JP2011200220A - Rnaの解析方法 - Google Patents
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Abstract
固定液により固定された組織または細胞の遺伝子の発現情報や発現有無を解析することを課題とする。
【解決手段】
固定液により固定された組織または細胞から抽出されたRNAの解析方法であって、該RNA全重量に対する電気泳動における1000〜4000ヌクレオチドの範囲のRNAの重量の比率をA(%)、該RNA全重量に対する電気泳動における4000ヌクレオチドを超える範囲のRNAの重量の比率をB(%)とするとき、該RNAが下式を満たすことを判定するステップを有する、RNAの解析方法。
式:B/A≦1
【選択図】なし
Description
式:B/A≦1。
(RNAの蛍光標識操作における収量確認)
“3D−Gene(登録商標) Human 25k chip”(東レ株式会社)を使用してマイクロアレイ解析を行う場合、蛍光標識されたアンチセンス鎖RNA(aRNA)を1μg準備できることが好ましい。そこで、1μg以上の蛍光標識aRNAを得るための条件について検討した。ヒト胃凍結組織から抽出したRNAを逆転写酵素(“SuperScript(登録商標) III”(インビトロジェン社))を用いてFirst strand cDNAを合成し、次にDNA合成酵素を添加してFirst strand DNAに相補的なSecond strand cDNA合成を行った。シリカベースのカラムを用いて合成したcDNAを精製した後、T7RNAポリメラーゼを用いたin vitro transcription(IVT)を42℃、8時間行うことで、aRNAの増幅反応を行った。この反応を5回実施し、aRNAを計50μg合成した。なお、IVT反応の際に用いるNTP混合物(ATP、GTP、CTP、UTP)に、アミノアリル(AA)基を付加したUTP(AA−UTP)を添加することで、合成aRNAにAA基を導入した。合成したAA−aRNA1μg、2μg、3μg、4μgにCy5(GEヘルスケア社)を標識する操作を各3回行った。各サンプルにおける標識後の回収量を表1に示す。マイクロアレイにより網羅的な遺伝子解析を行う際に1μgの蛍光標識aRNAを得るには、未標識の増幅aRNAが2μg以上あればよいことが示された。
(固定組織からのRNA抽出)
ヒト胃組織のFFPE標本32検体から、それぞれ10μm厚の薄切片を採取し、それぞれ1.5mLのチューブに入れた。そこにキシレン1mLを加えて攪拌し、パラフィンを溶解させた。16,000×gで5分間遠心した後、ピペットを用いて組織を吸わないようにキシレンを除いた。次いで、エタノール1mLを加えて攪拌し、16,000×gで2分間遠心した後、ピペットで組織を吸わないようにエタノールを十分に除去する操作を2回行った。チューブの蓋を開けた状態にして約10分間風乾させ、組織に含まれるエタノールを除いた。プロテイナーゼK溶液(500μg/mL)100μLを添加して組織を懸濁させ、37℃で16時間静置した。16,000×gで2分間遠心して残渣を除いた後、シリカカラムを用いてRNAを精製した。収量および純度(260nmと280nmの比)を分光光度計(サーモサイエンティフィック社、“Nano Drop”(登録商標))により測定した結果、ならびに“Agilent2100バイオアナライザ”(アジレント・テクノロジー社)(以下、バイオアナライザと略す。)により1000〜4000ヌクレオチドの範囲のRNAの重量比率A(%)および4000ヌクレオチドを超える範囲のRNAの重量比率B(%)をそれぞれ算定した結果、さらに、各サンプルのA、Bの値から、B/Aを求めたものを表2および3に、横軸にA、縦軸にB/Aをとってプロットし、B/A≦1のサンプルを“○”、B/A>1のサンプルを“×”として示したものを図1にそれぞれ示す。
B/A≦1である18サンプルについて、それぞれ1μgから、逆転写酵素(“SuperScript(登録商標) III”(インビトロジェン社))を用いてFirst strand cDNAを合成し、次にDNA合成酵素を添加してFirst strand DNAに相補的なSecond strand cDNA合成を行った。シリカベースのカラムを用いて合成したcDNAを精製した後、T7RNAポリメラーゼを用いたin vitro transcription(IVT)を42℃、8時間行い、aRNAの増幅反応を行った。なお、本反応の際、参考例1と同様にして、AA−UTPを用いて増幅aRNAにアミノアリル基を導入した。シリカベースのカラムを用いて、増幅したaRNAを精製した。増幅後の収量より算定した増幅倍率は表2に示すとおりすべてのサンプルで2倍以上であり、B/A≦1を満足するサンプルは、本発明のRNAの解析方法に適したサンプルであることがわかった。
遠心濃縮機(株式会社トミー精工、MV−100)を用いて各増幅aRNA溶液を濃縮し、約1μLとした。そこに“3D−Gene(登録商標) Hybridization Buffer”(東レ株式会社)のキットに添付のSodium Bicarbonate Bufferを5μL添加してピペッティングにより攪拌し、さらにDMSOに溶解させたCy5−NHS(GEヘルスケア社)を5μL加えてピペッティングにより攪拌して、40℃で1時間インキュベートすることでカップリング反応させた。各反応溶液をゲルろ過スピンカラム(バイオラッド社)を用いて未反応のCy5を除去、精製した後、ヌクレアーゼフリーの水で32μLにメスアップした。そこに“3D−Gene(登録商標) Hybridization Buffer”(東レ株式会社)のキットに添付の“5×Fragmentation Buffer”をそれぞれ8μL加え、軽くピペッティングして攪拌し、94℃で15分間処理した。各サンプルをクラッシュアイスで3分間急冷し、“マイクロコンYM−10”(ミリポア社)で精製した。
B/A≦1である18サンプルについて、標識、精製後のaRNAを、以下の操作によりマイクロアレイ解析を行った。各1000ng分のRNAを含む溶液をヌクレアーゼフリー水で16μLに調製し、“3D−Gene”(登録商標)Hybridization Buffer(東レ株式会社)の“Hybridization Buffer A”を2μL加えて、95℃で5分間熱処理した。クラッシュアイスで3分間急冷した後、“Hybridization Buffer B”を232μL加えて、穏やかにピペッティングで攪拌して、250μLの検体溶液を調製した。検体溶液を減圧下で脱気した後、“3D−Gene(登録商標)マウス全遺伝子型DNAチップ”(東レ株式会社)に210μLアプライした。カバーの孔4箇所をシールして塞ぎ、バイオシェーカー(東京理化器械株式会社、MMS−210)の天板に固定したハイブリダイゼーションチャンバー(タカラバイオ株式会社、TX711)にセットした。チャンバー庫内の温度を37℃とし、250rpmで旋回回転させて攪拌しながら、16時間反応させた。
反応後のチップを洗浄した後、スキャナ(3D−Gene(登録商標) Scanner(東レ株式会社))で蛍光シグナル値を測定することにより、有効スポット数を計数した。その結果、表2に示すとおり、有効スポット数は一様に高い結果であった。さらに、同一組織の凍結サンプルから抽出したRNAについて同様の実験を行い、各FFPE標本由来RNAと共通の有効スポットについて、相関係数を算出した。ここで、相関係数とは、2つのデータの相互関係の強さを定量的に表す指標であって、−1から1の間をとり、正の値であれば正の相関、負の値であれば負の相関、ゼロの時は無相関という。一般に、絶対値が0.5以上なら相関がある、0.5未満なら相関がないと判断することができ、2つのデータの相関の度合いが強いほど、その絶対値は1に近づく。なお、相関係数を“Microsoft Office Excel”(マイクロソフト)で求める場合は、「correl」という関数を使用すればよく、本実施例においても当該ソフトウェアを用いた。各サンプルにおける相関係数は表2に示すとおりであり、すべてのサンプルにおいて、凍結組織由来RNAとの高い正の相関関係が確認された。
B/A>1である14サンプルについて、それぞれ1μgから、上記と同様にして、アミノアリル化aRNA(AA−aRNA)として増幅した。増幅後の収量より算定した増幅倍率は表3に示すとおり2倍未満のサンプルがほとんどであり、RNAの標識化に支障をきたした。すなわち、B/A>1のサンプルは高い確率でRNAの解析に供するのが困難であることがわかった。
(FFPEからのRNA抽出)
作成条件、保存期間の異なるマウス(7週齢、雄、Slc:ICR)小脳、肝臓のホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)ブロックを表5のとおり準備した。各FFPEブロックから、ミクロトームを用いて10μm厚の薄切片をそれぞれ10枚採取し、1.5mLのチューブに5枚ずつ入れた。そこにキシレン1mLを加えて10秒間ボルテックスミキサーで攪拌し、パラフィンを溶解させた。16,000×gで5分間遠心した後、ピペットを用いて組織を吸わないよう注意深くキシレンを除いた。次いで、エタノール1mLを加えて10秒間ボルテックスミキサーで攪拌し、16,000×gで2分間遠心した後、ピペットで組織を吸わないよう注意深くエタノールを除去する操作を繰り返した。チューブの蓋を開けて約10分間風乾させ、組織に含まれるエタノールを除いた。プロテイナーゼK溶液(500μg/mL)100μLを添加して組織を懸濁させ、37℃で16時間静置した。16,000×gで2分間遠心して残渣を沈殿させて除いた後、シリカカラムを用いてRNAを精製した。収量および純度(260nmと280nmの比)を分光光度計(サーモサイエンティフィック社、“Nano Drop”(登録商標))により測定した結果、ならびにバイオアナライザによる1000〜4000ヌクレオチドの範囲のRNAの重量比率A(%)および4000ヌクレオチドを超える範囲のRNAの重量比率B(%)を算出した結果、ならびにB/Aの値をそれぞれ表4の(a)および(b)に示す。
各RNAサンプル1μgを、実施例1と同様にして、アミノアリル化aRNA(AA−aRNA)として増幅した。このとき、マウス小脳、肝臓の凍結組織からそれぞれ抽出したRNAも同様にして増幅した。増幅後の収量より算定した増幅倍率を表4に示す。B/A≦1のサンプルはすべて増幅倍率が2倍以上であったのに対し、B/A>1のサンプルの増幅倍率は2倍未満であった。
上記で2倍以上増幅して得られたaRNAについて、実施例1と同様にして蛍光標識、フラグメンテーションを行った。標識、精製後のaRNAの収量を表4に示す。
各1000ng分のRNAを含む溶液をヌクレアーゼフリー水で16μLに調製し、“3D−Gene(登録商標) Hybridization Buffer”(東レ株式会社)の“Hybridization Buffer A”を2μL加えて、95℃で5分間熱処理した。クラッシュアイスで3分間急冷した後、“Hybridization Buffer B plus”を232μL加えて、穏やかにピペッティングで攪拌して、250μLの検体溶液を調製した。検体溶液を減圧下で脱気した後、“3D−Gene(登録商標)マウス全遺伝子型DNAチップ”(東レ株式会社)に210μLアプライした。カバーの孔4箇所をシールして塞ぎ、バイオシェーカー(東京理化器械株式会社、MMS−210)の天板に固定したハイブリダイゼーションチャンバー(タカラバイオ株式会社、TX711)にセットした。チャンバー庫内の温度を37℃とし、250rpmで旋回回転させて攪拌しながら、16時間反応させた。
反応後、分析用チップのカバー部材を脱離させ、基板を洗浄、乾燥した。DNAチップ用のスキャナ(Axon Instruments社、“GenePix(登録商標) 4000B”)に上記基板をセットし、レーザー出力33%、フォトマルチプライヤーの電圧設定を500にした状態で、ハイブリダイゼーション反応した蛍光標識RNAのシグナル値(蛍光強度)、バックグラウンドノイズを測定した。全スポットのうち、1750個をバックグラウンド蛍光値測定用のネガティブコントロールスポットとし、個々のシグナル値からバックグラウンドシグナル値を差し引いて各スポットの真のシグナル値を算出した。ここで、真のシグナル値が正の場合を「有効スポット」とした。その結果、表4の(a)および(b)に示すとおり、有効スポット数は各サンプル間で概ね同等であった。
マウス小脳、肝臓、腎臓およびラット小脳、肝臓のFFPEから、実施例1と同様にしてそれぞれ抽出したRNAを、バイオアナライザで電気泳動した際に算定されたRINと、各RNAサンプル1μgから増幅したときの収量の関係について、図2ならびに表5の(a)〜(c)にまとめた。その結果、RINと収量の関係には相関関係がみられなかった。さらに、一部のサンプルについては、RINを算定できなかったものもあった(表5において“N/A”と表記)。よって、FFPEをはじめとする固定組織や固定細胞から抽出したRNAの場合、それらがRNAの解析に適したサンプルであるかどうかをRINで判定するのは困難であることが示された。
(固定組織からのRNA抽出)
作成条件、保存期間の異なるマウス(7週齢、雄、Slc:ICR)について、10%中性緩衝ホルマリンにより肝臓のホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)ブロックを表6のとおり準備した(サンプル(A)〜(D))。各ブロックから、ミクロトームを用いて10μm厚の薄切片をそれぞれ2枚採取し、1.5mLのチューブに入れた。キシレン1mLを加えて攪拌し、パラフィンを溶解させた。16,000×gで5分間遠心した後、ピペットを用いて組織を吸わないようにキシレンを除いた。次いで、エタノール1mLを加えて攪拌し、16,000×gで2分間遠心した後、ピペットで組織を吸わないようにエタノールを十分に除去する操作を2回行った。チューブの蓋を開けた状態にして約10分間風乾させ、組織に含まれるエタノールを除いた。プロテイナーゼK溶液(500μg/mL)100μLを添加して組織を懸濁させ、37℃で16時間静置した。16,000×gで2分間遠心して残渣を除いた後、シリカカラムを用いてRNAを精製した。RNAの収量および純度(260nmと280nmの比)を分光光度計(サーモサイエンティフィック社、“Nano Drop”(登録商標))により測定した結果、ならびにバイオアナライザによる1000〜4000ヌクレオチドの範囲のRNAの重量比率A(%)および4000ヌクレオチドを超える範囲のRNAの重量比率B(%)を算出した結果、ならびにB/A、A+Bの値を表7に示す。なお、コントロールとして、マウス(7週齢、雄、Slc:ICR)肝臓の新鮮凍結組織から抽出したRNAを用いた。
実施例1と同様のマウス肝臓FFPEから、同様の手法で抽出したRNAを、“miRCURY LNA microRNA Array Power Labeling kit”(EXIQON社)を用いて、キットのプロトコールに従い、各RNA500ngをCIP処理した後、酵素反応によりHy5色素を標識した。
各500ng分の標識RNAを含む溶液にヌクレアーゼフリー水を加えて、15.4μLに調製し、“3D−Gene(登録商標) miRNA Hybridization Buffer”(東レ株式会社)のBlock Reagentを0.6μL、miRNA Hybridization Bufferを105μLそれぞれ加えて混合し、減圧下で脱気した後、“3D−Gene(登録商標)マウスmiRNAチップ”(東レ株式会社)に110μLアプライした。カバーの孔4箇所をシールして塞ぎ、バイオシェーカー(東京理化器械株式会社、MMS−210)の天板に固定したハイブリダイゼーションチャンバー(タカラバイオ株式会社、TX711)にセットした。チャンバー庫内の温度を32℃とし、250rpmで旋回回転させて攪拌しながら、16時間反応させた。
さらに、同一組織の凍結サンプルから抽出したRNAについて同様の実験を行い、各FFPE標本由来RNAと共通の有効スポットについて、相関係数を算出した結果を表7に示す。B/A≦1のとき、凍結組織由来RNAとの高い正の相関関係が確認された。さらに、B/A≦1かつAが25%以上であるサンプル(C)は、同一組織の新鮮凍結サンプルとの相関が0.9以上であり、非常に相関が高いことが示された。したがって、B/Aの値より、解析の可否を事前に判断できることが示された。
(マイクロアレイの作製)
公知の方法であるLIGA(Lithographie Galvanoformung Abformung)プロセスを用いて、射出成形用の型を作製し、射出成型法により後述するような形状を有するPMMA製の基板を得た。なお、この実施例で用いたPMMAの平均分子量は5万であり、PMMA中には1重量%の割合で、カーボンブラック(三菱化学株式会社、#3050B)を含有させており、基板は黒色である。この黒色基板の分光反射率と分光透過率を測定したところ、分光反射率は、可視光領域(波長が400nmから800nm)のいずれの波長でも5%以下であり、また、同範囲の波長で、透過率は0.5%以下であった。分光反射率、分光透過率とも、可視光領域において特定のスペクトルパターン(ピークなど)はなく、スペクトルは一様にフラットであった。なお、分光反射率は、JIS Z 8722の条件Cに適合した照明・受光光学系を搭載した装置(ミノルタカメラ、CM−2002)を用いて、基板からの正反射光を取り込んだ場合の分光反射率を測定した。
実施例3と同様にして、作成条件、保存期間の異なるマウス(7週齢、雄、Slc:ICR)肝臓のホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)ブロックから薄切片を作製し、RNAを抽出した。収量および純度(260nmと280nmの比)を分光光度計(サーモサイエンティフィック社、“Nano Drop”(登録商標))により測定した結果、ならびにバイオアナライザによる1000〜4000ヌクレオチドの範囲のRNAの重量比率A(%)および4000ヌクレオチドを超える範囲のRNAの重量比率B(%)を算出した結果、ならびにB/A、A+Bの値を表8に示す。なお、コントロールとして、マウス(7週齢、雄、Slc:ICR)肝臓の新鮮凍結組織から抽出したRNAを用いた。
実施例3と同様にして抽出したRNAを、“PlatinumBright(登録商標)Nucleic Acid Labeling Kit”(KREATECH)を用いて蛍光標識した。各RNA1μgをNuclease Free Waterで16μLにメスアップし、ULS試薬および10×labeling solution各2μLを加えて、85℃で30分反応させ、PlatinmBright647色素をmRNAに標識した。付属の“KREApure columns”を用いて、未反応の色素を除去した。
各固定組織に含まれるmRNAについて、以下の手順によりマイクロアレイで解析した。各1μg分の標識RNAを含む溶液にヌクレアーゼフリー水を加えて、16μLに調製し、“3D−Gene(登録商標)Hybridization Buffer”(東レ株式会社)のHybridization Buffer Aを2μL、Hybridization Buffer Bを232μLそれぞれ加えて混合し、減圧下で脱気した後、上記で作製した分析用チップに210μLアプライした。カバーの孔4箇所をシールして塞ぎ、バイオシェーカー(東京理化器械株式会社;MMS−210)の天板に固定したハイブリダイゼーションチャンバー(タカラバイオ株式会社;TX711)にセットした。チャンバー庫内の温度を37℃とし、250rpmで旋回回転させて攪拌しながら、16時間反応させた。
反応後、チップのカバー部材を脱離させ、基板を洗浄、乾燥した。DNAチップ用のスキャナ(Axon Instruments社、“GenePix(登録商標)4000B”)に上記基板をセットし、レーザー出力33%、フォトマルチプライヤーの電圧設定を500にした状態で、ハイブリダイゼーション反応した蛍光標識RNAのシグナル値(蛍光強度)、バックグラウンドノイズを測定した。全スポットのうち32個をバックグラウンド蛍光値測定用のネガティブコントロールスポットとし、個々のシグナル値からバックグラウンドシグナル値を差し引いて、各スポットの真のシグナル値を算出した。ここで、真のシグナル値が正の場合を「有効スポット」とした。その結果、表8に示すとおり、B/A≦1の検体は、新鮮凍結マウス肝臓組織から抽出したリファレンスRNAと有効スポット数の差異が小さく、また両社の共通有効スポットにおける相関が高い傾向が確認された。さらに、Aの値が大きいほど、その傾向は顕著であった。一方、B/A>1の検体は有効スポット数がリファレンスRNAより少なく、検出できないmRNAが存在することが示唆された。
さらに、同一組織の凍結サンプルから抽出したRNAについて同様の実験を行い、各FFPE標本由来RNAと共通のmRNA有効スポットについて、相関係数を算出した。各サンプルにおける相関係数は表8に示すとおりであり、B/A≦1のとき、凍結組織由来RNAとの高い正の相関関係が確認された。さらに、B/A≦1かつAが25%以上であるサンプル(C)は、同一組織の新鮮凍結サンプルとの相関が0.9以上であり、非常に相関が高いことが示された。したがって、B/Aの値より、解析可否を判断できることが示された。
マウス小脳および肝臓組織のFFPE標本から、それぞれ10μm厚の切片を作成し、実施例1と同様の手法でRNAを抽出した。実施例2と同様に、マウス小脳および肝臓の凍結組織から抽出したRNAとともに、RNA1μgから増幅反応を行い、aRNAを得た。RNAの収量、純度、バイオアナライザによる1000〜4000ヌクレオチドの範囲のRNAの重量比率A(%)および4000ヌクレオチドを超える範囲のRNAの重量比率B(%)、ならびに増幅倍率を表9に示す。aRNAをCy3(GEヘルスケア社)で標識し、“Gene Expression Hybridization Kit”(アジレント・テクノロジー社)のハイブリダイゼーションバッファーと混合し、“Whole Mouse Genome Oligo Microarray(4×44k)”(アジレント・テクノロジー社)上で40時間ハイブリダイズした。洗浄後、“Agilent Microarray Scanner”(アジレント・テクノロジー社)でDNAマイクロアレイのイメージを読み取り、“Feature Extraction Software(v.9.5.3.1)”にて各スポットの蛍光シグナルを数値化した。その結果、表13の通り、相関係数は小脳:0.88、肝臓:0.85と高いことが示された。
実施例5で抽出したマウス小脳、肝臓のFFPE由来RNA、凍結組織由来RNAを用いて、実施例1と同様にして各RNA5μgから増幅反応を行い、aRNAを得た。このとき、アミノアリル基の代わりにビオチン基を導入した。増幅倍率を表10に示す。ビオチン化aRNAと所定量のControl Oligonucleotide、20×Eukaryotic Hybridization Controls、2×Hybridization Mix、DMSO、Nuclease−free Waterを混合し、99℃で5分間処理後、45℃で5分間処理した。さらに、16,000×gで5分間遠心した後、“Affymetrix(登録商標)Mouse Genome 430 2.0 Array”(アフィメトリクス社)にアプライして16時間ハイブリダイゼーション反応させた。所定の方法で洗浄、染色した後、“GeneChip(登録商標)Scanner 3000 7G System”(アフィメトリクス社)にて各スポットの蛍光シグナルを数値化した。その結果、表15の通り、凍結組織と比較してFFPEの有効スポット数は少ない傾向にあったものの、両者の相関係数は小脳:0.84、肝臓:0.82であり、高い相関関係が確認された。
(固定組織からのRNA抽出)
マウス(7週齢、雄、Slc:ICR)小脳および肝臓を摘出し、10%リン酸緩衝ホルマリン溶液(ホルムアルデヒド4%)に2日間、室温で浸漬して固定後、パラフィン包埋してFFPEブロックを作製した。各FFPEブロックから、ミクロトームを用いて10μm厚の薄切片をそれぞれ採取し、実施例1と同様にしてRNAを抽出した。収量および純度(260nmと280nmの比)を分光光度計(サーモサイエンティフィック社、“Nano Drop”(登録商標))により測定した結果、ならびにバイオアナライザによる1000〜4000ヌクレオチドの範囲のRNAの重量比率A(%)および4000ヌクレオチドを超える範囲のRNAの重量比率B(%)を算出した結果、ならびにB/Aの値を表11に示す。すべてのサンプルでB/A≦1であった。
抽出したマウス小脳、肝臓のRNA1μgから、実施例1と同様に増幅し、アミノアリル基を導入したaRNAを得た。分光光度計(サーモサイエンティフィック社、“Nano Drop”(登録商標))により収量を求め、増幅倍率を算定した結果を表11に示す。すべてのサンプルで増幅倍率は2〜20倍の範囲内であった。
増幅した各aRNAについて、実施例1と同様にして蛍光標識、フラグメンテーションを行った後、以下の操作によりマイクロアレイ解析を行った。各1000ng分のRNAを含む溶液をヌクレアーゼフリー水で16μLに調製し、“3D−Gene”(登録商標)Hybridization Buffer(東レ株式会社)の“Hybridization Buffer A”を2μL加えて、95℃で5分間熱処理した。クラッシュアイスで3分間急冷した後、“Hybridization Buffer B”を232μL加えて、穏やかにピペッティングで攪拌して、250μLの検体溶液を調製した。検体溶液を減圧下で脱気した後、“3D−Gene(登録商標)マウス全遺伝子型DNAチップ”(東レ株式会社)に210μLアプライした。カバーの孔4箇所をシールして塞ぎ、バイオシェーカー(東京理化器械株式会社、MMS−210)の天板に固定したハイブリダイゼーションチャンバー(タカラバイオ株式会社、TX711)にセットした。チャンバー庫内の温度を37℃とし、250rpmで旋回回転させて攪拌しながら、16時間反応させた。
反応後、分析用チップのカバー部材を脱離させ、基板を洗浄、乾燥した。DNAチップ用のスキャナ(Axon Instruments社、“GenePix(登録商標)4000B”)に上記基板をセットし、レーザー出力33%、フォトマルチプライヤーの電圧設定を500にした状態で、ハイブリダイゼーション反応した蛍光標識RNAのシグナル値(蛍光強度)、バックグラウンドノイズを測定した。全スポットのうち、1750個をバックグラウンド蛍光値測定用のネガティブコントロールスポットとし、個々のシグナル値からバックグラウンドシグナル値を差し引いて各スポットの真のシグナル値を算出した。ここで、真のシグナル値が正の場合を「有効スポット」とした。有効スポット数を表11に示す。同一組織における有効スポット数のバラつきが小さいことが示された。さらに小脳、肝臓の各遺伝子のシグナルの比(小脳/肝臓)より作成した散布図を図3に示す。この結果より、2回の実験の相関が高いことが示された。
Claims (7)
- 固定液により固定された組織または細胞から抽出されたRNAの解析方法であって、該RNA全重量に対する電気泳動における1000〜4000ヌクレオチドの範囲のRNAの重量の比率をA(%)、該RNA全重量に対する電気泳動における4000ヌクレオチドを超える範囲のRNAの重量の比率をB(%)とするとき、該RNAが下式を満たすことを判定するステップを有する、RNAの解析方法。
式:B/A≦1 - さらに前記比率A(%)が25%以上であることを判定するステップを有する、請求項1に記載のRNAの解析方法。
- 前記判定されたRNAを増幅倍率2〜20倍で増幅した増幅産物を解析する、請求項1または2に記載のRNAの解析方法。
- 前記判定されたRNAを非増幅により解析する、請求項1または2に記載のRNAの解析方法。
- 前記RNAがmiRNAである、請求項4に記載のRNAの解析方法。
- 前記固定液がホルムアルデヒドまたはパラホルムアルデヒドを含む、請求項1〜5のいずれかに記載のRNAの解析方法。
- 前記固定液により固定された組織または細胞がパラフィン包埋またはOCTコンパウンド包埋されてなる、請求項1〜6のいずれかに記載のRNAの解析方法。
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