WO2017146440A1 - 안드로스테논 및 바닐린의 공-결정, 이의 제조 방법 또는 이의 용도 - Google Patents

안드로스테논 및 바닐린의 공-결정, 이의 제조 방법 또는 이의 용도 Download PDF

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WO2017146440A1
WO2017146440A1 PCT/KR2017/001892 KR2017001892W WO2017146440A1 WO 2017146440 A1 WO2017146440 A1 WO 2017146440A1 KR 2017001892 W KR2017001892 W KR 2017001892W WO 2017146440 A1 WO2017146440 A1 WO 2017146440A1
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WO
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androstenone
vanillin
crystals
crystal
present
Prior art date
Application number
PCT/KR2017/001892
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English (en)
French (fr)
Inventor
김재선
유형철
김신
송영아
이상률
김경철
Original Assignee
제이투에이치바이오텍 (주)
메토요 주식회사
주식회사 천보
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C47/00—Compounds having —CHO groups
    • C07C47/52—Compounds having —CHO groups bound to carbon atoms of six—membered aromatic rings
    • C07C47/575—Compounds having —CHO groups bound to carbon atoms of six—membered aromatic rings containing ether groups, groups, groups, or groups
    • C07C47/58—Vanillin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J3/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen, substituted in position 17 beta by one carbon atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J41/00—Normal steroids containing one or more nitrogen atoms not belonging to a hetero ring

Definitions

  • the present invention relates to co-crystals of androstenone and vanillin, methods for their preparation or their use.
  • 5 ⁇ -androst-16-en-3-one is represented by the following formula (2).
  • 4-hydroxy-3-methoxybenzaldehyde (4-Hydroxy-3-methoxybenzaldehyde) is represented by the following formula (3), CAS number It is a phenolic aldehyde of 121-33-5 and has a molecular weight of 152.15 and is also called vanillin.
  • Androstenone is an endogenous substance that also exists in the human body and is a component detected in sweat or urine. In nature, it is particularly distributed in the salivary glands of male pigs and is the first pheromone that has been identified in mammals. Androstenone has an irritating scent that can be unpleasant and is a direct cause of boar taint. It is a hormone that affects the taste and aroma of pork along with skatole.
  • Korean Patent Registration No. 10-1297574 discloses a composition for promoting degradation of androstenone containing a root extract as a feed additive for eliminating boar of boar.
  • U.S. registered patent US 9,044,395 discloses a variety of androstenone-containing spray formulations for the behavioral correction of dogs and a variety of animals, for example aerosol sprays and isopropanol filled with compressed propane gas as a propelant
  • the pump spray containing the same is described.
  • the present invention is actually marketed in the United States under the brand name Stop that.
  • the actual product sold is a compressed propane-filled aerosol spray that is designed to produce a strong hissing sound when “spraying” the spray, as described in the paper above.
  • the inventors of the present invention produced a variety of pump sprays using androstenone, it was confirmed that the following problems.
  • aerosol sprays filled with compressed propane gas and containing ethanol could be inflated and exploded by fire or by high temperatures in summer.
  • commercially available product documentation states that storage is below 120 ° F (49 ° C) and that there is a risk of explosion if exposed to temperatures above that.
  • the temperature inside the vehicle can rise from 47 °C to 92 °C when the outside temperature is 35 °C in summer, and the driver's seat temperature of 68 °C for 4 hours from noon during summer , The back seat was 53 °C.
  • aerosol formulations in the form of compressed, flammable gases with low flash points, such as propane may be at risk in many environments of everyday life.
  • the pump spray formulation described in the US registered patent US 9,044,395 has been identified the following problems.
  • 0.01% of androstenone was dissolved in an aqueous solution containing 10% of isopropanol, but the solubility was not able to prepare a clear solution.
  • the water solubility of androstenone is known to be 0.23 ⁇ g / mL at room temperature, and the solubility was less than 0.1 mg / mL even in an aqueous solution of 10% isopropanol.
  • the present inventors have confirmed that androstenone itself has a limit in improving solubility, and precipitation occurs easily due to extremely poor solubility of androstenone in the pump spray formulation, and when spraying the sprayed dog, the precipitation has occurred. It was also confirmed experimentally that there was no effect compared to the placebo.
  • Androstenone is a white solid with a melting point of 140-145 ° C. Its sublimation gives off odor that can be unpleasant to humans even in a solid state. This smell is similar to the smell of sweat or foot, so it can be of course appealing to dogs. On the other hand, it has extremely poor solubility in water, and even in a solution containing alcohol, precipitation easily occurs during low temperature storage and long-term storage at room temperature, and once precipitation occurs, crystallinity is so excellent that it is difficult to dissolve again.
  • the present inventors attempted to overcome all the disadvantages of androstenone.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preparing co-crystals of androstenone and vanillin.
  • Another object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for animal stability.
  • the present invention provides a co-crystal of androstenone and vanillin represented by the following general formula (1):
  • the co-crystals of androstenone and vanillin of the present invention are characterized by novel powder X-ray diffraction (PXRD) analysis and differential scanning calorimetry (DSC) analysis, 1 H-NMR, and FE-SEM images. It is a crystalline polymorph and is named crystalline Form 1.
  • the co-crystal has a lattice structure of 1: 1 molar ratio of androstenone represented by the following formula (2) and vanillin represented by the following formula (3):
  • the co-crystal has a 2 ⁇ diffraction angle of 13.02 o ⁇ 0.2 o , 14.47 o ⁇ 0.2 o , 20.04 o ⁇ 0.2 o and 21.15 o ⁇ 0.2 o in powder X-ray diffraction (PXRD) analysis And endothermic peaks having an endothermic onset temperature of 72.4 ° C ⁇ 4 ° C and an endothermic temperature of 75.3 ° C ⁇ 4 ° C in differential scanning calorimetry (DSC) analysis.
  • PXRD powder X-ray diffraction
  • the co-crystals of androstenone and vanillin of the present invention have a powder X-ray diffraction pattern of FIG. 1 and can be identified by characteristic temperature differential scanning calorimetry (DSC) results as shown in FIG. 2. Can be.
  • DSC characteristic temperature differential scanning calorimetry
  • the value reported in relation to the DSC thermogram may show a difference of ⁇ 4 ° C., which means that the temperature observed through the DSC varies in the range of ⁇ 4 ° C. depending on the heating rate, the sample preparation method and the type of instrument used. Because it can have.
  • co-crystals of androstenone and vanillin of the present invention are not regular rectangular crystals, as can be seen in the image by the field emission scanning electron microscope (FE-SEM) of FIG. 3. It shows shape.
  • Crystalline images provided by field emission scanning electron microscopy can be represented by a slight deformation of the FE-SEM image depending on the sample preparation technique and the particular instrument used.
  • the most reasonable way to identify and determine the co-crystals of androstenone and vanillin of the present invention is based on the characteristic 2 ⁇ diffraction angle of the powder X-ray diffraction (PXRD) analysis, and is a temperature differential scanning calorimeter. It is specified by (DSC) measurement result and field emission scanning electron microscope (FE-SEM) measurement image result.
  • PXRD powder X-ray diffraction
  • the co-crystals of androstenone and vanillin of the invention have a melting point of 75.3 ° C ⁇ 4 ° C.
  • the present invention provides a method for preparing a co-crystal of androstenone and vanillin, comprising the steps of: (a) a-1) androstenone and vanillin Adding an organic solvent while mixing and grinding; Or a-2) adding androstenone, vanillin and an organic solvent, followed by stirring to filter and washing with an organic solvent; And (b) vacuum drying the resultant of step (a).
  • the method of the present invention is to produce co-crystals of the androstenone and vanillin of the present invention described above, the common content between the two is to avoid excessive complexity of the specification according to the repeated description. Omit the description.
  • the method for preparing the co-crystal of the present invention can be largely prepared through i) solvent addition grinding or ii) solvent mediated reaction.
  • the process of the present invention is subjected to the step of (a) a-1) adding an organic solvent while mixing and milling androstenone and vanillin.
  • the vanillin is added in a molar ratio of 0.95 to 1.10 equivalents, and more preferably in a molar ratio of 1.0 to 1.05 equivalents relative to androstenone.
  • the grinding is carried out at a speed of 150-300 rpm at a temperature of 30-40 °C using a ball mill, more preferably at a speed of 200-270 rpm at a temperature of 32-38 °C Most preferably at a temperature of 230-250 rpm at a temperature of 32-36 ° C.
  • rotational speed is too slow, less than 150 rpm, a homogeneous crystalline form may not be formed. If the rotational speed is too fast beyond 300 rpm, decomposition may occur due to frictional energy.
  • the milling is carried out for 30-120 minutes, more preferably for 30-60 minutes. If the grinding time is too short, less than 30 minutes, there is a fear that a complete crystalline form is not formed, on the contrary, if the grinding time is too long beyond 120 minutes there is a fear that amorphous or lead material is produced.
  • the organic solvent is one or two or more mixed solvents selected from the group consisting of methanol, ethanol, isopropanol, n-heptane, ethyl acetate and acetone, more preferably methanol, ethanol And acetone, most preferably methanol.
  • the organic solvent is added at 0.1 (volume / weight) times-0.5 (volume / weight) times relative to the androstenone and vanillin mixture.
  • the organic solvent is added in three to 10 times through the whole grinding process.
  • the method of the present invention includes the steps of (a) a-2) androstenone, vanillin and an organic solvent by adding and stirring, followed by filtration and washing with an organic solvent.
  • step (a) a-2) adds a first organic solvent to androstenone and vanillin, and then stirs to prepare a suspension, to which a second organic solvent is added and stirred. And then washed with a third organic solvent.
  • the vanillin of step (a) a-2) is added in a molar ratio of 0.95 to 1.10 equivalents, and more preferably 1.0 to 1.05 equivalents relative to androstenone.
  • the organic solvent of step (a) a-2) is selected from the group consisting of methanol, ethanol, isopropyl alcohol, n-butanol and acetone, more preferably the first
  • the organic solvent is one or two or more mixed solvents selected from the group consisting of methanol, ethanol, isopropyl alcohol, n-butanol and acetone, and the second and third organic solvents used after concentration are acetone alone, or acetone and methanol , Acetone and ethanol or a mixture of acetone and isopropanol.
  • the first organic solvent is methanol
  • the second and third organic solvents used after concentration are acetone.
  • the ratio of acetone is 80% (volume / volume) or more.
  • the first organic solvent is added in 5 (volume / weight) -10 (volume / weight) times with respect to the androstenone and vanillin mixture, and the suspension is made of androster with residual solvent in the total solution. It is prepared to be 0.1 (volume / weight) times-0.5 (volume / weight) times for the paddy and vanillin mixture, and the second organic solvent is 2.5 (volume / weight) -5 (volume / weight) for the androstenone and vanillin mixture.
  • the third organic solvent is added in 0.5 (volume / weight) times-1 (volume / weight) times relative to the androstenone and vanillin mixture.
  • the stirring after the addition of the first organic solvent is carried out for 30 minutes-1 hour at 25-30 °C
  • the stirring after addition of the second organic solvent is 1 at 20-25 °C Run for 2 hours.
  • step (b) vacuum drying the resultant of step (a)
  • the method of the present invention then comprises (b) vacuum drying the result of step (a).
  • step (b) is commonly included in the method for preparing co-crystals by i) solvent addition grinding or ii) solvent mediated reaction.
  • the vacuum drying is carried out at 40-45 ° C for 10-20 hours.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for animal stability comprising the co-crystal of androstenone and vanillin of the present invention as an active ingredient.
  • the active ingredient is included in 0.0001 to 1.0% based on the total weight of the composition.
  • the weight of the active ingredient is less than 0.0001% by weight, the effect is less likely to appear, and when the amount exceeds 1.0% by weight, the increase in effect due to the increase of the content is very weak, and there is a problem that the stability of the formulation is not secured.
  • an “animal” is an animal other than a human, preferably a dog, a cat, a horse, a bird, a tiger, a lion, or a mouse, more preferably a dog or a cat, and most preferably a dog.
  • animal stability means correcting or calming inappropriate behaviors such as barking and jumping, such as anxiety or excitement.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be oral or parenteral, and the parenteral injection includes nasal injection, intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, transdermal injection and the like.
  • the dosage form of the pharmaceutical composition may vary depending on the method of use, but may include warning agents (Plasters), granules (Granule), powders (Sowrups), syrups (solutions), solutions (Fluidextracts I), emulsions ( Emulsions, suspensions, infusions, tablets, injections, capsules, pills, and the like.
  • the composition may be prepared in a spray, aerosol, diffuser and a slow release matrix (slow release matrix).
  • compositions of the present invention may be prepared in unit dosage form by formulating with a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to methods which can be easily carried out by those skilled in the art. Or may be prepared by incorporation into a multi-dose container, and may further include a dispersant or stabilizer.
  • the present invention comprises administering to the animal an animal stable pharmaceutical composition comprising a co-crystal of the above-mentioned androstenone and vanillin of the present invention as an active ingredient. It provides a method of relaxing or calming animals.
  • the present invention provides an animal stable pharmaceutical composition comprising a co-crystal of androstenone and vanillin prepared by the method of the present invention as an active ingredient to an animal
  • An animal relaxation or calming method comprising the step of administering is provided.
  • the present invention provides co-crystals of androstenone and vanillin, methods for their preparation and their use.
  • the water solubility of the co-crystals of androstenone and vanillin increased by at least 100 ⁇ g in terms of androstenone as compared to 0.23 ⁇ g / mL at and room temperature. Due to the increased solubility, the pump spray formulation is fully dissolved during manufacture, and no precipitation occurs at all even under prolonged storage under refrigerated conditions.
  • the androstenone and vanillin co-crystals of the present invention are perfectly masked and have a subtle vanilla scent, even compared to conventional androstenones having a odor that may be offensive to humans.
  • Vanilla flavor is one of the favorite flavors of dogs and can be very effectively calmed when actually sprayed on barking and jumping dogs using the co-crystals of androstenone and vanillin of the present invention.
  • FIG. 2 shows the differential scanning calorimetry (DSC) results of polymorph 1 of androstenone-vanillin prepared according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 3 shows a field emission scanning electron microscope (FE-SEM) image of the polymorph type 1 of androstenone-vanillin prepared according to an embodiment of the present invention.
  • Example 3 Pump Spray Formulation Using Androstenone-Vaniline Crystalline Form 1
  • Example 1 and Example 2 were each taken to prepare a supersaturated aqueous solution, and then vortexed for 2 minutes and centrifuged for 1 minute at 14,000 rpm. The supernatant was filtered through an aqueous filter and analyzed by HPLC. 90% acetonitrile (0.1% phosphoric acid solution) was flowed at a rate of 1.0 mL / min as a mobile phase to a reversed phase C-18 Capcell-Pak column connected to a C-18 guard column as a fixed phase. The wavelength was measured by UV absorbance at 210 nm to quantify the androstenone concentration in the filtrate.
  • the water solubility of the androstenone and vanillin cocrystals of Examples 1 and 2 was measured to be 25 ⁇ g / mL or more in terms of androstenone. This can be interpreted as the result of more than 100-fold increase in water solubility of androstenone compared to 0.23 ⁇ g / mL at room temperature.
  • Androstenone and androstenone-vanillin cocrystal in 20% aqueous solution of EtOH were dissolved to contain 0.01% in terms of androstenone.
  • more dissolution time was required, and the solution was completely dissolved by adding a temperature up to 50 ° C. and cooled to room temperature. Each solution was stored at room temperature and -10 ° C, and the solid precipitate was observed over time.
  • Androstenone was found to be a solid precipitate after 24 hours at room temperature, and precipitation was observed after 2 hours at -10 ° C. Androstenone was not identified as below detection limits when each supernatant of the androstenone solution was taken and analyzed by HPLC. This is inferior to the inherent solubility, and it is interpreted that the once-precipitated androstenone acts as a seed to further induce precipitation.
  • Test Example 3 Severity Stability Test of Androstenone-Vaniline Crystalline Form 1 Solid and Liquid Composition
  • Example 1 0.01% of the androstenone-vanillin crystalline form 1 raw material prepared in Example 1 was diluted with 1/100 of an aqueous 10% ethanol solution to prepare a spray. This was diluted so that the concentration of androstenone-vanillin in the total solution was 1 ⁇ g / mL.
  • the first was a severe barking situation where the placebo pump spray containing only 10% ethanol aqueous solution was sprayed three times in a row around the face and watched for reaction.
  • the placebo confirmed the reaction 4 times out of 20 times, and in the case of the test substance, the reaction was confirmed 16 times out of 20 times. That is, the reaction rate of the placebo in this test is 20%, and the reaction rate of the test substance according to the present invention reaches 80%.
  • FIG. 1 PXRD analysis was performed on an X-ray powder diffractometer using Cu K ⁇ radiation (D8 Advance). The instrument was equipped with tubular power and the amount of current was set to 45 kV and 40 mA. The divergence and scattering slits were set to 1 ° and the light receiving slit was set to 0.2 mm. ⁇ -2 ⁇ continuous scans of 3 ° / min (0.4 seconds / 0.02 ° interval) from 5 to 35 ° 2 ⁇ were used.
  • DSC Q20 obtained from TA
  • DSC measurements (FIG. 2) were carried out in a sealed pan at a scan rate of 10 ° C./min from 20 ° C. to 250 ° C. under nitrogen purification.

Landscapes

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Abstract

본 발명은 안드로스테논 및 바닐린의 공-결정(co-crystal), 이의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 안드로스테논 및 바닐린의 공-결정은 단단한 격자 구조를 이루고 있어 안드로스테논이 갖는 승화성이 사라져 원료 상태로 장기간 보관 시에 안정성이 우수하며, 수용해도가 크게 개선되어 펌프 스프레이 제제를 제조 시 완전히 용해되며, 냉장 조건 하에서 장기간 보관하더라도 전혀 석출이 발생하지 않는다. 또한, 본 발명의 공-결정은 경시변화에 따른 초기 대비 함량이 줄지 않고 어떠한 유연물질도 생성되지 않으며, 동물이 좋아하는 바닐라향을 가질 뿐만 아니라 안정시키고자 하는 동물에게 분사했을 시 매우 효과적으로 진정시킬 수 있고, 기존 시판 제품에서 사용했듯 치찰음을 발생시키는 소음기를 사용하지 않아도 그 효과는 뚜렷하다.

Description

안드로스테논 및 바닐린의 공-결정, 이의 제조 방법 또는 이의 용도
본 특허출원은 2016년 02월 25일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제 10-2016-0022729호에 대하여 우선권을 주장하며, 상기 특허출원의 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명은 안드로스테논 및 바닐린의 공-결정(co-crystal), 이의 제조 방법 또는 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 하기 화학식 1로 표시되는 공-결정(co-crystal)에서, 5α-안드로스트-16-엔-3-원(5α-androst-16-en-3-one)은 하기 화학식 2로 표시되고, CAS 번호 18339-16-7의 승화성을 갖는 고체로서 272.43의 분자량을 갖으며 화학식 (5S,8R,9S,10S,13R,14S)-10,13-디메틸-1,2,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15-도데카하이드로사이클로펜타[a]펜아트렌-3-원[(5S,8R,9S,10S,13R,14S)-10,13-Dimethyl -1,2,4, 5,6,7,8,9,11,12,14,15-dodecahydrocyclopenta[a]phenanthren-3-one]으로 표기되며, 안드로스테논(Androstenone)이라고도 명명된다.
또한, 본 발명의 하기 화학식 1로 표시되는 공-결정(co-crystal)에서, 4-하이드록시-3-메톡시벤즈알데히드(4-Hydroxy-3-methoxybenzaldehyde)는 하기 화학식 3으로 표시되고, CAS 번호 121-33-5의 페놀성 알데히드로서 152.15의 분자량을 갖으며 바닐린(Vanillin)이라고도 명명된다.
화학식 1
Figure PCTKR2017001892-appb-I000001
화학식 2
Figure PCTKR2017001892-appb-I000002
화학식 3
Figure PCTKR2017001892-appb-I000003
안드로스테논은 인체에도 존재하는 내인성 물질로서 땀이나 소변에서 검출되는 성분이다. 자연계에는 특히 수컷 돼지의 침샘에 많이 분포하고 있으며 포유류에서 존재가 확인된 최초의 페로몬이다. 안드로스테논은 불쾌감을 줄 수 있는 자극적인 향을 지니고 있으며 웅취(boar taint)의 직접적인 원인이 되는 물질로서 스케이톨(skatole)과 함께 돈육의 맛과 향에 영향을 미치는 호르몬이다.
대한민국 등록특허 제10-1297574호에는 수퇘지의 웅취를 없애기 위한 사료첨가제로서 갈근 추출물을 함유하는 안드로스테논의 분해 촉진용 조성물을 개시하고 있다.
한편, 2014년에 발표된 논문 ‘The Professional Animal Scientist 30, 2014, 105-108’에는 안드로스테논의 새로운 용도에 대해 소개가 되고 있다. 이 논문에 의하면 안드로스테논을 짖고 뛰어 오르는(barking and jumping) 개에 스프레이로 분사할 경우 일시적으로 안정시키는 효과가 있음이 개시되어 있다. 해당 논문에는 안드로스테논 0.1 μg/mL의 이소프로판올 용액 및 안드로스테논 1.0 μg/mL의 이소프로판올 용액을 110 dB의 소리와 함께 분사할 경우 각각 78% 및 100%의 반응율로 짖기와 뛰어 오르기를 멈추는 것이 보고되어 있다. 한편, 안드로스테논이 함유되지 않은 110 dB의 소리(loud spray)에 의해서도 44%의 반응율로 짖기와 뛰어 오르기를 멈추고 있어서 스프레이에 장착한 소음과 안드로스테논이 함께 사용될 때 효과가 배가됨을 알 수 있었다.
미국 등록 특허 US 9,044,395에는 개를 비롯한 다양한 동물들의 행동 교정을 위해 다양한 안드로스테논 함유 스프레이 제제, 예를 들어 프로펠런트(propellant)로서 압축 프로판 가스를 충진하고 안드로스테논이 함유된 에어로졸 스프레이와 이소프로판올을 함유한 펌프 스프레이 등에 대해 기재하고 있다. 한편, 본 발명과 관련하여 실제로 미국에서는 Sentry사에서 Stop that이라는 브랜드로 시판이 되고 있다. 실제 판매 제품은 압축 프로판이 충진된 에어로졸 스프레이로서 상기 논문에 기재했듯이 스프레이를 분사할 때 “쉬익”하는 강한 치찰음(hissing sound)이 나도록 설계되어 있다.
본 발명자들은 안드로스테논을 이용하여 다양한 펌프 스프레이를 제조해 보았는데, 다음과 같은 문제가 있음을 확인할 수 있었다.
첫 번째로 압축 프로판 가스를 충진하고 에탄올을 함유한 에어로졸 스프레이는 화기에 의해 혹은 여름 철 높은 온도에 의해 팽창 및 폭발의 우려가 있었다. 실제 시판되는 제품 설명서에 120℉(섭씨 49℃) 이하에서 보관하게 되어 있으며, 그 이상의 온도에 노출될 경우 폭발의 위험이 있음이 기재되어 있었다. 대한민국 교통안전공단에서 발표한 자료에 의하면 여름철 외부 온도가 35℃일 경우 차량의 실내온도는 47℃에서 92℃까지 올라갈 수 있음이 알려져 있고, 여름철 정오부터 4시간 세워 둔 승용차의 운전석 온도는 68℃, 뒷자석은 53℃로 나타났다. 이는 프로판과 같은 발화점이 낮은 가연성 가스가 압축된 형태의 에어로졸 제제는 일상생활의 여러 환경에서 위험에 노출될 수 있음을 뜻한다.
한편, 상기 미국 등록 특허 US 9,044,395에 나와 있는 펌프 스프레이 제제에 대해서는 다음과 같은 문제점이 확인되었다. 상기 특허의 실시예에 나와 있듯이 0.01%의 안드로스테논을 10%의 이소프로판올이 함유된 수용액에 녹이고자 했으나 용해도가 낮아 맑은 용액을 제조할 수 없었다. 안드로스테논의 수용해도는 실온에서 0.23 μg/mL로 알려져 있으며, 10% 이소프로판올의 수용액에서도 용해도는 0.1 mg/mL에 미치지 못하였다. 이소프로판올의 농도를 30% 이상으로 할 때 가온하여 0.01% 안드로스테논 용액을 맑은 용액으로 제조가 가능했으나 실온에 장시간 두거나 혹은 냉장보관 조건 하에서 짧은 시간에 다시 석출되는 현상이 관찰되었다. 이는 펌프 스프레이 제제를 만들 경우 적정량의 안드로스테논을 안정한 상태로 용해할 수 없다는 결론에 이르게 되며, 이와 같은 낮은 용해도 탓에 실제 제품은 펌프 스프레이가 아닌 에탄올이 함유되고 98%의 프로판이 압축된 에어로졸 스프레이로 가져갔을 것으로 판단된다.
본 발명자들은 안드로스테논 자체로는 이와 같은 용해도 개선에 한계가 있음을 확인하였으며, 펌프 스프레이 제제에서 안드로스테논의 극난용성에 의해 쉽게 석출이 발생하며, 이렇게 석출이 일어난 스프레이를 짖는 개에게 분사할 경우 플라시보 대비 효과가 없음을 또한 실험적으로 확인할 수 있었다.
안드로스테논은 녹는점이 140-145℃인 흰색의 고체이며, 승화성이 있어 고체 상태에서도 사람에게 불쾌감을 줄 수 있는 향을 발산한다. 이 냄새는 땀냄새나 발냄새와 유사하기 때문에 개에 있어서는 물론 호감을 줄 수 있다. 한편 극난용성의 수용해도를 갖고 있고, 알콜이 혼합된 용액에서도 저온 보관 및 실온에서 장기간 보관 시 석출이 발생하기 쉽고, 한 번 석출이 발생한 경우 결정성이 너무 우수해 다시 용해시키기 어렵다.
이에 본 발명자들은 안드로스테논이 갖는 단점들을 모두 극복하고자 하였다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 안드로스테논-바닐린 공결정의 결정다형(polymorphs)을 스크리닝 하였다. 그 결과, 안드로스테논 및 바닐린을 특정 조건 하에서 용매 첨가 분쇄법 및 용매 매개 반응법으로 제조 시 열역학적으로 안정하고, 장기 보관 등의 조건하에서 경시변화에 의한 결정전이가 발생하지 않으며, 우수한 용해도와 웅취가 차폐된 결정성 고체 화합물을 우수한 수율로 얻을 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 안드로스테논 및 바닐린의 공-결정(co-crystal)을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 안드로스테논 및 바닐린의 공-결정(co-crystal)의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 동물 안정용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 동물 진정(안정화) 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 안드로스테논 및 바닐린의 공-결정(co-crystal)을 제공한다:
화학식 1
Figure PCTKR2017001892-appb-I000004
본 발명자들은 안드로스테논-바닐린 공결정의 결정다형(polymorphs)을 스크리닝 하였다. 그 결과, 안드로스테논 및 바닐린을 특정 조건 하에서 용매 첨가 분쇄법 및 용매 매개 반응법으로 제조 시 열역학적으로 안정하고, 장기 보관 등의 조건하에서 경시변화에 의한 결정전이가 발생하지 않으며, 우수한 용해도와 웅취가 차폐된 결정성 고체 화합물을 우수한 수율로 얻을 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 안드로스테논 및 바닐린의 공-결정(co-crystal)은 분말 X선 회절(PXRD)분석 및 시차주사 열량(DSC)분석, 1H-NMR, 그리고 FE-SEM 이미지를 통해 특정된 신규한 결정질 다형체이고, 결정형 1형으로 명명한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 공-결정은 하기 화학식 2로 표시되는 안드로스테논 및 하기 화학식 3으로 표시되는 바닐린이 1:1의 당량(molar ratio)의 격자구조를 이루고 있다:
화학식 2
Figure PCTKR2017001892-appb-I000005
화학식 3
Figure PCTKR2017001892-appb-I000006
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 공-결정은 분말 X선 회절(PXRD)분석에서 2θ회절각이 13.02o± 0.2o, 14.47o± 0.2o, 20.04o± 0.2o 및 21.15o± 0.2o 이고, 시차주사 열량(DSC)분석에서 흡열 개시 온도 72.4℃± 4℃ 및 흡열온도 75.3℃± 4℃의 흡열피크를 갖는다.
본 발명의 안드로스테논 및 바닐린의 공-결정(co-crystal)은 도 1의 분말 X선 회절 패턴을 갖으며, 도 2에 나타내는 것과 같이 특징적인 온도 시차주사 열량계 (DSC) 결과에 의해 식별될 수 있다.
한편, DSC 온도 기록도에 관련하여 보고된 값은 ± 4℃의 차이를 나타낼 수 있는데, 이는 DSC를 통해 관찰된 온도는 승온 속도, 샘플 제조 방법 및 사용한 기기의 종류에 따라 ± 4℃ 범위의 편차를 가질 수 있기 때문이다.
또한, 본 발명의 안드로스테논 및 바닐린의 공-결정(co-crystal)은 도 3의 전계방출형 주사전자현미경(FE-SEM)에 의한 이미지에서 볼 수 있는 바와 같이, 규칙적이지 않은 직사각형의 결정모양을 나타낸다.
전계방출형 주사전자현미경(FE-SEM)에 의해 제공 되어지는 결정모양 이미지는 샘플 제조 기술 및 사용한 특정 기기에 따라 FE-SEM 이미지가 약간의 변형된 형태로 나타내어질 수 있다.
본 발명의 안드로스테논 및 바닐린의 공-결정(co-crystal)을 확인 및 결정하는 가장 합리적인 방법은 분말 X선 회절(PXRD)분석 결과의 특징적인 2θ 회절각을 근간으로 하고, 온도 시차주사 열량계(DSC) 측정 결과와 전계방출형 주사전자현미경(FE-SEM) 측정 이미지 결과에 의해 구체화하는 것이다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 안드로스테논 및 바닐린의 공-결정(co-crystal)은 융점이 75.3℃± 4℃이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 안드로스테논 및 바닐린의 공-결정(co-crystal)의 제조방법을 제공한다: (a) a-1) 안드로스테논 및 바닐린을 혼합하고 분쇄하면서 유기용매를 첨가하는 단계; 또는 a-2) 안드로스테논, 바닐린 및 유기용매를 첨가하여 교반한 후 여과하여 유기용매로 세척하는 단계; 및 (b) 상기 단계 (a)의 결과물을 진공 건조하는 단계.
본 발명의 방법은 상술한 본 발명의 안드로스테논 및 바닐린의 공-결정(co-crystal)을 제조하는 것이기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 반복 기재에 따른 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
이하, 안드로스테논 및 바닐린의 공-결정을 제조하기 위한 본 발명의 방법을 단계별로 상세하게 설명하면 다음과 같다:
우선, 본 발명의 공-결정의 제조 방법은 크게 i) 용매 첨가 분쇄법 또는 ii) 용매 매개 반응법을 통하여 제조할 수 있다.
i) 용매 첨가 분쇄법을 통한 공-결정의 제조 방법은 다음과 같다:
(a) a-1) 안드로스테논 및 바닐린의 혼합, 그리고 분쇄하면서 유기용매의 첨가
우선, 본 발명의 방법은 (a) a-1) 안드로스테논 및 바닐린을 혼합하고 분쇄하면서 유기용매를 첨가하는 단계를 거친다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 바닐린은 안드로스테논에 대하여 0.95 내지 1.10 당량의 몰비로 첨가되며, 보다 바람직하게는 1.0 내지 1.05 당량의 몰비로 첨가된다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 분쇄는 볼밀을 이용하여 온도 30-40℃에서 150-300 rpm의 속도로 실시하고, 보다 바람직하게는 온도 32-38℃에서 200-270 rpm의 속도로 실시하며, 가장 바람직하게는 온도 32-36℃에서 230-250 rpm의 속도로 실시한다.
회전 속도가 150 rpm 미만으로 너무 느릴 경우 균질한 결정형이 형성되지 않을 우려가 있으며, 회전속도가 300 rpm을 초과하여 너무 빠를 경우 마찰 에너지에 의해 분해가 발생할 우려가 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 분쇄는 30-120분 동안 실시하며, 보다 바람직하게는 30-60분 동안 실시한다. 분쇄 시간이 30분 미만으로 너무 짧을 경우 완전한 결정형이 형성되지 않을 우려가 있으며, 반대로 분쇄시간이 120분을 초과하여 너무 길 경우 무정형 또는 유연물질이 생성될 우려가 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 유기용매는 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, n-헵탄, 에틸 아세테이트 및 아세톤으로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합용매이며, 보다 바람직하게는 메탄올, 에탄올 및 아세톤으로 구성된 군으로부터 선택되고, 가장 바람직하게는 메탄올이다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 유기용매는 안드로스테논 및 바닐린 혼합물에 대하여 0.1(부피/중량)배-0.5(부피/중량)배로 첨가된다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 유기용매는 분쇄 전 과정을 통해 3회 내지 10회에 걸쳐 나누어 첨가된다.
ii) 용매 매개 반응법을 통한 공-결정의 제조 방법은 다음과 같다:
(a) a-2) 안드로스테논, 바닐린 및 유기용매의 첨가 및 교반, 그리고 여과하여 유기용매로 세척
또한, 본 발명의 방법은 (a) a-2) 안드로스테논, 바닐린 및 유기용매를 첨가하여 교반한 후 여과하여 유기용매로 세척하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 단계 (a) a-2)는 안드로스테논 및 바닐린에 제 1 유기용매를 첨가하고 교반한 다음 농축하여 현탁액을 제조하고 이에 제 2 유기용매를 첨가하고 교반한 다음 제 3 유기용매로 세척하는 방법으로 실시된다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 단계 (a) a-2)의 바닐린은 안드로스테논에 대하여 0.95 내지 1.10 당량의 몰비로 첨가되며, 보다 바람직하게는 1.0 내지 1.05 당량의 몰비로 첨가된다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 단계 (a) a-2)의 유기용매는 메탄올, 에탄올, 이소프로필알콜, n-부탄올 및 아세톤으로 구성된 군으로부터 선택되고, 보다 바람직하게는 상기 제 1 유기용매는 메탄올, 에탄올, 이소프로필알콜, n-부탄올 및 아세톤으로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합 용매이고, 농축 후 사용하는 제 2 및 3 유기용매는 아세톤 단독, 또는 아세톤과 메탄올, 아세톤과 에탄올 또는 아세톤과 이소프로판올의 혼합용액이다. 가장 바람직하게는 상기 제 1 유기용매는 메탄올이고, 농축 후 사용하는 제 2 및 3 유기용매는 아세톤이다. 한편, 제 2 및 3 유기용매로서 혼합용액을 사용할 경우 아세톤의 비율이 80% (부피/부피) 이상이 되도록 하는 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 제 1 유기용매는 안드로스테논과 바닐린 혼합물에 대하여 5(부피/중량)-10(부피/중량)배로 첨가되고, 상기 현탁액은 전체 용액 중 잔류 용매가 안드로스테논과 바닐린 혼합물에 대하여 0.1(부피/중량)배-0.5(부피/중량)배가 되도록 제조되며, 상기 제 2 유기용매는 안드로스테논과 바닐린 혼합물에 대하여 2.5(부피/중량)-5(부피/중량)배로 첨가되고, 상기 제 3 유기용매는 안드로스테논과 바닐린 혼합물에 대하여 0.5(부피/중량)배-1(부피/중량)배로 첨가된다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 제 1 유기용매를 첨가 후 교반은 25-30℃에서 30분-1시간 동안 실시하고, 상기 제 2 유기용매를 첨가 후 교반은 20-25℃에서 1시간-2시간 동안 실시한다.
(b) 상기 단계 (a)의 결과물의 진공건조
그 다음, 본 발명의 방법은 (b) 상기 단계 (a)의 결과물을 진공건조하는 단계를 포함한다.
상기 단계 (b)의 진공건조 단계는 i) 용매 첨가 분쇄법 또는 ii) 용매 매개 반응법을 통한 공-결정의 제조방법에 공통적으로 포함된다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 진공 건조는 40-45℃에서 10-20시간 동안 실시한다.
이러한 방법으로 안드로스테논 및 바닐린의 공-결정을 제조할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 안드로스테논 및 바닐린의 공-결정(co-crystal)을 유효성분으로 포함하는 동물 안정용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 유효성분은 조성물의 총 중량에 대하여 0.0001 내지 1.0 %로 포함된다. 상기 유효성분의 중량이 0.0001 중량% 미만일 때는 그 효과가 나타나기 어렵고, 1.0 중량%를 초과하는 경우에는 함량의 증가에 따른 효과의 증가가 매우 미약하고, 제형상의 안정성이 확보되지 않는 문제점이 있다.
본 명세서에서 “동물”은 인간을 제외한 동물로서, 바람직하게는 개, 고양이, 말, 새, 호랑이, 사자, 마우스이며, 보다 바람직하게는 개 또는 고양이이고, 가장 바람직하게는 개이다.
본 명세서에서 “동물 안정”은 불안 또는 흥분 등으로 나타나는 짖고 뛰어 오르는(barking and jumping) 것과 같은 부적절한 행동을 교정 또는 진정시키는 것을 의미한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 모두 가능하며, 상기 비경구 주입은 비강 주입, 정맥 내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 주입 등을 포함한다.
상기 약제학적 조성물의 제형은 사용밥법에 따라 달라질 수 있으나, 경고제(Plasters), 과립제(Granule), 산제(Powders), 시럽제(Syrups), 액제(solutions), 유동엑스제(FluidextractsI), 유제(Emulsions), 현탁제(suspensions), 침제(Infusions), 정제(Tablets), 주사제(Injections), 캅셀제(Capsules) 및 환제(Pill)등으로 제조할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 조성물은 스프레이, 에어로졸, 디퓨저 및 서방성 매트릭스(slow release matrix)등으로 제조될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 안드로스테논 및 바닐린의 공-결정(co-crystal)을 유효성분으로 포함하는 동물 안정용 약제학적 조성물을 동물에게 투여하는 단계를 포함하는 동물 진정(relaxing or calming) 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 방법에 의해 제조된 안드로스테논 및 바닐린의 공-결정(co-crystal)을 유효성분으로 포함하는 동물 안정용 약제학적 조성물을 동물에게 투여하는 단계를 포함하는 동물 진정(relaxing or calming) 방법을 제공한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 안드로스테논 및 바닐린의 공-결정(co-crystal), 이의 제조방법 및 이의 용도를 제공한다.
(b) 본 발명의 안드로스테논 및 바닐린의 공-결정은 안드로스테논이 갖는 단점들을 모두 극복하기 위한 것으로서, 특별한 조건 하에서 제조한 안드로스테논 및 바닐린의 공-결정은 단단한 격자 구조를 이루고 있어서 안드로스테논이 갖는 승화성이 사라지며, 이로 인해 원료 상태로 장기간 보관 시에 안정성이 우수하다.
(c) 또한, 안드로스테논의 수용해도가 실온에서 0.23 μg/mL인 것과 비교할 때 안드로스테논 및 바닐린의 공-결정의 수용해도는 안드로스테논으로 환산 시 25 μg/mL 이상으로서 100배 이상 증가했으며, 늘어난 용해도로 인해 펌프 스프레이 제제를 제조 시 완전히 용해되며, 냉장 조건 하에서 장기간 보관하더라도 전혀 석출이 발생하지 않는다.
(d) 그리고, 종래의 안드로스테논 함유 시판 제품이 49℃ 이상에서 폭발의 위험이 있는 것과 비교할 때, 본 발명의 안드로스테논 및 바닐린의 공-결정의 펌프 스프레이 제제는 50℃에서 4주간 보관한 후 HPLC를 사용하여 안드로스테논의 함량을 정량했을 때 초기 대비 함량이 줄지 않고 어떠한 유연물질도 생성되지 않는다.
(e) 기존 안드로스테논이 사람에게 있어 불쾌감을 줄 수 있는 향을 지닌 것과 비교하여도 본 발명의 안드로스테논 및 바닐린 공-결정은 완벽하게 향이 차폐되어 은은한 바닐라향을 갖는다. 한편, 바닐라향은 개가 좋아하는 향의 하나로서 실제로 본 발명의 안드로스테논 및 바닐린의 공-결정을 사용하여 펌프 스프레이를 제조하여 짖고 뛰어 오르는 개에게 분사했을 시 매우 효과적으로 진정시킬 수 있다.
(f) 본 발명의 안드로스테논-바닐린 공결정을 사용한 펌프 스프레이는 기존 시판 제품에서 사용했듯 치찰음을 발생시키는 소음기를 사용하지 않아도 그 효과는 뚜렷했다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따라 제조된 안드로스테논-바닐린 다형체 1형의 분말 X-선 회절 패턴을 나타낸다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따라 제조된 안드로스테논-바닐린의 다형체 1형의 시차 주사 열량측정(DSC) 결과를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따라 제조된 안드로스테논-바닐린의 다형체 1형의 전계방출형 주사전자현미경(FE-SEM) 이미지를 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: 용매 첨가 분쇄법을 이용한 안드로스테논 -바닐린 결정형 1형의 제조
안드로스테논 3 g과 바닐린 1.68 g을 용기에 넣고 지르코니아 볼 20개를 투입하여 회전속도 230-250 rpm, 내부 온도 32-36℃를 유지하면서, 30분간 분쇄하였다. 분쇄하는 과정 중에 메탄올을 0.2 ml씩 5차례에 걸쳐 총 1.0 ml를 첨가하였다. 두 물질을 완전 분쇄한 후 40℃에서 16시간 진공 건조하여 안드로스테논-바닐린 결정형 1형을 수득하였다. 그리고, 상기 안드로스테논-바닐린 결정형 1형은 바닐라 향을 나타내었다.
실시예 2: 용매 매개 반응법을 이용한 안드로스테논-바닐린 결정형 1형의 제조
100 ml 반응기에 안드로스테논 3 g과 바닐린 1.68 g을 투입한 후 메탄올 30 ml를 상온에서 투입한 후 25℃에서 40분 동안 교반 하였다. 그 후 40℃에서 용매를 감압 증발시켜 현탁액으로 만들었다. 이 현탁액에 아세톤 20 ml를 투입한 후 혼합용액을 20℃에서 1시간 동안 교반 한 후, 여과하여 아세톤 4 ml로 세척한 후 40℃에서 16시간 진공 건조하여 안드로스테논-바닐린 결정형 1형을 수득하였다. 그리고, 상기 안드로스테논-바닐린 결정형 1형은 바닐라 향을 나타내었다.
실시예 3: 안드로스테논-바닐린 결정형 1형을 이용한 펌프 스프레이 제제
안드로스테논-바닐린 결정형 1형을 이용한 펌프 스프레이 제제는 통상적인 스프레이 제제의 제조방법에 따라 하기 표 1 및 표 2에 기재된 성분들을 지정된 양으로 하여 제조하였다.
성분 % g
안드로스테논-바닐린 결정형 1형 0.01 0.01
에탄올 10.00 10.00
증류수 89.99 89.99
합 100 % 100
성분 % g
안드로스테논-바닐린 결정형 1형 0.02 0.02
에탄올 20.00 20.00
증류수 79.99 79.99
합 100 % 100
시험예 1: HPLC를 사용한 용해도 측정
용해도 측정을 위해 실시예 1 및 실시예 2의 안드로스테논-바닐린 결정형 1형을 각각 취하여 과포화시킨 수용액을 제조한 후 2분 동안 교반(vortexing)하고14,000 rpm에서 1분 간 원심분리하였다. 상층액은 수성필터로 여과하여 HPLC로 분석하였다. 고정상으로 C-18 guard 컬럼과 연결된 역상 C-18 Capcell-Pak 컬럼에 이동상으로서 90% 아세토니트릴 (0.1% 인산용액)을 1.0 mL/분의 속도로 흘려주었다. 파장은 210 nm에서 UV 흡광도를 측정하여 여액중의 안드로스테논 농도를 정량하였다.
분석 결과, 실시예 1 및 실시예 2의 안드로스테논과 바닐린 공결정의 수용해도는 안드로스테논으로 환산 시 25 μg/mL 이상으로 측정되었다. 이는 안드로스테논의 수용해도가 실온에서 0.23 μg/mL인 것과 비교할 때 100배 이상 증가한 결과로 해석할 수 있다.
시험예 2: 혼합용매에서의 석출안정성 비교 시험
20% EtOH 수용액에 안드로스테논과 안드로스테논-바닐린 공결정을 안드로스테논으로 환산하여 각각 0.01%가 함유되도록 용해하였다. 안드로스테논의 경우 상대적으로 용해 시간이 더 필요하였으며, 50℃까지 온도를 가하여 완전히 용해시킨 후 실온으로 식혔다. 각각의 용액을 실온과 -10℃에서 보관하며, 시간 경과에 따른 고체 석출 여부를 관찰하였다.
안드로스테논은 실온에서 24시간 이후부터 고체 석출이 확인되었으며, -10 ℃에서는 2시간이 지난 시점부터 석출이 관찰되었다. 안드로스테논 용액의 각각의 상층액을 취하여 HPLC로 분석하였을 때 안드로스테논은 검출한계 이하로서 확인되지 않았다. 이는 고유의 용해도에도 미치지 못하는 것으로서 일단 석출된 안드로스테논이 시드(seed)로 작용하여 석출을 더욱 유도한 것으로 해석된다.
반면, 안드로스테논-바닐린 결정형 1형 용액의 경우 실온과 -10℃에서 4주까지 보관했을 시 석출되는 현상이 전혀 관찰되지 않았다. 이는 안드로스테논-바닐린 결정형이 용해도의 개선과 함께 석출 안정성이 매우 우수함을 알 수 있었다.
시험예 3: 안드로스테논-바닐린 결정형 1형 고체 및 액상 조성물의 가혹안정성 시험
실시예 1 및 실시예 2에서 제조한 안드로스테논-바닐린 결정형 1형의 원료들과 실시예 3에서 제조한 두 가지 비율의 조성물을 기밀용기에 담아 각각 50℃에서 4주간 보관하였다. HPLC를 이용하여 각각의 유연물질 발생여부를 확인하였으며, 결정형 원료의 경우 PXRD와 DSC로 결정 전이 여부를 추가로 관찰하였고, 액상 조성물의 경우 초기 대비 함량의 변화를 측정하였다. 결정형 1형의 원료는 초기와 동일한 결정형을 유지함으로써 결정전이가 발생하지 않음을 확인하였으며, 고체 원료 및 두 가지 조성물 모두 초기 대비 유연물질이 생성되지 않았다. 실시예 3의 두 가지 액상 조성물의 경우 초기 대비 4주 후 안드로스테논의 함량에 변화가 없었으며 이는 원료와 조성물 모두 가혹조건하에서 매우 안정하다는 것을 알 수 있었다.
시험예 4: 안드로스테논-바닐린 결정형 1형의 스프레이의 효능 시험
실시예 1에서 제조한 0.01%의 안드로스테논-바닐린 결정형 1형의 원료를 10% 에탄올 수용액의 1/100로 희석하여 스프레이로 제조하였다. 이는 전체 용액 중 안드로스테논-바닐린의 농도가 1 μg/mL이 되도록 희석한 것이다.
주인이 아닌 제 3자에게 심하게 짖는 총 10마리의 애완견을 대상으로 하여 다음과 같이 교차 실험을 진행하였다. 애완견은 푸들 네 마리, 몰티즈 두 마리, 포메라니안 두 마리, 퍼그와 치와와를 각각 한 마리씩으로 구성하였다.
첫 번째는 심하게 짖는 상황에서 10% 에탄올 수용액만 들어 있는 플라시보 펌프 스프레이를 얼굴 주변에 연속하여 3회 분사한 후 반응을 지켜 보았다.
두 번째는 30분 이상의 시간이 경과된 후 역시 심하게 짖는 상황에서 10% 에탄올 수용액에 안드로스테논-바닐린이 1 μg/mL의 농도로 함유되어 있는 펌프 스프레이를 얼굴 주변에 동일한 방식으로 연속하여 3회 분사한 후 반응을 지켜 보았다.
위와 같은 방식으로 각각의 애완견에 대해 플라시보와 시험물질을 각각 두 차례에 걸쳐 분사한 후 1분 이상 짖기를 멈춘 회수를 기록하여 표 3에 기재하였다.
- Dog1 Dog2 Dog3 Dog4 Dog5 Dog6 Dog7 Dog8 Dog9 Dog10
플라시보 0 0 0 2 0 1 0 0 0 1
시험물질 2 1 1 2 2 2 2 0 2 2
표 3에서 볼 수 있듯이 플라시보의 경우 총 20회 중 4회 반응을 확인하였으며, 시험물질의 경우 20회 중 16회에 반응을 확인하였다. 즉, 본 시험에서 플라시보의 반응율은 20%이며, 본 발명에 의한 시험물질의 반응율은 80%에 달한다.
흥미로운 것은 애완견 중 한 마리(몰티즈)는 플라시보와 시험물질 모두에 반응을 했으며, 다른 한 마리(치와와)는 플라시보와 시험물질 모두에 반응을 하지 않았다. 본 시험은 애완견의 개체수를 늘려 진행할 경우 더욱 신뢰할 만한 데이터를 얻을 수 있을 것으로 확인된다.
실험예 1: 분말 X-선 회절 (PXRD)
PXRD 분석(도 1)을 Cu Kα 방사선을 사용하여 (D8 Advance) X-선 분말 회절계 상에서 수행하였다. 기구에는 관 동력이 장치되어 있고, 전류량은 45 kV 및 40 mA 로 설정하였다. 발산 및 산란 슬릿은 1°로 설정하였고, 수광 슬릿은 0.2 mm 로 설정하였다. 5 에서 35° 2θ까지 3°/분 (0.4 초/0.02°간격) 의 θ-2θ 연속 스캔을 사용하였다.
실험예 2: 온도 시차주사 열량법(DSC)
TA사로 부터 입수한 DSC Q20을 사용하여, 질소 정화 하에 20℃ 에서 250℃까지 10℃/min의 스캔속도로, 밀폐 팬에서 DSC 측정(도 2)을 수행하였다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (13)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 안드로스테논 및 바닐린의 공-결정(co-crystal):
    화학식 1
    Figure PCTKR2017001892-appb-I000007
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 공-결정은 하기 화학식 2로 표시되는 안드로스테논 및 하기 화학식 3으로 표시되는 바닐린이 1:1의 당량(molar ratio)의 격자구조를 이루고 있는 것을 특징으로 하는 안드로스테논 및 바닐린의 공-결정(co-crystal):
    화학식 2
    Figure PCTKR2017001892-appb-I000008
    화학식 3
    Figure PCTKR2017001892-appb-I000009
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 공-결정은 분말 X선 회절(PXRD)분석에서 2θ회절각이 13.02o± 0.2o, 14.47o± 0.2o, 20.04o± 0.2o 및 21.15o± 0.2o 이고, 시차주사 열량(DSC)분석에서 흡열 개시 온도 72.4℃± 4℃ 및 흡열온도 75.3℃± 4℃의 흡열피크의 흡열 피크를 갖는 것을 특징으로 하는 안드로스테논 및 바닐린의 공-결정(co-crystal).
  4. 다음의 단계를 포함하는 안드로스테논 및 바닐린의 공-결정(co-crystal)의 제조방법:
    (a) a-1) 안드로스테논 및 바닐린을 혼합하고 분쇄하면서 유기용매를 첨가하는 단계; 또는 a-2) 안드로스테논, 바닐린 및 유기용매를 첨가하여 교반한 후 여과하여 유기용매로 세척하는 단계; 및
    (b) 상기 단계 (a)의 결과물을 진공 건조하는 단계.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 단계 (a) a-1) 및 a-2)의 바닐린은 상기 안드로스테논에 대하여 0.95 내지 1.10 당량의 몰비로 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 4 항에 있어서, 상기 단계 (a) a-1)의 유기용매는 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, n-헵탄, 에틸 아세테이트 및 아세톤으로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합용매이고, 상기 단계 (a) a-2)의 유기용매는 메탄올, 에탄올, 이소프로필알콜, n-부탄올 및 아세톤으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 4 항에 있어서, 상기 단계 (b)의 진공 건조는 40-45℃에서 10-20시간 동안 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 안드로스테논 및 바닐린의 공-결정(co-crystal)을 유효성분으로 포함하는 동물 안정용 약제학적 조성물.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 유효성분은 조성물의 총 중량에 대하여 0.0001 내지 1.0 %로 포함되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제 8 항에 있어서, 상기 동물은 개 또는 고양이 인 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. 제 8 항에 있어서, 상기 조성물의 제형이 스프레이, 에어로졸, 디퓨저 및 사방성 매트릭스(slow release matrix)로 구성된 군으로 선택되는 제형인 것을 특징으로 하는 조성물.
  12. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 안드로스테논 및 바닐린의 공-결정(co-crystal)을 유효성분으로 포함하는 동물 안정용 약제학적 조성물을 동물에게 투여하는 단계를 포함하는 동물 진정 방법.
  13. 제 4 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 안드로스테논 및 바닐린의 공-결정(co-crystal)을 유효성분으로 포함하는 동물 안정용 약제학적 조성물을 동물에게 투여하는 단계를 포함하는 동물 진정 방법.
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