WO2017146033A1 - 体液由来ｍｉＲＮＡの品質を評価する方法 - Google Patents

体液由来ｍｉＲＮＡの品質を評価する方法 Download PDF

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聡子 小園
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Definitions

  • the present invention relates to a method for evaluating the quality of miRNA derived from a body fluid sample.
  • MiRNA is transcribed from genomic DNA as RNA (precursor) with a hairpin-like structure. This precursor is cleaved by a dsRNA cleaving enzyme (Drosha, Dicer) having a specific enzyme RNase III cleavage activity, then changed to a double-stranded form, and then becomes a single strand.
  • a dsRNA cleaving enzyme Rosha, Dicer
  • RNase III RNase III cleavage activity
  • One of the antisense strands is incorporated into a protein complex called RISC and is considered to be involved in mRNA translational suppression.
  • miRNA has a different form at each stage after transcription.Therefore, when miRNA is targeted for detection, various forms such as a hairpin structure, a double-stranded structure, and a single-stranded structure are usually used. It is necessary to consider. miRNA consists of RNA of 15 to 25 bases, and its existence has been confirmed in various organisms.
  • miRNAs are present not only in cells but also in body fluids such as serum, plasma, urine, spinal fluid, which are specimens that do not contain cells, and their expression levels are various in various diseases including cancer.
  • body fluids such as serum, plasma, urine, spinal fluid, which are specimens that do not contain cells
  • their expression levels are various in various diseases including cancer.
  • biomarker search research for body fluids such as serum / plasma, urine, spinal fluid, etc. has been carried out using the DNA microarray method, and development to biomarker tests that can detect diseases early is expected. .
  • RNA is a substance that is easily degraded by various physical and chemical factors such as heat, degrading enzymes, and freeze-thaw.
  • RNA degradation is the amount of expression. It is known to affect measurements. In a test that measures the expression level of miRNA contained in body fluids as a disease biomarker, if the test and diagnosis are based on the measurement value of the expression level with uncertainty, the opportunity for appropriate treatment is missed. Or applying the wrong medical care may impose unnecessary financial and physical burden on the patient. Therefore, in order to accurately measure the expression level, it is extremely important to use a specimen in which the miRNA targeted for the test is not degraded for the test.
  • Patent Document 1 proposes a method for quantitatively evaluating the degradation degree of RNA from the difference in length of the RNA segment. Here, when the nucleotide is degraded, the segment length is shortened. Utilizes the characteristics of long RNA.
  • the conventional method described above is a method using ribosomal RNA or long RNA, and ribosomal RNA or long RNA is RNA present in the nucleus or cytoplasm, such as serum, plasma, urine, It hardly exists in body fluid samples such as spinal fluid. Therefore, according to this conventional method, it was not possible to accurately measure the degradation degree of miRNA contained in a body fluid sample and evaluate the quality.
  • An object of the present invention is to find a technique for evaluating the quality by measuring the degree of degradation of miRNA contained in a body fluid sample when the body fluid sample is not suitable for the conventional method.
  • the present inventors measured the amount of miRNA whose abundance varies depending on the degradation of a nucleic acid sample contained in a body fluid specimen (hereinafter referred to as “reference miRNA”). As a result, it was found that the quality of the target miRNA can be evaluated, and the present invention has been completed. That is, the present invention uses at least one of the miRNAs shown in SEQ ID NOs: 1 to 12 as a reference miRNA, and the amount of the reference miRNA in the body fluid sample and the standard body fluid sample in a state where degradation of the nucleic acid sample has not progressed. This is a method for evaluating the quality of miRNA by comparing the amount of miRNA in the medium, and includes the following embodiments.
  • a method for evaluating the quality of miRNA derived from a body fluid sample, A bodily fluid sample and a standard bodily fluid of one or more reference miRNAs selected from miRNAs consisting of the base sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 12 using an miRNA-containing RNA sample prepared from the bodily fluid sample and the standard bodily fluid sample A measurement process for measuring the abundance in each specimen; A body fluid sample and a standard by comparing the abundance measurement value or representative value of one or more reference miRNAs in a body fluid sample with an abundance measurement value or representative value of one or more reference miRNAs in a standard body fluid sample A comparison step of obtaining a difference or ratio of one or more reference miRNA abundance measurement values or representative values thereof between body fluid samples; and one or a plurality of reference miRNA abundance measurement values obtained in the comparison step Or the said method including the determination process of determining the quality of miRNA derived from a bodily fluid specimen based on the difference or ratio of the representative value.
  • the comparison step includes a difference or ratio of abundance measurement values of one reference miRNA, a difference or ratio of abundance measurement values of each of a plurality of reference miRNAs, or a representative value of abundance measurement values of a plurality of reference miRNAs
  • the method according to (1) which is a step of obtaining a difference or ratio.
  • the determining step includes comparing a difference or ratio of the abundance measurement value of the one or more reference miRNAs or a representative value thereof with a threshold value determined in advance as a reference, (1) or (2 ) Described method.
  • the difference is obtained by subtracting the measured amount of the abundance in the standard body fluid sample or the representative value from the measured amount of the abundance in the sample of the body fluid or the representative value thereof, or the presence in the sample of the body fluid 4.
  • the determination step includes comparing a difference or ratio of the abundance measurement value of the one or more reference miRNAs or a representative value thereof with a threshold value determined in advance as a reference, wherein the difference or ratio is The method according to (4), wherein when the threshold value is exceeded, the quality of the miRNA derived from the body fluid sample is determined to be good.
  • the representative values of the abundance measurement values of the plurality of reference miRNAs in the body fluid sample and the standard body fluid sample are the average value or median value of the abundance measurement values of the plurality of reference miRNAs, respectively (1) to ( 5. The method according to any one of 5).
  • the measurement step includes correcting the abundance measurement value of one or a plurality of reference miRNAs in the body fluid sample and the standard body fluid sample, and the subsequent steps are performed using the corrected measurement value.
  • the measurement step comprises: a probe for capturing the one or more reference miRNAs immobilized on a support; and a nucleic acid sample extracted from the body fluid sample and the standard body fluid sample and labeled with a labeling substance.
  • the method according to any one of (1) to (7) comprising measuring the abundance of the one or more reference miRNAs in the body fluid sample and the standard body fluid sample by performing hybridization by bringing them into contact with each other. the method of.
  • the measuring step includes measuring the abundance of the target miRNA in the bodily fluid sample simultaneously with measuring the abundance of the one or more reference miRNAs in the bodily fluid sample. ) Any one of the methods. (10) The method according to (9), wherein the measurement step includes correcting the abundance measurement value of the target miRNA in the body fluid sample. (11) In the measurement step, a probe for capturing a target miRNA and a probe for capturing the one or more reference miRNAs immobilized on a support, and extracted from a body fluid sample and labeled with a labeling substance The method according to (9) or (10), comprising measuring the abundance of the target miRNA and the one or more reference miRNAs in the body fluid sample by bringing the nucleic acid sample into contact with each other and performing hybridization Method.
  • a miRNA quality evaluation chip comprising a support on which a probe for capturing one or a plurality of reference miRNAs selected from miRNAs consisting of base sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 12 is immobilized.
  • the present invention it is possible to evaluate the quality of miRNA contained in a body fluid specimen, which was difficult with the conventional method.
  • the present invention is a method for evaluating the quality (degree of degradation) of a miRNA derived from a body fluid sample, wherein one or a plurality of miRNAs selected from the miRNAs having the base sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 12 are used as reference miRNAs.
  • the abundance of the reference miRNA in the body fluid sample can be examined by measuring the amount of the reference miRNA in the RNA sample extracted from the body fluid sample.
  • quality of miRNA in body fluid samples “quality of miRNA in body fluid samples” and “quality of miRNA from body fluid samples” are synonymous with the terms miRNA quality in RNA samples extracted from body fluid samples It is.
  • the quality of miRNA contained in a body fluid sample is evaluated in advance in gene expression analysis, for example, analysis using an array chip such as a microarray, analysis by polymerase chain reaction (PCR) method, or sequencing method. It can be used to determine the suitability of performing these analyses.
  • gene expression analysis for example, each miRNA is labeled using a support on which a miRNA in a body fluid is labeled and a probe for capturing one or more target miRNAs and a probe for capturing a reference miRNA are fixed.
  • Measuring the expression level of the target miRNA performing an amplification reaction using a primer for amplifying one or more target miRNAs and a primer for amplifying the reference miRNA, and measuring the expression level of the target miRNA, etc. Furthermore, analysis of gene expression and testing using these results, for example, testing for measuring clinical specimens to grasp the pathological condition are included.
  • RNA is a kind of non-coding RNA (ncRNA) which means a short RNA of about 15 to 25 bases produced in vivo, and is considered to have a function of regulating the expression of mRNA.
  • miRNA is transcribed from genomic DNA as RNA (precursor) with a hairpin-like structure. This precursor is cleaved by a dsRNA cleaving enzyme (Drosha, Dicer) having a specific enzyme RNase III cleavage activity, then changed to a double-stranded form, and then becomes a single strand.
  • RISC protein complex
  • miRNA has different aspects at each stage after transcription. Therefore, when miRNA is targeted (detection target), normally, such as a hairpin structure, a double-stranded structure, a single-stranded structure, etc. Various forms need to be considered. The presence of miRNA has been confirmed in various organisms.
  • the body fluid sample to which the present invention can be applied is a body fluid sample separated from a living body, and examples thereof include body fluids such as blood, serum, plasma, urine, spinal fluid, saliva, wipes, and various tissue fluids. It is not limited to.
  • the type of living body from which the body fluid specimen is derived is not particularly limited and includes various biological species, but is typically a mammal, particularly a human.
  • miRNAs are decomposed by various direct and indirect factors, including temperature and heat, external forces such as vibration and ultrasonic waves, and electric and magnetic fields.
  • the cause of quality degradation is not limited to these.
  • RNA can be extracted from these specimens and the miRNA expression level can be measured using this RNA.
  • RNA extraction may be performed by a known method (for example, the method of Favaloro et al. (Favaloro et. Al., Methods Enzymol. 65: 718 (1980))) or various commercially available kits for RNA extraction (for example, Qiagen). MiRNeasy of Toray Industries, Inc., “3D-Gene” “RNA” extraction “reagent” from “liquid” sample, etc.
  • the abundance of one or a plurality of reference miRNAs selected from the miRNA consisting of the base sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 12 in the body fluid sample, and the miRNA consisting of the base sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 12 The abundance in the standard body fluid sample of one or more reference miRNAs selected from is measured. Further, simultaneously with the measurement of the abundance of the reference miRNA in the body fluid sample, the abundance of the target miRNA and the abundance of the standard nucleic acid for correction described later may be measured.
  • the miRNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NOs: 1 to 12 used as the reference miRNA in the present invention is a miRNA selected as a miRNA whose abundance decreases depending on the degradation of the nucleic acid sample in the body fluid sample.
  • a miRNA selected as a miRNA whose abundance decreases depending on the degradation of the nucleic acid sample in the body fluid sample.
  • the correlation between degraded RNA and undegraded RNA decreases, for example, the correlation coefficient is 0.95 or less.
  • the reference miRNA used in the present invention is an miRNA whose abundance varies (decreases) in correlation with such RNA degradation.
  • miRNA is preferable in which the ratio of expression level before and after RNA degradation is preferably 0.8 or less, more preferably 0.7 or less.
  • an miRNA whose abundance is greatly reduced depending on the storage time in the serum state can be preferably selected.
  • miRNAs whose abundance decreases depending on the storage time for example, serum samples prepared after blood collection are stored in a refrigerator (eg, 4 ° C.), and after storage, 0 hours, 6 hours, 12 hours, and 24 hours Thereafter, it can be selected by measuring the abundance of miRNA after 7 days every other day and comparing the degree of decrease. If the serum sample is stored in the refrigerator for a longer period, the miRNA abundance can be measured and compared to that period, for example, by extending the storage time to 2 weeks or 1 month later. Good.
  • the abundance of miRNAs obtained from sera with different storage times can be determined by applying statistical methods and comparing miRNAs whose decrease in abundance over time is statistically significant by comparison between groups in gene expression analysis. Can be selected. For example, a statistical analysis method based on a commonly used t test may be used. For example, the statistical language “R” package “SAM” (Tusher VG et. Al., Proc Natl Acad Sic USA. 2001 98 (9) 5116-5121) can be applied as it is.
  • one or a plurality of reference miRNAs selected from 12 specific miRNAs selected by the inventors of the present application, preferably 12 types of miRNAs comprising the base sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 12 are used.
  • the abundance in the body fluid sample and the standard body fluid sample is measured.
  • a standard body fluid sample is a sample in which degradation of a nucleic acid sample has not progressed, and is a sample that is used as a criterion for determining the quality of miRNA contained in a body fluid sample as compared to a body fluid sample.
  • the standard body fluid specimen for example, the same specimen that has just been obtained or prepared as a target body fluid specimen and in which the degradation of the nucleic acid sample contained therein has not progressed can be used.
  • a specimen prepared from the same kind of body fluid as a separate body of the same biological species can be used.
  • a bodily fluid specimen of the same species that is commercially available as a standard product may be obtained and used.
  • the body fluid sample is serum (blood)
  • the sample immediately after the serum sample is prepared sample immediately after 0 hours of storage time
  • a serum sample immediately after being prepared from a separate body of the same species after storage time 0 hours
  • commercially available serum may be used.
  • probes for capturing nucleic acids such as a reference miRNA, a target miRNA described later, and a standard nucleic acid for correction are also collectively referred to as “capture probes” or simply “probes”.
  • Measurement of the abundance of miRNA can be performed, for example, by a hybridization assay using an array chip such as a microarray in which a probe that specifically binds to the target miRNA is immobilized on a support.
  • an array chip including a support on which a “reference miRNA capture probe” for capturing one or more reference miRNAs is immobilized can be used.
  • an array chip including a support on which a “target miRNA capture probe” for capturing a target miRNA described later and a “standard nucleic acid capture probe for correction” for capturing a standard nucleic acid for correction are further immobilized. Also good.
  • Capture probe or “probe for capturing” means a substance capable of binding directly or indirectly, preferably directly and selectively to the miRNA to be captured.
  • Nucleic acids, proteins, saccharides and other antigenic compounds In the present invention, a nucleic acid probe can be preferably used.
  • nucleic acid derivatives such as PNA (peptide nucleic acid) and LNA (LockedLNucleic ⁇ ⁇ Acid) can be used as the nucleic acid.
  • a derivative means a labeled derivative with a fluorophore, a modified nucleotide (for example, a nucleotide containing a group such as halogen, alkyl such as methyl, alkoxy such as methoxy, thio, carboxymethyl, etc.)
  • a chemically modified derivative such as a derivative comprising a nucleotide having undergone a constitution, saturation of a double bond, deamination, substitution of an oxygen molecule with a sulfur molecule, and the like.
  • the chain length of the nucleic acid probe is preferably not less than the length of the miRNA to be detected from the viewpoint of ensuring the stability and specificity of hybridization. Usually, if the chain length is about 17 to 25 bases, the probe can sufficiently exhibit selective binding to the target miRNA. Such an oligonucleic acid probe having a short chain length can be easily prepared by a known chemical synthesis method or the like.
  • the nucleic acid probe has a base sequence that is completely complementary to the target miRNA. However, even if there are some differences, the base is highly homologous enough to hybridize with the target miRNA under stringent conditions. Any array can be used as a capture probe.
  • the stringency during hybridization is a function of temperature, salt concentration, probe chain length, GC content of the nucleotide sequence of the probe, and the concentration of the chaotropic agent in the hybridization buffer.
  • the conditions described in Sambrook, J. et al. (1998) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York can be used. .
  • Stringent temperature conditions are about 30 ° C or higher.
  • Other conditions include the hybridization time, the concentration of the detergent (eg, SDS), the presence or absence of carrier DNA, and various stringencies can be set by combining these conditions.
  • Those skilled in the art can appropriately determine conditions for obtaining a function as a capture probe prepared for detection of a desired sample RNA.
  • miRNA sequence information can be obtained from databases such as GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) and miRBase website (http://www.mirbase.org/). it can.
  • GenBank http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/
  • miRBase website http://www.mirbase.org/. It can.
  • a reference miRNA capture probe, a target miRNA capture probe, and a standard nucleic acid capture probe for correction can be designed based on sequence information available from these sites.
  • the number of miRNA capture probes immobilized on the support is not particularly limited.
  • the abundance of miRNA may be measured using a fixed number of miRNA capture probes covering all known miRNAs whose sequences have been identified on a support, or for testing purposes, etc. Accordingly, a desired number of miRNA capture probes immobilized on a support may be used.
  • the same support as that used in known microarrays and macroarrays can be used.
  • a slide glass, a membrane, beads or the like can be used. it can.
  • a support having a shape having a plurality of convex portions on the surface described in Japanese Patent No. 4244788 can also be used.
  • the material of the support is not particularly limited, and examples thereof include inorganic materials such as glass, ceramic, and silicon; polymers such as polyethylene terephthalate, cellulose acetate, polycarbonate, polystyrene, polymethyl methacrylate, and silicone rubber.
  • a method for immobilizing a capture probe on a support there are known a method of synthesizing oligo DNA on the surface of the support and a method of dropping oligo DNA synthesized in advance on the surface of the support and immobilizing it.
  • the former method examples include the method of Ronald et al. (US Pat. No. 5,705,610), the method of Michel et al. (US Pat. No. 6,142,266), and the method of Francesco et al. (US Pat. No. 7037659).
  • the support since an organic solvent is used during the DNA synthesis reaction, the support is preferably made of a material resistant to the organic solvent.
  • DNA synthesis is controlled by irradiating light from the back surface of the support, and therefore the support is preferably made of a light-transmitting material.
  • Examples of the latter method include the method of Hirota et al. (Patent No. 3922454) and a method using a spotter.
  • Examples of the spot method include a pin method based on mechanical contact of a pin tip with a solid phase, an ink jet method utilizing the principle of an ink jet printer, and a capillary method using a capillary tube.
  • post-treatment such as cross-linking by UV irradiation and surface blocking is performed as necessary.
  • a functional group such as an amino group or SH group is introduced at the end of the oligo DNA.
  • the surface modification of the support is usually performed by treatment with a silane coupling agent having an amino group or the like.
  • sample-derived nucleic acid sample For hybridization with each miRNA capture probe immobilized on a support, a nucleic acid sample labeled with a labeling substance (sample-derived nucleic acid sample) is prepared from RNA extracted from the sample, and the labeled nucleic acid sample is probed. It is carried out by contacting with.
  • the “sample-derived nucleic acid sample” includes not only RNA extracted from the sample, but also cDNA and cRNA prepared from the RNA by a reverse transcription reaction.
  • the labeled sample-derived nucleic acid sample may be a sample obtained by directly or indirectly labeling a sample RNA with a labeling substance, or a cDNA or cRNA prepared from the sample RNA may be directly or indirectly labeled with a labeling substance. It may be labeled.
  • Methods for binding a labeling substance to a sample-derived nucleic acid sample include binding a labeling substance to the 3 ′ end of the nucleic acid sample, binding a labeling substance to the 5 ′ end, and incorporating a nucleotide bound to the labeling substance into the nucleic acid.
  • An enzyme reaction can be used in the method of binding a labeling substance to the 3 'end and the method of binding a labeling substance to the 5' end.
  • T4-RNA Ligase, Terminal Deoxitidil Transferase, Poly A-polymerase, etc. can be used.
  • any labeling method can be referred to the method described in “Shao-YaoYYing, edited by miRNA experiment protocol, Yodosha, 2008”.
  • kits for binding a labeling substance directly or indirectly to the end of RNA are commercially available.
  • 3D-Gene ”miRNA labeling kit Toray Industries, Inc.
  • miRCURY miRNA HyPower labeling kit Exicon
  • NCode miRNA Labeling system Life Technologies) Co., Ltd.
  • FlashTag Biotin RNA Labeling Kit Genesphere
  • cDNA or cRNA incorporating a labeled substance is prepared by synthesizing cDNA or cRNA from sample RNA in the presence of labeled deoxyribonucleotides or labeled ribonucleotides, and this is arrayed.
  • a method of hybridizing with the above probe is also possible.
  • examples of labeling substances that can be used include various labeling substances that are also used in known microarray analysis. Specific examples include fluorescent dyes, phosphorescent dyes, enzymes, and radioisotopes, but are not limited thereto. Preferred are fluorescent dyes that are easy to measure and easy to detect. Specifically, cyanine (cyanine 2), aminomethylcoumarin, fluorescein, indocarbocyanine (cyanine 3), cyanine 3.5, tetramethylrhodamine, rhodamine red, Texas red, indocarbocyanine (cyanine 5), cyanine Examples include, but are not limited to, 5.5, cyanine 7, and known fluorescent dyes such as oyster.
  • semiconductor fine particles having a light emitting property may be used as the labeling substance.
  • semiconductor fine particles include cadmium selenium (CdSe), cadmium tellurium (CdTe), indium gallium phosphide (InGaP), silver indium zinc sulfide (AgInZnS), and the like.
  • the nucleic acid sample derived from the specimen labeled as described above is brought into contact with the miRNA capture probe on the support, and the nucleic acid sample and the probe are hybridized.
  • This hybridization step can be performed in the same manner as in the past.
  • the reaction temperature and time are appropriately selected according to the chain length of the nucleic acid to be hybridized, but in the case of nucleic acid hybridization, it is usually about 30 ° C. to 70 ° C. for 1 minute to several tens of hours.
  • Hybridization is performed, and after washing, the signal intensity from the labeling substance in each probe-immobilized region on the support is detected.
  • the signal intensity is detected using an appropriate signal reader according to the type of labeling substance.
  • a fluorescent dye is used as a labeling substance
  • a fluorescence microscope or a fluorescence scanner may be used.
  • Measured value of detected fluorescence intensity is compared with ambient noise. Specifically, the measured value obtained from the probe-immobilized region is compared with the measured value obtained from other positions, and the case where the former numerical value is exceeded is detected (effective determination positive). .
  • the background noise may be subtracted.
  • the ambient noise can be subtracted from the detected measurement value as background noise.
  • the measurement values of the target miRNA and reference miRNA obtained in the measurement step may be used as they are in the comparison step and determination step described later.
  • the expression analysis of the target miRNA in a body fluid sample is performed.
  • the measurement value of the target miRNA and the measurement value of the reference miRNA may be corrected, the corrected measurement value may be used as the expression level, and the comparison process and the determination process may be performed using this expression level. That is, the measurement step may include a process of correcting the measurement values of the target miRNA and the reference miRNA.
  • a conventional method can be used, and examples thereof include a global normalization method and a quantile normalization method in which correction is performed using measured values of all detected miRNAs.
  • housekeeping RNAs such as U1 snoRNA, U2 snoRNA, U3 snoRNA, U4 snoRNA, U5 snoRNA, U6 snoRNA, 5S rRNA, 5.8S rRNA (see JP 2007-75095; , Specific corrective endogenous miRNAs (Roberts, TC et al., 2014, PLoS ONE, Vol. 9 (2), e89237; Chen, X. et al., 2013, PLoS ONE, Vol.
  • Endogenous means not naturally added to the specimen, but naturally present in the specimen.
  • endogenous miRNA refers to miRNA that is naturally present in the specimen and is derived from the organism that provided the specimen.
  • the abundance measurement value or representative value of one or more reference miRNAs in the body fluid sample obtained in the measurement step is used as the abundance measurement value of one or more reference miRNAs in the standard body fluid sample.
  • This is a step of obtaining a difference or ratio between the measured value of the amount of each reference miRNA in both specimens or the representative value thereof as compared with the value or the representative value thereof.
  • the difference or ratio of the reference miRNA abundance measurement value or its representative value typically refers to the difference or ratio obtained by the following equation.
  • the difference or ratio may be calculated by the following formulas I ′ and II ′ in which the calculation order is reversed instead of the formulas I and II.
  • Difference in measured amount of reference miRNA or a representative value thereof (measured amount or representative value in a standard body fluid sample) ⁇ (measured amount or representative value in a body fluid sample) (formula I ′)
  • Reference miRNA abundance measurement value or ratio of representative values thereof (abundance measurement value or representative value in standard body fluid specimen) / (abundance measurement value or representative value in body fluid specimen) (formula II ′)
  • the difference or ratio of the measured value or representative value of the reference miRNA may be converted to a logarithmic value after calculating the difference or ratio, or the difference or ratio is calculated after logarithmically converting the abundance in the sample first. May be.
  • the logarithmic value means a value converted to a logarithm with a base of 2.
  • the abundance measurement of the reference miRNA contained in the body fluid sample is performed.
  • the difference or ratio between the measured value and the abundance measurement value of the reference miRNA contained in the standard body fluid sample may be obtained and used for the determination.
  • the representative values of the abundance measurement values of the plurality of reference miRNAs contained in the body fluid sample and the abundance measurement values of the plurality of reference miRNAs contained in the standard body fluid sample A representative value can be obtained and a difference or ratio between the two representative values can be obtained and used for determination.
  • an average value or a median value can be used as described later.
  • the difference or ratio between the abundance measurement value in the body fluid sample and the abundance measurement value in the standard body fluid sample is determined for each reference miRNA, and in the next determination step, the determination is performed according to the predetermined standard for each reference miRNA.
  • the quality of miRNA contained in the body fluid sample can be determined.
  • the abundance measurement value or representative value of one or more reference miRNAs in the body fluid sample obtained in the comparison step, and the abundance measurement of one or more reference miRNAs in the standard body fluid sample This is a step of determining the quality of miRNA contained in the body fluid sample based on the difference or ratio with the value or the representative value.
  • the determination of the quality of miRNA is a standard for determining the quality of one or more reference miRNA abundance measurement values or the difference or ratio between the representative miRNAs contained in the body fluid sample and the standard body fluid sample.
  • a threshold value is set in advance, and quality (good or bad) can be determined based on whether or not the threshold value is exceeded.
  • the quality of miRNA contained in a body fluid sample is good when the difference or ratio of the measured amount of the reference miRNA obtained by the above formula I or formula II or the representative value thereof exceeds a predetermined threshold value. If it is determined that there is a difference or ratio between the measured amount of the reference miRNA or the representative value thereof or less than the threshold value, the quality of the miRNA contained in the body fluid sample can be determined to be poor.
  • the quality of miRNA contained in the body fluid specimen is lower when the difference or ratio falls below a predetermined threshold value. When it is determined to be good and the difference or ratio is equal to or greater than the threshold value, it is possible to determine that the quality of the miRNA contained in the body fluid sample is poor.
  • the difference or ratio between the abundance measurement values of each reference miRNA obtained in the comparison step or the representative value thereof may be converted into a logarithm, and the determination may be performed using the logarithmic value.
  • the comparison step When one miRNA is used as the reference miRNA among the miRNAs having the base sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 12, in the comparison step, the abundance measurement value of the reference miRNA contained in the body fluid sample and the standard body fluid sample are used. The difference or ratio of the abundance measurement values of the reference miRNA included is obtained, and whether or not the difference or ratio exceeds the reference threshold (in the case of Formula I, II) or is lower (Formula I In case of “, II”), the quality can be judged.
  • representative values of the abundance measurement values of the plurality of reference miRNAs contained in the body fluid sample and standard body fluids Obtain a representative value of the abundance measurement values of the multiple reference miRNAs contained in the specimen, and whether the difference or ratio of these representative values exceeds the reference threshold (in the case of Formulas I and II) or below (In the case of formulas I ′ and II ′), quality can be determined.
  • the representative value an average value or a median value of the abundances of a plurality of reference miRNAs can be used as the representative value.
  • the abundance measurement value and the standard body fluid sample contained in the body fluid sample for each reference miRNA may be obtained, and whether or not the reference threshold value is exceeded or not for each reference miRNA may be determined. In this case, it is preferable to provide further judgment criteria by prioritizing or weighting individual judgments based on a plurality of reference miRNAs.
  • one reference miRNA may be arbitrarily selected from the miRNAs shown in SEQ ID NOs: 1 to 12. However, it is possible to select one that significantly decreases the abundance depending on the storage time.
  • hsa-miR-125a-3p SEQ ID NO: 1
  • hsa-miR-125b-1-3p SEQ ID NO: 2
  • it is preferable to use a plurality of reference miRNAs For example, it is more preferable to use 2 to 5 reference miRNAs, and it is particularly preferable to select two of hsa-miR-125a-3p and hsa-miR-125b-1-3p.
  • the reference miRNA is selected from the miRNA excluding the target miRNA. Just choose.
  • the threshold value used as a criterion for determination can be arbitrarily set according to the purpose of the evaluation and the required accuracy.
  • the abundance measurement value of the reference miRNA contained in the standard body fluid sample can be set as the threshold value.
  • the abundance measurement of the reference miRNA in the body fluid sample and the presence of the reference miRNA in the standard body fluid sample It can be compared with the quantity measurement value to determine the quality.
  • the ratio (e / E) of the measured amount of the reference miRNA in the body fluid sample e to the amount of the measured amount of the reference miRNA in the standard body fluid sample (e / E) is obtained, and this value exceeds the threshold t1.
  • the threshold t1 is preferably 0.7 or more, and more preferably 0.8 or more.
  • a difference (e ⁇ E) between the measured amount e of the reference miRNA in the body fluid sample and the measured amount E of the reference miRNA in the standard body fluid sample is obtained, and this value is the threshold t2.
  • the quality of miRNA contained in a body fluid sample can be determined to be good when the value exceeds. Since the abundance may vary depending on the type of miRNA, the threshold t2 can be arbitrarily set according to the reference miRNA used for determination. For example, the threshold value t2 can be set in the range of -50 or more and 0 or less, and can be set in the range of -20 or more and 0 or less when the determination is made based on a stricter standard.
  • the quality of the miRNA contained in the body fluid sample can be determined to be good.
  • e-E> t2 (Formula 2A)
  • the reference miRNA abundance measurement value E in the standard body fluid sample may be adopted as the threshold t3, in which case the reference miRNA abundance measurement value e in the body fluid sample is the threshold as shown in Equation 3A. If the measured amount E of the reference miRNA in the standard body fluid sample exceeds t3, the quality of the miRNA contained in the body fluid sample can be determined to be good. This corresponds to the case where the threshold value t2 is set to 0 in Equation 2A. Therefore, Formula 3A corresponds to one mode of Formula 2A. That is, Equation 3A corresponds to the determination based on the difference in the abundance measurement values.
  • e> E ( t3) (Formula 3A)
  • non-degradation is a stable miRNA that does not depend on RNA degradation. The determination may be made using “endogenous miRNA”).
  • Non-degraded endogenous miRNA is miRNA in which a constant amount is contained in a body fluid sample irrespective of its type, and preferably contained before RNA degradation (immediately after obtaining or preparing the sample, etc.) A point in time when degradation of the nucleic acid sample has not progressed and after RNA degradation (a certain time has elapsed since the sample was obtained or prepared, and the degradation of the nucleic acid sample contained therein is expected to have progressed) MiRNA having a ratio of the abundance measurement value to 0.90 or more, more preferably 0.95 or more can be selected.
  • hsa-miR-149-3p consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 25
  • hsa-miR-4463 consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 26, etc.
  • the “correction endogenous miRNA” used in the correction process can be commonly used as “non-degraded endogenous miRNA”.
  • the abundance measurement value e of the reference miRNA in the body fluid sample and the non-degradation The ratio of the abundance measurement value c of the endogenous miRNA (abundance ratio e / c) and the abundance measurement value E of the reference miRNA in the standard body fluid sample and the abundance measurement value C of the non-degraded endogenous miRNA.
  • the ratio (abundance ratio E / C) is obtained, and when the ratio of each of these two abundance ratios exceeds the threshold value t4, the quality of the miRNA contained in the body fluid sample can be determined to be good.
  • the difference between the measured amount e of the reference miRNA in the body fluid sample and the measured amount c of the non-degraded endogenous miRNA (the amount of difference e ⁇ c), and the standard body fluid sample The difference (abundance difference EC) between the abundance measurement E of the reference miRNA and the abundance measurement C of the non-degraded endogenous miRNA is determined, and the ratio of these two abundance differences exceeds the threshold t5 In this case, the quality of miRNA contained in the body fluid sample can be determined as good.
  • the threshold values t4 and t5 are preferably 0.7, and more preferably 0.8. Expressions 4A and 5A correspond to the determination based on the ratio of the abundance measurement values. (E / c) / (E / C)> t4 (Formula 4A) (E ⁇ c) / (E ⁇ C)> t5 (Formula 5A)
  • the ratio (abundance ratio e / c) of the measured amount a of the reference miRNA in the body fluid sample e to the measured amount c of the non-degraded endogenous miRNA, and the standard body fluid sample The ratio of the abundance measurement value E of the reference miRNA to the abundance measurement value C of the non-degraded endogenous miRNA (abundance ratio E / C) is determined, and the difference between the two abundance ratios exceeds the threshold t6 In this case, the quality of miRNA contained in the body fluid sample can be determined as good.
  • the difference between the measured amount a of the reference miRNA in the body fluid sample e and the measured amount c of the non-degraded endogenous miRNA (the abundance difference e ⁇ c), and the standard body fluid sample
  • the difference between the abundance measurement value E of the reference miRNA and the abundance measurement value C of the non-degraded endogenous miRNA (absence difference EC) is obtained, and the difference between these two abundance differences exceeds the threshold t7
  • the quality of miRNA contained in the body fluid sample can be determined as good.
  • the threshold values t6 and t7 can be set, for example, in the range of -50 or more and 0 or less, and can be 0, for example.
  • Expressions 6A and 7A correspond to the determination based on the difference between the abundance measurement values.
  • (E / c)-(E / C)> t6 (E ⁇ c) ⁇ (E ⁇ C)> t7 (Formula 7A)
  • a ratio of the abundance measurement value E of the reference miRNA in the standard body fluid sample and the abundance measurement value C of the non-degraded endogenous miRNA may be employed.
  • the ratio (abundance ratio e / c) of the measured amount a of the reference miRNA in the body fluid sample to the measured amount c of the non-degraded endogenous miRNA is a threshold t8, that is, The quality of miRNA contained in a body fluid sample is exceeded when the ratio of the abundance measurement value E of the reference miRNA in the standard body fluid sample to the abundance measurement value C of the non-degraded endogenous miRNA (existence ratio E / C) is exceeded.
  • Expression 8A is an aspect of Expression 6A, and corresponds to determination based on the difference in the abundance measurement values.
  • a difference between the measured value E of the reference miRNA in the standard body fluid sample E and the measured value C of the non-degraded endogenous miRNA abundance may be employed.
  • the difference between the measured amount e of the reference miRNA in the body fluid sample and the measured amount c of the non-degraded endogenous miRNA is a threshold t9, that is, The quality of miRNA contained in a body fluid sample exceeds the difference between the measured amount E of the reference miRNA in the standard body fluid sample and the measured amount C of the non-degraded endogenous miRNA abundance C (abundance difference EC). It can be judged as good. This corresponds to the case where the threshold value t7 is set to 0 in the case where the expression 7A is employed.
  • Expression 9A is an aspect of Expression 7A, and corresponds to determination based on the difference in the abundance measurement values.
  • e / c> E / C ( t8)
  • the representative value of the abundance measurement value of multiple reference miRNAs in the body fluid sample and the representative value of the abundance measurement value of the plurality of reference miRNAs in the standard body fluid sample are obtained.
  • the difference or ratio between the two representative values can be obtained and used for the determination.
  • a representative value r of the abundance measurement values of a plurality of reference miRNAs in the body fluid sample is used instead of the measured amount E of the reference miRNA in the standard body fluid sample.
  • the representative value R of the measured amount of the reference miRNA in the standard body fluid sample may be used.
  • the determination may be made using any one of the following formulas 1B to 9B.
  • the representative value an average value or a median value of the respective measured values can be used.
  • the thresholds t1 to t9 are given a certain error ⁇ width, and “t1 ⁇ ⁇ ” to It may be “t9 ⁇ ⁇ ”.
  • the error ⁇ may be arbitrarily set.
  • about 10% of E can be set as ⁇ so that the threshold value t2 has a width.
  • each threshold value a value obtained by converting the measured value of the abundance into a logarithm may be used.
  • an appropriate threshold value may be set according to the conversion.
  • the abundance ratio (e / E) of the reference miRNA may be converted into a logarithmic value, and the threshold value t1 may be set according to the conversion. In this case, as a result, the difference between the logarithmic values of the abundance measurement values e and E is obtained.
  • the difference or ratio between the abundance measurement value in the body fluid sample and the abundance measurement value in the standard body fluid sample is determined for each reference miRNA, and the determination is performed for each reference miRNA according to the determination criteria, and the results are integrated.
  • the quality of miRNA contained in the body fluid sample can be determined.
  • the miRNA contained in the body fluid sample can be judged as good quality.
  • the number of reference miRNAs determined to be poor exceeds the number of reference miRNAs determined to be good or a predetermined number
  • the quality of miRNA contained in the sample can be determined to be poor.
  • priority may be given to the failure determination by one specific reference miRNA than the number of reference miRNAs that have given a good determination.
  • the quality of the miRNA contained in the body fluid sample may be determined to be bad regardless of the number of good reference miRNAs.
  • one specific reference miRNA either hsa-miR-125a-3p (SEQ ID NO: 1) or hsa-miR-125b-1-3p (SEQ ID NO: 2) can be preferably employed.
  • the present invention in order to evaluate the quality of miRNA derived from a body fluid sample, in one or more computers, A body fluid sample of one or more reference miRNAs selected from miRNAs consisting of the base sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 12, each measured using an RNA sample containing miRNA prepared from a body fluid sample and a standard body fluid sample And a measurement value acquisition step of acquiring an abundance measurement value in a standard body fluid sample; A body fluid sample and a standard by comparing the abundance measurement value or representative value of one or more reference miRNAs in a body fluid sample with an abundance measurement value or representative value of one or more reference miRNAs in a standard body fluid sample A comparison step of obtaining a difference or ratio of one or more reference miRNA abundance measurement values or representative values thereof between body fluid samples; and one or a plurality of reference miRNA abundance measurement values obtained in the comparison step Alternatively, based on the difference or ratio of the representative values, the quality of miRNA derived
  • the program is incorporated in a device for analyzing the expression level of miRNA, and in the measurement value acquisition step, the reference miRNA expression level (that is, in the sample) measured by the expression measurement unit of the device or an expression measurement device separate from the device.
  • the measurement value of the reference miRNA abundance is obtained, and each step may be performed using the measurement value.
  • the measurement value to be acquired may be a corrected measurement value.
  • the program may include an instruction for causing the computer to execute processing for correcting the acquired measurement value. Details of each step are as described above for the miRNA quality evaluation method of the present invention.
  • Program is a data processing method described in an arbitrary language or description method, and may be in any form such as source code or binary code.
  • the “program” is not necessarily limited to a single configuration, but is distributed in the form of a plurality of modules and libraries, or in cooperation with a separate program represented by an OS (Operating System). Including those that achieve the function.
  • OS Operating System
  • a reading procedure, an installation procedure after reading, or the like a known configuration or procedure can be used.
  • the “recording medium” can be any “portable physical medium” (non-transitory recording medium) such as a flexible disk, magneto-optical disk, ROM, EPROM, EEPROM, CD-ROM, MO, DVD, and the like.
  • it may be a “communication medium” that holds a program in a short period of time, such as a communication line or a carrier wave when transmitting a program via a network, represented by a LAN, WAN, or the Internet.
  • the present invention also provides a miRNA quality evaluation chip comprising a support on which a probe for capturing one or more reference miRNAs selected from miRNAs consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 12 is immobilized.
  • a probe for capturing a target miRNA and a probe for capturing one or a plurality of reference miRNAs selected from miRNAs consisting of base sequences represented by SEQ ID NOs: 1 to 12 are immobilized.
  • a miRNA expression analysis chip including a support.
  • target miRNA one or a plurality of reference miRNAs selected from miRNAs consisting of the base sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 12, probes for capturing them, and support on which these capture probes are immobilized
  • the body is as described above.
  • the chip for miRNA expression analysis of the present invention is for capturing a housekeeping RNA used in the correction processing, a specific correction endogenous miRNA, a correction nucleic acid such as an external standard nucleic acid to be added, particularly a correction endogenous miRNA.
  • the probe may be further immobilized on the support.
  • One or a plurality of miRNAs used is used as a reference miRNA for measuring the degree of degradation of RNA derived from a body fluid sample.
  • the body fluid sample is a human body fluid sample
  • one or a plurality of miRNAs selected from miRNAs having the base sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 12 may be used as the reference miRNA.
  • miR-125a-3p gene or “miR-125a-3p” refers to human miR-125a-3p (ie hsa-miR-125a-3p, miRBase Accession No. MIMAT0004602) and other species homologs or Includes orthologs.
  • the RNA sequence shown in SEQ ID NO: 1 is the sequence of hsa-miR-125a-3p.
  • the hsa-miR-125a-3p gene can be obtained by the method described in Lagos-Quintana M et al., 2002, Curr Biol, 12, p735-739.
  • miR-125a-3p also encompasses its precursor “mir-125a”, which has a hairpin-like structure, for example the term “hsa-miR-125a-3p” includes hsa-mir-125a (MiRBase Accession No. MI0000469, SEQ ID NO: 13) is also included.
  • miR-125b-1-3p gene refers to human miR-125b-1-3p (ie hsa-miR-125b-1-3p, miRBase Accession No. MIMAT0004592 ) And other species homologs or orthologs.
  • the RNA sequence shown in SEQ ID NO: 2 is the sequence of hsa-miR-125b-1-3p.
  • the hsa-miR-125b-1-3p gene can be obtained by the method described in Lagos-Quintana M et al., 2002, Curr Biol, 12, p735-739.
  • Hsa-mir-125b-1 (miRBase Accession No. MI0000446, SEQ ID NO: 14) is also included.
  • miR-3184-5p gene refers to human miR-3184-5p (ie hsa-miR-3184-5p, miRBase Accession No. MIMAT0015064) and other species homologs or Includes orthologs.
  • the RNA sequence shown in SEQ ID NO: 3 is the sequence of hsa-miR-3184-5p.
  • the hsa-miR-3184-5p gene can be obtained by the method described in Stark MS et al., 2010, PLoS One, Vol. 5, e9685.
  • miR-3184-5p also encompasses its precursor “mir-3184”, which has a hairpin-like structure, for example the term “hsa-miR-3184-5p” includes hsa-mir-3184 (MiRBase AccessionNo. MI0014226, SEQ ID NO: 15) is also included.
  • miR-4443 gene or “miR-4443” includes human miR-4443 (ie, hsa-miR-4443, miRBase Accession No. MIMAT0018961), homologs or orthologs of other species.
  • the RNA sequence shown in SEQ ID NO: 4 is the sequence of hsa-miR-4443.
  • the hsa-miR-4443 gene can be obtained by the method described in Jima DD et al., 2010, Blood, 116, p118-127.
  • the term “miR-4443” also includes its precursor “mir-4443” having a hairpin-like structure.
  • the term “hsa-miR-4443” includes hsa-mir-4443 (miRBase Accession No MI0016786, SEQ ID NO: 16) is also included.
  • miR-4638-5p gene or “miR-4638-5p” refers to human miR-4638-5p (ie hsa-miR-4638-5p, miRBase Accession No. MIMAT0019695) and other species homologs or Includes orthologs.
  • the RNA sequence shown in SEQ ID NO: 5 is the sequence of hsa-miR-4638-5p.
  • the hsa-miR-4638-5p gene can be obtained by the method described in Persson H et al., 2011, Cancer Res, 71, p78-86.
  • miR-4638-5p also encompasses its precursor “mir-4638”, which has a hairpin-like structure, for example the term “hsa-miR-4638-5p” includes hsa-miR-4638 (MiRBase AccessionNo. MI0017265, SEQ ID NO: 17) is also included.
  • miR-4746-3p gene refers to human miR-4746-3p (ie hsa-miR-4746-3p, miRBase Accession No. MIMAT0019881) or other species homologs or Includes orthologs.
  • the RNA sequence shown in SEQ ID NO: 6 is the sequence of hsa-miR-4746-3p.
  • the hsa-miR-4746-3p gene can be obtained by the method described in Persson H et al., 2011, Cancer Res, 71, p78-86.
  • miR-4746-3p also encompasses its precursor “mir-4746” which has a hairpin-like structure, for example the term “hsa-miR-4746-3p” includes hsa-mir-4746 (MiRBase Accession No. MI0017385, SEQ ID NO: 18) is also included.
  • miR-5572 gene or “miR-5572” includes human miR-5572 (ie, hsa-miR-5572, miRBase Accession No. MIMAT0022260), homologs or orthologs of other species.
  • the RNA sequence shown in SEQ ID NO: 7 is the sequence of hsa-miR-5572.
  • the hsa-miR-5572 gene can be obtained by the method described in Tandon M et al., 2012, Oral Dis, 18, p127-131.
  • the term “miR-5572” also includes its precursor “mir-5572” having a hairpin-like structure.
  • the term “hsa-miR-5572” includes hsa-mir-5572 (miRBase Accession No MI0019117, SEQ ID NO: 19) is also included.
  • miR-575 gene or “miR-575” includes human miR-575 (ie, hsa-miR-575, miRBase Accession No. MIMAT0003240) and other species homologs or orthologs.
  • the RNA sequence shown in SEQ ID NO: 8 is the sequence of hsa-miR-575.
  • the hsa-miR-575 gene can be obtained by the method described in Cummins JM et al., 2006, Proc Natl Acad Sci USA, Vol. 103, p3687-3692.
  • the term “miR-575” also includes its precursor “mir-575”, which has a hairpin-like structure.
  • the term “hsa-miR-575” includes hsa-mir-575 (miRBase Accession No MI0003582, SEQ ID NO: 20) is also included.
  • miR-6798-5p gene refers to human miR-6798-5p (ie hsa-miR-6798-5p, miRBase Accession No. MIMAT0027496) or other species homologs or Includes orthologs.
  • the RNA sequence shown in SEQ ID NO: 9 is the sequence of hsa-miR-6798-5p.
  • the hsa-miR-6798-5p gene can be obtained by the method described in Ladewig E et al., 2012, Genome Res, Vol. 22, p1634-1645.
  • the term “miR-6798-5p” also includes its precursor “mir-6798”, which has a hairpin-like structure.
  • the term “hsa-miR-6798-5p” includes hsa-mir-6798. (MiRBase AccessionNo. MI0022643, SEQ ID NO: 21) is also included.
  • miR-7110-5p gene refers to human miR-7110-5p (ie hsa-miR-7110-5p, miRBase Accession No. MIMAT0028117) and other species homologs or Includes orthologs.
  • the RNA sequence shown in SEQ ID NO: 10 is the sequence of hsa-miR-7110-5p.
  • the hsa-miR-7110-5p gene can be obtained by the method described in Ladewig E et al., 2012, Genome Res, Vol. 22, p1634-1645.
  • miR-7110-5p also encompasses its precursor “mir-7110”, which has a hairpin-like structure, for example the term “hsa-miR-7110-5p” includes hsa-mir-7110 (MiRBase AccessionNo. MI0022961, SEQ ID NO: 22) is also included.
  • miR-887-3p gene refers to human miR-887-3 (ie hsa-miR-887-3p, miRBase Accession No .MIMAT0004951) or other species homologs or Includes orthologs.
  • the RNA sequence shown in SEQ ID NO: 11 is the sequence of hsa-miR-887-3p.
  • the hsa-miR-887-3p gene can be obtained by the method described in Berezikov E et al., 2006, Genome Res, 16, p1289-1298.
  • miR-887-3p also encompasses its precursor “mir-887”, which has a hairpin-like structure, for example the term “hsa-miR-887-3p” includes hsa-mir-887 (MiRBase AccessionNo. MI0005562, SEQ ID NO: 23) is also included.
  • miR-939-5p gene refers to human miR-939-5p (ie hsa-miR-939-5p, miRBase Accession No. MIMAT0004982) and other species homologs or Includes orthologs.
  • the RNA sequence shown in SEQ ID NO: 12 is the sequence of hsa-miR-939-5p.
  • the hsa-miR-939-5p gene can be obtained by the method described in Lui WO et al., 2007, Cancer Res, 67, p6031-6043.
  • miR-939-5p also includes “mir-939” having a hairpin-like structure as a precursor thereof, for example, the term “hsa-miR-939-5p” includes hsa-mir- 939 (miRBase Accession No. MI0005761, SEQ ID NO: 24) is also included.
  • the present invention will be described more specifically based on examples including the process of selecting a reference miRNA that depends on RNA degradation.
  • the present invention is not limited to the following examples.
  • Example 1 Selection of reference miRNA (DNA microarray) The following experiment was performed using “3D-Gene” human miRNA oligo chip (compatible with miRBase release 21) manufactured by Toray Industries, Inc.
  • sample RNA RNA contained in the serum sample (hereinafter referred to as sample RNA) was extracted.
  • sample RNA RNA contained in the serum sample
  • “3D-Gene” RNA extraction reagent from liquid sample kit Toray Industries, Inc.
  • the obtained sample RNA was labeled using “3D-Gene” “miRNA” labeling kit (Toray Industries, Inc.). At the time of labeling, an external standard nucleic acid was added in order to correct the miRNA measurement value to the expression level.
  • the labeled sample RNA was hybridized using “3D-Gene” miRNA chip (Toray Industries, Inc.) according to the standard protocol.
  • the DNA microarray after hybridization was subjected to a microarray scanner (Toray Industries, Inc.), and the fluorescence intensity was measured. The scanner was set to 100% laser output, and the voltage setting of the photomultiplier was set to AUTO.
  • the measured value of each miRNA detected by the DNA microarray was converted into a logarithm with a base of 2 and corrected with an external standard nucleic acid added at the time of labeling to obtain the expression level of each miRNA.
  • the expression level of each miRNA at the time of each incubation time was measured three times for the serum that was allowed to stand at 4 ° C for 0, 6, 24, 48, 72, 168 hours after detection with the DNA microarray. The average value was measured.
  • Selection of reference miRNA Compare the miRNA expression level of each serum sample obtained as described above, and extract the miRNA whose expression level (abundance in the sample) fluctuates depending on the standing time. Made a selection.
  • the ratio to the expression level of each miRNA at the time of standing 6, 24, 48, 72, 168 hours ((6, 24, 48, 72 Alternatively, the expression amount at the time of 168 hours) / (the expression amount at 0 hours) was obtained.
  • the miRNAs that were stably detected in the high expression region were narrowed down.
  • the miRNAs shown in Table 1 decreased in expression over time under conditions where the miRNA in serum was stored in a relatively unstable state at 4 ° C., and the degree thereof was large. It was.
  • the correlation coefficient between both serum samples was 0.95 or less in the expression level of total miRNA detected in the serum sample when the standing time in the refrigerator was 0 hour and the serum sample after 168 hours From the results, it was confirmed that RNA degradation in the serum specimen had progressed after 168 hours. From this, it was confirmed that the miRNA shown in Table 1 can be used as an miRNA indicator whose expression level (abundance in the specimen) varies over time depending on the degradation of RNA contained in the serum specimen.
  • the miRNA quality (degree of degradation) of serum samples can be known by measuring the expression level of the miRNA shown in Table 1.
  • hsa-miR-125a-3p (SEQ ID NO: 1) and hsa-miR-125b-1-3p (SEQ ID NO: 2) show sensitive fluctuations from the early stage (after 48 hours), and are more accurate. It was found to be suitable for quality evaluation.
  • Example 1 From the results of Example 1, in Examples 2 to 6 below, the threshold value of the expression ratio of the reference miRNA was set to 0.8, and when it exceeded this, the quality of the miRNA contained in the sample was determined to be good.
  • RNA extraction reagent from liquid sample kit (Toray Industries, Inc.) was used.
  • the obtained specimen RNA was labeled using “3D-Gene” “miRNA labeling kit” (Toray Industries, Inc.), and at the time of labeling, an external standard nucleic acid was added to correct the measured value of miRNA to the expression level.
  • the labeled specimen-derived RNA was hybridized using “3D-Gene” miRNA chip (Toray Industries, Inc.) according to the standard protocol.
  • the DNA microarray after hybridization was subjected to a microarray scanner (Toray Industries, Inc.), and the fluorescence intensity was measured. The scanner was set to 100% laser output, and the voltage setting of the photomultiplier was set to AUTO.
  • the detected miRNA signal value was corrected by the signal value of the external standard nucleic acid to obtain the expression level.
  • Hsa-miR-125b-1-3p (SEQ ID NO: 2) was selected as a reference miRNA used for quality judgment.
  • a commercially available serum sample is used as a standard body fluid sample in which degradation of the nucleic acid sample has not progressed, and in the same manner as above, hsa-miR-125b-1- An expression level of 3p was obtained.
  • the expression level of hsa-miR-125b-1-3p derived from the serum sample was divided by the expression level of hsa-miR-125b-1-3p derived from the standard body fluid sample, and the expression level ratio between them was determined.
  • the expression level ratio was 0.99, which exceeded the threshold value of 0.8. Therefore, the quality of miRNA contained in this serum sample was determined to be good.
  • the correlation coefficient between the detected expression level of all miRNAs derived from serum samples and the expression level of all miRNAs derived from standard body fluid samples was 0.99, indicating that the miRNA quality was good and was not degraded. It was done. This coincided with the quality determination result according to the present invention.
  • Reference miRNAs used for quality assessment are hsa-miR-125b-1-3p (SEQ ID NO: 2) and hsa-miR-6798-5p (SEQ ID NO: 2) instead of hsa-miR-125b-1-3p (SEQ ID NO: 2).
  • SEQ ID NO: 2 hsa-miR-125b-1-3p
  • SEQ ID NO: 2 hsa-miR-6798-5p
  • the comparison of the expression levels of both samples was performed using the average expression level of the two miRNAs as a representative value.
  • the expression level ratio was determined by dividing the representative value of the serum sample by the representative value of the standard body fluid sample. As a result, the expression level ratio was 0.98, which exceeded the threshold value of 0.8. Therefore, the quality of miRNA contained in this serum sample was determined to be good.
  • the correlation coefficient between the detected expression level of all miRNAs derived from serum samples and the expression level of all miRNAs derived from standard body fluid samples was 0.99, indicating that the miRNA quality was good and was not degraded. It was done. This coincided with the quality determination result according to the present invention.
  • Example 4 Serum samples were changed to those after 168 hours of standing at 4 ° C. after preparation of the serum, except for the above, and in the same manner as in Example 3, two miRNAs (hsa derived from serum samples and standard body fluid samples) -miR-125b-1-3p (SEQ ID NO: 2) and hsa-miR-6798-5p (SEQ ID NO: 9)) were measured. The average value of the expression levels of the two miRNAs was used as a representative value, and the expression level ratio was determined from the representative value.
  • the expression level ratio was 0.34, which was below the threshold value 0.8, and therefore the quality of miRNA contained in this serum sample was determined to be poor.
  • the correlation coefficient between the detected expression level of all miRNAs derived from serum specimens and the expression level of all miRNAs derived from standard body fluid specimens is a low 0.93, resulting in degradation of miRNAs and poor quality. It was shown that This coincided with the quality determination result according to the present invention.
  • Example 5 Serum samples were changed to those after 72 hours of standing at 4 ° C. after preparation of the serum, except for the above, in the same manner as in Example 3, two miRNAs (hsa derived from serum samples and standard body fluid samples) were used. -miR-125b-1-3p (SEQ ID NO: 2) and hsa-miR-6798-5p (SEQ ID NO: 9)) were measured. The expression level ratio of hsa-miR-125b-1-3p and the expression level ratio of hsa-miR-6798-5p were respectively determined, and the expression levels were compared.
  • the expression level ratio of hsa-miR-6798-5p was 0.95, which exceeded the threshold value 0.8, but the expression level ratio of hsa-miR-125b-1-3p was 0.73, which was below the threshold value 0.8. Since one of the two reference miRNAs was below the threshold, the quality of the miRNA contained in the sample was determined to be poor.
  • the correlation coefficient between the expression level of all miRNAs detected and the expression level of all miRNAs derived from the standard body fluid sample was a slightly low value of 0.94, and miRNA degradation occurred and the quality was slightly deteriorated. It has been shown. This coincided with the quality determination result according to the present invention.
  • RNA extracted from serum samples after 72 hours of static standing and 168 hours of static standing is extracted from commercially available serum specimens that are standard body fluid specimens in which degradation of nucleic acid samples has not progressed Compared with, the difference in quality (degree of decomposition) could not be confirmed in the result of electrophoresis.
  • hsa-miR-149-3p SEQ ID NO: 25
  • hsa-miR-125b-1-3p SEQ ID NO: 2
  • serum samples Was changed to one after 168 hours of standing at 4 ° C after serum preparation, and the expression levels of these two miRNAs derived from serum samples and standard body fluid samples were measured in the same manner as in Example 2 except for these. did.
  • hsa-miR-149-3p used as the reference miRNA is one of the most stable miRNAs in Example 1 above, in which the expression level did not change (decrease) with the passage of the standing time. .
  • the expression level ratio was 0.98, exceeding the threshold value of 0.8.
  • the quality of miRNA contained in the specimen was determined to be good.
  • the correlation coefficient between the expression level of all miRNAs derived from the detected serum sample and the expression level of all miRNAs derived from the standard body fluid sample was 0.94, the miRNA actually decomposed and the quality was It was shown that it was getting worse. That is, when hsa-miR-149-3p that does not correspond to the reference miRNA that can be used in the present invention was used, the quality could not be judged correctly.
  • Example 6 In the same manner as in Example 2, in addition to using hsa-miR-125b-1-3p (SEQ ID NO: 2) as a reference miRNA used for quality determination, non-degrading endogenous miRNA that does not depend on RNA degradation is used. A certain hsa-miR-4463 (SEQ ID NO: 26) was also used to measure the expression levels of these two miRNAs derived from serum samples and standard body fluid samples. For each serum sample and standard body fluid sample, determine the expression ratio by dividing the expression level of hsa-miR-125b-1-3p by the expression level of hsa-miR-4463. Was divided by the expression level ratio derived from the standard body fluid sample to determine the ratio of the expression level, and compared with the threshold value.
  • the ratio of the expression level obtained by dividing the expression level of hsa-miR-125b-1-3p by the expression level of hsa-miR-4463 was 0.97 for serum samples and 0.98 for standard body fluid samples. .
  • the ratio of these expression level ratios was 0.99, which exceeded the threshold value of 0.8. Therefore, the quality of miRNA contained in the specimen was determined to be good.
  • the correlation coefficient between the detected expression level of all miRNAs derived from serum samples and the expression level of all miRNAs derived from standard body fluid samples was 0.99, indicating that the miRNA quality was good and was not degraded. It was done. This coincided with the quality determination result according to the present invention.

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Abstract

体液検体由来のmiRNAの品質を評価する新規な方法が開示されている。本発明の方法では、配列番号1～12に示すmiRNAの少なくともいずれかを基準miRNAとし、体液検体中の当該基準miRNAの存在量と、核酸試料の分解が進行していない状態である標準体液検体中のmiRNAの存在量とを比較することにより、miRNAの品質を評価する。配列番号１～１２で示される塩基配列からなるmiRNAは、体液検体中の核酸試料の分解に依存して存在量が減少するmiRNAとして本願発明者らにより選択されたmiRNAである。

Description

体液由来ｍｉＲＮＡの品質を評価する方法
　本発明は、体液検体由来のmiRNAの品質を評価する方法に関する。
　miRNA（マイクロRNA）は、ゲノムDNAからヘアピン様構造のRNA（前駆体）として転写されてくる。この前駆体は、特定の酵素RNase III切断活性を有するdsRNA切断酵素（Drosha、Dicer）により切断された後、二本鎖の形態へと変化し、その後一本鎖となる。そして、片方のアンチセンス鎖がRISCと称するタンパク質複合体に取り込まれ、mRNAの翻訳抑制に関与すると考えられている。このように、miRNAは、転写後、各段階においてその態様は異なるため、通常、miRNAを検出対象とする場合は、ヘアピン構造体、二本鎖構造体、一本鎖構造体等の各種形態を考慮する必要がある。miRNAは15～25塩基のRNAからなり、様々な生物でその存在が確認されている。
　近年、miRNAは、細胞内のみならず、細胞を含まない検体である血清、血漿、尿、脊髄液等の体液にも多く存在し、その発現量が、がんをはじめとした様々な疾患のバイオマーカーとなる可能性が示唆されている。miRNAは、2016年2月現在、ヒトで2500種以上が存在し、高感度なDNAマイクロアレイ等の測定系を利用した場合、そのうちの1000種を超えるmiRNAの発現を血清・血漿中で同時に検出することが可能である。そこで、DNAマイクロアレイ法を用いて血清・血漿、尿、脊髄液等の体液を対象としたバイオマーカー探索研究が実施されており、疾患を早期に発見できるバイオマーカー検査への展開が期待されている。
　一方、RNAは熱や分解酵素、凍結融解などの物理的及び化学的な様々な要素によって分解しやすい物質であり、DNAマイクロアレイを用いて遺伝子発現解析を行う場合は、RNAの分解が発現量の測定に影響を及ぼすことが知られている。疾患のバイオマーカーとして、体液に含まれるmiRNAの発現量を測定する検査においては、不確実性を有する発現量の測定値をもとに検査・診断してしまうと、適切な治療の機会を逃したり、間違った医療を適用することで患者に不要な経済的、体力的負担を強いたりすることになる。したがって、発現量を正確に測定するために、検査標的とするmiRNAが分解していない検体を検査に使用することがきわめて重要である。
　従来、RNAの分解度を測定する手法としては、一般的に電気泳動が用いられており、例えば、28SリボソームRNA由来のバンドと18SリボソームRNA由来のバンドの濃度比（28S／18S）から測定できる。また、別の手法としては、特許文献１ではRNAセグメントの長さの違いから、RNAの分解度を定量評価する方法が提案されており、ここでは、ヌクレオチドが分解するとセグメント長が短くなるという、長鎖RNAの特徴を利用している。
　しかしながら、miRNAの発現量を測定するときには、短鎖分画のRNAを利用することが多く、この場合は長鎖RNAが含まれないため、上記のような従来方法は、RNAの分解度を測定するための有効な手法にはなりえない。遺伝子発現解析結果の全遺伝子の相関係数から、使用したRNAの分解度を測定することもできるが、全遺伝子のデータが必要であり、時間と手間がかかる。そこで、長鎖RNA由来の分解断片に着目し、短鎖分画に混入する分解断片を指標として、短鎖分画中のmiRNAの分解度を評価する手法が開発されている（特許文献２）。
特表２０１５－５１９０４５号公報 特開２００８－３５７７９号公報
　上記のように、標的とするRNAの発現量を正確に測定するためには、検体中のRNAの分解度を測定して品質を評価することが重要である。しかし、前述した従来の方法は、リボソームRNAや長鎖RNAを利用する方法であるところ、リボソームRNAや長鎖RNAは、核内や細胞質内に存在するRNAであり、例えば血清、血漿、尿、脊髄液等の体液検体にはほとんど存在しない。そのため、この従来の方法によっては、体液検体に含まれるmiRNAの分解度を正確に測定して品質を評価することはできなかった。
　本発明の課題は、検体として、従来の方法には適さない体液検体を用いる場合に、その体液検体に含まれるmiRNAの分解度を測定して品質を評価する手法を見出すことである。
　上記課題を解決するため、本発明者らは、体液検体に含まれる核酸試料の分解に依存して存在量が変動するmiRNA（以下、「基準miRNA」という。）を基準としてその存在量を測定することで、標的とするmiRNAの品質を評価することができることを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、配列番号1～12に示すmiRNAの少なくともいずれかを基準miRNAとし、体液検体中の当該基準miRNAの存在量と、核酸試料の分解が進行していない状態である標準体液検体中のmiRNAの存在量とを比較することにより、miRNAの品質を評価する方法であり、以下の態様を包含する。
(１)　体液検体由来のmiRNAの品質を評価する方法であって、
　体液検体及び標準体液検体より調製された、miRNAを含むRNAサンプルを用いて、配列番号１～１２で示される塩基配列からなるmiRNAから選択される１又は複数の基準miRNAの、体液検体及び標準体液検体中の存在量をそれぞれ測定する、測定工程；
　体液検体中の１又は複数の基準miRNAの存在量測定値又はその代表値を、標準体液検体中の１又は複数の基準miRNAの存在量測定値又はその代表値と比較して、体液検体及び標準体液検体間での１又は複数の基準miRNAの存在量測定値又はその代表値の差又は比を得る、比較工程；及び
　前記比較工程で得られた、１又は複数の基準miRNAの存在量測定値又はその代表値の差又は比に基づいて、体液検体由来のmiRNAの品質の良否を判定する、判定工程
を含む、前記方法。
(２)　前記比較工程は、１の基準miRNAの存在量測定値の差若しくは比、複数の基準miRNAそれぞれの存在量測定値の差若しくは比、又は複数の基準miRNAの存在量測定値の代表値の差若しくは比を得る工程である、(１)記載の方法。
(３)　前記判定工程は、前記１又は複数の基準miRNAの存在量測定値又はその代表値の差又は比を、基準として予め定められた閾値と対比することを含む、(１)又は(２)記載の方法。
(４)　前記比較工程は、体液検体中の存在量測定値又はその代表値から標準体液検体中の存在量測定値又はその代表値を減算して差を求めること、又は、体液検体中の存在量測定値又はその代表値を標準体液検体中の存在量測定値又はその代表値で除算して比を求めることを含む、(１)～(３)のいずれか１項に記載の方法。
(５)　前記判定工程は、前記１又は複数の基準miRNAの存在量測定値又はその代表値の差又は比を、基準として予め定められた閾値と対比することを含み、該差又は比が該閾値を超える場合に体液検体由来のmiRNAの品質を良と判定する、(４)記載の方法。
(６)　体液検体及び標準体液検体中の複数の基準miRNAの存在量測定値の代表値が、それぞれ、複数の基準miRNAの存在量測定値の平均値又は中央値である、(１)～(５)のいずれか１項に記載の方法。
(７)　前記測定工程は、体液検体及び標準体液検体中の１又は複数の基準miRNAの存在量測定値を補正することを含み、補正済みの測定値を用いて以後の工程が実施される、(１)～(６)のいずれか１項に記載の方法。
(８)　前記測定工程は、支持体上に固定化された前記１又は複数の基準miRNAを捕捉するためのプローブと、体液検体及び標準体液検体から抽出され標識物質で標識された核酸試料とをそれぞれ接触させてハイブリダイゼーションを行なうことにより、体液検体及び標準体液検体中の当該１又は複数の基準miRNAの存在量を測定することを含む、(１)～(７)のいずれか１項に記載の方法。
(９)　前記測定工程は、体液検体中の前記１又は複数の基準miRNAの存在量の測定と同時に、当該体液検体中の標的miRNAの存在量を測定することを含む、(１)～(８)のいずれか１項に記載の方法。
(１０)　前記測定工程は、体液検体中の標的miRNAの存在量測定値を補正することを含む、(９)記載の方法。
(１１)　前記測定工程は、支持体上に固定化された、標的miRNAを捕捉するためのプローブ及び前記１又は複数の基準miRNAを捕捉するためのプローブと、体液検体から抽出され標識物質で標識された核酸試料とを接触させてハイブリダイゼーションを行なうことにより、体液検体中の標的miRNA及び当該１又は複数の基準miRNAの存在量をそれぞれ測定することを含む、(９)又は(１０)記載の方法。
(１２)　前記体液検体が、血液、血清又は血漿である、(１)～(１１)のいずれか１項に記載の方法。
(１３)　体液検体由来のmiRNAの品質を評価するために、１又は複数のコンピュータに、
　体液検体及び標準体液検体より調製された、miRNAを含むRNAサンプルを用いてそれぞれ測定された、配列番号１～１２で示される塩基配列からなるmiRNAから選択される１又は複数の基準miRNAの体液検体及び標準体液検体中の存在量測定値を取得する、測定値取得工程；
　体液検体中の１又は複数の基準miRNAの存在量測定値又はその代表値を、標準体液検体中の１又は複数の基準miRNAの存在量測定値又はその代表値と比較して、体液検体及び標準体液検体間での１又は複数の基準miRNAの存在量測定値又はその代表値の差又は比を得る、比較工程；及び
　前記比較工程で得られた、１又は複数の基準miRNAの存在量測定値又はその代表値の差又は比に基づいて、体液検体由来のmiRNAの品質の良否を判定する、判定工程
を実行させるためのプログラム。
(１４)　(１３)記載のプログラムを記録した、コンピュータ読み取り可能な記録媒体。
(１５)　配列番号１～１２で示される塩基配列からなるmiRNAから選択される１又は複数の基準miRNAを捕捉するためのプローブが固定化された支持体を含む、miRNA品質評価用チップ。
(１６)　標的miRNAを捕捉するためのプローブ及び配列番号１～１２で示される塩基配列からなるmiRNAから選択される１又は複数の基準miRNAを捕捉するためのプローブが固定化された支持体を含む、miRNA発現解析用チップ。
　本発明により、従来の方法では困難であった、体液検体に含まれるmiRNAの品質評価が可能となる。また、本発明によれば、体液検体が、例えばmiRNAを用いた遺伝子発現解析に適する品質を有するかどうかを高精度でかつ簡便に評価することができるので、体液検体中のバイオマーカーの発現量を指標としてより正確な疾患の検査が可能となる。
　本発明は、体液検体由来のmiRNAの品質（分解の程度）を評価する方法であって、配列番号１～１２で示される塩基配列からなるmiRNAから選択される1又は複数のmiRNAを基準miRNAとし、当該体液検体中の基準miRNAの存在量と、標準体液検体中の基準miRNAの存在量を測定する測定工程；当該測定工程で得られた体液検体中の基準miRNAの測定値又はその代表値と、標準体液検体に含まれる基準miRNAの測定値又はその代表値の差又は比を得る比較工程；当該比較工程で得られた各存在量測定値の差又は比に基づいて、体液検体由来のmiRNAの品質（分解の程度）を判定する判定工程、を含む方法である。
　体液検体中の基準miRNAの存在量は、体液検体から抽出したRNAサンプル中の基準miRNA量を測定することにより調べることができる。「体液検体に含まれるmiRNAの品質」、「体液検体中のmiRNAの品質」、「体液検体由来のmiRNAの品質」という語は、体液検体から抽出したRNAサンプル中のmiRNAの品質という語と同義である。
　本発明の方法は、遺伝子発現解析、例えばマイクロアレイ等のアレイチップを用いた解析や、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法、シークエンス法による解析において、体液検体に含まれるmiRNAの品質を予め評価することにより、これらの解析を行うことの適否を判断することに用いることができる。遺伝子発現解析には、例えば、体液中のmiRNAを標識し、1又は複数の標的miRNAを捕捉するためのプローブと、基準miRNAを捕捉するためのプローブとが固定された支持体を用いて各miRNAの発現量を測定すること、1又は複数の標的miRNAを増幅するためのプライマーと、基準miRNAを増幅するためのプライマーとを使用して増幅反応を行い、標的miRNAの発現量を測定することなどが含まれ、さらにこれらの結果を利用して遺伝子発現の解析や検査、例えば、病態を把握するために臨床検体を測定する検査を行うことが含まれる。
　「miRNA」は、生体内で作られる鎖長15～25塩基程度の短鎖RNAを意味するノンコーディングRNA（ncRNA）の一種であり、mRNAの発現を調節する機能を有すると考えられている。miRNAは、ゲノムDNAからからヘアピン様構造のRNA（前駆体）として転写されてくる。この前駆体は、特定の酵素RNase III切断活性を有するdsRNA切断酵素（Drosha、Dicer）により切断された後、二本鎖の形態へと変化し、その後一本鎖となる。そして、片方のアンチセンス鎖がRISCと称するタンパク質複合体に取り込まれ、mRNAの翻訳抑制に関与すると考えられている。このように、miRNAは、転写後、各段階においてその態様は異なるので、通常、miRNAを標的（検出対象）とする場合は、ヘアピン構造体、二本鎖構造体、一本鎖構造体等の各種形態を考慮する必要がある。miRNAは様々な生物でその存在が確認されている。
　本発明を適用できる体液検体は、生体から分離された体液検体であり、例えば、血液、血清、血漿、尿、髄液、唾液、ぬぐい液、各種組織液等の体液を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。体液検体が由来する生体の種類は特に限定されず、各種の生物種が包含されるが、典型的には哺乳動物、特にヒトである。
　これらの体液中のmiRNAの品質が低下する、すなわちmiRNAが分解する原因としては、温度や熱などの他、体液に対する振動や超音波などの外部力、電場や磁場など含めた各種の直接、間接的の物理的な力などが考えられるが、品質低下の原因はこれらに限定されるものではない。
　本発明においては、これらの検体からRNAを抽出し、このRNAを用いてmiRNAの発現量を測定することができる。RNAの抽出は、公知の方法（例えば、Favaloroらの方法（Favaloro et. al., Methods Enzymol. 65: 718 (1980)）等）や、RNA抽出のための各種の市販のキット（例えば、キアゲン社のmiRNeasy、東レ社の“3D-Gene” RNA extraction reagent from liquid sample等）を適用することができる。
＜測定工程＞
　本発明では、配列番号1～12で示される塩基配列からなるmiRNAから選択される1又は複数の基準miRNAの体液検体中の存在量、及び、配列番号1～12で示される塩基配列からなるmiRNAから選択される1又は複数の基準miRNAの標準体液検体中の存在量の測定を行う。また、体液検体中の基準miRNAの存在量の測定と同時に、後述する標的miRNAの存在量や補正用標準核酸の存在量の測定を行ってもよい。
　本発明において基準miRNAとして用いる、配列番号1～12で示される塩基配列からなるmiRNAは、体液検体中の核酸試料の分解に依存して存在量が減少するmiRNAとして選択されたmiRNAである。一般に、RNAが分解すると、一部が断片化するため、遺伝子RNAの存在量は減少する。この場合、遺伝子発現解析で検出された全遺伝子において、分解したRNAと分解していないRNAとの相関は低下し、例えば相関係数は0.95以下になる。本発明で用いる基準miRNAは、このようなRNAの分解と相関して存在量が変動（減少）するmiRNAである。例えば、後に示す補正処理によって得られる発現量において、RNA分解前とRNA分解後との発現量比が、好ましくは0.8以下、より好ましくは0.7以下になるようなmiRNAが好ましい。
　体液検体として血清（血液）を用いる場合、本発明で用いる基準miRNAとしては、血清状態での保存時間に依存して存在量がより大きく減少するmiRNAを好ましく選択することができる。保存時間に依存して存在量が減少するmiRNAは、例えば、採血後に調製した血清検体を冷蔵庫（例えば、4℃）で保存し、保存開始0時間後、6時間後、12時間後、24時間後、さらに以降1日おきに7日後のmiRNAの存在量を測定し、その減少の程度を比較することで、選択することができる。血清検体を冷蔵庫で保存する期間がより長期に及ぶ場合には、その期間にあわせて、例えば2週後や1ヶ月後まで保存時間を延長して、miRNAの存在量を測定して比較すればよい。こうして保存時間の異なる血清から得られたmiRNAの存在量は、統計的手法を適用して、遺伝子発現解析の群間比較により、時間経過による存在量の減少が統計学的に有意であるmiRNAを選抜することができる。例えば、一般に利用されるt検定などに基づく統計解析法を利用すればよい。例えば、統計言語「R」のパッケージ「SAM」（Tusher VG et. al., Proc Natl Acad Sic USA. 2001 98（9）5116－5121）をそのまま適用することもできる。
　本発明の測定工程では、本願発明者らが選定した特定の１２種類のmiRNA、好ましくは配列番号１～１２で示される塩基配列からなる１２種類のmiRNAから選択される1又は複数の基準miRNAの、体液検体及び標準体液検体中の存在量を測定する。標準体液検体とは、核酸試料の分解が進行していない検体であり、体液検体と比較して、体液検体に含まれるmiRNAの品質の良否の判定の基準とする検体である。標準体液検体としては、例えば、対象の体液検体を入手又は調製した直後のもので、それに含まれる核酸試料の分解が進行していない状態の同一検体を用いることもできる。または、調製直後の対象体液検体と同一の検体の入手ができない場合には、同一生物種の別個体の同種の体液から調製されたものを用いることもできる。または、標準品として市販されている同一生物種の体液検体を入手して用いてもよい。体液検体が血清（血液）である場合には、血清検体を調製した直後の検体（保存時間0時間経過後の検体）を標準体液検体として用いることができる。調製直後の血清検体が入手できない場合は、同じ生物種の別個体から調製された直後（保存時間0時間経過後）の血清検体を用いてもよいし、市販されている血清を用いてもよい。
　以下、基準miRNAや、後述する標的miRNA、補正用標準核酸等の核酸を捕捉するためのプローブを、総じて「捕捉プローブ」又は単に「プローブ」ともいう。
　miRNAの存在量の測定は、例えば、対象のmiRNAに特異的に結合するプローブを支持体上に固定化したマイクロアレイ等のアレイチップを用いたハイブリダイゼーションアッセイにより行なうことができる。本発明においては、1又は複数の基準miRNAを捕捉するための「基準miRNA捕捉プローブ」が固定化された支持体を含むアレイチップを用いることができる。また、後述する標的miRNAを捕捉するための「標的miRNA捕捉プローブ」、補正用標準核酸を捕捉するための「補正用標準核酸捕捉プローブ」がさらに固定化された支持体を含むアレイチップを用いてもよい。
　「捕捉プローブ」又は「捕捉するためのプローブ」とは、捕捉対象のmiRNAと直接的又は間接的に、好ましくは直接的に、かつ選択的に結合し得る物質を意味し、代表的な例として、核酸、タンパク質、糖類及び他の抗原性化合物を挙げることができる。本発明においては、核酸プローブを好ましく用いることができる。核酸は、DNAやRNAのほか、PNA（ペプチド核酸）やLNA（Locked Nucleic Acid）などの核酸誘導体を用いることができる。ここで誘導体とは、核酸の場合、蛍光団などによるラベル化誘導体、修飾ヌクレオチド（例えば、ハロゲン、メチルなどのアルキル、メトキシなどのアルコキシ、チオ、カルボキシメチルなどの基を含むヌクレオチド、及び塩基の再構成、二重結合の飽和、脱アミノ化、酸素分子の硫黄分子への置換などを受けたヌクレオチドなど）を含む誘導体などの化学修飾誘導体を意味する。
　核酸プローブの鎖長は、ハイブリダイゼーションの安定性と特異性を確保する観点から、検出対象とするmiRNAの長さ以上とすることが好ましい。通常、17～25塩基程度の鎖長とすれば、プローブが対象とするmiRNAへの選択的結合性を十分に発揮することができる。そのような鎖長の短いオリゴ核酸プローブは、周知の化学合成法等により容易に調製することができる。
　核酸プローブは、対象のmiRNAと完全に相補的な塩基配列とすることが好ましいが、一部に相違があっても、対象のmiRNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズできる程度に相同性の高い塩基配列であれば、捕捉プローブとして使用可能である。
　ハイブリダイゼーション時のストリンジェンシーは、温度、塩濃度、プローブの鎖長、プローブのヌクレオチド配列のGC含量及びハイブリダイゼーション緩衝液中のカオトロピック剤の濃度の関数であることが知られている。ストリンジェントな条件としては、例えば、Sambrook, J. et al. (1998) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkに記載された条件などを用いることができる。ストリンジェントな温度条件は、約30℃以上である。その他の条件としては、ハイブリダイゼーション時間、洗浄剤（例えば、SDS）の濃度、及びキャリアDNAの存否等であり、これらの条件を組み合わせることによって、様々なストリンジェンシーを設定することができる。当業者は、所望する検体RNAの検出のために用意した捕捉プローブとしての機能を得るための条件を適宜決定することができる。
　miRNAの配列情報は、GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）等のデータベースやmiRBaseのウェブサイト（http://www.mirbase.org/）から入手することができる。基準miRNA捕捉プローブ、標的miRNA捕捉プローブ及び補正用標準核酸捕捉プローブは、これらのサイトから入手できる配列情報に基づいて設計することができる。
　支持体上に固定化されるmiRNA捕捉プローブの数は特に限定されない。例えば、配列が同定されている公知のmiRNAの全てを網羅する数のmiRNA捕捉プローブを支持体上に固定化したものを用いて、miRNAの存在量を測定してもよいし、検査目的等に応じて所望の数のmiRNA捕捉プローブを支持体上に固定化したものを用いてもよい。
　捕捉プローブが整列固定化される支持体としては、公知のマイクロアレイやマクロアレイ等で使用されている支持体と同様のものを用いることができ、例えば、スライドガラスや膜、ビーズなどを用いることができる。特許第4244788号等に記載されている、表面に複数の凸部を有する形状の支持体を用いることもできる。支持体の材質は、特に限定されないが、ガラス、セラミック、シリコンなどの無機材料；ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、シリコーンゴム等のポリマーなどを挙げることができる。
　支持体に捕捉プローブを固定化する方法としては、支持体表面上でオリゴDNAを合成する方法と、あらかじめ合成しておいたオリゴDNAを支持体表面へ滴下し固定する方法が知られている。
　前者の方法としては、Ronaldらの方法（米国特許第5705610号明細書）、Michelらの方法（米国特許第6142266号明細書）、Francescoらの方法（米国特許第7037659号明細書）が挙げられる。これらの方法ではDNA合成反応時に有機溶媒を用いるため、支持体は有機溶媒に耐性のある材質であることが望ましい。また、Francescoらの方法では、支持体の裏面から光を照射してDNA合成を制御するため、支持体は透光性を有する材質であることが好ましい。
　後者の方法としては、廣田らの方法（特許第3922454号）やスポッターを用いる方法を挙げることができる。スポットの方式としては、固相へのピン先端の機械的な接触によるピン方式、インクジェットプリンターの原理を利用したインクジェット方式、毛細管によるキャピラリー方式等が挙げられる。スポット処理した後は、必要に応じてUV照射によるクロスリンキング、表面のブロッキング等の後処理が行なわれる。表面処理した支持体表面に共有結合でオリゴDNAを固定化させるため、オリゴDNAの末端にはアミノ基やSH基等の官能基が導入される。支持体の表面修飾は、通常、アミノ基等を有するシランカップリング剤処理によって行なわれる。
　支持体上に固定化された各miRNA捕捉プローブとのハイブリダイゼーションは、検体から抽出したRNAから、標識物質で標識された核酸試料（検体由来の核酸試料）を調製し、この標識核酸試料をプローブと接触させることにより実施する。「検体由来の核酸試料」には、検体から抽出したRNAのほか、該RNAから逆転写反応により調製されたcDNA及びcRNAが包含される。標識された検体由来の核酸試料は、検体RNAを直接的又は間接的に標識物質で標識したものでもよいし、また、検体RNAから調製されたcDNAやcRNAを直接的又は間接的に標識物質で標識したものでもよい。
　検体由来の核酸試料に標識物質を結合させる方法としては、核酸試料の3’末端に標識物質を結合させる方法、5’末端に標識物質を結合させる方法、標識物質が結合したヌクレオチドを核酸に取り込ませる方法を挙げることができる。3’末端に標識物質を結合させる方法、5’末端に標識物質を結合させる方法では酵素反応を用いることができる。酵素反応には、T4 RNA LigaseやTerminal Deoxitidil Transferase、Poly A polymeraseなどを用いることができる。いずれの標識方法も「Shao-Yao Ying編、miRNA実験プロトコール、羊土社、2008年」に記載されている方法を参考にすることができる。また、RNAの末端に直接又は間接的に標識物質を結合させるためのキットが各種市販されている。例えば、3’末端に直接又は間接的に標識物質を結合させるキットとしては、“3D-Gene” miRNA labeling kit（東レ社）、miRCURY miRNA HyPower labeling kit（エキシコン社）、NCode miRNA Labeling system（ライフテクノロジーズ社）、FlashTag Biotin RNA Labeling Kit（ジェニスフィア社）等を例示することができる。
　このほか、従来法と同様に、標識したデオキシリボヌクレオチド又は標識したリボヌクレオチドの存在下で検体RNAからcDNA又はcRNAを合成することにより、標識物質が取り込まれたcDNA又はcRNAを調製し、これをアレイ上のプローブとハイブリダイズさせる、という方法も可能である。
　本発明において、使用できる標識物質としては、公知のマイクロアレイ解析においても使用されている各種の標識物質を挙げることができる。具体的には、蛍光色素、りん光色素、酵素、放射線同位体などが挙げられるが、これらに限定されない。好ましいのは、測定が簡便で、検出しやすい蛍光色素である。具体的には、シアニン（シアニン2）、アミノメチルクマリン、フルオロセイン、インドカルボシアニン（シアニン3）、シアニン3．5、テトラメチルローダミン、ローダミンレッド、テキサスレッド、インドカルボシアニン（シアニン5）、シアニン5．5、シアニン7、オイスターなどの公知の蛍光色素が挙げられるが、これらに限定されない。
　また、標識物質としては、発光性を有する半導体微粒子を用いてもよい。このような半導体微粒子としては、例えばカドミウムセレン（CdSe）、カドミウムテルル（CdTe）、インジウムガリウムリン（InGaP）、シルバーインジウム硫化亜鉛（AgInZnS）などが挙げられる。
　上記のようにして標識された検体由来の核酸試料を支持体上のmiRNA捕捉プローブと接触させ、核酸試料とプローブをハイブリダイズさせる。このハイブリダイゼーション工程は、従来と全く同様に行うことができる。反応温度及び時間は、ハイブリダイズさせる核酸の鎖長に応じて適宜選択されるが、核酸のハイブリダイゼーションの場合、通常、30℃～70℃程度で1分間～十数時間である。ハイブリダイゼーションを行ない、洗浄後、支持体上の個々のプローブ固定化領域における標識物質からのシグナル強度を検出する。シグナル強度の検出は、標識物質の種類に応じて適当なシグナル読取装置を用いて行なう。蛍光色素を標識物質として用いた場合には、蛍光顕微鏡や蛍光スキャナー等を用いればよい。
　検出された蛍光強度の測定値は、周辺ノイズと比較される。具体的には、プローブ固定化領域から得られた測定値と、それ以外の位置から得られた測定値を比較し、前者の数値が上回っている場合を検出された（有効判定陽性）とする。
　検出された測定値に、バックグラウンドノイズが含まれている場合には、バックグラウンドノイズを減算してもよい。周辺ノイズをバックグラウンドノイズとして、検出した測定値から減算することもできる。その他、「藤淵航、堀本勝久編、マイクロアレイデータ統計解析プロトコール、羊土社、2008年」に記載されている方法を用いてもよい。
＜補正処理＞
　本発明において、測定工程で得られた標的miRNA及び基準miRNAの存在量の測定値をそのまま後述する比較工程、判定工程で用いてもよいが、例えば、体液検体中の標的miRNAの発現解析を行う場合には、標的miRNAの測定値及び基準miRNAの測定値の補正を行ない、補正後の測定値を発現量とし、この発現量を用いて比較工程及び判定工程を実施してよい。つまり、測定工程は、標的miRNA及び基準miRNAの測定値を補正する処理を含んでいてもよい。
　補正方法としては、従来法を用いることができ、例えば、検出された全miRNAの測定値を用いて補正を行うグローバルノーマリゼーション法、クォンタイルノーマリゼーション法などが挙げられる。また、U1 snoRNA、U2 snoRNA、U3 snoRNA、U4 snoRNA、U5 snoRNA、U6 snoRNA、5S rRNA、5.8S rRNAといったハウスキーピングRNA（特開2007-75095号公報; 特開2007-97429号公報など参照）や、特定の補正用内因性miRNA（Roberts, T.C.ら、2014年、PLoS ONE、第9(2)巻、e89237; Chen, X.ら、2013年、PLoS ONE、第8(11)巻、e79652; WO 2016/043170など参照）を用いて補正してもよいし、RNAの抽出時や標識時に添加した外部標準核酸を用いて補正してもよい。「内因性」とは、人工的に検体に添加されたものではなく、検体に自然に存在することを意味する。例えば「内因性miRNA」と言った場合、検体中に自然に存在している、その検体を提供した生物に由来するmiRNAを示す。体液検体中の標的miRNAの発現解析において本発明の方法を適用しmiRNAの品質評価を行なう場合は、検体に依存されないスパイクコントロールなどの外部標準核酸を利用した補正方法を用いることが好ましい。
＜比較工程＞
　本発明の比較工程は、前記測定工程で得られた体液検体中の1又は複数の基準miRNAの存在量測定値又はその代表値を、標準体液検体中の1又は複数の基準miRNAの存在量測定値又はその代表値と比較して、両検体中の各基準miRNAの存在量測定値又はその代表値の差又は比を得る工程である。ここで、基準miRNAの存在量測定値又はその代表値の差又は比は、典型的には、次の式で求められる差又は比をいう。
基準miRNAの存在量測定値又はその代表値の差
＝(体液検体中の存在量測定値又は代表値)－(標準体液検体中の存在量測定値又は代表値)・・・(式I)
基準miRNAの存在量測定値又はその代表値の比
＝(体液検体中の存在量測定値又は代表値)／(標準体液検体中の存在量測定値又は代表値)・・・(式II)
　もっとも、式I、式IIに代えて、計算の順序を逆にした以下の式I'、式II'にて差又は比を計算しても差し支えない。
基準miRNAの存在量測定値又はその代表値の差
＝(標準体液検体中の存在量測定値又は代表値)－(体液検体中の存在量測定値又は代表値)・・・(式I')
基準miRNAの存在量測定値又はその代表値の比
＝(標準体液検体中の存在量測定値又は代表値)／(体液検体中の存在量測定値又は代表値)・・・(式II')
　基準miRNAの存在量測定値又は代表値の差又は比は、差又は比を算出した後に対数値に変換してもよいし、先に検体中存在量を対数変換してから差又は比を算出してもよい。本発明において、対数値とは、底が２の対数に変換された値を意味する。
　判定工程の説明で後述するように、配列番号1～12で示される塩基配列からなるmiRNAのうち、1つのmiRNAを基準miRNAとして用いる場合には、体液検体に含まれる当該基準miRNAの存在量測定値と標準体液検体に含まれる当該基準miRNAの存在量測定値の差又は比を求めて判定に用いればよい。また、複数のmiRNAを基準miRNAとして用いる場合には、体液検体に含まれる当該複数の基準miRNAの存在量測定値の代表値と標準体液検体に含まれる当該複数の基準miRNAの存在量測定値の代表値を求め、その両代表値の差又は比を求めて判定に使用することができる。代表値としては、後述する通り、平均値又は中央値を用いることができる。あるいは、個々の基準miRNAごとに体液検体中の存在量測定値と標準体液検体中の存在量測定値との差又は比を求め、次の判定工程において、基準miRNAごとに所定基準に従って判定を行い、体液検体に含まれるmiRNAの品質の良否を判定することができる。
＜判定工程＞
　本発明の判定工程は、比較工程で得られた体液検体中の1又は複数の基準miRNAの存在量測定値又はその代表値と、前記標準体液検体中の1又は複数の基準miRNAの存在量測定値又はその代表値との差又は比に基づいて、体液検体に含まれるmiRNAの品質の良否を判定する工程である。miRNAの品質の良否の判定は、体液検体と標準体液検体に含まれる1又は複数の基準miRNAの存在量測定値又はその代表値の差又は比について、品質の良否を判定するための基準とする閾値を予め設定し、その閾値を超えるか否かによって品質の良否（良又は不良）を判定することができる。すなわち、上記式I又は式IIで得られる基準miRNAの存在量測定値又はその代表値の差又は比が、予め任意に定めた閾値を超える場合に、体液検体に含まれるmiRNAの品質が良であると判定し、当該基準miRNAの存在量測定値又はその代表値の差又は比が閾値以下である場合に、体液検体に含まれるmiRNAの品質を不良であると判定することができる。あるいは、上記式I'又は式II'で得られる差又は比を用いる場合には、当該差又は比が予め任意に定めた基準とする閾値を下回る場合に、体液検体に含まれるmiRNAの品質が良であると判定し、当該差又は比が該閾値以上である場合に、体液検体に含まれるmiRNAの品質を不良であると判定することができる。
　判定工程においては、上述した通り、比較工程で得られた各基準miRNAの存在量測定値又はその代表値の差又は比を対数に変換し、その対数値を用いて判定を行ってもよい。
　配列番号1～12で示される塩基配列からなるmiRNAのうち、1つのmiRNAを基準miRNAとして用いる場合には、比較工程において、体液検体に含まれる当該基準miRNAの存在量測定値と標準体液検体に含まれる当該基準miRNAの存在量測定値の差又は比を求め、この差又は比の値が基準とする閾値を超えるか否か（式I, IIの場合）、又は下回るか否か（式I', II'の場合）によって品質の良否を判定することができる。
　基準miRNAとして、配列番号1～12で示される塩基配列からなるmiRNAのうち複数の基準miRNAを用いる場合には、体液検体に含まれる当該複数の基準miRNAの存在量測定値の代表値と標準体液検体に含まれる当該複数の基準miRNAの存在量測定値の代表値を求め、これら代表値の差又は比が基準とする閾値を超えるか否か（式I, IIの場合）、又は下回るか否か（式I', II'の場合）によって品質の良否を判定することができる。ここで、代表値としては、複数の基準miRNAの存在量の平均値又は中央値を用いることができる。
　また、基準miRNAとして、配列番号1～12で示される塩基配列からなるmiRNAのうち複数の基準miRNAを用いる場合には、個々の基準miRNAごとに体液検体に含まれる存在量測定値と標準体液検体に含まれる存在量測定値との差又は比を求め、基準miRNAごとに基準とする閾値を超えるか否か／下回るか否かを判定してもよい。この場合には、複数の基準miRNAによる個々の判定に優先順位付けや重み付けをすること等により、さらなる判断基準を設けることが好ましい。1つの基準miRNAを用いる場合には、配列番号1～12に示すmiRNAから1つのmiRNAを任意に選択すればよいが、保存時間に依存して存在量が顕著に減少するものを選択することが好ましく、例えば、hsa-miR-125a-3p（配列番号1）、hsa-miR-125b-1-3p（配列番号2）のいずれかを選択することが好ましい。また、より厳格な又は高精度の評価を行う場合には、複数の基準miRNAを用いることが好ましい。例えば、2～5個の基準miRNAを用いることがより好ましく、特に、hsa-miR-125a-3p及びhsa-miR-125b-1-3pの2つを選択することが好ましい。もっとも、下記実施例に記載する通り、hsa-miR-125a-3p及びhsa-miR-125b-1-3pのいずれか一方のみを複数の基準miRNAのうちの１つとして採用した場合でも、十分に精度よく品質の良否を判定することができる。また、例えば遺伝子発現解析を目的とする場合であって、発現解析対象である標的miRNAが配列番号1～12に示すmiRNAのいずれかに該当する場合は、当該標的miRNAを除くmiRNAから基準miRNAを選択すればよい。
　判定の基準とする閾値は、評価の目的や求める精度などに応じて任意に設定することができる。例えば、標準体液検体に含まれる基準miRNAの存在量測定値を閾値に設定することができる。
　以下、式I又は式IIに従って基準miRNAの存在量測定値又は代表値の差又は比を計算する場合の判定工程について、より具体的に説明する。式I'又は式II'に従う場合は、下記に準じて適当な閾値を採用し、その閾値を下回る場合にmiRNAの品質を良と判定すればよい。
　1つの基準miRNAを用いる場合には、例えば、以下の式1A～9Aないしは式1B～9Bに示す判断基準に従って、体液検体中の基準miRNAの存在量測定値と標準体液検体中の基準miRNAの存在量測定値とを比較し、品質の良否を判定することができる。
　式1Aに示すように、体液検体中の基準miRNAの存在量測定値eと標準体液検体中の基準miRNAの存在量測定値Eの比（e／E）を求め、この値が閾値t1を上回る場合に当該体液検体に含まれるmiRNAの品質を良と判定することができる。閾値t1は、好ましくは0.7以上であり、より好ましくは0.8以上である。
　　e／E＞t1　　（式1A）
　また、式2Aに示すように、体液検体中の基準miRNAの存在量測定値eと標準体液検体中の基準miRNAの存在量測定値Eの差（e－E）を求め、この値が閾値t2を上回る場合に体液検体に含まれるmiRNAの品質を良と判定することができる。miRNAの種類によってその存在量は異なることがあるので、閾値t2は判定に用いる基準miRNAに応じて任意に設定することができる。例えば、閾値t2は、-50以上0以下の範囲で設定することができ、より厳しい基準で判定する場合には、-20以上0以下の範囲で設定することができる。例えば、閾値t2を0とし、存在量測定値の差（e－E）が0より大きい（プラス）である場合に、体液検体に含まれるmiRNAの品質を良と判定することができる。
　　e－E＞t2　　（式2A）
　また、閾値t3として標準体液検体中の基準miRNAの存在量測定値Eを採用してもよく、その場合は、式3Aに示すように、体液検体中の基準miRNAの存在量測定値eが閾値t3、すなわち標準体液検体中の基準miRNAの存在量測定値Eを上回る場合に、体液検体に含まれるmiRNAの品質を良と判定することができる。これは、式2Aにおいて閾値t2を0とする場合に相当する。従って、式3Aは式2Aの一態様に該当する。すなわち、式3Aは存在量測定値の差に基づく判定に該当する。
　　e＞E（＝t3）　　（式3A）
　体液検体中のmiRNAの分解のほか、実験操作上、測定結果へ影響を与える要因を考慮する場合には、RNAの分解に依存しない安定に存在するmiRNAである内因性miRNA（以下、「非分解内因性miRNA」という。）を利用して判定をしてもよい。非分解内因性miRNAは、体液検体中に、その種類に依存せず一定量が含まれているmiRNAであり、好ましくはRNA分解前（検体を入手又は調製した直後のもの等で、それに含まれる核酸試料の分解が進行していないような時点）とRNA分解後（検体の入手又は調製後、一定時間が経過しており、それに含まれる核酸試料の分解が進行していると予想される時点）との存在量測定値の比が0．90以上、より好ましくは0．95以上であるようなmiRNAを選定することができる。例えば、配列番号25で示される塩基配列からなるhsa-miR-149-3pや、配列番号26で示される塩基配列からなるhsa-miR-4463等を非分解内因性miRNAとして用いることができる。体液検体中の標的miRNAの発現解析を行う場合には、前記の補正処理で用いる「補正用内因性miRNA」を「非分解内因性miRNA」として共通に使用することができる。
　非分解内因性miRNAを利用して体液検体に含まれるmiRNAの品質の良否を判定する場合には、例えば、式4Aに示すように、体液検体中の基準miRNAの存在量測定値eと非分解内因性miRNAの存在量測定値cとの比（存在量比e／c）、及び、標準体液検体中の基準miRNAの存在量測定値Eと非分解内因性miRNAの存在量測定値Cとの比（存在量比E／C）を求め、これら2つの各存在量比の比が閾値t4を上回る場合に、体液検体に含まれるmiRNAの品質を良と判定することができる。
　あるいは、式5Aに示すように、体液検体中の基準miRNAの存在量測定値eと非分解内因性miRNAの存在量測定値cとの差（存在量差e－c）、及び、標準体液検体中の基準miRNAの存在量測定値Eと非分解内因性miRNAの存在量測定値Cとの差（存在量差E－C）を求め、これら2つの各存在量差の比が閾値t5を上回る場合に、体液検体に含まれるmiRNAの品質を良と判定することができる。この場合の閾値t4及びt5は、好ましくは0.7であり、より好ましくは0.8である。
　式4A、式5Aは、存在量測定値の比に基づく判定に該当する。
　　（e／c）／（E／C）＞t4　　（式4A）
　　（e－c）／（E－C）＞t5　　（式5A）
　また、式6Aに示すように、体液検体中の基準miRNAの存在量測定値eと非分解内因性miRNAの存在量測定値cとの比（存在量比e／c）、及び、標準体液検体中の基準miRNAの存在量測定値Eと非分解内因性miRNAの存在量測定値Cとの比（存在量比E／C）を求め、これら2つの各存在量比の差が閾値t6を上回る場合に、体液検体に含まれるmiRNAの品質を良と判定することができる。
　あるいは、式7Aに示すように、体液検体中の基準miRNAの存在量測定値eと非分解内因性miRNAの存在量測定値cとの差（存在量差e－c）、及び、標準体液検体中の基準miRNAの存在量測定値Eと非分解内因性miRNAの存在量測定値Cとの差（存在量差E－C）を求め、これら2つの各存在量差の差が閾値t7を上回る場合に、体液検体に含まれるmiRNAの品質を良と判定することができる。閾値t6及びt7は、例えば-50以上0以下の範囲で設定することができ、例えば0であり得る。
　式6A、式7Aは、存在量測定値の差に基づく判定に該当する。
　　（e／c）－（E／C）＞t6　　（式6A）
　　（e－c）－（E－C）＞t7　　（式7A）
　また、閾値t8として、標準体液検体中の基準miRNAの存在量測定値Eと非分解内因性miRNAの存在量測定値Cとの比（存在量比E／C）を採用してもよく、その場合は、式8Aに示すように、体液検体中の基準miRNAの存在量測定値eと非分解内因性miRNAの存在量測定値cとの比（存在量比e／c）が閾値t8、すなわち標準体液検体中の基準miRNAの存在量測定値Eと非分解内因性miRNAの存在量測定値Cとの比（存在量比E／C）を上回る場合に、体液検体に含まれるmiRNAの品質を良と判定することができる。これは、式6Aを採用する場合において、閾値t6を0とする場合に相当する。従って、式8Aは式6Aの一態様であり、存在量測定値の差に基づく判定に該当する。
　あるいは、閾値t9として、標準体液検体中の基準miRNAの存在量測定値Eと非分解内因性miRNAの存在量測定値Cとの差（存在量差E－C）を採用してもよく、その場合は、式9Aに示すように、体液検体中の基準miRNAの存在量測定値eと非分解内因性miRNAの存在量測定値cとの差（存在量差e－c）が閾値t9、すなわち標準体液検体中の基準miRNAの存在量測定値Eと非分解内因性miRNAの存在量測定値Cとの差（存在量差E－C）を上回る場合に、体液検体に含まれるmiRNAの品質を良と判定することができる。これは、式7Aを採用する場合において、閾値t7を0とする場合に相当する。従って、式9Aは式7Aの一態様であり、存在量測定値の差に基づく判定に該当する。
　　e／c＞E／C（＝t8）　　（式8A）
　　e－c＞E－C（＝t9）　　（式9A）
　複数のmiRNAを基準miRNAとして用いる場合には、体液検体中の複数の基準miRNAの存在量測定値の代表値と、標準体液検体中の当該複数の基準miRNAの存在量測定値の代表値を求め、その両代表値の差又は比を求めて判定に使用することができる。具体的には、上記式1A～式9Aに示す判断基準において、体液検体中の基準miRNAの存在量測定値eに代えて体液検体中の複数の基準miRNAの存在量測定値の代表値rを、標準体液検体中の基準miRNAの存在量測定値Eに代えて標準体液検体中の複数の基準miRNAの存在量測定値の代表値Rを、それぞれ用いればよい。つまり、下記の式1B～式9Bのいずれかを用いて判定すればよい。代表値としては、各測定値の平均値又は中央値を使用することができる。
　　r／R＞t1　　（式1B）
　　r－R＞t2　　（式2B）
　　r＞R（＝t3）　　（式3B）
　　（r／c）／（R／C）＞t4　　（式4B）
　　（r－c）／（R－C）＞t5　　（式5B）
　　（r／c）－（R／C）＞t6　　（式6B）
　　（r－c）－（R－C）＞t7　　（式7B）
　　r／c＞R／C（＝t8）　　（式8B）
　　r－c＞R－C（＝t9）　　（式9B）。
　ここで、上記の式1A～式9A、式1B～式9Bにおいて、実験の誤差等を考慮して、閾値t1～t9に一定の誤差αの幅を持たせて、それぞれ「t1±α」～「t9±α」としてもよい。この場合の誤差αは任意に設定すればよいが、例えば、式2Aにおいては、Eの10％程度をαとして設定して閾値t2に幅を持たせることができる。
　また、各閾値として、存在量の測定値を対数に変換したものを用いてもよい。この場合、その変換にあわせて適切な閾値を設定すればよい。例えば、式1Aを適用する場合に、基準miRNAの存在量比（e／E）を対数値に変換し、その変換にあわせて閾値t1を設定すればよい。この場合、結果的に、存在量測定値e、Eの各対数値の差を求めることになる。
　また、個々の基準miRNAごとに体液検体中の存在量測定値と標準体液検体中の存在量測定値との差又は比を求め、基準miRNAごとに判定基準に従って判定を行い、その結果を総合して体液検体に含まれるmiRNAの品質の良否を判定することができる。
　具体的には、例えば、基準miRNAごとの判定において、良と判定された基準miRNAの数が、不良と判定された基準miRNAの数又は任意の所定数を上回る場合に、体液検体に含まれるmiRNAの品質を良と判定することができる。逆に、不良と判定された基準miRNAの数が、良と判定された基準miRNAの数又は所定数を上回る場合に、検体に含まれるmiRNAの品質を不良と判定することができる。また、より厳格な又は高精度の評価を行う場合には、良判定を与えた基準miRNAの数よりも特定の1種の基準miRNAによる不良判定を優先してもよい。すなわち、その特定の1種の基準miRNAの判定結果が不良の場合には、良判定の基準miRNAの数にかかわらず、体液検体に含まれるmiRNAの品質を不良と判定してもよい。そのような特定の1種の基準miRNAとしては、hsa-miR-125a-3p（配列番号1）及びhsa-miR-125b-1-3p（配列番号2）のいずれかを好ましく採用できる。
　また、本発明は、上記本発明のmiRNA品質評価方法に従い、体液検体由来のmiRNAの品質を評価するために、１又は複数のコンピュータに、
　体液検体及び標準体液検体より調製された、miRNAを含むRNAサンプルを用いてそれぞれ測定された、配列番号１～１２で示される塩基配列からなるmiRNAから選択される１又は複数の基準miRNAの体液検体及び標準体液検体中の存在量測定値を取得する、測定値取得工程；
　体液検体中の１又は複数の基準miRNAの存在量測定値又はその代表値を、標準体液検体中の１又は複数の基準miRNAの存在量測定値又はその代表値と比較して、体液検体及び標準体液検体間での１又は複数の基準miRNAの存在量測定値又はその代表値の差又は比を得る、比較工程；及び
　前記比較工程で得られた、１又は複数の基準miRNAの存在量測定値又はその代表値の差又は比に基づいて、体液検体由来のmiRNAの品質の良否を判定する、判定工程
を実行させるための（すなわち、1又は複数のコンピュータに上記各工程を実行させる命令を含む）プログラム、及び該プログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体を提供する。
　例えば、miRNAの発現量を解析する装置に該プログラムが組み込まれ、測定値取得工程において、該装置の発現測定部又は該装置とは別個の発現測定装置が測定した基準miRNA発現量（すなわち検体中の基準miRNA存在量）の測定値を取得し、該測定値を用いて各工程が実施されてよい。取得する測定値は、補正済みの測定値であってもよい。また、該プログラムが、取得した測定値を補正する処理をコンピュータに実行させる命令を含んでいてもよい。各工程の詳細は、本発明のmiRNA品質評価方法に関して上記に説明した通りである。
　「プログラム」とは、任意の言語や記述方法にて記述されたデータ処理方法であり、ソースコードやバイナリコード等の形式を問わない。なお、「プログラム」は必ずしも単一的に構成されるものに限られず、複数のモジュールやライブラリとして分散構成されるものや、OS（Operating System）に代表される別個のプログラムと協働してその機能を達成するものをも含む。記録媒体を読み取るための具体的な構成、読み取り手順、あるいは、読み取り後のインストール手順等については、周知の構成や手順を用いることができる。
　「記録媒体」は、フレキシブルディスク、光磁気ディスク、ROM、EPROM、EEPROM、CD-ROM、MO、DVD等の任意の「可搬用の物理媒体」（非一過性の記録媒体）であり得る。あるいは、LAN、WAN、インターネットに代表される、ネットワークを介してプログラムを送信する場合の通信回線や搬送波のように、短期にプログラムを保持する「通信媒体」であり得る。
　本発明はまた、配列番号1～12で示される塩基配列からなるmiRNAから選択される1又は複数の基準miRNAを捕捉するためのプローブが固定化された支持体を含む、miRNA品質評価用チップを提供する。また、本発明は、標的miRNAを捕捉するためのプローブと、配列番号1～12で示される塩基配列からなるmiRNAから選択される1又は複数の基準miRNAを捕捉するためのプローブが固定化された支持体を含む、miRNA発現解析用チップを提供する。ここで、標的miRNA、配列番号1～12で示される塩基配列からなるmiRNAから選択される1又は複数の基準miRNA、これらを捕捉するためのプローブ、また、これらの捕捉プローブが固定化される支持体は、前記のとおりである。
　本発明のmiRNA発現解析用チップは、前記の補正処理で用いるハウスキーピングRNA、特定の補正用内因性miRNA、添加する外部標準核酸等の補正用核酸、特に補正用内因性miRNAを捕捉するためのプローブが、さらに支持体に固定化されていてもよい。
　本発明においては、miR-125a-3p、miR-125b-1-3p、miR-3184-5p、miR-4443、miR-4638-5p、miR-4746-3p、miR-5572、miR-575、miR-6798-5p、miR-7110-5p、miR-887-3p、及びmiR-939-5pから選択される1又は複数のmiRNA、好ましくは配列番号１～１２で示される塩基配列からなるmiRNAから選択される１又は複数のmiRNAを、体液検体由来RNAの分解度を測定するための基準miRNAとして使用する。体液検体がヒトの体液検体である場合、配列番号１～１２に示す塩基配列からなるmiRNAから選択される１又は複数のmiRNAを基準miRNAとして使用すればよい。
　「miR-125a-3p遺伝子」又は「miR-125a-3p」という用語は、ヒトのmiR-125a-3p（すなわちhsa-miR-125a-3p、miRBase Accession No. MIMAT0004602）やその他生物種のホモログもしくはオーソログなどを包含する。配列番号１に示すRNA配列はhsa-miR-125a-3pの配列である。hsa-miR-125a-3p遺伝子は、Lagos-Quintana Mら、2002年、Curr Biol、12巻、p735-739に記載される方法によって得ることができる。また、「miR-125a-3p」という語には、ヘアピン様構造をとるその前駆体「mir-125a」も包含され、例えば「hsa-miR-125a-3p」という語にはhsa-mir-125a（miRBase Accession No. MI0000469、配列番号13）も包含される。
　「miR-125b-1-3p遺伝子」又は「miR-125b-1-3p」という用語は、ヒトのmiR-125b-1-3p（すなわちhsa-miR-125b-1-3p、miRBase Accession No. MIMAT0004592）やその他生物種のホモログもしくはオーソログなどを包含する。配列番号２に示すRNA配列はhsa-miR-125b-1-3pの配列である。hsa-miR-125b-1-3p遺伝子は、Lagos-Quintana Mら、2002年、Curr Biol、12巻、p735-739に記載される方法によって得ることができる。また、「miR-125b-1-3p」という語には、ヘアピン様構造をとるその前駆体「mir-125b-1」も包含され、例えば「hsa-miR-125b-1-3p」という語にはhsa-mir-125b-1（miRBase Accession No. MI0000446、配列番号14）も包含される。
　「miR-3184-5p遺伝子」又は「miR-3184-5p」という用語は、ヒトのmiR-3184-5p（すなわちhsa-miR-3184-5p、miRBase Accession No. MIMAT0015064）やその他生物種のホモログもしくはオーソログなどを包含する。配列番号３に示すRNA配列はhsa-miR-3184-5pの配列である。hsa-miR-3184-5p遺伝子は、Stark MSら、2010年、PLoS One、5巻、e9685に記載される方法によって得ることができる。また、「miR-3184-5p」という語には、ヘアピン様構造をとるその前駆体「mir-3184」も包含され、例えば「hsa-miR-3184-5p」という語にはhsa-mir-3184（miRBase Accession No. MI0014226、配列番号15）も包含される。
　「miR-4443遺伝子」又は「miR-4443」という用語は、ヒトのmiR-4443（すなわちhsa-miR-4443、miRBase Accession No. MIMAT0018961）やその他生物種のホモログもしくはオーソログなどを包含する。配列番号４に示すRNA配列はhsa-miR-4443の配列である。hsa-miR-4443遺伝子は、Jima DDら、2010年、Blood、116巻、p118-127に記載される方法によって得ることができる。また、「miR-4443」という語には、ヘアピン様構造をとるその前駆体「mir-4443」も包含され、例えば「hsa-miR-4443」という語にはhsa-mir-4443（miRBase Accession No. MI0016786、配列番号16）も包含される。
　「miR-4638-5p遺伝子」又は「miR-4638-5p」という用語は、ヒトのmiR-4638-5p（すなわちhsa-miR-4638-5p、miRBase Accession No. MIMAT0019695）やその他生物種のホモログもしくはオーソログなどを包含する。配列番号５に示すRNA配列はhsa-miR-4638-5pの配列である。hsa-miR-4638-5p遺伝子は、Persson Hら、2011年、Cancer Res、71巻、p78-86に記載される方法によって得ることができる。また、「miR-4638-5p」という語には、ヘアピン様構造をとるその前駆体「mir-4638」も包含され、例えば「hsa-miR-4638-5p」という語にはhsa-miR-4638（miRBase Accession No. MI0017265、配列番号17）も包含される。
　「miR-4746-3p遺伝子」又は「miR-4746-3p」という用語は、ヒトのmiR-4746-3p（すなわちhsa-miR-4746-3p、miRBase Accession No. MIMAT0019881）やその他生物種のホモログもしくはオーソログなどを包含する。配列番号６に示すRNA配列はhsa-miR-4746-3pの配列である。hsa-miR-4746-3p遺伝子は、Persson Hら、2011年、Cancer Res、71巻、p78-86に記載される方法によって得ることができる。また、「miR-4746-3p」という語には、ヘアピン様構造をとるその前駆体「mir-4746」も包含され、例えば「hsa-miR-4746-3p」という語にはhsa-mir-4746（miRBase Accession No. MI0017385、配列番号18）も包含される。
　「miR-5572遺伝子」又は「miR-5572」という用語は、ヒトのmiR-5572（すなわちhsa-miR-5572、miRBase Accession No. MIMAT0022260）やその他生物種のホモログもしくはオーソログなどを包含する。配列番号７に示すRNA配列はhsa-miR-5572の配列である。hsa-miR-5572遺伝子は、Tandon Mら、2012年、Oral Dis、18巻、p127-131に記載される方法によって得ることができる。また、「miR-5572」という語には、ヘアピン様構造をとるその前駆体「mir-5572」も包含され、例えば「hsa-miR-5572」という語にはhsa-mir-5572（miRBase Accession No. MI0019117、配列番号19）も包含される。
　「miR-575遺伝子」又は「miR-575」という用語は、ヒトのmiR-575（すなわちhsa-miR-575、miRBase Accession No. MIMAT0003240）やその他生物種のホモログもしくはオーソログなどを包含する。配列番号８に示すRNA配列はhsa-miR-575の配列である。hsa-miR-575遺伝子は、Cummins JMら、2006年、Proc Natl Acad Sci USA、103巻、p3687-3692に記載される方法によって得ることができる。また、「miR-575」という語には、ヘアピン様構造をとるその前駆体「mir-575」も包含され、例えば「hsa-miR-575」という語にはhsa-mir-575（miRBase Accession No. MI0003582、配列番号20）も包含される。
　「miR-6798-5p遺伝子」又は「miR-6798-5p」という用語は、ヒトのmiR-6798-5p（すなわちhsa-miR-6798-5p、miRBase Accession No. MIMAT0027496）やその他生物種のホモログもしくはオーソログなどを包含する。配列番号９に示すRNA配列はhsa-miR-6798-5pの配列である。hsa-miR-6798-5p遺伝子は、Ladewig Eら、2012年、Genome Res、22巻、p1634-1645に記載される方法によって得ることができる。また、「miR-6798-5p」という語には、ヘアピン様構造をとるその前駆体「mir-6798」も包含され、例えば「hsa-miR-6798-5p」という語にはhsa-mir-6798（miRBase Accession No. MI0022643、配列番号21）も包含される。
　「miR-7110-5p遺伝子」又は「miR-7110-5p」という用語は、ヒトのmiR-7110-5p（すなわちhsa-miR-7110-5p、miRBase Accession No. MIMAT0028117）やその他生物種のホモログもしくはオーソログなどを包含する。配列番号１０に示すRNA配列はhsa-miR-7110-5pの配列である。hsa-miR-7110-5p遺伝子は、Ladewig Eら、2012年、Genome Res、22巻、p1634-1645に記載される方法によって得ることができる。また、「miR-7110-5p」という語には、ヘアピン様構造をとるその前駆体「mir-7110」も包含され、例えば「hsa-miR-7110-5p」という語にはhsa-mir-7110（miRBase Accession No. MI0022961、配列番号22）も包含される。
　「miR-887-3p遺伝子」又は「miR-887-3p」という用語は、ヒトのmiR-887-3（すなわちhsa-miR-887-3p、miRBase Accession No .MIMAT0004951）やその他生物種のホモログもしくはオーソログなどを包含する。配列番号１１に示すRNA配列はhsa-miR-887-3pの配列である。hsa-miR-887-3p遺伝子は、Berezikov Eら、2006年、Genome Res、16巻、p1289-1298に記載される方法によって得ることができる。また、「miR-887-3p」という語には、ヘアピン様構造をとるその前駆体「mir-887」も包含され、例えば「hsa-miR-887-3p」という語にはhsa-mir-887（miRBase Accession No. MI0005562、配列番号23）も包含される。
　「miR-939-5p遺伝子」又は「miR-939-5p」という用語は、ヒトのmiR-939-5p（すなわちhsa-miR-939-5p、miRBase Accession No. MIMAT0004982）やその他生物種のホモログもしくはオーソログなどを包含する。配列番号１２に示すRNA配列はhsa-miR-939-5pの配列である。hsa-miR-939-5p遺伝子は、Lui WOら、2007年、Cancer Res、67巻、p6031-6043に記載される方法によって得ることができる。また、「miR-939-5p」という語には、その前駆体としてヘアピン様構造をとる「mir-939」も包含され、例えば「hsa-miR-939-5p」という語にはhsa-mir-939（miRBase Accession No. MI0005761、配列番号24）も包含される。
　以下、RNAの分解に依存する基準miRNAを選択した過程を含め、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
＜実施例1＞　基準miRNAの選択
（DNAマイクロアレイ）
　東レ株式会社製の“3D-Gene” human miRNA oligo chip（miRBase release 21対応）を用いて以下の実験を行なった。
（血清検体の調製）
　健常ヒト3名よりそれぞれ採血し、血清を調製した。得られた血清を300μLずつ1名につき6本に分注し、うち5本を4℃に設定した冷蔵庫に静置した。1名につき1本はただちに－80℃に設定した冷凍庫に収容した（0時間）。冷蔵庫に静置した血清検体について、6時間、24時間、48時間、72時間および168時間後にそれぞれ回収して、－80℃に設定した冷凍庫に収容した。－80℃の冷凍庫に収容した検体は、下記に述べるRNA抽出作業まで、そのまま静置した。
（検体RNAの調製とmiRNA発現量の測定）
　上記のように調製され、冷凍庫に静置された血清を同時に溶解し、血清検体に含まれるRNA（以下、検体RNAという。）を抽出した。抽出には、“3D-Gene” RNA extraction reagent from liquid sample kit（東レ社）を用いた。
　得られた検体RNAを、“3D-Gene” miRNA labeling kit（東レ社）を用いて標識した。標識時には、miRNAの測定値を発現量に補正するために、外部標準核酸を添加した。標識した検体RNAについて、“3D-Gene” miRNA chip（東レ社）を用い、その標準プロトコールに従い、ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後のDNAマイクロアレイをマイクロアレイスキャナー（東レ社）に供して蛍光強度を測定した。スキャナーの設定は、レーザー出力100％、フォトマルチプライヤーの電圧設定をAUTO設定にした。
　DNAマイクロアレイで検出された各miRNAの測定値を、底が2の対数に変換し、標識時に添加した外部標準核酸による補正を行い、各miRNAの発現量を取得した。
　以上のようにして、DNAマイクロアレイでの検出後0、6、24、48、72、168時間、4℃で静置された血清について、各静置時間経過時における各miRNAの発現量を3回測定し、その平均値を得た。
（基準miRNAの選択）
　上記のようにして得られた各血清検体のmiRNA発現量を比較し、静置時間に依存して発現量（検体中存在量）が変動する程度の大きいmiRNAを抽出することで、基準miRNAの選択を行った。
　まず、静置0時間経過時の各miRNAの発現量を基準とし、静置6、24、48、72、168時間経過時の各miRNAの発現量との比（（6、24、48、72又は168時間経過時の発現量）／0時間の発現量）を得た。
　次に、検出されたmiRNAのうち、高発現領域で安定して検出されるmiRNAに絞り込みをした。
　絞り込んだmiRNAのなかから、静置時間の経過に依存して発現量が変動する程度が大きいmiRNAを選択するため、統計言語「R」のパッケージ「SAM」（Tusher VG et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA，2001，98（9），5116－5121）を用いて、SAMの統計量が－1以下であるmiRNAを抽出した。抽出された上位12種のmiRNAとその発現量比を表１に示す。
　表１に示すmiRNA（配列番号1～12）は、4℃という、血清中のmiRNAが比較的不安定な状態で保存される条件において、継時的に発現量が低下し、その程度が大きかった。また、冷蔵庫での静置時間が0時間時の血清検体と168時間経過時の血清検体で検出された全miRNAの発現量において、その両血清検体間の相関係数は0.95以下であったことから、168時間経過時点で血清検体中のRNAの分解が進行していることが確認された。このことから、表１に示すmiRNAは、血清検体に含まれるRNAの分解に依存して、経時的にその発現量（検体中存在量）が変動するmiRNA指標として利用できることが確認された。すなわち、表１に示すmiRNAは、その発現量を測定することによって、血清検体のmiRNAの品質（分解の程度）を知ることが可能であることが分かった。特にhsa-miR-125a-3p（配列番号1）およびhsa-miR-125b-1-3p（配列番号2）は、早期（48時間経過時）から鋭敏な変動を示しており、より高精度な品質の評価に適していることが分かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　実施例1の結果より、以下の実施例2～6では、基準miRNAの発現量比の閾値を0.8と設定し、これを上回る場合に、その検体に含まれるmiRNAの品質を良と判定した。
＜実施例2＞
　健常ヒト1名より採血し、血清検体を調製した。得られた血清を300μL分注し、ただちに-80℃に設定した冷凍庫に収容した。RNAの抽出には、“3D-Gene” RNA extraction reagent from liquid sample kit（東レ社）を用いた。
　得られた検体RNAを、“3D-Gene” miRNA labeling kit（東レ社）を用いて標識し、標識時には、miRNAの測定値を発現量に補正するために、外部標準核酸を添加した。標識した検体由来RNAは、“3D-Gene” miRNA chip（東レ社）を用い、その標準プロトコールに従い、ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後のDNAマイクロアレイをマイクロアレイスキャナー（東レ社）に供して蛍光強度を測定した。スキャナーの設定は、レーザー出力100％、フォトマルチプライヤーの電圧設定をAUTO設定にした。検出されたmiRNAのシグナル値を、外部標準核酸のシグナル値により補正して、発現量を得た。
　品質の判定に用いる基準miRNAとして、hsa-miR-125b-1-3p（配列番号2）を選択した。また、市販されている血清検体を、核酸試料の分解が進行していない状態である標準体液検体として使用し、上記と同様にして、その標準体液検体に含まれるhsa-miR-125b-1-3pの発現量を得た。
　血清検体由来のhsa-miR-125b-1-3pの発現量を、標準体液検体由来のhsa-miR-125b-1-3pの発現量で割り返して、両者の発現量比を求めた。発現量比は0.99であり、閾値0.8を上回ったことから、この血清検体に含まれるmiRNAの品質を良と判定した。
　一方、検出された血清検体由来の全miRNAの発現量と、標準体液検体由来の全miRNAの発現量との相関係数は0.99であり、miRNAの品質が良好で分解していなかったことが示された。これは、上記本発明による品質の判定結果と一致していた。
＜実施例3＞
　品質の判定に用いる基準miRNAとして、hsa-miR-125b-1-3p（配列番号2）の代わりに、hsa-miR-125b-1-3p（配列番号2）とhsa-miR-6798-5p（配列番号9）の2種を用いることに変更し、これ以外は実施例2と同様にして、血清検体由来及び標準体液検体由来のこれら2種のmiRNAの発現量を測定した。
　両検体の発現量の比較は、2種のmiRNAの発現量の平均値を代表値として行った。血清検体の代表値を標準体液検体の代表値で割り、発現量比を求めた。その結果、発現量比は0.98であり、閾値0.8を上回ったことから、この血清検体に含まれるmiRNAの品質を良と判定した。
　一方、検出された血清検体由来の全miRNAの発現量と、標準体液検体由来の全miRNAの発現量との相関係数は0.99であり、miRNAの品質が良好で分解していなかったことが示された。これは、上記本発明による品質の判定結果と一致していた。
＜実施例4＞
　血清検体を、血清を調製後、4℃で静置168時間経過後のものに変更し、これ以外は実施例3と同様にして、血清検体由来及び標準体液検体由来の2種のmiRNA（hsa-miR-125b-1-3p（配列番号2）とhsa-miR-6798-5p（配列番号9））の発現量を測定した。2種のmiRNAの発現量の平均値を代表値とし、代表値から発現量比を求めた。
　その結果、発現量比は0.34であり、閾値0.8を下回ったことから、この血清検体に含まれるmiRNAの品質を不良と判定した。
　一方、検出された血清検体由来の全miRNAの発現量と、標準体液検体由来の全miRNAの発現量との相関係数は0.93と低い値であり、miRNAの分解が生じ、品質が悪化していたことが示された。これは、上記本発明による品質の判定結果と一致していた。
＜実施例5＞
　血清検体を、血清を調製後、4℃で静置72時間経過後のものに変更し、これ以外は実施例3と同様にして、血清検体由来及び標準体液検体由来の2種のmiRNA（hsa-miR-125b-1-3p（配列番号2）とhsa-miR-6798-5p（配列番号9））の発現量を測定した。hsa-miR-125b-1-3pの発現量比とhsa-miR-6798-5pの発現量比をそれぞれ求め、発現量の比較を行なった。
　その結果、hsa-miR-6798-5pの発現量比は0.95であり、閾値0.8を上回ったが、hsa-miR-125b-1-3pの発現量比は0.73であり、閾値0.8を下回った。2種の基準miRNAのうち1種が閾値を下回ったため、検体に含まれるmiRNAの品質を不良と判定した。
　一方、検出された全miRNAの発現量と、標準体液検体由来の全miRNAの発現量との相関係数は0.94とやや低い値であり、miRNAの分解が生じ、品質がやや悪化していたことが示された。これは、上記本発明による品質の判定結果と一致していた。
＜比較例1＞
　本発明のmiRNAの品質の評価方法を、従来の品質評価方法である電気泳動による方法と比較するため、上記実施例4、5で使用した血清検体を用いて電気泳動による品質の評価を実施した。
　その結果、上記静置72時間経過時、静置168時間経過時の血清検体から抽出されたRNAは、核酸試料の分解が進行していない標準体液検体である市販の血清検体から抽出されたRNAと比べて、電気泳動の結果では品質（分解の程度）の差が確認できなかった。
＜比較例2＞
　品質の判定に用いる基準miRNAとして、hsa-miR-125b-1-3p（配列番号2）の代わりに、hsa-miR-149-3p（配列番号25）を用いることに変更し、また、血清検体を、血清調製後に4℃で静置168時間経過後のものに変更し、これら以外は実施例2と同様にして、血清検体由来及び標準体液検体由来のこれら2種のmiRNAの発現量を測定した。ここで、基準miRNAとして用いたhsa-miR-149-3pは、上記実施例1において、静置時間の経過によっても発現量が変動（低下）せず最も安定していたmiRNAの1つである。
　その結果、発現量比は0.98であり、閾値0.8を上回った。本発明の方法と同様の基準で評価した場合には、検体に含まれるmiRNAの品質は良と判定された。しかしながら、検出された血清検体由来の全miRNAの発現量と、標準体液検体由来の全miRNAの発現量との相関係数は0.94であったことから、実際にはmiRNAの分解が生じ、品質は悪化していたことが示された。すなわち、本発明で用いることのできる基準miRNAには該当しないhsa-miR-149-3pを用いた場合には、正しく品質の判定ができなかった。
＜実施例6＞
　実施例2と同様にして、品質の判定に用いる基準miRNAとして、hsa-miR-125b-1-3p（配列番号2）を用いることに加えて、RNAの分解に依存しない非分解内因性miRNAであるhsa-miR-4463（配列番号26）も利用して、血清検体由来及び標準体液検体由来のこれら2種のmiRNAの発現量を測定した。血清検体と標準体液検体のそれぞれについて、hsa-miR-125b-1-3pの発現量をhsa-miR-4463の発現量で割り返した発現量比を求めた後、血清検体由来の発現量比を標準体液検体由来の発現量比で割り返して発現量比の比を求め、閾値と比較した。
　その結果、hsa-miR-125b-1-3pの発現量をhsa-miR-4463の発現量で割り返した発現量比は、血清検体由来では0.97であり、標準体液検体由来では0.98であった。これら発現量比の比は0.99であり、閾値0.8を上回ったため、検体に含まれるmiRNAの品質を良と判定した。
　一方、検出された血清検体由来の全miRNAの発現量と、標準体液検体由来の全miRNAの発現量との相関係数は0.99であり、miRNAの品質が良好で分解していなかったことが示された。これは、上記本発明による品質の判定結果と一致していた。

Claims (16)

  1. 　体液検体由来のmiRNAの品質を評価する方法であって、
    　体液検体及び標準体液検体より調製された、miRNAを含むRNAサンプルを用いて、配列番号１～１２で示される塩基配列からなるmiRNAから選択される１又は複数の基準miRNAの、体液検体及び標準体液検体中の存在量をそれぞれ測定する、測定工程；
    　体液検体中の１又は複数の基準miRNAの存在量測定値又はその代表値を、標準体液検体中の１又は複数の基準miRNAの存在量測定値又はその代表値と比較して、体液検体及び標準体液検体間での１又は複数の基準miRNAの存在量測定値又はその代表値の差又は比を得る、比較工程；及び
    　前記比較工程で得られた、１又は複数の基準miRNAの存在量測定値又はその代表値の差又は比に基づいて、体液検体由来のmiRNAの品質の良否を判定する、判定工程
    を含む、前記方法。
  2. 　前記比較工程は、１の基準miRNAの存在量測定値の差若しくは比、複数の基準miRNAそれぞれの存在量測定値の差若しくは比、又は複数の基準miRNAの存在量測定値の代表値の差若しくは比を得る工程である、請求項１記載の方法。
  3. 　前記判定工程は、前記１若しくは複数の基準miRNAの存在量測定値又はその代表値の差又は比を、基準として予め定められた閾値と対比することを含む、請求項１又は２記載の方法。
  4. 　前記比較工程は、体液検体中の存在量測定値又はその代表値から標準体液検体中の存在量測定値又はその代表値を減算して差を求めること、又は、体液検体中の存在量測定値又はその代表値を標準体液検体中の存在量測定値又はその代表値で除算して比を求めることを含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　前記判定工程は、前記１又は複数の基準miRNAの存在量測定値又はその代表値の差又は比を、基準として予め定められた閾値と対比することを含み、該差又は比が該閾値を超える場合に体液検体由来のmiRNAの品質を良と判定する、請求項４記載の方法。
  6. 　体液検体及び標準体液検体中の複数の基準miRNAの存在量測定値の代表値が、それぞれ、複数の基準miRNAの存在量測定値の平均値又は中央値である、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 　前記測定工程は、体液検体及び標準体液検体中の１又は複数の基準miRNAの存在量測定値を補正することを含み、補正済みの測定値を用いて以後の工程が実施される、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 　前記測定工程は、支持体上に固定化された前記１又は複数の基準miRNAを捕捉するためのプローブと、体液検体及び標準体液検体から抽出され標識物質で標識された核酸試料とをそれぞれ接触させてハイブリダイゼーションを行なうことにより、体液検体及び標準体液検体中の当該１又は複数の基準miRNAの存在量を測定することを含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 　前記測定工程は、体液検体中の前記１又は複数の基準miRNAの存在量の測定と同時に、当該体液検体中の標的miRNAの存在量を測定することを含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 　前記測定工程は、体液検体中の標的miRNAの存在量測定値を補正することを含む、請求項９記載の方法。
  11. 　前記測定工程は、支持体上に固定化された、標的miRNAを捕捉するためのプローブ及び前記１又は複数の基準miRNAを捕捉するためのプローブと、体液検体から抽出され標識物質で標識された核酸試料とを接触させてハイブリダイゼーションを行なうことにより、体液検体中の標的miRNA及び当該１又は複数の基準miRNAの存在量をそれぞれ測定することを含む、請求項９又は１０記載の方法。
  12. 　前記体液検体が、血液、血清又は血漿である、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 　体液検体由来のmiRNAの品質を評価するために、１又は複数のコンピュータに、
    　体液検体及び標準体液検体より調製された、miRNAを含むRNAサンプルを用いてそれぞれ測定された、配列番号１～１２で示される塩基配列からなるmiRNAから選択される１又は複数の基準miRNAの体液検体及び標準体液検体中の存在量測定値を取得する、測定値取得工程；
    　体液検体中の１又は複数の基準miRNAの存在量測定値又はその代表値を、標準体液検体中の１又は複数の基準miRNAの存在量測定値又はその代表値と比較して、体液検体及び標準体液検体間での１又は複数の基準miRNAの存在量測定値又はその代表値の差又は比を得る、比較工程；及び
    　前記比較工程で得られた、１又は複数の基準miRNAの存在量測定値又はその代表値の差又は比に基づいて、体液検体由来のmiRNAの品質の良否を判定する、判定工程
    を実行させるためのプログラム。
  14. 　請求項１３記載のプログラムを記録した、コンピュータ読み取り可能な記録媒体。
  15. 　配列番号１～１２で示される塩基配列からなるmiRNAから選択される１又は複数の基準miRNAを捕捉するためのプローブが固定化された支持体を含む、miRNA品質評価用チップ。
  16. 　標的miRNAを捕捉するためのプローブ及び配列番号１～１２で示される塩基配列からなるmiRNAから選択される１又は複数の基準miRNAを捕捉するためのプローブが固定化された支持体を含む、miRNA発現解析用チップ。
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