KR20210110073A

KR20210110073A - 난소 예비력 바이오마커 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20210110073A
Application number: KR1020200025534A
Authority: KR
Inventors: 이경아; 김경화; 궁미경
Original assignee: 차의과학대학교 산학협력단
Priority date: 2020-02-28
Filing date: 2020-02-28
Publication date: 2021-09-07
Also published as: US20230131962A1; KR102316507B1; WO2021172676A1

Abstract

일 양상에 따른 난소 예비력 진단용 조성물, 키트, 및 이를 이용한 난소 예비력을 진단하기 위해 정보를 제공하는 방법에 따르면, 난포 발달을 초기에 예측할 수 있다. 또한, 난자의 수뿐 아니라, 난자의 질 또한 예측하여 종합적인 난소 예비력 진단을 할 수 있다.

Description

난소 예비력 바이오마커 및 이의 용도{Biomarker for Ovarian reserve and use thereof}

난소 예비력 검사용 바이오마커 조성물, 키트, 및 이를 이용한 난소 예비력의 예측 방법에 관한 것이다.

난소는 생식 세포인 난자를 건강하게 만들어 내는 일과 여성호르몬을 분비하여 생식 주기를 정상적으로 유지하게 하는 두 가지 중요한 기능을 담당하는 기관이다. 여성은 태어날 때 정해진 수의 원시난포를 가지고 태어나며, 가임기 동안 매달 20~30개의 원시난포가 성장을 재개하고, 이 중 오직 한 개의 난포만이 배란되어 성숙 난자를 생산하게 된다. 즉, 난소에 존재하는 제한된 수의 원시난포를 계속적으로 소비하는 구조로 여성의 나이가 증가하면 생식 능력은 급격하게 저하되게 되고 이후 원시난포의 고갈로 인해 폐경에 도달하게 된다.

현대사회는 여성의 사회진출로 인해 혼인 연령이 점차 늦어지고 있으며 이에 따라 자연히 첫 아기를 출산하는 엄마의 나이가 고령화 되고 있는 문제점이 존재한다. 또한, 40세 이전에 생식세포가 고갈되는 조기난소부전 및 암치료를 위한 방사선 혹은 화학물질에 의한 난소기능 소실 등 다양한 형태의 난소 기능 관련 문제점이 존재한다. 만혼 및 평균 수명 증가로 인한 난소 기능의 문제는 난임으로 인한 저출산 및 여성호르몬 분비 저하로 인한 여성 삶의 질적 저하와 연결되어 사회적 문제로 대두되고 있다.

여성의 난소 기능 및 난자 생산 능력을 예측하기 위해 난소예비력을 평가하나 절대적인 기준은 없다. 보통 여성의 난소 내 존재하는 원시난포의 수나 초기 난포의 발달 진행에 대한 모니터링은 육안으로는 불가능하다. 따라서 초기 난포 발달 중에 분비되는 물질을 측정하여 간접적으로 난포 발달 여부를 판단하고 있는 실정이다. 현재 주로 사용되고 있는 난소예비력의 지표는 AMH으로, AMH는 성장을 재개한 초기 난포(1차 난포 이상)의 과립세포에서 분비되며 월경 주기에 따라 변동이 적고 민감도가 높다는 장점이 있어 난포 발달 및 증가하는 과립세포의 양을 알려줄 수 있는 지표로 사용되고 있다. 그러나 AMH의 양을 측정하기 위해 개발되어 사용되고 있는 human AMH assay kit의 경우 분석 편차가 큰 문제점이 있을 뿐 아니라, AMH만으로 난소 기능을 모두 파악할 수 없고, 난자의 질적 평가에는 이용되지 못하는 한계점이 존재하고 있다.

이에, 본 발명자들은 난소의 기능을 초기에 예측하고 난자의 기능뿐 아니라 난자의 질 또한 예측 가능한 난소 예비력 바이오마커를 개발하여 위와 같은 한계점을 해결하였다.

일 양상은 miR-145-5p 또는 miR-425-5p의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 난소 예비력(Ovarian reserve) 진단용 조성물을 제공한다.

다른 양상은 miR-145-5p 또는 miR-425-5p의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 난소 예비력(Ovarian reserve) 진단용 키트를 제공한다.

다른 양상은 난소의 기능 저하가 의심되는 개체에서 miR-145-5p 또는 miR-425-5p의 발현 수준을 측정하는 단계; 및

상기 측정된 발현 수준을 정상 대조군의 유전자의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 난소 예비력의 진단을 위한 정보를 제공하기 위하여 마커를 검출하는 방법을 제공한다.

다른 양상은 miR-145-5p 또는 miR-425-5p의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 난소 기능 저하 또는 조기 폐경의 진단용 조성물을 제공한다.

상기 miRNA는 난소 저하가 의심되는 개체 또는 난소 예비력이 낮을 것으로 의심되는 개체에서 분리된 생물학적 시료에서 분리된 것일 수 있다. 상기 개체는 포유류일 수 있으며, 인간, 개, 고양이, 래트, 쥐, 햄스터, 토끼, 말, 양, 소, 염소 또는 돼지일 수 있다. 상기 개체는 여성 표현형일 수 있다.

상기 생물학적 시료는 혈액 유래 시료, 세포 유래 시료일 수 있다. 상기 혈액 유래 시료는 혈액으로부터 분리된 혈청(Serum), 혈장(Plasma) 말초 혈액 단핵구(peripheral blood mononuclear cell: PBMC)일 수 있다. 상기 PBMC는 T-세포, B-세포, 자연살해(natural killer: NK) 세포, 단핵구, 대식세포, 수지상세포, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 혈청 또는 혈장일 수 있다. 상기 시료는 전사체(transcript) 또는 단백질을 포함할 수 있다.

용어 "miR" 또는 "마이크로 RNA"는 표적 RNA의 분해(degradation)를 촉진시키거나 또는 그들의 번역을 억제시킴으로써 유전자 발현을 전사 후에 조절하는 21 내지 23개의 비코딩 RNA를 말한다. 본 명세서에서 사용된 miRNA의 성숙 서열은 miRNA 데이터베이스 (http://www.mirbase.org)에서 얻을 수 있다. 일반적으로 마이크로 RNA는 pre-miRNA라 불리는 헤어핀 구조를 갖는 약 70-80 nt (nucleotide) 길이의 전구체로 전사된 후, RNAse III 효소인 Dicer에 의해 잘려 성숙된 형태로 생성된다. 마이크로 RNA는 miRNP라 불리는 리보뉴클레오복합체를 형성하여 표적 부위에 상보적 결합을 통해 표적 유전자를 절단하거나, 번역을 억제한다. 30% 이상의 인간 miRNA는 클러스터로 존재하며, 하나의 전구체로 전사된 후, 절단과정을 거쳐 최종 성숙 miRNA가 형성되는 것일 수 있다.

상기 miR-145-5p는 micro RNA-145-5p이며, 인간에서 mir-145유전자에 의해 인코딩되는 짧은 RNA이다. 상기 miR-145-5p는 인간의 5번 염색체에 존재하는 것일 수 있다. 상기 miR-145-5p의 발현은 난소 호르몬 분비, 난소 기능 활성화, 난소 예비력과 관련이 있는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 miR-145-5p의 발현이 감소할 경우, 난소 예비력이 높고, 난소 기능이 높거나, 임신 가능성이 높은 것일 수 있다.

상기 miR-425-5p는 micro RNA-425-5p이며, 인간에서 mir-425유전자에 의해 인코딩되는 짧은 RNA이다. 상기 miR-425-5p는 인간의 3번 염색체에 존재하는 것일 수 있다. 상기 miR-145-5p의 발현은 난소 호르몬 분비, 난소 기능 활성화, 난소 예비력과 관련이 있는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 miR-145-5p의 발현이 증가할 경우, 난소 예비력이 높고, 난소 기능이 높거나, 임신 가능성이 높은 것일 수 있다.

상기 유전자는 BMP 신호전달경로(Bone Morphogenetic Protein (BMP) signaling Pathway)를 촉진하는 것일 수 있다. 구체적으로, miR-145-5p는 TGFβ superfamily에 속하는 유전자를 표적하는 것일 수 있다. 상기 유전자는 Acvr1b, Acvr2a, Bmpr2, Tgfbr2, Smad1, 및 Smad3으로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 것일 수 있다. 더불어, TGFβ superfamily는 크게 TGFβ 신호전달 경로(TGF-β signaling pathway)와 BMP 신호전달경로(Bone Morphogenetic Protein (BMP) signaling Pathway) 두 가지로 나뉘고, miR-145-5p는 이 두 경로를 모두 표적하고 있는 것일 수 있으며, 결과적으로 난소의 BMP 신호전달경로를 촉진하는 것일 수 있다.

BMP 신호전달경로를 촉진될 경우, 난소 내 휴면 상태인 원시난포 활성화, 난소 호르몬 증진, 난소 기능의 증진 등을 통해 난소 예비력 증진이 이루어지는 것일 수 있다.

상기 miR-425-5p는 BMP antagonist인 Grem2를 표적하는 것일 수 있으며, 결과적으로 난소의 BMP 신호전달경로를 촉진시키는 것일 수 있다.

용어 "유전자(gene)"는 유전 정보의 단위로서, 기능을 갖는 물질을 암호화하는 핵산 서열을 의미한다. 상기 유전자는 열린 해독틀(open reading frame: ORF)를 포함할 수 있다. 상기 유전자는 ORF 뿐만 아니라 프로모터를 포함한 조절 서열을 포함할 수 있다.

상기 유전자의 발현 수준은 상기 유전자로부터 전사 또는 번역된 전사체(transcript) 및 이로부터 번역된 단백질 또는 그의 단편의 발현 수준일 수 있다. 상기 전사체는 mRNA, 비-암호화 RNA(non-coding RNA), 또는 이들의 상보적 DNA(complementary DNA: cDNA)을 포함할 수 있다. 상기 단편(fragment)은 상기 단백질의 일부로서, 면역원성 폴리펩티드일 수 있다.

용어 "발현 수준(expression level)"은 단백질의 양 또는 전사체의 양을 의미한다. 상기 발현 수준은 단백질 또는 전사체의 상대적인 비율일 수 있다. 예를 들어, 발현 수준의 증가는 음성 대조군에 비해 단백질 또는 전사체의 양이 증가한 것일 수 있다.

상기 제제는 상기 유전자에 의해 발현된 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다. 상기 항체는 폴리클론 항체 또는 모노클론 항체일 수 있다. 용어 "항체(antibody)"는 용어 "면역글로불린(immunoglobulin)"과 상호교환적으로 사용될 수 있다. 상기 항체는 폴리클론 항체 또는 모노클론 항체일 수 있다. 상기 항체는 전장 항체일 수 있다. 상기 항원 결합 단편은 항원 결합 부위를 포함하는 폴리펩티드를 말한다. 상기 항원 결합 단편은 단일-도메인 항체(single-domain antibody), Fab, Fab', 또는 scFv일 수 있다. 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 고체 지지체에 부착된 것일 수 있다. 상기 고체 지지체는 예를 들어, 금속 칩, 플레이트, 또는 웰(well)의 표면이다.

상기 제제는 상기 유전자의 핵산 서열과 동일하거나 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산일 수 있다. 상기 핵산은 프라이머 또는 프로브일 수 있다. 상기 프라이머 또는 프로브는 그의 말단 또는 내부에 형광 물질, 화학발광물질(chemiluminescent) 또는 방사성 동위원소 등으로 표지된 것일 수 있다.

용어 "상보적"은 소정의 혼성화 또는 어닐링 조건, 바람직하게는 생리학적 조건 하에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 상기miRNA 표적에 선택적으로 혼성화 할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 일부 또는 부분적으로 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적 (perfectly complementary)인 것을 모두 포괄하는 의미일 수 있다. 실질적으로 상보적이란, 완전히 상보적인 것은 아니지만, 표적 서열에 결합하여 본 명세서에 따른 효과 즉, miRNA 의 활성을 방해하기에 충분한 효과를 낼 정도의 상보성을 의미하는 것이다.

용어 "핵산"은 폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, DNA, RNA, 및 그 유사체 및 그 유도체를 포함하는 것으로 예를 들면 펩타이드 핵산 (PNA) 또는 그 혼합물을 포함한다. 또한 핵산은 단일 또는 이중가닥일 수 있으며, 폴리펩타이드, mRNA, microRNA 또는 siRNA 등을 포함하는 분자를 코딩할 수 있다.

용어 "난소 예비력(Ovarian reserve)"는 난소 내 배란 가능성이 있는 난자의 수의 정도, 및 배란 유도에 의해 획득된 난자의 질의 정도를 나타내는 지표이다. 상기 난소 예비력은 임신 가능성, 난소 기능 정도, 또는 조기 폐경을 나타내는 지표를 의미할 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 난소 예비력은 원시 난포 활성화, 난소호르몬 생성 또는 난소기능저하 여부를 나타내는 것일 수 있다.

용어 "난소기능저하"는 난소의 기능 저하로 인해 난소 기능 저하 관련 질병의 발병의 위험이 높은 상태를 의미할 수 있다. 난소 기능은 난포자극호르몬(FSH), 에스트라디올(estradiol) 또는 AMH(Anti-Mullerian hormone, 항뮬러관 호르몬) 수치의 변화를 측정하여 확인할 수 있다. 또한, 일 양상에 따른 진단용 조성물을 이용하여 확인할 수 있다. 상기와 같은 난소기능 저하는 호르몬 불균형, 조기난소부전, 다낭성 난소 증후군, 난임 또는 조기 폐경 등을 유발할 수 있다.

난소 기능 저하 관련 질병은 조기난소부전, 다낭성 난소 증후군, 난임, 조기 폐경, 희발월경, 월경 불순, 난소 부전증, 안드로겐 과다혈증, 빈혈, 무월경, 형태학적인 다낭, 인슐린 저항성, 및 보상적 고인슐린혈증으로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 것일 수 있다.

용어"난소 예비력이 낮음"은 난소 내 난자의 수가 적고, 난자의 질이 상대적으로 낮음을 의미할 수 있다. 따라서, 임신 가능성이 낮음, 조기 폐경의 위험이 높음 또는 난소 기능 저하 관련 질병의 위험성이 높음을 의미할 수 있다. 또한, 난소 기능의 저하를 의미할 수 있다.

"난소 예비력이 높음"은 난소 내 난자의 수가 많고, 난자의 질이 상대적으로 높음을 의미할 수 있다. 따라서, 임신 가능성이 높거나 조기 폐경의 위험이 낮음 또는 난소 기능 저하 관련 질병의 위험성이 낮음을 의미할 수 있다. 또한, 난소 기능이 활발함을 의미할 수 있다.

용어 "진단(diagnosis)"은 병명을 판정하는 일을 말하고, 난소 예비력의 병명, 병의 상태, 병기, 병인, 합병증의 유무, 예후, 및 재발 등을 포함할 수 있다.

다른 양상은 miR-145-5p 및 miR-425-5p으로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 난소 예비력(Ovarian reserves) 진단용 키트를 제공한다.

다른 양상은 miR-145-5p 및 miR-425-5p으로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 난소 기능 부진 또는 조기 폐경의 진단용 키트를 제공한다.

상기 유전자는 난소 저하가 의심되는 개체 또는 난소 예비력이 낮을 것으로 의심되는 에서 분리된 생물학적 시료에서 분리된 것일 수 있다. 상기 개체는 포유류일 수 있으며, 인간, 개, 고양이, 래트, 쥐, 햄스터, 토끼, 말, 양, 소, 염소 또는 돼지일 수 있다.

상기 생물학적 시료는 혈액 유래 시료, 또는 세포 유래 시료일 수 있다. 예를 들어, 혈장 또는 혈구일 수 있다.

상기 개체, 생물학적 시료, 유전자, 발현 수준, 제제, 난소 예비력, 및 진단은 전술한 바와 같다.

상기 키트는 난소 예비력 진단에 필요한 시료를 더 포함할 수 있다. 상기 키트는 고체 지지체, 항체 또는 항원 결합 단편의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적합한 완충용액, 발색 효소, 형광물질로 표지 된 2차 항체, 또는 발색 기질을 포함할 수 있다. 상기 키트는 핵산 검출을 위하여, 중합효소, 완충제, 핵산, 조효소, 형광물질, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 중합 효소는 예를 들어 Taq 중합효소이다.

다른 양상은 다른 양상은 난소의 기능 저하가 의심되는 개체에서 miR-145-5p 또는 miR-425-5p의 발현 수준을 측정하는 단계; 및

상기 측정된 발현 수준을 정상 대조군의 유전자의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 난소 기능 부진 또는 조기 폐경의 진단을 위한 정보를 제공하기 위하여 마커를 검출하는 방법을 제공한다.

상기 방법은 상기 miR-145-5p 유전자의 측정된 발현 수준이 정상 대조군에서 측정된 발현 수준에 비해 감소하거나; 또는

상기 miR-425-5p유전자의 측정된 발현 수준이 정상 대조군에서 측정된 발현 수준에 비해 증가한 경우, 상기 개체는 난소 예비력이 높은 것 조기 폐경의 위험이 낮은 것 또는 난소 기능이 높은 것으로 결정하는 단계를 포함할 수 있다.

또한, 상기 방법은 상기 miR-145-5p 유전자의 측정된 발현 수준이 정상 대조군에서 측정된 발현 수준에 비해 감소하거나; 또는

상기 miR-425-5p유전자의 측정된 발현 수준이 정상 대조군에서 측정된 발현 수준에 비해 증가한 경우, 상기 개체는 조기난소부전의 위험이 낮은 것으로 결정하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.

상기 개체는 포유동물, 예를 들어, 사람, 개, 고양이, 마우스, 토끼, 말, 양, 햄스터, 고슴도치, 페럿(ferret), 또는 기니 피그(guinea pig)일 수 있다. 상기 개체는 난소 예비력의 저하가 의심되거나, 난소 기능 부진이 의심되는 개체일 수 있다. 구체적으로, 난소 기능 부진은 난소 호르몬의 저하 또는 난소의 활성화 저하를 포함하여 결과적으로 임신 기능 저하를 유래하는 현상을 통틀어 의미할 수 있다.

상기 혈액 유래 시료는 혈청(Serum), 혈장(Plasma) 또는 그들의 조합일 수 있다.

상기 측정하는 단계는 상기 혈액 유래 시료와, 상기유전자의 핵산 서열과 동일하거나 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산을 인큐베이션시키는 단계를 포함할 수 있다.

상기 측정하는 단계는 전기영동, 면역블로팅, 효소 결합 면역흡착 분석법(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay: ELISA), 면역 조직 화학 염색, 단백질 칩, 면역침강, 마이크로어레이, 노던 블로팅, 폴리머라제 증폭 반응(polymerase chain reaction: PCR), 역전사-PCR(reverse transcription-PCR: RT-PCT) 폴리머라제 증폭 반응, 실시간 PCR, 또는 이들의 조합으로 수행될 수 있다.

상기 방법은 상기 측정된 발현 수준을 정상 대조군의 유전자의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함한다.

용어 "정상 대조군(normal control)"은 용어 "음성 대조군(negative control)"과 상호교환적으로 사용될 수 있다. 상기 정상 대조군은 난소 예비력에 걸린 적이 없는 개체 또는 건강한 개체일 수 있다.

다른 양상은 난소의 기능 저하가 의심되는 개체 또는 난소 예비력의 저하가 의심되는 개체에서 miR-145-5p 및 miR-425-5p으로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 발현 수준을 측정하는 단계; 및

상기 측정된 발현 수준을 정상 대조군의 유전자의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 난소 기능 부진, 불임, 또는 난임을 진단하기 위해 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

일 양상에 따른 난소 예비력 진단용 조성물, 키트, 및 이를 이용한 난소 예비력의 진단 방법 또는 난소 예비력을 진단하기 위해 정보를 제공하는 방법에 따르면, 난소 예비력을 조기에 진단할 수 있다. 또한, 난자의 수뿐 아니라, 난자의 질 또한 예측하여 종합적인 난소 예비력 진단을 할 수 있다.

도 1은 노화 난소의 기능 회복을 위한 줄기세포 치료의 계획 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 노화 생쥐 모델에 주입된 태반 유래 중간엽 줄기세포의 난소 내 정착능을 분석한 이미지이다.
도 3은 줄기세포 치료 후 난포 수 및 혈중 호르몬 농도를 분석한 그래프이다.
도 4는 miRNA-Seq 기반으로 초기 난포 발달 관련 circulating miRNA을 분석한 그래프 및 표이다.
도 5는 선별된 miRNA가 원시난포 활성화와 관련된 BMP 신호전달경로에 미치는 영향을 분석한 이미지이다.
도 6은 줄기세포 치료에 의한miR-145와 miR-425 발현 변화가 BMP 신호전달경로를 촉진하는 원리 및 원시난포가 활성화되는 모식도를 나타낸 것이다.

이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 난소예비력 또는 난소조기부전의 바이오마커 선별 및 확인

1. 노화 난소의 기능 회복 위한 줄기세포 치료

도 1에 나타낸 바와 같이, 자연적으로 노화된 52주령 암컷 쥐의 꼬리 정맥을 통해 5Х10⁵의 태반유래 중간엽줄기세포를 10일 간격으로 세 번 주입 후 1주, 2주, 3주, 5주를 줄기세포 치료 실험군(이하 "실험군"이라 한다.)으로 정의하고, 같은 조건에서 동량의 PBS만을 투입한 군을 대조군으로 정의하여 비교 분석하였다.

노화 쥐에 주입한 태반유래 중간엽줄기세포는 도 2A에 나타낸 바와 같이, 난소 내 정착 여부를 확인하기 위해 PKH67로 염색하였다. PKH67 염색은 PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Kits(Sigma-Aldrich)를 이용하여 세포주입 직전에 진행하였다. 적출한 난소들을 DPBS 세척 후 4% paraformaldehyde를 이용하여 고정하였다. OCT(Optimal cutting temperature)로 동결 블록(Frozen block)을 만든 후 12μm 두께로 동결 절편(Frozen section)을 제작하였다. 만든 동결 절편은 고정 및 DAPI 대조염색(Counter staining) 후 공초점 현미경(Confocal microscope)을 이용하여 노화 난소 내 태반유래 중간엽줄기세포의 존재 여부를 확인하였다.

그 결과, 도 2B에 나타낸 것과 같이, PKH67로 염색된 태반유래 중간엽줄기세포는 주입 후 1주부터 난소 내에 정착된 것을 확인할 수 있었으며 난포 주변에서도 정착된 것을 관찰할 수 있었다. 또한 주입 5주가 경과한 실험군 쥐의 샘플에서도 태반유래 중간엽줄기세포를 관찰할 수 있었다.

상기와 같은 결과는 노화 쥐의 꼬리 정맥을 통해 줄기세포를 10일 간격으로 세 번 주입하면 주입된 세포가 난소 내로 잘 정착된다는 것을 의미하는 것이다.

다음으로, 노화 난소 내로 정착한 태반유래 중간엽줄기세포의 효능을 분석하기 위해 난포 수 및 혈중 호르몬 양을 분석하였다.

난포 수 확인을 위해 적출한 난소들은 4% paraformaldehyde를 이용하여 고정한 후 파라핀 블록(Paraffin block)을 제작하였다. 난소 전체를 7μm 두께로 잘라 파라핀 절편(Paraffin section)을 만들었다. 이때 조직 절편은 극성을 띠는 슬라이드에 순서대로 부착하였다. 슬라이드 번호 10번째의 슬라이드들을 선택하여 탈파라핀 과정과 고정 과정을 거친 후 H&E(Haematoxylin and eosin) 염색을 하였다. 염색된 슬라이드는 광학 현미경(Optical microscope)을 이용하여 난포 발달 단계(원시난포, 1차난포, 2차난포 및 강소 형성 난포)에 따른 난포의 수를 분석하였다. 발달 단계에 따른 난포의 구분은 다음과 같다. 원시난포는 몇개의 편평한 과립세포(Flattened granulosa cells)가 난자를 둘러쌓은 형태의 난포이며, 1차 난포는 원시 난포가 성장을 시작하면서 과립세포가 입방형(Cuboidal granulosa cells)으로 변화된 난포이다. 2차난포는 1차난포가 더 성장한 난포로 과립세포가 두 층 이상으로 증가한 난포들이며 그 동안에 과립세포 바깥 쪽으로 협막세포(Theca cell)가 나타나기 시작한다. 과립세포의 수는 계속 증가하여 어느 이상으로 자라게 되면 난포 안에 난포강(Antrum)이 형성되며 이를 강소형성 난포(Antral follicle)라 한다.

E2와 AMH는 혈청에서 측정하였다. 12시간 절식 후, CO₂ 가스로 호흡 마취하고, 주사기를 이용하여 복대동맥에서 혈액을 채취하였으며 다양한 혈액생화학적 검사를 위해 혈청분리관(polyethylene tube)을 사용하였다. 채취한 혈액은 채혈 후 40분 이내에 원심분리기를 이용하여 혈청을 분리하였다. 호르몬 측정을 위해 혈청을 각300㎕씩 분리하여 -20℃에 보관하였다. 혈청 내 E2 농도는 Elecsys^® Estradiol III(Roche Diagnostics GmbH)를 사용하였으며, AMH 농도는Elecsys^® AMH immunoassay(Roche Diagnostics GmbH)를 사용하였다. 두 호르몬 모두 cobas 6000 system(Roche Diagnostics GmbH)을 이용하여 값을 측정하였고, 표준물질(Standard)의 표준곡선을 이용하여 혈청 내 각 호르몬의 농도를 계산하였다.

그 결과, 도 3A에 나타낸 바와 같이, 태반유래 중간엽줄기세포를 세 번 반복 주입한 후 2주와 3주 그룹에서 1차난포의 수가 2배 이상 증가하는 것을 관찰할 수 있었다.

더불어, 난소에서 생성되는 E2를 실험군 및 대조군에서 비교한 결과, 도 3B에 나타낸 바와 같이, 줄기세포 주입 된 쥐의 혈액에서 더 높게 존재하는 것을 관찰하였다. 또한, 도 3C에 나타낸 바와 같이, 초기 난포 발달의 지표인 AMH의 농도도 줄기세포 주입 후 2주와 3주 그룹에서 유의미하게 증가되는 것을 관찰할 수 있었다.

위와 같은 결과는, 노화 난소 내에 정착된 태반유래 중간엽줄기세포는 잠자고 있던 원시난포를 활성화시킨다는 것을 의미하는 것이다. 즉, 노화 난소 내에 정착된 태반유래 중간엽줄기세포가 정착되는 경우 초기 난포의 발달을 증가시켜 난소예비력을 향상시키고 난소호르몬 생성을 통한 난소 기능 증진의 기능의 표현형이 관찰되는 것을 확인하였다.

2. circulating miRNA 바이오마커의 선별

초기 난포 발달 관련 circulating miRNA를 선별하기 위해 miRNA-Seq을 진행하였다. 보다 구체적으로, 상기 실시예 1의 데이터를 바탕으로, 줄기세포 주입 후 2주 그룹 쥐의 혈장에서 1차난포의 수가 급격히 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, 이를 바탕으로 주입 후 2주 후의 실험군 쥐의 혈장을 채취하여 miRNA-Seq을 실시하였다.

태반유래 중간엽줄기세포 주입 후 2주 된 동물의 혈청에서 miRNeasy serum/plasma kit (Qiagen)를 이용하여 circulating miRNA를 분리하였다. ㈜이바이오젠에 의뢰하여 miRNA-seq을 진행하였다. 간략하게 설명하면, 실험에 적용하기 전 circulating miRNA의 농도는 극미량 분광광도계(ND 2000; Nano Drop)를 이용하여 측정한 후, 200 ng 정량으로 맞춰 주었다. 라이브러리 제작(Library construction)은 multiple Small RNA library Prep kit(NEB)를 이용하여 진행하였으며, Illumina NextSeq500(Illumina)와 Illumina SE75(Illumina)를 이용하여 miRNA-seq을 진행하였다. 이후 이바이오젠에서 제공하는 엑셀 기반 miRNA-seq data 분석(ExDEGA)를 이용하여 유의미하게(p<0.05) 대조군에 비해 2배이상 차이 나게 발현하는 circulating miRNA를 선별하였다.

혈청 200㎕에서 miRNeasy serum/plasma kit (Qiagen)를 이용하여 circulating miRNA를 분리하였으며, 분리 과정 중 cel-miR-39 mimic (1.6Х10⁸ copies/㎕; Qiagen)을 넣어 external spike-in control로 사용하였다. 추출한 circulating miRNA는 HB_I RT Reaction kit(Heimbiotek)를 이용하여 역전사(Reverse transcription)하였다. 모든 quantitative real-time RT-PCR 분석은 CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad)와 Nucleic mix II 키트를 이용하여 수행하였다. PCR 반응물은 HB miR Multi assay kit system I를 사용해 만들었으며, 반응 싸이클 조건은 95℃ 15분에 이은 95℃ 10초, 그리고 60℃ 40초의 단일 형광 측정 40 싸이클로 구성하여 수행하였다. 상기 실험에 사용한 프라이머(Primer)는 Heimbiotek 사에서 구입하여 사용하였으며, 측정된 miRNA의 발현 레벨은 cel-miR-39의 발현량으로 보정하였다.

그 결과, 도 4A에 나타낸 것과 같이, 노화 쥐에 줄기세포 주입 후 변화하는 다양한 circulating miRNA들을 확인할 수 있었고, 그 중 대조군에 비해 줄기세포를 주입한 그룹의 혈청에서 낮게 발현하는 miR-145-5p와 높게 발현하는 miR-425-5p를 선별하였다.

다음으로, 선별된 circulating miRNA의 발현을 검증하기 위해 quantitative real-time RT-PCR을 진행하였다. 그 결과, 도 4B에서 나타낸 것과 같이, miRNA-145-5p는 태반유래 중간엽줄기세포 주입 후 2주와 3주에서 발현이 감소하였고, miRNA-425-5p는 발현이 증가함을 확인하였다.

3. 선별된 바이오마커의 BMP 신호전달 경로의 촉진 확인

상기 실시예 2에서 선별한 circulating miRNA의 하위 유전자들을 확인하기 위하여 miRWalk, TargetScan, miRmap, miRanda 등 다양한 생물정보학 방법(computational algorithms)을 이용하여 결과를 분석하였다.

그 결과, 도 5A에 나타낸 것과 같이, miR-145-5p는 TGFβ superfamily에 속하는 유전자(Acvr1b, Acvr2a, Bmpr2, Tgfbr2, Smad1, Smad3)를 표적하는 것을 알 수 있었다. TGFβ superfamily는 크게 TGFβ 신호전달 경로와 BMP 신호전달경로 두 가지로 나뉘는데, 상기 miR-145-5p는 이 두 경로를 모두 표적하고 있는 것으로 확인되었다.

선별한 circulating miRNA의 별한 변화로 인한 하위 단백질들의 발현 변화를 난소 조직에서 웨스턴 블로팅 (Western blotting) 방법을 이용하여 확인하였다. 난소 조직에 단백질 분해액(Lysis buffer)를 이용하여 단백질을 추출한 뒤 10 혹은 12% SDS-polyacrylamide gel 상에 전기영동 하였다. 이후 폴리비닐덴디플루오리드막(PVDF membrane; polyvinyldene fluoride membrane)에 transfer한 후 5% skim milk를 포함한 TBS-T 완충 용액과 1시간 동안 반응시킨다. 1차 항체로 4℃에서 하룻밤 동안 반응시킨 후 겨자무과산화효소(HRP; horseradish peroxidase)가 부착된 2차 항체를 실온에서 1시간 반응시킨 후 강화 화학발광체 (ECL; enhanced chemiluminescence) 방법을 이용하여 단백질 발현을 확인하였다.

그 결과, 도 5B에 나타낸 것과 같이, 단백질 발현 변화를 Western blot으로 확인한 결과 miR-145-5p가 낮게 발현하고 있는 줄기세포 주입 후 2주, 3주, 5주 그룹의 난소에서 BMP 신호전달경로에 관련된 단백질(Acvr2a, Bmpr2, Smad1, p-Smad1/5)의 발현이 대조군에 비해 높게 발현하고 있는 것을 확인하였다.

또한, 도 5C에 나타낸 것과 같이, MiR-425-5p가 BMP antagonist인 Grem2를 표적하는 것으로 확인하였으며, 단백질 발현 변화를 난소에서 확인한 결과 줄기세포 주입 후 2주와 3주 그룹에서 대조군에 비해 낮게 발현하는 것을 관찰하였다.

상기와 같은 결과는, 노화 쥐에 주입된 태반유래 중간엽줄기세포에 의해 혈액 내에 존재하는 circulating miRNA의 발현이 변화하고 이들의 발현 변화는 난소의 BMP 신호전달경로를 촉진시킨다는 것을 의미한다.

결과적으로, 도 6에 나타낸 바와 같이, BMP 경로의 촉진은 난소 내 BMP 신호전달경로의 활성화로 인해 난소 내 휴면상태인 원시난포들이 활성화되는 것을 시사하는 것이다. 원시난포에서 1차난포 단계로 난포발달을 재개하는 경우, 이후 난포성장이 활발하게 진행되고 결과적으로 난소호르몬의 생성과 분비도 증가하여 노화 쥐의 난소 기능이 증진되는 것을 관찰할 수 있었다.

따라서 혈액에 존재하는 miR-145-5p와 miR-425-5p의 발현 변화를 난포 발달의 지표로 이용하여 여성의 난소예비력을 예측할 수 있다. 또한 호르몬 생성 등의 난소기능의 예측이 가능하여 조기난소부전 진단 등의 지표로 사용될 수 있다.

Claims

miR-145-5p 또는 miR-425-5p의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 난소 예비력(Ovarian reserve) 진단용 조성물.
청구항 1에 있어서, 난소 예비력은 원시 난포 활성화, 난소호르몬 생성 또는 난소기능저하 여부를 나타내는 것인 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 제제는
상기 miRNA의 핵산 서열과 동일하거나 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산인 것인 조성물.
청구항 3에 있어서, 상기 핵산은 프라이머 또는 프로브인 것인 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 miRNA는 BMP 신호전달경로(Bone Morphogenetic Protein (BMP) signaling Pathway)를 촉진하는 것인 조성물.
miR-145-5p 또는 miR-425-5p의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 난소 예비력(Ovarian reserve) 진단용 키트.
난소의 기능 저하가 의심되는 개체에서 miR-145-5p 또는 miR-425-5p의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
상기 측정된 발현 수준을 정상 대조군의 유전자의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 난소 예비력의 진단을 위한 정보를 제공하기 위하여 마커를 검출하는 방법.
청구항 7에 있어서, 난소 예비력은 원시 난포 활성화, 난소호르몬 생성 또는 난소기능저하 여부를 나타내는 것인 방법.
청구항 7에 있어서, 상기 개체는 사람, 개, 고양이, 마우스, 래트(rat), 토끼, 말, 양, 소, 염소, 또는 돼지인 것인 방법.
청구항 7에 있어서, 상기 측정하는 단계는 상기 유전자의 핵산 서열과 동일하거나 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산을 인큐베이션시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
청구항 7에 있어서, 상기 측정하는 단계는 전기영동, 면역블로팅, 효소 결합 면역흡착 분석법(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay: ELISA), 면역 조직 화학 염색, 단백질 칩, 면역침강, 마이크로어레이, 노던 블로팅, 폴리머라제 증폭 반응(polymerase chain reaction: PCR), 역전사-PCR(reverse transcription-PCR: RT-PCT) 폴리머라제 증폭 반응, 실시간 PCR, 또는 이들의 조합으로 수행되는 것인 방법.
청구항 8에 있어서, 상기 miR-145-5p 유전자의 측정된 발현 수준이 정상 대조군에서 측정된 발현 수준에 비해 감소하거나; 또는
상기 miR-425-5p유전자의 측정된 발현 수준이 정상 대조군에서 측정된 발현 수준에 비해 증가한 경우,
상기 개체는 난소 예비력이 높거나 또는 난소 기능 활성화가 높은 것으로 결정하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
청구항 8에 있어서, 상기 miR-145-5p 유전자의 측정된 발현 수준이 정상 대조군에서 측정된 발현 수준에 비해 감소하거나; 또는
상기 miR-425-5p유전자의 측정된 발현 수준이 정상 대조군에서 측정된 발현 수준에 비해 증가한 경우,
상기 개체는 조기난소부전의 위험이 낮은 것으로 결정하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.