JPWO2020022483A1 - 腸管上皮細胞の製造方法および腸管上皮細胞 - Google Patents
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Abstract
Description
また、腸管上皮細胞は肝臓細胞と分化誘導の条件が類似していることが知られており、多能性幹細胞から腸管上皮細胞へ誘導する過程においては、一部の細胞が肝臓細胞に分化するという懸念がある。腸管上皮細胞に肝臓細胞がコンタミーションすると、試験結果に影響する恐れがあるので、コンタミネーションする肝臓細胞を少なくする方法が求められている。
<1> 多能性幹細胞を腸管幹細胞へと分化させる工程1、およびMEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤およびTGFβ受容体阻害剤からなる群より選択される一以上とEGFとの存在下において工程1で得られた腸管幹細胞を腸管上皮細胞へと分化させる工程2を含む、腸管上皮細胞の製造方法であって、工程2の途中において、分化中の細胞を、以下のいずれかの時点で一回以上再播種する、上記方法。
(a)多能性幹細胞の分化の開始後、15日〜25日の時点;
(b)工程2の開始後4日目以降、かつ工程2の終了より5日以上前の時点;
(c)工程2の全体の期間の長さを1としたとき、工程2の開始後、0.2〜0.7の長さの期間が経過した時点;
(d)工程2の開始後であって、成人腸における腸特異的ホメオボックスの発現量を100とした時の、腸特異的ホメオボックスの相対発現量が、300以下である時点;
(e)工程2の開始後であって、成人腸におけるCDX2の発現量を100とした時の、CDX2の相対発現量が、150以下である時点;または
(f)工程2の開始後であって、成人腸におけるビリンの発現量を100とした時の、ビリンの相対発現量が、100以下である時点:
<2> 工程2の途中において、分化中の細胞を、以下のいずれかの時点で一回以上再播種する、<1>に記載の方法。
(a)多能性幹細胞の分化の開始後、21日〜25日の時点;
(b)工程2の開始後10日目以降、かつ工程2の終了より5日以上前の時点;
(c)工程2の全体の期間の長さを1としたとき、工程2の開始後の0.5〜0.7の長さの期間が経過した時点;
(d)工程2の開始後であって、成人腸における腸特異的ホメオボックスの発現量を100とした時の、腸特異的ホメオボックスの相対発現量が、300以下である時点;
(e)工程2の開始後であって、成人腸におけるCDX2の発現量を100とした時の、CDX2の相対発現量が、150以下である時点;または
(f)工程2の開始後であって、成人腸におけるビリンの発現量を100とした時の、ビリンの相対発現量が、100以下である時点:
<3> 工程2の途中において、分化中の細胞を、一回以上再播種する際における、再播種の培地がROCK阻害剤を含む培地である、<1>または<2>に記載の方法。
<4> 工程2が、MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤、EGFおよびcAMP活性化物質の存在下において工程1で得られた腸管幹細胞を腸管上皮細胞へと分化させる工程を含む、<1>から<3>のいずれか一に記載の方法。
<5> 工程2において、細胞の再播種を多孔膜上に行う、<1>から<4>のいずれか一に記載の方法。
<6> 工程1を、表面積が30cm2以上の培養プレート上において行う、<1>から<5>のいずれか一に記載の方法。
<7> 工程2における再播種以降の培養を、1ウエルの表面積が3cm2以下の培養プレート上において行う、<1>から<6>のいずれか一に記載の方法。
<8> <1>から<7>の何れか一に記載の方法で得られる腸管上皮細胞。
<9> 肝臓マーカーであるアルブミンの発現量が、Caco−2細胞におけるアルブミンの発現量と同等以下である、<8>に記載の腸管上皮細胞。
[用語の説明]
MEK1:Mitogen−activated protein kinase kinase 1
TGFβ受容体:トランスフォーミング増殖因子β受容体
EGF:上皮細胞増殖因子
LIF:白血病阻害因子
bFGF:塩基性線維芽細胞増殖因子
SCF:幹細胞因子
FGF2:線維芽細胞増殖因子2
GSK−3β:グリコーゲン合成酵素キナーゼ 3β
cAMP:環状アデノシン一リン酸
ROCK:Rho−associatedcoiled−coilformingkinase/Rho結合キナーゼ
BMP4:骨形成タンパク質4
VEGF:血管内皮細胞増殖因子
FBS:ウシ胎児血清
本発明による腸管上皮細胞の製造方法は、多能性幹細胞を腸管上皮細胞系譜へ分化誘導することを含む。本発明によれば、生体の腸管組織を構成する腸管上皮細胞と類似の特性を示す細胞、即ち腸管上皮細胞が得られる。
(a)多能性幹細胞の分化の開始後、15日〜25日の時点;
(b)工程2の開始後4日目以降、かつ工程2の終了より5日以上前の時点;
(c)工程2の全体の期間の長さを1としたとき、工程2の開始後、0.2〜0.7の長さの期間が経過した時点;
(d)工程2の開始後であって、成人腸における腸特異的ホメオボックスの発現量を100とした時の、腸特異的ホメオボックスの相対発現量が、300以下である時点;
(e)工程2の開始後であって、成人腸におけるCDX2の発現量を100とした時の、CDX2の相対発現量が、150以下である時点;または
(f)工程2の開始後であって、成人腸におけるビリンの発現量を100とした時の、ビリンの相対発現量が、100以下である時点。
さらに、上記した(a)〜(f)のいずれかの時点で一回以上再播種することにより、コンタミネーションする肝臓細胞を大幅に減少することができる。
工程1では多能性幹細胞を培養し、腸管幹細胞へと分化させる。換言すれば、腸管幹細胞への分化を誘導する条件下で多能性幹細胞を培養する。多能性幹細胞が腸管幹細胞へ分化する限り、培養条件は特に限定されない。典型的には、多能性幹細胞が内胚葉細胞を介して腸管幹細胞へと分化するように、以下で説明する2段階の分化誘導、即ち、多能性幹細胞の内胚葉細胞への分化(工程1−1)と、内胚葉細胞の腸管幹細胞への分化(工程1−2)を行う。
この工程では多能性幹細胞を培養し、内胚葉細胞へと分化させる。換言すれば、内胚葉への分化を誘導する条件下で多能性幹細胞を培養する。多能性幹細胞が内胚葉細胞に分化する限り、培養条件は特に限定されない。例えば、常法に従い、アクチビンAを添加した培地で培養する。この場合、培地中のアクチビンAの濃度を例えば10ng/mL〜200 ng/mL、好ましくは20 ng/mL〜150 ng/mLとする。細胞の増殖率や維持等の観点から、培地に血清または血清代替物(KnockOutTMSerumReplacement(KSR)など)を添加することが好ましい。血清はウシ胎仔血清に限られるものではなく、ヒト血清や羊血清等を用いることもできる。血清または血清代替物の添加量は例えば0.1%(v/v)〜10%(v/v)である。
この工程では、工程1−1で得られた内胚葉細胞を培養し、腸管幹細胞へと分化させる。換言すれば、腸管幹細胞への分化を誘導する条件下で内胚葉細胞を培養する。内胚葉細胞が腸管幹細胞へと分化する限り、培養条件は特に限定されない。好ましくは、FGF2の存在下、またはGSK−3β阻害剤の存在下で培養を行う。FGF2としては好ましくはヒトFGF2(例えばヒト組換えFGF2)を用いる。
工程2では、MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤およびTGFβ受容体阻害剤からなる群より選択される一以上とEGFを併用し、工程1で得られた腸管幹細胞を腸管上皮細胞へと分化させる。「MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤およびTGFβ受容体阻害剤からなる群より選択される一以上」としては、MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤およびTGFβ受容体阻害剤のうちの一つ(即ち、MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤またはTGFβ受容体阻害剤の何れか一)でもよいし、MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤およびTGFβ受容体阻害剤のうちの二つ(即ち、MEK1阻害剤とDNAメチル化阻害剤の組み合わせ、MEK1阻害剤とTGFβ受容体阻害剤の組み合わせ、またはDNAメチル化阻害剤またはTGFβ受容体阻害剤の組み合わせ)でもよいし、MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤およびTGFβ受容体阻害剤の全てでもよい。
<培養工程A>
培養工程Aでは、(a−1)EGFおよびcAMP活性化物質の存在下での培養と、その後に行われる、(a−2)MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤およびEGFの存在下での培養を行う。このように2段階の培養を行えば、腸管上皮細胞への分化促進、成熟化、機能獲得の効果が期待できる。(a−1)の培養の期間は例えば2日間〜10日間、好ましくは4日間〜8日間であり、(a−2)の培養の期間は例えば9日間〜29日間、好ましくは7日間〜27日間である。尚、特に説明しない事項(各培養に使用可能な化合物、各化合物の添加濃度等)については、上記の対応する説明が援用される。
培養工程Bでは、(b−1)EGFの存在下での培養と、その後に行われる、(b−2)MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤、EGFおよびcAMP活性化物質の存在下での培養を行う。このように2段階の培養を行えば、腸管上皮細胞への分化促進、成熟化、機能獲得の効果が期待できる。(b−1)の培養の期間は例えば2日間〜10日間、好ましくは4日間〜8日間であり、(b−2)の培養の期間は例えば9日間〜19日間、好ましくは7日間〜17日間である。尚、特に説明しない事項(各培養に使用可能な化合物、各化合物の添加濃度等)については、上記の対応する説明が援用される。
培養工程Cでは、(c−1)EGFおよびcAMP活性化物質の存在下での培養と、その後に行われる、(c−2)MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤、EGFおよびcAMP活性化物質の存在下での培養を行う。このように2段階の培養を行えば、腸管上皮細胞への分化促進、成熟化、機能獲得の効果が期待できる。(c−1)の培養の期間は例えば2日間〜10日間、好ましくは4日間〜8日間であり、(c−2)の培養の期間は例えば9日間〜19日間、好ましくは7日間〜17日間である。尚、特に説明しない事項(各培養に使用可能な化合物、各化合物の添加濃度等)については、上記の対応する説明が援用される。
培養工程Dでは、(d−1)MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤、EGFおよびcAMP活性化物質の存在下での培養を行う。この培養工程は、培養操作が簡便であること、腸管上皮細胞への分化に対してより効果的であること、化合物であるため安定した効果が期待できること等の点で特に有利である。(d−1)の培養の期間は例えば15日間〜25日間、好ましくは17日間〜23日間である。尚、特に説明しない事項(各培養に使用可能な化合物、各化合物の添加濃度等)については、上記の対応する説明が援用される。
(a)多能性幹細胞の分化の開始後、15日〜25日の時点(好ましくは16日〜24日の時点であり、さらに好ましくは17日〜23日の時点である。また、別の観点からは、好ましくは21日〜25日の時点であり、より好ましくは22日〜24日の時点であり、特に好ましくは23日の時点である);
(b)工程2の開始後4日目以降、かつ工程2の終了より5日以上前の時点(好ましくは、工程2の開始後10日目以降、かつ工程2の終了より5日以上前の時点、より好ましくは、
工程2の開始後11日目以降、かつ工程2の終了より5日以上前の時点である);
(c)工程2の全体の期間の長さを1としたとき、工程2の開始後、0.2〜0.7の長さの期間が経過した時点(好ましくは0.5〜0.7の長さの期間が経過した時点、さらに好ましくは0.6の長さの期間が経過した時点である);
(d)工程2の開始後であって、成人腸における腸特異的ホメオボックスの発現量を100とした時の、腸特異的ホメオボックスの相対発現量が、300以下である時点(好ましくは250以下、さらに好ましくは200以下の時点である);
(e)工程2の開始後であって、成人腸におけるCDX2の発現量を100とした時の、CDX2の相対発現量が、150以下である時点(好ましくは130以下、さらに好ましくは110以下の時点である);または
(f)工程2の開始後であって、成人腸におけるビリンの発現量を100とした時の、ビリンの相対発現量が、100以下である時点(好ましくは85以下、さらに好ましくは70以下の時点である);
本発明によれば、上記した本発明による腸管上皮細胞の製造方法で得られる腸管上皮細胞が提供される。本発明の腸管上皮細胞は、好ましくは、肝臓マーカーであるアルブミンの発現量が、Caco−2細胞におけるアルブミンの発現量と同等以下である細胞である。
ヒトiPS細胞(FF−1)はマトリゲル(登録商標)コートしたディッシュ上に播種し、5% O2条件下CO2インキュベーター中37℃にて培養した。ヒトiPS細胞(FF−1)の継代は3〜5日培養後、1:3〜1:10のスプリット比で行った。継代後48時間は培地を交換せず、それ以降は毎日交換した。ヒトiPS細胞(FF−1)はセルラー・ダイナミクス・インターナショナルから入手したものである。
比較例1〜3、実施例1〜4の分化培養方法の概要を図1に示す。
図1において、符号および略号は以下を示す。
Activin Aを含むRPMI 1640培地およびBMP4, VEGF, FGF2, EGFを含むRPMI 1640培地
2% FBS, 1% Glutamax, 250 ng/mL FGF2を含むDMEM/F12
2% FBS、1% Glutamax、1% NEAA、2% B27 supplement、1% N2 supplement、100ユニット/mLペニシリンG、100μg/mLストレプトマイシン、20 ng/mL上皮細胞増殖因子(EGF)を含むDMEM/F12
20 ng/mL EGFを含むAdvanced DMEM/F12(Thermo fisher scientific)
F: Forskolin
a: 5−アザ−2’−デオキシシチジン(5−aza−2’dc)
P: PD98059
A: A8301
比較例2および3では、Day11およびDay29に再播種した。
実施例1および2では、Day11およびDay17に再播種した。
実施例3および4では、Day11およびDay23に再播種した。
ヒトiPS細胞(FF−1)を、Activin A存在下での培養およびBMP4, VEGF, FGF2, EGF存在下での培養、合計で7日間(0日目〜7日目)培養し、さらに、2%FBS、1%Glutamax、250ng/mL FGF2を含むDMEM/F12で4日間(7日目〜11日目)の培養を行い、腸管幹細胞へ分化誘導した。
ヒトiPS細胞(FF−1)を、比較例1と同様の条件で11日間培養し、腸管幹細胞へ分化誘導した。比較例1と同様の条件で細胞を剥離、播種した。
再播種当日(29日目)にY−27632を10μmol/Lとなるように添加し、CO2インキュベーター中37℃にて60分間処理した細胞をアクターゼで剥離し、セルカルチャーインサート上の多孔膜(表面積は、0.33cm2)に再播種した。翌日の培地交換まで1日間Y−27632を添加した。それ以外は比較例2と同様に培養し、腸管上皮細胞を得た。
ヒトiPS細胞(FF−1)を、比較例1と同様の条件で11日間培養し、腸管幹細胞へ分化誘導した。比較例1と同様の条件で細胞を剥離、播種した。
その後、比較例1と同様の条件で1日間(11日目〜12日目)、5日間(12日目〜17日目)培養した後、細胞を培養容器からアクターゼで剥離し、セルカルチャーインサート上の多孔膜(表面積は、0.33cm2)に再播種した。
再播種後、20 ng/mL EGFを含むAdvanced DMEM/F12で1日間(17日目〜18日目)、20 ng/mL EGF、30μmol/L Forskolin、5μmol/L 5−aza−2’dc、20μmol/L PD98059、0.5μmol/L A8301を含むAdvanced DMEM/F12で12日間(18日目〜30日目)培養し、腸管上皮細胞を得た。
再播種当日(17日目)にY−27632を10μmol/Lとなるように添加し、CO2インキュベーター中37℃にて60分間処理した細胞をアクターゼで剥離し、セルカルチャーインサート上の多孔膜(表面積は、0.33cm2)に再播種した。翌日の培地交換まで1日間Y−27632を添加した。それ以外は実施例1と同様に培養し、腸管上皮細胞を得た。
ヒトiPS細胞(FF−1)を、比較例1と同様の条件で11日間培養し、腸管幹細胞へ分化誘導した。比較例1と同様の条件で細胞を剥離、播種した。
その後、比較例1と同様の条件で1日間(11日目〜12日目)、6日間(12日目〜18日目)、さらに比較例1と同様5−aza−2’dc、PD98059、A8301を添加して5日間(18日目〜23日目)培養した後、細胞を培養容器からアクターゼで剥離し、セルカルチャーインサート上の多孔膜(表面積は、0.33cm2)に再播種した。
再播種後、20 ng/mL EGFを含むAdvanced DMEM/F12で1日間(23日目〜24日目)20 ng/mL EGF、30μmol/L Forskolin、5μmol/L 5−aza−2’dc、20μmol/L PD98059、0.5μmol/L A8301を含むAdvanced DMEM/F12で6日間(24日目〜30日目)培養し、腸管上皮細胞を得た。
再播種当日(23日目)にY−27632を10μmol/Lとなるように添加し、CO2インキュベーター中37℃にて60分間処理した細胞をアクターゼで剥離し、セルカルチャーインサート上の多孔膜(表面積は、0.33cm2)に再播種した。翌日の培地交換まで1日間Y−27632を添加した。それ以外は実施例1と同様に培養し、腸管上皮細胞を得た。
比較例1〜3および実施例1〜4で得た腸管上皮細胞のCYP3A4活性をミダゾラムの代謝産物の量から測定した。分化誘導終了後、5μmol/Lミダゾラムを含む培地で37℃にてインキュベーションし、2時間経過後、培地をサンプリングした。代謝活性は、液体クロマトグラフィー−マススペクトロメーター(LC−MS/MS)を用いて測定した培地中の1−水酸化ミダゾラムの量より算出した。代謝実験終了後、タンパク定量を行い、代謝活性をタンパク量で補正した。結果を表1に示す。
それぞれの試験群における再播種日でTranswellに細胞を播種し、試験終了日まで培養した細胞のバリア機能(transepithelial electrical resistance:TEER)を測定した。TEERはEVOM2(登録商標)Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter(WORLD PRECISION INSTRUMENTS)を用いて測定した。操作はマニュアルに従った。結果を表2に示す。
実施例1〜4は、比較例1と同様の十分なバリア機能(200Ω・cm2以上)を示したが、比較例2および3ではバリア機能が消失していた。
試験例2でバリア機能が保たれていた比較例1、実施例1〜4の腸管上皮細胞から試験終了日に、RNeasy(登録商標)Mini Kit(Qiagen)を用いてRNAを抽出した。操作は、添付マニュアルに従った。逆転写反応として、相補的DNA(cDNA)の合成は、High capacity RNA−to−cDNA Kit(applied biosystems)を使用した。操作は添付マニュアルに従った。
リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(Real−Time RT−PCR)は、TaqMan(登録商標) Gene Expression Master Mix(applied biosystems)を用い、cDNAを鋳型にして行った。操作はマニュアルに従った。内在性コントロールとしてリボソームの18Sを用い、測定結果を補正した。種々の遺伝子のプローブを用いてmRNAの発現量を見積もった。結果を表3に示す。表3における数値は、 小腸マーカーについては、Adult Intestineにおける発現量を100としたときの相対発現量を、肝臓マーカーについては、Caco−2における発現量を100としたときの相対発現量を示す。
比較例1と同様の条件で、ヒトiPS細胞(FF−1)の培養および分化誘導を行った。培養および分化誘導は4群に分けて開始し、Day11,Day20,Day25,Day30の時点で、1群ずつ試験例3と同様の試験に供し、小腸マーカーVillin1、CDX2、ISXの発現を調べた。結果を図2に示す。図2における数値は、Adult Intestineにおける発現量を100としたときの相対発現量を示す。
小腸マーカーの発現量がDay25から急激に増加する(=腸管上皮細胞への分化が急激に進む)ことが分かった。試験例2の結果と合わせて考えると、腸管上皮細胞のバリア機能に悪影響を与えないためには、小腸マーカー発現がDay25前後の量の時に、再播種操作を行うことが望ましい。
Claims (9)
- 多能性幹細胞を腸管幹細胞へと分化させる工程1、およびMEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤およびTGFβ受容体阻害剤からなる群より選択される一以上とEGFとの存在下において工程1で得られた腸管幹細胞を腸管上皮細胞へと分化させる工程2を含む、腸管上皮細胞の製造方法であって、工程2の途中において、分化中の細胞を、以下のいずれかの時点で一回以上再播種する、前記方法。
(a)多能性幹細胞の分化の開始後、15日〜25日の時点;
(b)工程2の開始後4日目以降、かつ工程2の終了より5日以上前の時点;
(c)工程2の全体の期間の長さを1としたとき、工程2の開始後、0.2〜0.7の長さの期間が経過した時点;
(d)工程2の開始後であって、成人腸における腸特異的ホメオボックスの発現量を100とした時の、腸特異的ホメオボックスの相対発現量が、300以下である時点;
(e)工程2の開始後であって、成人腸におけるCDX2の発現量を100とした時の、CDX2の相対発現量が、150以下である時点;または
(f)工程2の開始後であって、成人腸におけるビリンの発現量を100とした時の、ビリンの相対発現量が、100以下である時点: - 工程2の途中において、分化中の細胞を、以下のいずれかの時点で一回以上再播種する、請求項1に記載の方法。
(a)多能性幹細胞の分化の開始後、21日〜25日の時点;
(b)工程2の開始後10日目以降、かつ工程2の終了より5日以上前の時点;
(c)工程2の全体の期間の長さを1としたとき、工程2の開始後の0.5〜0.7の長さの期間が経過した時点;
(d)工程2の開始後であって、成人腸における腸特異的ホメオボックスの発現量を100とした時の、腸特異的ホメオボックスの相対発現量が、300以下である時点;
(e)工程2の開始後であって、成人腸におけるCDX2の発現量を100とした時の、CDX2の相対発現量が、150以下である時点;または
(f)工程2の開始後であって、成人腸におけるビリンの発現量を100とした時の、ビリンの相対発現量が、100以下である時点: - 工程2の途中において、分化中の細胞を、一回以上再播種する際における、再播種の培地がROCK阻害剤を含む培地である、請求項1または2に記載の方法。
- 工程2が、MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤、EGFおよびcAMP活性化物質の存在下において工程1で得られた腸管幹細胞を腸管上皮細胞へと分化させる工程を含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 工程2において、細胞の再播種を多孔膜上に行う、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- 工程1を、表面積が30cm2以上の培養プレート上において行う、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- 工程2における再播種以降の培養を、1ウエルの表面積が3cm2以下の培養プレート上において行う、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1から7の何れか一項に記載の方法で得られる腸管上皮細胞。
- 肝臓マーカーであるアルブミンの発現量が、Caco−2細胞におけるアルブミンの発現量と同等以下である、請求項8に記載の腸管上皮細胞。
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