDI6383, MEDI0562, Hu106-222/Hu1 19-122 (UTMDACC).
6. Zytotoxisches Agens nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den virusinfizierten T-Lymphozyten um virusinfizierte CD4+-T-Lymphozyten handelt.
7. Zytotoxisches Agens nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Virusinfektion um eine HIV-Infektion handelt.
8. Zytotoxisches Agens nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Zytostatikum aufweist.
9. Zytotoxisches Agens nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Zytostatikum ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Alkylanzien, Platinanaloga, Interkalantien, Antibiotika, Mitosehemmer, Taxane.
10. Zytotoxisches Agens nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Virostatikum aufweist.
1 1 . Pharmazeutische Zusammensetzung, die das zytotoxische Agens nach einem der Ansprüche 1 -10 sowie einen pharmazeutisch akzeptablen Träger aufweist.
12. Verwendung eines zytotoxischen Agens' zur Prophylaxe und/oder Behandlung von Virusinfektion, das zur selektiven Bindung an einen Membranrezeptor virusinfizierter T-Lymphozyten ausgebildet ist, wobei der Membranrezeptor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: CD134, CD132, CD71 , CD70, CD54, CD39, BTLA, CD97, CD2, CD63, CD50, CD161 , CD218, CD226, CD7, CD49d und CD29.
13. Verfahren zum Auffinden von zytotoxischen Agenzien, das das Auswählen solcher Verbindungen umfasst, die selektiv an einen Membranrezeptor virusinfizierter T- Lymphozyten binden können, wobei der Membranrezeptor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: CD134, CD132, CD71 , CD70, CD54, CD39, BTLA, CD97, CD2, CD63, CD50, CD161 , CD218, CD226, CD7, CD49d und CD29.
14. Verwendung eines Membranrezeptors virusinfizierter T-Lymphozyten, der gegenüber nicht-infizierten T-Lymphozyten überexprimiert ist, zur Diagnose einer Virusinfektion, wobei der Membranrezeptor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: CD134, CD132, CD71 , CD70, CD54, CD39, BTLA, CD97, CD2, CD63, CD50, CD161 , CD218, CD226, CD7, CD49d und CD29.
15. Verfahren zur Diagnose einer Virusinfektion, das die Bestimmung einer etwaigen Überexpression eines Membranrezeptors virusinfizierter T-Lymphozyten gegenüber nicht-infizierten T-Lymphozyten umfasst, wobei der Membranrezeptor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: CD134, CD132, CD71 , CD70, CD54, CD39, BTLA, CD97, CD2, CD63, CD50, CD161 , CD218, CD226, CD7, CD49d und
16. Verfahren zur Bestimmung von Oberflächenstrukturen auf virusinfizierten T-
Lymphozyten, vorzugsweise Membranrezeptoren, die als Ziel von zytostatischen Agenzien geeignet sind, das die Infektion von T-Lymphozyten mit einem Virus und die Bestimmung einer etwaigen Überexpression der Oberflächenstrukturen auf den virusinfizierten T-Lymphozyten gegenüber nicht-infizierten T-Lymphozyten umfasst.
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