WO2017154795A1 - 人工多能性幹細胞の腸管上皮細胞への分化誘導 - Google Patents

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知樹 壁谷
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    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells

Definitions

  • the present invention relates to a method for inducing differentiation of induced pluripotent stem cells (iPS) into intestinal epithelial cells and uses thereof.
  • iPS induced pluripotent stem cells
  • iPS induced pluripotent stem
  • Patent Document 1 In order to provide intestinal epithelial cells used for drug absorption tests and the like, a method for selectively obtaining intestinal stem / progenitor cells from cells derived from the intestinal tract has been reported (Patent Document 1). In addition, a method for producing or maintaining pluripotent cells using an ALK5 inhibitor has been proposed (Patent Document 2).
  • Non-patent Document 1 Reports that embryoid bodies were formed from mouse iPS cells to produce intestinal tract-like tissues (Non-patent Document 1), and reports that intestinal-like tissues were prepared from human iPS cells by three-dimensional culture (Non-Patent Documents 2, Although there is 3), the differentiation induction methods in these reports are complicated, and the differentiation efficiency is not sufficient, and pharmacokinetic analysis has not been performed in detail. Furthermore, the differentiation induction method induces differentiation using a large amount of extremely expensive growth factors and cytokines and is not suitable for practical use.
  • Non-Patent Documents 4, 5, and 6 human pluripotent stem cells (ES cells or iPS cells) were successfully differentiated into intestinal cells (Non-Patent Documents 4, 5, and 6), but the pharmacokinetic functions are sufficient. It has not been revealed.
  • the present inventors are also studying the differentiation of human iPS cells into intestinal epithelial cells, and have reported that the prepared intestinal epithelial cell-like cells have various pharmacokinetic functions (Patent Document 3).
  • Non-Patent Documents 7 and 8 Low molecular weight compounds useful for promoting differentiation from human iPS cells to intestinal epithelial cells and acquiring functions have been found (Patent Document 3, Non-Patent Document 8).
  • this invention makes it a subject to provide the new method and its use which can prepare easily the cell (intestinal epithelial cell-like cell) which shows the function close
  • Patent Document 3 a new low molecular weight compound having an action different from the previously reported low molecular weight compound (Patent Document 3), and its action on differentiation from iPS cells into intestinal epithelial cells. ⁇ The effect was examined in detail. In addition, detailed studies were made on the pharmacokinetic functions of intestinal epithelial cell-like cells obtained by inducing differentiation using low molecular weight compounds that were found to be useful.
  • cAMP is important as an inducing factor in inducing differentiation of intestinal stem cell-like cells obtained from iPS cells via endoderm-like cells into intestinal epithelial cell-like cells.
  • the cells are cultured under conditions where cAMP is supplied to the cells.
  • suppressing the decrease in intracellular cAMP concentration by using a cAMP-degrading enzyme inhibitor is effective for inducing differentiation into the intestinal epithelium, particularly for acquiring the function as an intestinal epithelial cell.
  • useful knowledge was brought about about the relationship between the addition time of the low molecular compound to be used and the effect.
  • the present inventors have found a new low molecular weight compound useful for promoting differentiation and acquiring a function, and succeeded in producing a more functional intestinal epithelial cell-like cell.
  • the following invention is mainly based on the above results and considerations.
  • a method for inducing differentiation of induced pluripotent stem cells into intestinal epithelial cells comprising the following steps (1) to (3): (1) a step of differentiating induced pluripotent stem cells into endoderm-like cells; (2) a step of differentiating the endoderm-like cells obtained in step (1) into intestinal stem cell-like cells; (3) A step of differentiating the intestinal stem cell-like cells obtained in step (2) into intestinal epithelial cell-like cells in the presence of a MEK1 inhibitor, a DNA methylation inhibitor, a TGF ⁇ receptor inhibitor, and EGF And culturing under conditions in which cAMP is supplied to the cells.
  • step (3) includes any one of the following AC culture steps: Culturing step A: (a-1) culturing in the presence of a MEK1 inhibitor, DNA methylation inhibitor, TGF ⁇ receptor inhibitor and EGF, and (a-2) MEK1 inhibitor, DNA methyl following the culturing. Including culturing in the presence of a phosphorylation inhibitor, a TGF ⁇ receptor inhibitor and EGF, and under conditions where cAMP is supplied to the cells, Culturing step B: (b-1) culturing in the presence of a MEK1 inhibitor, a DNA methylation inhibitor, a TGF ⁇ receptor inhibitor and EGF and supplying cAMP to the cells, and subsequent to the culturing.
  • (B-2) including culturing in the presence of a MEK1 inhibitor, a DNA methylation inhibitor, a TGF ⁇ receptor inhibitor, an EGF and a cAMP degrading enzyme inhibitor
  • Culturing step C: (c-1) includes culturing in the presence of a MEK1 inhibitor, a DNA methylation inhibitor, a TGF ⁇ receptor inhibitor and EGF, and a condition where cAMP is supplied to the cells.
  • the culture period of (a-1) is 1 to 5 days, the culture period of (a-2) is 3 to 15 days, The culture period of (b-1) is 3 days to 15 days, the culture period of (b-2) is 3 days to 15 days, The method according to [3], wherein the culture period of (c-1) is 3 days to 15 days.
  • the culture of (a-2), the culture of (b-1), and the culture of (c-1) are added to the cAMP in addition to the MEK1 inhibitor, DNA methylation inhibitor, TGF ⁇ receptor inhibitor and EGF.
  • the culture step A includes (a-3) culture in the presence of a MEK1 inhibitor, a DNA methylation inhibitor, a TGF ⁇ receptor inhibitor, and EGF following the culture of (a-2),
  • Culturing step B includes (b-3) culture in the presence of (b-3) MEK1 inhibitor, DNA methylation inhibitor, TGF ⁇ receptor inhibitor and EGF,
  • Culturing step C comprises (c-2) culturing in the presence of (c-2) MEK1 inhibitor, DNA methylation inhibitor, TGF ⁇ receptor inhibitor and EGF, following the culturing of (c-1).
  • the method according to any one of [5].
  • [16] The method according to [15], wherein the pharmacokinetics is metabolism, absorption, excretion, drug interaction, induction of a drug metabolizing enzyme, or induction of a drug transporter.
  • a method for evaluating the gastrointestinal mucosal disorder action of a test substance comprising the following steps (a) and (b): (A) contacting the test substance with the intestinal epithelial cell-like cell according to [14]; (B) a step of detecting the expression of mucin 2 in the intestinal epithelial cell-like cell and determining the gastrointestinal mucosal disorder action of the test substance based on the detection result, wherein decreased expression of mucin 2 is observed, A process that serves as an indicator that the test substance has a gastrointestinal mucosal disorder effect.
  • a method for evaluating the protective action of the test substance on the digestive tract mucosa comprising the following steps (A) and (B): (A) A step of bringing a test substance into contact with the intestinal epithelial cell-like cell according to [14]; (B) a step of detecting the expression of mucin 2 in the intestinal epithelial cell-like cell and determining the protective action of the test substance on the gastrointestinal mucosa based on the detection result, wherein increased expression of mucin 2 by the substance is observed This is a process that serves as an indicator that the test substance has a gastrointestinal mucosa protective action.
  • a cell preparation comprising the intestinal epithelial cell-like cell according to [14].
  • VD3 25-dihydroxyvitamin D 3
  • Meloxicam-50 Cells cultured in a medium supplemented with meloxicam at a concentration of 50 ⁇ M.
  • Meloxicam-200 Cells cultured in a medium supplemented with meloxicam at a concentration of 200 ⁇ M.
  • Indomethacin-75 Cells cultured in a medium supplemented with indomethacin at a concentration of 75 ⁇ M.
  • Indomethacin-300 Cells cultured in a medium supplemented with indomethacin at a concentration of 300 ⁇ M.
  • Ketoprofen-200 Cells cultured in a medium supplemented with ketoprofen at a concentration of 200 ⁇ M.
  • Ketoprofen-800 Cells cultured in a medium supplemented with ketoprofen at a concentration of 800 ⁇ M.
  • Irsogladine-10 cells cultured in a medium supplemented with irsogladine at a concentration of 10 ⁇ M.
  • Irsogladine-40 cells cultured in a medium supplemented with irsogladine at a concentration of 40 ⁇ M.
  • Rebamipide-50 Cells cultured in a medium supplemented with rebamipide at a concentration of 50 ⁇ M.
  • Rebamipide-100 Cells cultured in a medium supplemented with rebamipide at a concentration of 100 ⁇ M.
  • Rebamipide-250 Cells cultured in a medium supplemented with rebamipide at a concentration of 250 ⁇ M.
  • Rebamipide-1000 Cells cultured in a medium supplemented with rebamipide at a concentration of 1000 ⁇ M.
  • SI Commercially available human small intestinal cells.
  • Caco-2 Human colon cancer-derived cells.
  • the present invention relates to a method for inducing differentiation of induced pluripotent stem cells (iPS cells) into the intestinal epithelial cell lineage (hereinafter also referred to as “differentiation induction method of the present invention”).
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • intestinal epithelial cell lineage hereinafter also referred to as “differentiation induction method of the present invention.
  • iPS cells are cells having pluripotency (pluripotency) and proliferative ability produced by reprogramming somatic cells by introduction of reprogramming factors. Artificial pluripotent stem cells exhibit properties similar to ES cells. Somatic cells used for the production of iPS cells are not particularly limited, and may be differentiated somatic cells or undifferentiated stem cells. Although the origin thereof is not particularly limited, preferably, somatic cells of mammals (eg, primates such as humans and chimpanzees, rodents such as mice and rats), particularly preferably human somatic cells are used. iPS cells can be prepared by various methods reported so far. In addition, it is naturally assumed that an iPS cell production method developed in the future will be applied.
  • mammals eg, primates such as humans and chimpanzees, rodents such as mice and rats
  • iPS cell production The most basic method of iPS cell production is to introduce four factors, transcription factors Oct3 / 4, Sox2, Klf4 and c-Myc, into cells using viruses (Takahashi K, Yamanaka S : Cell 126 (4), 663-676, 2006; Takahashi, K, et al: Cell 131 (5), 861-72, 2007).
  • Human iPS cells have been reported to be established by introducing four factors, Oct4, Sox2, Lin28 and Nonog (Yu J, et al: Science 318 (5858), 1917-1920, 2007).
  • Three factors excluding c-Myc (Nakagawa M, et al: Nat. Biotechnol.
  • lentiviruses (Yu J, et al: Science 318 (5858), 1917-1920, 2007), adenoviruses (Stadtfeld M, et al: Science 322 (5903 ), 945-949, 2008), plasmid (Okita K, et al: Science 322 (5903), 949-953, 2008), transposon vectors (Woltjen K, Michael IP, Mohseni P, et al: 770, 2009; Kaji K, Norrby K, Pac a A, et al: Nature 458, 771-775, 2009; Yusa K, Rad R, Takeda J, et al: Nat Methods 6, 363-369, 2009), or Techniques using episomal vectors (Yu J, Hu K, Smuga-Otto K, Tian S, et al: Science 324, 797-801, 2009) have been developed.
  • pluripotent stem cell markers such as Fbxo15, Nanog, Oct / 4, Fgf-4, Esg-1, and Cript Etc. can be selected as an index.
  • the selected cells are collected as iPS cells.
  • IPS cells can also be provided from, for example, Kyoto University or RIKEN BioResource Center.
  • inducing differentiation means acting to differentiate along a specific cell lineage.
  • iPS cells are induced to differentiate into intestinal epithelial cells.
  • the differentiation induction method of the present invention is roughly divided into three stages of induction processes, that is, a process of differentiating iPS cells into endoderm-like cells (step (1)), and the obtained endoderm-like cells into intestinal stem cell-like cells. And the step of differentiating (step (2)) and the step of differentiating the obtained intestinal stem cell-like cells into intestinal epithelial cell-like cells (step (3)).
  • iPS cells are cultured and differentiated into endoderm-like cells.
  • iPS cells are cultured under conditions that induce differentiation into endoderm-like cells.
  • the culture conditions are not particularly limited as long as iPS cells differentiate into endoderm-like cells.
  • the cells are cultured in a medium supplemented with activin A according to a conventional method.
  • the concentration of activin A in the medium is, for example, 10 ng / mL to 200 ng / mL, preferably 20 ng / mL to 150 ng / mL.
  • serum or serum replacement Knockout serum replacement (KSR), etc.
  • Serum is not limited to fetal bovine serum, and human serum, sheep serum, and the like can also be used.
  • the amount of serum or serum replacement added is, for example, 0.1% (v / v) to 10% (v / v).
  • An inhibitor of the Wnt / ⁇ -catenin signaling pathway eg, hexachlorophene, quercetin, Wnt3a, which is a Wnt ligand
  • Wnt3a which is a Wnt ligand
  • two-stage culture is performed as step (1).
  • the first stage culture is performed in a medium supplemented with a relatively low concentration of serum (eg, 0.1% (v / v) to 1% (v / v)), and the second stage culture is the first stage culture.
  • a medium with a higher serum concentration for example, the serum concentration is 1% (v / v) to 10% (v / v)).
  • Adopting the two-stage culture in this way is preferable in that the growth of undifferentiated cells is suppressed by the first-stage culture and the differentiated cells are grown in the subsequent second stage.
  • the period of step (1) is, for example, 1 day to 10 days, preferably 2 days to 7 days.
  • the first stage culture period is, for example, 1 to 7 days, preferably 2 to 5 days
  • the second stage culture period is, for example, 1 to 6 days. Days, preferably 1 to 4 days.
  • the endoderm-like cells obtained in step (1) are cultured and differentiated into intestinal stem cell-like cells.
  • the endoderm cells are cultured under conditions that induce differentiation into intestinal stem cell-like cells.
  • the culture conditions are not particularly limited as long as the endoderm-like cells differentiate into intestinal stem cell-like cells.
  • the culture is performed in the presence of FGF2 (fibroblast growth factor 2) based on the experimental results shown in the Examples described later.
  • FGF2 fibroblast growth factor 2
  • human FGF2 for example, human recombinant FGF2
  • step (2) may be carried out.
  • the endoderm-like cells may be selected with a flow cytometer (cell sorter) using a cell surface marker as an index.
  • FGF2 In the presence of FGF2 is synonymous with the condition in which FGF2 is added to the medium. Therefore, in order to perform culture in the presence of FGF2, a medium supplemented with FGF2 may be used.
  • An example of the concentration of FGF2 added is 100 ng / mL to 500 ng / mL.
  • the period of step (2) (culture period) is, for example, 2 days to 10 days, preferably 3 days to 7 days. If the culture period is too short, the expected effects (increased differentiation efficiency, promotion of acquisition of functions as intestinal stem cells) cannot be sufficiently obtained. On the other hand, if the culture period is too long, the differentiation efficiency is lowered.
  • intestinal stem cell-like cells Differentiation into intestinal stem cell-like cells can be determined or evaluated using, for example, the expression of intestinal stem cell marker as an index.
  • intestinal stem cell markers are G protein-coupled receptor 5 (LGR5) and ephrin B2 receptor (EphB2) containing leucine-rich repeats.
  • Step (3) Differentiation into intestinal epithelial cell-like cells>
  • first condition a DNA methylation inhibitor, a TGF ⁇ receptor inhibitor, and EGF
  • second condition cAMP is supplied to the cell
  • the intestinal stem cell-like cells obtained in step (2) are differentiated into intestinal epithelial cell-like cells.
  • the cell population obtained through the step (2) or a part thereof is subjected to the step (3) without sorting.
  • the step (3) may be performed. Selection of intestinal stem cell-like cells may be performed, for example, with a flow cytometer (cell sorter) using a cell surface marker as an index.
  • the first condition that is, the presence of MEK1 inhibitor, DNA methylation inhibitor, TGF ⁇ receptor inhibitor and EGF is synonymous with the condition in which these compounds are added to the medium. Therefore, in order to satisfy the first condition, a medium to which these compounds are added may be used.
  • Examples of MEK1 inhibitors include PD98059, PD184352, PD184161, PD0325901, U0126, MEK inhibitor I, MEK inhibitor II, MEK1 / 2 inhibitor II, and SL327.
  • examples of DNA methylation inhibitors include 5-aza-2'-deoxycytidine, 5-azacytidine, RG108, and zebralin.
  • A-83-01 used in the examples described later exhibits inhibitory activity on TGF- ⁇ receptors ALK4, ALK5, and ALK7. What shows inhibitory activity with respect to one or more of ALK4, ALK5, and ALK7 may be used.
  • A-83-01, SB431542, SB-505124, SB525334, D4476, ALK5 inhibitor, LY2157299, LY364947, GW788388, and RepSox satisfy the condition.
  • concentration of MEK1 inhibitor added is 4 ⁇ M to 100 ⁇ M, preferably 10 to 40 ⁇ M.
  • an example of the addition concentration of a methylation inhibitor in the case of 5-aza-2′-deoxycytidine is 1 ⁇ M to 25 ⁇ M, preferably 2.5 ⁇ M to 10 ⁇ M
  • the addition concentration of the TGF ⁇ receptor inhibitor is 0.1 ⁇ M to 2.5 ⁇ M, preferably 0.2 ⁇ M to 1 ⁇ M.
  • concentration when using the compound different from the illustrated compound ie, PD98059, 5-aza-2'-deoxycytidine, and A-83-01
  • concentration when using the compound different from the illustrated compound ie, PD98059, 5-aza-2'-deoxycytidine, and A-83-01
  • concentration when using the compound different from the illustrated compound ie, PD98059, 5-aza-2'-deoxycytidine, and A-83-01
  • concentration according to the above concentration range In view of the difference in properties (particularly the difference in activity) of PD98059, 5-aza-2′-deoxycytidine, A-83-01), those skilled in the art can set the concentration according to the above concentration range. Further, whether or not the set concentration range is appropriate can be confirmed by a preliminary experiment according to an example described later.
  • the second condition that is, the condition under which cAMP is supplied to the cell is synonymous with the condition in which a compound that can be taken into the cell and a compound that acts as cAMP when taken into the cell is present. Therefore, in order to satisfy the second condition, for example, a medium to which a cAMP derivative that can be taken into cells is added may be used.
  • PAMP activators e.g., 8-Br-cAMP (8-Bromoadenosine-3 ′, 5′-cyclic monophosphate sodium salt, CAS Number: 76939-46-3), 6-Bnz-cAMP (N6-Benzoyladenosine- 3 ', 5'-cyclic monophosphate sodium salt salt, CAS Number: 1135306-29-4), cAMPS-Rp ((R) -Adenosine, cyclic 3', 5 '-(hydrogenphosphorothioate) triethylammonium salt, CAS Number: 151837- 09-1), cAMPS-Sp ((S) -Adenosine, cyclic 3 ', 5'-(hydrogenphosphorothioate) triethylammonium salt, CAS Number: 93602-66-5), Dibutyryl-cAMP (N6, O2'-Dibutyryl adenosine 3 ', 5'-cyclic monophosphate
  • 8-CPT-cAMP 8 -(4-Chlorophenylthio) adenosine 3 ', 5'-cyclic monophosphate, CAS Number: 93882-12-3
  • 8-pCPT-2'-OM e-cAMP e.g., 8- (4-Chlorophenylthio) -2′-O-methyladenosine 3 ′, 5′-cyclic monophosphate monosodium, CAS No Number: 634634207-53-7) can be used.
  • concentration of cAMP derivative added is 0.1 mM to 10 mM, preferably 0.2 mM to 5 mM, more preferably 0.5 mM to 2 mM.
  • addition concentration in the case of using the exemplified compound, that is, a compound different from 8-Br-cAMP, the difference between the characteristics of the compound used and the characteristics of the exemplified compound (8-Br-cAMP) (particularly In view of the difference in activity), those skilled in the art can set the concentration according to the above concentration range. Further, whether or not the set concentration range is appropriate can be confirmed by a preliminary experiment according to an example described later.
  • the period (culture period) of step (3) is, for example, 7 to 40 days, preferably 10 to 30 days. If the culture period is too short, the expected effects (increased differentiation efficiency, promotion of acquisition of functions as intestinal epithelial cells) cannot be sufficiently obtained. On the other hand, if the culture period is too long, the differentiation efficiency is lowered.
  • intestinal epithelial cell markers include ATP binding cassette transporter B1 / multidrug resistance protein 1 (ABCB1 / MDR1), ATP binding cassette transporter G2 / breast cancer resistance protein (ABCG2 / BCRP), cytochrome P450P3A4 (CYP3A4) , Pregnane X receptor (PXR), SLC (solute carrier) family member 15A1 / peptide transporter 1 (SLC15A1 / PEPT1), SLC (solute carrier) organic anion transporter 2B1 (SLCO2B1 / OATP2B1), sucrase-isomaltase, uridine
  • ATP binding cassette transporter B1 / multidrug resistance protein 1 ABSB1 / MDR1
  • ATP binding cassette transporter G2 / breast cancer resistance protein ABCG2 / BCRP
  • cytochrome P450P3A4 cytochrome P450P3A4
  • PXR Pregnane X receptor
  • SLC synthetic carrier family member
  • sucrase-isomaltase which is highly specific to the intestinal epithelium, and villin 1, CYP3A4, a major drug-metabolizing enzyme in the small intestine, SLC15A1 / PEPT1, which is involved in peptide absorption in the small intestine, and organic anions in the small intestine SLCO2B1 / OATP2B1 involved in absorption is a particularly effective marker.
  • a cell population consisting only of the target cells (intestinal epithelial cell-like cells) or a cell population that contains the target cells in a high ratio (high purity)
  • select a cell surface marker that is characteristic for the target cells may be selected and sorted as an index.
  • step (3) any one of the following culture steps A to C is performed.
  • ⁇ Culture process A> In the culture step A, (a-1) culture in the presence of a MEK1 inhibitor, a DNA methylation inhibitor, a TGF ⁇ receptor inhibitor and EGF, followed by the culture, (a-2) a MEK1 inhibitor, DNA Culturing is performed in the presence of a methylation inhibitor, a TGF ⁇ receptor inhibitor, and EGF, and under conditions where cAMP is supplied to the cells. That is, two-stage culture is performed depending on whether or not cAMP is supplied to the cells. In this way, effects of promoting differentiation into intestinal epithelial cells, maturation, and function acquisition can be obtained.
  • the culture period of (a-1) is, for example, 1 day to 5 days.
  • the culture period of (a-2) is, for example, 3 to 15 days.
  • the culture of (a-2) may be performed under conditions where a cAMP-degrading enzyme inhibitor is also present in addition to the MEK1 inhibitor, the DNA methylation inhibitor, the TGF ⁇ receptor inhibitor and the EGF. If such conditions are adopted, it can be expected that inhibition of cAMP degradation suppresses a decrease in intracellular cAMP concentration and promotes differentiation into intestinal epithelium, in particular, acquisition of functions as intestinal epithelial cells. That is, this condition is advantageous for the preparation of more functional intestinal epithelial cell-like cells.
  • cAMP-degrading enzyme inhibitors include IBMX® (3-isobutyl-1-methylxanthine) ® (MIX), Theophylline, Papaverine, Pentoxifylline® (Trental), KS-505, 8-Methoxymethyl-IBMX, Vinpocetine® (TCV-3B), EHNA, Trequinsin (HL-725), Lixazinone (RS-82856), (LY-186126), Cilostamide (OPC3689), Bemorradan (RWJ-22867), Anergrelide (BL4162A), Indolidan (LY195115), Cilostazol (OPC-13013), Milrinone ( WIN47203), Siguazodan (SKF-94836), 5-Methyl-imazodan (CI 930), SKF-95654, Pirilobendan (UD-CG 115 BS), Enoximone (MDL 17043), Imazodan (CL 914), SKF-94120, Vesnarin
  • concentration of cAMP-degrading enzyme inhibitor added is 0.05 mM to 5 mM, preferably 0.1 mM to 3 mM, more preferably 0.2 mM to 1 mM.
  • addition concentration when using a compound different from the exemplified compound that is, a compound different from IBMX, considering the difference between the characteristics of the compound used and the characteristics of the exemplified compound (IBMX) (particularly the difference in activity)
  • concentration range considering the difference between the characteristics of the compound used and the characteristics of the exemplified compound (IBMX) (particularly the difference in activity)
  • concentration range considering the difference between the characteristics of the compound used and the characteristics of the exemplified compound (IBMX) (particularly the difference in activity)
  • concentration range that is, a compound different from IBMX
  • culture in the presence of a MEK1 inhibitor, a DNA methylation inhibitor, a TGF ⁇ receptor inhibitor and EGF may be performed.
  • the culture period is, for example, 1 day to 10 days.
  • ⁇ Culture process B> In the culture step B, (b-1) culture in the presence of a MEK1 inhibitor, a DNA methylation inhibitor, a TGF ⁇ receptor inhibitor, and EGF, and a condition in which cAMP is supplied to the cells, followed by the culture. (B-2) Cultivation is carried out in the presence of a MEK1 inhibitor, a DNA methylation inhibitor, a TGF ⁇ receptor inhibitor, EGF and a cAMP degrading enzyme inhibitor.
  • a MEK1 inhibitor a DNA methylation inhibitor
  • TGF ⁇ receptor inhibitor a TGF ⁇ receptor inhibitor
  • EGF EGF
  • a cAMP degrading enzyme inhibitor a cAMP degrading enzyme inhibitor
  • the culture period of (b-1) is, for example, 3 to 15 days.
  • the culture period of (b-2) is, for example, 3 to 15 days.
  • the culture of (b-1) may be carried out under conditions where a cAMP-degrading enzyme inhibitor is present in addition to the MEK1 inhibitor, DNA methylation inhibitor, TGF ⁇ receptor inhibitor and EGF.
  • a cAMP-degrading enzyme inhibitor is present in addition to the MEK1 inhibitor, DNA methylation inhibitor, TGF ⁇ receptor inhibitor and EGF.
  • culture in (b-2) After the culture in (b-2), culture in the presence of a MEK1 inhibitor, a DNA methylation inhibitor, a TGF ⁇ receptor inhibitor and EGF (culture in (b-3)) may be performed.
  • the culture period is, for example, 1 day to 10 days.
  • ⁇ Culture process C> In the culturing step C, (c-1) culturing is performed in the presence of a MEK1 inhibitor, a DNA methylation inhibitor, a TGF ⁇ receptor inhibitor, and EGF, and under conditions where cAMP is supplied to the cells.
  • the culture period of (c-1) is, for example, 3 to 15 days.
  • concentration of each compound, etc. said corresponding description is used.
  • a condition in which a cAMP-degrading enzyme inhibitor is present in addition to the MEK1 inhibitor, the DNA methylation inhibitor, the TGF ⁇ receptor inhibitor and the EGF is also used (the condition in which cAMP is supplied to the cells is used in combination). You may decide to do it. When such conditions are employed, a decrease in intracellular cAMP concentration can be suppressed while supplying cAMP to the cells. Therefore, it is an effective condition for maintaining intracellular cAMP at a high level, and it can be expected that efficient differentiation induction into intestinal epithelial cells is promoted.
  • culture in (c-2) After the culture in (c-1), culture in the presence of a MEK1 inhibitor, a DNA methylation inhibitor, a TGF ⁇ receptor inhibitor and EGF (culture in (c-2)) may be performed.
  • the culture period is, for example, 1 day to 10 days.
  • step (1), (2), (3), step (3), step A, step B, step C subculture is performed in the middle. Also good. For example, when the cells become confluent or subconfluent, a part of the cells is collected and transferred to another culture vessel, and the culture is continued. In order to promote differentiation, it is preferable to set the cell density low. For example, the cells may be seeded at a cell density of about 1 ⁇ 10 4 cells / cm 2 to 1 ⁇ 10 6 cells / cm 2 .
  • ROCK inhibitor Rho-associated coiled-coil forming kinase / Rho-binding kinase
  • culture conditions in each step constituting the present invention may be those generally adopted in animal cell culture. That is, for example, it may be cultured in an environment of 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • IMDM Iskov modified Dulbecco medium
  • Ham F12 medium HamF12
  • D-MEM Dulbecco modified Eagle medium
  • Gibco, etc. Glasgow basic medium
  • RPMI1640 medium etc.
  • Two or more basic media may be used in combination.
  • a basic medium suitable for culturing epithelial cells for example, D-MEM and Ham F12 medium
  • D-MEM a mixed medium
  • components that can be added to the medium include bovine serum albumin (BSA), antibiotics, 2-mercaptoethanol, PVA, non-essential amino acids (NEAA), insulin, transferrin, and selenium.
  • BSA bovine serum albumin
  • NEAA non-essential amino acids
  • insulin transferrin
  • selenium selenium
  • cells are cultured two-dimensionally using a culture dish or the like.
  • intestinal epithelial cell-like cells can be obtained from iPS cells by two-dimensional culture.
  • three-dimensional culture using a gel culture substrate or a three-dimensional culture plate may be performed.
  • the second aspect of the present invention relates to the use of intestinal epithelial cell-like cells prepared by the differentiation induction method of the present invention.
  • Various assays are provided as a first use.
  • the intestinal epithelial cell-like cell of the present invention can be used in a model system of the intestine, particularly the small intestine, and is useful for evaluating pharmacokinetics (absorption, metabolism, etc.) and toxicity in the intestine, particularly the small intestine.
  • the intestinal epithelial cell-like cell of the present invention can be used for evaluating the pharmacokinetics and toxicity of the compound.
  • the intestinal epithelial cell-like cells of the present invention can be used to test the absorbability or membrane permeability of a test substance, drug interaction, induction of drug metabolizing enzymes, induction of drug transporters, toxicity, etc. it can. That is, the present invention evaluates the absorbability or membrane permeability of a test substance, drug interaction, induction of a drug metabolizing enzyme, induction of a drug transporter, toxicity, etc. as one of the uses of intestinal epithelial cell-like cells.
  • a method (first aspect) is provided.
  • a step of preparing a cell layer composed of intestinal epithelial cell-like cells obtained by the differentiation induction method of the present invention and (ii) a step of bringing a test substance into contact with the cell layer; (Iii) quantifying a test substance that has permeated through the cell layer, and evaluating the absorbability or membrane permeability of the test substance, drug interaction, induction of a drug metabolizing enzyme, induction of a drug transporter, or toxicity Do.
  • the absorbability of the test substance can also be evaluated by the method described later (second aspect).
  • intestinal epithelial cell-like cells are typically cultured on a semipermeable membrane (porous membrane) to form a cell layer.
  • a semipermeable membrane for example, Transwell (registered trademark) provided by Corning
  • a culture insert for example, Transwell (registered trademark) provided by Corning
  • “Contact” in step (ii) is typically performed by adding a test substance to the medium.
  • the timing of adding the test substance is not particularly limited. Therefore, after culturing is started in a medium not containing the test substance, the test substance may be added at a certain point in time, or the culture may be started in advance in a medium containing the test substance.
  • organic compounds or inorganic compounds having various molecular sizes can be used as the test substance.
  • organic compounds include nucleic acids, peptides, proteins, lipids (simple lipids, complex lipids (phosphoglycerides, sphingolipids, glycosylglycerides, cerebrosides, etc.), prostaglandins, isoprenoids, terpenes, steroids, polyphenols, catechins, vitamins (B1, B2, B3, B5, B6, B7, B9, B12, C, A, D, E, etc.) Existing or candidate ingredients such as pharmaceuticals, nutritional foods, food additives, agricultural chemicals, cosmetics (cosmetics)
  • One of the preferable test substances is a plant extract, cell extract, culture supernatant, etc.
  • the test substance can be used by simultaneously adding two or more kinds of test substances.
  • the test substance may be derived from a natural product or synthesized, for example, in the latter case It is possible to build an efficient assay systems using techniques
  • the period for contacting the test substance can be set arbitrarily.
  • the contact period is, for example, 10 minutes to 3 days, preferably 1 hour to 1 day.
  • the contact may be performed in a plurality of times.
  • the test substance that has permeated the cell layer is quantified.
  • a culture vessel equipped with a culture insert such as Transwell a test substance that has passed through the culture insert, that is, a sample that has moved into the upper or lower vessel through the cell layer.
  • the test substance is quantified by a measurement method such as mass spectrometry, liquid chromatography, or immunological technique (for example, fluorescence immunoassay (FIA method), enzyme immunoassay (EIA method)) according to the test substance.
  • FIA method fluorescence immunoassay
  • EIA method enzyme immunoassay
  • the absorbability or membrane permeability of the test substance Based on the quantification result (the amount of the test substance that has permeated the cell layer) and the amount of the test substance used (typically the amount added to the medium), the absorbability or membrane permeability of the test substance, drug interaction, Judge and evaluate drug-metabolizing enzyme induction, drug transporter induction, or toxicity.
  • the present invention also provides a method for evaluating metabolism or absorption of a test substance as another aspect (second aspect).
  • this method (I) a step of bringing a test substance into contact with the intestinal epithelial cell-like cell obtained by the differentiation induction method of the present invention, and (II) metabolism or absorption of the test substance, drug interaction, drug metabolizing enzyme Induction, drug transporter induction, or a step of measuring and evaluating toxicity.
  • Step (I) that is, the contact between the intestinal epithelial cell-like cells and the test substance can be carried out in the same manner as in the above step (ii). However, it is not essential to form a cell layer in advance.
  • step (II) the metabolism or absorption of the test substance, drug interaction, induction of drug metabolizing enzyme, induction of drug transporter, or toxicity is measured and evaluated (step (II)).
  • step (I) that is, after contact with the test substance, metabolism or the like can be measured and evaluated without a substantial time interval, or for a certain time (for example, 10 minutes to 5 hours).
  • Metabolism etc. may be measured and evaluated after the passage. Metabolism can be measured, for example, by detecting a metabolite. In this case, the expected metabolite is usually measured qualitatively or quantitatively using the culture solution after step (I) as a sample.
  • An appropriate measurement method may be selected according to the metabolite. For example, mass spectrometry, liquid chromatography, immunological method (eg, fluorescence immunoassay (FIA method), enzyme immunoassay (EIA method)) ) Etc. can be adopted.
  • FFA method fluorescence immunoassay
  • EIA method enzyme
  • the metabolic amount of the test substance can be evaluated according to the amount of the metabolite.
  • the metabolic efficiency of the test substance may be calculated based on the detection result of the metabolite and the amount of the test substance used (typically, the amount added to the medium).
  • Test substance using the expression of drug metabolizing enzymes (cytochrome P450 (especially CYP3A4), uridine diphosphate-glucuronyltransferase (especially UGT1A8, UGT1A10), sulfate transferase (especially SULT1A3, etc.)) in intestinal epithelial cell-like cells It is also possible to measure the metabolism.
  • the expression of drug metabolizing enzymes can be assessed at the mRNA level or protein level. For example, when an increase in the mRNA level of the drug-metabolizing enzyme is observed, it can be determined that “the test substance has been metabolized”. Similarly, when an increase in the activity of the drug-metabolizing enzyme is observed, it can be determined that “the test substance has been metabolized”. As in the case of determining a metabolite as an index, quantitative determination / evaluation may be performed based on the expression level of a drug metabolizing enzyme.
  • the remaining amount of the test substance in the culture solution is measured.
  • the test substance is quantified using the culture solution after step (I) as a sample.
  • An appropriate measuring method may be selected according to the test substance. For example, mass spectrometry, liquid chromatography, immunological techniques (for example, fluorescence immunoassay (FIA method), enzyme immunoassay (EIA method)) and the like can be employed.
  • FFA method fluorescence immunoassay
  • EIA method enzyme immunoassay
  • the amount of absorption or absorption efficiency of the test substance can be determined and evaluated according to the degree of decrease.
  • the absorption can also be evaluated by measuring the amount of the test substance taken up into the cells.
  • the measurement / evaluation of metabolism and the measurement / evaluation of absorption may be performed simultaneously or in parallel.
  • mucin 2 which is recognized in human small intestinal epithelial cells, is frequently used as a model system for the small intestine, as shown in the Examples below. It was found that the cells are highly expressed at a level that is not comparable to Caco-2 cells (cells derived from human colon cancer). This fact confirms that the cell is extremely useful as a model system for the small intestine, and also shows that mucin 2 expression is useful as an indicator of an assay using the cell.
  • the present invention provides, as a further embodiment (third embodiment) of the assay using intestinal epithelial cell-like cells, two evaluation methods using mucin 2 expression as an index, ie, gastrointestinal mucosal disorder action of the test substance. (Third aspect; hereinafter referred to as “disorder action evaluation method” in some cases) and a method (fourth aspect. Hereinafter referred to as “protective action”). (Sometimes abbreviated as "evaluation method”). Note that the method for evaluating the disorder action of the present invention is particularly useful for predicting a drug that may cause mucosal disorder (ulcer) as a side effect (prediction of the risk of side effects). It is particularly useful for screening for new drugs that have the effect of suppressing side effects or stress ulcers.
  • the disorder action evaluation method (third aspect) of the present invention (a) a step of bringing a test substance into contact with an intestinal epithelial cell-like cell obtained by the differentiation induction method of the present invention, and (b) the intestinal epithelial cell Detecting mucin 2 expression in cells and determining the gastrointestinal mucosal damage action of the test substance based on the detection results. A process that serves as an indicator of having an obstructive action is performed.
  • Step (a) that is, the contact between the intestinal epithelial cell-like cell and the test substance can be carried out in the same manner as in the above-described embodiment (first embodiment, second embodiment). However, it is not essential to form a cell layer in advance. Since the test substance that can be used is the same as the above-described aspects (the first aspect and the second aspect), the description thereof is omitted.
  • the expression of mucin 2 in the intestinal epithelial cell-like cells is detected, and the gastrointestinal mucosal disorder action of the test substance is determined based on the detection result. That is, in the present invention, the gastrointestinal mucosal disorder action of the test substance is determined using the expression of mucin 2. More specifically, the fact that decreased expression of mucin 2 is observed is used as an indicator that the test substance has a gastrointestinal mucosal disorder action. Therefore, it is determined that the test substance has gastrointestinal mucosal disorder action when mucin 2 expression is reduced, and the test substance has no gastrointestinal mucosa disorder action when mucin 2 expression is not reduced. judge.
  • the intensity (degree) of gastrointestinal mucosal disorder action may be determined based on the degree (level) of mucin 2 expression reduction.
  • the strength of the gastrointestinal mucosal disorder action of each test substance may be compared and evaluated based on the degree (level) of mucin 2 expression decrease.
  • Mucin 2 is a secreted protein. Mucin 2 is a mucosal substance involved in the protection of the intestinal mucosa, and it is known that a decrease in the quality and quantity of mucin 2 induces ulcerative colitis and cancer.
  • Mucin 2 expression may be detected, for example, according to a conventional method.
  • Methods for detecting mucin 2 include RT-PCR, real-time PCR (mRNA measurement / quantification), immunological methods such as fluorescence immunoassay (FIA) and enzyme immunoassay (EIA), mass spectrometry Etc. can be illustrated.
  • FIA fluorescence immunoassay
  • EIA enzyme immunoassay
  • control intestinal epithelial cell-like cells (other conditions are the same) (hereinafter referred to as “control”) that are not brought into contact with the test substance are prepared, and the expression of mucin 2 is also detected. Then, by comparing with the expression level of the control, it is determined whether the test substance reduces the expression of mucin 2. As described above, when the gastrointestinal mucosal disorder action of the test substance is determined by comparison with the control, a more reliable determination result can be obtained.
  • the protective action evaluation method (fourth aspect) of the present invention (A) a step of bringing a test substance into contact with an intestinal epithelial cell-like cell obtained by the differentiation induction method of the present invention, and (B) the intestinal epithelial cell Detecting the expression of mucin 2 in a cell-like cell and determining the protective action of the test substance on the gastrointestinal mucosa based on the detection result, the increased expression of mucin 2 by the substance is observed. A process that serves as an indicator of having a gastrointestinal mucosa protective effect is performed.
  • step (A) the intestinal epithelial cell-like cell is contacted with the test substance.
  • the contact between the intestinal epithelial cell-like cell and the test substance can be carried out in the same manner as in the above embodiment (third embodiment).
  • the expression of mucin 2 in the intestinal epithelial cell-like cells is detected, and the gastrointestinal mucosa protective action of the test substance is determined based on the detection result. That is, in the present invention, the gastrointestinal mucosa protective action of the test substance is determined using the expression of mucin 2. More specifically, the fact that increased expression of mucin 2 is observed is used as an indicator that the test substance has a gastrointestinal mucosa protective action. Therefore, it is determined that the test substance has gastrointestinal mucosa protective action when increased expression of mucin 2 is observed, and the test substance does not have gastrointestinal mucosa protective action when no increase in mucin 2 expression is observed. judge.
  • the strength (degree) of gastrointestinal mucosa protective action may be determined.
  • the strength and weakness of the gastrointestinal mucosa protective action of each test substance may be compared and evaluated based on the degree (level) of increased expression of mucin 2.
  • control a comparative control
  • intestinal epithelial cell-like cells that are not brought into contact with the test substance (other conditions are the same) can be used.
  • the evaluation method of this aspect is useful, for example, for screening for new drugs for prevention or treatment of mucosal disorders or stress ulcers as side effects of drugs.
  • an effective test substance is selected based on the determination result in the step (B).
  • the selected substance has a sufficient medicinal effect
  • the substance can be used as an active ingredient of the intestinal mucosa protective agent as it is.
  • it does not have a sufficient medicinal effect it can be used as an active ingredient of an intestinal mucosa protective agent after improving its medicinal effect by modifying such as chemical modification.
  • the same modification may be applied for the purpose of further increasing the medicinal effect.
  • a cell preparation containing intestinal epithelial cell-like cells is provided as a second use of the intestinal epithelial cell-like cells prepared by the differentiation induction method of the present invention.
  • the cell preparation of the present invention can be applied to the treatment of various intestinal diseases. In particular, it is expected to be used as a material for regeneration / reconstruction of intestinal epithelial tissue that has been impaired (including dysfunction). That is, contribution to regenerative medicine can be expected.
  • intestinal epithelial cell-like cells obtained by the method of the present invention are suspended in physiological saline or a buffer solution (for example, a phosphate buffer solution), or the cells are used. It can be prepared by producing a three-dimensional tissue (organoid or spheroid).
  • 1 ⁇ 10 5 to 1 ⁇ 10 10 cells may be contained as a single dose so that a therapeutically effective amount of cells can be administered.
  • the content of the cells can be appropriately adjusted in consideration of the purpose of use, the target disease, the sex of the application target (recipient), age, weight, the state of the affected area, the state of the cells, and the like.
  • DMSO Dimethyl sulfoxide
  • serum albumin for the purpose of cell protection, antibiotics for the purpose of blocking bacterial contamination, and various components (vitamins for the purpose of cell activation, proliferation or differentiation induction, etc. , Cytokines, growth factors, steroids, etc.) may be included in the cell preparation of the present invention.
  • other pharmaceutically acceptable ingredients for example, carriers, excipients, disintegrants, buffers, emulsifiers, suspensions, soothing agents, stabilizers, preservatives, preservatives, physiological saline, etc. You may make it contain in the cell formulation of this invention.
  • Method (1) Cells Human iPS cells (iPS-51: Windy) are expressed in human fetal lung fibroblasts MRC-5, octamer binding protein 3/4 (OCT3 / 4), sex determining region Y-box 2 (SOX2), After introducing kruppel-like factor 4 (KLF4), v-myc myelocytomatosis viral oncogene homolog (avian) (c-MYC) using a pantropic retrovirus vector, human ES cell-like colonies are cloned, Granted by Dr. Akihiro Umezawa, National Center for Child Health and Development. Mouse fetal fibroblasts (MEF) were used as feeder cells.
  • KLF4 kruppel-like factor 4
  • c-MYC v-myc myelocytomatosis viral oncogene homolog
  • FBS fetal bovine serum
  • L-Glu 2 mmol / L L-glutamine
  • NEAA non-essential amino acid
  • 100 units / mL penicillin G 100 ⁇ g / mL Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) containing streptomycin was used.
  • EDTA trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid
  • Cell Banker 1 was used as the MEF stock solution.
  • Human iPS cells were seeded on MEF (6 ⁇ 10 5 cells / 100 mm dish) treated with mitomycin C and cultured in a CO 2 incubator under 5% CO 2 /95% air conditions. Incubated at 0 ° C. Human iPS cells were subcultured at a split ratio of 1: 2 to 1: 3 after 3-5 days of culture. For human iPS cells, the medium was changed 48 hours after thawing and thereafter daily.
  • the cells were cultured in DMEM / F12 containing 2% FBS, 1% glutamax and 250 ng / mL FGF2 for 4 days to differentiate into intestinal stem cells.
  • Y-27632 Ras binding kinase inhibitor
  • the cells were peeled off with actase and seeded in a 24-well plate for cell culture coated with Matrigel from which growth factors had been removed, which had been diluted 30-fold with a medium for human iPS cells.
  • Drug metabolizing enzyme treatment is 2% FBS, 2 mmol / L L-Glu, 1% NEAA, 2% B27 supplement, 1% N2 supplement, 100 units / mL penicillin G, 100 ⁇ g / mL streptomycin, 20 ng Add 1 ⁇ , 25-dihydroxyvitamin D 3 (VD3) to 10 nmol / L or 100 nmol / L, or rifampicin to 10, 40, 100 ⁇ mol / L to DMEM / F12 containing EGF / mL EGF. It was performed by culturing for 48 hours.
  • PD98059 (20 ⁇ mol / L), 5-aza-2'-deoxycytidine (5 ⁇ mol / L), A-83-01 (0.5 ⁇ mol / L), low molecular weight compounds that we previously discovered during differentiation.
  • IBMX 3-isobutyl-1-methylxanthine
  • RNA extraction Total ribonucleic acid (RNA) extraction
  • RNA was extracted according to the attached manual of RNeasy (registered trademark) Mini Kit (Qiagen) after completion of induction of differentiation of human iPS cells.
  • Real-Time RT-PCR Real-time reverse transcription polymerase chain reaction
  • SYBR registered trademark
  • Premix Ex Taq II Perfect Real Time
  • GPDH glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase
  • the cells were solubilized with 0.2 M sodium hydroxide solution containing 0.5% sodium dodecyl sulfate (SDS), and a scintillation solution was added.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • the amount of cellular uptake of Gly-Sar or ES was calculated from the radioactivity measured using a liquid scintillation counter.
  • the apparent membrane permeability coefficient of Hoechst 33342 is based on the fluorescence intensity measured using a fluorescence plate reader (excitation wavelength 355 nm, fluorescence wavelength 460 nm), and the apparent membrane permeability coefficient of digoxin is measured using a liquid scintillation counter. Calculated from The Efflux ratio was calculated by dividing the apparent membrane permeability coefficient from the basement membrane side to the apical membrane side by the apparent membrane permeability coefficient from the topside membrane side to the basement membrane side. The transepithelial electrical resistance (TEER) value was measured using Millicell ERS-2.
  • TEER transepithelial electrical resistance
  • ABCB1 / MDR1 ATP-binding cassette transporter B1 / multidrug resistance protein 1
  • ABCG2 / BCRP ATP-binding cassette transporter G2 / breast cancer resistance protein
  • CYP3A4 cytochrome P450 3A4
  • LGR5 G protein-coupled receptor including leucine-rich repeat
  • PXR pregnane X receptor
  • SLC15A1 / PEPT1 SLC (solute carrier) family member 15A1 / peptide transporter 1: expressed on the apical membrane side of the small intestine.
  • SLCO2B1 / OATP2B1 SLC (solute carrier) organic anion transporter 2B1: expressed on the apical membrane side of the small intestine.
  • Sucrase-isomaltase A disaccharide-degrading enzyme present in the intestinal epithelium and a marker specific to the intestinal epithelium.
  • UGT1A1 uridine diphosphate-glucuronyltransferase 1A1: involved in glucuronidation of drugs.
  • UGT1A4 uridine diphosphate-glucuronyltransferase 1A4: involved in glucuronidation of drugs.
  • Villin 1 is the main component of microvilli.
  • intestinal epithelial cell-like cells induced to differentiate by conventional differentiation methods did not show CYP3A4 expression induction by rifampicin, but by inducing differentiation using 8-Br-cAMP and IBMX, the response by rifampicin Came to have sex.
  • CYP3A4 was evaluated from the amount of mitazolam metabolite (1-hydroxide) which is a typical substrate of CYP3A4.
  • intestinal epithelial cells induced to differentiate using 8-Br-cAMP and IBMX showed CYP3A4 activity in the group not treated with the inducer. There was a significant increase (FIG. 6).
  • CYP3A4 activity was significantly increased by treating 1 ⁇ , 25-dihydroxyvitamin D3 (VD3) in cells induced to differentiate using 8-Br-cAMP and IBMX.
  • OATP estrone-3-sulfate
  • BSP bromosulfphthalein
  • TEER Transmembrane resistance
  • the function of BCRP as an excretion transporter was examined.
  • Hoechst 33342 was used as the BCRP substrate and Ko143 was used as the inhibitor.
  • These ratios were calculated from the apparent membrane permeability coefficient obtained, and the activity of BCRP was evaluated.
  • the apparent membrane permeability coefficient ratio was obtained by treatment with Ko143 in both intestinal epithelial cell-like cells induced by conventional differentiation methods and intestinal epithelial cell-like cells induced by differentiation using 8-Br-cAMP and IBMX. Decreased (FIG. 10).
  • the intestinal epithelial cell-like cells induced to differentiate using 8-Br-cAMP and IBMX increased the apparent membrane permeability coefficient ratio in the absence of Ko143. It was suggested to have activity.
  • conditions for supplying cAMP to the cells specifically, for example, adding 8-Br-cAMP to the medium
  • conditions for suppressing a decrease in intracellular cAMP concentration specifically, for example, cAMP-degrading enzyme
  • an inhibitor for example, IBMX
  • IBMX is added to the medium to promote differentiation into intestinal epithelial cells, and is particularly effective for acquiring (maturation) functions as intestinal epithelial cells.
  • these conditions can be used alone or in combination to produce more functional intestinal epithelial cell-like cells. It becomes possible to obtain.
  • intestinal epithelial cell-like cells having a function of transporting uptake and excretion transporters in addition to drug metabolizing enzyme activity and induction ability have been successfully produced from human iPS cells by a simple method.
  • Method ⁇ mucosal disorder action Mucin by adding meloxicam (50 ⁇ M, 200 ⁇ M), indomethacin (75 ⁇ M, 300 ⁇ M), ketoprofen (200 ⁇ M, 800 ⁇ M), known as NSAIDs and having mucosal damage, for 6 days in the process of differentiation into intestinal epithelial cells The expression variation of 2 was examined.
  • ⁇ Mucosal protective action In the process of differentiating into intestinal epithelial cells, mucosal 2 expression variation was examined by adding irsogladine (10 ⁇ M, 40 ⁇ M) and rebamipide (50 ⁇ M, 100 ⁇ M, 250 ⁇ M, 1000 ⁇ M), which have mucosal protective action, for 6 days .
  • RNA extraction> After completion of recovery after differentiation into intestinal epithelial cells, extraction was performed according to the manual attached to Agencourt (registered trademark) RNAdvance Tissue Kit. ⁇ Reverse transcription reaction> Complementary DNA (cDNA) was synthesized using ReverTra Ace (registered trademark) qPCR RT Master Mix according to the attached manual. ⁇ Real-time reverse polymerase chain reaction (Real-Time RT-PCR)> For Real-Time RT-PCR, KAPA SYBR Fast qPCR Kit was used, and the reaction was performed according to the attached manual using cDNA as a template. Results were corrected using hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HPRT) as an endogenous control.
  • HPRT hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase
  • FIG. 12 shows the detection results of mucin 2 mRNA.
  • the intestinal epithelial cell-like cells (Control) prepared by this method highly expressed mucin 2, which is hardly expressed in Caco-2 cells derived from human colon cancer (Caco-2).
  • the expression level reaches about 70% of the expression level of commercially available human small intestine-derived cells (SI). This fact indicates that the intestinal epithelial cell-like cells prepared by this method are extremely useful as a model system for the small intestine.
  • the intestinal epithelial cell-like cells prepared by this method have an assay based on the expression of mucin 2 (prediction of drugs that cause mucosal damage (ulcer) (prediction of side effect risk) and drugs that have mucosal protective effects. It is useful for screening system).
  • Intestinal epithelial cell-like cells are useful as a model system for the small intestine, and can be used for absorption / metabolism / membrane permeability, induction of drug-metabolizing enzymes, induction of drug transporters, evaluation of toxicity, and the like. Also, it is expected to be used as an active ingredient of cell preparations for treating various intestinal diseases or as a material for regenerative medicine.

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Abstract

生体の腸管上皮細胞に近い機能を示す細胞を簡便に調製可能な新たな方法及びその用途を提供することを課題とする。（１）人工多能性幹細胞を内胚葉様細胞へと分化させる工程と、（２）工程（１）で得られた内胚葉様細胞を腸管幹細胞様細胞へと分化させる工程と、（３）工程（２）で得られた腸管幹細胞様細胞を腸管上皮細胞様細胞へと分化させる工程であって、MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びEGFの存在下、且つcAMPが細胞へ供給される条件下での培養を含む工程によって、人工多能性幹細胞を腸管上皮細胞へ分化誘導する。

Description

人工多能性幹細胞の腸管上皮細胞への分化誘導
　本発明は人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem：iPS）を腸管上皮細胞へ分化誘導する方法及びその用途に関する。本出願は、２０１６年３月８日に出願された日本国特許出願第２０１６－０４４０８８号に基づく優先権を主張するものであり、当該特許出願の全内容は参照により援用される。
　小腸には多くの薬物代謝酵素や薬物トランスポーターが存在することから、肝臓と同様、薬物の初回通過効果に関わる臓器として非常に重要である。そのため、医薬品開発早期の段階から小腸における医薬品の膜透過性や代謝を評価することが、薬物動態特性に優れた医薬品の開発に必要である。現在、小腸のモデル系としてはヒト結腸癌由来のCaco-2細胞が多用されている。しかし、Caco-2細胞における薬物トランスポーターの発現パターンはヒト小腸とは異なる。また、Caco-2細胞には薬物代謝酵素の発現及び酵素誘導はほとんど認められないことから、正確に小腸での薬物動態を評価することは難しい。したがって、小腸における薬物代謝及び膜透過性を総合的に評価するためには初代小腸上皮細胞の利用が望ましいが、初代小腸上皮細胞の入手は困難である。
　ところで、ヒト人工多能性幹（induced pluripotent stem：iPS）細胞は2007年に山中らによって樹立された。このヒトiPS細胞は、1998年にThomsonらによって樹立されたヒト胚性幹（embryonic stem：ES）細胞と同様な、多分化能とほぼ無限の増殖能をもつ細胞である。ヒトiPS細胞はヒトES細胞に比べ倫理的な問題が少なく、医薬品開発のための安定した細胞供給源として期待される。
　尚、薬剤の吸収試験などに利用される腸管上皮細胞を提供するために、腸管由来の細胞から腸管の幹／前駆細胞を選択的に取得する方法が報告されている（特許文献１）。また、ALK5阻害因子を用いた多能性細胞の作製ないし維持方法が提案されている（特許文献２）。
特開２００８－２０６５１０号公報 特表２０１２－５１１９３５号公報 国際公開第２０１４／１３２９３３号パンフレット
Ueda T et al., Biochem Biophys Res Commun. 2010 Jan 1;391(1):38-42. McCracken KW et al., Nat Protoc. 2011 Nov 10;6(12):1920-8 Spence JR, Nature. 2011 Feb 3;470(7332):105-109. Ogaki S et al., Stem Cells. 2013 Jun;31(6):1086-1096. Ozawa T et al., Sci Rep. 2015 Nov 12;5:16479. Ogaki S et al., Sci Rep. 2015 Nov 30;5:17297. Iwao T et al., Drug Metab Pharmacokinet, 29(1), 44-51 (2014). Iwao T et al., Drug Metab Dispos, 43(6), 603-610 (2015).
　現在、iPS細胞から腸管への分化に関する報告は少ない。マウスiPS細胞から胚様体を形成し腸管様の組織を作製したという報告（非特許文献１）と、ヒトiPS細胞から三次元培養により腸管様の組織を作製したという報告（非特許文献２、３）があるが、これらの報告での分化誘導法は煩雑であり、しかも分化効率が十分でなく、薬物動態学的な解析は詳細に行われていない。さらに、当該分化誘導法は極めて高価な増殖因子やサイトカイン類を大量に用いて分化を誘導しており、実用化に適さない。その後、ヒト多能性幹細胞（ES細胞またはiPS細胞）から腸管細胞への分化に成功したとの報告がされているが（非特許文献４、５、６）、薬物動態学的機能については十分明らかにされていない。本発明者らも、ヒトiPS細胞から腸管上皮細胞への分化について研究を進めており、作製した腸管上皮細胞様細胞はさまざまな薬物動態学的機能を有することを報告している（特許文献３、非特許文献７、８）。また、ヒトiPS細胞から腸管上皮細胞への分化促進および機能獲得に有用な低分子化合物を見出している（特許文献３、非特許文献８）。
　以上のように、多くの研究者によって精力的な研究が行われ、一定の成果が得られているものの、薬物動態アッセイや毒性試験などに利用可能な機能的な腸管上皮細胞をインビトロで調製することに対するニーズは依然として高い。そこで本発明は、生体の腸管上皮細胞に近い機能を示す細胞（腸管上皮細胞様細胞）を簡便に調製可能な新たな方法及びその用途を提供することを課題とする。
　上記課題の下、本発明者らは、以前に報告した低分子化合物（特許文献３）とは異なる作用を有する新たな低分子化合物に注目し、iPS細胞から腸管上皮細胞への分化に対するその作用・効果を詳細に調べた。また、有用性が認められた低分子化合物を用いて分化誘導して得られた腸管上皮細胞様細胞の薬物動態学的機能について詳細な検討を加えた。
　検討の結果、iPS細胞から内胚葉様細胞を経て得られた腸管幹細胞様細胞を腸管上皮細胞様細胞へと分化誘導する際の誘導因子としてcAMPが重要であることが明らかとなった。詳細には、以前に報告した低分子化合物（MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤及びTGFβ受容体阻害剤）が培地中に存在することに加え、cAMPが細胞へ供給される条件下で培養すること、及びcAMP分解酵素阻害剤を使用することで細胞内cAMP濃度の低下を抑えることが、腸管上皮への分化誘導、特に腸管上皮細胞としての機能の獲得に有効であることが判明した。また、使用する低分子化合物の添加時期と効果との関係について有益な知見がもたらされた。
　検討の末に見出された培養条件で作製された腸管上皮細胞様細胞は、腸管上皮特異的な酵素（薬物代謝酵素）を高発現し、ビタミンD受容体を介した薬物代謝酵素（CYP3A4）の良好な発現誘導も示した。また、取り込み及び排出トランスポーターの輸送機能も備えていた。
　以上のように、本発明者らは、分化促進及び機能の獲得に有用である新たな低分子化合物を見出し、より機能的な腸管上皮細胞様細胞の作製に成功した。以下の発明は、主として、以上の成果及び考察に基づく。
　［１］以下の工程（１）～（３）を含む、人工多能性幹細胞を腸管上皮細胞へ分化誘導する方法：
　（１）人工多能性幹細胞を内胚葉様細胞へと分化させる工程；
　（２）工程（１）で得られた内胚葉様細胞を腸管幹細胞様細胞へと分化させる工程；
　（３）工程（２）で得られた腸管幹細胞様細胞を腸管上皮細胞様細胞へと分化させる工程であって、MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びEGFの存在下、且つcAMPが細胞へ供給される条件下での培養を含む工程。
　［２］工程（３）の前記培養の期間が７日間～４０日間である、［１］に記載の方法。
　［３］工程（３）が、以下のＡ～Ｃのいずれかの培養工程を含む、［１］に記載の方法、
　培養工程Ａ：（ａ－１）MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びEGFの存在下での培養と、該培養に続く、（ａ－２）MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びEGFの存在下、且つcAMPが細胞へ供給される条件下での培養を含む、
　培養工程Ｂ：（ｂ－１）MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びEGFの存在下、且つcAMPが細胞へ供給される条件下での培養と、該培養に続く、（ｂ－２）MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤、EGF及びcAMP分解酵素阻害剤の存在下での培養を含む、
　培養工程Ｃ：（ｃ－１）MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びEGFの存在下、且つcAMPが細胞へ供給される条件下での培養を含む。
　［４］（ａ－１）の培養の期間は１日間～５日間であり、（ａ－２）の培養の期間は３日間～１５日間であり、
　（ｂ－１）の培養の期間は３日間～１５日間であり、（ｂ－２）の培養の期間は３日間～１５日間であり、
　（ｃ－１）の培養の期間は３日間～１５日間である、［３］に記載の方法。
　［５］（ａ－２）の培養、（ｂ－１）の培養、及び（ｃ－１）の培養が、MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びEGFに加えてcAMP分解酵素阻害剤も存在する条件で行われる、［３］又は［４］に記載の方法。
　［６］培養工程Ａが、（ａ－２）の培養に続く、（ａ－３）MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びEGFの存在下での培養を含み、
　培養工程Ｂが、（ｂ－２）の培養に続く、（ｂ－３）MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びEGFの存在下での培養を含み、
　培養工程Ｃが、（ｃ－１）の培養に続く、（ｃ－２）MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びEGFの存在下での培養を含む、［２］～［５］のいずれか一項に記載の方法。
　［７］（ａ－３）の培養、（ｂ－３）の培養、及び（ｃ－２）の培養の期間は１日間～１０日間である、［６］に記載の方法。
　［８］cAMPが細胞へ供給される条件が、培地中に8-Br-cAMPが存在することである、［１］～［７］のいずれか一項に記載の方法。
　［９］cAMP分解酵素阻害剤がIBMXである、［１］～［８］のいずれか一項に記載の方法。
　［１０］MEK1阻害剤がPD98059であり、DNAメチル化阻害剤が5-アザ-2’-デオキシシチジンであり、TGFβ受容体阻害剤がA-83-01である、［１］～［９］のいずれか一項に記載の方法。
　［１１］工程（１）における分化誘導因子としてアクチビンAを用いる、［１］～［１０］のいずれか一項に記載の方法。
　［１２］工程（２）における分化誘導因子としてFGF2を用いる、［１］～［１１］のいずれか一項に記載の方法。
　［１３］人工多能性幹細胞がヒト人工多能性幹細胞である、［１］～［１２］のいずれか一項に記載の方法。
　［１４］［１］～［１３］のいずれか一項に記載の方法で得られた腸管上皮細胞様細胞。
　［１５］［１４］に記載の腸管上皮細胞様細胞を用いた、被検物質の体内動態又は毒性を評価する方法。
　［１６］前記体内動態が、代謝、吸収、排泄、薬物相互作用、薬物代謝酵素の誘導、又は薬物トランスポーターの誘導である、［１５］に記載の方法。
　［１７］以下の工程（ｉ）～（ｉｉｉ）を含む、［１５］又は［１６］に記載の方法：
　（ｉ）［１４］に記載の腸管上皮細胞様細胞で構成された細胞層を用意する工程；
　（ｉｉ）前記細胞層に被検物質を接触させる工程；
　（ｉｉｉ）前記細胞層を透過した被検物質を定量し、被検物質の吸収性ないし膜透過性、薬物相互作用、薬物代謝酵素の誘導、薬物トランスポーターの誘導、又は毒性を評価する工程。
　［１８］以下の工程（Ｉ）及び（ＩＩ）を含む、［１５］又は［１６］に記載の方法：
　（Ｉ）［１４］に記載の腸管上皮細胞様細胞に被検物質を接触させる工程；
　（ＩＩ）被検物質の代謝若しくは吸収、薬物相互作用、薬物代謝酵素の誘導、薬物トランスポーターの誘導、又は毒性を測定・評価する工程。
　［１９］以下の工程（ａ）及び（ｂ）を含む、被検物質の消化管粘膜障害作用を評価する方法：
　（ａ）［１４］に記載の腸管上皮細胞様細胞に被検物質を接触させる工程；
　（ｂ）前記腸管上皮細胞様細胞におけるムチン2の発現を検出し、検出結果に基づき被検物質の消化管粘膜障害作用を判定する工程であって、ムチン2の発現低下が認められることが、被検物質が消化管粘膜障害作用を有することの指標となる工程。
　［２０］以下の工程（Ａ）及び（Ｂ）を含む、被検物質の消化管粘膜保護作用を評価する方法：
　（Ａ）［１４］に記載の腸管上皮細胞様細胞に被検物質を接触させる工程；
　（Ｂ）前記腸管上皮細胞様細胞におけるムチン2の発現を検出し、検出結果に基づき被検物質の消化管粘膜保護作用を判定する工程であって、前記物質によるムチン2の発現上昇が認められることが、被検物質が消化管粘膜保護作用を有することの指標となる工程。
　［２１］［１４］に記載の腸管上皮細胞様細胞を含む、細胞製剤。
ヒトiPS細胞から腸管上皮細胞への分化に対する8-Br-cAMPとIBMXの効果。平均値±S.D. (n = 3)で表した。コントロールは8-Br-cAMP及びIBMX非添加群。 図１の続き。 分化させた腸管上皮細胞様細胞における各種マーカー遺伝子発現に対する8-Br-cAMPとIBMXの効果。平均値±S.D. (n = 3)で表した。コントロールは8-Br-cAMP及びIBMX非添加群。 図３の続き。 分化させた腸管上皮細胞様細胞におけるCYP3A4発現誘導。平均値±S.D. (n = 3)で表した。コントロールは8-Br-cAMP及びIBMX非添加群。 分化させた腸管上皮細胞様細胞におけるミダゾラムの代謝活性（CYP3A4代謝活性）。平均値±S.D. (n = 3)で表した。**P < 0.01 対 コントロール群（誘導剤処理なし）、†P < 0.05 対 8-Br-cAMP+IBMX群（誘導剤処理なし）、コントロールは8-Br-cAMP及びIBMX非添加群。ミダゾラムは100 μmol/Lで添加。1α,25-ジヒドロキシビタミンD3（VD3）は10 nmol/Lで添加。 分化させた腸管上皮細胞様細胞におけるグリシルサルコシン（Gly-Sar）の取り込み（PEPT1輸送活性）。平均値±S.D. (n = 3)で表した。**P < 0.01 及び††P < 0.01 対 コントロール群（イブプロフェンなし）、‡‡P < 0.01 対 8-Br-cAMP+IBMX群（イブプロフェンなし）、コントロールは8-Br-cAMP+IBMX非添加群。イブプロフェンは3 mmol/Lで添加。 分化させた腸管上皮細胞様細胞におけるエストロン-3-硫酸（ES）の取り込み（OATP輸送活性）。平均値±S.D. (n = 3)で表した。**P < 0.01 対 BSPなし。ブロムスルフタレイン（BSP）は0.2 mmol/Lで添加。 分化させた腸管上皮細胞様細胞の経上皮電気抵抗（TEER）値の経時変化。平均値±S.D. (n = 3)で表した。 分化させた腸管上皮細胞様細胞におけるヘキスト33342の輸送（BCRP輸送活性）。平均値±S.D. (n = 3)で表した。コントロールは8-Br-cAMP及びIBMX非添加群。ヘキスト33342は20 μmol/Lで添加。Ko143は10 μmol/Lで添加。 分化させた腸管上皮細胞様細胞におけるジゴキシンの輸送。平均値±S.D. (n = 3)で表した。コントロールは8-Br-cAMP及びIBMX非添加群。ベラパミルは10 μmol/Lで添加した。 分化させた腸管上皮細胞様細胞におけるムチン2の発現（mRNAレベル）及びそれを利用したアッセイの結果。縦軸は、市販のヒト小腸細胞（SI）の発現レベルを基準（100）にした相対値。平均値±標準偏差（n=3）　Control：コントロール（粘膜障害作用を示す物質も粘膜保護作用を有する物質も非添加の培地で培養した細胞）。　メロキシカム-50：メロキシカムを濃度50μMで添加した培地で培養した細胞。　メロキシカム-200：メロキシカムを濃度200μMで添加した培地で培養した細胞。　インドメタシン-75：インドメタシンを濃度75μMで添加した培地で培養した細胞。　インドメタシン-300：インドメタシンを濃度300μMで添加した培地で培養した細胞。　ケトプロフェン-200：ケトプロフェンを濃度200μMで添加した培地で培養した細胞。　ケトプロフェン-800：ケトプロフェンを濃度800μMで添加した培地で培養した細胞。　イルソグラジン-10：イルソグラジンを濃度10μMで添加した培地で培養した細胞。　イルソグラジン-40：イルソグラジンを濃度40μMで添加した培地で培養した細胞。　レバミピド-50：レバミピドを濃度50μMで添加した培地で培養した細胞。　レバミピド-100：レバミピドを濃度100μMで添加した培地で培養した細胞。　レバミピド-250：レバミピドを濃度250μMで添加した培地で培養した細胞。　レバミピド-1000：レバミピドを濃度1000μMで添加した培地で培養した細胞。　SI：市販のヒト小腸細胞。　Caco-2：ヒト結腸癌由来細胞。
　本発明は人工多能性幹細胞（iPS細胞）を腸管上皮細胞系譜へ分化誘導する方法（以下、「本発明の分化誘導方法」とも呼ぶ。）に関する。本発明によれば、生体の腸管組織を構成する腸管上皮細胞と類似の特性を示す細胞、即ち腸管上皮細胞様細胞が得られる。
　「人工多能性幹細胞（iPS細胞）」とは、初期化因子の導入などにより体細胞をリプログラミングすることによって作製される、多能性（多分化能）と増殖能を有する細胞である。人工多能性幹細胞はES細胞に近い性質を示す。iPS細胞の作製に使用する体細胞は特に限定されず、分化した体細胞でもよいし、未分化の幹細胞でもよい。また、その由来も特に限定されないが、好ましくは哺乳動物（例えば、ヒトやチンパンジーなどの霊長類、マウスやラットなどのげっ歯類）の体細胞、特に好ましくはヒトの体細胞を用いる。iPS細胞は、これまでに報告された各種方法によって作製することができる。また、今後開発されるiPS細胞作製法を適用することも当然に想定される。
　iPS細胞作製法の最も基本的な手法は、転写因子であるOct3/4、Sox2、Klf4及びc-Mycの４因子を、ウイルスを利用して細胞へ導入する方法である（Takahashi K, Yamanaka S: Cell 126 (4), 663-676, 2006; Takahashi, K, et al: Cell 131 (5), 861-72, 2007）。ヒトiPS細胞についてはOct4、Sox2、Lin28及びNonogの４因子の導入による樹立の報告がある（Yu J, et al: Science 318(5858), 1917-1920, 2007）。c-Mycを除く３因子（Nakagawa M, et al: Nat. Biotechnol. 26 (1), 101-106, 2008）、Oct3/4及びKlf4の２因子（Kim J B, et al: Nature 454 (7204), 646-650, 2008）、或いはOct3/4のみ（Kim J B, et al: Cell 136 (3), 411-419, 2009）の導入によるiPS細胞の樹立も報告されている。また、遺伝子の発現産物であるタンパク質を細胞に導入する手法（Zhou H, Wu S, Joo JY, et al: Cell Stem Cell 4, 381-384, 2009; Kim D, Kim CH, Moon JI, et al: Cell Stem Cell 4, 472-476, 2009）も報告されている。一方、ヒストンメチル基転移酵素G9aに対する阻害剤BIX-01294やヒストン脱アセチル化酵素阻害剤バルプロ酸（VPA）或いはBayK8644等を使用することによって作製効率の向上や導入する因子の低減などが可能であるとの報告もある（Huangfu D, et al: Nat. Biotechnol. 26 (7), 795-797, 2008; Huangfu D, et al: Nat. Biotechnol. 26 (11), 1269-1275, 2008; Silva J, et al: PLoS. Biol. 6 (10), e 253, 2008）。遺伝子導入法についても検討が進められ、レトロウイルスの他、レンチウイルス（Yu J, et al: Science 318(5858), 1917-1920, 2007）、アデノウイルス（Stadtfeld M, et al: Science 322 (5903), 945-949, 2008）、プラスミド（Okita K, et al: Science 322 (5903), 949-953, 2008）、トランスポゾンベクター（Woltjen K, Michael IP, Mohseni P, et al: Nature 458, 766-770, 2009; Kaji K, Norrby K, Pac a A, et al: Nature 458, 771-775, 2009; Yusa K, Rad R, Takeda J, et al: Nat Methods 6, 363-369, 2009）、或いはエピソーマルベクター（Yu J, Hu K, Smuga-Otto K, Tian S, et al: Science 324, 797-801, 2009）を遺伝子導入に利用した技術が開発されている。
　iPS細胞への形質転換、即ち初期化（リプログラミング）が生じた細胞はFbxo15、Nanog、Oct/4、Fgf-4、Esg-1及びCript等の多能性幹細胞マーカー（未分化マーカー）の発現などを指標として選択することができる。選択された細胞をiPS細胞として回収する。
　iPS細胞は、例えば、国立大学法人京都大学又は独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンターから提供を受けることもできる。
　本明細書において「分化誘導する」とは、特定の細胞系譜に沿って分化するように働きかけることをいう。本発明ではiPS細胞を腸管上皮細胞へと分化誘導する。本発明の分化誘導方法は大別して３段階の誘導工程、即ち、iPS細胞を内胚葉様細胞へと分化させる工程（工程（１））と、得られた内胚葉様細胞を腸管幹細胞様細胞へと分化させる工程（工程（２））と、得られた腸管幹細胞様細胞を腸管上皮細胞様細胞へと分化させる工程（工程（３））を含む。以下、各工程の詳細を説明する。
＜工程（１）　内胚葉様細胞への分化＞
　この工程ではiPS細胞を培養し、内胚葉様細胞へと分化させる。換言すれば、内胚葉様細胞への分化を誘導する条件下でiPS細胞を培養する。iPS細胞が内胚葉様細胞に分化する限り、培養条件は特に限定されない。例えば、常法に従い、アクチビンAを添加した培地で培養する。この場合、培地中のアクチビンAの濃度を例えば10 ng/mL～200 ng/mL、好ましくは20 ng/mL～150 ng/mLとする。細胞の増殖率や維持等の観点から、培地に血清又は血清代替物（Knockout serum replacement(KSR)など）を添加することが好ましい。血清はウシ胎仔血清に限られるものではなく、ヒト血清や羊血清等を用いることもできる。血清又は血清代替物の添加量は例えば0.1%(v/v)～10%(v/v)である。
　Wnt／β－カテニンシグナル経路の阻害剤（例えば、ヘキサクロロフェン、クエルセチン、WntリガンドであるWnt3a）を培地に添加し、内胚葉様細胞への分化の促進を図ってもよい。
　好ましい一態様では、工程（１）として２段階の培養を行う。１段階目の培養では比較的低濃度の血清（例えば、0.1%(v/v)～1%(v/v)）を添加した培地で行い、続く２段階目の培養では一段階目の培養よりも血清濃度を高めた培地（血清濃度を例えば1%(v/v)～10%(v/v)）で行う。このように２段階の培養を採用することは、１段階目の培養により未分化細胞の増殖を抑制し、続く２段階目により分化した細胞を増殖させる点で好ましい。
　工程（１）の期間（培養期間）は例えば１日間～１０日間、好ましくは２日間～７日間である。工程（１）として２段階の培養を採用する場合には１段階目の培養期間を例えば１日間～７日間、好ましくは２日間～５日間とし、２段階目の培養期間を例えば１日間～６日間、好ましくは１日間～４日間とする。
＜工程（２）　腸管幹細胞様細胞への分化＞
　この工程では、工程（１）で得られた内胚葉様細胞を培養し、腸管幹細胞様細胞へと分化させる。換言すれば、腸管幹細胞様細胞への分化を誘導する条件下で内胚葉細胞を培養する。内胚葉様細胞が腸管幹細胞様細胞へ分化する限り、培養条件は特に限定されない。好ましくは、後述の実施例に示した実験結果を踏まえ、FGF2（線維芽細胞増殖因子２）の存在下で培養を行う。好ましくはヒトFGF2（例えばヒト組換えFGF2）を用いる。
　典型的には、工程（１）を経て得られた細胞集団又はその一部を、選別することなく工程（２）に供する。一方で、工程（１）を経て得られた細胞集団の中から内胚葉様細胞を選別した上で工程（２）を実施することにしてもよい。内胚葉様細胞の選別は例えば、細胞表面マーカーを指標にしてフローサイトメーター（セルソーター）で行えばよい。
　「FGF2の存在下」とは、FGF2が培地中に添加された条件と同義である。従って、FGF2の存在下での培養を行うためには、FGF2が添加された培地を用いればよい。FGF2の添加濃度の例を示すと100ng/mL～500ng/mLである。
　工程（２）の期間（培養期間）は例えば２日間～１０日間、好ましくは３日間～７日間である。当該培養期間が短すぎると、期待される効果（分化効率の上昇、腸管幹細胞としての機能の獲得の促進）が十分に得られない。他方、当該培養期間が長すぎると、分化効率の低下を引き起こす。
　腸管幹細胞様細胞へ分化したことは、例えば、腸管幹細胞マーカーの発現を指標にして判定ないし評価することができる。腸管幹細胞マーカーの例を挙げると、ロイシンリッチリピートを含むGタンパク質共役受容体５（LGR5）、エフリンB2受容体（EphB2）である。
＜工程（３）　腸管上皮細胞様細胞への分化＞
　この工程では、MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びEGFの存在下（以下、この条件を「第１条件」と呼ぶ）、且つcAMPが細胞へ供給される条件下（以下、この条件を「第２条件」と呼ぶ）で培養し、工程（２）で得られた腸管幹細胞様細胞を腸管上皮細胞様細胞へと分化させる。典型的には、工程（２）を経て得られた細胞集団又はその一部を、選別することなく工程（３）に供する。一方で、工程（２）を経て得られた細胞集団の中から腸管幹細胞様細胞を選別した上で工程（３）を実施することにしてもよい。腸管幹細胞様細胞の選別は例えば、細胞表面マーカーを指標にしてフローサイトメーター（セルソーター）で行えばよい。
　第１条件、即ちMEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びEGFの存在下とは、これらの化合物が培地中に添加された条件と同義である。従って、第１条件を満たすためには、これらの化合物が添加された培地を用いればよい。
　MEK1阻害剤として、PD98059、PD184352、PD184161、PD0325901、U0126、MEK inhibitor I、MEK inhibitor II、MEK1/2 inhibitor II、SL327を挙げることができる。同様に、DNAメチル化阻害剤として5-アザ-2’-デオキシシチジン、5-アザシチジン、RG108、ゼブラリンを挙げることができる。TGFβ受容体阻害剤については、後述の実施例に使用したA-83-01がTGF-β受容体ALK4、ALK5、ALK7に阻害活性を示すことを考慮すれば、好ましくは、TGF-β受容体ALK4、ALK5、ALK7の一以上に対して阻害活性を示すものを用いるとよい。例えば、A-83-01、SB431542、SB-505124、SB525334、D4476、ALK5 inhibitor、LY2157299、LY364947、GW788388、RepSoxが当該条件を満たす。
　MEK1阻害剤の添加濃度の例（PD98059の場合）を示すと4μM～100μM、好ましくは10～40μMである。同様にメチル化阻害剤の添加濃度の例（5-アザ-2’-デオキシシチジンの場合）を示すと、1μM～25μM、好ましくは2.5μM～10μMであり、TGFβ受容体阻害剤の添加濃度の例（A-83-01の場合）を示すと0.1μM～2.5μM、好ましくは0.2μM～1μMである。尚、例示した化合物、即ち、PD98059、5-アザ-2’-デオキシシチジン及びA-83-01とは異なる化合物を使用する場合の添加濃度については、使用する化合物の特性と、例示した化合物（PD98059、5-アザ-2’-デオキシシチジン、A-83-01）の特性の相違（特に活性の相違）を考慮すれば、当業者であれば上記濃度範囲に準じて設定することができる。また、設定した濃度範囲が適切であるか否かは、後述の実施例に準じた予備実験によって確認することができる。
　第２条件、即ち、cAMPが細胞へ供給される条件とは、細胞内へ取り込み可能な化合物であって、細胞内に取り込まれるとcAMPとして作用する化合物が存在する条件と同義である。従って、第２条件を満たすためには、例えば、細胞内へと取り込み可能なcAMP誘導体が添加された培地を用いればよい。cAMP誘導体としてPKA活性剤（例えば、8-Br-cAMP(8-Bromoadenosine-3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt, CAS Number : 76939-46-3)、6-Bnz-cAMP(N6-Benzoyladenosine-3',5'-cyclic monophosphate sodium salt salt, CAS Number : 1135306-29-4)、cAMPS-Rp((R)-Adenosine, cyclic 3',5'-(hydrogenphosphorothioate) triethylammonium salt, CAS Number : 151837-09-1)、cAMPS-Sp((S)-Adenosine, cyclic 3',5'-(hydrogenphosphorothioate) triethylammonium salt, CAS Number : 93602-66-5)、Dibutyryl-cAMP(N6,O2'-Dibutyryl adenosine 3',5'-cyclic monophosphate sodium salt salt, CAS Number : 16980-89-5)、8-Cl-cAMP(8-Chloroadenosine- 3', 5'- cyclic monophosphate salt, CAS Number : 124705-03-9)）、Epac活性剤（Rp-8-Br-cAMPS(8-Bromoadenosine 3',5'-cyclic Monophosphothioate, Rp-Isomer . sodium salt, CAS Number : 129735-00-8)、8-CPT-cAMP(8-(4-Chlorophenylthio)adenosine 3',5'-cyclic monophosphate, CAS Number : 93882-12-3)、8-pCPT-2'-O-Me-cAMP(8-(4-Chlorophenylthio)-2'-O-methyladenosine 3',5'-cyclic monophosphate monosodium, CAS Number : 634207-53-7)等）を採用することができる。cAMP誘導体の添加濃度の例（8-Br-cAMPの場合）を示すと、0.1mM～10mM、好ましくは0.2mM～5mM、更に好ましくは0.5mM～2mMである。尚、例示した化合物、即ち、8-Br-cAMPとは異なる化合物を使用する場合の添加濃度については、使用する化合物の特性と、例示した化合物（8-Br-cAMP）の特性の相違（特に活性の相違）を考慮すれば、当業者であれば上記濃度範囲に準じて設定することができる。また、設定した濃度範囲が適切であるか否かは、後述の実施例に準じた予備実験によって確認することができる。
　工程（３）の期間（培養期間）は例えば７日間～４０日間、好ましくは１０日間～３０日間である。当該培養期間が短すぎると、期待される効果（分化効率の上昇、腸管上皮細胞としての機能の獲得の促進）が十分に得られない。他方、当該培養期間が長すぎると、分化効率の低下を引き起こす。
　腸管上皮細胞様細胞へ分化したことは、例えば、腸管上皮細胞マーカーの発現やペプチドの取り込み、或いはビタミンD受容体を介した薬物代謝酵素の発現誘導を指標にして判定ないし評価することができる。腸管上皮細胞マーカーの例を挙げると、ATP結合カセットトランスポーターB1/多剤耐性タンパク1（ABCB1/MDR1）、ATP結合カセットトランスポーターG2/乳ガン耐性タンパク（ABCG2/BCRP）、シトクロムP450 3A4（CYP3A4）、プレグナンX受容体（PXR）、SLC（solute carrier）ファミリーメンバー15A1/ペプチドトランスポーター1（SLC15A1/PEPT1）、SLC（solute carrier）有機アニオントランスポーター2B1（SLCO2B1/OATP2B1）、スクラーゼ－イソマルターゼ、ウリジン2リン酸-グルクロン酸転移酵素1A1（UGT1A1）、ウリジン2リン酸-グルクロン酸転移酵素1A4（UGT1A4）、ビリン 1（Villin 1）である。この中でも、腸管上皮に特異性の高いスクラーゼ－イソマルターゼ、及びビリン1、小腸での主要な薬物代謝酵素であるCYP3A4、小腸でのペプチドの吸収に関与するSLC15A1/PEPT1、小腸での有機アニオンの吸収に関与するSLCO2B1/OATP2B1は特に有効なマーカーである。
　目的の細胞（腸管上皮細胞様細胞）のみからなる細胞集団又は目的の細胞が高比率（高純度）で含まれた細胞集団を得ようと思えば、目的の細胞に特徴的な細胞表面マーカーを指標にして培養後の細胞集団を選別・分取すればよい。
　好ましくは、工程（３）として、以下のＡ～Ｃのいずれかの培養工程を行う。
＜培養工程Ａ＞
　培養工程Ａでは、（ａ－１）MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びEGFの存在下での培養と、当該培養に続く、（ａ－２）MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びEGFの存在下、且つcAMPが細胞へ供給される条件下での培養を行う。即ち、cAMPが細胞へ供給される条件の有無で異なる２段階の培養を行う。このようにすれば、腸管上皮細胞への分化促進、成熟化、機能獲得の効果が得られる。（ａ－１）の培養の期間は例えば１日間～５日間である。同様に、（ａ－２）の培養の期間は例えば３日間～１５日間である。尚、特に説明しない事項（各培養に使用可能な化合物、各化合物の添加濃度等）については、上記の対応する説明が援用される。
　（ａ－２）の培養を、MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びEGFに加えてcAMP分解酵素阻害剤も存在する条件で行うことにしてもよい。当該条件を採用すると、cAMPの分解阻害によって細胞内cAMP濃度の低下が抑えられ、腸管上皮への分化誘導、特に腸管上皮細胞としての機能の獲得が促されることを期待できる。即ち、当該条件は、より機能的な腸管上皮細胞様細胞の調製に有利なものである。cAMP分解酵素阻害剤として、IBMX (3-isobutyl-1-methylxanthine) (MIX)、Theophylline、Papaverine、Pentoxifylline (Trental)、KS-505、8-Methoxymethyl-IBMX、Vinpocetine (TCV-3B)、EHNA、Trequinsin (HL-725)、Lixazinone (RS-82856)、(LY-186126)、Cilostamide (OPC3689)、Bemoradan (RWJ-22867)、Anergrelide (BL4162A)、Indolidan (LY195115)、Cilostazol (OPC-13013)、Milrinone (WIN47203)、Siguazodan (SKF-94836)、5-Methyl-imazodan (CI 930)、SKF-95654、Pirilobendan (UD-CG 115 BS)、Enoximone (MDL 17043)、Imazodan (CL 914)、SKF-94120、Vesnarinone (OPC 8212)、Rolipram (Ro-20-1724)、(ZK-62711)、Denbufyll'ine、Zaprinast (M&B-22, 948)、Dipyridamole、Zaprinast (M&B-22, 948)、Dipyridamole、Zardaverine、AH-21-132、Sulmazol (AR-L 115 BS)を例示することができる。cAMP分解酵素阻害剤の添加濃度の例（IBMXの場合）を示すと、0.05mM～5mM、好ましくは0.1mM～3mM、更に好ましくは0.2mM～1mMである。尚、例示した化合物、即ち、IBMXとは異なる化合物を使用する場合の添加濃度については、使用する化合物の特性と、例示した化合物（IBMX）の特性の相違（特に活性の相違）を考慮すれば、当業者であれば上記濃度範囲に準じて設定することができる。また、設定した濃度範囲が適切であるか否かは、後述の実施例に準じた予備実験によって確認することができる。
　（ａ－２）の培養の後に、MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びEGFの存在下での培養（（ａ－３）の培養）を行うことにしてもよい。この培養の期間は例えば１日間～１０日間とする。この培養を行うと腸管上皮細胞への分化促進、成熟化、機能獲得の効果が得られる。
＜培養工程Ｂ＞
　培養工程Ｂでは、（ｂ－１）MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びEGFの存在下、且つcAMPが細胞へ供給される条件下での培養と、当該培養に続く、（ｂ－２）MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤、EGF及びcAMP分解酵素阻害剤の存在下での培養を行う。このように、cAMPが細胞へ供給される条件で培養した後、cAMP分解酵素阻害剤が存在する条件で培養すると、腸管上皮細胞への分化促進、成熟化、機能獲得の効果が得られる。（ｂ－１）の培養の期間は例えば３日間～１５日間である。同様に、（ｂ－２）の培養の期間は例えば３日間～１５日間である。尚、特に説明しない事項（各培養に使用可能な化合物、各化合物の添加濃度等）については、上記の対応する説明が援用される。
　（ｂ－１）の培養を、MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びEGFに加えてcAMP分解酵素阻害剤も存在する条件で行うことにしてもよい。当該条件を採用すると、早い段階から細胞内cAMP濃度の低下が抑えられ、腸管上皮への分化誘導、特に腸管上皮細胞としての機能の獲得が促されることを期待できる。即ち、当該条件は、より機能的な腸管上皮細胞様細胞の効率的な調製に有利なものである。
　（ｂ－２）の培養の後に、MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びEGFの存在下での培養（（ｂ－３）の培養）を行うことにしてもよい。この培養の期間は例えば１日間～１０日間とする。この培養を行うと腸管上皮細胞への分化促進、成熟化、機能獲得の効果が得られる。
＜培養工程Ｃ＞
　培養工程Ｃでは、（ｃ－１）MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びEGFの存在下、且つcAMPが細胞へ供給される条件下での培養を行う。（ｃ－１）の培養の期間は例えば３日間～１５日間である。尚、特に説明しない事項（各培養に使用可能な化合物、各化合物の添加濃度等）については、上記の対応する説明が援用される。
　（ｃ－１）の培養を、MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びEGFに加えてcAMP分解酵素阻害剤も存在する条件（cAMPが細胞へ供給される条件も併用される）で行うことにしてもよい。当該条件を採用すると、cAMPを細胞へ供給しつつ、細胞内cAMP濃度の低下を抑えることができる。従って、細胞内cAMPを高レベルに維持するために有効な条件となり、腸管上皮細胞への効率的な分化誘導が促されることを期待できる。
　（ｃ－１）の培養の後に、MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びEGFの存在下での培養（（ｃ－２）の培養）を行うことにしてもよい。この培養の期間は例えば１日間～１０日間とする。この培養を行うと腸管上皮細胞への分化促進、成熟化、機能獲得の効果が得られる。
　本発明を構成する各工程（工程（１）、（２）、（３）、工程（３）を構成する培養工程Ａ、培養工程Ｂ、培養工程Ｃ）において、途中で継代培養を行ってもよい。例えばコンフルエント又はサブコンフルエントになった際に細胞の一部を採取して別の培養容器に移し、培養を継続する。分化を促進するために細胞密度を低く設定することが好ましい。例えば1×104個／cm2～1×106個／cm2程度の細胞密度で細胞を播種するとよい。
　培地交換や継代培養などに伴う、細胞の回収の際には、細胞死を抑制するためにY-27632等のROCK阻害剤（Rho-associated coiled-coil forming kinase/Rho結合キナーゼ）で予め細胞を処理しておくとよい。
　本発明を構成する各工程における、その他の培養条件（培養温度など）は、動物細胞の培養において一般に採用されている条件とすればよい。即ち、例えば37℃、5%CO2の環境下で培養すればよい。また、基本培地として、イスコフ改変ダルベッコ培地（IMDM）（GIBCO社等）、ハムF12培地（HamF12）（SIGMA社、Gibco社等）、ダルベッコ変法イーグル培地（D-MEM）（ナカライテスク株式会社、シグマ社、Gibco社等）、グラスゴー基本培地（Gibco社等）、RPMI1640培地等を用いることができる。二種以上の基本培地を併用することにしてもよい。工程（２）、工程（３）、工程（３）を構成する培養工程Ａ、培養工程Ｂ、培養工程Ｃにおいては、上皮細胞の培養に適した基本培地（例えばD-MEMとハムF12培地の混合培地、D-MEM）を用いることが好ましい。培地に添加可能な成分の例としてウシ血清アルブミン（BSA）、抗生物質、2-メルカプトエタノール、PVA、非必須アミノ酸（NEAA）、インスリン、トランスフェリン、セレニウムを挙げることができる。典型的には培養皿などを用いて二次元的に細胞を培養する。本発明の方法によれば、二次元培養によってiPS細胞から腸管上皮細胞様細胞を得ることが可能となる。但し、ゲル状の培養基材あるいは３次元培養プレートなどを用いた３次元培養を実施することにしてもよい。
　本発明の第２の局面は本発明の分化誘導方法で調製した腸管上皮細胞様細胞の用途に関する。第１の用途として各種アッセイが提供される。本発明の腸管上皮細胞様細胞は腸管、特に小腸のモデル系に利用可能であり、腸管、特に小腸での薬物動態（吸収、代謝など）の評価や毒性の評価に有用である。換言すれば、本発明の腸管上皮細胞様細胞は、化合物の体内動態の評価や毒性の評価にその利用が図られる。
　具体的には、本発明の腸管上皮細胞様細胞を用いて被検物質の吸収性ないし膜透過性、薬物相互作用、薬物代謝酵素の誘導、薬物トランスポーターの誘導、毒性等を試験することができる。即ち、本発明は、腸管上皮細胞様細胞の用途の一つとして、被検物質の吸収性ないし膜透過性、薬物相互作用、薬物代謝酵素の誘導、薬物トランスポーターの誘導、毒性等を評価する方法（第１の態様）を提供する。当該方法では、（ｉ）本発明の分化誘導方法で得られた腸管上皮細胞様細胞で構成された細胞層を用意する工程と、（ｉｉ）前記細胞層に被検物質を接触させる工程と、（ｉｉｉ）前記細胞層を透過した被検物質を定量し、被検物質の吸収性ないし膜透過性、薬物相互作用、薬物代謝酵素の誘導、薬物トランスポーターの誘導、又は毒性を評価する工程を行う。尚、被検物質の吸収性については、後述の方法（第２の態様）でも評価することができる。
　工程（ｉ）では、典型的には、半透過性膜（多孔性膜）の上で腸管上皮細胞様細胞を培養し、細胞層を形成させる。具体的には、例えば、カルチャーインサートを備えた培養容器（例えば、コーニング社が提供するトランスウェル（登録商標））を使用し、カルチャーインサート内に細胞を播種して培養することにより、腸管上皮細胞様細胞で構成された細胞層を得る。
　工程（ｉｉ）での「接触」は、典型的には、培地に被検物質を添加することによって行われる。被検物質の添加のタイミングは特に限定されない。従って、被検物質を含まない培地で培養を開始した後、ある時点で被検物質を添加することにしても、予め被検物質を含む培地で培養を開始することにしてもよい。
　被検物質には様々な分子サイズの有機化合物又は無機化合物を用いることができる。有機化合物の例として核酸、ペプチド、タンパク質、脂質（単純脂質、複合脂質（ホスホグリセリド、スフィンゴ脂質、グリコシルグリセリド、セレブロシド等）、プロスタグランジン、イソプレノイド、テルペン、ステロイド、ポリフェノール、カテキン、ビタミン（B1、B2、B3、B5、B6、B7、B9、B12、C、A、D、E等）を例示できる。医薬品、栄養食品、食品添加物、農薬、香粧品（化粧品）等の既存成分或いは候補成分も好ましい被検物質の一つである。植物抽出液、細胞抽出液、培養上清などを被検物質として用いてもよい。２種類以上の被検物質を同時に添加することにより、被検物質間の相互作用、相乗作用などを調べることにしてもよい。被検物質は天然物由来であっても、或いは合成によるものであってもよい。後者の場合には例えばコンビナトリアル合成の手法を利用して効率的なアッセイ系を構築することができる。
　被検物質を接触させる期間は任意に設定可能である。接触期間は例えば１０分間～３日間、好ましくは１時間～１日間である。接触を複数回に分けて行うことにしてもよい。
　工程（ｉｉｉ）では、細胞層を透過した被検物質を定量する。例えば、トランスウェル（登録商標）のようなカルチャーインサートを備えた培養容器を使用した場合には、カルチャーインサートを透過した被検物質、即ち、細胞層を介して上部もしくは下部容器内に移動した被検物質を、被検物質に応じて、質量分析、液体クロマトグラフィー、免疫学的手法（例えば蛍光免疫測定法（FIA法）、酵素免疫測定法（EIA法））等の測定方法で定量する。定量結果（細胞層を透過した被検物質の量）と被検物質の使用量（典型的には培地への添加量）に基づき、被検物質の吸収性ないし膜透過性、薬物相互作用、薬物代謝酵素の誘導、薬物トランスポーターの誘導、又は毒性を判定・評価する。
　本発明は別の態様（第２の態様）として、被検物質の代謝又は吸収を評価する方法も提供する。当該方法では、（Ｉ）本発明の分化誘導方法で得られた腸管上皮細胞様細胞に被検物質を接触させる工程と、（ＩＩ）被検物質の代謝若しくは吸収、薬物相互作用、薬物代謝酵素の誘導、薬物トランスポーターの誘導、又は毒性を測定・評価する工程を行う。
　工程（Ｉ）、即ち腸管上皮細胞様細胞と被検物質の接触は、上記工程（ｉｉ）と同様に実施することができる。但し、予め細胞層を形成させることは必須ではない。
　工程（Ｉ）の後、被検物質の代謝若しくは吸収、薬物相互作用、薬物代謝酵素の誘導、薬物トランスポーターの誘導、又は毒性を測定・評価する（工程（ＩＩ））。工程（Ｉ）の直後、即ち、被検物質の接触の後、実質的な時間間隔を置かずに代謝等を測定・評価しても、或いは、一定の時間（例えば１０分～５時間）を経過した後に代謝等を測定・評価することにしてもよい。代謝の測定は、例えば、代謝産物の検出によって行うことができる。この場合には、通常、工程（Ｉ）後の培養液をサンプルとして、予想される代謝産物を定性的又は定量的に測定する。測定方法は代謝産物に応じて適切なものを選択すればよいが、例えば、質量分析、液体クロマトグラフィー、免疫学的手法（例えば蛍光免疫測定法（FIA法）、酵素免疫測定法（EIA法））等を採用可能である。
　典型的には、被検物質の代謝産物が検出されたとき、「被検物質が代謝された」と判定ないし評価する。また、代謝産物の量に応じて被検物質の代謝量を評価することができる。代謝産物の検出結果と、被検物質の使用量（典型的には培地への添加量）に基づき、被検物質の代謝効率を算出することにしてもよい。
　腸管上皮細胞様細胞における薬物代謝酵素（シトクロムP450（特にCYP3A4）、ウリジン2リン酸-グルクロン酸転移酵素（特にUGT1A8、UGT1A10）、硫酸転移酵素（特にSULT1A3など））の発現を指標として被検物質の代謝を測定することも可能である。薬物代謝酵素の発現はmRNAレベル又はタンパク質レベルで評価することができる。例えば、薬物代謝酵素のmRNAレベルに上昇を認めたとき、「被検物質が代謝された」と判定することができる。同様に、薬物代謝酵素の活性に上昇を認めたとき、「被検物質が代謝された」と判定することができる。代謝産物を指標として判定する場合と同様に、薬物代謝酵素の発現量に基づいて定量的な判定・評価を行うことにしてもよい。
　被検物質の吸収を評価するためには、例えば、培養液中の被検物質の残存量を測定する。通常、工程（Ｉ）後の培養液をサンプルとして被検物質を定量する。測定方法は被検物質に応じて適切なものを選択すればよい。例えば、質量分析、液体クロマトグラフィー、免疫学的手法（例えば蛍光免疫測定法（FIA法）、酵素免疫測定法（EIA法））等を採用可能である。典型的には、培養液中の被検物質の含有量の低下を認めたとき、「被検物質が吸収された」と判定・評価する。また、低下の程度に応じて被検物質の吸収量ないし吸収効率を判定・評価することができる。尚、細胞内に取り込まれた被検物質の量を測定することによっても、吸収の評価は可能である。
　尚、代謝の測定・評価と吸収の測定・評価を同時に又は並行して行うことにしてもよい。
　後述の実施例に示す通り、本発明の分化誘導方法で調製した人工多能性幹細胞由来腸管上皮細胞様細胞では、ヒト小腸上皮細胞で発現を認めるムチン2が、小腸のモデル系として頻用されているCaco-2細胞（ヒト結腸癌由来の細胞）とは比較にならないレベルで高発現していることが判明した。この事実は当該細胞が小腸のモデル系として極めて利用価値が高いことを裏づけるとともに、当該細胞を用いたアッセイの指標としてムチン2の発現が有用であることを示す。そこで本発明は、腸管上皮細胞様細胞を用いたアッセイの更なる態様（第３の態様）として、ムチン2の発現を指標とした二つの評価法、即ち、被検物質の消化管粘膜障害作用を評価する方法（第３の態様。以下、「障害作用評価法」と略称することがある）と被検物質の消化管粘膜保護作用を評価する方法（第４の態様。以下、「保護作用評価法」と略称することがある）を提供する。尚、本発明の障害作用評価法は、副作用として粘膜障害（潰瘍）を起こす可能性がある薬物の予測（副作用リスクの予測）に特に有用であり、本発明の保護作用評価法はこの様な副作用又はストレス性潰瘍を抑制する作用を持つ新規薬物のスクリーニングに特に有用である。
　本発明の障害作用評価法（第３の態様）では、（ａ）本発明の分化誘導方法で得られた腸管上皮細胞様細胞に被検物質を接触させる工程と、（ｂ）前記腸管上皮細胞様細胞におけるムチン2の発現を検出し、検出結果に基づき被検物質の消化管粘膜障害作用を判定する工程であって、ムチン2の発現低下が認められることが、被検物質が消化管粘膜障害作用を有することの指標となる工程を行う。
　工程（ａ）、即ち腸管上皮細胞様細胞と被検物質の接触は、上記態様（第１態様、第２態様）と同様に実施することができる。但し、予め細胞層を形成させることは必須ではない。使用可能な被検物質についても、上記の態様（第１態様及び第２態様）と同様であるため、その説明を省略する。
　工程（ａ）に続く工程（ｂ）では、腸管上皮細胞様細胞におけるムチン2の発現を検出し、検出結果に基づき被検物質の消化管粘膜障害作用を判定する。即ち、本発明ではムチン2の発現を利用して被検物質の消化管粘膜障害作用が判定される。より具体的には、ムチン2の発現低下が認められることを、被検物質が消化管粘膜障害作用を有することの指標として用いる。従って、ムチン2の発現低下を認めた場合に被検物質は消化管粘膜障害作用を有すると判定し、ムチン2の発現低下を認めない場合に被検物質は消化管粘膜障害作用を有しないと判定する。ムチン2の発現低下の程度（レベル）に基づき、消化管粘膜障害作用の強さ（程度）を決定することにしてもよい。また、複数の被検物質を用いた場合には、ムチン2の発現低下の程度（レベル）に基づき、各被検物質の消化管粘膜障害作用の強弱を比較評価することにしてもよい。
　ムチン2は分泌タンパク質である。ムチン2は腸管粘膜の保護に関わっている粘膜質であり、ムチン2の質や量の低下は潰瘍性大腸炎や癌を誘発することが知られている。
　ムチン2の発現は例えば常法に従って検出すればよい。ムチン2の検出方法として、RT-PCR法やリアルタイムPCR法（mRNAの測定／定量）、蛍光免疫測定法（FIA法）や酵素免疫測定法（EIA法）等の免疫学的手法、質量分析法等を例示することができる。
　通常は、比較対照として、被検物質に接触させない腸管上皮細胞様細胞（その他の条件は同一とする）（以下、「コントロール」と呼ぶ）を用意し、そのムチン2の発現も検出する。そして、当該コントロールの発現レベルと比較することによって、被検物質がムチン2の発現を低下させたか判断する。このようにコントロールとの比較によって被験物質の消化管粘膜障害作用を判定すれば、より信頼性の高い判定結果が得られる。
　本発明の保護作用評価法（第４の態様）では、（Ａ）本発明の分化誘導方法で得られた腸管上皮細胞様細胞に被検物質を接触させる工程と、（Ｂ）前記腸管上皮細胞様細胞におけるムチン2の発現を検出し、検出結果に基づき被検物質の消化管粘膜保護作用を判定する工程であって、前記物質によるムチン2の発現上昇が認められることが、被検物質が消化管粘膜保護作用を有することの指標となる工程を行う。
　工程（Ａ）では、腸管上皮細胞様細胞と被検物質の接触が行われる。腸管上皮細胞様細胞と被検物質の接触は、上記態様（第３態様）と同様に実施することができる。
　使用可能な被検物質については、上記の態様（第１態様及び第２態様）と同様であるため、その説明を省略する。
　工程（Ａ）に続く工程（Ｂ）では、腸管上皮細胞様細胞におけるムチン2の発現を検出し、検出結果に基づき被検物質の消化管粘膜保護作用を判定する。即ち、本発明ではムチン2の発現を利用して被検物質の消化管粘膜保護作用が判定される。より具体的には、ムチン2の発現上昇が認められることを、被検物質が消化管粘膜保護作用を有することの指標に用いる。従って、ムチン2の発現上昇を認めた場合に被検物質は消化管粘膜保護作用を有すると判定し、ムチン2の発現上昇を認めない場合に被検物質は消化管粘膜保護作用を有しないと判定する。ムチン2の発現上昇の程度（レベル）に基づき、消化管粘膜保護作用の強さ（程度）を決定することにしてもよい。また、複数の被検物質を用いた場合には、ムチン2の発現上昇の程度（レベル）に基づき、各被検物質の消化管粘膜保護作用の強弱を比較評価することにしてもよい。
　上記態様（第３の態様）と同様、より信頼性の高い判定結果を得るため、比較対照（コントロール）を設け、コントロールとの比較によって被検物質の消化管粘膜保護作用を判定することが好ましい。この場合のコントロールとしては、被検物質に接触させない腸管上皮細胞様細胞（その他の条件は同一とする）を用いることができる。
　当該態様（第４の態様）の評価法は、例えば、薬物の副作用としての粘膜障害又はストレス性潰瘍の予防又は治療用の新規薬物のスクリーニングに有用である。本発明の評価法をスクリーニングに利用する場合には、工程（Ｂ）での判定結果に基づき有効な被検物質を選抜する。選択した物質が十分な薬効を有する場合には、当該物質をそのまま腸管粘膜保護薬の有効成分として使用することができる。一方で十分な薬効を有しない場合には化学的修飾などの改変を施してその薬効を高めた上で、腸管粘膜保護薬の有効成分として使用することができる。勿論、十分な薬効を有する場合であっても、更なる薬効の増大を目的として同様の改変を施してもよい。
　本発明の分化誘導方法で調製した腸管上皮細胞様細胞の第２の用途として腸管上皮細胞様細胞を含有する細胞製剤が提供される。本発明の細胞製剤は各種腸疾患の治療に適用可能である。特に、障害された（機能不全を含む）腸管上皮組織の再生・再建用の材料としての利用が想定される。即ち、再生医療への貢献を期待できる。本発明の細胞製剤は、例えば、本発明の方法によって得られた腸管上皮細胞様細胞を生理食塩水や緩衝液（例えばリン酸系緩衝液）等に懸濁すること、或いは当該細胞を用いて三次元組織体（オルガノイドやスフェロイド）を作製することによって調製することができる。治療上有効量の細胞を投与できるように、一回投与分の量として例えば1×105個～1×1010個の細胞を含有させるとよい。細胞の含有量は、使用目的、対象疾患、適用対象（レシピエント）の性別、年齢、体重、患部の状態、細胞の状態などを考慮して適宜調整することができる。
　細胞の保護を目的としてジメチルスルホキシド（DMSO）や血清アルブミン等を、細菌の混入を阻止することを目的として抗生物質等を、細胞の活性化、増殖又は分化誘導などを目的として各種の成分（ビタミン類、サイトカイン、成長因子、ステロイド等）を本発明の細胞製剤に含有させてもよい。さらに、製剤上許容される他の成分（例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水など）を本発明の細胞製剤に含有させてもよい。
Ａ．ヒトiPS細胞から腸管上皮細胞への分化促進／機能獲得に有用な低分子化合物の探索
　生体の腸管上皮細胞に近い機能を示す細胞（腸管上皮細胞様細胞）を簡便且つ低コストで調製することを目指し、従来報告した低分子化合物とは異なる作用を有する新たな低分子化合物のヒトiPS細胞から腸管上皮細胞への分化に対する有用性を検討した。また、有用性が確認された化合物を利用して作製した腸管上皮細胞様細胞の薬物動態学的機能を検討した。
１．方法
（１）細胞
　ヒトiPS細胞（iPS-51：Windy）は、ヒト胎児肺線維芽細胞MRC-5にoctamer binding protein 3/4（OCT3/4）、sex determining region Y-box 2（SOX2）、kruppel-like factor 4（KLF4）、v-myc myelocytomatosis viral oncogene homolog（avian）（c-MYC）を、パントロピックレトロウイルスベクターを用いて導入後、ヒトES細胞様コロニーをクローン化したものであり、国立成育医療研究センター梅澤明弘博士よりご供与いただいた。フィーダー細胞はマウス胎仔線維芽細胞（MEF）を使用した。
（２）培地
　MEFの培養には10%ウシ胎仔血清（FBS）、2 mmol/L L-グルタミン（L-Glu）、1%非必須アミノ酸（NEAA）、100 ユニット/mLペニシリンG、100μg/mLストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を用いた。MEFの剥離液には0.05%トリプシン-エチレンジアミン四酢酸（EDTA）を、MEFの保存液にはセルバンカー1を用いた。ヒトiPS細胞の維持培養には20%ノックアウト血清代替物（KSR）、0.8% NEAA、2 mmol/L L-Glu、0.1 mmol/L 2-メルカプトエタノール（2-MeE）、5 ng/mL線維芽細胞増殖因子（FGF）2を含むDMEM Ham’s F-12（DMEM/F12）を用いた。ヒトiPS細胞の剥離液には1 mg/mLコラゲナーゼIV、0.25%トリプシン、20% KSR、1 mmol/L塩化カルシウムを含むダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を用いた。ヒトiPS細胞の保存液には霊長類ES/iPS細胞用凍結保存液を用いた。
（３）ヒトiPS細胞の培養
　ヒトiPS細胞はマイトマイシンC処理を施したMEF（6×105 cells/100 mmディッシュ）上に播種し、5% CO2/95% air条件下CO2インキュベーター中37℃にて培養した。ヒトiPS細胞の継代は、3～5日培養後、1:2～1:3のスプリット比で行った。ヒトiPS細胞は解凍48時間後に培地を交換し、それ以降は毎日交換した。
（４）ヒトiPS細胞の腸管上皮細胞への分化
　ヒトiPS細胞の腸管上皮細胞への分化は、ヒトiPS細胞が培養ディッシュに対し、未分化コロニーの占める割合が約70%になった状態で開始した。0.5% FBS、100 ng/mLアクチビンA、100ユニット/mLペニシリンG、100μg/mLストレプトマイシンを含むロズウェルパーク記念研究所（RPMI）＋グルタマックス培地で2日間、2% FBS、100 ng/mLアクチビンA、100ユニット/mLペニシリンG、100μg/mLストレプトマイシンを含むRPMI＋グルタマックス培地で1日間培養することで内胚葉に分化させた。その後、2% FBS、1%グルタマックス、250 ng/mL FGF2を含むDMEM/F12で4日間培養することで腸管幹細胞へ分化させた。この処理後、Y-27632（Rho結合キナーゼ阻害剤）を10 μmol/Lとなるように添加し、5% CO2/95% air条件下CO2インキュベーター中37℃にて60分間処理した細胞をアクターゼにて剥離し、あらかじめヒトiPS細胞用培地にて30倍に希釈した、成長因子を除去したマトリゲルにてコートした細胞培養用24ウェルプレートに播種した。その後、2% FBS、2 mmol/L L-Glu、1% NEAA、2% B27 supplement、1% N2 supplement、100ユニット/mLペニシリンG、100μg/mLストレプトマイシン、20 ng/mL上皮細胞増殖因子（EGF）、10 μmol/L Y-27632を含むDMEM/F12で1日間、2% FBS、2 mmol/L L-Glu、1% NEAA、2% B27 supplement、1% N2 supplement、100ユニット/mLペニシリンG、100μg/mLストレプトマイシン、20 ng/mL上皮細胞増殖因子（EGF）を含むDMEM/F12で18日間培養することで腸管上皮細胞へ分化させた。薬物代謝酵素の誘導剤処理は、2% FBS、2 mmol/L L-Glu、1% NEAA、2% B27 supplement、1% N2 supplement、100 units/mLペニシリンG、100 μg/mLストレプトマイシン、20 ng/mL EGFを含むDMEM/F12に1α,25-ジヒドロキシビタミンD3（VD3）を10 nmol/L又は100 nmol/L、或いはリファンピシンを10、40、100 μmol/Lとなるよう添加し、回収前48時間培養することで行った。また、分化の際に以前我々が見出した低分子化合物であるPD98059（20 μmol/L）、5-アザ-2’-デオキシシチジン（5 μmol/L）、A-83-01（0.5 μmol/L）に加え、1 mmol/L 8-ブロモ-3’,5’-サイクリックアデノシン一リン酸（8-Br-cAMP）、0.5 mmol/L 3-イソブチル-1-メチルキサンチン（IBMX）を添加し、腸管幹細胞および腸管上皮細胞への分化に及ぼす影響について検討した。
（５）総リボ核酸（RNA）抽出
　総RNAはヒトiPS細胞の分化誘導終了後、RNeasy（登録商標） Mini Kit（Qiagen）の添付マニュアルに従い抽出した。
（６）逆転写反応
　相補的DNA（cDNA）の合成は、PrimeScript（登録商標） RT reagent Kit (Perfect Real Time)（タカラバイオ株式会社）を使用した。操作は添付マニュアルに従った。
（７）リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（Real-Time RT-PCR）
　SYBR（登録商標） Premix Ex Taq II（Perfect Real Time）（タカラバイオ株式会社）を用い、cDNAを鋳型にしてReal-Time RT-PCRを行った。操作は添付マニュアルに従った。内在性コントロールとしてグリセルアルデヒド3リン酸脱水素酵素（GAPDH）を用い、測定結果を補正した。
（８）グリシルサルコシン（Gly-Sar）およびエストロン-3-硫酸（ES）の取り込み実験
　分化誘導終了後、トリチウムラベルされたGly-SarもしくはESを含む取り込み溶液で37°Cもしくは4°Cにてインキュベーションした。Gly-Sarの取り込み実験では、137 mmol/L塩化ナトリウム、5.4 mmol/L塩化カリウム、0.81 mmol/L硫酸マグネシウム、0.44 mmol/Lリン酸二水素カリウム、0.34 mmol/Lリン酸水素二ナトリウム、1.3 mmol/L塩化カルシウム、4.2 mmol/L炭酸水素ナトリウム、5.6 mmol/L D-グルコース、10 mmol/L MESを含むpH 6.0の取り込み溶液を、ESの取り込み実験では、137 mmol/L塩化ナトリウム、5.4 mmol/L塩化カリウム、0.81 mmol/L硫酸マグネシウム、0.44 mmol/Lリン酸二水素カリウム、0.34 mmol/Lリン酸水素二ナトリウム、1.3 mmol/L塩化カルシウム、4.2 mmol/L炭酸水素ナトリウム、5.6 mmol/L D-グルコース、10 mmol/L HEPESを含むpH 7.4の取り込み溶液を用いた。インキュベーション終了後、氷冷した取り込み溶液で細胞を洗浄することにより取り込みを停止させた。その後、0.5%ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を含む0.2 M水酸化ナトリウム溶液で細胞を可溶化し、シンチレーション溶液を加えた。Gly-SarもしくはESの細胞内取り込み量は、液体シンチレーションカウンターを用いて測定した放射活性より算出した。
（９）ヘキスト33342およびジゴキシンの輸送実験
　分化誘導終了後、ヘキスト33342もしくはトリチウムラベルされたジゴキシンを含む取り込み溶液をセルカルチャーインサートの頂側膜側もしくは基底膜側に加え、37°Cにてインキュベーションし、溶液を加えた反対側のチャンバーより経時的にサンプリングした。輸送実験では、137 mmol/L塩化ナトリウム、5.4 mmol/L塩化カリウム、0.81 mmol/L硫酸マグネシウム、0.44 mmol/Lリン酸二水素カリウム、0.34 mmol/Lリン酸水素二ナトリウム、1.3 mmol/L塩化カルシウム、4.2 mmol/L炭酸水素ナトリウム、5.6 mmol/L D-グルコース、10 mmol/L HEPESを含むpH 7.4の取り込み溶液を用いた。ヘキスト33342の見かけの膜透過係数は蛍光プレートリーダーを用いて測定した蛍光強度より（励起波長355 nm、蛍光波長460 nm）、ジゴキシンの見かけの膜透過係数は液体シンチレーションカウンターを用いて測定した放射活性より算出した。Efflux ratioは基底膜側から頂側膜側への見かけの膜透過係数を頂側膜側から基底膜側への見かけの膜透過係数で除することで算出した。なお、経上皮電気抵抗（TEER）値はMillicell ERS-2を用いて測定した。
（１０）薬物代謝実験
　分化誘導終了後、100 μmol/Lミダゾラムを含む培地（2 mmol/L L-Glu、1% NEAA、1% N2 supplement、100 ユニット/mLペニシリンG、100 μg/mLストレプトマイシン、20 ng/mL EGFを含むDMEM/F12）で37°Cにてインキュベーションし、所定の時間経過後、培地をサンプリングした。代謝活性は、液体クロマトグラフィー-マススペクトロメーター（LC-MS/MS）を用いて測定した培地中の1-水酸化ミダゾラムの量より算出した。代謝実験終了後、タンパク定量を行い、代謝活性をタンパク量で補正した。
　本検討で使用したマーカー遺伝子の特徴を以下に示す。
　ABCB1/MDR1（ATP結合カセットトランスポーターB1/多剤耐性タンパク1）：P糖タンパク質であり、排出トランスポーターとして機能する。
　ABCG2/BCRP（ATP結合カセットトランスポーターG2/乳ガン耐性タンパク）：排出トランスポーターとして機能する。
　CYP3A4（シトクロムP450 3A4）：小腸において主要な薬物代謝酵素である。
　LGR5（ロイシンリッチリピートを含むGタンパク質共役型受容体）：腸管幹細胞のマーカーである。
　PXR（プレグナンX受容体）：CYP3A4の発現や誘導に関与する。
　SLC15A1/PEPT1（SLC（solute carrier）ファミリーメンバー15A1/ペプチドトランスポーター1）：小腸の頂側膜側に発現している。
　SLCO2B1/OATP2B1（SLC（solute carrier）有機アニオントランスポーター2B1）：小腸の頂側膜側に発現している。
　Sucrase-isomaltase（スクラーゼ－イソマルターゼ）：腸管上皮に存在する二糖分解酵素であり、腸管上皮特異的マーカーである。
　UGT1A1（ウリジン2リン酸-グルクロン酸転移酵素1A1）：薬物のグルクロン酸抱合に関わる。
　UGT1A4（ウリジン2リン酸-グルクロン酸転移酵素1A4）：薬物のグルクロン酸抱合に関わる。
　Villin 1（ビリン 1）：微絨毛の主要な構成成分である。
２．結果
（１）腸管上皮細胞への分化条件の検討
　ヒトiPS細胞から腸管上皮細胞への分化誘導の際に添加する8-Br-cAMPおよびIBMXの濃度および期間の検討を行った。その結果、8-Br-cAMPは1 mmol/Lで分化開始後8～14日の間に、IBMXは0.5 mmol/Lで分化開始後14～18日目の間に用いることで、排出トランスポーターであるABCB1/MDR1、ペプチドの取り込みトランスポーターであるSCL15A1/PEPT1、主要な薬物代謝酵素であるシトクロムP450（CYP）3A4およびCYP3A4の発現に関与する核内受容体であるプレグナンX受容体（PXR）のmRNA発現レベルが高かった（図１、２）。したがって、8-Br-cAMPの添加は1 mmol/Lの濃度で分化開始後8～14日に、IBMXの添加は0.5 mmol/Lの濃度で分化開始後14～23日に添加することとした。
　次に、上記の条件で8-Br-cAMPおよびIBMXを添加した際の腸管幹細胞マーカー、腸管マーカーおよび薬物動態関連遺伝子の発現解析を行った。その結果、コントロールと比較してCYP3A4では17倍、ABCB1/MDR1では30倍、PXRでは20倍、SLC15A1/PEPT1では5倍、ウリジン2リン酸-グルクロン酸転移酵素（UGT）1A1では20倍、UGT1A4では40倍、ABCG2/BCRPでは3倍ほどのmRNAの発現が増加した（図３、４）。
（２）分化させた腸管上皮細胞様細胞におけるCYP3A4誘導能および活性の評価
　CYP3A4の誘導剤である1α,25-ジヒドロキシビタミンD3（VD3）およびリファンピシンを用いて、CYP3A4の発現誘導について検討を行った。その結果、従来の分化法で分化誘導した腸管上皮細胞様細胞および8-Br-cAMPとIBMXを用いて分化誘導した腸管上皮細胞様細胞のいずれにおいても1α,25-ジヒドロキシビタミンD3によるCYP3A4の誘導が認められた（図５）。一方、従来の分化法で分化誘導した腸管上皮細胞様細胞ではリファンピシンによるCYP3A4の発現誘導が認められていなかったが、8-Br-cAMPとIBMXを用いて分化誘導を行うことによって、リファンピシンによる応答性を有するようになった。
　次に、CYP3A4の代表的な基質であるミタゾラムの代謝物（1-水酸化体）の生成量から、CYP3A4の活性を評価した。その結果、従来の分化法で分化誘導させた腸管上皮細胞と比較して、8-Br-cAMPとIBMXを用いて分化誘導した腸管上皮細胞では、誘導剤未処理の群で、CYP3A4の活性が有意に増加した（図６）。また8-Br-cAMPとIBMXを用いて分化誘導した細胞において、1α,25-ジヒドロキシビタミンD3（VD3）を処理することで、CYP3A4の活性が有意に増加した。
（３）分化させた腸管上皮細胞様細胞における取り込みトランスポーターの機能評価
　ペプチドの取り込みトランスポーターであるPEPT1の活性を、その基質であるグリシルサルコシン（Gly-Sar）を用いて評価した。また、この取り込みがトランスポーターを介する取り込みでるかどうか評価するため、PEPT1の阻害剤であるイブプロフェン存在下およびトランスポーターの機能が抑制される4℃条件下でも取り込み実験を行った。その結果、従来の分化法で分化誘導した腸管上皮細胞様細胞および8-Br-cAMPとIBMXを用いて分化誘導した腸管上皮細胞様細胞のいずれにおいてもイブプロフェン存在下および4℃条件下では、Gly-Sarの取り込みが有意に低下した（図７）。また従来の分化法と比較して、8-Br-cAMPとIBMXを用いて分化誘導した腸管上皮細胞では、イブプロフェン未処理群（コントロール群）において、Gly-Sarの取り込みが有意に増加したことから、8-Br-cAMPとIBMXを用いて分化誘導を行うことによって、PEPT1活性の上昇が示された。
　有機アニオントランスポーターであるOATPの活性を、その基質であるエストロン-3-硫酸（ES）を用いて、阻害剤であるブロムスルフタレイン（BSP）の存在下または非存在下で評価した。その結果、8-Br-cAMPとIBMXを用いて分化誘導した腸管上皮細胞様細胞において、BSP存在下でESの取り込みが有意に低下したことから、OATP活性を有していることが示された（図８）。
（４）分化させた腸管上皮細胞様細胞における排出トランスポーターの機能評価
　8-Br-cAMPとIBMXを用いてセルカルチャーインサート上で分化誘導させた腸管上皮細胞様細胞の経上皮膜抵抗（TEER）値を測定したところ、分化が進むにつれて経時的なTEER値の上昇が認められ、最終的に200-250 Ω×cm2に達した（図９）。
　セルカルチャーインサート上で分化誘導を行った腸管上皮細胞様細胞を用いて、排出トランスポーターであるBCRPの機能について検討を行った。BCRPの基質としてはヘキスト33342を、阻害剤としてはKo143を用いた。得られた見かけの膜透過係数よりこれらの比を算出し、BCRPの活性を評価した。その結果、従来の分化法で分化誘導した腸管上皮細胞様細胞および8-Br-cAMPとIBMXを用いて分化誘導した腸管上皮細胞様細胞のいずれにおいても、Ko143の処理により見かけの膜透過係数比が低下した（図１０）。従来の分化法と比較して、8-Br-cAMPとIBMXを用いて分化誘導した腸管上皮細胞様細胞では、Ko143非存在下において、見かけの膜透過係数比が増加したことから、より高いBCRP活性を有することが示唆された。
　先ほどと同様、セルカルチャーインサート上で分化誘導を行った腸管上皮細胞様細胞を用いて、排出トランスポーターであるP-gpの機能について検討を行った。P-gpの基質としてはジゴキシンを、阻害剤としてはベラパミルを用いた。その結果、従来の分化法と比較して、8-Br-cAMPとIBMXを用いて分化誘導した腸管上皮細胞では、ベラパミル非存在下において、見かけの膜透過係数比が増加し、ベラパミルの処理によりその比が低下した（図１１）。このことから、従来の分化法では検出することができなかったP-gp活性の検出が可能となったことが示された。
　以上の結果から、cAMPが細胞へ供給される条件（具体的には例えば8-Br-cAMPを培地に添加すること）及び細胞内cAMP濃度の低下を抑える条件（具体的には例えばcAMP分解酵素阻害剤（例えばIBMX）を培地に添加すること）が腸管上皮細胞への分化を促進し、特に、腸管上皮細胞としての機能の獲得（成熟化）に有効であることが明らかとなった。以前に報告した条件、即ち、MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤及びTGFβ受容体阻害剤の併用に加え、これらの条件を単独又は組み合わせて用いることにより、より機能的な腸管上皮細胞様細胞を得ることが可能になる。
３．まとめ
　以上の通り、薬物代謝酵素活性及び誘導能に加え、取り込みおよび排出トランスポーターの輸送機能を有する腸管上皮細胞様細胞をヒトiPS細胞から簡便な方法にて作製することに成功した。また、分化促進及び機能獲得に有効な条件を見出すことに成功した。
Ｂ．ヒトiPS細胞由来腸管上皮細胞様細胞の特性の検討
　iPS細胞由来腸管上皮細胞様細胞の更なる有用性を検討するため、腸管粘膜の保護に関わっている粘膜質であるムチン2に着目し、iPS細胞由来腸管上皮細胞様細胞におけるムチン2の発現状態を調べた。
１．方法
＜粘膜障害作用＞
　腸管上皮細胞へと分化させる過程で、NSAIDsとして知られ粘膜障害作用を有するメロキシカム（50μM、200μM）、インドメタシン（75μM、300μM）、ケトプロフェン（200μM、800μM）を6日間添加し、培養することでムチン2の発現変動を検討した。
＜粘膜保護作用＞
　腸管上皮細胞へと分化させる過程で、粘膜保護作用を有するイルソグラジン（10μM、40μM）、レバミピド（50μM、100μM、250μM、1000μM）を6日間添加し、培養することでムチン2の発現変動を検討した。
＜RNA抽出＞
　腸管上皮細胞への分化後の回収終了後、Agencourt（登録商標）RNAdvance Tissue Kitの添付マニュアルに従い抽出した。
＜逆転写反応＞
　相補的DNA（cDNA）の合成は、ReverTra Ace（登録商標） qPCR RT Master Mixを使用し、添付マニュアルに従い行った。
＜リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（Real-Time RT-PCR）＞
　Real-Time RT-PCRはKAPA SYBR Fast qPCR Kitを用い、cDNAを鋳型にして、反応は添付マニュアルに従い行った。結果は内在性コントロールとしてヒポキサンチン-グアニンホスホリボシル トランスフェラーゼ（HPRT）を用いて補正した。
２．結果・考察
　ムチン2 mRNAの検出結果を図１２に示す。本法で調製した腸管上皮細胞様細胞（Control）は、ヒト結腸癌由来のCaco-2細胞（Caco-2）では殆ど発現していないムチン2を高発現していた。その発現量は、市販のヒト小腸由来細胞（SI）の発現量の約70％にも達する。この事実は、本法で調製した腸管上皮細胞様細胞が小腸のモデル系として極めて利用価値が高いことを示す。
　NSAIDsを添加することで、本法で調製した腸管上皮細胞様細胞のムチン2の発現（mRNAレベル）が低下した（ケトプロフェン-200を除く）。また、NSAIDsの中でもCOX-2選択的阻害剤であるメロキシカムを添加した場合では、他のNSAIDs（非選択的COX阻害剤）と比べてムチン2の発現（mRNAレベル）の低下が緩やかであった。これは、粘膜障害がCOX-1阻害と密接に関係することを反映した結果である。一方で、粘膜保護作用を有することが知られるイルソグラジン、レバミピドを添加した場合では、ムチン2の発現（mRNAレベル）が上昇した。以上の結果は、本法で調製した腸管上皮細胞様細胞が、ムチン2の発現を指標にしたアッセイ（粘膜障害（潰瘍）を起こす薬物の予測（副作用リスクの予測）及び粘膜保護作用を有する薬物のスクリーニング系）に有用であることを示す。
　本願発明によれば、iPS細胞から、より機能的な腸管上皮細胞様細胞を簡便且つ効率的に調製できる。腸管上皮細胞様細胞は小腸のモデル系として有用であり、吸収・代謝・膜透過性、薬物代謝酵素の誘導、薬物トランスポーターの誘導、毒性の評価等に利用できる。また、各種腸疾患治療用の細胞製剤の有効成分として、或いは再生医療の材料としての利用も期待される。
　この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。

Claims (21)

  1. 　以下の工程（１）～（３）を含む、人工多能性幹細胞を腸管上皮細胞へ分化誘導する方法：
    　（１）人工多能性幹細胞を内胚葉様細胞へと分化させる工程；
    　（２）工程（１）で得られた内胚葉様細胞を腸管幹細胞様細胞へと分化させる工程；
    　（３）工程（２）で得られた腸管幹細胞様細胞を腸管上皮細胞様細胞へと分化させる工程であって、MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びEGFの存在下、且つcAMPが細胞へ供給される条件下での培養を含む工程。
  2. 　工程（３）の前記培養の期間が７日間～４０日間である、請求項１に記載の方法。
  3. 　工程（３）が、以下のＡ～Ｃのいずれかの培養工程を含む、請求項１に記載の方法、
    　培養工程Ａ：（ａ－１）MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びEGFの存在下での培養と、該培養に続く、（ａ－２）MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びEGFの存在下、且つcAMPが細胞へ供給される条件下での培養を含む、
    　培養工程Ｂ：（ｂ－１）MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びEGFの存在下、且つcAMPが細胞へ供給される条件下での培養と、該培養に続く、（ｂ－２）MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤、EGF及びcAMP分解酵素阻害剤の存在下での培養を含む、
    　培養工程Ｃ：（ｃ－１）MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びEGFの存在下、且つcAMPが細胞へ供給される条件下での培養を含む。
  4. 　（ａ－１）の培養の期間は１日間～５日間であり、（ａ－２）の培養の期間は３日間～１５日間であり、
    　（ｂ－１）の培養の期間は３日間～１５日間であり、（ｂ－２）の培養の期間は３日間～１５日間であり、
    　（ｃ－１）の培養の期間は３日間～１５日間である、請求項３に記載の方法。
  5. 　（ａ－２）の培養、（ｂ－１）の培養、及び（ｃ－１）の培養が、MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びEGFに加えてcAMP分解酵素阻害剤も存在する条件で行われる、請求項３又は４に記載の方法。
  6. 　培養工程Ａが、（ａ－２）の培養に続く、（ａ－３）MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びEGFの存在下での培養を含み、
    　培養工程Ｂが、（ｂ－２）の培養に続く、（ｂ－３）MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びEGFの存在下での培養を含み、
    　培養工程Ｃが、（ｃ－１）の培養に続く、（ｃ－２）MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びEGFの存在下での培養を含む、請求項２～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 　（ａ－３）の培養、（ｂ－３）の培養、及び（ｃ－２）の培養の期間は１日間～１０日間である、請求項６に記載の方法。
  8. 　cAMPが細胞へ供給される条件が、培地中に8-Br-cAMPが存在することである、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 　cAMP分解酵素阻害剤がIBMXである、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 　MEK1阻害剤がPD98059であり、DNAメチル化阻害剤が5-アザ-2’-デオキシシチジンであり、TGFβ受容体阻害剤がA-83-01である、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 　工程（１）における分化誘導因子としてアクチビンAを用いる、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 　工程（２）における分化誘導因子としてFGF2を用いる、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 　人工多能性幹細胞がヒト人工多能性幹細胞である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 　請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法で得られた腸管上皮細胞様細胞。
  15. 　請求項１４に記載の腸管上皮細胞様細胞を用いた、被検物質の体内動態又は毒性を評価する方法。
  16. 　前記体内動態が、代謝、吸収、排泄、薬物相互作用、薬物代謝酵素の誘導、又は薬物トランスポーターの誘導である、請求項１５に記載の方法。
  17. 　以下の工程（ｉ）～（ｉｉｉ）を含む、請求項１５又は１６に記載の方法：
    　（ｉ）請求項１４に記載の腸管上皮細胞様細胞で構成された細胞層を用意する工程；
    　（ｉｉ）前記細胞層に被検物質を接触させる工程；
    　（ｉｉｉ）前記細胞層を透過した被検物質を定量し、被検物質の吸収性ないし膜透過性、薬物相互作用、薬物代謝酵素の誘導、薬物トランスポーターの誘導、又は毒性を評価する工程。
  18. 　以下の工程（Ｉ）及び（ＩＩ）を含む、請求項１５又は１６に記載の方法：
    　（Ｉ）請求項１４に記載の腸管上皮細胞様細胞に被検物質を接触させる工程；
    　（ＩＩ）被検物質の代謝若しくは吸収、薬物相互作用、薬物代謝酵素の誘導、薬物トランスポーターの誘導、又は毒性を測定・評価する工程。
  19. 　以下の工程（ａ）及び（ｂ）を含む、被検物質の消化管粘膜障害作用を評価する方法：
    　（ａ）請求項１４に記載の腸管上皮細胞様細胞に被検物質を接触させる工程；
    　（ｂ）前記腸管上皮細胞様細胞におけるムチン2の発現を検出し、検出結果に基づき被検物質の消化管粘膜障害作用を判定する工程であって、ムチン2の発現低下が認められることが、被検物質が消化管粘膜障害作用を有することの指標となる工程。
  20. 　以下の工程（Ａ）及び（Ｂ）を含む、被検物質の消化管粘膜保護作用を評価する方法：
    　（Ａ）請求項１４に記載の腸管上皮細胞様細胞に被検物質を接触させる工程；
    　（Ｂ）前記腸管上皮細胞様細胞におけるムチン2の発現を検出し、検出結果に基づき被検物質の消化管粘膜保護作用を判定する工程であって、前記物質によるムチン2の発現上昇が認められることが、被検物質が消化管粘膜保護作用を有することの指標となる工程。
  21. 　請求項１４に記載の腸管上皮細胞様細胞を含む、細胞製剤。
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