WO2017150927A1 - Bkca 채널 활성화용 조성물 - Google Patents

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WO2017150927A1
WO2017150927A1 PCT/KR2017/002291 KR2017002291W WO2017150927A1 WO 2017150927 A1 WO2017150927 A1 WO 2017150927A1 KR 2017002291 W KR2017002291 W KR 2017002291W WO 2017150927 A1 WO2017150927 A1 WO 2017150927A1
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WO
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channel
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curarinone
bkca
hydroxy
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PCT/KR2017/002291
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박철승
이소정
최재수
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Gwangju Institute of Science and Technology
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Gwangju Institute of Science and Technology
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/35—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom
    • A61K31/352—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom condensed with carbocyclic rings, e.g. methantheline 
    • A61K31/353—3,4-Dihydrobenzopyrans, e.g. chroman, catechin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/10—Drugs for disorders of the urinary system of the bladder
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to novel compounds capable of activating BK Ca channels.
  • BK Ca channels Large conductance Ca 2 + - activity K + channels (BK Ca channels) are membrane polarization and / or the cells are activated by the in Ca2 +, is passed across the cell width prevent K + ion (Cui et al 2009; Yang et al 2015..) .
  • BK Ca channels are widely expressed in various types of excitable and nonexcitable cells, neurotransmitter release (Raffaelli et al. 2006), smooth muscle contraction (Brenner et al. 2000; Herrera et. al. 2000), and the regulation of some important physiological processes, including periodic behavioral rhythms (Meredith et al. 2006).
  • Dysfunction of the BK Ca channel is epilepsy (Lorenz et al. 2007; Du et al. 2005), erectile dysfunction (Werner et al. 2005) and overactive bladder (OAB) (Meredith et. al. 2004).
  • OABs are generally characterized by the presence of urinary urgency with increased day or night time frequency (Cerruto et al. 2012). OAB affects approximately 17% of the Western population, both men and women, and increases with age (Coyne et al. 2013).
  • the BK Ca channel is one of the most physiologically important K + channels and regulates UBSM function in health and disease (Petkov et al. 2014). BK Ca channels are highly expressed in UBSM (Hristov et al. 2011). By being uniquely activated by both membrane polarization and intracellular Ca2 +, BK Ca channel activation underlies the initial repolarization stage of spontaneous action potentials, which trigger the maintenance of stable membrane potential and UBSM phasic contraction. Moreover, a series of studies the BK Ca channel cholinergic and purinergic - showed that there were reports that an important role in reducing the induced contractility (contractility), BK Ca channel expression or changes the function can contribute to OAB generation ( Werner ME et al 2007).
  • the present inventors have made diligent research efforts to discover novel compounds having BK Ca channel activation potency using natural compound libraries. As a result, the present invention was completed by identifying that among the flavanone derivatives having a similar structure, compounds having specific substituents have greatly increased BK Ca channel activation ability.
  • an object of the present invention is to provide a composition for preventing or treating BK Ca channel activity-related diseases, diseases or disorders.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for activating BKCa channel comprising a flavanone derivative represented by the following general formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof:
  • R 1 is a hydrophobic substituent selected from the group consisting of hydrogen and linear or branched C 1 -C 15 alkyl or alkenyl;
  • R 1 is C 6 -C 15 alkyl or alkenyl
  • R 2 is C 1 -C 4 alkoxy and when R 1 is hydrogen or C 1 -C 5 alkyl or alkenyl R 2 is hydroxy;
  • R3, R4 and R5 are each independently hydrogen or hydroxy provided that at least one of R3, R4 and R5 is hydroxy.
  • the present inventors have made diligent research efforts to discover novel compounds having BK Ca channel activation potency using natural compound libraries. As a result, it was found that among the flavanone derivatives having a similar structure, compounds having specific substituents had greatly increased BK Ca channel activation ability.
  • BK Ca channel activators of BK Ca channels using newly developed cell-based assays. It exhibits a mutation BK Ca channel is very greatly enhanced Ca 2 + sensitivity used in the present analysis, for channel activation did not need increasing in the Ca 2 + additionally cells (Lee et al. 2013). Therefore, we were able to use commercially available thallium (Tl +)-based fluorescence analysis for voltage active K + channels.
  • Tl + thallium
  • alkyl refers to a straight or branched chain saturated hydrocarbon group.
  • Alkyl of C1-C15 means an alkyl group having an alkyl unit having 1 to 15 carbon atoms.
  • alkenyl refers to a straight or branched chain hydrocarbon group containing one or more carbon-carbon double bonds.
  • Alkenyl of C 1 -C 15 means an alkenyl group having an alkenyl unit having 1 to 15 carbon atoms.
  • R 1 of the present invention is a hydrophobic substituent selected from the group consisting of hydrogen and linear or branched C 1 -C 15 alkyl or alkenyl as described above, and is unsubstituted with a substituent which imparts hydrophilicity such as a hydroxy group.
  • the present inventors have described the BKCa of a kurarinol compound having the same chemical structural formula, except that a kurarinone compound and a rabularuryl substituent of the kurarinon are substituted by a hydroxy group (-OH). This was confirmed through a comparison of channel activity.
  • R 1 of the present invention is C 6 -C 15 alkyl or alkenyl
  • R 2 is C 1 -C 4 alkoxy
  • R 1 of the present invention is hydrogen or C 1 -C 5 alkyl or alkenyl.
  • R 2 is hydroxy
  • alkoxy refers to an oxygen substituent bonded to an alkyl group by a single bond, and means a form in which hydrogen of the hydroxy group is substituted with an alkyl group.
  • Alkoxy of C 1 -C 4 means alkoxy having an alkyl group of 1 to 4 carbon atoms substituted with hydrogen of a hydroxy group and bonded to oxygen.
  • R 1 of the invention is C 6 -C 15 alkyl or alkenyl
  • R 2 is methoxy
  • R 1 of the invention is hydrogen, 3-methyl-2-buten-1-yl (3-methyl-2-buten-1-yl) or 2-isopropenyl-5-methyl 4-hexen-1-yl (2-isopropenyl-5-methyl-4-hexen-1-yl).
  • the 3-methyl-2-buten-1-yl substituent of the present invention is also named a prenyl substituent, and the 2-isopropenyl-5-methyl-4-hexen-1-yl substituent is a lavandulyl It may also be named a substituent.
  • R1 of the present invention when R1 of the present invention is hydrogen, R2 is hydroxy.
  • R 1 of the invention when R 1 of the invention is 3-methyl-2-buten-1-yl, R 2 is hydroxy.
  • R 1 of the invention is 2-isopropenyl-5-methyl-4-hexen-1-yl
  • R 2 is methoxy
  • R 4 of the present invention is hydroxy, wherein R 3 and R 5 are each independently hydrogen (-H) or hydroxy (-OH).
  • At least one of R 3 and R 5 of the present invention is hydrogen.
  • the flavanone derivative represented by Formula 1 of the present invention is a group consisting of kurarinone, naringenin and leachianone G (see Fig. 3). It is a compound selected from.
  • the composition of the present invention shifts the conductivity-voltage (G-V) correlation of the BKCa channel in the negative voltage direction. Moving the conductivity-voltage correlation in the negative voltage direction indicates that the BKCa channel is activated by stabilizing the open shape of the channel.
  • the present invention provides a composition for the prevention or treatment of a BKCa channel activity lowering-related condition, disease or condition comprising the composition described above.
  • the term “decreased BK Ca channel activity-related condition, disease or disease” means that the activity of the BK Ca channel is lowered or substantially inactivated relative to normal levels, and thus controlled by BK Ca channel activity. Degradation of important physiological functions such as neuronal excitability, neurotransmitter secretion, smooth muscle cell contraction, and frequency tuning of hair cells, resulting in a disease or condition do.
  • the BK Ca channel activity lowering-related condition, disease or condition of the invention is cardiovascular disease, obstructive or inflammatory airway disease, lower urinary tract disorders, erectile dysfunction , Anxiety and anxiety-related conditions, epilepsy or pain.
  • BKCa channels-activate the activated potassium channels large-conductance calcium-activated potassium (BKCa) channels) (Salkoff, et al., 2006; Cui, et al., 2009). These channels are known to perform important physiological functions in neuronal excitability, neurotransmitter secretion, smooth muscle cell contraction, and frequency tuning of hair cells (Brenner, et al., 2000; Nelson, et al., 1995; Fettiplace and Fuchs, 1999).
  • BKCa channels consist of a pore-forming ⁇ -subunit and a regulatory ⁇ -subunit.
  • the ⁇ -subunit of the BKCa channel consists of seven transmembrane domains (Catterall, 1995) and the C-terminus contains two regulators that regulate the K + conductance domain (RCK) domain, which are cells A gate ring is formed that responds to the Ca 2+ concentration in the cell (Jiang, et al., 2001).
  • BKCa channels are known to be therapeutic targets closely related to hypertension, coronary artery spasm, urinary incontinence and many neurological diseases (Ghatta, et al., 2006). Mice deficient in BKCa channels are known to exhibit symptoms such as incontinence, bladder overactivity, and erectile dysfunction (Meredith, et al., 2004; Werner, et al., 2005).
  • BK Ca channels stabilizes cells by increasing K + efflux and causing hyperpolarization.
  • substances that open or enhance the activity of BK Ca channels may confer therapeutic benefits that reduce intracellular excitability and relieve tension in smooth muscle cells.
  • cardiovascular disease is a general term used to classify a number of conditions that affect the vasculature of the heart, heart valves, blood, and the body, and diseases affecting the heart or blood vessels. Include them.
  • Cardiovascular diseases of the present invention are atherosclerosis, atherothrombosis, atherosclerosis, coronary artery disease, ischemia, reperfusion injury, hypertension, restenosis, arterial inflammation, myocardial ischemia or ischemic heart disease, stable and unstable angina, stroke, congestive heart failure
  • Aortic diseases such as aortic stenosis or aortic aneurysm and peripheral vascular disease.
  • peripheral vascular disease refers to diseases of the heart and central nervous system vessels often encountered upon narrowing of the vessels of the extremities, for example, blood vessels are free of defects, but not cold, stress or Functional diseases resulting from stimuli such as smoking, and organic diseases resulting from structural defects of the vascular system such as atherosclerosis lesions, local inflammation or traumatic injury.
  • Obstructive or inflammatory airway diseases of the present invention include airway hyperresponsiveness, pneumoconiosis, aluminumemia, carbonosis, asbestosis, septicemia, ptilosis, siderosis, silicosis, tobacco poisoning, byssinosis Sarcoidosis, beryllium disease, emphysema, acute respiratory distress syndrome (ARDS), acute lung injury (ALI), acute or chronic infectious lung disease, chronic obstructive pulmonary disease (chronic) obstructive pulmonary disease (COPD), bronchitis, chronic bronchitis, whiskey bronchitis, exacerbation of airway hyperreactivity or cystic fibrosis, or cough including chronic cough, exacerbation of airway hyperreactivity, pulmonary fibrosis, pulmonary hypertension, inflammatory lung disease And diseases of acute or chronic respiratory infections.
  • ARDS acute respiratory distress syndrome
  • ALI acute lung injury
  • COPD chronic obstructive pulmonary disease
  • COPD chronic
  • lower urinary tract disease herein includes all lower urinary tract diseases characterized by irritable bladder with or without urinary, frequent, urinary, and nocturia.
  • the lower urinary tract disorders of the present invention are hypersensitive bladder such as overactive bladder, overactive detrusor, unstable bladder, detrusor hyperreflexia, sensory urgency, and symptoms of detrusor hyperactivity.
  • Lower urinary tract disease symptoms including obstructive urination as needed, and symptoms such as frequent urination and / or urination.
  • lower urinary tract diseases may include neurogenic bladder resulting from neurological damage, including but not limited to stroke, Parkinson's disease, diabetes, multiple sclerosis, peripheral neuropathy, or spinal cord injury. have. Lower urinary tract diseases may also include spastic bladder in patients with prostatitis, interstitial cystitis, prostatic hyperplasia, and spinal cord injury.
  • the lower urinary tract disease of the present invention may include: an overactive bladder, an unstable bladder, overactive detrusor muscle, detrusor instability, detrusor hyperreflexion, sensory urgency, urinary incontinence, urinary incontinence, stress incontinence, nerves Relfex urinary incontinence, slow urination, late dropping, dysuria and spastic bladder.
  • erectile dysfunction herein is a persistent inability to acquire or maintain an erection sufficient to perform sexual intercourse, which is closely associated with endothelial cell dysfunctions.
  • BK Ca channels of the invention Diseases, disorders or conditions associated with the modulation of BK Ca channels of the invention include pain disorders; Generalized anxiety disorder, anxiety panic, obsessive compulsive disorder, social phobia, performance anxiety, posttraumatic stress disorder, acute stress response, adjustment disorder, hypochondriacal disorder, Anxiety and anxiety-related conditions such as separation anxiety disorders, agoraphobia, and certain phobias; And simple partial seizures, complex partial seizures, secondary generalized seizures, absence seizures, myoclonic seizures, clonic seizures, tonic seizures, tonic seizures epilepsy such as generalized seizure, including but not limited to tonic clonicseizure and atonic seizure.
  • anxiety associated with certain phobias includes, but is not limited to, animals, insects, storms, driving, flying, height or leg crossings, closed or confined spaces, water, blood or wounds, as well as injection or surgical medical and dental processes It doesn't happen.
  • Pain disorders are also disorders with pain, for example acute pain such as musculoskeletal pain, post operative pain and surgical pain; Chronic inflammatory pain (eg, rheumatoid arthritis and osteoarthritis), neuropathic pain (eg, post herpetic neuralgia, trigeminal neuralgia and sympathetically maintained pain) and cancer Chronic pain such as associated pain and fibromyalgia; Pain associated with migraine headaches; Pain (both chronic and acute) and / or fever and / or infections in conditions such as rheumatic fever; Symptoms associated with other viral infections, such as influenza or the common cold; Lower back pain and neck pain; headache; toothache; Sprains and strains; Myositis; Neuralgia; Fasciitis (synovitis); Arthritis, including rheumatoid arthritis; Degenerative joint diseases, including osteoarthritis; Gout and ankylosing spondylitis; Tendinitis; Bursitis; Skin related conditions such as p
  • the pharmaceutical composition of the present invention includes a pharmaceutically acceptable carrier in addition to the active ingredient.
  • Pharmaceutically acceptable carriers included in the pharmaceutical compositions of the present invention are those commonly used in the preparation, such as lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, Calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, and the like It doesn't happen.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a humectant, a sweetener, a flavoring agent, an emulsifier, a suspending agent, a preservative, and the like.
  • a lubricant e.g., talc, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, a kaolin, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mann
  • Suitable dosages of the pharmaceutical compositions of the present invention may vary depending on factors such as the formulation method, mode of administration, age, weight, sex, morbidity, condition of food, time of administration, route of administration, rate of excretion and response to response of the patient. Can be. On the other hand, the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is preferably 0.001-1000 mg / kg (body weight) per day.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally or parenterally, and when administered parenterally, may be administered topically to the skin, intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, transdermal administration, and the like. .
  • compositions of the present invention may be administered orally, and solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, troches, and the like, which solid preparations contain at least one compound of the present invention.
  • solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, troches, and the like, which solid preparations contain at least one compound of the present invention.
  • excipients for example, starch, calcium carbonate, sucrose or lactose, gelatin and the like are mixed and prepared.
  • lubricants such as magnesium styrate talc are also used.
  • Liquid preparations for oral administration include suspensions, liquid solutions, emulsions or syrups, and include various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin. Can be.
  • Formulations for oral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilizers, suppositories, and the like.
  • non-aqueous solvent and the suspension solvent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like can be used.
  • base of the suppository witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerol, gelatin and the like can be used.
  • compositions of the present invention may be prepared in unit dosage form by formulating with a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to methods which can be easily carried out by those skilled in the art. Or may be prepared by incorporating into a multi-dose container.
  • Conventional formulations include, for example, oral (tablets, capsules, powders), oral cavity, sublingual, intrarectal, intravaginal, intranasal, topical or parenteral (intravenous, cavernous, intramuscular, subcutaneous). And dosage forms).
  • the compounds according to the invention may be in the form of tablets containing starch or lactose, in the form of capsules alone or in the form of excipients, or in the form of elixirs or suspensions containing chemicals which flavor or color. It can be administered orally, orally or sublingually.
  • Liquid formulations may be suspending agents (eg, methyl cellulose, semisynthetic glycerides such as witepsol or mixtures of apricot kernel oil with PEG-6 esters or PEG-8 with caprylic / capric glycerol).
  • Pharmaceutically acceptable additives such as glyceride mixtures such as mixtures of lides).
  • a sterile aqueous solution when injected parenterally, for example, intravenously, intracavernosally, intramuscularly, subcutaneously, and intratracheally, wherein the solution is to have isotonicity with blood. It may also contain other substances (eg salts or monosaccharides such as mannitol, glucose).
  • the flavanone derivatives of the present invention may be used in the form of pharmaceutically acceptable salts, and salts may be acid addition salts formed by pharmaceutically acceptable free acid.
  • Acid addition salts include inorganic acids such as hydrochloric acid, nitric acid, phosphoric acid, sulfuric acid, hydrobromic acid, hydroiodic acid, nitrous acid or phosphorous acid and aliphatic mono and dicarboxylates, phenyl-substituted alkanoates, hydroxy alkanoates and alkanes.
  • non-toxic organic acids such as dioate, aromatic acids, aliphatic and aromatic sulfonic acids, organic acids such as acetic acid, benzoic acid, citric acid, lactic acid, maleic acid, gluconic acid, methanesulfonic acid, 4-toluenesulfonic acid, tartaric acid and fumaric acid.
  • Such pharmaceutically nontoxic salts include sulfate, pyrosulfate, bisulfate, sulfite, bisulfite, nitrate, phosphate, monohydrogen phosphate, dihydrogen phosphate, metaphosphate, pyrophosphate chloride, bromide, and iodide.
  • the acid addition salt according to the present invention is produced by dissolving the flavanone derivative of the general formula 1 in an organic solvent, for example methanol, ethanol, acetone, methylene chloride, acetonitrile, and the like by adding an organic acid or an inorganic acid.
  • the precipitate may be prepared by filtration and drying, or may be prepared by distillation of the solvent and excess acid under reduced pressure, followed by drying or crystallization under an organic solvent.
  • Bases can also be used to make pharmaceutically acceptable metal salts.
  • Alkali metal or alkaline earth metal salts are obtained, for example, by dissolving a compound in an excess of alkali metal hydroxide or alkaline earth metal hydroxide solution, filtering the insoluble compound salt, and evaporating and drying the filtrate. At this time, it is pharmaceutically suitable to prepare sodium, potassium or calcium salt as the metal salt.
  • corresponding silver salts are obtained by reacting an alkali metal or alkaline earth metal salt with a suitable negative salt (eg, silver nitrate).
  • the present invention includes not only the thienopyrimidine derivative represented by Chemical Formula 1 and pharmaceutically acceptable salts thereof, but also possible solvates, hydrates, stereoisomers, and the like which can be prepared therefrom.
  • the present invention provides a composition for preventing or treating BK Ca channel activity-related diseases, diseases or conditions.
  • composition of the present invention it is possible to effectively activate the BK Ca channel, can be used for the prevention or treatment of various diseases arising from the BK Ca channel is inactive or deactivation.
  • FIG. 1 shows the results of screening of BK Ca channel activators using cell-based fluorescence assays.
  • a library of natural compounds was screened for the discovery of new BK Ca channel activators.
  • AD293 cells stably expressing overactive mutant BK Ca channels (G803D / N806K) were used for Tl + -based fluorescence (FluxORTM) analysis.
  • Representative traces of fluorescence changes are shown for the five different compounds as relative fluorescence units (RFUs).
  • Each compound was transferred to each test-well at 5 ⁇ M final concentration before the experiment and stimulus buffer was added at 120 seconds.
  • DMSO ⁇ , 1%, vehicle
  • Curarinone •
  • RFU values obtained at 240 seconds (B) and fold-increase (C) compared to DMSO are shown for 14 different compounds. Curranone is highlighted in gray.
  • 2 shows the concentration-dependent increase in fluorescence signal after treatment with curarinone.
  • AD293 cells stably expressing mutant BK channels were treated with different concentrations of curarinone.
  • 2A shows representative fluorescent traces. After baseline was obtained for 20 seconds, the Tl + -containing stimulation buffer was treated.
  • Cells were cultured in the presence of 1% DMSO ( ⁇ ) or other concentrations of curarinone ( ⁇ : 3 ⁇ , ⁇ : 5 ⁇ , ⁇ : 10 ⁇ , ⁇ : 30 ⁇ ) as vehicle. Cells were also incubated with 1 ⁇ M of paxilline, a BKCa channel blocker, with curarinone (5 ⁇ M) ( ⁇ ).
  • 2B shows the initial increase in RFU at different concentrations of curarinone. Error bars (SEM) are shown. Inset shows the chemical structure of curarinone.
  • Figure 3 shows the results of the structure-activity relationship of the flavonoid derivatives.
  • 3A shows the structure of the flavonoids used in the present invention.
  • 3B shows a representative trace of RFU of each compound treated with 10 ⁇ .
  • 3C shows the initial RFU increase in the presence of 10 ⁇ M of each compound.
  • FIG. 5 shows the effect of curarinone on the current-voltage and conductivity-voltage relationships of the macroscopic BK Ca channel current.
  • FIG. 5A shows a representative trace of BK Ca channel current at 3 ⁇ M [Ca2 +] i at different curarinone concentrations. Ion currents were induced with 100-ms voltage step-pulses. The current was recorded in 10 mV increments from -80 mV to 200 mV. The holding voltage was -100 mV.
  • 5B shows the effect of curarinone on the conductivity-voltage (GV) relationship. Conductivity was obtained from peak-tail current. The current was normalized by the maximum current of the vehicle trace.
  • 5C shows the effect of curarinone on half-maximum voltage (V1 / 2).
  • 6 shows the effect of curarinone on activation and deactivation of macroscopic BKCa currents.
  • 6A and 6B represent representative traces of activation (A) and inactivation (B) when treated with vehicle (black) or 20 ⁇ M of curinone (grey). The current traces obtained at 100 mV were compared.
  • FIG. 7 shows the effect of curarinone on a single BKCa channel.
  • Each graph in A of FIG. 7 shows a typical single-channel current recording of BKCa channels at different film voltages.
  • the concentration of intracellular Ca 2 + (pipette Ca 2 + concentration) was fixed at 10 ⁇ M.
  • the current was initially recorded in the absence of curarinone at different voltages and then in the presence of curarinone (5 ⁇ M). Curarinone solution was spread on the extracellular side.
  • Solid lines represent closed levels of single BK Ca channels and dashed lines represent open levels.
  • 7B shows the effect of curarinone on single-channel conductivity. Urine channel (urinary) current-amplitude was measured in a solution of 10 ⁇ M Ca 2 + cells.
  • FIG. 7C shows the effect of curarinone on the voltage-dependent open-pore (P 0 ) of a single BK Ca channel. Opening probability was measured using a trace as in B of FIG. 7.
  • FIG. 8 shows the effect of curarinone on ACh induced contraction in isolated rat bladder strips.
  • FIG. 8A shows representative contraction traces induced by ACh with and without preincubation of curarinone.
  • FIG. 8B shows the percent percent relaxation induced by curinone on ACh-induced contraction.
  • Each bar graph represents the mean ⁇ SEM of 6 experiments. Black represents control, white represents curarinone treatment experiment.
  • 9 shows the effect of curarinone on urination behavior in rats.
  • 9A shows the effect of curarinone on the frequency of urination of WKY and SHR after intraperitoneal injection of curarinone (0.5 and 5 mg / kg). The frequency of urination was observed for 3 hours.
  • 9B shows the total number of urinations. Each symbol or bar represents the mean ⁇ SEM of 5 (WKY) or 7 (SHR) animals (*** P ⁇ 0.001).
  • a chemical library containing 794 natural compounds was obtained from the Korea Research Institute of Chemical Technology (KRICT; www.chembank.org). Additional curarinone and derivatives thereof were purified from Kushen, the dried root of Sophora Flavescens (Jung et al. 2008). Curarinone and other compounds were dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) (Sigma-Aldrich) as stock solution. 4-Chloro-7- (trifluoromethyl) -10H-benzofuro [3,2-b] indole-1-carboxylic acid (CTBIC) was also dissolved in DMSO.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • CTBIC 4-Chloro-7- (trifluoromethyl) -10H-benzofuro [3,2-b] indole-1-carboxylic acid
  • Modified HEK293 cells expressing mutant BKCa channels (Lee et al., 2013) were supplemented with 10% fetal bovine serum and antibiotic 1 mg / ml Geneticin (Dibbe), Dulbecco's Modified Eagle's medium). The cells were incubated at 37 ° C., 5% CO 2 humidified conditions.
  • AD-293 cells stably expressing mutant BKCa channels (G803D / N806K) were used for cell-based analysis (Lee et al., 2013). Approximately 20000 cells / well were placed on a black-wall assay plate (Corning Incorporated) coated with poly-D-lysine (Sigma-Aldrich), a 96-well clear-bottom. Inoculation. FluxORTM calcium channel analysis (Invitrogen) was used for initial screening of compound libraries and for further analysis of candidate compounds. Experiments were performed according to the manufacturer's following instructions: Growth medium was replaced with 80 ⁇ l / well of loading buffer containing FluxORTM fluorescent dye and incubated for 1 hour in the absence of light.
  • Fluorescent signals were obtained at excitation wavelength of 485 nm and emission wavelength of 528 nm.
  • Membrane polarization occurred with a stimulus buffer containing thallium ions.
  • the fluorescence signal was measured in two states: every 10 seconds for 2 minutes before the stimulation buffer and then every 10 seconds for 3 minutes after the addition of the stimulation buffer for synergy H1 and every 2 seconds for 20 seconds before the stimulation buffer. Seconds and then every 2 seconds for 160 seconds after adding stimulation buffer for FlexStation 3.
  • the change in fluorescence signal is measured in relative fluorescence units (RFU or F / F0, where F0 is the minimum fluorescence value of each fluorescence trace).
  • REU relative fluorescence units
  • F0 the minimum fluorescence value of each fluorescence trace.
  • Xenopus laevis oocytes heterologously expressing BKCa channel ⁇ -subunit (Slo1) were used for electrophysiological recordings. Subcloning and functional expression of rat BKCa channel ⁇ -subunits using oocyte expression vector pNBC1.0 has been previously reported (Ha et al., 2000). Sequence information of Slo1 used in the present invention is disclosed in GenBank as expression number AF135265. Plasmid DNA was linearized using NotI restriction enzymes and complementary RNA (cRNA) from the linear form of DNA using the mMessage Machine (Ambion) of nucleoside triphosphate and cap analog m7G (5 ') ppp (5') G. Synthesis was carried out using T7 RNA polymerase in the presence.
  • cRNA complementary RNA
  • Oocytes from stages V to VI were surgically removed from ovarian lobes of anesthetized X. laevis (Xenopus I, Dexter, MI).
  • I removed the cell Ca 2 + - and moved to the pre-Oocyte Ringer (oocyte Ringer's) (OR) culture medium (86 mM NaCl, 1.5 mM KCl , 2 mM MgCl2 and 10 mM HEPES, pH 7.6).
  • I 3 mg / ml collagen degradation enzyme Ca 2 + containing (Worthington Biochemicals) a cell-by incubation for 1 hour 30 minutes to 2 hours in a pre-OR medium I begeo the follicle cells (follicular cell) of the cell layer It was.
  • Channel current was amplified using an Axopatch 200B amplifier (Axon Instruments), low-pass filtered at 1 kHz using a four-pole Bessel filter, Digidata 1200A ( Axon Instruments) was used to digitize at a 10 point / ms rate.
  • a single BKCa channel was readily activated by membrane translocation simply delivered at 100 mV.
  • the transition between closed and open states was determined by setting the titer at half unitary current amplitude.
  • the average amplitude of the channel current was obtained from the histogram fitted with Gaussian distributions and the average current is plotted against the transmembrane voltage. Slope-conductivity values were obtained from linear regression.
  • the macroscopic current of the expressed BKCa channel was activated to a membrane potential, usually in the range of -80 to 200 mV, in 10 mV increments by voltage-clamp pulses delivered from a holding petential of -100 mV.
  • the dwell-time of the open and closed events recorded for a single BKCa channel was analyzed using the linear histogram method.
  • the dwell-time distribution was fitted to a single index using the simplex-least-squares fitting methods (Clampfit, Axon Instruments).
  • the peak in the dwell-time distribution was located at the time-constant of the exponential component.
  • the solutions for single and macroscopic channel recordings contained gluconate as a nenpermeant anion.
  • Intracellular and extracellular solutions contained the following components unless otherwise specified: 120 mM calcium gluconate, 10 mM MHEPES, 4 mM KCl, and 5 mM MEGTA, pH 7.2.
  • the total Ca + 2 an appropriate amount of cells to be added to the solution is a program MaxChelator; using (Patton et al, 2004 http://maxchelator.stanford.edu/. ) Calculated.
  • the same set of intracellular solutions was used throughout the experiments.
  • the separated strip was clipped between the static mount and the force-displacement transducer and 10 ml of Krebs solution ((mM): 118.4 NaCl, 4.7 KCl, 1.2 KH 2 PO 4 , 1.2 MgSO It was suspended in a temperature-controlled (37 ° C.) organ bath containing 4 , 25.0 NaHCO 3 , 2.5 CaCl 2 , and 12.2 glucose; pH 7.35-7.40). The long term bath was continuously bubbled using a mixture of 95% O 2 and 5% CO 2 . Each UBSM strip was stretched to an optimal isometric tension of 1.0 g and equilibrated for 60 minutes.
  • curarinone is a natural flavanone compound
  • BK Ca channels were activated by a series of voltage pulses, and macroscopic currents were recorded under increased concentrations of activated extracellular curarinone. It is evident that as the curarinon concentration increases, the channel current is activated at lower voltages and deactivated more slowly (see Figure 5A).
  • FIG. 3B the voltage-dependent activation of the macroscopic BKCa channel current is shown as the conductivity-voltage (GV) relationship. Curarinon gradually shifts the GV curve to the left and increases the maximum conductivity (Gmax) in a dose-dependent manner. Curarinon-dependent migration in the GV relationship was further quantified and shown in FIG. 5C.
  • the inactivation of the BKCa channel was shown to be greatly affected by the flavanone derivative of the present invention. Therefore, the effect of curarinone on the opening and closing movement of BKCa channel was investigated.
  • FIG. 6 the activation (or opening) and inactivation (or closure) procedures of the BKCa channel were analyzed. While the current level increased in the presence of 20 ⁇ M, the activation rate did not vary considerably (see FIG. 6A). At four increased concentrations of curarinone (0, 5, 10, 20 ⁇ M) the activation time-constant ( ⁇ activation) was not significantly increased (see Figure 6C). On the other hand, the deactivation rate was dramatically reduced by curarinone.
  • curarinone is an effective candidate compound having bladder relaxation activity by enhancing the detrusor muscle BKCa channel and improving OAB syndrome.
  • McManus OB Helms LM, Pallanck L, Ganetzky B, Swanson R, and Leonard RJ (1995) Functional role of the beta subunit of high conductance calcium-activated potassium channels. Neuron 14, 645-650.
  • Flavonoid naringenin a potential immunomodulator for Chlamydia trachomatis inflammation. Mediators Inflamm. 2013: 102457.
  • the present invention relates to novel compounds capable of activating BKCa channels.
  • the composition of the present invention it is possible to effectively activate the BKCa channel, it can be used for the prevention or treatment of various diseases caused by BKCa channel inactivation or deactivation.

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Abstract

본 발명은 본 발명은 BKCa 채널을 활성화 시킬 수 있는 신규 화합물들에 관한 것이다. 본 발명의 조성물을 이용하면, BKCa 채널을 효과적으로 활성화 시킬 수 있고, BKCa 채널 비 활성화 또는 활성 저하에 따라 발생하는 다양한 질병의 예방 또는 치료에 이용할 수 있다.

Description

BKCA 채널 활성화용 조성물
본 발명은 BKCa 채널을 활성화 시킬 수 있는 신규 화합물들에 관한 것이다.
큰 전도도 Ca2 +-활동성 K+채널(BKCa 채널)은 막 분극 및/또는 세포내 Ca2+에 의해 활성화 되고, K+ 이온을 세포 막을 가로질러 통과시킨다(Cui et al. 2009; Yang et al. 2015). BKCa 채널은 다양한 타입의 흥분성 세포(excitable cell) 및 비흥분성 세포(nonexcitable cell)에서 널리 발현되며, 신경전달물질 방출(Raffaelli et al. 2006), 평활근의 수축(Brenner et al. 2000; Herrera et al. 2000), 및 주기성 행동 리듬(Meredith et al. 2006)을 포함하는 몇몇 중요한 생리학적 과정의 조절에 관계된다. BKCa 채널의 기능장애는 간질(epilepsy)(Lorenz et al. 2007; Du et al. 2005), 발기 부전(erectile dysfunction)(Werner et al. 2005) 및 과민성 방광(overactive bladder; OAB)(Meredith et al. 2004)과 같은 몇몇 질병의 원인으로 알려져 있다.
OAB는 일반적으로 증가된 낮 또는 밤 시간 빈도를 갖는 요의절박(urinary urgency)의 존재에 의해 특징지워진다(Cerruto et al. 2012). OAB는 약 17%의 서방 세계 인구, 남성 및 여성 모두에 영향을 미치며, 연령과 함께 증가한다(Coyne et al. 2013). 항 무스카린제, 혼합-작용 약물(mixed-action drug) 및 β-아드레날린 수용체 작용제를 포함하는, 방광 내의 다른 리셉터를 타겟팅하는 OAB에 대한 약물들의 몇몇 클래스가 있다(Abraham et al. 2015). 비록 OAB 치료의 중심이 항무스카린 약리학이지만, 부작용 및 감소하는 효능이 장기간 순응 문제(long-term compliance problem)의 원인이 된다(Jayarajan et al. 2013). 그러므로 직접적으로 방광 평활근(urinary bladder smooth muscle; UBSM)를 타겟팅하고 부작용이 적은 OAB에 대한 신규 치료학적 처치가 크게 요구된다. OAB에 대하여 부상중인 치료학적 타겟 중에서, 방광 K+ 채널은 전임상 실험에서 큰 가능성을 보였다. 그러나 지금까지는 임상적으로 연구된 K+ 채널의 활성자 또는 개시자는 실망스러운 결과들은 얻었다(Andersson et al. 2013).
BKCa 채널은 가장 생리학적으로 중요한 K+ 채널 중의 하나이고, 건강 및 질병에서의 UBSM 기능을 조절한다(Petkov et al. 2014). BKCa 채널은 UBSM에서 고 발현된다(Hristov et al. 2011). 막 분극 및 세포 내 Ca2+ 모두에 의해 독특하게 활성화된 것에 의해, BKCa 채널 활성화는 안정막 전위의 유지 및 UBSM 상동성 수축(phasic contraction)을 촉발하는 자발적 활동 전위의 최초 재분극 단계의 기저가 된다. 더욱이 일련의 연구들은 BKCa 채널이 콜린성 및 퓨린성-유도된 수축성(contractility) 감소에 대해 중요한 역할을 한다는 것을 보고하였고, BKCa 채널 발현 또는 기능의 변경이 OAB 발생에 기여할 수 있다는 것을 보여주었다(Werner ME et al 2007). 그러므로, 내인성 BKCa 채널의 화학적 활성화에 의한 UBSM 완화 유도가 가능하다. 사실 BKCa 채널의 몇몇 활성자 화합물이 그들의 방광 이완 효과에 대하여 보고되어 왔고(dela Pena et al. 2009; Layne et al. 2010; Ahn et al. 2011;La Fuente et al;Park et al. 2014), 더욱이 OAB 신드롬에 대한 치료 타겟으로서 그 가능성이 제시되었다. 그러나 BKCa 채널 활성자의 효능 및 특이도(specificity)는 그들의 임상적 이용에 대한 문제로서 남아 있었다(Nardi et al. 2006; Bentzen et al. 2014). 그러므로 높은 특이도를 갖고 더 나은 효능을 갖는 신규한 BKCa 채널 활성자를 발굴할 필요가 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 천연 화합물 라이브러리를 이용하여 BKCa 채널 활성화 효능이 있는 신규 화합물을 발굴하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 유사한 구조를 갖는 플라바논 유도체 중에서도 특정의 치환기를 갖는 화합물들이 크게 증가된 BKCa 채널 활성화능을 갖는 것을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 BKCa 채널 활성-관련 질환, 질병 또는 상태(diseases, disorders or conditions) 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 하기 일반식 1로 표시되는 플라바논 유도체 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 BKCa 채널 활성화용 약제학적 조성물을 제공한다:
일반식 1
Figure PCTKR2017002291-appb-I000001
상기 일반식 1에 있어서, R1은 수소 및 직쇄 또는 분지쇄형의 C1-C15 알킬 또는 알케닐로 구성된 군으로부터 선택되는 소수성 치환기이고;
상기 R1이 C6-C15의 알킬 또는 알케닐인 경우 R2는 C1-C4의 알콕시이며, 상기 R1이 수소 또는 C1-C5 알킬 또는 알케닐인 경우 R2는 히드록시이고;
R3, R4 및 R5 는 각각 독립적으로 수소 또는 히드록시이며, 단 R3, R4 및 R5 중 적어도 하나는 히드록시이다.
본 발명자들은 천연 화합물 라이브러리를 이용하여 BKCa 채널 활성화 효능이 있는 신규 화합물을 발굴하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 유사한 구조를 갖는 플라바논 유도체 중에서도 특정의 치환기를 갖는 화합물들이 크게 증가된 BKCa 채널 활성화능을 갖는 것을 규명하였다.
본 발명자들은 BKCa 채널의 신규한 천연 활성자를 새롭게 개발된 세포-기반 분석을 이용하여 탐색하였다. 본 분석에서 이용된 돌연변이 BKCa 채널이 매우 크게 향상된 Ca2 + 민감도를 나타내므로, 채널 활성화를 위해 추가적으로 세포내 Ca2 +를 증가시키는 것은 필요치 않았다(Lee et al. 2013). 그러므로, 본 발명자들은 전압 활동성 K+ 채널에 대해 상업적으로 이용가능한 탈륨(Tl+)-기반 형광 분석을 이용할 수 있었다. 천연 화합물의 라이브러리를 스크리닝함으로써, 본 발명자들은 플라바논 골격을 갖는 BKCa 채널 활성자인 화합물들을 발굴할 수 있었다.
본 명세서 상의 용어 "알킬"은 직쇄 또는 분지쇄형의 포화 탄화수소기를 의미한다. C1-C15의 알킬은 탄소수 1 내지 15의 알킬 유니트를 가지는 알킬기를 의미한다. 본 명세서 상의 용어 "알케닐"은 탄소-탄소 이중결합을 하나 이상 포함하는 직쇄 또는 분지쇄형의 탄화수소기를 의미한다. C1-C15의 알케닐은 탄소수 1 내지 15의 알케닐 유니트를 가지는 알케닐기를 의미한다.
본 발명의 R1은 상술한 바와 같이 수소 및 직쇄 또는 분지쇄형의 C1-C15 알킬 또는 알케닐로 구성된 군으로부터 선택되는 소수성 치환기로서, 히드록시기와 같이 친수성을 부여하는 치환기로 치환되어 있지 않은 상태의 것이다. 본 발명자들은 구체적인 일례로서, 쿠라리논(kurarinone) 화합물과 쿠라리논의 라반듀릴 치환기가 히드록시기(-OH)에 의해 치환되어 있는 외에 화학 구조식이 동일한 쿠라리놀(kurarinol)(참조: 도 3) 화합물의 BKCa 채널 활성의 비교를 통해 이를 확인하였다.
또한 상술한 바와 같이 본 발명의 R1이 C6-C15의 알킬 또는 알케닐인 경우 R2는 C1-C4의 알콕시이며, 본 발명의 R1이 수소 또는 C1-C5 알킬 또는 알케닐인 경우 R2는 히드록시이다. 본 명세서에서 용어 "알콕시"는 알킬기와 단일결합에 의해 결합된 산소 치환기를 의미하며, 히드록시기의 수소가 알킬기로 치환된 형태를 의미한다. C1-C4의 알콕시는 탄소수 1 내지 4의 알킬기가 히드록시기의 수소를 치환하여 산소에 결합되어 있는 알콕시를 의미한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 본 발명의 R1이 C6-C15의 알킬 또는 알케닐인 경우 R2는 메톡시이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 R1은 수소, 3-메틸-2-부텐-1-일(3-methyl-2-buten-1-yl) 또는 2-이소프로페닐-5-메틸-4-헥센-1-일(2-isopropenyl-5-methyl-4-hexen-1-yl)이다. 본 발명의 3-메틸-2-부텐-1-일 치환기는 프레닐(prenyl) 치환기로도 명명되며, 2-이소프로페닐-5-메틸-4-헥센-1-일 치환기는 라반듀릴(lavandulyl) 치환기로도 명명될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 본 발명의 R1이 수소인 경우, 상기 R2는 히드록시이다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 본 발명의 R1이 3-메틸-2-부텐-1-일인 경우, R2는 히드록시이다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 본 발명의 R1이 2-이소프로페닐-5-메틸-4-헥센-1-일인 경우, R2는 메톡시이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 R4는 히드록시이고, 상기 R3 및 R5는 각각 독립적으로 수소(-H) 또는 히드록시(-OH)이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 R3 및 R5 중 적어도 어느 하나 이상은 수소이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 일반식 1로 표시되는 플라바논 유도체는 쿠라리논(kurarinone), 나린제닌(naringenin) 및 리치아논 G(leachianone G)(참조: 도 3)로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 조성물은 BKCa 채널의 전도도-전압(G-V) 상관관계를 음적 전압(negative voltage) 방향으로 이동시킨다. 전도도-전압 상관관계를 음적 전압 방향으로 이동시킨다는 것은 채널의 개방 형태를 안정화 시킴으로써 BKCa 채널을 활성화 시킨다는 것을 나타낸다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 조성물을 포함하는 BKCa 채널 활성 저하-관련 상태, 질환 또는 질병의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 명세서 상의 용어 "BKCa 채널 활성 저하-관련 상태, 질환 또는 질병"이란 BKCa 채널의 활성이 정상 수준에 비해 저하되어 있거나, 실질적으로 불활성화되어 있고, 이에 따라 BKCa 채널 활성에 의해 제어되는 채널 신경세포의 흥분도(neuronal excitability), 신경전달물질 분비, 평활근세포의 수축 및 유모세포의 주파수 조정(frequency tuning) 등의 중요한 생리학적 기능이 저하된 상태, 이에 따라 발생되는 질환 또는 질병을 의미한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 본 발명의 BKCa 채널 활성 저하-관련 상태, 질환 또는 질병은 심혈관질환(cardiovascular disease), 폐쇄 또는 염증 기도 질환, 하부 요로 질환(lower urinary tract disorders), 발기부전, 불안 및 불안-관련 상태, 간질 또는 동통을 포함한다.
막 탈분극(membrane depolarization)과 세포내 Ca2 + 농도의 증가는 BK 또는 Maxi-K 채널로 알려진 큰 전도성을 가진 칼슘-활성화된 포타슘 채널(large-conductance calcium-activated potassium(BKCa) channels)을 활성화시킨다(Salkoff, et al., 2006; Cui, et al., 2009). 상술한 채널들은 신경세포의 흥분도(neuronal excitability), 신경전달물질 분비, 평활근세포의 수축 및 유모세포의 주파수 조정(frequency tuning)에서 중요한 생리학적 기능들을 수행함이 알려져 있다(Brenner, et al., 2000; Nelson, et al., 1995; Fettiplace and Fuchs, 1999). BKCa 채널들은 동공-형성(pore-forming) α-서브유니트와 조절성 β-서브유니트로 구성된다. BKCa 채널의 α-서브유니트는 7개의 막통과 도메인들로 구성되며(Catterall, 1995) C-말단은 K+ 전도성(K+ conductance domain; RCK) 도메인을 조절하는 2개의 조절인자를 포함하는 데, 이들은 세포내 Ca2+ 농도에 반응하는 게이트 링(gating ring)을 형성한다(Jiang, et al., 2001). BKCa 채널은 고혈압, 관상 동맥 경련(coronary artery spasm), 요실금(urinary incontinence) 및 많은 신경학적 질환들과 밀접한 관련성을 갖는 치료 타겟임이 알려져 있다(Ghatta, et al., 2006). BKCa 채널이 결핍된 마우스는 요실금(incontinence), 과민성 방광(bladder overactivity) 및 발기 부전(erectile dysfunction) 같은 증상들을 나타내는 것이 알려져 있으며(Meredith, et al., 2004; Werner, et al., 2005)이를 회복시키거나 활성화 시킴으로서 상기 질환들을 예방 또는 치료할 수 있음이 알려져 있다. 또한, BKCa 채널의 기능 장애는 소뇌성 운동 실조증(cerebellar ataxia) 및 발작성 이상운동질환(paroxysmal movement disorders)을 초래할 수 있다는 것이 알려져 있으며, 상기 질환 들의 치료학적 타겟이 될 수 있다(Lee and Cui, 2010). BKCa 채널의 활성화는 K+ 유출을 증가시키고 과다분극을 야기함으로써 세포를 안정화시킨다. 따라서, BKCa 채널의 활성을 개방 또는 강화시키는 물질은 세포내 흥분성(excitability)을 감소시키고 평활근세포들의 긴장을 완화시키는 치료학적 이점들을 부여할 수 있다.
본 명세서의 용어 "심혈관질환(cardiovascular disease)"은 심장, 심장 판막, 혈액 및 몸의 혈관구조(vasculature)에 영향을 미치는 수많은 상태를 분류하는데 이용되는 일반적인 용어로, 심장 또는 혈관에 영향을 미치는 질병들을 포함한다.
본 발명의 심혈관질환은 죽상경화증, 죽상혈전증, 아테롬성 동맥경화증, 관상동맥질환, 허혈, 재관류 손상, 고혈압, 재협착증, 동맥 염증, 심근 허혈 또는 허혈성 심장 질환, 안정 및 불안정 협심증, 뇌졸중, 울혈성 심부전, 대동맥 협착증 또는 대동맥류 같은 대동맥질환 및 말초혈관질환을 포함한다. 본 명세서의 용어 "말초혈관질환(peripheral vascular disease, PVD)"은 종종 사지 혈관의 협착시에 직면하는 심장 및 중추신경계 외측 혈관의 질환을 의미하며, 예를 들어 혈관에는 결함이 없지만 감기, 스트레스 또는 흡연과 같은 자극으로부터 발생하는 기능적 질환, 및 죽상경화증 병변, 국소 염증 또는 외상성 손상과 같은 혈관계의 구조적 결함으로부터 발생되는 기질적 질환으로 구분될 수 있다.
본 발명의 폐쇄 또는 염증 기도 질환은 기도 과다반응, 진폐증, 알루미늄증, 탄분증, 석면증, 석폐증, 첩모탈락증(ptilosis), 철침착증(siderosis), 규폐증, 연초 중독증, 면폐증(byssinosis), 사르코이드증(sarcoidosis), 베릴륨증, 폐기종, 급성 호흡 곤란 증후군(acute respiratory distress syndrome; ARDS), 급성 폐 손상(acute lung injury; ALI), 급성 또는 만성 감염성 폐질환, 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease; COPD), 기관지염, 만성 기관지염, 색색거리는(wheezy) 기관지염, 기도 과다반응 또는 낭섬유증 악화, 또는 만성 기침을 포함하는 기침, 기도 과다반응의 악화, 폐 섬유증, 폐 고혈압, 염증성 폐질환, 및 급성 또는 만성 호흡 감염 질환을 포함한다.
본 명세서의 용어 "하부 요로 질환"은 실뇨, 빈뇨, 급뇨, 및 야간뇨를 갖거나 또는 갖지 않는 과민성 방광에 의해서 특징되는 모든 하부 요로 질환을 포함한다. 따라서, 본 발명의 하부 요로 질환은 과민성 방광(overactive bladder), 과민성 배뇨근, 불안정성 방광(unstable bladder), 배뇨근과반사(detrusor hyperreflexia), 감각성 급뇨(sensory urgency) 및 배뇨근 과활동성의 증상 같은 과민성 방광(urinary bladder), 요실금 또는 긴박성 요실금(urge urinary incontinence), 스트레스성 요실금(urinary stress incontinence), 느린 배뇨, 배뇨 말기 적하(dribbling), 무뇨증 및/또는 허용 가능한 비율로 배뇨를 위한 압력을 가해야하는 필요와 같은 폐쇄성 배뇨 현상을 포함하는 하부 요로 질환 증상, 그리고 빈뇨 및/또는 급뇨와 같은 증상을 포함한다. 또한, 하부 요로 질환은 뇌졸증, 파킨슨 병(Parkinson's disease), 당뇨병, 다발성 경화증, 말초 신경병증, 또는 척수 손상을 포함하나, 이에 한정되지 않는 신경학적 손상의 결과로 발생되는 신경인성 방광을 포함할 수 있다. 또한, 하부 요로 질환은 전립선염, 간질성 방광염, 전립선 비대증, 및 척수 손상 환자의 경련성 방광(spastic bladder)을 포함할 수 있다. 본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 하부 요로 질환은 과민성 방광, 불안정성 방광, 과민성 배뇨근, 배뇨근불안정(detrusor instability), 배뇨근과반사, 감각성 급뇨, 요실금, 긴박성 요실금, 스트레스성 요실금, 신경인성 요실금(relfex urinary incontinence), 느린 배뇨, 배뇨 말기 적하, 배뇨 장애(dysuria) 및 경련성 방광(spastic bladder)을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서의 용어 "발기 부전(erectile dysfunction)"은 성교 수행에 충분한 발기를 획득하거나 유지하는데 있어서 지속적인 불능 상태로, 이는 내피세포의 기능 이상(endothelial cell dysfunctions)과 밀접하게 연관되어 있다.
본 발명의 BKCa 채널의 조절과 관련된 질환, 장애 또는 상태는 통증 장애(pain disorders); 범불안장애, 불안공황, 강박장애, 사회 공포증, 수행 불안(performance anxiety), 외상 후 스트레스 장애(posttraumatic stress disorder), 급성 스트레스 반응, 적응 장애(adjustment disorder), 건강염려성장애(hypochondriacal disorder), 분리 불안 장애, 광장공포증 및 특정 공포증(phobia) 같은 불안 및 불안-관련 상태; 및 단순 부분 발작, 복합체 부분 발작, 이차 전신 발작(secondary generalised seizure), 결신 발작(absence seizure), 근간대 발작(myoclonic seizure), 간대 발작(clonic seizure), 강직 발작(tonic seizure), 강직 간대 발작(tonic clonicseizure) 및 무동성 발작(atonic seizure)을 포함하는 전신 발작(generalised seizure) 같은 간질을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 특정 공포증과 관련된 불안은 동물, 곤충, 폭풍우, 운전, 비행, 높이 또는 다리 건너기, 폐쇄 또는 좁은 공간, 물, 혈액 또는 상처뿐만 아니라, 주사 또는 외과적인 의료 및 치과 과정을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 통증장애는 고통을 동반하는 장애로, 예를 들어 골격통증(musculoskeletal pain), 수술 후 통증(post operative pain) 및 수술 통증(surgical pain)과 같은 급성 통증; 만성 염증성 통증(예컨대, 류마티스 관절염 및 골관절염), 신경병증성 통증(예컨대, 대상포진 후 신경통(post herpetic neuralgia), 삼차신경병증(trigeminal neuralgia) 및 교감신경 유지 통증(sympathetically maintained pain)) 및 암과 연관된 통증 및 섬유근육통증(fibromyalgia)과 같은 만성 통증; 편두통과 연관된 통증; (만성 및 급성 모두) 통증, 및/또는 류머트즘열(rheumatic fever)과 같은 상태의 열 및/또는 감염; 인플루엔자(influenza) 또는 일반적인 감기와 같은 다른 바이러스 감염과 연관된 증상; 하부요통 및 경부통; 두통; 치통; 염좌(sprains) 및 좌성(strains); 근염(myositis); 신경통(neuralgia); 건막염(synovitis); 류마티스 관절염을 포함하는 관절염 ; 골관절염을 포함하는 퇴행성 관절증 (degenerative joint diseases) ; 통풍(gout) 및 강직성 척추염(ankylosing spondylitis); 건염(tendinitis); 윤활낭염(bursitis); 건선(psoriasis), 습진(eczema), 화상 및 피부염(dermatitis)과 같은 피부 관련 상태; 운동 손상(sports injuries); 및 수술 및 치과 과정으로 야기되는 손상과 같은 손상들을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약제학적 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.001-1000 mg/kg(체중)이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구로 투여되는 경우, 피부에 국소적으로 도포, 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 투여할 수 있고, 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 트로키제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 본 발명의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여 를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용 액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제 인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제 제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁 용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝 솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 통상적인 제형이라 함은 예를 들면 경구(정제, 캡슐제, 분말제), 구강 내, 혀 밑, 직장 내, 질 내, 비강 내, 국소 또는 비경구(정맥 내, 해면체 내, 근육 내, 피하 및 관 내를 포함) 투여 제형을 일컫는다. 예를 들면, 본 발명에 따른 화합물은 전분 또는 락토오즈를 함유하는 정제 형태로, 또는 단독 또는 부형제를 함유하는 캡슐 형태로, 또는 맛을 내거나 색을 띄게 하는 화학 약품을 함유하는 엘릭시르 또는 현탁제 형태로 경구, 구강 내 또는 혀 밑 투여될 수 있다. 액체 제제는 현탁제(예를 들면, 메틸셀룰로오즈, 위텝솔(witepsol)과 같은 반합성 글리세라이드 또는 행인유(apricot kernel oil)와 PEG-6 에스테르의 혼합물 또는 PEG-8과 카프릴릭/카프릭 글리세라이드의 혼합물과 같은 글리세라이드 혼합물)와 같은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제와 함께 제조된다. 또한, 비경구적으로 예를 들면, 정맥 내, 해면체 내, 근육 내, 피하 및 관내를 통하여 주사되는 경우 무균의 수용액 형태로서 사용하는 것이 가장 바람직하며, 이때 상기 용액은 혈액과의 등장성을 갖기 위하여 다른 물질들(예를 들면 염(salt) 또는 만니톨, 글루코오스와 같은 단당류)를 함유할 수도 있다.
본 발명의 플라바논 유도체는 약제학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염을 사용할 수 있다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산 또는 아인산과 같은 무기산류와 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류와 같은 무독성 유기산, 아세트산, 안식향산, 구연산, 젖산, 말레인산, 글루콘산, 메탄설폰산, 4-톨루엔설폰산, 주석산, 푸마르산과 같은 유기산으로부터 얻는다. 이러한 약학적으로 무독한 염류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, β-하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트 또는 만델레이트를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들면, 일반식 1의 플라바논 유도체를 유기용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤, 메틸렌클로라이드, 아세토니트릴 등에 녹이고 유기산 또는 무기산을 가하여 생성된 침전물을 여과, 건조하여 제조되거나, 용매와 과량의 산을 감압 증류한 후 건조하거나 유기용매 하에서 결정화시켜셔 제조할 수 있다.
또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속 염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다. 또한, 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 음염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다. 또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 티에노피리미딘 유도체 및 이의 약학적으로 허용되는 염뿐만 아니라, 이로부터 제조될 수 있는 가능한 용매화물, 수화물, 입체이성질체 등을 모두 포함한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 BKCa 채널 활성-관련 질환, 질병 또는 상태(diseases, disorders or conditions) 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
(b) 본 발명의 조성물을 이용하면, BKCa 채널을 효과적으로 활성화 시킬 수 있고, BKCa 채널 비 활성화 또는 활성 저하에 따라 발생하는 다양한 질병의 예방 또는 치료에 이용할 수 있다.
도 1은 세포-기반 형광 분석을 이용한 BKCa 채널 활성자의 스크리닝 결과를 나타낸다. 신규 BKCa 채널 활성자 발굴을 위해 천연 화합물들의 라이브러리를 스크리닝하였다. 과활성 돌연변이 BKCa 채널(G803D/N806K)을 안정적으로 발현하는 AD293 세포를 Tl+-기반 형광(FluxORTM)분석에 이용하였다. 형광 변화의 대표 트레이스를 상대적 형광 유닛(relative fluorescence unit, RFU)으로서 5가지 다른 화합물들에 대해 나타내었다. 각각의 화합물을 실험 전에 5 μM 최종 농도로 각각의 테스트-웰로 운반하였고, 자극 버퍼(stimulus buffer)를 120초에 추가하였다. DMSO(■, 1%, 비히클) 및 쿠라리논(●)을 채워진 기호로서 강조하였다. 240초에서 얻은 RFU 값(B) 및 DMSO와 비교한 증가배율(fold-increase) (C)를 14가지 다른 화합물들에 대해 나타내었다. 쿠라리논은 회색으로 강조하였다.
도 2는 쿠라리논의 처리 후의 형광 신호의 농도-의존 증가를 나타낸다. 안정적으로 돌연변이 BK 채널을 발현하는 AD293 세포를 다른 농도의 쿠라리논으로 처리하였다. 도 2의 A는 대표 형광 트레이스를 나타낸다. 20초 동안 기준 선을 얻은 후에, Tl+-함유 자극 버퍼를 처리하였다. 세포들을 비히클로서의 1% DMSO(□) 또는 다른 농도의 쿠라리논(■: 3 μM, ●: 5 μM, ▲: 10 μM, ▼: 30 μM)의 존재하에서 배양시켰다. 세포들을 또한 쿠라리논(5 μM)과 함께 BKCa 채널 차단제인 팍실린(paxilline) 1 μM 로 배양시켰다(◆). 도 2의 B는 다른 농도의 쿠라리논에서의 최초 RFU 증가를 나타낸다. 에러 바(S.E.M.)를 나타내었다. 삽입도는 쿠라리논의 화학구조를 나타낸다.
도 3은 플라보노이드 유도체들의 구조-활성 관계 연구결과를 나타낸다. 도 3의 A는 본 발명에서 이용된 플라보노이드의 구조를 나타낸다. 도 3의 B는 10 μM로 처리한 각 화합물들의 RFU의 대표 트레이스를 나타낸다. 도 3의 C는 각 화합물 10 μM의 존재 하에서의 최초 RFU 증가를 나타낸다.
도 4는 거시적 BKCa 채널 전류의 쿠라리논에 의한 가역적 강화를 나타낸다. BKCa 채널에 의해 유발된 테일 전류의 대표 다이어리-플랏을 연속 기록으로서 나타내었다. 이온 전류를 -100 mV의 보유(holding) 전압으로부터 100 mV의 50-ms 스텝-펄스로 매초마다 기록하였다. 전류를 특정의 포인트(100 mV 전압 펄스 후 0.8 ms)에서 얻었다. 각각의 대표 전류 트레이스(a-d)는 화살표로 표시한 포인트에서의 전류를 나타낸다.
도 5는 거시적 BKCa 채널 전류의 전류-전압 및 전도도-전압 관계 상의 쿠라리논의 효과를 나타낸다. 도 5의 A는 다른 쿠라리논 농도에서의 3 μM[Ca2+]i에서의 BKCa 채널 전류의 대표 트레이스를 나타낸다. 이온 전류를 100-ms 전압 스텝-펄스로 유발시켰다. 전류를 -80 mV에서 200 mV까지 10 mV 증분으로 기록하였다. 보유 전압은 -100 mV였다. 도 5의 B는 전도도-전압(G-V) 관계 상의 쿠라리논의 효과를 나타낸다. 전도도는 피크-테일 전류로부터 얻었다. 전류는 비히클 트레이스의 최대 전류에 의해 정규화시켰다. 각각의 기호들은 다른 쿠라리논 농도에서의 전도도를 나타낸다: 비히클(■, n=12), 3 μM(●, n=8), 5 μM(▲, n=12), 10 μM(▼, n=8) 및 20 μM(◆, n=4). 도 5의 C는 절반-최대 전압(V1/2) 상의 쿠라리논의 효과를 나타낸다. 그래프 상의 각각의 기호들은 V1/2의 S.E.M 및 평균을 나타낸다. 결과값들은 모든 독립 데이터 세트를 볼츠만 함수(Boltzmann function)(P0=[1/(1+exp{(V1/2-V)/k}])를 이용하여 피팅함으로써 얻었다.
도 6은 거시적 BKCa 전류의 활성화 및 비활성화 상의 쿠라리논의 효과를 나타낸다. 도 6의 A 및 B는 비히클(검정) 또는 20 μM의 쿠라리논(회색)으로 처리하였을 때 활성화(A) 및 비활성화(B)의 대표 트레이스를 나타낸다. 100 mV에서 얻은 전류 트레이스를 비교하였다. 도 6의 C 및 D는 다른 농도의 쿠라리논에서의 활성화 및 비활성화 시간-상수 값(τ)을 나타낸다. 기호들은 비히클 (□, n=12), 3 μM(■, n=8), 5 μM (●, n=12), 10 μM (▲, n=8) 및 20 μM (◆, n=4)을 나타낸다. 시간-상수 값은 Clampfit 프로그램을 이용한 지수 표준 함수(y(t)=A1exp(-t/τ1)+C)를 이용하여 모든 독립 데이터 세트를 피팅하는 것으로부터 얻었다.
도 7은 단일 BKCa 채널 상의 쿠라리논의 효과를 나타낸다. 도 7의 A의 각각의 그래프는 다른 막 전압에서의 BKCa 채널의 전형적인 단일-채널 전류 기록을 나타낸다. 세포 내부 Ca2 +의 농도(피펫 Ca2 + 농도)를 10 μM로 고정시켰다. 전류를 다른 전압에서 쿠라리논의 부재하에 최초로 기록하였고, 이어서 쿠라리논(5 μM)의 존재하에서 기록하였다. 쿠라리논 용액을 세포외부 측 상에 살포하였다. 실선은 단일 BKCa 채널의 닫힌 수준을 나타내고, 점선은 열린 수준을 나타낸다. 도 7의 B는 단일-채널 전도도 상의 쿠라리논의 효과를 나타낸다. 채널의 뇨(urinary) 전류-진폭을 10 μM 세포 내 Ca2 + 용액에서 측정하였다. 쿠라리논(○)의 부재 하에서 채널 전류를 최초로 기록한 뒤, 5 μM의 쿠라리논(●)을 살포하였다. 막 전압은 각각 75 mV(n=4), 50 mV(n=5), 25 mV(n=5), -25 mV(n=3), 및 -50 mV(n=2)였다. 그래프 상에 프리셋팅된 각 데이터를 가우시안 함수(Gaussian function)를 이용하여 피팅된 모든 포인트 진폭 히스토그램으로부터 얻었다. 단일 채널의 전도도를 선형 함수로 피팅된 슬로프를 이용하여 추측하였다. 도 7의 C는 단일 BKCa 채널의 전압-의존 개방-가능성(P0) 상의 쿠라리논의 효과를 나타낸다. 개방 가능성을 도 7의 B에서와 같은 트레이스를 이용하여 측정하였다. 단일 BKCa 채널의 세포막 의존적 개방확률의 증가를 쿠라리논이 없는 상태(○)와 5 μM 쿠라리논을 처리한 상태에서 (●) 측정하고, 그 데이터 포인트를 볼츠만 함수(Boltzmann function)(P0=[1/(1+exp{(V1/2-V)/k}])에 의해 피팅시켰다. 도 7의 D는 50 mV에서의 5 μM 쿠라리논의 부존재(상단 트레이스) 및 존재(하단 트레이스)상의 BKCa 채널의 대표 단일-채널 전류를 나타낸다. 도 7의 E는 50 mV에서의 5 μM 쿠라리논의 부존재(빈 막대) 및 존재(채워진 막대) 상에서의 단일 BKCa 채널의 평균 개방-시간 및 평균 폐쇄-시간 상의 쿠라리논의 효과를 나타낸다. 각각의 막대 그래프는 평균±SEM(n=5)를 나타낸다.
도 8은 분리한 래트 방광 스트립에 있어서의 ACh에 의해 유도된 수축에 대한 쿠라리논의 효과를 나타낸다. 도 8의 A는 쿠라리논의 예비 배양(preincubation) 유무에 따른 ACh에 의하여 유도된 대표 수축 트레이스를 나타낸다. 도 8의 B는 ACh-유도된 수축 상의 쿠라리논에 의해 유도된 이완 퍼센트 비율을 나타낸다. 각각의 막대 그래프는 6회 실험의 평균±SEM을 나타낸다. 검정은 대조구, 흰색은 쿠라리논 처리 실험을 나타낸다.
도 9는 래트의 배뇨 행동 상의 쿠라리논의 효과를 나타낸다. 도 9의 A는 쿠라리논(0.5 및 5 mg/kg)의 복강 내 주입 후의 WKY 및 SHR의 배뇨 빈도 상의 쿠라리논의 효과를 나타낸다. 배뇨 빈도를 3시간 동안 관찰하였다. 도 9의 B는 배뇨 총 횟수를 나타낸다. 각각의 기호 또는 막대는 5(WKY) 또는 7(SHR) 동물의 평균±SEM을 나타낸다(***P<0.001).
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: 실험재료
794 천연 화합물을 함유하는 화학 라이브러리를 한국 화학 연구원(Korea Research Institute of Chemical Technology, KRICT; www.chembank.org)으로부터 얻었다. 추가적인 쿠라리논 및 이의 유도체는 Sophora Flavescens의 건조된 뿌리인 고삼(Kushen)으로부터 정제하였다(Jung et al. 2008). 쿠라리논 및 다른 화합물들은 스톡 용액으로서의 DMSO(dimethyl sulfoxide)(Sigma-Aldrich)에 용해시켰다. 4-클로로-7-(트리플루오로메틸)-10H-벤조퓨로[3,2-b]인돌-1-카복실산(CTBIC) 또한 DMSO 내에 용해시켰다.
실시예 2: 세포 배양
돌연변이 BKCa 채널을 발현하는, 개질된 HEK293 세포인 AD-293 세포(Lee et al., 2013)를 10% 태아소혈청 및 항생제인 1 mg/ml 게네티신(Gibco)이 보충된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's medium)에 두었다. 37℃, 5% CO2의 가습 조건에서 세포들을 배양하였다.
실시예 3: 형광 분석 및 데이터 분석
돌연변이 BKCa 채널(G803D/N806K)을 안정적으로 발현하는 AD-293 세포를 세포-기반 분석에 이용하였다(Lee et al., 2013). 대략 20000 세포/웰을 96-웰 클리어-바텀(clear-bottom)인, 폴리-D-라이신(Sigma-Aldrich)으로 코팅된 블랙-월 분석 플레이트(black-wall assay plate)(Corning Incorporated) 상에 접종하였다. 화합물 라이브러리의 최초 스크리닝 및 후보 화합물의 추가적인 분석에 FluxORTM 칼슘 채널 분석(Invitrogen)을 이용하였다. 제조자의 다음 지침에 따라 실험들을 수행하였다: 성장 배지는 FluxORTM 형광 염료를 함유하는 로딩 버퍼 80 μl/웰로 교체하였고, 빛이 없는 조건에서 1시간 동안 배양하였다. 배양 후, 로딩 버퍼를 다양한 농도의 관심있는 화합물들을 함유하는 분석 버퍼(assay buffer) 100 μl/웰로 치환한 후 20분에서 30분 동안 배양하였다. DMSO(1%)는 비히클이며, 이를 모든 테스트 화합물에 이용하였다. BKCa 채널의 활성자로서 종래 확인된 CTBIC(Cormemis et al. 2005; Lee et al. 2012)를 양성 대조구로서 이용하였다. 형광 측정을 위해, 최초 스크리닝에 시너지 TM H1 하이브리드 멀티-모드 마이크로플레이트 리더(BioTek Instrument Inc., Winnoski, VT) 및 Cen5 소프트웨어를 이용하였고, 추가적인 분석에 Flexstation 3 멀티-모드 마이크로플레이트 리더(Molecular Devices) 및 SoftMax®Pro 소프트웨어를 각각 이용하였다. 형광 시그널을 485 nm의 여기 파장 및 528 nm의 방출 파장에서 얻었다. 탈륨 이온을 함유하는 자극 버퍼(stimulus buffer)에 의해 막 분극화가 발생하였다. 형광 시그널을 두 상태에서 측정하였다: 자극 버퍼를 처리하기 전 2분 동안 매 10초 및 그 후 시너지 H1에 대한 자극 버퍼를 추가 후 3분간 매 10초마다, 그리고 자극 버퍼 처리 전 20초 간 매 2초 및 그 후 FlexStation 3에 대한 자극 버퍼를 추가 후 160초 동안 매 2초마다.
형광 시그널의 변화를 상대 형광 단위(relative fluorescence unit)(RFU 또는 F/F0, 여기서 F0는 각 형광 트레이스의 최소 형광 값이다). 쿠라리논 및 이의 유도체의 활성화 효과들을 정량적으로 비교하기 위해, 최초 형광 증가를 자극 버퍼로 처리 후의 첫 세 포인트를 이용하여 계산하였고, 선형 슬로프를 OriginPro 9.1(OriginLab Corp., Northampton, MA)을 이용하여 예측하였다.
실시예 4: Xenopus 난모 세포 내에서의 복제된 BKca 채널의 기능성 발현
BKCa 채널 α-서브유닛(Slo1)를 이종 발현하는(heterologously expressing) Xenopus laevis 난모 세포를 전기 생리(electrophysiological) 기록에 이용하였다. 난모세포 발현 벡터 pNBC1.0을 이용한 래트(rat) BKCa 채널 α-서브유닛의 서브클로닝 및 기능성 발현은 종래 보고되었다(Ha et al., 2000). 본 발명에서 이용된 Slo1의 서열 정보는 GenBank에 발현 번호 AF135265로 공개되어 있다. 플라스미드 DNA는 NotI 제한 효소를 이용하여 선형화시켰고 상보적인 RNA(cRNA)를 mMessage Machine(Ambion)을 이용하여 DNA의 선형 형태로부터 뉴클레오시드 삼인산 및 캡 아날로그 m7G(5')ppp(5')G의 존재하에서 T7 RNA 중합효소를 이용하여 합성하였다.
마취시킨 X. laevis(Xenopus I, Dexter, MI)의 난소 부엽(ovarian lobes)으로부터 스테이지 V 내지 VI의 난모세포를 외과적으로 제거하였다. 제거한 난모세포를 Ca2 +-프리 난모세포 링거(oocyte Ringer's)(OR) 배양 배지(86 mM NaCl, 1.5 mM KCl, 2 mM MgCl2 및 10 mM HEPES, pH 7.6)로 이동시켰다. 난모세포를 3 mg/ml 콜라겐 분해효소(Worthington Biochemicals)를 함유하는 Ca2 +-프리 OR 배지 내에서 1시간 30분 내지 2시간 동안 배양하는 것에 의해 난모세포의 난포 세포(follicular cell) 층을 베거하였다. 그런 뒤 난모세포를 Ca2 +-프리 OR 배지 및 ND-96 배지(96 mM NaCl, 2 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 5 mM HEPES, 및 50 g/ml 겐타마이신, pH 7.6)로 광범위하게 세척하였다. 세척한 난모세포를 ND-96 배지에서 18℃로 보관하였다. 난모세포를 사용 전 적어도 하루동안 안정화(stabilization) 시켰다. 안정화 후, 각각의 난모세포에 대해, 거시적 전류 기록을 위한 50 nl 뉴클레아제-프리 물 내의 합성된 cRNA 대략 50 ng 및 마이크로디스펜서(Drummond Scientific, Broomall, PA)를 이용한 단일-채널 기록을 위한 1 ng(50 nl 뉴클레아제-프리 물 내에서의)을 주입하였다. cRNA 주입된 난모세포를 18℃에서 1 내지 3일간 ND-96 배지에서 배양시켰다. 패치-클램프 실험 직전에, 난모세포의 난황막(vitelline membrane)을 미세-겸자(fine forceps)로 수동으로 제거하였다.
실시예 5: 전기생리학적 기록 및 데이터 분석
종래 알려진대로(Ha et al., 2000) 아웃사이드-아웃 배열 내에서 기가옴-씰 패치-클램프(gigaohm-seal patch-clamp) 방법을 이용하여 모든 거시적 전류 기록 및 단일-채널 기록을 수행하였다. 패치 피펫들을 붕규산염(borosilicate) 유리(WPI, Sarasota, FL)로부터 제조하였고, 패치 기록을 위해 2 내지 4 MΩ의 저항으로 불-광택 처리(fire-polished)하였다. 단일-채널 기록을 위해, 패치 피펫들을 또한 4 내지 8 MΩ 저항으로 불-광택 처리하였고, 전기적 노이즈를 감소시키기 위해 밀랍(beeswax)으로 코팅하였다. Axopatch 200B 증폭기(Axon Instruments)를 이용하여 채널 전류를 증폭시켰고, 4-극 베셀 필터(four-pole Bessel filter)를 이용하여 1 kHz에서 저주파-통과 필터링시켰으며(low-pass filtered), Digidata 1200A(Axon Instruments)를 이용하여 10 포인트/ms 비율로 디지털화시켰다.
고농도의 세포 내 Ca2+에서, 100 mV로 간단히 전달된 막 전위에 의해, 단일 BKCa 채널을 용이하게 활성화시켰다. 단일-채널 분석을 위해, 폐쇄 및 개방 상태 사이의 전환을, 절반의 단일 전류 진폭(unitary current amplitude)에서의 역가를 세팅하는 것에 의해 결정하였다. 발현된 채널의 단일-채널 전도도를 결정하기 위해, 가우스 분포(Gaussian distributions)로 피팅된 히스토그램으로부터 채널 전류의 평균 진폭을 얻었고, 막통과 전압에 대해 평균 전류를 도시하였다. 슬로프-전도도 값을 선형 회귀로부터 얻었다. 발현된 BKCa 채널의 거시적 전류를 -100 mV의 보유 전위(holding petential)로부터 전달된 전압-클램프 펄스에 의해 10 mV 증분(increment)으로 대개 -80 내지 200 mV 범위의 막 전위까지 활성화시켰다. 단일 BKCa 채널에 대해 기록된 개방 및 폐쇄 이벤트의 드웰-타임(dwell-time)은 선형 히스토그램 방법을 이용하여 분석하였다. 상기 드웰-타임 분포는 심플렉스-리스트-스퀘어 피팅 방법(simplex-least-squares fitting methods)(Clampfit, Axon Instruments)을 이용하여 단일 지수로 피팅시켰다. 드웰-타임 분포에서의 피크는 지수 성분의 시간-상수에 위치하였다.
내인성 칼슘-활성화 클로라이드 채널의 활성화를 방지하기 위해, 단일 및 거시적 채널 기록을 위한 용액들은 비삼투성(nenpermeant) 음이온으로서 글루코네이트를 함유하였다. 세포내 및 세포외 용액들은 달리 명시하지 않는 한 다음의 성분들을 함유하였다: 120 mM 칼슘 글루코네이트, 10 mM MHEPES, 4 mM KCl, 및 5 mM MEGTA, pH 7.2. 요구되는 프리 [Ca2+]i를 제공하기 위해, 세포 내 용액으로 첨가할 적절한 양의 총 Ca2 +는 프로그램 MaxChelator(Patton et al., 2004; http://maxchelator.stanford.edu/)를 이용하여 계산하였다. 채널 특성들을 정확하게 비교하기 위해, 세포 내 용액의 동일한 세트를 전체 실험들에 걸쳐 이용하였다. 상업적인 소프트웨어 패키지, 예컨대 Clampex 8.0 또는 8.1(Axon Instruments) 및 Origin 9.1(OriginLab Corp., Northampton, MA)를 단일-채널 및 거시적 기록 데이터 양쪽을 얻고 분석하는데 이용하였다. 데이터를 평균±SE(n=독립 기록의 수)로서 요약하였고, 짝지어진 스튜던트 t-검정(paired Student's t-test)를 이용하여 비교하였다. 0.05이하의 p-값은 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
실시예 6: 방광 평활근의 등척성 장력(isometric tension) 기록
UBSM 실험의 등척성 장력 기록을 종래 알려진 방법으로 수행하였다(dela Peㆁa et al. 2009; Kullmann et al. 2014). 요컨대, 수컷 Sprague-Dawley 래트(300-350 g)를 CO2 질식으로 안락사시켰다. 그런 뒤, 방광을 절제하고, 네 개의 스트립으로 길이 방향으로 분할하였다(대략 2×8 mm). 분리된 스트립을 정적 마운트 및 힘-변위 변환기(force-displacement transducer) 사이에 클리핑시켰고, 10 ml의 크랩 용액(Krebs solution)((mM): 118.4 NaCl, 4.7 KCl, 1.2 KH2PO4, 1.2 MgSO4, 25.0 NaHCO3, 2.5 CaCl2, 및 12.2 글루코오스; pH 7.35-7.40)을 함유하는 온도-제어된(37℃) 장기(organ) 배스(bath) 내에 현탁시켰다. 상기 장기 배스를 혼합물 95% O2 및 5% CO2의 혼합물을 이용하여 지속적으로 거품발생시켰다. 각각의 UBSM 스트립을 1.0 g의 최적의 등척성 장력까지 신장시켰고, 60분간 평형(equilibration)시켰다. 평형 동안, 조직을 신선한 크랩 용액(Krebs solution)으로 매 15분마다 세척하였고, 기저 장력을 1.0 g까지 조정하였다. 평형 후 스트립을 지속적인 반응이 기록될 때까지 아세틸클로린(1 μM)의 반복된 적용에 의해 안정화시켰다. 쿠라리논의 완화 효과를 조사하기위해, 아세틸폴린의 첨가에 앞서 쿠라리논으로 조직을 30분간 전-배양시켰고(pre-incubated), 그런 뒤 쿠라리논의 존재하세엇 아세틸콜린-유도의 수축 반응이 반복되었다. 아세틸콜린-유도의 수축으로부터 기인한 장력에 있어서의 퍼센트 감소로서 이완(relaxation)을 표현하였다. 각 시리즈에서의 하나의 스트립을 시간 대조구로서 할당하였다. 등척성 장력에서의 변화를 Lab Chart Software(Version 7, AD Instruments)로 인스톨시킨 컴퓨터에 결부된 Power Lab Data Acquisition System(ADInstruments)을 이용하여 기록하였다. 데이터를 평균±SE(n=DSM 스트립의 수)로서 요약하였고, 짝지은 스튜던트 t-검정을 이용하여 비교하였다. 0.05 이하의 p-값을 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
결과
1. 탈륨-형광 분석을 이용한 BKCa 채널 활성자의 확인
신규 BKCa 채널 활성자들을 확인하기 위해, 천연 원천들로부터 정제된 총 794 단일 화합물들을 Tl+ 형광을 채용한 세포-기반 분석을 이용하여 스크리닝하였다. 5 μM 최종 농도에서, Tl+ 형광이 증가된 몇몇 화합물들은 비히클(1% DMSO)과 유의하게 비교되었다(참조: 도 1A). 화합물들 가운데, 가장 강한 형광 증가는, Sophora flavescens로부터의 플라바논 화합물인 쿠라리논의 처리로부터 얻었다(참조: 도 2). 쿠라리논은 용량-의존 방식으로 Tl+ 형광이 증가되었고(참조: 도 2A), 형광 증가는 선택적인 BKCa 채널 억제자인 1 μM 팍실린의 공동-처리에 의해 완전히 차단되었다. 다른 농도의 쿠라리논에 의해 유발된 최초의 RFU 증가를 도 2B(n=4)에서 정량하였다.
쿠라리논이 천연 플라바논 화합물이기 때문에, 플라보노이드의 몇몇 관련 화합물들을 시험하였다. 10 μM 농도(n=4)로 처리하였고, 상기 화합물들은 Tl+-형광 증가 상의 차별적 효과를 나타내었다. 쿠라리논, 리치아논 G, 및 나린제닌이 강항 형광 증가를 보인 반면에, 쿠라리놀을 포함한 다른 유도체들은 더욱 약한 효과를 나타내었다. 단지 플라바논 백본의 8번 위치에서의 지방족 체인 내의 추가적인 히드록실 그룹을 함유하는 쿠라리놀이 그 효능에서 극적인 감소를 보인다는 것은 주목할만 하다. 시험된 것들 중, 최초 Tl+-기반 형광 분석에 있어서 쿠라리논이 가장 강한 증가를 보였기 때문에, 이어지는 기능적 연구들은 본 화합물을 이용하여 수행하였다.
2. BKCa 채널의 거시적 전류 상의 플라바논 유도체의 효과
비록 세포-기반의 Tl+-형광 분석이 고속-처리 스크리닝(high-throughput screening)에 적합화 되었고, 최초의 BKCa 채널 활성자 후보들을 제공하였지만, 야생형 BKCa 채널을 이용한 전기 생리 각각의 화합물들의 활성을 입증하고 특성화할 필요가 있었다. 그러므로 Xenopus 난모 세포 상에 이종적으로 발현된 래트 BKCa 채널(rSlo1)의 α 서브유닛 상의 쿠라리논의 효과를 특성화하였다. 거시적 채널 전류 상의 시간-의존적 효과를, 3 μM 세포내 Ca2 +의 존재하에서 아웃사이드-아웃 배열에 있어서의 절제된(excised) 막 패치들을 이용하여 조사하였다(참조: 도 4). 소 테일 전류(small tail current)가 각각의 시험 펄스에 의해 유발되는 반면에(참조: 도 4의 a), 세포외부 면에 대한 5 μM 쿠라리논의 처리는 테일-전류를 시간-의존 방식으로 대단히 강화시킨다(참조: 도 4의 b 및 c). 쿠라리논의 제거 상에, 채널 전류는 기저 수준에 대해 점진적으로 탈-강화(de-potentiation)되었다(참조: 도 4의 d). 쿠라리논에 의한 BKCa 채널의 강화 및 탈-강화 모두가 두 상(two phases)을 보인다는 것을 주목할만하다: 몇 초 사이의 최초의 급속 증가, 및 몇분에 걸친 느리고 완만한 증가. 이중-지수 함수로 피팅될 때, 결합 시간-상수(assocation time-constant) 값은 고속 상(fast phase)(τfast)에 대해 1.47±0.34초, 저속 상(τslow)에 대해 64.9±8.8초로 각각 예상되었다. 비록 두 다른 상들이 명백하지만, BKCa 채널의 탈-강화는, 2.78±0.95 초 및 90.06±12.21 초로 각각 측정된 해리 시간-상수를 갖는 강화보다 더욱 길었다. 절제된 인사이드-아웃 패치 기록을 이용하여 쿠라리논을 세포 안쪽으로부터 처리하였을 때, BKCa 채널 전류의 유의한 변화가 관찰되지 않았다. 그러므로 이러한 결과들은 쿠라리논이 BKCa 채널의 활성을 세포 밖으로부터 직접적으로 및 가역적으로 강화시킬 수 있다는 것을 나타낸다.
3. BKCa 채널의 거시적 전류 상의 플라바논 유도체의 농도 의존 효과
다음으로 BKCa 채널의 플라바논 유도체-유도의 강화의 메카니즘을 연구하였다. 전압 펄스의 시리즈에 의해 BKCa 채널은 활성화 되었고, 활성화된 세포 외 쿠라리논의 증가된 농도 하에서 거시적 전류를 기록하였다. 쿠라리논 농도가 증가함에 따라, 채널 전류는 더 낮은 전압에서 활성화되고, 더욱 천천히 비활성화된다는 것이 명백하다(참조: 도 5A). 도 3B에서, 거시적 BKCa 채널 전류의 전압-의존 활성화는 전도도-전압(G-V) 관계로서 나타내었다. 쿠라리논은 점진적으로 G-V 커브를 좌측으로 이동시키고, 최대 전도도(Gmax)를 용량-의존 방식으로 증가시킨다. G-V 관계에서의 쿠라리논-의존 이동은 추가적으로 정량화시켰고, 도 5C에서 도시화 시켰다. 20 μM 쿠라리논의 존재하에서, 절반-활성 전압(V1/2)은 107.4±2.2 mV로부터 27.7±3.0 mV까지 음의 방향으로 대략 80 mV 이동된다. 쿠라리논은 또한 점진적으로 채널의 최대 전도도(G/Gmax)를 증가시켰다. G/Gmax는 20 μM 쿠라리논에서 1.35로 예측되었고, 비히클 대조구에 비해 약 1.8배 더 높은 것이다. 그러므로 이러한 결과들은 쿠라리논이 더욱 음성인 막 전압에서 채널을 활성화 시킴으로써 BKCa 채널을 강화시키고, 채널의 최대 개방 가능성을 증가시킨다는 것을 보여준다.
4. 활성화 및 비활성화 동역학 BKCa 채널 상의 플라바논 유도체의 효과
도 5A의 거시적 전류 트레이스에 나타낸 바와 같이, BKCa 채널의 비활성화는 본 발명의 플라바논 유도체에 의해 크게 영향을 받는 것으로 나타났다. 그러므로 BKCa 채널의 개폐 운동 상의 쿠라리논의 효과를 조사하였다. 도 6에서, BKCa 채널의 활성화(또는 개방) 및 비활성화(또는 폐쇄) 절차를 분석하였다. 20 μM의 존재 하에서 전류 레벨이 증가하는 반면에, 활성화율은 고려할만큼 달라되지 않았다(참조: 도 6A). 쿠라리논의 네 증가된 농도(0, 5, 10, 20 μM)에서 활성화 시간-상수(τactivation)는 유의하게 증가되지 않았다(참조: 도 6C). 반면에, 비활성화율은 쿠라리논에 의해 극적으로 감소하였다. 흥미롭게도, 채널이 더 높은 양의 전압에 의해 활성화되어져 왔을 때, 쿠라리논이 BKCa 채널의 폐쇄를 더욱 눈에 띄게 느리게 만든다는 점에서, 쿠라리논에 의한 비활성화의 감속(slowing)은 전압-의존적이었다. 종합적으로 이러한 결과들은 쿠라리논이 BKCa 채널의 개방 형태를 안정화 시키고, 쿠라리논의 결합친화도가 더 높은 전압에서의 채널 형태를 가지고 더욱 강해질 수 있다는 것을 보여준다.
5. BKCa 채널의 단일-채널 전류 상의 플라바논 유도체의 효과
플라바논 유도체 작용의 메카니즘을 더 이해하기 위해, 그 효과를 단일-채널 레벨에서 조사하였다. 단일 BKCa 채널을 10 μM 세포 내 Ca2 +의 존재 하에서 아웃스탠드-아웃 패치에서 기록하였다. BKCa 채널을 활성화 시키기위해, 막 전압을 80 mV 보다 더 높아질 때까지 최초로 탈분극시켰고, 패치 막 내의 채널의 수를 계수하였다. 오직 단일 채널을 함유하는 패치들만을 후속 실험들에 이용하였다. 5 μM의 쿠라리논의 부재 또는 존재 하에서의 단일 채널의 대표 트레이스를 도 7A에 나타내었다. 채널의 개방은 예상대로 막 전압에 대해 크게 의존하였다. 그러나 개폐 행동은 세포 외측에 대한 5 μM 쿠라리논의 적용에 의해 극적으로 변경되었다. BKCa 채널이 -25 mV 상의 대조구 용액에서 거의 개방되지 않는 반면, 채널의 더 잦은 개방이 명백하였다. 50 mV에서, 채널은 쿠라리논의 존재 하에서 연장된 기간동안 개방을 유지하였다. 채널 전도도 상의 쿠라리논의 효과를 시험하기 위해, 각 BKCa 채널의 단일 전류 진폭(unitary current amplitude)을 화합물의 존재 또는 부존재 상에서 다양한 막 전압에서 측정하였고, 단일-채널 전류-전압(I-V) 관계들을 도시하였다(참조: 도 7B). 단일-채널 전도도는 대조구에서 221.1±16.4, 쿠라리논에서 238.3±8.7 pS로 각각 예상되었고, 화합물이 채널의 단일-채널 전도도를 유의하게 수정하지 못한다는 것을 나타낸다. 이후 단일 채널의 P0 상의 쿠라리논의 효과를 분석하였다. P0는 쿠라리논의 존재 및 부존재 상에서 몇몇 다른 전압으로 측정되었고, 볼츠만 함수(Boltzmann function)로 피팅시켰다(참조: 도 7C). 최대 개방의 절반이 요구되는 전압인 V1/ 2은 절반-활성화 전압(V1/2)은 대조구에서 68.7±3.7 mV, 5 μM 쿠라리논의 존재하에서 43.7±2.1 mV이었다(참조: 도 7D). 이러한 결과들은, 거시적 채널 전류에 있어서 이미 언급된 발견들과 잘 일치하여 단일 채널 전도도에 영향을 줌 없이, 쿠라리논이 채널의 개방 가능성을 증가시키는 것에 의해 BKCa 채널을 강화시킬 수 있다는 것을 나타낸다. 그 후 쿠라리논의 존재 상의 단일 BKCa 채널들의 개폐 행동을 분석하였다. 쿠라리논이 다일 BKCa 채널의 P0를 매우 극적으로 증가시키기 때문에, 본 발명의 분석들을, 개방-폐쇄 전환이 합리적인 시간-스케일에서 비교될 수 있는 50 mV에서의 단일-채널 기록들로 제한하였다(참조: 도 7D). 평균 폐쇄-시간이 쿠라리논의 부존재 시 3.69±0.80 ms이고 5 μM의 쿠라리논의 존재 시 3.60±4.1 ms로 측정되는 반면에, 평균 개방-시간은 각각 2.98±0.34 ms 및 5.77±0.90 ms으로 측정되었다(참조: 도 7E). 이러한 결과들은 쿠라리논의 결합이 개방 형태를 안정화시키고, 그럼으로써 채널의 폐쇄 비율을 채널의 개방 전환에 영향을 줌 없이 감소시킨다는 것을 나타내고, 나아가 거시적 전류 기록의 결과를 확증한다.
6. 래트 방광 조직에 대한 플라바논 유도체의 효과
플라바논 유도체가 이형 시스템(heterologous system) 상에 발현된 복제 BKCa 채널을 강력하게 강화시키기 때문에, 플라바논 유도체 화합물이 또한 방광 평활근을 in vivo에서 이완시킬 수 있는지 확인코자 하였다. 아세틸콜린(ACh)-유발의 UBSM의 수축에 대한 쿠라리논의 효능을 확인하기 위해, 래트 배뇨근 스트립의 등척성 장력을 기록하였다. 1 μM ACh이 피크 장력 및 이에 따른 상대적으로 안정적인 안정 레벨(plateau levles) 감소를 유발하는 반면에(참조: 도 8A), 쿠라리논을 이용한 조직의 전처리는 유의하게 ACh-유발의 수축을 억제하였다. 이완 효과는 비히클 처리에 비하여 100 μM 쿠라리논에서 58.2±6.2%였다(p<0.05, n=6)(참조: 도 8B). 대조적으로 비히클 처리된 시간 매칭된 대조구 조직에서의 수축 반응에서는 유의한 변화가 없었다.
7. WKY 및 SHR의 배뇨 행동 상의 플라바논 유도체의 효과
방광 이완 및 배뇨 활성 상의 플라바논 유도체의 효과를 추가적으로 입증하기 위해, 위스타 교토 래트(Wistar Kyoto rat, WKY) 및 자발성 고혈압 래트(spontaneous hypertensive rat, SHR)의 배뇨 행동을 조사하였다. 누적 배뇨 빈도를 쿠라리논을 경구 투여한 WKY 및 SHR에 대하여 도 9A에 나타내었다. 쿠라리논의 투여에 의해, 배뇨 빈도에서의 뚜렷한 차이점은 WKY 및 SHR 사이에서 명백하였다. 대조구 WKY의 배뇨 빈도가 5 mg/kg 용량 이상의 쿠라리논에 의해 영향을 받지 않은 반면, 화합물은 SHR에 대한 배뇨 빈도를 용량-의존 방식으로 감소시켰다. 3 시간 동안의 총 배뇨 빈도는 도 9B에 도시하였다. 5 mg/kg의 쿠라리논이 투여될 때, 배뇨 빈도에서의 유의한 감소가 SHR에서 관찰되었다(비히클에 대해 10.9±1.4 및 쿠라리논에 대해 6.9±0.8). WKY 대조구 래트에서는 상기와 같은 배뇨 빈도의 감소가 관찰되지 않았다. ex vivo 등척성 장력 기록과 함께, 상기 결과들은 추가적으로 쿠라리논이 배뇨근 근육 BKCa 채널을 강화하는 것에 의해 방광 이완 활성을 갖고, OAB 신드롬을 개선시키는 유효한 후보 화합물임을 보여준다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
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본 발명은 본 발명은 BKCa 채널을 활성화 시킬 수 있는 신규 화합물들에 관한 것이다. 본 발명의 조성물을 이용하면, BKCa 채널을 효과적으로 활성화 시킬 수 있고, BKCa 채널 비 활성화 또는 활성 저하에 따라 발생하는 다양한 질병의 예방 또는 치료에 이용할 수 있다.

Claims (12)

  1. 하기 일반식 1로 표시되는 플라바논 유도체 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 BKCa 채널 활성화용 조성물:
    일반식 1
    Figure PCTKR2017002291-appb-I000002
    상기 일반식 1에 있어서, R1은 수소 및 직쇄 또는 분지쇄형의 C1-C15 알킬 또는 알케닐로 구성된 군으로부터 선택되는 소수성 치환기이고;
    상기 R1이 C6-C15의 알킬 또는 알케닐인 경우 R2는 C1-C4의 알콕시이며, 상기 R1이 수소 또는 C1-C5 알킬 또는 알케닐인 경우 R2는 히드록시이고;
    R3, R4 및 R5 는 각각 독립적으로 수소 또는 히드록시이며, 단 R3, R4 및 R5 중 적어도 하나는 히드록시이다.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 R1이 C6-C15의 알킬 또는 알케닐인 경우 R2는 메톡시인 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 R1은 수소, 3-메틸-2-부텐-1-일(3-methyl-2-buten-1-yl) 또는 2-이소프로페닐-5-메틸-4-헥센-1-일(2-isopropenyl-5-methyl-4-hexen-1-yl)인 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 R1이 수소인 경우, 상기 R2는 히드록시인 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제 3 항에 있어서, 상기 R1이 3-메틸-2-부텐-1-일인 경우, R2는 히드록시인 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제 3 항에 있어서, 상기 R1이 2-이소프로페닐-5-메틸-4-헥센-1-일인 경우, R2는 메톡시인 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 R4는 히드록시이고, 상기 R3 및 R5는 각각 독립적으로 수소 또는 히드록시인 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 R3 및 R5 중 적어도 어느 하나 이상은 수소인 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 일반식 1로 표시되는 플라바논 유도체는 쿠라리논, 나린제닌 및 리치아논 G로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물인 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 BKCa 채널의 전도도-전압(G-V) 상관관계를 음적 전압(negative voltage) 방향으로 이동시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 BKCa 채널 활성 저하-관련 상태, 질환 또는 질병의 예방 또는 치료용 조성물.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 BKCa 채널 활성 저하-관련 상태, 질환 또는 질병은 심혈관질환(cardiovascular disease), 폐쇄 또는 염증 기도 질환, 하부 요로 질환(lower urinary tract disorders), 발기부전, 불안 및 불안-관련 상태, 간질 또는 동통인 것을 특징으로 하는 조성물.
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