KR20200025961A

KR20200025961A - 난소의 fsh에 대한 반응성의 진단 또는 예측용 바이오마커 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20200025961A
Application number: KR1020180104044A
Authority: KR
Inventors: 이경아; 궁미경; 이수연
Original assignee: 차의과학대학교 산학협력단
Priority date: 2018-08-31
Filing date: 2018-08-31
Publication date: 2020-03-10
Also published as: JP7134359B2; CN112639131A; WO2020046045A1; JP2022513191A; KR102089559B1; US20210404001A1

Abstract

난소의 FSH에 대한 반응성의 진단 또는 예측용 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것이다. 일 양상에 따른 난소의 FSH에 대한 반응성의 진단 또는 예측용 조성물, 키트, 및 이를 이용한 방법에 따르면, 혈액과 난포액, 과립 세포, 난구 세포 내 존재하는 miRNA를 사용하여 난소의 반응성 정도를 간편하게 진단할 수 있으므로, 난소의 FSH에 대한 반응성 이상에 따른 증상이나 질병에 대한 예측이나 진단이 용이하다.

Description

난소의 FSH에 대한 반응성의 진단 또는 예측용 바이오마커 및 이의 용도{Biomarker for diagnosing or predicting reactivity to FSH of ovary}

난소의 FSH에 대한 반응성의 진단 또는 예측용 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것이다.

최근 보조생식술의 비약적인 발전에도 불구하고 체외수정시술 및 배아이식술 시행 후 임신 성공율은 30~40% 정도에 불과한 실정이다. 이러한 낮은 임신 성공율의 이유는 과배란 유도에 반응이 미약한 난소기능이 저하된 환자(난소 저반응 군)에서의 체외수정 후 임신 성공율이 낮기 때문이다. 즉, 전체 임신율을 증가시키는 노력에 가장 큰 장애 요인으로 작용하는 것이 난소기능부전으로 인식된다.

2011년 4월 유럽생식의학회(ESHRE)는 다음 3가지 항목 중 2가지에 해당하는 경우로 진단 기준을 제시하였다: ⅰ) 모체나이 40세 이상 또는 poor response의 다른 위험요소가 있는 경우, ⅱ) 이전의 poor response(3개 이하의 난자 수), ⅲ) 비정상적인 ovarian reserve test(AFC<5-7) 또는 AMH<0.5-1.1ng/mL). 난소 저반응군에서 인위적으로 과배란을 유도하여도, 만들어지는 난자의 개수가 1~3개에 불과하다. 결국 난소 저반응군이 대조군과 동일한 양의 난자를 모으기 위해서는 더 오랫동안 과배란 유도주사를 맞아야 하기 때문에 여성이 감내해야 하는 주사 스트레스나 경제적 부담이 클 수밖에 없고 이는 난임 치료를 포기하게 만드는 원인이다.

따라서 성선자극호르몬을 이용한 과배란에 불량한 반응을 보이는 '난소 저반응 군'의 성공적인 임신을 위한 적절한 치료는 최근 불임 환자의 치료에 있어서 가장 큰 과제 중의 하나로 남아 있다. 그동안 '난소 저반응' 환자에서 난소자극에 대한 효과를 증가시키기 위한 다양한 방법들이 제안되어 왔다. 예를 들어, 과배란유도 시 사용되는 외인성 성선자극호르몬의 용량을 증가시키거나, clomiphene citrate와 hMG 병용요법, 성선자극호르몬 유리호르몬 촉진제 장기 병합요법 또는 초단기 요법, 성선자극호르몬 유리호르몬 길항제의 사용, 성장호르몬의 투여 등이 있으나, 이 중 어느 방법도 정상 반응 군에서 관찰되는 임상 결과에는 현저히 미치지 못하는 상태이다. 또한 GnRH 아고니스트 또는 GnRH 안타고니스트를 활용한 방법이 이용되고 있으며, 기타 성선자극호르몬의 용량을 증가시키거나 DHEA, Letrozole, L-아르기닌 등의 다양한 약제를 추가하는 방법 등이 보고되고 있다. 또한 PTEN 저해제를 사용한 난소조직내 원시난포의 활성화, 조직의 생체이식 및 난포발달유도, 성숙난자의 체취 및 체외수정과 배아이식을 통한 임신이 성공한 사례가 발표되어 있으나, 매우 복잡한 과정에 비하여 낮은 성공률을 갖고 있어 아직은 일반적으로 적용하기 어려운 방법이다.

한편, 난소 저반응이라고 하는 것은 시험관아기 시술을 위하여 과배란 주사를 맞은 후 난자채취를 하였음에도 불구하고 난자가 3개 이하로 나오거나 여러 가지 진단 결과 이러한 상황이 예측되는 경우를 말한다. 이러한 난소 저반응군의 경우, 대부분 난소의 기능 자체가 현저히 낮아진 경우가 많으며, 대체적으로는 임신율도 낮다. 일반적으로, 난소 저반응은 고나도트로핀(성선자극호르몬) 자극 동안 초음파 스캔 상 관찰되는 성장난포 수를 고려하여 진단한다. 그러나, 진단에 대한 구체적인 매뉴얼(측정시점, 성장 난포의 직경 기준)의 부재로 인해 난자 회수량(3~6개 미만)을 두고 난소 저반응을 진단하였다. 이때, 고나도트로핀에 대한 난소의 저반응은 일시적으로 일어날 수 있는 현상이며 추후 호르몬 투여량을 조절하거나 심지어 동일한 양을 투여해도 재발되지 않을 수 있다. 발표된 연구에 따르면, 난소 저반응을 보인 여성 중 약 1/3이 다음 사이클에서 정상적으로 과배란이 일어나는 것으로 알려져 있다. 이처럼 주기별로 성장난포 수의 다양한 기복이 나타나는 현상 또한 난소 저반응을 진단하는 과정에 반드시 고려되어야 할 요소이다.

이렇듯 서로 다른 기준을 가지고 '난소기능저하'를 정의하였기 때문에 난소기능부전을 갖는 난소 저반응군, 또는 조기 폐경의 예방, 진단, 또는 예측을 위한 바이오마커를 발굴하려는 노력이 필요한 실정이다.

난소의 FSH에 대한 반응성을 진단 또는 예측할 수 있는 바이오마커에 관한 것으로, miRNA-4463 또는 이의 모방체의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 조성물, 키트 또는 상기 miRNA-4463 또는 이의 모방체를 이용한 난소의 FSH에 대한 반응성을 진단 또는 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

일 양상은 마이크로RNA-4464(miRNA-4463) 또는 miRNA-4463의 모방체(mimic)의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 난소의 여포자극호르몬(Follicle-stimulating hormone: FSH)에 대한 반응성의 진단 또는 예측용 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 용어 "마이크로알엔에이 (마이크로RNA, microRNA, miRNA, mir)"는 특정 염기 서열 (또는 서열번호)로 나타내어지는 miRNA 뿐만 아니라 상기 miRNA의 전구체 (pre-miRNA), 초기전사체 (pri-miRNA), 및 이들과 이들과 생물학적 기능이 동등한 miRNA, 예를 들면 동족체 (즉, 호몰로그 또는 오솔로그), 유전자 다형 등의 변이체, 및 유도체를 포함한다. 이러한 전구체, 초기전사체, 동족체, 변이체 또는 유도체는 구체적으로는 miRBase release 20(http://WWW.mirbase.org/)에 의해 동정할 수 있다.

또한, 본 명세서에서 miRNA는 mir 유전자의 유전자 산물이어도 좋고, 그러한 유전자 산물은 성숙한 miRNA (예를 들면, 상기한 바와 같은 mRNA의 번역 억제에 관여하는 15~25 염기, 또는 19~25 염기의 비코딩 RNA) 또는 miRNA 전구체 또는 전사체 (예를 들어 pre-miRNA 또는 pri-miRNA)를 포함한다.

일 구체예에서 miRNA-4463의 모방체는 a) miRNA-4463의 성숙한 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; b) miRNA-4463의 pre-miRNA(전구체) 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; 및 c) miRNA-4463의 pri-miRNA(초기전사체) 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나일 수 있다.

일 구체예에서 상기 miRNA-4463 또는 miRNA-4463의 모방체는 서열번호 1을 포함하는 폴리펩티드일 수 있다. 상기 서열은 난소의 FSH에 대한 반응성을 진단하는데 있어서 일정정도 변형이 가능하다. 본 기술 분야의 당업자 라면 이러한 인위적인 변형에 의해 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람 직하게는 98%의 상동성이 유지되는 염기서열이 본 발명에서 목적하는 난소의 FSH에 대한 반응성 예측 마커로서 정상 개체와 난소 비반응성 개체 간에 발현량 차이를 유의있게 비교 가능하는 한, 상기 염기서열과 균등한 것임을 쉽게 이해할 것이다.

본 명세서에서 난소의 "여포자극호르몬에 대한 반응성"은 난소가 여포자극호르몬(FSH)에 대하여 반응하는지 여부 또는 그 정도를 지칭할 수 있다. 일 양상에서, 난소의 FSH에 대한 반응성은 과립 세포의 FSH에 대한 반응성 측정을 통해서 측정할 수 있다. 본 명세서에서 "과립 세포(granulosa cells)"는 난포 내의 과립 세포를 지칭할 수 있다. 난자의 성공적인 성숙을 위해서는 난자와 균형 맞춘 난구세포 및 과립 세포의 정상적인 분열과 성장이 매우 중요하다. 그러나, 여성의 난자를 바로 연구에 사용할 수는 없기 때문에 난자 주변에 있으면서 난자성숙에 중요한 역할을 하는 난포 내 과립 세포를 대상으로 연구해야 한다. 그러나, 과립 세포는 난포 밖으로 나올 경우 곧 황체화가 일어나는 특성을 가지므로, 과립 세포 자체의 특성을 연구하기에 어려운 세포로 공지되어 있다.

상기 난소의 FSH에 대한 반응성은 난소가 FSH에 반응하여 에스트로겐을 형성하는지 여부 또는 생성 정도를 지칭할 수 있고, 예를 들어, 과립 세포가 FSH에 반응하여 에스트로겐을 형성하는지 여부 또는 그 정도를 측정함으로써 평가할 수 있다. 과립 세포는 FSH에 반응하여 에스트로겐을 형성하고 난포의 발달을 조절하는 역할을 수행한다고 알려져 있다. FSH에 대한 반응성 이상에 따라 에스트로겐 형성에 이상이 생겨 난소기능부전이나 조기 폐경이 발생할 수 있다. 이 경우, 난소의 FSH에 대한 반응성을 미리 진단 또는 예측한다면 난소기능저하로 인하여 발생하는 질병, 예를 들어 난소기능부전이나 조기 폐경을 진단 또는 예측할 수 있다.

일 구체예에서, miRNA-4463 또는 이의 모방체의 발현 수준이 높은 상태는 난소가 FSH에 대한 반응성이 없거나 낮은 상태를 의미할 수 있다.

일 구체예에서, miRNA-4463 또는 이의 모방체의 발현 수준이 낮은 상태는 난소가 FSH에 대한 반응성이 있거나 높은 상태를 의미할 수 있다.

본 명세서에서 "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 진단은 개체에서 난소의 FSH에 대한 반응성 확인하는 것으로 해석될 수 있다.

본 명세서에서 용어 "마커(marker)"또는 바이오마커란 난소의 FSH에 대한 반응성을 예측할 수 있는 물질로, 과립 세포에서 FSH에 대한 반응성이 달리 나타나는 대사체, 폴리펩티드, 단백질 또는 핵산, 유전자, 지질, 당지질, 당단백질 또는 당 등과 같은 유기 생체 분자들을 포함한다. 본 발명에서의 마커는 miRNA-4463 또는 이의 모방체일 수 있다.

본 명세서에서 "핵산의 수준을 측정하는 제제"는 시료에 포함된 표적 유전자의 발현 여부를 확인하기 위하여, 상기 표적 유전자로부터 전사된 mRNA의 수준을 측정하는 방법에 사용되는 제제를 의미한다. 상기 "제제"는 시료에 포함된 miRNA-4463, 이의 모방체 또는 이의 단편의 발현 여부를 확인하는 방법에 사용되는 제제를 의미하는데, 바람직하게는 RT-PCR, 경쟁적 RTPCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블럿팅(Northern blotting), 유전자 칩 분석법 등의 방법에 사용되는 표적 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머 또는 프로브가 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 본 명세서에서 용어 "프라이머"란, 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시할 수 있다. 본 명세서에서 용어 "프로브"란, 유전자 또는 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하는데, 올리고뉴클레오티드 (oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있고, 보다 용이하게 검출하기 위하여 라벨링될 수 있다. 상기 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용 하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체 (예: 메틸 포스포네이트, 포스소트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체 (예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.

상기 miRNA-4463은 CYP19A1(cytochrome P450 family 19 subfamily A member 1), 또는 ESR1(ER-α)의 mRNA를 표적으로 하는 것일 수 있다. CYP19A1은 과립 세포 내에서 최종적으로 17베타-에스트로겐을 합성하는 에스트로겐 합성 효소(Aromatase)이다. 17베타-에스트로겐은 실질적으로 생물학적 기능을 하는 에스트로겐 중 하나인 스테로이드 호르몬으로서 세포내 수용체 혹은 핵수용체인 ESR1(ER-α) 및 ESR2(ER-β)를 통하여 유전자 발현을 조절한다.

상기 miRNA-4463은 과립 세포에서 에스트로겐의 합성을 억제하는 것일 수 있다. 구체적으로는, 과립 세포에서 CYP19A1(cytochrome P450 family 19 subfamily A member 1), 또는 ESR1(ER-α)의 mRNA를 표적으로 함으로써 에스트로겐의 합성을 억제할 수 있다.

상기 조성물에서, 난소의 FSH에 대한 반응성을 진단 또는 예측함으로써 난소기능저하로 인해 발생하는 질병, 예를 들어 난소기능부전 또는 조기 폐경을 진단 또는 예측할 수 있다. 상기 "난소기능부전(ovarian dysfunction)"은 난소기능이 정상적으로 작용하지 않는 경우에 발생하는 것으로, 배란성 주기부정증, 황체기능부전증, 무배란성 주기부정증 등으로 분류될 수 있다. 난소기능부전은 난소 저반응과 상호교환적으로 사용할 수 있고, 시험관 아기 시술을 위하여 과배란 주사를 맞은 후 난자 채취를 하였음에도 불구하고 난자가 3개 이하로 나오거나 이러한 상황이 예측되는 상태를 의미할 수 있다. 상기 "조기 폐경"은 보통 수준보다 일찍 폐경이 오는 현상을 지칭한다. 여성이 나이가 들면 난소의 기능이 중단되어 에스트로겐의 생성이 줄고 월경이 멈추는데 이를 폐경이라 한다. 정상적으로 폐경은 약 45세에서 56세 사이에 일어나지만, 조기 폐경은 40세 이전에 폐경이 오는 것을 임상적 기준으로 정하고 있으며, 환자들에게서 여포자극 호르몬의 분비가 증가하고, 에스트로겐의 분비가 줄어든다는 특징을 나타낸다.

상기 조성물은 난소의 FSH에 대한 반응성 예측에 필요한 시료를 더 포함할 수 있다.

다른 양상은 일 양상은 마이크로RNA-4464(miRNA-4463) 또는 miRNA-4463의 모방체(mimic)의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 난소의 여포자극호르몬(Follicle-stimulating hormone: FSH)에 대한 반응성의 진단 또는 예측용 키트를 제공한다.

일 구체예에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR키트일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 RT-RCP 키트는 상기 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다. 상기 키트는 상기 miRNA-4463 또는 miRNA-4463의 모방체 수준을 측정하기 위한 제제, 장치, 및 알고리즘이 내장된 컴퓨터를 포함할 수 있고, 상기 알고리즘을 통해 상기 마커의 수준 측정 결과를 난소의 FSH에 대한 반응성과 연관시키는 것인, 키트에 관한 것일 수 있다.

상기 키트에는 공지의 알고리즘이 사용될 수 있는 있으며, 이로 제한하는 것은 아니나, 선형 또는 비선형 회귀 알고리즘; 선행 또는 비선형 classification 알고리즘; ANOVA; 신경망 알고리즘; 유전적 알고리즘; 서포트 벡터 머신 알고리즘; 계층 분석 또는 클러스터링 알고리즘; 결정 트리를 이용한 계층 알고리즘, 또는 Kernel principal components 분석 알고리즘; Markov Blanket 알고리즘; recursive feature elimination 또는 엔트로피-기본 recursive feature elimination algorithms; committee network로 정렬된 복수의 알고리즘; 및 전방 floating search 또는 후방 floating search 알고리즘으로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다.

다른 양상은 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 miRNA-4463 또는 miRNA-4463의 모방체의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 상기 발현 수준을 대조군에서 측정된 miRNA-4463 또는 miRNA-4463의 모방체의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는 난소의 FSH에 대한 반응성의 진단 또는 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

상기 개체는 인간을 포함한 포유동물일 수 있다.

본 명세서에서 "생물학적 시료"는 생물로부터 수득된 시료를 말한다. 상기 생물학적 시료는 혈액, 혈장, 혈소판, 혈청, 복수액, 골수액, 림프액, 타액, 누액, 점막액, 양수, 난포액, 과립 세포, 난구 세포 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 생물학적 시료가 혈액 또는 혈장일 경우, 채취가 용이한 혈액, 혈장을 검체로 사용하기 때문에 개체의 장기 조직을 적출하지 않아 개체에게 부담을 주지 않으면서도 간편하게 분석할 수 있다. 또한, 상기 생물학적 시료가 난포액, 과립세포, 또는 난구 세포일 경우, 이들 시료는 시험관 아기 시술 과정에서 난자와 함께 채취되므로 시술에 필요한 난자를 수집 후 남은 시료를 사용할 수 있어 시료 수집이 비교적 용이하다. 따라서, 호르몬에 대한 난소의 반응성을 예측할 수 있는 마커로 손쉽게 채취할 수 있는 혈액이나 난포액, 과립 세포, 난구 세포 내의 miRNA를 사용함으로써 예측의 용이성 측면에서 유익을 가질 수 있다.

상기 방법에서, 상기 난소의 FSH에 대한 반응성을 진단 또는 예측함으로써 난소기능부전 또는 조기 폐경을 진단 또는 예측하기 위한 것일 수 있다.

상기 방법은 난소의 FSH에 대한 반응성의 진단 또는 예측에 관한 정보를 제공하기 위해, 마커 분석 결과에 추가하여, 개체의 상기 마커 이외의 임상정보를 추가로 사용할 수 있다. 이러한 임상 정보란, 난소예비력 검사 결과 등을 포함할 수 있다.

다른 양상은 난소의 FSH에 대한 반응성 저하를 예방 또는 치료할 수 있을 것으로 예상되는 후보물질을 투여하고, miR-4463 또는 이의 모방체의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 난소의 FSH에 대한 반응성 저하의 예방 또는 치료용 제제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.

상기 방법은, (a) 대조군인 난소의 FSH에 대한 반응성 저하가 발생한 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 miRNA-4463 또는 이의 모방체의 발현 수준을 측정하는 단계; (b) 상기 개체에서 난소의 FSH에 대한 반응성 저하를 치료할 수 있을 것으로 예상되는 후보물질을 투여하는 단계; (c) 실험군인 상기 후보물질이 투여된 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 miRNA-4463 또는 모방체의 발현 수준을 측정하는 단계; 및, (d) 대조군에서 측정된 miRNA-4463 또는 이의 단편의 수준을 실험군에서 측정된 것과 비교하여, 대조군에서 측정된 것보다도 실험군에서 측정된 것이 낮은 수준을 나타내는 경우, 상기 후보물질을 난소의 FSH에 대한 반응성 저하를 방지하는 예방용 제제 또는 난소의 FSH에 대한 반응성 저하를 치료하는 치료용 제제로서 사용할 수 있는 것으로 판정하는 단계를 포함한다.

일 양상에 따른 난소의 FSH에 대한 반응성의 진단 또는 예측용 조성물, 키트, 및 이를 이용한 방법에 따르면, 혈액과 난포액, 과립 세포, 난구 세포 내 존재하는 miRNA를 사용하여 난소의 FSH에 대한 반응성 정도를 간편하게 진단할 수 있으므로, 난소의 FSH에 대한 반응성 이상에 따른 증상이나 질병에 대한 예측이나 진단이 용이하다.

도 1은 FSHR 발현이 억제된 KGN 세포주(siFSHR) 및 상기 세포주에 FSH를 처리한 세포주(siFSHR+FSH)에서 FSHR mRNA 발현 수준을 RT-PCR로 확인한 그래프이다.
도 2는 FSHR 발현이 억제된 KGN 세포주(siFSHR) 및 상기 세포주에 FSH를 처리한 세포주(siFSHR+FSH)에서 FSHR 단백질 발현 수준을 웨스텅 블롯팅으로 확인한 그래프이다.
도 3은 FSHR 발현이 억제된 KGN 세포주(siFSHR) 및 상기 세포주에 FSH를 처리한 세포주(siFSHR+FSH)의 배양액으로 분비된 에스트로겐의 양을 ELISA로 확인한 그래프이다. E2: 에스트로겐.
도 4는 아무것도 처리하지 않은 대조군 KGN 세포주(MOCK), miR-4463 모방체(mimic)를 처리한 KGN 세포주(miR-4463 mimic), miR-4463 억제제를 처리한 KGN 세포주(miR-4463 inhibitor)에서 CYP19A1, ER-α, ER-β 단백질 발현 수준을 웨스턴 블롯팅으로 확인한 도이다.
도 5는 아무것도 처리하지 않은 대조군 KGN 세포주(MOCK), miR-4463 모방체(mimic)를 처리한 KGN 세포주(miR-4463 mimic), miR-4463 억제제를 처리한 KGN 세포주(miR-4463 inhibitor)의 배양액으로 분비된 에스트로겐의 양을 ELISA로 확인한 그래프이다.

이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 과립 세포주에 대한 FSH 처리의 효과 확인

1.1. 사용된 세포주

2001년 일본의 Nishi 박사팀은 난소 과립 세포 암(ovarian granulosa carcinoma)으로부터 과립 세포와 비슷한 여성생식호르몬의 분비 양상을 보이는 인간 난소 과립 세포-유사 종양 세포주(human ovarian granulosa-like tumor cell line)인 KGN 세포를 구축하였다. 이후 여성 과립 세포의 특성 및 내분비 장애물질에 대한 반응 스크리닝 등의 다량의 세포가 필요한 연구에는 KGN 세포를 사용해오고 있다. 본 발명에서는 구하기 힘든 여성의 과립 세포를 가지고 여러 가지 특성을 연구하기에 앞서, 본 연구를 통하여 과립 세포 배양 시스템을 구축하고 여성의 생식능력 증가를 위해 필요한 여러 가지 생식세포의 활용에 필요한 기초 DATA를 축적하기 위한 일련의 연구를 진행하였다. 본 발명자는 여포자극호르몬수용체(Follicle-stimulating hormone receptor: FSHR)가 높게 발현하는 인간 과립 세포주인 KGN 세포를 일본의 RIKEN 사로부터 제공받아 사용하였다.

1.2. 인간 과립 세포주에서 FSH 처리에 의한 FSHR 발현의 변화 확인

KGN 세포주에서 FSHR 발현이 감소한 상태에서 FSH를 처리하고, FSH가 FSHR의 발현에 어떠한 변화를 유도하는지 확인하기 위하여 다음과 같이 실험하였다. 먼저, KGN 세포주에서 FSHR의 발현을 감소시키기 위해 FSHR siRNA를 처리하였다. 상기 처리된 세포주에 여포자극호르몬(Follicle-stimulating hormone: FSH)을 처리한 후, FSHR mRNA 발현 변화를 RT-PCR로 확인하고 FSHR 단백질 발현 변화는 웨스턴 블롯팅으로 확인하였다.

도 1은 FSHR 발현이 억제된 KGN 세포주(siFSHR) 및 상기 세포주에 FSH를 처리한 세포주(siFSHR+FSH)에서 FSHR mRNA 발현 수준을 RT-PCR로 확인한 그래프이다.

도 2는 FSHR 발현이 억제된 KGN 세포주(siFSHR) 및 상기 세포주에 FSH를 처리한 세포주(siFSHR+FSH)에서 FSHR 단백질 발현 수준을 웨스턴 블롯팅으로 확인한 그래프이다.

도 1 및 도 2에 나타낸 바와 같이, FSHR 발현이 억제된 KGN 세포주에서 FSHR mRNA의 상대적인 발현 수준 및 FSHR 단백질의 상대적인 발현 수준이 낮았고, FSH 처리 후에는 다시 유의적으로 증가하였다.

따라서, FSH는 인간 과립 세포에서 감소된 FSHR의 수준을 회복시키는 효과가 있다.

1.3. 인간 과립 세포주에서 FSH 처리에 의한 에스트로겐 발현의 변화 확인

KGN 세포주에서 FSHR 발현이 감소한 상태에서 FSH를 처리하고, FSH가 에스트로겐의 합성에 어떠한 변화를 유도하는지 확인하기 위하여 다음과 같이 실험하였다. 먼저, KGN 세포주에서 FSHR의 발현을 감소시키기 위해 FSHR siRNA를 처리하였다. 상기 처리된 세포주에 여포자극호르몬(Follicle-stimulating hormone: FSH)을 처리한 후, 배양액으로 분비된 에스트로겐의 양을 ELISA로 확인하였다.

도 3은 FSHR 발현이 억제된 KGN 세포주(siFSHR) 및 상기 세포주에 FSH를 처리한 세포주(siFSHR+FSH)의 배양액으로 분비된 에스트로겐의 양을 ELISA로 확인한 그래프이다. 그래프에 명시된 E2는 에스트로겐을 지칭한다.

도 3에 나타낸 바와 같이, FSHR 발현이 억제된 KGN 세포주에서 배양액으로 분비된 에스트로겐 수준이 낮았고, FSH를 추가적으로 처리한 경우에도 에스트로겐의 분비가 회복되지 않았다.

따라서, FSHR이 발현하지 않는 경우 과립 세포의 FSH에 대한 반응성이 감소하여 에스트로겐이 생산되지 않는 것을 확인하였다.

실시예 2. 난소기능부전의 진단을 위한 바이오마커 도출

난소기능부전의 진단을 위한 바이오마커를 도출해내기 위해서, FSH 반응성에 따라 차이나게 발현하는 miRNA를 miRNA 마이크로어레이를 통해 확인하였다. 세포의 전체 RNA을 추출하여 Calf Intestinal Alkaline Phosphatase(CIP)로 5'-말단의 인산기를 제거한 후, Cy3 형광염료를 표지하였다. 표지된 RNA와 마이크로어레이 슬라이드를 56℃에서 16시간 동안 충분히 반응시킨 후 씻어주었다. 이 슬라이드는 Agilent G2565CA Microarray Scanner System을 사용하여 스캔 후, 형광 강도를 정량화 하여 그룹 간 miRNA 발현의 차이를 분석한다. 정량화된 값은GeneSpring GX 13.1을 사용하여 정규화(normalization)한 후 분석하였다.

구체적으로는, 대조군인 KGN 세포주와 FSHR 발현이 억제된 KGN 세포주에 각각 FSH를 처리하였을 때 2배 이상 감소 또는 증가하는 miRNA의 목록을 마이크로어레이를 통해 확인하였다. 그 결과, 총 4개의 miRNA (miR-130a-3p, miR-329-3p, miR-4463, miR-185-5p)를 확보하였다.

이들 miRNA의 표적 유전자를 8개의 데이터베이스 (miRWalk, PITA, miRanda, RNA22, miRDB, RNAhybrid, Pictar2, Targetscan)를 사용하여 확인하였다. 그 결과, miR-130a-3p, miR-329-3p, miR-4463, miR-185-5p이 공통적으로 조절하는 총 725개의 표적 유전자 목록을 확보하였다.

확보한 725개의 표적 유전자가 포함된 신호 전달 경로를 분석하기 위해 DAVID functional annotation bioinformatics를 사용하였고 표적 유전자가 다수 포함된 상위 10개의 신호 전달 경로를 하기 표 1에 나타내었다.

표 1에 나타낸 바와 같이, 상위 10개의 신호 전달 경로 중 FSH 신호전달과 관련된 PI3K-Akt 신호 전달 경로, Ras 신호 전달 경로, PKA/cAMP 신호 전달 경로가 포함된 것을 확인하였다.

따라서, FSH 반응성에 따라 차이나게 발현하는 miRNA (miR-130a-3p, miR-329-3p, miR-4463, miR-185-5p)가 실제로 FSH의 신호 전달 체계와 관련이 있다는 결론을 얻었다.

다음, FSH의 표적 유전자와 난소 자극과 관련된 유전자 목록을 다수의 논문, 예를 들면 Dr. Joanne Richard(2010), 또는 Sigma Altmae(2011)에서 확인하고, 유전자 목록을 하기 표 2에 나타내었다.

표 2에 나타낸 바와 같이, 이들 유전자 중, miR-130a-3p, miR-329-3p, miR-4463, miR-185-5p의 표적 유전자들이 다수 포함되어 있는 것을 확인하였다. 특히, 최종적으로 과립 세포에서 에스트로겐을 합성하는 아로마타제(Aromatase)인 CYP19A1과 에스트로겐 수용체인 ESR1(ER-α)을 miR-4463의 표적 유전자로 도출하였다.

종합하면, FSHR의 억제에 의해 FSH에 대한 반응성이 감소된 과립 세포주와 상기 FSH에 대한 반응성이 감소된 과립 세포주에 FSH를 처리하여 FSH에 대한 반응성이 회복된 과립 세포주에서 miR-130a-3p, miR-329-3p, miR-4463, 및 miR-185-5p의 발현이 2배 이상 차이나는 것을 확인하였으므로, FSH 반응성과 연관된 miRNA가 miR-130a-3p, miR-329-3p, miR-4463, 및 miR-185-5p임을 알 수 있다. 나아가 miR-130a-3p, miR-329-3p, miR-4463, 및 miR-185-5p의 표적 유전자를 확인한 결과, 다수의 FSH 표적 유전자와 난소 자극과 관련된 유전자가 포함되어 있는 것을 확인함으로써 상기 4개의 miRNA가 난소 기능에 중요한 역할을 할 것이라고 예상할 수 있다. 특히 과립 세포에서 에스트로겐의 합성과 생물학적 기능을 조절하는 CYP19A1과 ESR1(ER-α)이 miR-4463의 표적 유전자임을 확인하였다.

실시예 3. 바이오마커의 검증

MiR-4463의 처리에 의해 과립 세포에서 CYP19A1과 ESR1(ER-α)의 발현이 감소하였는지 다음과 같이 확인하였다. miR-4463의 처리에 의해 과립 세포에서 에스트로겐의 분비가 변화하는지 확인하기 위해서, 아무것도 처리하지 않은 KGN 세포주(MOCK), miR-4463 모방체(mimic)를 처리한 KGN 세포주(miR-4463 mimic), miR-4463 억제제를 처리한 KGN 세포주(miR-4463 inhibitor)에서 CYP19A1, ER-α, ER-β 단백질 발현 수준을 웨스턴 블롯팅으로 확인하였다.

도 4는 아무것도 처리하지 않은 대조군 KGN 세포주(MOCK), miR-4463 모방체(mimic)를 처리한 KGN 세포주(miR-4463 mimic), miR-4463 억제제를 처리한 KGN 세포주(miR-4463 inhibitor)에서 CYP19A1, ER-α, ER-β 단백질 발현 수준을 웨스턴 블롯팅으로 확인한 도이다.

도 4에 나타난 바와 같이, miR-4463 모방체에 의해 CYP19A1, ER-α의 발현 수준이 유의적으로 감소하였고, miR-4463 억제제를 처리한 경우 대조군보다 발현이 증가하는 양상을 보였다.

또한, miR-4463의 처리에 의해 과립 세포에서 에스트로겐의 분비가 변화하는지 다음과 같이 확인하였다. 아무것도 처리하지 않은 KGN 세포주(MOCK), miR-4463 모방체(mimic)를 처리한 KGN 세포주(miR-4463 mimic), miR-4463 억제제를 처리한 KGN 세포주(miR-4463 inhibitor)를 배양하고, 배양액으로 분비된 에스트로겐의 양을 ELISA를 통해 확인하였다.

도 5는 아무것도 처리하지 않은 대조군 KGN 세포주(MOCK), miR-4463 모방체(mimic)를 처리한 KGN 세포주(miR-4463 mimic), miR-4463 억제제를 처리한 KGN 세포주(miR-4463 inhibitor)의 배양액으로 분비된 에스트로겐의 양을 ELISA로 확인한 도이다. 그래프에 명시된 E2는 에스트로겐을 지칭한다.

도 5에 나타낸 바와 같이, miR-4463 모방체에 의해 에스트로겐의 분비가 유의적으로 감소하였고, miR-4463 억제제를 처리한 경우 대조군보다 증가하는 양상을 보였다.

즉, miR-4463은 CYP19A1와 ESR1(ER-α)의 발현을 조절함으로써 과립 세포의 에스트로겐의 분비에 관여한다. 따라서, 과립 세포에서 miR-4463의 FSH에 대한 반응성을 확인함으로써 난소의 FSH에 대한 반응성을 진단, 예측할 수 있다.

<110> CHA University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Biomarker for diagnosing or predicting reactivity to FSH of ovary <130> PN122842 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 17 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-4463 <400> 1 gagacugggg uggggcc 17

Claims

마이크로RNA-4464(miRNA-4463) 또는 miRNA-4463의 모방체(mimic)의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 난소의 여포자극호르몬(Follicle-stimulating hormone: FSH)에 대한 반응성의 진단 또는 예측용 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 miRNA-4463의 모방체는
a) miRNA-4463의 성숙한 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드;
b) miRNA-4463의 pre-miRNA(전구체) 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; 및
c) miRNA-4463의 pri-miRNA(초기전사체) 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나인 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 miRNA-4463은 서열번호 1을 갖는 것인 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 miRNA-4463은 CYP19A1(cytochrome P450 family 19 subfamily A member 1), 또는 ESR1(ER-α)의 mRNA를 표적으로 하는 것인 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 miRNA-4463은 과립 세포에서 에스트로겐의 합성을 억제하는 것인 조성물.
청구항 1에 있어서, 난소의 FSH에 대한 반응성을 진단 또는 예측함으로써 난소기능부전 또는 조기 폐경을 진단 또는 예측하기 위한 것인 조성물.
miRNA-4463 또는 miRNA-4463의 모방체를 포함하는 난소의 여포자극호르몬(Follicle-stimulating hormone: FSH)에 대한 반응성의 진단 또는 예측용 키트.
개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 miRNA-4463 또는 miRNA-4463의 모방체의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
상기 발현 수준을 대조군에서 측정된 miRNA-4463 또는 miRNA-4463의 모방체의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는 난소의 FSH에 대한 반응성의 진단 또는 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법.
청구항 8에 있어서, 상기 시료는 혈액, 난포액, 과립 세포, 또는 난구 세포인 것인 방법.
청구항 8에 있어서, 상기 난소의 FSH에 대한 반응성을 진단 또는 예측함으로써 난소기능부전 또는 조기 폐경을 진단 또는 예측하기 위한 것인 방법.