WO2017142388A2 - Composición farmacéutica de proteínas híbridas recombinantes capaces de generar anticuerpos neutralzantes en contra del veneno de alacranes - Google Patents

Composición farmacéutica de proteínas híbridas recombinantes capaces de generar anticuerpos neutralzantes en contra del veneno de alacranes Download PDF

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WO2017142388A2
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thioredoxin
venom
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Lourival Domingos Possani Postay
Luján BALTAZAR BECERRIL
Verónica QUINTERO HERNÁNDEZ
Lidia GONZÁLEZ MORALES
Juana María JIMÉNEZ VARGAS
Ernesto ORTIZ SURI
Gerardo CORZO BURGUETE
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Laboratorios Silanes S.A. De C.V.
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Definitions

  • the present invention relates to the design of recombinant proteins formed with toxins selected from the venom of scorpions from various parts of the world (genera Androc ⁇ onus, Buthacus, Buthus, Leiurus, Parabuthus, Ceniruroides, Tityus) which are expressed tfeterologously, by genetic engineering, with adequate folding, such as hybrid proteins, capable of functioning as efficient antigens (immunogens) in the production of antibodies in mammals, thus work individually or in certain mixtures thereof, remaining as suitable compositions for immunization and generation of antibodies capable of neutralizing the complete venom of the scorpion species from which the genetic information of the toxins was obtained.
  • Examples of venom components that can generate neutralizing antibodies to the poisons are: to anatoxin AmmVIH of scorpion Anciroctonus auretanicus mauretanicus (North Africa) (Martin-Eauclaire et ai., 2006), neurotoxin Ts1 (TsVSI or TSY) of scorpion Tityus serrulatus (Mendes et ai., 2008), Sa enzyme S D-Lb1C of the violinist spider Loxoceies boneti (Olvera et al., 2008), the Cn2 neurotoxin of the scorpion Centruroides noxius (Licea et al., 1998), among others .
  • Faboterápicos ie F (ab ') 2
  • Pepsin a product of the elimination of the chrysalisable fragment by digestion of the immunoglobulin with the enzyme Pepsin
  • Hybrid antigenic proteins in which part of the protein whose antibody recognition is irrelevant to neutralize its toxic effects is replaced, and only the relevant antigenic part (antigenic determinants) to generate neutralizing antibodies remains, also represent an advantage in the development of anti-poisons
  • There is knowledge for the production of recombinant antigens for the production of anti-poisons against scorpion sting (Garc ⁇ a-Gómez et al, 2008; Corona et al., 2008; Corzo-Burgue ⁇ e et al., 201 1).
  • a main objective of this invention is to obtain defined mixtures of recombinant neurotoxins that, when used as immunogens in horses, allow the generation of highly specific antibodies against the main toxic components of a given poison and neutralize the toxic effects produced by the bite of said species or said scorpion species and its application in a pharmaceutical composition for use as antivenom.
  • the selection of the clones, the construction of the molecular vectors, the expression of the hybrid genes, the pharmaceutical composition used of the hybrid proteins and their use in experimental animals are described herein, showing that they are efficient for the generation of antibodies. neutralizers against the poison of the scorpions studied.
  • Scorpion species of the Androclonus, Buthus, Leiurus and Parabuthus genera are among the most dangerous in the regions of North Africa, African Sahel, East and South Africa, Near and Middle East. It is estimated that in these regions the number of scorpion bites is about 637,000 bites per year, which causes approximately 2421 deaths (Chippaux and Goyffon, 2008).
  • Some of the recombinant toxins indicated in this development come precisely from scorpion venoms of these genera and they are also the most potent toxins of their respective poisons, these were selected, one by one, based on the existing reports regarding them as far as to toxicity and percentage that they represent within their respective poison.
  • scorpions The most important medical scorpions, as reported by Chippaux and Goyffon ⁇ Chippaux and Goyffon, 2008) are: C. etegans, C. ⁇ nfamatus, C. iimpldus limpidus, C. noxius, C. suffusus suffusus, C. tecomanus and C Sculpturatus As can be seen, these species of scorpions all belong to the genus Centruroides. Some of the recombinant toxins of this development are precisely from scorpion poisons of this genus and they are also the most potent toxins of their respective poisons. These toxins were selected one by one based on the existing reports about them in terms of toxicity and percentage they represent within their respective venom.
  • Tityus serrulatus (yellow scorpion), Tityus bahiens ⁇ s (Alacrán café) and Tityus stigmurus are primarily responsible for scorpworks in humans (Bucaretchi et al., 1995; Eickstedt et al., 1996).
  • Tityus serrulatus is the Brazilian scorpion that causes the most serious accidents with a mortality rate of approximately 1% among children and the elderly. This species is widely distributed throughout the country, covering the states of Sao Paulo, Minas Gerais, Bahia, Espirito Santo, Goiás, Paraná and Rio de Janeiro (Ministério da Sa ⁇ de, 2001).
  • T. serrulatus venom The main toxic component of T. serrulatus venom is the neurotoxin Ts1, also known as Ts-n (Martin-Eauciaire et. Al., 1992.), but there are also other toxic components, such as the toxin Ts2 and the toxin Ts3 (Martin-Eauciaire et al., 1994, Becerril et al., 1997.), which share an identity with the Ts1 toxin of 72% and 38%, respectively.
  • the Ts3 toxin binds to other sites in the sodium channel compared to Ts1 and Ts2, as well as to different paraphrases of antibodies that recognize them, epitopes.
  • TsNTxP non-toxic peptide
  • the serum generated is capable of neutralizing 1.75 DL 0 or scorpion venom T. serrulatus (Guerra-Duarte et al., 2010). Because of this, the TsNTxP peptide is considered an important natural anatoxin in anti-Tityus serotherapy.
  • Underlined nucleotides correspond to the sequences of the restriction sites and the enterokinase (italic) cutting site.
  • Figure 1 B Nucieotidic and amino acid sequence: Nucieotidic sequence of the gene encoding the AaHIl toxin.
  • Figure 1C Nucieotide and amino acid sequence: Nucieotide sequence of the gene encoding the AmmV toxin.
  • Figure 1 D Nucieotidic and amino acid sequence: Nucieotidic sequence of the gene encoding the AmmVIII toxin.
  • Figure 1 E. Generation of the gene encoding the Boti toxin, from the scorpion Buthus occitanus tunetanus with preference use! of codons of E. coii.
  • Figure 1 F Nucieotidic and amino acid sequence: Nucieotidic sequence of the gene encoding the Lqhll toxin and its corresponding translation into amino acids. External oiigonucleotides introduce the restriction sites necessary for cloning the gene into e! pET22B expression vector.
  • Figure 1 G Generation of the gene encoding the ia LqhlV toxin, from the scorpion Leiurus quinquestriatus hebraeus with preference use! of codons of E. coii. Nucieotide sequence of the six oiigonucleotides designed with preference use! of codons of E, coii and synthesized for e! join of! LqhlV toxin gene.
  • Figure 1 H Nucieotidic and amino acid sequence. Nucieotide sequence of the gene that codes for the Pg8 toxin and its corresponding translation into amino acids. The oiigonucleotides used for assembly with preference use! of codons of E, cois are those reported in e! Article: Toxican 53 (2009) 770-778, The assembled gene was used as a temper to clone it into the pET22b expression vector with the external oligos indicated in Figure 1 H.
  • Figure 1 Generation of! gene that codes for the Acra4 toxin, from! scorpion Androctonus crassicauda with preference use! of codons of E. coii. Nucieotide sequence of the six oiigonucleotides designed with preference use! of codons of E. coii and synthesized for ei assembly of the Acra4 toxin gene.
  • the oigigryucidotlids REV1 ⁇ Acra4, Dir2- Acra4, Rev2- Acra4 and Dir3- Acra4 are the internal oyigonucieotldos and Dlr1 ⁇ BEK- Acra4 and Rev3-Xhol- Acra4 are the two external oigiglynucleotides, Nuc eotids the corresponding sequences of the sites restriction and in italics the nucleotides of the cut-off site from eerokinase.
  • Figure 1J Generation of the gene that codes for the toxin Bul, from the scorpion Buthacus acrocentrus with preference use! of codons of £ coli.
  • the oligonucleotide REV1-Bu1, D ⁇ r2-Bu1, Rev2-Bu1 and Dir3-Bii1 are the internal oigonucieotldos and Dir1-BEK-Bu1 and Rev3 ⁇ Xho! ⁇ Bu1 are the two external oilgonucleotides.
  • Underlined nucleotides correspond to the sequences of the restriction sites and in italics the nucleotides of the enterokinase cut-off site.
  • FIG. 1 Expression vector pET22b ⁇ Thio and cloning of the assembled toxin gene.
  • AaHI A scheme of the AaH! Toxin gene assembly is shown. using six oilgonucleotides and restriction sites within the pET22b-Thio expression vector where the AaHI toxin gene (BamHI and Xhol) was cloned. A scheme of the fusion protein that is expressed can be visualized, which contains in the N-termini thioredoxin protein followed by a cut-off site for enterokinase, then to AaHI toxin and finally, in the C-terminal there are 8 histidines which allow purification of the fusion protein.
  • FIG. 3 AcriSamide gei electrophoresis of the thioredox ⁇ na-EK-AmmV- 8His fusion protein. SDS-PAGE. The figure shows a 12% acrylamide gel, in which it is visualized in lane 1: the molecular weight marker, in lane 2: the Thioredoxin-EK-AmmV-8His fusion protein and in lane 3: the Thioredoxin-EK-AmmV-6His fusion protein. These samples are the result of circumvention of NI-NTA agarose affinity chromatography. The arrow indicates the fusion protein.
  • FIG. 4A Purification and repurification of the Thioredoxin ⁇ EK ⁇ AaHI ⁇ 6His fusion protein by HPLC.
  • HPLC chromatogram in which the arrow indicates the fraction and retention time corresponding to the Thioredoxin-EK-AaHI-6His fusion protein,
  • FIG. 4B Purification and repurification of the Threoredoxin-EK-AaHi-8His fusion protein by HPLC.
  • HPLC chromatogram in which the arrow indicates the fraction and retention time corresponding to the Thyredoxin ⁇ EK-AaHil-6His fusion protein,
  • FIG. 4C Purification and repurification of the Thioredoxin-EK-AmmV-6His fusion protein by HPLC.
  • HPLC chromatogram in which the arrow indicates the fraction and retention time corresponding to the Thtorredoxin ⁇ EK ⁇ AmmV-8His fusion protein.
  • Figure 4D Purification of the Threoredoxin-EK-AmmVII! -6His fusion protein by HPLC.
  • HPLC chromatogram in which the arrow indicates the fraction and retention time corresponding to the thioredoxin fusion proiein ⁇ EK-AmmVII! ⁇ 6His.
  • Figure 4E Purification and repurification of the thioredoxin-EK-Botl ⁇ 6His fusion proiein by HPLC.
  • HPLC chromatogram in which the arrow indicates the fraction and retention time corresponding to the thioredoxin-EK-Boil-6His fusion protein.
  • FIG. 4F Purification of the Thioredoxin-EK-Lqhll-6His fusion protein by HPLC. HPLC chromatogram. in which the arrow indicates the fraction and retention time corresponding to the Thioredoxin-EK-Lqhll-8His fusion protein.
  • Figure 4G Purification and repurification of the Thioredoxin-EK-Lqh ⁇ V-6His fusion protein by HPLC.
  • HPLC chromatogram in which the arrow indicates the fraction and retention time corresponding to the thioredoxin-EK-LqhlV-6His fusion protein.
  • FIG. 4H Purification and repurification of the Thioredoxin-EK-Pg8-6His fusion protein by HPLC.
  • HPLC chromatogram in which the arrow indicates the fraction and retention time corresponding to the Thioredoxin-EK-Pg8-6His fusion protein.
  • FIG 41 Purification of the Thio-EK-Acra4-6His fusion protein via HPLC.
  • the purification chromatogram of the Thio-EK-Acra4-6His fusion protein is shown by reverse phase high pressure liquid chromatography (RP-HPLC).
  • RP-HPLC reverse phase high pressure liquid chromatography
  • a C18 analytical column Vydac, U.S.A
  • a gradient of buffer A Water + 0.12% TFA
  • buffer B Alcohol + 0.1% TFA
  • FIG. 1 Purification of the Thio-EK-Bu1-8His fusion protein by HPLC.
  • the chromatogram of the purification of the Thio-E-Bu1-6His fusion protein is shown by reverse phase high pressure liquid chromatography (RP-HPLC).
  • RP-HPLC reverse phase high pressure liquid chromatography
  • a C18 analytical column Vydac, U.S.A
  • a gradient of buffer A Water + 0.12% TFA
  • buffer B Alcohol + 0.1% TFA
  • Figure 8 Antibody titer of rabbits 05, 06 and 08 against the venom of 5 different species of North Africa after the fifth immunization.
  • Figure 8 Antibody titer of rabbit 06, against the venom of 4 different scorpion species from North Africa after the second, third and fourth indentation.
  • Figure 9. Antibody titer of! Rabbit 08, against the venom of 4 different species of North Africa after the second, third and fourth indent.
  • FIG 11 Graph and table illustrating the antibody titer obtained with the recognition of the recombinant toxins AaHI, AaHIl, AmmV, AmmVN, Lqhll, LqhlV, Bot !.
  • FIG. 12 A. Gel SDS-PAGE a! 12% of the recombinant fusion proteins. one ). Thio ⁇ E ⁇ AaHI (20,677 Da); 2). Thio-EK-AaHH (21, 1 17 Da); 3). Thio-EK-AmmV (21, 176.9 Da); 4). Thio- EK-ArnmVI! (21, 292 Da), 5). Thio ⁇ EK ⁇ Lqh! L (21, 150.9 Da), 6). Thio ⁇ EK ⁇ LqhlV (21, 085.9 Da), 7). Thio-E -Bot! (21, 133.8 Da), 8). Protein marker (Page Plus Ruler, Thermo scientific). B. Western Blot. The same order of ge samples is followed!
  • FIG. 13 Assembly of the gene coding for Cn2 toxin from scorpion C. noxius with preference use! of codons of E, coli.
  • the nucleotide sequence of the gene coding for the Cn2 toxin assembled with the preferred use is indicated in the upper part! of codons for E. coli; this preference could be corroborated to! use the program E, coli Codon Usage Analysis 2.0. (http://faculty.ucr.edu/ ⁇ mrnaduro/codonusaqe/usaqe, htm).
  • each of the codons that code for the amino acids of the Cn2 toxin is indicated, as well as the frequency with which E. coli uses that codon.
  • Figure 14A Generation of the gene that codes for the Cn2 toxin, from! scorpion C. noxius with preference use! of £ codons. coli, a and b) Nucleotide sequence of the six oligonucleotides designed with preference use! of E. coli codons and synthesized for the assembly of the Cn2 toxin gene. Nucleotides in bold type correspond to the sequences recognized by restriction enzymes and those encoding the enterokinase enzyme cleavage site. c) Nucleotide sequence of the assembled gene of the Cn2 toxin, with preference use! of E. coli codons and their translation into amino acids. In the coding thread of!
  • DNA is underlined, in black, the sequence of the direct internal oligonucleotides Cn2UpA and Cn2UpC and in the complementary strand of DNA are underlined, in italics, the reverse reverse oligonucleotides Cn2LwB and Cn2L D.
  • Figure 14B Generation of! gene that codes for toxin CII1, from! scorpion C. limpidus limpidus with preference use! of E. coli codons.
  • a and b Nucleotide sequence of the six oligonucleotides designed with preference use! of E. coli codons and synthesized for the assembly of the OH toxin gene.
  • the first four CIH UpA, Cüi LwB, CIH UpC, CIH LwD are the internal oligonucleotides
  • B-EK-CII1 corr and Rev ⁇ Xhol-CI! 1 are the two external oligonucleotides.
  • Nucleotides in bold type correspond to the sequences of the restriction sites and the enterokinase shear site.
  • c) Nucleotide sequence of the gene assembly of toxin CII1, with preference use! of codons of E. co / and their translation into amino acids.
  • the sequence of the internal direct oligonucleotides C ⁇ H UpA and CIH UpC is underlined in the DNA coding strand and in the complementary strand of DNA the internal reverse oligonucleotides GIH LwB and CIH LwD are underlined.
  • Figure 14C Generation of the gene coding for the CII2 toxin, from the scorpion C. srnpidus impidus with preference use! of E. coli codons.
  • a and b Nucleotide sequence of the six oligonucleotides designed with preference use! of codons of E. cois and synthesized for the assembly of the CII2 toxin gene.
  • the first four CI! 2UpA, C !! 2LwB, Cil2UpC, CI! 2LwD are the internal oligonucleotides and B-EK-CII2 and Rev ⁇ Xhol ⁇ C !! 2 are the two external oligonucleotides.
  • Nucleotides in bold type correspond to the sequences of the restriction sites and the enterokinase shear site.
  • the sequence of the internal direct oligonucleotides C! L2UpA and CII2UpC is underlined in the DNA coding strand and in the complementary strand of DNA the internal reverse oligonucleotides Ci! 2LwB and CII2LwD are underlined.
  • Figure 14D Generation of the gene that codes for the Cssll toxin, from! aacran C. suffusus suffusus with preference use! of £ codons.
  • coli a) Nucleotide sequence of the four oligonucleotides designed with preference use! of E. coli codons and synthesized for the assembly of the Cssll toxin gene. b) Nucleotide sequence of the assembled gene of ia toxin Cssi !, with preference use! of E. coli codons and their translation into amino acids. It was used as tempered DNA of the nucleotide sequence of the Cssll toxin, the one reported in e! Article: Estrada, et.
  • FIG. 15 Expression and detection of the recombinant Cn2 toxin fusion protein
  • FIG. 18 Expression vector pET22b ⁇ Thio and cloning of the assembled gene of the Cn2 toxin.
  • a scheme of the assembly of the Cn2 toxin gene is shown by six olsgonucidioids and restriction sites within the pET22b-Thio expression vector, where the Cn2 toxin gene (BamH! And Xhol) was donated.
  • a scheme of the expressed fusion protein can be visualized, which contains in the N-terminal ia Thioredoxin protein followed by a cut-off site for enterokinase (E), then the Cn2 toxin and finally, in the C-terrninai there is 8 histidines that allow purification of the fusion protein.
  • FIG. 17A Purification and repurification of the Thioredoxin-EK-Cn2-6His fusion protein by HPLC.
  • HPLC chromatogram, in e! which arrow indicates the fraction and retention time corresponding to the Thioredoxin ⁇ E -Cn2-6His fusion protein.
  • FIG. 17B Purification and repurification of the Thioredoxin-EK ⁇ CII1 ⁇ 6His fusion protein by HPLC.
  • HPLC chromatogram in which the arrow indicates the fraction and retention time corresponding to the Thioredoxin-EK-CIH-8His fusion protein,
  • FIG. 17C Purification and repurification of the fusion protein Tsorredoxin-EK-CII2-6His by HPLC.
  • HPLC chromatogram in which the arrow indicates the fraction and retention time corresponding to the Thioredoxin-EK-CII2-6His fusion protein.
  • FIG. 17D Purification and repurification of the Thioredoxin-EK-Cssll ⁇ 8His fusion protein by HPLC.
  • HPLC chromatogram in which the arrow indicates the fraction and retention time corresponding to the Thioredoxin-EK-Cssll-8His fusion protein.
  • FIG. 18 Recognition test of native toxins by polyclonal antibodies obtained after the immunization schedule.
  • the native toxins Cn2 and II1 were immunoabsorbed in ELISA plates and subsequently recognized by polyclonal antibodies obtained from the immunization of mice with the respective recombinant toxins. The dilution is indicated that the serum was used and the determinations were made in duplicate.
  • Serum titers obtained from mice immunized with the recombinant Cn2 fusion protein Serum titration of the immunized mice was carried out using as antigens the total venom of C. noxius and the recombinant protein Cn2. The absorbance curves are indicated with respect to the dilution of the serum and the titers obtained in each case.
  • FIG 20 Serum titers obtained from mice immunized with the recombinant Cssil fusion protein. Serum titration of immunized mice was carried out using as antigens the total venom of Centruroides suffusus sulfusus and protein. Cssll recombinant. The absorbance curves are indicated with respect to serum dilution and the titres obtained in each case.
  • Figure 21 Analysis of the sequence of the gene coding for the toxin Ts1, from the scorpion Tityus serruiatus with preference use! of E. coli codons.
  • the entry of the gene's DNA sequence into the E. coli Codon Usage Analysis 2.1 program generates a diagram consisting of a horizontal bar for each codon. The length of the bar is proportional to the frequency at which each codon is expressed. At the bottom of each codon, e! amino acid coding.
  • FIG 22 Sequence analysis of! gene coding for the TsNTxP toxin, from the scorpion Tityus serruiatus with the preferential use of E. coli codons.
  • the entry of the gene's DNA sequence into the E. coli Codon Usage Anaiysis 2.1 program generates a diagram consisting of a horizontal bar for each codon. The length of the bar is proportional to the frequency at which each codon is expressed. The coding amino acid is indicated in the lower part of each codon.
  • Figure 23A Generation of the gene encoding the toxin Ts1, from the scorpion Tityus serruiatus with preference use! of £ codons.
  • Nucleotides in bold correspond to the sequences of the restriction sites and in italics the cut-off site of the enterokinase.
  • B) Nucieotidic sequence of the assembled gene of the toxin Ts1, with preference use! of E. coli codons. In the coding thread of! DNA is highlighted in italics in the sequence of the direct oligonucleotides GamTserUpI and GamTserUp3 and in the complementary strand of DNA the reverse oligonucleotides GamTserLw2 and GamTserLw4 are underlined.
  • Figure 23B Generation of the gene coding for the TsNTxP toxin, from the scorpion Tityus serruiatus with preferential use of E coli codons
  • FIG. 23C Generation of the gene coding for the Ts3 toxin, from the scorpion Tityus serruiatus with preferential use of E. coii codons.
  • FIG. 24 Expression vector pET22b-Thio and cloning of the assembled Ts1 toxin gene.
  • a scheme of the Ts1 toxin assembly is shown by six oligonucleotides and the restriction sites within the pET22b-Thio expression vector where the Ts1 toxin gene (BamHi and Xhol) was cloned.
  • a scheme of the expressed fusion protein can be visualized, which contains in the N-terminal the Thioredoxin protein followed by a cut-off site for enterokinase. then the toxin Ts1 and finally, in the C-terminai there are 6 histidines that allow purification of the fusion protein.
  • FIG. 25 Expression and purification of the Thio-EK-TsNTxP fusion protein.
  • ooll BL21 (DE3) after 6 hours of induction, 4).
  • PPB fraction 5).
  • Water fraction 6).
  • HPLC purified fusion protein (retention time of 34.9 min). The arrow indicates the place of migration of the fusion protein around 20 kDa, both in the gel and in the Western blot. Anti-histidine antibodies were used in the development of the western blot.
  • FIG. 26A Purification and re-purification of the Thioredoxin-EK-Ts1-8His fusion protein by HPLC.
  • HPLC chromatogram in which the arrow indicates the fraction and retention time corresponding to the Thioredoxin-EK ⁇ Ts1 ⁇ 8His fusion protein.
  • FIG. 26B HPLC purification of the Thio ⁇ EK ⁇ TsNTxP-6His fusion protein. At the fraction corresponding to the retention time of 34 minutes, the motecular mass was determined through a mass spectrometer, obtaining the expected ionic series, the which indicates that the experimental mass is the same as the theoretical one, which corresponds to 20,630 Da.
  • Recombinant toxin recognition assay (Mixture of the Ts1, TsNTxP and Ts3 hybrids) by the polyclonal antibodies obtained after the immunization scheme applied to rabbit 34.
  • the recombinant toxins were immunoabsorbed in ELISA plates and subsequently they were recognized by polyclonal antibodies obtained from the 2nd, 4th and 5th immunization of rabbit 34 with the mixture of the Ts1, TsNTxP and Ts3 hybrids.
  • the dilution used for the serum is indicated (3,000, 9,000, 27,000 and 81,000 correspond to the dilutions 1: 3000, 1: 9000, 1: 27000 and 1: 81000) and the determinations were made in duplicate.
  • FIG. 28 Expression vector pQE-30 and donation of the assembled gene of the toxin Ts1.
  • the construction will be made up of the four vector amino acids (MRGS), six histidine residues, followed by a cut-off site for the FXa protease (IEGR) and finally the sequence of the Ts1 toxin.
  • MRGS vector amino acids
  • IEGR FXa protease
  • Figure 29 Affinity expression and purification of the fusion protein M ⁇ 6His ⁇ FXa-Ts1. 15% SDS-PAGE gel. one ). Molecular Weight Marker, 2). Extract of the Origami strain of £. coü at time 0, 3). Extract of the Origami strain of E, co ⁇ i before inducing, 4). Extract of the Origami strain of £. coü after inducing, 5). Soluble fraction, 8). Insoluble fraction, 7 and 8). Elution of the M ⁇ 8His-FXa-Ts1 protein from the affinity column. 9). HPLC purified fusion protein (16 min, see figure 2). The arrow indicates the location of fusion protein fusion around 8.7 kDa.
  • FIG. 30 HPLC purification and repurification of the fusion protein -8His ⁇ FXa ⁇ Ts1.
  • the arrow indicates the fraction and retention time corresponding to the fusion protein.
  • Figure 31 Mass spectrum. It represents the relative abundance of ions produced with respect to their mass / charge ratio.
  • the theoretical mass for the fusion protein -6His-FXa-Ts1 is 8,742.98 Da.
  • FIG 32 Affinity expression and purification of the M-6His-EK-Ts3 fusion protein. 15% SDS-PAGE gel. one ). Molecular Weight Marker, 2). Extract of the Origami strain of E. coli before inducing, 3). Extract of the Origami strain of E. coli after induction, 4). Soluble fraction, 5). Insoluble fraction, 6). Elution of the M-6His-FXa ⁇ Ts1 protein from the nickel affinity column, 7). HPLC purified fusion protein (15.8 min, see figure 33). The arrow indicates the migration site of the aerator fusion protein of 9.4 kDa. Figure 33. HPLC purification of the M-6His-EK-Ts3 fusion protein. The chromatogram shows that the protein is eiut ' given at 15.8 min.
  • Figure 34 Mass spectrum. Represents the relative abundance of the ions produced with respect to their mass / charge ratio. The experimentally determined mass is 9,493.8 Da.
  • Figure 36 Affinity expression and purification of the SVS-6His-EK-TsNTxP fusion protein. 15% SDS-PAGE gel. one ). Extract of the Origami strain of E. coli before inducing, 2). Extract of Origami strain of E. coli after inducing, 3), Soluble fraction, 4). Insoluble fraction, 5). Elution of the M-8His-FXa-Ts1 protein from the affinity column. 6). HPLC purified fusion protein (15 min, see figure 38), 7). Molecular weight marker. The arrow indicates the location of fusion protein fusion around 8.7 kDa.
  • FIG. 36 HPLC purification of the M-6His-EK-TsNTxP fusion protein. The chromatogram shows that the protein is eluted at 15 min.
  • Figure 38 Antibody titers of sera from rabbits immunized with the mixture of Sas proteins fvl-SHis-Fxa-H ⁇ s, -6His-EK-Ts3, M-6His-EK-TsNTxP.
  • the preimmune serum of rabbits 71, 72 and 73, as well as the serum of the first bleeding were evaluated against the venom of Tityus serrulatus.
  • Figure 39 Antibody titers of sera obtained from immunization of rabbits with the mixture of proteins y-8His ⁇ Fxa-H ⁇ , M-8His-EK-Ts3, M ⁇ 6His-EK-TsNTxP.
  • the graph shows the antibody titration of the sera obtained in 2nd and 7th indentation against the venom of Tityus serrulatus.
  • the antigens are all substances foreign to an organism that are not accepted by the immunological system, which is capable of synthesizing an antibody that recognizes and sticks to the antigen, preventing it from causing damage to the organism in contact with the unwanted antigen .
  • the medical practice is to use the "antigen-bonded fragments" of horse-generated antibodies, which are purified from the blood of animals and prepared for therapeutic use, remaining as the active substance of amphibennes, from which it arises the term "faboterápico" already used in a generic way in some of the scientific literature of the field.
  • the faboterápicos in the case of the scorpion picket, are neutralizing fragments of the action of the scorpion venom toxins.
  • fabotherapeutics depending on the type of antigen, against which we want to have an immunoglobulin (antibody) that recognizes it and neutralizes its possible harmful action to the individual in question.
  • anti-aacran fabotherapeutics these are produced by injecting mixtures of various poisons, or homogenates of the venomous glands of scorpions of different dangerous species to humans, to horses that are immune to venom.
  • a mixture of the venom of the scorpion species Centruroides noxius, Centruroides ⁇ impidas iimpidus, Centruroides suffusus suffusus, and Centruroides Iimpidus tecomanus (Fabotherapeutic Alacramyn TM from the Bioclón Institute, Mexico) is used.
  • the horse is immunized, its blood is obtained and its immunogiobulins are treated to produce only "F (ab ' ) 2 " fragments, among which there are some molecules that are capable of neutralizing the toxins of the poison.
  • Part of the invention describes the selection of a specific mixture of proteins ⁇ scorpion toxins fused to the thioredoxin protein) that are capable of generating antibodies in caba ⁇ los and other animals such as mice and rabbits, without requiring the use of total poisons or bomogeneized of venomous glands to produce fragments of protective antibodies against the toxins of various species of scorpions, and the strategy and products (immunogens) used are described below.
  • TsNTXP of scorpion Tityus serruiatus (Brazil), SEQ ID No: 15
  • hybrids can be with thioredoxin or with histidine tails and they contain the recognition sequences of the EK and FXa endopeptidases as explained below for each case.
  • the strategy is designed to obtain a nucieotidic sequence capable of expressing these toxins in a heterologous system.
  • the selection of said toxins is part of the present invention, since despite the fact that the sequences were previously determined and appear in scientific publications and database (Rochat et al., 1970; Rochat et al., 1972; Rosso and Rochat, 1985 ; Alami et al., 2003; Gregoire and Rochat, 1983; Borneman and Hahin, 1993; Corzo et ai., 2001; Garc ⁇ a-Gómez et al., 2009; Callskan, et al., 2013; Caliskan et ai., 2012 , Vázquez et.
  • the present invention is an innovation both in the selection of toxins that generate neutralizing antibodies, as well as in the testing and selection of mixtures that provide advantages to the technical field, with respect to what the use of native poisons implies. .
  • the selected toxins are found in limited quantities in their respective poisons, for which it was necessary to generate an expression system capable of producing in sufficient quantity the recombinant toxins and mainly in a folded form, since this type of toxins possess 8 cysteines that they form 4 disulfide bridges, so that recombinant toxin that is not folded like the native one has a very low probability of inducing the production of neutralizing antibodies. (Pedroso De Lima & Düzgünes N. Eds. 1995).
  • scorpion toxins expressed in the cytoplasm of bacteria are produced without folding, that is, they lack the disulfide bridges that maintain the three-dimensional structure required for their function, for which an extra step is required after purification that allows disulfide bridges to form correctly. This is quite expensive for antigen production. In addition, the yield of the final folded protein is low. In our bacterial expression system, we fuse the thioredoxin protein gene with the desired toxin and with the proper folding.
  • the thioredoxin included as part of the protein fusion in the cases tested functions as a protein that provides, on the one hand, stability to the toxin to which it is fused and on the other hand, it has intramolecular folding chaperone activity whereby favors the folding of the toxin to which it is attached.
  • intramolecular folding chaperone activity whereby favors the folding of the toxin to which it is attached.
  • External and internal olygonucleotides were designed to assemble each of the toxins, AaH and AaH II of the scorpion Androctonus austraiis Héctor, AmmV and AmmVIII of the scorpion Androctonus mauratanicus auretanicus, Bot I of the scorpion Buthus occ ⁇ anus tunetanus, Lqhll alacrus lequsque Lehtrustrich and Lqhllus lechustrichr , Pg8 of the scorpion Parabuthus granuiatus, Acra4 of! scorpion Androctonus crassicauda and Bulb of scorpion Buthacus macrocentrus, with preferential use of codons of E. cois.
  • These olygonucleotides were synthesized by chemical synthesis, in the DNA synthesis and sequencing unit of the Institute of Biotechnology of the UNAM. See Figures 1A-1J
  • the nucleotide sequence of the genes was assembled by recursive PCR and subsequent cloning in the pBluescriptKS (-) vector.
  • the assembly PCR of each toxin was performed using Vent DNA polymerase (New Engiand Biolabs, USA), following the instructions suggested by the supplier.
  • the two external oligo nucleotides were used at a final concentration of 0.2 pmoi / ⁇ and the internal oligo nucleotides at a concentration of 0.02 pmol / ⁇ .
  • the PCR conditions were: 5 minutes at 94 ° C, followed by 8 cycles with a low alignment temperature (94 ° C 30 sec, 50 ° C 1 min, 72 ° C 1 min), and then 25 short cycles with a high alignment temperature (94 ° C 30 sec, 80 ° C 30 sec, 72 ° C 30 sec), ending with 5 min incubation at 72 ° C.
  • PCR products were separated on agarose gel and purified with the QIAQuick gel extraction kit (QIAGEN, USA).
  • the PCR products were cloned with blunt ends into the pBluescriptKS (-) vector (Stratagene, USA), previously digested with the EcoRM enzyme, using T4 DNA ligase (Fermentas, Canada), according to the protocol provided by the supplier.
  • the ligation product was electrotransformed into DH5 alpha electrocompetent cells which were subsequently plated in Petri dishes with 2XYT medium containing also IPTG / X-Gal / Ampicillin for selection of white or blue clones and positive (white) clones were verified by PCR from colony with the T7-like olygonucleotides (5'-GCG TAA TAC GAC TCA CTA TA-3 ") and T3-like (5" -CTC ACT AAA GGG AAC AAA AGC-3 ').
  • the clones that gave the PCR with the expected size were amplified and plasmid DNA was obtained from them by means of the alkaline lysis method.
  • the constructs were sequenced to verify that the assembly and donated sequence of each gene of each toxin was correct.
  • the preparation of the expression vector pET22b-Thioredoxin ⁇ cutting site for Sickokinase was continued.
  • the vector pThioH ⁇ s C nitrogen
  • EK enterokinase
  • the PCR product was digested with the enzymes A / col and Xhol and cloned into the expression vector pET22b (Novagen).
  • expression vector was called pET22b-Thio. See Figure 2.
  • the external oligonucleotides encoding the N-terminal of each toxin contain a BamHI cloning site which allows the toxin gene to be cloned in the same reading frame as the thioredoxin gene of the expression vector, followed by a sequence that encodes the bovine enterokinase (Asp-Asp-Asp-Asp-Lys) cutting site to be able to separate it from! last gene that codes for the toxin.
  • This construction was made for each of the recombinant toxins used in the project.
  • the reverse oligonucleotide introduces an Xhol restriction site designed to maintain the construct in the reading frame of the sequence encoding the 8 histidines of the expression vector.
  • the plasmids containing the toxin genes were digested with the enzymes BamHI and Xhol (New England Bioiabs, USA) and the released inserts were purified by agarose gel electrophoresis using the "QIAQuick gei extraction" kit (QIAGEN ). The purified restriction fragments were ligated to the expression vector pET22b-Thio previously digested with BamHI and Xhol. See Figure 2.
  • Each of the expression vectors containing the gene encoding the toxin was eiectrotransformed into bacterial cells.
  • the bacterium used is E. coli strain BL21 (DE3) (Stratagene, Agilent Technologies Co.), this strain is not pathogenic, it is genetically modified in functions related to recombination of its genetic material, amino acid synthesis, protease production, among other functions, in order to make it more efficient for the expression of recombinant proteins.
  • the main feature of BL21 (DE3) is that it includes DE3, a prophage ⁇ , which contains the T7 gene 2 ⁇
  • RNA polymerase under the control of the lacUVS promoter, whereby it is possible to use it to produce proteins from a cloned gene in an expression vector under the control of the T7 promoter.
  • E. coü strain BL21 (DE3) is a descendant of the E. coü B strain used by the Pasteur Institute in Paris, in the first studies with bacteriophages.
  • E. coü B is the most common host of phage T1-T7, whereby strains derived from E. coü B are widely used together with those derived from E. coü K-12. Both considered as low-risk organizations ⁇ Level 1) (NIH Guide ⁇ ines, U.S. Department of Health and Human Services, 1986).
  • E. coü BL21 (DE3) encodes proteins that give resistance to the antibiotic ampicillin. The gene that codes for the protein that confers antibiotic resistance is obtained from nature and is used in genetic engineering to select and identify the already modified organism.
  • the methods used for the introduction of genetic material into the modified strain are transformation, conjugation or transfection.
  • the precipitated cells were completely resuspended in 20 ml of PPB buffer (200 mg / ml sucrose, 1 mlVI EDTA, 30 m Tris-HCI pH8) and incubated in ice for 30 minutes. 20 minutes were centrifuged at 5,000 xg and the supernatant was recovered. Subsequently, the cell precipitate was resuspended in 20 ml of H 2 0, incubated for one hour on ice and centrifuged again at 5,000 xg for 20 min at 4 "C. The supernatant was recovered and the cells were resuspended in 5 ml of 50 mM Tris, pH 8.
  • PPB buffer 200 mg / ml sucrose, 1 mlVI EDTA, 30 m Tris-HCI pH8
  • 20 minutes were centrifuged at 5,000 xg and the supernatant was recovered.
  • the cell precipitate was resuspended in 20 ml of H 2 0, incubated
  • the cells were broken using sonicator, giving pulses of 30 seconds of ignition and 10 seconds of rest.This was always done on ice, to avoid heating the sample. It was then centrifuged at 5,000 xga at 4 ° C for 20 min and the supernatant recovered. DNAse was added to the supernatants recovered ⁇ g of DNAse for every 1 ml of iced coexists), incubated 15 minutes on ice and centrifuged 5,000 xga at 4 ° C for 20 min or until the cell debris was completely removed from the sample. The supernatant was recovered and the sample was filtered, if necessary. Sodium azide (final concentration 0.02%) was added to avoid contamination. This extract was used for protein purification using affinity columns. See Figure 3 (lanes 2 and 3).
  • the proteins were separated by electrophoresis in a discontinuous polyacrylamide gel under denaturing conditions (SDS-PAGE) according to the method described by Laemm ⁇ i (Laemmli, 1970).
  • a Mighty small II camera Hoefer Scienfific Instruments, San Francisco, USA was used, with gels 0.75 mm thick. A 5% concentration gel precedes the 12% separation gel.
  • Each sample was diluted in a denaturation solution containing 125 mM Tris pH 8.8, 4% sodium dodecyl sulfate (SDS), 20% glycerol, 10% ⁇ -mercaptoethanol, 0.05% (v / v) blue of bromophenol and incubated for 5 min at 95 ° C.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • the molecular masses of the binary pathway peptides obtained were determined by ⁇ VIALDI-TOF or ESi-ION-TRAP (Romeo et ai., 2008), in the proteomics laboratory of the Biotechnology Institute of UNAM.
  • Enzyme-linked immunoassays were performed in 96-well polyvinyl plates (Costar, Cambridge MA. USA) by coupling 3 ⁇ g per well of the native toxin dissolved in a solution of NaHC0 3 0.05 MH 9.4 incubated at 37 ° C by 1 hour. 3 washes were performed with 1X PBS added with 0.1% tween 20 (this solution of PBS 1X + Tween is abbreviated as PBST). The non-specific binding sites were blocked with a 0.5% saturated solution of BSA (bovine serum albumin) in PBST coiocating 200 ⁇ per well and incubating at 37 ° C for 2 h or at 4 ° C overnight.
  • BSA bovine serum albumin
  • the protein does not exert any toxic effect on the mouse, because the toxin having fused to the thioredoxin at its N-terminal end, affects its activity probably due to steric hindrance.
  • the fact that as a fusion protein the toxin is not toxic is one of the main advantages when used as an antigen, since when immunizing animals there is no danger that the animal subject to the immunization process will suffer the toxic effect of the recombinant, thus allowing to immunize them with high doses of the antigen.
  • mice and rabbits were immunized with the recombinant toxins and when performing challenge experiments, they showed that they developed antibodies that are capable of recognizing the poison and protect against toxins.
  • immunization experiments on horses, which are the experimental animals of choice for the production of fabotherapeutics (neutralizing antibodies), and which are also the procedures authorized by the health authorities, both national and national. World Health Organization.
  • the antivenoms currently in use for humans are mostly made by hfper-immunization of horses. An example of this is the so-called "Alacramyn", which is one of the antivenoms currently in use in the Mexican population that requires this product.
  • the total scorpion poisons used in the experiments that support the present description were purchased from the Latoxan company (France).
  • mice The immunization in mice and the neutralization results using the sera obtained are described below.
  • Groups of 10 mice of the 17 g CD1 strain on average were immunized initially.
  • the immunogens used were the r (toxin) His fusion protein (SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 14, SEQ ID No. 16, and SEQ ID No. 18).
  • Injection of toxins was performed subcutaneously.
  • the emulsion was prepared with the toxin dissolved in PBS ai 1X with complete Freund's adjuvant (rockiand) in the first immunization, and incomplete or alumina in the following immunizations.
  • Immunization was performed by injecting the toxin in 100 ⁇ of solution per mouse on each occasion, with a period of approximately 10 days between immunizations. The generation and increase of serum antibodies against total venom and native or recombinant toxins was checked by ELISA assays. After the last immunization, neutralization tests of 1 to 3 DL 50 of total venom were performed with groups of 3 or more mice (See Tables 1-3 of neutralization data, according to the immunization schedule that precedes them.
  • mice were immunized: with each of the hybrids of the recombinant toxins (fusion protein format): rThio-toxin (rThio-EK-toxin-8His) (SEQ ID No 11- SEC ⁇ D No 20).
  • Immunization scheme I 10 mice were immunized with the fusion protein:
  • Serum OLso enene used Proportion of surviving mice with respect to total mice tested
  • Serum DLSQ venom used Proportion of surviving mice with respect to total mice tested
  • mice Severe intoxication symptoms were observed in 4 mice, but 3 hours after injection and 8 mice from a group of 10 survived. Symptoms observed in control mice: all died between 25 minutes to 1 time hour and half.
  • mice were immunized with Sa mixture of the fusion proteins of AmmV and AmmV! ⁇ i (from Androctonus mauretanicus mauretanicus) and e! challenge was with Androctonus austraiis venom.
  • antibody titres were determined by ELISA assays by the conventional method with peroxidase-coupled anti-rabbit antibody absorbance was detected at 490 nrn.
  • rabbit 08 is the one that presents the best titles against the poisons of A. austraiis, A. rnauretanicus, B. occ ⁇ tanus and L qu ⁇ nquestriatus, so it was decided to use the serum of this rabbit to perform of neutralization tests against Sos four poisons in female mice of strain CD1 of 18 to 20 g in weight. See figures 8 and 9, Because the titers against the poisons were not so high, it was decided to start testing 2 DL 50 of each poison only in two control mice and two more for the 250 ⁇ serum neutralization test. In cases where there was death of the mice in the presence of serum, it was reduced to 1 LD 50 , while in another case 2 LD 50 were left because severe symptoms of mouse poisoning were observed and in another it was increased to 3 DL 50 .
  • Table 9 shows the neutralization assays of A. australis venom, where it is observed that with 2 DL 50 , 100% of the mice population in both controls and serum die. So the mice were challenged with only 1 DL 50 of venom and in the control mice the death is observed in 30 minutes, here we would expect only the death of 50% of the population so this indicates that we are perhaps not using the correct amount of venom or this group of mice was very sensitive, so more tests would have to be done. However, when comparing the control group with those in the serum, it is observed that 50% of the population dies and the time in which the symptoms occur is delayed, in the control the mice die around 30 minutes, while in the other group they die at ios 70 minutes.
  • Table 11 shows that only two mice are injected with 3 LD50 of the total venom of L. quinquestriatus. It is observed that 100% of the population dies both in the group of control mice and in which the venom mixed with the 250 ⁇ of serum is administered. Based on these results, it was decided to challenge a group of 8 mice with only 2 LD50 of the venom with and without serum. It is observed that 100% of control mice die while in the other group 100% survive. These results indicate that rabbit serum 08 is able to neutralize 2 LD50 of the L. quinquestriatus venom.
  • Table 12 shows the neutralization test with Buthus occitanus venom, in which it is evident that rabbit serum 06 is capable of neutralizing 2 DL 50 of the total venom.
  • the rabbit serum 06 not only has a good ability to recognize the different venoms of the scorpions of North Africa, but is also able to neutralize 1 DL 50 , 2 DL 50 and 3 LD 50 of the poisons of A. austraiis, A, mauretanicus, B. occitanus and L quinquestriatus, respectively.
  • Buffer is stopped until the absorbance at 280 nm is equal to or less than 0.07, 2M Tris-HCI pH 8.0 buffer is used to prevent denaturation of the antibodies.
  • the fractions of interest are dialyzed against 10 volumes of the sample with PBS1X, four changes of 1 hour are made at 4 ° C.
  • the antibodies are stored in PBS1X + 50% Glycerol + 0.02% NaN 3> aliquots of 750 pg / 1.5 ml are prepared and stored at -70 ° C. With these aliquots, the antibody titer against the recombinant toxins AaHI, AaHIi, AmmV, AmmVII, Lqhll, LqhlV and Botl was determined. See Figure 1 1.
  • FIG. 12 shows the recognition of recombinant fusion proteins by the purified antibody. As shown in Figure 12A, bands around 20 kDa corresponding to the fusion proteins of interest are observed, as well as a dimer of these proteins between 35 and 40 kDa. In the case of WB, a good recognition of the proteins is observed, obtaining bands around 20, 40 and 80 kDa, indicating that the antibody is also recognizing dimers and trimers of the fusion proteins.
  • mice Two groups of 2.5 Kg New Zealand rabbits were immunized with each of these immunogens, administration was subcutaneously, by injecting the recombinant toxin in a final volume of 500 ⁇ ! of 1X PBS. 8 immunizations were made with 10-day lapses between them. Once the immunization protocol was finished, neutralization tests of the total venom with the sera obtained were carried out. 3 groups of mice with an approximate weight of 17 to 20 grams and inoculated intraperitoneally were used. For the control, 4 mice were used in which only the total venom of Parabuthus granulatus was injected. For each of the challenges, 6 mice were used, injected with 250 ⁇ of preimmune serum previously incubated at 37 ° C for 60 min with 3 DL S or of the total venom.
  • Immunizations were performed in a manner similar to that performed in the system with mice and in the following tables of immunization schedules ⁇ III and IV) the details of each immunization can be observed and at the end of each scheme the neutralization table is found corresponding where the protective capacity of each serum was assessed: Scheme II !.
  • mice injected with 250 ⁇ 4/4 venom and Rabbit serum 46, 2 DLso
  • mice Group of control mice (only they are).
  • mice presented 43 light symptoms of poisoning but
  • Leiurus venom and 300 ⁇ of serum Leiurus quinquestriatus Slight symptoms such as Horse 43 hebraeus paralysis of the hind legs were observed.
  • Leiurus venom has other toxins of medical importance, and only one of them was used to immunize the horse, which may be the reason for the partial neutralization that was obtained.
  • mice were injected with different amounts of the serum obtained from the immunized horses, previously incubated at 37 ° C for 80 min with 3 LD 50 of the total venom to be evaluated (see Tables 17 to 20). For practical purposes only the results obtained with single horse serum are shown, however, essentially the same type of results were obtained with the other two horses tested.
  • the 4 mice in the control group injected with 3 DL 50 of venom died, in contrast the group of four mice injected with the mixture of this poison and with 100 ⁇ of horse serum 43 (Table 17) all survived, and 3 DL 50 of A.
  • mice were evaluated, with 4 mice each, and the four were injected, respectively, with 1.5 DL 50 and 3 DL 50 of total venom! of L quinquestriatus hebraeus, in both groups all mice died.
  • each antigenic group is included here: the AaHI toxin of the scorpion Androctonus australis (belonging to the antigenic group 1), AaHH toxin of the scorpion Androctonus australis (belonging to the antigenic group 2), the toxin Bot1 of the scorpion Buthus occitanus tunetanus (belonging to the antigenic group 3) and the LqhlV toxin of the scorpion Leiurus quinquestriatus hebraeus (belonging to the antigenic group 4).
  • Said immunogenic combination may be accompanied by at least one pharmaceutically acceptable excipient to form a pharmaceutical composition useful as an immunogen that allows inducing the generation of antivenoms against various species of scorpion.
  • Each of the expression vectors containing the toxin coding gene was electroporated at £. with strain BL21 (DE3) in the same manner as described for the first group of antigens.
  • the expression process was initiated by growing a pre-circle in LB medium with ampiciiin. After growing the culture to an OD between 0.7-1, determined at 600 nm, expression was induced with IPTG (Isopropyl pD ⁇ 1 ⁇ thiogalactopyranoside) for 6 at 12 h at 30 ° C.
  • the culture was centrifuged at 5,000 x g for 10 min at 4 ° C in 250 m centrifuge tubes !, in order to obtain all the cell precipitate. Cells were frozen -20 ° C, until use.
  • a bacterial periplasmic extract containing the expressed fusion protein was obtained, in the same manner described above. This extract was used for protein purification using affinity columns.
  • the expressed fusion proteins were purified by affinity chromatography and HPLC, as described for the previous group.
  • the proteins were eluted with 400 mM imidazole in 1X PBS (see example in Figure 15 (A) III).
  • the peptides obtained were separated on a C18 column (25mm x 4.1mm) with a gradient of 20 to 80% of solvent B over a period of 40 min and were manually collected by absorbance monitoring at 230 nm ( Figures 17A-17D).
  • the proteins were separated by electrophoresis in a discontinuous polyacrylamide gel under denaturing conditions (SDS-PAGE), by the method also described above See Figure 15A as an example.
  • the Cssii toxin was purified according to the methodology reported in Martin et al., 1987.
  • groups of 10 mice of strain CD1 of 17 g on average were immunized initially (see immunization schedules 1, 2 and 3 following).
  • the immunogens used were the fusion proteins r (toxin) H ⁇ s (SEQ ID No. 25 - SEQ ID No. 28).
  • the toxins were injected subcutaneously.
  • the emulsion was prepared with the toxin dissolved in PBS IX with Freund's complete adjuvant (mineral oil and dead mycobacteria) at the first immunization, and incomplete (mineral oil) or alumina at the following immunizations.
  • Immunization was performed by injecting the toxin in 100 ⁇ of solution per mouse on each occasion, with a period of approximately 10 days between immunizations. The generation and increase of serum antibodies against total venom and native toxins were checked by ELISA assays (see example in Figure 19). After the last immunization neutralization tests were performed on mice using 1 to 3 DL 50 . See Tables 21 to 25.
  • the immunization scheme 1 that was carried out using 2 groups of 8 mice of strain CD1 is described below.
  • One of the groups was immunized with the recombinant Cn2 toxin fusion protein from Centruroides noxius, and another group with the recombinant CII1 toxin fusion protein from C. linipidus ümpidus.
  • the 15 ⁇ ig injected. correspond to the amount of Cn2 toxin present in the fusion protein:
  • IIC1 1 DLso of 0111 1.73 ⁇ of CII1 toxin per 20 g of mouse (determined in Balb / C strain mice, by Dr. Georgina Curróla, IBT-UNAM)
  • both the fusion protein with the recombinant Cn2 toxin, and the fusion protein with the recombinant CII1 toxin function as excellent immunogens since they have the ability to induce immunized mice the production of neutralizing antibodies of the respective native toxins Cn2 or CII1 (isolated directly from the venom of C. noxius or C. Hmpidus iimpidus, respectively).
  • the serum of mice immunized with the Cn2 toxin fusion protein it has the ability to neutralize 2 and 3 DL 50 of native Cn2 toxin (Table 21) and the mice to which the mixture was injected. Native Cn2 toxin and serum of immunized mice showed no symptoms of intoxication.
  • mice immunized with the fusion protein of toxin CII1 it has the ability to neutralize 2 DL S or native toxin OH (Table 22) and the mice to which the mixture of native CI11 toxin is injected and the serum of the immunized mice also did not show symptoms of intoxication.
  • mice of the CD1 strain were immunized. It started by injecting 5 ⁇ 9 of rCn2His hybrid until reaching 25 ⁇ 9 at the last inoculation, in a final volume of 100 ⁇ of solution. In order to evaluate the effectiveness of the antibodies generated by the immunized mice, they were challenged directly (by injection) with total C. noxius venom. For the challenge, a control group of 3 mice was used (to which only total C.
  • mice immunized and challenged with the total C. noxius venom that survived were bled 48 hours after the challenge to determine the antibody titers present in the serum obtained. Immunization resulted in the generation of antibodies that specifically recognize the recombinant toxin Cn2 and total venom.
  • mice were immunized with the Cssll toxin fusion protein, in order to assess the neutralizing ability of the serum generated against the total venom of C. suf ⁇ usus suffusus. In both cases the following immunization schedule (3) was followed:
  • DL 5Ü was previously determined for the venom used in this test: 1 LD 50 per 20 g mouse weight, Intraperitoneal route. 5 b
  • mice immunized with the corresponding total venom In the case of the challenge with the total C venom, Iimpidus iimpidus, a control group of 6 mice was used in which 1 DLso of C. Iimpidus Iimpidus venom was injected and a second group consisting of 8 of the mice immunized with The mixture of the hybrids of the toxins Cl! 1 and CII2, to which 1 DL 50 of C poison, Iimpidus iimpidus, was injected directly. Two of the six mice in the control group died but the remaining four mice had severe symptoms of intoxication for more than 24 hours (Table 24).
  • mice of the CD1 strain were immunized under the above immunization schedule: 6 immunizations were performed subcutaneously by injecting 30 ⁇ g of rCssilHis in each of them, in a final volume of 100 ⁇ of 1X PBS solution. Be they obtained two indentations throughout the immunizations to estimate and compare the antibodies that were generated by the mice. Once the immunization protocol was completed, the effectiveness of the antibodies generated was assessed by challenging the mice immunized with total venom.
  • mice A group of 3 mice of approximately 20 grams was used as a control. The mice were injected intraperitoneally with 3 DL 50 total Centruroides suffusus suffusus venom in a final volume of 200 ⁇ ! of 1X PBS. There was no survival of any (or that was expected as 3 DL 5 r> were used) of the control mice while of the challenged mice, 100% survived (Table 25). Immunized and surviving mice when challenged with C. suffusus suffusus venom were bled 48 hours after the challenge to determine the titer of antibodies generated and this was determined by ELISA using the rCn2 toxin and total venom. as antigens, the titer of the antibodies generated. The final titers of the serum mixture of the 10 mice were 11.011 against recombinant Cssll fusion toxin and 1.890 against total venom ( Figure 20).
  • External and internal oigonucleotides were also designed to assemble the DNA segments that code for each of the 3 toxins of the scorpion venom Tityus serrulatus: Ts1, Ts3 and TsNTXp of the scorpion Tityus serruiatus with preference use! of codons of Escherichia cois. See figures 21 and 22. These oigonucleotides were synthesized by chemical synthesis. See Figures 23A-23C.
  • Each of the expression vectors containing the gene encoding the toxin was ethereal in E. coli strain BL21 (DE3) also in the same manner as that already described for the above antigens.
  • a bacterial periplasmic extract was obtained containing the fusion protein under the control of the T7 promoter. This extract was used for protein purification using affinity columns. See example in figure 25,
  • the expressed fusion proteins were purified by affinity chromatography and HPLC, as described for the previous group.
  • the proteins were eluted with 400 mM imidazoi in 1 X PBS (see example in Figure 25 (A) III).
  • the peptides obtained were separated on a C18 column (25mm x 4.1mm) with a gradient of 20 to 80% of solvent B over a period of 40 min and were manually collected by absorbance monitoring at 230 nm ( Figures 26A-28C).
  • the proteins were separated by electrophoresis in a discontinuous polyacrylamide gel under denaturing conditions (SDS-PAGE), by the method also described above See Figure 25A as an example.
  • Tityus fusion proteins Digestions of Tityus fusion proteins were made with the protease enterokinase (EK), their molecular masses were also obtained by MALDI-TOF or ESI-.ION-TRAP as already described. ELISA assays were also performed in a manner similar to that described and the results are shown in Figure 27.
  • EK protease enterokinase
  • the toxic activity of each recombinant T. serruiatus antigen was evaluated in CD1 strain mice, which were injected intraperitoneally ten times the LD 50 dose reported for each toxin. The result was that at that concentration the protein does not exert any toxic effect on the mouse, because the toxin has fused to the thioredoxin at its N ⁇ terminus end, affects its activity on the sodium channels probably due to spherical impediment .
  • the fact that the toxin co or fusion protein is not toxic is one of the main advantages when using it as an antigen, since when immunizing animals there is no danger that the animal subject to the immunization process will suffer the toxic effect of the recombinant, thus allowing to immunize them with high doses of the antigen.
  • mice of the 17 g CD1 strain on average were first immunized (see Immunization Scheme 1).
  • the immunogen used was the Tsi fusion protein (SEQ ID No1a). Immunogen injection was performed subcutaneously. The emulsion was prepared with the toxin dissolved in 1X PBS with Freund's complete adjuvant at the first immunization, and incomplete (mineral oil) or alumina at the following immunizations. Immunization was performed by injecting the toxin in 100 ⁇ of solution per mouse on each occasion, with a period of approximately 10 days between immunizations. The generation and increase of serum antibodies against total venom and native toxins was checked by ELISA assays. Immunization scheme 1: Immunization of CD1 strain mice with the Ts1 fusion protein of Tityus serrulatus.
  • the 3 rabbits (numbers 33, 34 and 38) were immunized, as mentioned above, with the mixture of recombinant toxins Ts1, Ts3 and TsNTxP from the Scorpion Tityus serrulatus (see immunization scheme 2), In the case of rabbit 33, they performed only 6 immunizations with the mixture of the recombinant toxins and the rabbits 34 and 38 also received 3 additional immunizations with Tityus serru! atus venom (see immunization scheme 3). Immunizations were applied with an approximate period of 10 days between them. Immunization scheme 2: Immunization of rabbits 33, 34 and 36, with the mixture of the recombinant toxin hybrids Ts1, Ts3 and TsNTxP of the scorpion Tityus serrulatus.
  • Immunization scheme 3 poison reinforcements for rabbits 34 and 38.
  • Table 27 Tityus serruiatus venom neutralization assays using the serum of rabbits immunized with the mixture of the recombinant toxin hybrids Ts1, Ts3 and TsNTxP.
  • Rabbit serum 36 was the best in terms of neutralizing capacity, since both 2 DL 50 and 3 DL S0 of Tityus serruiatus total venom could be neutralized.
  • This result indicates that the mixture of the recombinant hybrids of the toxins Ts1, Ts3 and TsNTxP induces a good immune response, which is increased by applying tota venom! in the last immunization boosters. It is important to note that only two immunizations with total venom would not be sufficient to achieve the antibody titres found with the use of mixtures of the fusion proteins. It is evident that the fusion toxins described enrich the immune response.
  • the nucleotide sequence of the gene encoding the Tsl peptide of the scorpion Tityus serrula ⁇ us with preferential use of E. coit codons and its translation into amino acids is as follows:
  • ctg atg gat cat gaa tgc aaa ctg age tgc ttt att ttt ctt ccg ata gac tac cta gta ctt ccg acg ttt gac teg acg aaa taa
  • the nucleotide sequence of the gene coding for the TsNTxP, the scorpion Tityus serrulatus with preferential use of E. coü codons and its translation into amino acids is as follows:
  • tgc tac ggt ctg ceg gac tet aga cea atg acg cgc acc ggc cgc acg atg acg atg cea gac ggc ctg aga
  • the vector used for its expression was the vector pGE-30 (QIAGEN) and the bacterial strain: Escherichia coli Origami.
  • a construction scheme of the expression vector is shown in Figure 28.
  • pQE30 recursive PCR was performed. The assembly of each gene was performed using Vent DNA Polymerase (New England Biolabs, USA), following the supplier's instructions.
  • the two external oligonucleotides were used at a final concentration of 0.2 pmol / ⁇ and the internal oligonucleotides at a concentration of 0.02 pmoi / ⁇ .
  • the PCR conditions were: 5 min at 94 t!
  • the PCR products were separated on a 1% agarose gel and purified with the ki ⁇ QIAQuick gel extract ⁇ on ki ⁇ (QIAGEN, USA).
  • the enzyme T4 DNA ligase (Fermentas, Canada) was used to clone the PCR products into the pQE30 vector (previously digested with the Ba Hl and Pst enzymes; New England BioLabs, USA), with the ligation product it is transformed to DH5a electrocompetent cells and subsequently are plated in Petri dishes with 2xYT medium added with ampiciiin (200 pg / ml).
  • the resulting clones are verified by PCR with the oligonucleotides pQE30Forw (5 !
  • the constructs were sequenced to verify that the cloned sequence encoding each toxin is in the correct reading frame.
  • the nucleotide and amino acid sequences corresponding to each of the recombinant toxins cloned in the expression vector pQE30 are shown below.
  • strain E. coii Origami was used, transformed by heat shock.
  • the expression of the recombinants was induced with PTG at a final concentration of 0.5 mM and growth was maintained for an additional 6 to 8 h at 30 ° C with stirring at 120 rprn. Subsequently, it was centrifuged at 6,500 x g for 5 min at 4 ° C in 250 ml centrifuge bottles.
  • the cell packet was washed with 200 ml of a 50 mM Tris solution, pH 8 and centrifuged again at 8,500 x g for 5 min at 4 ° C. The supernatant was discarded and the cells were resuspended in 25 ml of the same solution added with 0.3 mg lysozyme / ml. The cells were broken using 3 cycles of 8-minute sonication with pulses of 40 s and 20 s of rest allowing 10 minutes between each cycle, the samples were kept on ice throughout the process. The extract was centrifuged at 8,000 x g for 20 min, and the supernatant (soluble fraction) was removed.
  • the cell pellet was washed with 20 ml of 20 mM Tris pH 8, centrifuged at 8000 x g for 15 min, the supernatant was removed and two more washes were performed.
  • the resulting tablet was treated with 15 ml of a 50 mM Tris denaturing solution, 6 M guanidine chloride at pH 8 and gentle agitation, to extract the insoluble protein that clusters as inclusion bodies. Finally the preparation was centrifuged at 8,000 x g at 4 ° C for 1h.
  • the protein of interest is obtained in both insoluble and soluble form, by which the protein of both fractions is purified.
  • Nickel affinity protocol QIAexpress® System, QUIAGEN
  • the methodology was as follows: 1. Prepare a mini column containing 1.5 ml of Nickel-NTA Agarose resin (Qiagen).
  • E ul ia recombinant protein with 5 volumes of 300 mM buffer of imidazoi in 50 mM Tris-HCI pH 8.0.
  • fusion protein -6His ⁇ EK-TsNTxP After its affinity purification and the striking test, its purification was also performed by reverse phase high pressure liquid chromatography (RP-HPLC) in a similar way as described above for M-8His ⁇ Fxa-Ts1.
  • RP-HPLC reverse phase high pressure liquid chromatography
  • Serum ELISA assays of immunized rabbit rabbits were performed against recombinant toxins and against Tityus s & rru! Atus total venom.
  • the antibody (the different serum dilutions of the respective immunized rabbit) + 1X PBS (100 ⁇ ! Per well) was added. They were incubated for 1 h at 37 ° C and washed 3 times with 1X PBS + Tween (0.1%).
  • Anti-rabbit antibody coupled to peroxidase + 1X 1 2000 PBS (100 ⁇ per well) was added. It was incubated for 1 h at 37 C and washed 3 times with 1X PBS + Tween (0.1%).
  • the developing solution was prepared with 11 ml of 0.1 N Na phosphate buffer pH 5.0, 4.4 mg Ortho-phenylenediamine and 4.4 ⁇ H H 2 0 2 and 100 ⁇ of the solution was added to each well.
  • the ELISA piaca was covered with aluminum for 3 to 10 min at room temperature, until a coloration was observed. 10 ⁇ of HCf 6N S was added to stop the reaction. The absorbance at 490 nm was measured in the ELISA reader.
  • the recombinant.es antigens are able to give priority to the immune response, which is confirmed by using the final serum after the two reinforcements given with the total poison of Tityus serrulatus, which is capable of neutralizing the 3 DL 5 or, as see in table 7, where all mice treated with rabbit serum 72 survive.
  • Tityus serrulatus which is capable of neutralizing the 3 DL 5 or, as see in table 7, where all mice treated with rabbit serum 72 survive.
  • the production of antivenoms at the industrial level based on, for example, obtaining serum using horses, there is the option to select the best responding specimens, and despite such variability in the responses, with the use of recombinant toxins. , reason for this invention, the conclusion is clear: its use is recommended to enhance the immune response and they represent an advantage for the production of high-quality antigens, as has been argued in the description.
  • compositions comprising the proteins of the invention, alone or in possible combinations thereof, such as the active component, can come in a lyophilized state and before inoculation, they must be reconstituted in a solvent that is a pharmaceutically acceptable carrier, the latter remaining as the inactive component and / or as a second adjuvant component of the immune response of the pharmaceutical composition.
  • a solvent that is a pharmaceutically acceptable carrier
  • the latter remaining as the inactive component and / or as a second adjuvant component of the immune response of the pharmaceutical composition.
  • the antigens may contain: at least one Siofilization protector such as: sucrose, Ficoll 70, polyvinylpyrrolidone; At least one agent to gain volume, for example Manito!
  • the solvent can be, for example, isotonic saline solution (such as NaCl).
  • a suitable equine immunization pian can be managed to obtain a serum with antibody titre (hyperimmune), the equines must be young mixed race adults, be in good condition. health and receive a balanced diet with vitamin and mineral reinforcements, negative for equine infectious anemia and piroplasmosis and dewormed with afbendazo ⁇ -praziquante !. They must be maintained according to strict ethical conditions in accordance with the "International Animal Welfare Recommendations" and the "Committee Members, International Society on Toxinology”.
  • the horses can be inoculated with the antigenic composition of the invention, following an immunization scheme defined by personnel skilled in the technical area, using or not adjuvants that confirm the presentation of the antigens, for example: Freund's Compound adjuvant or Adjuvant of Freund Incomplete, can optionally be handled as an aluminum phosphate adjuvant or other aluminum salts.
  • adjuvants for example: Freund's Compound adjuvant or Adjuvant of Freund Incomplete
  • antigen delivery vehicles of the invention which are known in the state of the art, for example: amphiphilic micelles, carbon nanotubes, nanoparticles or polymer microspheres such as poly (D, L -Lactide-co-glycolide) (PLG) and polylactide (PLA), among others.
  • TsNTxp an immunogenic protein from Tifyus serruiatus scorpion venom, Toxicon. 37 (3): 507-517.
  • Fab fragments of the monoclonal anfibody BCF2 are capable of neutralizing the whole soluble venom from the scorpion Centruroides noxius Hoffmann. Toxicon 34 (8): 843-7.
  • T.M. Dias, F., Horta, C.C., Pena, I.F., Arantes, E.C., Ka ⁇ apothakis, E. 2008. Effective Tityus serrulatus an ⁇ i-venom produced using the Ts1 compose! Toxicon 52 (7): 787-93.

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Abstract

La presente invención se refiere a una mezcla específica de proteínas híbridas formadas con toxinas seleccionadas del veneno de alacranes de distintas partes del mundo y la proteína tiorredoxina, las cuales se expresan heterólogamente, por ingeniería genética, como proteínas híbridas, y son capaces de funcionar como antígenos (inmunógenos) eficientes en la producción de anticuerpos en mamíferos, que a su vez neutralizan el veneno completo de las especies de alacranes de los cuales se obtuvo la información genética de las toxinas, así como a una composición farmacéutica que contiene dicha mezcla o combinación para usarse como antiveneno de alacrán.

Description

COMPOSICIÓN FARMACÉUTICA DE PROTEINAS HÍBRIDAS RECOWtBINA TES CAPACES DE GENERAR ANTICUERPOS NEUTRALIZANTES EN CONTRA DEL
VENENO DE ALACRANES CAMPO TÉCNICO
La presente invención se refiere al diseño de proteínas recombinantes formadas con toxinas seleccionadas dei veneno de alacranes de varias partes del mundo (géneros Androcíonus, Buthacus, Buthus, Leiurus, Parabuthus, Ceniruroides, Tityus) las cuales se expresan tfeterólogamente, por ingeniería genética, con plegamiento adecuado, como proteínas híbridas, capaces de funcionar como antígenos (inmunógenos) eficientes en la producción de anticuerpos en mamíferos, funcionan así de manera individual o bien en determinadas mezclas de !as mismas quedando como composiciones adecuadas para inmunización y generación de anticuerpos con capacidad neutralizante del veneno completo de las especies de alacranes de los cuales se obtuvo la información genética de las toxinas.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
El conocimiento generado en los laboratorios de investigación de la ÜNA , primeramente en el instituto de Investigación en Fisiología Celular, después en el Instituto de Investigaciones Biomédieas ha permitido identificar los componentes tóxicos del veneno de alacranes de muchas partes del mundo (Possani y col., 1999). El uso de los péptidos tóxicos para la generación de antivenenos capaces de neutralizar el efecto dañino de estas proteínas del veneno, posibilitó el diseño de una estrategia tecnológica capaz de producir dichos antivenenos de una manera más racional y efectiva, objeto de esta invención.
De este modo se describe la síntesis de los genes que codifican para las toxinas rnayoritarias del veneno de alacranes peligrosos al humano, se traía de especies comunes de diversas regiones del planeta. Estos genes se incorporaron a vectores moleculares capaces de expresar en bacterias (Escheríchia cois) las proteínas de forma recombinante, como un producto híbrido no tóxico. Estos fueron utilizados en modelos animales (ratones y/o conejos y/o caballos) demostrando que son capaces de generar anticuerpos protectores.
Estudios previos han demostrado que las neurotoxinas de arácnidos son inmunogénícas y que los anticuerpos generados contra éstas, no solo son capaces de neutralizar a la toxina misma, sino al veneno total de la especie correspondiente (Calderon-Aranda y col., 1993). También se han reportado casos de anticuerpos que son generados contra un componente no tóxico, natural o sintético, y que también neutralizan al veneno total de la especie correspondiente. Así, se ha observado que la generación de anticuerpos contra un solo componente de un veneno, puede ser una alternativa eficaz para la producción de anti- venenos. Para definir a! componente dei veneno que una vez aislado es e¡ adecuado para generar la respuesta neutralizante deseada se requiere de un vasto conocimiento en el campo y diversas pruebas y diseños experimentales muy minuciosos, para concluir de manera exitosa. Ejemplos de componentes de venenos que pueden generar anticuerpos neutralizantes de los venenos son: ¡a anatoxina AmmVIH del alacrán Anciroctonus auretanicus mauretanicus (Norte de África) (Martin-Eauclaire et ai., 2006), la neurotoxína Ts1 (TsVSI o TSY) del alacrán Tityus serrulatus (Mendes et ai., 2008), Sa enzima S D-Lb1C de ia araña violinista Loxoceies boneti (Olvera et al., 2008), la neurotoxina Cn2 del alacrán Centruroides noxius (Licea et al., 1998), entre otros.
El desarrollo de la terapia con anticuerpos ha evolucionado rápidamente en los últimos veinte años, especialmente con las inmunogíobuiinas como proteínas modulares (Espino-Soíis et al., 2009), lo que ha ¡levado a un mayor número de estudios en ios que se pretende evaluar las propiedades inmunológicas de las neurotoxinas. Hasta ahora los resultados esenciales de ios estudios inmunológicos para toxinas de alacranes son la identificación, purificación, caracterización estructural y farmacológica de toxinas individuales y de familias de toxinas, obtención de suero y anticuerpos neutralizantes, localización y descripción estructural de los determinantes antigénicos, epftopes relativos a sitios tóxicos, y ensayos de neutralización y capacidad de protección de ¡os anticuerpos generados para las toxinas y para venenos totales. Actualmente la producción de anti-venenos se realiza inmunizando caballos con ei veneno total de los alacranes de interés, siendo que unas pocas toxinas presentes en los venenos son las que en verdad son tóxicas para ¡os humanos u otros mamíferos (Zamudio et al., 1992; Calderon-Aranda et al., 1993; Olvera et al., 2006; Hernández-Salgado et al., 2009). Debido a esto, una de ¡as desventajas de los actuales anti-venenos es la gran cantidad de proteína no-específica que contienen. Estos anticuerpos no específicos pueden ser los responsables de efectos secundarios en los pacientes bajo tratamiento, especialmente en menores de edad. La producción de Faboterápicos (i.e. F(ab')2, producto de la eliminación del fragmento crisfalizable por digestión de la inmunoglobulina con ia enzima Pepsina), representa un avance para mejorar la calidad de los anti-venenos (Ismaii, 2003); sin embargo, estos aún podrían mejorarse al disminuir aquellos anticuerpos generados contra fracciones del veneno que no estén involucradas en la toxicidad ai humano, de esta manera se aumentaría la espeGificidad del anti-veneno. Las proteínas antigénicas híbridas, en las cuales se sustituye parte de la proteína cuyo reconocimiento por anticuerpos es irrelevante para neutralizar sus efectos tóxicos, y solo permanece Sa parte antigénica relevante (determinantes antigénicos) para generar anticuerpos neutralizantes, también representan una ventaja en el desarrollo de anti-venenos. Existen conocimientos para la producción de antígenos recombínantes para la producción de anti-venenos en contra de la picadura de alacrán (García-Gómez et al, 2008; Corona et al., 2008; Corzo-Burgueíe et al., 201 1 ). De esta manera, un objetivo principal de esta invención es obtener mezclas definidas de neurotoxinas recombínantes que al ser usadas como inmunógenos en caballos permita ¡a generación de anticuerpos altamente específicos contra los principales componentes tóxicos de un determinado veneno y neutralizar los efectos tóxicos producidos por la picadura de dicha especie o dichas especies de alacrán y su aplicación en una composición farmacéutica para su uso como antiveneno. En la presente se describen la selección de las clonas, la construcción de los vectores moleculares, la expresión de los genes híbridos, la composición farmacéutica usada de las proteínas híbridas y su uso en animales experimentales, quedando demostrado que son eficientes para ia generación de anticuerpos neutralizantes en contra del veneno de los alacranes estudiados.
Las especies de alacrán de los géneros Androclonus, Buthus, Leiurus y Parabuthus son de las mas peligrosas en las regiones del Norte de África, Sahel Africano, Este y Sur de África, Cercano y Medio Oriente. Se estima que en estas regiones el número de picaduras de alacrán es de cerca de 637,000 picaduras al año, lo cual provoca aproximadamente 2421 muertes (Chippaux and Goyffon, 2008). Algunas de las toxinas recombínantes indicadas en este desarrollo provienen precisamente de venenos de alacranes de estos géneros y además son las toxinas mas potentes de sus respectivos venenos, éstas fueron seleccionadas, una por una, en base a ¡os reportes existentes respecto a ellas en cuanto a toxicidad y porcentaje que representan dentro de su respectivo veneno.
Datos epidemiológicos publicados por la Dirección Adjunta de Epidemiología de la Secretaría de Salud de México indican que en los últimos 10 años ha ocurrido un número registrado de accidentes por picadura de alacrán que rebasa anualmente un cuarto de millón de personas. Específicamente, para 2005 se reportaron 247,976 casos y para los años subsecuentes los datos fueron (se enlistan los años y el número de personas picadas) 2006: 282,598; 2007: 271 ,440; 2008: 271 ,976; 2009: 287,666; 2012: 280,160; 201 1 : 296,392; 2012: 313,559. Las áreas geográficas más afectadas correponden a los Estados de Jalisco, Guerrero, orelos y Michoacán. Los alacranes de importancia médica más importantes, según reportan Chippaux y Goyffon {Chippaux y Goyffon, 2008) son: C. etegans, C. ¡nfamatus, C. iimpldus limpidus, C. noxius, C. suffusus suffusus, C. tecomanus y C. sculpturatus. Como puede observarse estas especies de alacranes pertenecen todos al género Centruroides. Algunas de las toxinas recombínantes de este desarrollo son precisamente de venenos de alacranes de este género y ademas son las toxinas mas potentes de sus respectivos venenos. Estas toxinas fueron seleccionadas una por una en base a ¡os reportes existentes acerca de ellas en cuanto a toxicidad y porcentaje que representan dentro de su respectivo veneno.
En Sudamérica, y especialmente en Brasil, las picaduras de especies de alacranes del género Tityus representan un grave problema de Salud. Datos provistos por el sistema de información del Ministerio de Salud de Brasil (SINAN, Sistema Nacíona! de Informacao de Agravos de Notificacáo), muestran que de enero del 2007 a diciembre del 2011 , se presentaron 235, 892 casos de picaduras de alacrán tan solo en Brasil y 414 muertes debido a ésto. El género Tityus contiene el número más grande de especies peligrosas de alacrán en Sudamé ica. En Brasil, tres especies de este género: Tityus serrulatus (alacrán amarillo), Tityus bahiensís (Alacrán café) y Tityus stigmurus son los principales responsables de escorpionismo en humanos (Bucaretchi et al., 1995; Eickstedt et al., 1996). Tityus serrulatus es el alacrán Brasileño que causa los accidentes mas serios con una tasa de mortalidad de aproximadamente 1 % entre niños y ancianos. Esta especie está ampliamente distribuida en todo el País, abarcando los estados de Sao Paulo, Minas Gerais, Bahia, Espirito Santo, Goiás, Paraná y Rio de Janeiro (Ministério da Saúde, 2001 ).
El componente tóxico mayoritario del veneno de T. serrulatus es la neurotoxina Ts1 , también conocida como Ts-n (Martin-Eauciaire et. al., 1992.), pero también existen otros componentes tóxicos, tales como la toxina Ts2 y la toxina Ts3 (Martin-Eauciaire et al., 1994, Becerril et al., 1997.), las cuales comparten una identidad con la toxina Ts1 del 72% y 38%, respectivamente. La toxina Ts3 se une a otros sitios en el canal de sodio en comparación a la Ts1 y Ts2, así como a diferentes paráfopos de anticuerpos que las reconocen, epítopes. Debido a esto, anticuerpos producidos solamente contra la toxina Ts1 no son capaces de neutralizar al veneno completo. Por otra parte, del veneno de Tityus serrulatus, se ha aislado un péptido no tóxico, llamado TsNTxP (Guatimosim et al., 1999), que comparte una identidad de secuencia con la toxina Ts1 deí 65 %, con la toxina Ts2 del 59 % y con la toxina Ts3 del 43%. El uso del péptido TsNTxP como inmunogeno genera anticuerpos policlonales que tienen una reactividad cruzada contra varias toxinas del veneno, mostrando una capacidad neutralizante tanto en ensayos in vivo como in vitro. El suero generado es capaz de neutralizar 1.75 DL 0o del veneno del alacrán T. serrulatus (Guerra-Duarte et al., 2010). Debido a ésto, el péptido TsNTxP es considerado como una anatoxina natural importante en la seroterapia anti-Tityus.
Debido a los fundamentos anteriores algunas de las toxinas recombinantes incluidas en la presente invención son precisamente Ts1 , Ts3 y TsNTxP de Tityus serrulatus. DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1A. Generación de! gen que codifica para la toxina AaH!, del alacrán Androctonus austraiis Héctor con uso preferencia! de codones de £. coii. A) Secuencia nucieotídica de los seis oiigonucleótidos diseñados con uso preferencia! de codones de E, coii y sintetizados para el ensamble del gen de ia toxina AaH!. Los cuatro primeros Rev1 -AaHI, Dir2«AaHI, Rev2-AaHI y Dir3-AaH! son ¡os oiigonucleótidos internos y Dir1 -BEK-AaHi y Rev3-Xhol-AaH¡ son los dos oiigonucleótidos extemos. Nucleótidos subrayados corresponden a las secuencias de los sitios de restricción y dei sitio de corte de la enterocinasa (itálicas).
Figura 1 B. Secuencia nucieotídica y de aminoácidos: Secuencia nucieotídica del gen que codifica para la toxina AaHIl.
Figura 1C. Secuencia nucieotídica y de aminoácidos: Secuencia nucieotídica dei gen que codifica para la toxina AmmV. Los oiigonucleótidos externos Amm5__Up1 y Amm5__Lw6 introducen los sitios de clonación BamH! y Xhol respectivamente.
Figura 1 D. Secuencia nucieotídica y de aminoácidos: Secuencia nucieotídica del gen que codifica para la toxina AmmVIII. Los oiigonucleótidos externos Amm8_Up1 y Amm8 _Lw8 introducen los sitios de clonación BamH! y Xhol, respectivamente.
Figura 1 E. Generación del gen que codifica para la toxina Boti, del alacrán Buthus occitanus tunetanus con uso preferencia! de codones de E. coii.
Figura 1 F. Secuencia nucieotídica y de aminoácidos: Secuencia nucieotídica del gen que codifica para la toxina Lqhll y su correspondiente traducción en aminoácidos. Los oiigonucleótidos externos introducen los sitios de restricción necesarios para la clonación del gen en e! vector de expresión pET22B.
Figura 1 G. Generación del gen que codifica para ia toxina LqhlV, del alacrán Leiurus quinquestriatus hebraeus con uso preferencia! de codones de E. coii. Secuencia nucieotídica de los seis oiigonucleótidos diseñados con uso preferencia! de codones de E, coii y sintetizados para e! ensamble de! gen de la toxina LqhlV.
Figura 1 H. Secuencia nucieotídica y de aminoácidos. Secuencia nucieotídica del gen que codifica para la toxina Pg8 y su correspondiente traducción en aminoácidos. Los oiigonucleótidos utilizados para el ensamble con uso preferencia! de codones de E, cois son aquellos reportados en e! artículo: Toxican 53 (2009) 770-778, El gen ensamblado fue utilizado como templado para clonarlo en el vector de expresión pET22b con los oligos externos señalados en la Figura 1 H.
Figura 1 !. Generación de! gen que codifica para la toxina Acra4, de! alacrán Androctonus crassicauda con uso preferencia! de codones de E. coii. Secuencia nucieotídica de los seis oiigonucleótidos diseñados con uso preferencia! de codones de E. coii y sintetizados para ei ensamble del gen de la toxina Acra4. Los oíigonucíeótldos REV1~Acra4, Dir2- Acra4, Rev2- Acra4 y Dir3- Acra4 son los oíigonucíeótldos Internos y Dlr1~BEK- Acra4 y Rev3-Xhol- Acra4 son los dos oíigonucíeótldos externos, Nuc eótidos subrayados corresponden a las secuencias de los sitios de restricción y en cursivas ¡os nucleótidos del sitio de corte de !a eníerocinasa.
Figura 1J. Generación del gen que codifica para la toxina Bul , del alacrán Buthacus acrocentrus con uso preferencia! de codones de £ coli. Secuencia nucleotídica de los seis oíigonucíeótldos diseñados con uso preferencial de codones de E. coli y sintetizados para el ensamble del gen de la toxina Bul . Los oíigonucíeótldos REV1-Bu1 , Dír2-Bu1 , Rev2-Bu1 y Dir3-Bii1 son los oíigonucíeótldos internos y Dir1-BEK-Bu1 y Rev3~Xho!~Bu1 son ios dos oilgonucleótidos externos. Nucleótidos subrayados corresponden a las secuencias de los sitios de restricción y en cursivas los nucleótidos del sitio de corte de ¡a enterocinasa.
Figura 2. Vector de Expresión pET22b~Thio y clonación del gen ensamblado de la toxina. AaHI. Se muestra un esquema del ensamble del gen de la toxina AaH! usando seis oilgonucleótidos y los sitios de restricción dentro del vector de expresión pET22b-Thio donde fue clonado el gen de la toxina AaHI (BamHI y Xhol). Puede visualizarse un esquema de la protefna de fusión que se expresa, ia cual contiene en el N-terminaí ¡a proteína Tiorredoxina seguida de un sitio de corte para enterocinasa, luego ¡a toxina AaHI y finalmente, en el C- terminal hay 8 histidinas que permiten purificar la proteína de fusión.
Figura 3. Electroforesis en gei de acriSamida de la protefna de fusión Tiorredox¡na-EK-AmmV- 8His. SDS-PAGE. La figura muestra un gel de acrilamida al 12%, en el cual se visualiza en el carril 1 : el marcador de peso molecular, en el carril 2: la proteina de fusión Tiorredoxina-EK- AmmV-8His y en el carril 3: la proteína de fusión Tiorredoxina-EK-AmmV-6His. Estas muestras son resultado de la elusión de la cromatografía de afinidad a NI-NTA agarosa. La flecha indica a la proteína de fusión.
Figura 4A: Purificación y repurificación de la proteína de fusión Tiorredoxina~EK~AaHI~6His por HPLC. Cromatograma de HPLC, en el cual ia flecha indica ia fracción y el tiempo de retención correspondiente a la proteína de fusión Tiorredoxina-EK-AaHI-6His,
Figura 4B: Purificación y repurificación de la proteina de fusión Tíorredoxina-EK-AaHíi-8His por HPLC. Cromatograma de HPLC, en el cual la flecha indica la fracción y el tiempo de retención correspondiente a la proteína de fusión Tíorredoxina~EK-AaHil-6His,
Figura 4C: Purificación y repurificación de la proteína de fusión Tiorredoxina-EK-AmmV-6Hís por HPLC. Cromatograma de HPLC, en el cual la flecha indica la fracción y el tiempo de retención correspondiente a la protefna de fusión Ttorredoxina~EK~AmmV-8His. Figura 4D: Purificación de la protefna de fusión Tíorredoxina-EK-AmmVII!-6His por HPLC. Cromatograma de HPLC, en el cual la flecha indica la fracción y el tiempo de retención correspondiente a la proieína de fusión Tiorredoxina~EK-AmmVII!~6His.
Figura 4E: Purificación y repurificación de la proieína de fusión Tiorredoxina-EK-Botl~6His por HPLC. Cromatograma de HPLC, en el cual la flecha indica la fracción y el tiempo de retención correspondiente a ¡a proteina de fusión Tiorredoxina-EK-Boíl-6His.
Figura 4F: Purificación de la proteína de fusión Tiorredoxina-EK-Lqhll-6His por HPLC. Cromatograma de HPLC. en el cual la flecha indica la fracción y el tiempo de retención correspondiente a la proteína de fusión Tiorredoxina-EK-Lqhll-8His.
Figura 4G: Purificación y repurificación de la proteína de fusión Tiorredoxína-EK-Lqh¡V-6His por HPLC. Cromatograma de HPLC, en el cual la flecha indica la fracción y el tiempo de retención correspondiente a ¡a proteína de fusión Tiorredoxina-EK-LqhlV-6His.
Figura 4H: Purificación y repurificación de la proteína de fusión Tiorredoxina-EK-Pg8-6His por HPLC. Cromatograma de HPLC, en el cual la flecha indica la fracción y el tiempo de retención correspondiente a la proteína de fusión Tiorredoxina-EK-Pg8-6His.
Figura 41. Purificación de ía protefna de fusión Thio-EK-Acra4-6His mediante HPLC. Se muestra el cromatograma de la purificación de la proteína de fusión Thio-EK-Acra4-6His mediante cromatografía de líquidos de alta presión por fase reversa (RP-HPLC). Para lo cual se empleó una columna analítica C18 (Vydac, U.S.A) y un gradiente de buffer A (Agua + 0.12% de TFA) a buffer B (Acetonitrilo + 0.1% de TFA) de 20- 65 % en 45 minutos. El tiempo de retención correspondiente a la proteína de fusión de Acra4 es el tiempo 30.2.
Figura J. Purificación de la proteína de fusión Thio-EK-Bu1-8His mediante HPLC. Se muestra e¡ cromatograma de la purificación de la proteína de fusión Thio-E -Bu1-6His mediante cromatografía de líquidos de alta presión por fase reversa (RP-HPLC). Para lo cual se empleó una columna analítica C18 (Vydac, U.S.A) y un gradiente de buffer A (Agua + 0.12% de TFA) a buffer B (Acetonitrilo + 0,1 % de TFA) de 20-85 % en 45 minutos. El tiempo de retención correspondiente a la proteína de fusión de Bul es el tiempo 29.4,
Figura 5. Título de anticuerpos de los conejos 05, 06 y 08 después de ser inmunizados por quinta vez con las toxinas recombinantes fusionadas a la Tiorredoxina.
Figura 8: Título de anticuerpos de los conejos 05, 06 y 08 contra el veneno de 5 diferentes especies del Norte de África después de la quinta inmunización.
Figura 7. Títuio de anticuerpos del conejo 05, contra el veneno de 4 diferentes especies de alacrán del Norte de África después de la segunda, tercera y cuarta sangría.
Figura 8: Título de anticuerpos del conejo 06, contra el veneno de 4 diferentes especies de alacrán del Norte de África después de la segunda, tercera y cuarta sangría. Figura 9. Título de anticuerpos de! conejo 08, contra el veneno de 4 diferentes especies del Norte de África después de ¡a segunda, tercera y cuarta sangría.
Figura 10. Fracciones de la columna de afinidad a Proteína A. Las fracciones de interés corresponden a! volumen de elución de 42 a 55 mi.
Figura 11 . Gráfica y tabla que ilustran el título de anticuerpos obtenido con el reconomiento de las toxinas recombinantes AaHI, AaHIl, AmmV, AmmVN, Lqhll, LqhlV, Bot!.
Figura 12. A. Gel SDS-PAGE a! 12% de ¡as proteínas de fusión recombinante. 1 ). Thio~E ~ AaHI (20,677 Da); 2). Thio-EK-AaHH (21 ,1 17 Da); 3). Thio-EK-AmmV (21 ,176.9 Da); 4). Thio- EK-ArnmVI! ( 21 ,292 Da), 5). Thio~EK~Lqh!l (21 ,150.9 Da), 6). Thío~EK~LqhlV (21 ,085.9 Da), 7). Thio-E -Bot! (21 ,133.8 Da), 8). Marcador de proteínas (Page Plus Ruler, Thermo scientific). B. Western Blot. Se sigue el mismo orden de las muestras del ge!.
Figura 13. Ensamble del gen que codifica para la toxina Cn2 del alacrán C. noxius con uso preferencia! de codones de E, coli. En !a parte superior se indica la secuencia nucleotidica del gen que codifica para la toxina Cn2 ensamblada con el uso preferencia! de codones para E. coli; dicha preferencia pudo ser corroborada a! utilizar el programa E, coli Codon Usage Analysis 2.0. (http://faculty.ucr.edu/~mrnaduro/codonusaqe/usaqe, htm). En la parte inferior se indica cada uno de los codones que codifican para los aminoácidos de la toxina Cn2, así como también la frecuencia con la cual E. coli utiliza ese codón.
Figura 14A. Generación del gen que codifica para la toxina Cn2, de! alacrán C. noxius con uso preferencia! de codones de £. coli, a y b) Secuencia nucleotidica de los seis oligonucleótidos diseñados con uso preferencia! de codones de E. coli y sintetizados para el ensamble del gen de la toxina Cn2. Los nucleótidos en negritas corresponden a las secuencias reconocidas por las enzimas de restricción y las que codifican al sitio de corte de la enzima enterocinasa. c) Secuencia nucleotidica del gen ensamblado de la toxina Cn2, con uso preferencia! de codones de E. coli y su traducción en aminoácidos. En la hebra codificante de! DNA se encuentra subrayada, en negro, la secuencia de los oligonucleótidos directos internos Cn2UpA y Cn2UpC y en la hebra complementaria de DNA se encuentran subrayados, en itálicas, los oligonucleótidos reversos infernos Cn2LwB y Cn2L D.
Figura 14B. Generación de! gen que codifica para la toxina CII1 , de! alacrán C. limpidus limpidus con uso preferencia! de codones de E. coli. a y b) Secuencia nucleotidica de los seis oligonucleótidos diseñados con uso preferencia! de codones de E. coli y sintetizados para el ensamble del gen de la toxina OH . Los cuatro primeros CIH UpA, Cüi LwB, CIH UpC, CIH LwD son los oligonucleótidos internos, B-EK-CII1 corr y Rev~Xhol-CI!1 son los dos oligonucleótidos externos. Los nucleótidos en negritas corresponden a las secuencias de ios sitios de restricción y del sitio de corte de la enterocinasa. c) Secuencia nucleotidica del gen ensamblado de la toxina CII1 , con uso preferencia! de codones de E. co/ y su traducción en aminoácidos. En la hebra codificante del DNA se encuentra subrayada la secuencia de los oligonucleótidos directos internos CÍH UpA y CIH UpC y en la hebra complementaria de DNA se encuentran subrayados los oligonucleótidos reversos internos GIH LwB y CIH LwD.
Figura 14C. Generación del gen que codifica para la toxina CII2, del alacrán C. ¡srnpidus ¡impidus con uso preferencia! de codones de E. coli. a y b) Secuencia nucleotídíca de ¡os seis oligonucleótidos diseñados con uso preferencia! de codones de E. cois y sintetizados para el ensambie del gen de la toxina CII2. Los cuatro primeros CI!2UpA, C!!2LwB, Cíl2UpC, CI!2LwD son los oligonucleótidos internos y B-EK-CII2 y Rev~Xhol~C!!2 son los dos oligonucleótidos externos. Nucleótidos en negritas corresponden a las secuencias de ios sitios de restricción y del sitio de corte de la enterocinasa. c) Secuencia nucleotídíca de! gen ensamblado de la toxina CII2, con uso preferencia! de codones de E. coli y su traducción en aminoácidos. En la hebra codificante del DNA se encuentra subrayada la secuencia de los oligonucleótidos directos internos C!l2UpA y CII2UpC y en la hebra complementaria de DNA se encuentran subrayados los oligonucleótidos reversos internos Ci!2LwB y CII2LwD,
Figura 14D. Generación del gen que codifica para la toxina Cssll, de! aiacrán C. suffusus suffusus con uso preferencia! de codones de £. coli. a) Secuencia nucleotídíca de los cuatro oligonucleótidos diseñados con uso preferencia! de codones de E. coli y sintetizados para el ensamble del gen de la toxina Cssll. b) Secuencia nucleotídíca del gen ensamblado de ia toxina Cssi!, con uso preferencia! de codones de E. coli y su traducción en aminoácidos. Se utilizo como DNA templado de ¡a secuencia nucleotídica de la toxina Cssll, la reportada en e! artículo: Estrada, et. al., 2007. Oügo Directo: introduce el sitio de Bamf-i! (negritas) y sitio de corte de enterocinasa en el a ino-terminal de la secuencia. Oligo Reverso: introduce el sitio de Xhol (negritas), en el carboxilo termina! de la secuencia.
Figura 15. Expresión y detección de la proteína de fusión de ia toxina Cn2 recombínante A) Electroforésis en gel de po!iacri!arnida, SDS-PAGE, a! 12%, en el cual se visualiza ia proteína de fusión presente en extractos peripiásmicos de diferentes cepas de bacteria, después de la inducccsón I: E.coíi cepa OrigamiDE3 II: E.coii cepa BI21 DE3 y !H: protefna de fusión de la toxina Cn2 purificada por columna de afinidad a Níquel. La flecha indica ¡a proteína de fusión expresada o purificada . B) Inmunodetección de la proteína de fusión de la toxina Cn2 recombínante, mediante un ensayo de ELISA, en e! cual se incluyo un control negativo (BSA) y un control positivo (toxina Cn2 nativa), para la inmunodetección se utilizó un anticuerpo recombínante Fab8009F especifico contra la toxina Cn2 (además solo reconoce a la Cn2 correctamente estructurada). C) Aminoácidos detectados mediante la metodología de degradación de Edman, se detectaron ios 10 primeros aminoácidos correspondientes ai N- termina! de la proteína de fusión).
Figura 18. Vector de Expresión pET22b~Thio y clonación del gen ensamblado de la toxina Cn2. Se muestra un esquema del ensamble del gen de la toxina Cn2 mediante seis olsgonucíeóiidos y los sitios de restricción dentro del vector de expresión pET22b-Thio, donde fue donado el gen de la toxina Cn2 (BamH! y Xhol). Puede visualizarse un esquema de la proteína de fusión que se expresa, ¡a cual contiene en el N-terminal ia proteína Tiorredoxina seguida de un sitio de corte para enterocinasa (E ), luego la toxina Cn2 y finalmente, en el C-terrninai hay 8 histidinas que permiten purificar a ia proteína de fusión.
Figura 17A: Purificación y repurifícación de la proteína de fusión Tiorredoxina-EK-Cn2-6His por HPLC. Cromatograma de HPLC, en e! cual la flecha indica la fracción y el tiempo de retención correspondiente a la proteína de fusión Tiorredoxina~E -Cn2-6His.
Figura 17B: Purificación y repurificación de la proteína de fusión Tiorredoxina-EK~CII1~6Hís por HPLC. Cromatograma de HPLC, en el cual la flecha indica la fracción y el tiempo de retención correspondiente a la proteína de fusión Tiorredoxina-EK-CIH -8His,
Figura 17C: Purificación y repurificación de la proteína de fusión Tsorredoxina-EK-CII2-6His por HPLC. Cromatograma de HPLC, en el cual la flecha indica la fracción y el tiempo de retención correspondiente a la proteína de fusión Tiorredoxina-EK-CII2-6His.
Figura 17D: Purificación y repurificación de la proteína de fusión Tiorredoxina-EK-Cssll~8His por HPLC. Cromatograma de HPLC, en el cuai la flecha indica la fracción y el tiempo de retención correspondiente a la proteína de fusión Tiorredoxina-EK-Cssll-8His.
Figura 18. Ensayo de reconocimiento de las toxinas nativas por los anticuerpos policlonaies obtenidos después del esquema de inmunización. Las toxinas nativas Cn2 y II1 fueron inmunoabsorbidas en placas de ELISA y posteriormente fueron reconocidas por anticuerpos policlonaies obtenidos de la inmunización de ratones con las respectivas toxinas recombinantes. Se indica ¡a dilución que se uso del suero y las determinaciones se hicieron por duplicado.
Figura 19. Títulos de sueros obtenidos de ratones inmunizados con la proteína de fusión Cn2 recombinante. La titulación deí suero de los ratones inmunizados se llevó a cabo utilizando como antígenos el veneno total de C. noxius y a la proteína recombinante Cn2. Se indica las curvas de absorbancia con respecto a la dilución del suero y los títulos obtenidos en cada caso.
Figura 20. Títulos de sueros obtenidos de ratones inmunizados con la proteína de fusión Cssil recombinante. La titulación del suero de los ratones inmunizados se llevó a cabo utilizando como antígenos el veneno total de Centruroides suffusus sulfusus y a ¡a proteína recombinante Cssll. Se indica las curvas de absorbancia con respecto a Sa dilución del suero y los títulos obtenidos en cada caso.
Figura 21. Análisis de la secuencia del gen que codifica para la toxina Ts1 , del alacrán Tityus serruiatus con el uso preferencia! de codones de E. coli. La entrada de la secuencia de DNA del gen al programa E. coli Codon Usage Analysis 2.1 genera un diagrama conformado por una barra horizontal para cada codón. El largo de la barra es proporcional a la frecuencia en la que se expresa cada codón. En la parte inferior de cada codón se indica e! aminoácido codificante.
Figura 22. Análisis de la secuencia de! gen que codifica para la toxina TsNTxP, del alacrán Tityus serruiatus con el uso preferencial de codones de E. coli. La entrada de la secuencia de DNA del gen al programa E. coli Codon Usage Anaiysis 2.1 genera un diagrama conformado por una barra horizontal para cada codón. El largo de la barra es proporcional a la frecuencia en la que se expresa cada codón. En ía parte inferior de cada codón se indica el aminoácido codificante.
Figura 23A. Generación del gen que codifica para la toxina Ts1 , del alacrán Tityus serruiatus con uso preferencia! de codones de £. coli. A) Secuencia nucieotídica de los seis oligonucleótidos diseñados con uso preferencial de codones de E. coli y sintetizados para el ensamble del gen de la toxina Ts1. Los cuatro primeros GamTserUpI , CamTserLw2, GamTserUpS y GamTserLw4, son los oligonucleótidos internos y Ts1__4TRXUp y Ts1__4TRXLw, son los dos oligonucleótidos externos. Los nucleótidos en negritas corresponden a las secuencias de los sitios de restricción y en itálicas el sitio de corte de la enterocinasa. B) Secuencia nucieotídica del gen ensamblado de la toxina Ts1 , con uso preferencia! de codones de E. coli . En la hebra codificante de! DNA se encuentra resaltada en itálicas ía secuencia de los oligonucleótidos directos GamTserUpI y GamTserUp3 y en la hebra complementaria de DNA se encuentran subrayados los oligonucleótidos reversos GamTserLw2 y GamTserLw4.
Figura 23B. Generación del gen que codifica para la toxina TsNTxP, del alacrán Tityus serruiatus con uso preferencial de codones de E coli A) Secuencia nucieotídica de los seis oligonucleótidos diseñados con uso preferencial de codones de E. coli y sintetizados para el ensamble del gen de la toxina TsNTxP. Los cuatro primeros son los oligonucleótidos internos y los dos últimos son oligonucleótidos externos. Nucleótidos en negritas corresponden a las secuencias de los sitios de restricción y del sitio de corte de la enterocinasa (itálicas). B) Secuencia nucieotídica del gen ensamblado de la toxina TsNTxP, con uso preferencial de codones de E. coli. Figura 23C, Generación del gen que codifica para la toxina Ts3, del alacrán Tityus serruiatus con uso preferencial de codones de E. coii. A) Secuencia nucleotídica de ios seis oligonucleótidos diseñados con uso preferencial de codones de E, coli y sintetizados para el ensamble del gen de la toxina Ts3. Los cuatro primeros son los oligonucleótidos internos y ¡os dos últimos son oligonucleótidos externos. Nucleótidos en negritas corresponden a las secuencias de ¡os sitios de restricción y del sitio de corte de la enterocinasa (itálicas). B) Secuencia nucleotídica del gen ensamblado de la toxina Ts3, con uso preferencia! de codones de E. coÍi,
Figura 24. Vector de expresión pET22b-Thio y clonación del gen ensamblado de la toxina Ts1. Se muestra un esquema del ensamble de la toxina Ts1 mediante seis oligonucleótidos y ¡os sitios de restricción dentro del vector de expresión pET22b-Thio donde fue clonado ei gen de la toxina Ts1 (BamHi y Xhol). Puede visualizarse un esquema de la proteína de fusión que se expresa, la cual contiene en el N-terminal la proteína Tiorredoxina seguida de un sitio de corte para enterocinasa. luego la toxina Ts1 y finalmente, en el C-terminai hay 6 histidinas que permiten purificar la proteina de fusión.
Figura 25. Expresión y purificación de la proteina de fusión Thio-EK-TsNTxP. A. Gel SDS- PAGE al 12%. 1 ). Extracto de la cepa de E. coli BL21 (DE3) antes de la inducción, 2). Extracto de la cepa de £. coli BL21 (DE3) después de las 6 horas de inducción con SPTG, 3). Extracto periplásmico con PPB, 4). Fracción de agua, 5). Elución de ía proteina de fusión de la columna de afinidad a Ni+2; 6). Proteina de fusión purificada por HPLC en una columna analítica C18 (Tiempo de retención de 34.9 min), 7). Marcador de peso molecular, B. Western Blc-t, 1 ). Marcador de peso molecular, 2). Extracto de la cepa de E. coli BL21 (DE3) antes de la inducción, 3). Extracto de la cepa de E. ooll BL21 (DE3) después de las 6 horas de inducción, 4). Fracción de PPB, 5). Fracción de agua, 6). Elución de la proteína de fusión por la columna de afinidad. 7). Proteína de fusión purificada por HPLC (Tiempo de retención de 34.9 min). La flecha indica ei lugar de migración de la proteína de fusión alrededor de los 20 kDa, tanto en el gel como en el Western blot Se emplearon anticuerpos anti-histidinas en el revelado del western blot.
Figura 26A: Purificación y re purificación de la proteína de fusión Tiorredoxina-EK-Ts1 -8His por HPLC. Cromatograma de HPLC, en el cual la flecha indica la fracción y el tiempo de retención correspondiente a ia proteína de fusión Tiorredoxina-EK~Ts1~8Hís.
Figura 26B. Purificación por HPLC de la protefna de fusión Thio~EK~TsNTxP-6His. A la fracción correspondiente al tiempo de retención de 34 minutos, se ie determinó la masa motecular a través de un espectrómetro de masas, obteniendo ¡a serie iónica esperada, la cual indica que ¡a masa experimental es la misma que ¡a teórica, la cual corresponde a 20,630 Da.
Figura 28C. Purificación por HPLC de la praíeína de fusión Thio~EK~Ts3-8His. A la fracción correspondiente a! tiempo de retención 34 minutos se le determinó la masa molecular a través de un espectrómetro de masas y resultó ser similar a la masa teórica, la cual corresponde a 21 ,323 Da.
Figura 27, Ensayo de reconocimiento de ¡as toxinas recombinantes (Mezcla de los híbridos de Ts1 , TsNTxP y Ts3) por ¡os anticuerpos poiiclonales obtenidos después del esquema de inmunización aplicado al conejo 34. Las toxinas recombinantes fueron inmunoabsorbidas en placas de ELISA y posteriormente fueron reconocidas por anticuerpos poiiclonales obtenidos de la 2a, 4a y 5a inmunización del conejo 34 con la mezcla de ¡os híbridos de Ts1 , TsNTxP y Ts3. Se indica la dilución que se uso del suero (3,000, 9,000, 27000 y 81000 corresponden a ¡as diluciones 1 :3000, 1 :9000, 1 :27000 y 1 :81000) y las determinaciones se hicieron por duplicado.
Figura 28. Vector de expresión pQE-30 y donación del gen ensamblado de la toxina Ts1 . Representación del ensamble de los 8 oligonucleótidos para construir el gen del péptido Ts1 , el cual esta flanqueado por los sitios de restricción BamHI y Pstl para ser clonado en e¡ vector de expresión pQE-30. De tal manera, que la construcción quedará conformada por la cuatro aminoácidos del vector (MRGS), seis residuos de histidina, seguidos por un sitio de corte para la proteasa FXa (IEGR) y finalmente la secuencia de la toxina Ts1 .
Figura 29. Expresión y purificación por afinidad de la proteína de fusión M~6His~FXa-Ts1. Gel SDS-PAGE al 15%. 1 ). Marcador de Peso Molecular, 2). Extracto de la cepa Origami de £. coü en el tiempo 0, 3). Extracto de ¡a cepa Origami de E, coíi antes de inducir, 4). Extracto de la cepa Origami de £. coü después de inducir, 5). Fracción soluble, 8). Fracción insolubie, 7 y 8). Elución de la proteína M~8His-FXa-Ts1 de la columna de afinidad. 9). Proteína de fusión purificada por HPLC (16 min, ver figura 2). La flecha indica el lugar de migración de la proteína de fusión alrededor de los 8.7 kDa.
Figura 30. Purificación y repurificación por HPLC de la proteína de fusión -8His~FXa~Ts1. En el cromatograma la flecha indica la fracción y el tiempo de retención correspondiente a la proteína de fusión.
Figura 31. Espectro de masas. Representa la abundancia relativa de los iones producidos con respecto a su relación masa/carga. La masa teórica para la proteína fusión -6His-FXa- Ts1 es de 8,742.98 Da.
Figura 32. Expresión y purificación por afinidad de la proteína de fusión M-6His-EK-Ts3. Gel SDS-PAGE al 15%. 1 ). Marcador de Peso Molecular, 2). Extracto de la cepa Origami de E. coli antes de inducir, 3). Extracto de ¡a cepa Origami de E. coli después de inducir, 4). Fracción soluble, 5). Fracción insoluble, 6). Elución de la proteína M-6His-FXa~Ts1 de la columna de afinidad a níquel, 7). Proteina de fusión purificada por HPLC (15.8 mín, ver figura 33). La flecha indica el lugar de migración de ia proteina de fusión airededor de los 9.4 kDa. Figura 33. Purificación por HPLC de la proteina de fusión M-6His-EK-Ts3. En el cromatograma se muestra que la proteína es eiut'da a los 15.8 min.
Figura 34. Espectro de masas. Representa !a abundancia relativa de los iones producidos con respecto a su relación masa/carga. La masa determinada experimentaímente es de 9,493.8 Da.
Figura 36. Expresión y purificación por afinidad de la proteína de fusión SVS-6His-EK-TsNTxP. Gel SDS-PAGE al 15%. 1 ). Extracto de la cepa Origami de E. coli antes de inducir, 2). Extracto de la cepa Origami de E. coli después de inducir, 3), Fracción soluble, 4). Fracción insoluble, 5). Elución de la proteína M-8His-FXa-Ts1 de la columna de afinidad. 6). Proteina de fusión purificada por HPLC (15 min, ver figura 38), 7). Marcador de Peso Molecular. La flecha indica el lugar de migración de la proteína de fusión alrededor de los 8.7 kDa.
Figura 36. Purificación por HPLC de la proteína de fusión M-6His-EK-TsNTxP. En el cromatograma se muestra que la proteina es elufda a los 15 min.
Figura 37, Espectro de masas. Representa la abundancia relativa de los iones producidos con respecto a su relación masa/carga. La serie iónica observada indica que ¡a masa teórica es de 8,742.23 Da.
Figura 38: Títulos de anticuerpos de los sueros de los conejos inmunizados con la mezcla de Sas proteínas fvl-SHis-Fxa-Hís, -6His-EK-Ts3, M-6His-EK-TsNTxP. El suero preinmune de los conejos 71 , 72y 73, así como el suero de la primera sangría se evaluaron contra el veneno de Tityus serrulatus.
Figura 39: Títuios de anticuerpos de los sueros obtenidos de la inmunización de conejos con la mezcla de las proteínas y-8His~Fxa-HÍ$, M-8His-EK-Ts3, M~6His-EK-TsNTxP. En la gráfica se muestra la titulación de anticuerpos de los sueros obtenidos en ¡a 2da y 7a sangría contra el veneno de Tityus serrulatus.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Como se puede constatar existe un problema de Salud Pública generalizado en varios países, causado por la picadura de alacranes que contienen toxinas que causan síntomas de intoxicación graves, que si no son tratados en tiempo adecuado pueden ocasionar la muerte de las personas picadas. El tratamiento de elección indicado en ia práctica clínica es la utilización de fragmentos de anticuerpos de caballos híper-inmunizados con ios venenos correspondientes, los cuales son fragmentos funcionales en su capacidad de neutralizar los Ί ^ síntomas de intoxicación de los pacientes. Estos fragmentos se denominan "faboterapicos", cuyo significado viene de la abreviación "Fab" de ¡a literatura inglesa "fragment of antigen binding", que en Español se traduce por "fragmento de pegado a antígeno". Esto es, son los segmentos de las inmunoglobuíinas, sinónimo de anticuerpos, que se pegan a ios antígenos, que son los componentes extraños a los organismos. Los antígenos son todas ¡as substancias extrañas a un organismo que no son aceptados por el sistema inrnunológico, el cual es capaz de sintetizar un anticuerpo que reconoce y se pega al antígeno, impidiendo que este cause daño al organismo en contacto con el antígeno no deseado. La práctica médica consiste en utilizar los "fragmentos de pegado a antígeno" de anticuerpos generados por caballos, los cuales se purifican de la sangre de los animales y se preparan para su uso terapéutico, quedando como el principio activo de los anfivenenos, de donde surge el término "faboterápico" utilizado ya de manera genérica en alguna de la literatura científica del campo. Entonces los faboterápicos, para el caso del piquete de alacranes, son fragmentos neutralizantes de ia acción de las toxinas del veneno de alacrán. Así mismo, existen distintos tipos de faboterápicos dependiendo del tipo de antígeno, en contra del cual queremos tener una inmunoglobulina (anticuerpo) que lo reconozca y neutralice su posible acción dañina al individuo en cuestión.
Para el caso específico de los faboterápicos anti-aíacrán estos se producen por medio de la inyección de mezclas de varios venenos, o de homogeneizados de las glándulas venenosas de alacranes de diferentes especies peligrosas a ios humanos, a caballos que se toman inmunes ai veneno. En México se usa una mezcla de los venenos de las especies de alacrán Centruroides noxius, Centruroides ¡impidas iimpidus, Centruroides suffusus suffusus y Centruroides Iimpidus tecomanus (Alacramyn™ faboterápico del Instituto Bioclón, México). Una vez inmunizado el caballo, su sangre es obtenida y sus inmunogiobulinas son tratadas para producir solamente ¡os fragmentos "F(ab') 2", entre los cuales hay algunas moléculas que son capaces de neutralizar las toxinas del veneno.
Parte de la invención describe la selección de una mezcla específica de proteínas {toxinas de alacrán fusionadas a la proteína tiorredoxina) que son capaces de generar anticuerpos en cabaílos y en otros animales como ratón y conejo, sin requerir el uso de los venenos totales o del bomogeneizado de glándulas venenosas para producir fragmentos de anticuerpos protectores en contra de las toxinas de varias especies de alacranes, y a continuación se describe la estrategia y los productos (inmunógenos) utilizados.
De forma específica, seleccionamos las siguientes secuencias de aminoácidos de toxinas del veneno de los siguientes alacranes: Para Norte de África, Marruecos, Este de ía cuenca Mediterránea, Sahei Africano, Turquía, Cercano y Medio Oriente:
I . AaHI del alacrán Androctonus australis {Norte de África, de Argelia a Egipto), SEQ ID No:1
2. AaHIl del alacrán Androctonus australis (Norte de África, de Argelia a Egipto), SEQ ID No:2
3. AmmV del alacrán Androctonus mauretanicus mauretanicus (Norte de África, Marruecos), SEQ ID No:3
4. AmmViH dei alacrán Androctonus mauretanicus mauretanicus (Norte de África, Marruecos), SEQ ID No:4
5. Boíl de! alacrán Buthus o citanus tunetanus (Norte de África, Este de la cuenca mediterránea y el Sahel Africano), SEQ ID No:5
6. Lqhll del alacrán Leiurus quinquestriatus hebraeus (África y Medio Oriente), SEQ ID No:6
7. LqhlV del alacrán Leiurus quinquestriatus hebraeus (África y Medio Oriente), SEQ ID No:7
8. Pg8 del alacrán Parabuthus granuiatus (Sur de África), SEQ ÍD No:8
9, Acra4 dei alacrán Androctonus crassicauda (Norte de África a Arabia Saudita y Turquía), SEQ ID No:9
10, Bul del alacrán Buthacus macrocen us (Norte de África a Arabia Saudita y Turquía), SEQ ID No:10
De forma específica, seleccionamos las siguientes secuencias de aminoácidos de toxinas dei género Centruroides para México:
I I . Cn2 del alacrán Centruroides noxius (México), SEQ ID No:21
12, CIHdel alacrán Centruroides limpidus (México), SEQ ID No:22
13. Ci¡2 del alacrán Centruroides limpidus (México), SEQ ID No:23
14, Cssil del alacrán Centruroides suffusus (México), SEQ ID No:24
De forma específica, seleccionamos las siguientes secuencias de aminoácidos de toxinas de Tityus serruiatus para Sudamérica:
15. Tsi del alacrán Tiíyus serru!atus (Brasil), SEQ ID No: 13
16, Ts3 del alacrán Tityus serruiatus (Brasil), SEQ SD No: 14
17. TsNTXP del alacrán Tityus serruiatus (Brasil), SEQ ID No:15
Al final de la presente, se proporcionan listados de 38 secuencias de las toxinas recombinantes ya sea maduras o bien híbridas (fusiones) obtenidas y probadas, agrupadas por región geográfica. Las híbridas pueden ser con tiorredoxina o con colas de histidinas y contienen las secuencias de reconocimiento de las endopeptidasas EK y de FXa como se explica más adelante para cada caso.
Una vez conocidas ias secuencias de aminoácidos de las toxinas seleccionadas, se procede al diseño de la estrategia para obtener una secuencia nucieotídica capaz de expresar en un sistema heterólogo dichas toxinas. La selección de dichas toxinas hace parte de la presente invención, pues no obstante que las secuencias fueron determinadas previamente y constan en publicaciones científicas y banco de datos (Rochat et al., 1970; Rochat et al., 1972; Rosso y Rochat, 1985; Alami et al., 2003; Gregoire y Rochat, 1983; Borneman y Hahin, 1993; Corzo et ai., 2001 ; García-Gómez et al., 2009; Callskan, et al., 2013; Caliskan et ai., 2012, Vázquez et. al., 1995; Ramírez et. al., 1994; Dehesa-Davila et. al., 1996; Martin et, al., 1987, Martin-Eauclaire et. al., 1992; Martin-Eauclaire et. al., 1994; Guatirnosim et al., 1999) no es obvio ni está al alcance de cualquier experto en el campo del arte, poder establecer que dichas secuencias funcionarán como inmunógenos, o sea como antígenos, capaces de generar anticuerpos protectores. La presente invención es una innovación tanto en la selección de las toxinas que generan ¡os anticuerpos neutralizantes, así como en ¡a prueba y selección de las mezclas que aportan ventajas al campo técnico, con respecto a lo que implica el uso de los venenos nativos.
Las toxinas seleccionadas se encuentran en cantidades limitadas en sus respectivos venenos, por io cual fue necesario generar un sistema de expresión capaz de producir en cantidad suficiente a las toxinas recombinantes y principalmente en forma estrueturalmente plegada, ya que este tipo de toxinas poseen 8 cisteínas que forman 4 puentes disulfuro, por lo cual aquella toxina recombinanfe que no esté plegada como la nativa tiene muy baja probabilidad de inducir la producción de anticuerpos neutralizantes. (Pedroso De Lima & Düzgünes N. Eds. 1995). Existen ejemplos en la literatura de toxinas de alacrán expresadas en citoplasma de bacterias, pero éstas son producidas sin plegamiente, es decir, carecen de los puentes de disulfuro que mantienen la estructura tridimensional requerida para su función, por io cual se requiere de un paso extra posterior a su purificación que permite que se formen los puentes disulfuro correctamente. Esto resulta bastante costoso para la producción del antígeno. Además el rendimiento de ¡a proteína plegada final es bajo. En nuestro sistema de expresión bacterial, fusionamos el gen de la proteína tiorredoxina con la toxina deseada y con el plegamiento adecuado.
La tiorredoxina incluida como parte de la fusión protéica en los casos probados, funciona como una proteína que brinda, por una parte, estabilidad a la toxina a ¡a cual esta fusionada y por otra parte, tiene actividad de chaperona de plegamiento intramolecular por lo cual favorece el plegamiento de la toxina a la que esta unida. Además de todos estos beneficios, el hecho de que la toxina recombinante este fusionada a la íiorredoxina y este híbrido se utiiice para inmunizar, hace posible que se pueda aplicar una mayor cantidad de toxina porque en su forma de híbrido no es tóxica, de esta manera representa a un inmunógeno ideal, estrucíuraimente plegado, estable y no tóxico para inmunizar a los animales experimentales.
!nrrsunogenos recombirsantes á® alacranes del Norte de Africa, b rruecos, Este de la cuenca Mediterránea, Sahd Africano, Turquía, Cercano y Medio Oriente
Se diseñaron olígonucleótidos externos e internos para ensamblar a cada una de ias toxinas, AaH ly AaH II del alacrán Androctonus austraiis Héctor, AmmV y AmmVIII del alacrán Androctonus mauratanicus auretanicus, Bot I del alacrán Buthus occñanus tunetanus, Lqhll y LqhlV del alacrán Leiurus quinquestriatus hebraeus, Pg8 del alacrán Parabuthus granuiatus, Acra4 de! alacrán Androctonus crassicauda y Bul del alacrán Buthacus macrocentrus, con uso preferencial de codones de E. cois. Estos olígonucleótidos se sintetizaron mediante síntesis química, en la unidad de síntesis y secuenciación del ADN del Instituto de Biotecnología de la UNAM. Véanse Figuras 1A-1J
Se realizó el ensamble de la secuencia nucleotídica de los genes mediante PCR recursivo y clonación posterior en el vector pBluescriptKS(-). El PCR de ensamble de cada toxina fue realizado utilizando Vent DNA polimerasa (New Engiand Biolabs, USA), siguiendo las instrucciones sugeridas por el proveedor. Los dos olígonucleótidos externos se usaron a una concentración final de 0.2 pmoí/μΙ y los olígonucleótidos internos a una concentración de 0.02 pmol/μΙ. Las condiciones de PCR fueron: 5 minutos a 94°C, seguido por 8 ciclos con una temperatura baja de alineamiento (94°C 30 seg, 50°C 1 min, 72°C 1 min), y luego 25 ciclos cortos con una temperatura alta de alineamiento (94°C 30 seg, 80°C 30 seg, 72°C 30 seg), finalizando con 5 min de incubación a 72°C.
Los productos de PCR fueron separados en gel de agarosa y purificados con el kit QIAQuick gel extraction (QIAGEN, USA). Los productos de PCR fueron clonados con extremos romos dentro del vector pBluescriptKS(-) (Stratagene, USA), digerido previamente con la enzima EcoRM, usando T4 DNA ligasa (Fermentas, Canad ), de acuerdo al protocolo suministrado por el proveedor. Ei producto de ligación fue electrotransformado dentro de células electrocompetentes DH5 alpha las cuales fueron subsecuentemente plateadas en cajas Petri con medio 2XYT conteniendo además IPTG/X-Gal/Ampicílína para selección de clonas blancas o azules y las clonas positivas (blancas) fueron verificadas por PCR de colonia con los olígonucleótidos T7-like (5'-GCG TAA TAC GAC TCA CTA TA-3") y T3-like (5"-CTC ACT AAA GGG AAC AAA AGC-3'). Las clonas que dieron el PCR con el tamaño esperado fueron amplificadas y se obtuvo DNA plasmídico de ellas por medio del método de lisis alcalina. Las construcciones fueron secuenciadas para verificar que el ensamble y secuencia donada de cada gen de cada toxina fuera correcta.
Se continuó con la preparación del vector de expresión pET22b-Tiorredoxina~sitio de corte para Enferocinasa. Para construir el vector de expresión, se ocupó el vector pThioHís C (ínvitrogen) para obtener el gen que codifica para la tiorredoxina y el sitio de corte para enterocinasa (EK)( para lo cual se realizó un PCR utilizando oligonucleótidos que incluían el sitio de restricción Ncoi en el amino-terminal de la tiorredoxina y el sitio Xho en el carboxilo terminal del sitio EK, El producto de PCR fue digerido con las enzimas A/col y Xhol y se clonó en el vector de expresión pET22b (Novagen). Este vector de expresión fue llamado pET22b- Thio. Véase la Figura 2.
Una vez preparado el vector de expresión pET22b-Thio, procedimos a la inserción de los genes ensamblados dentro del mismo. Las secuencias que codifican para cada toxina clonada en el vector pBluescriptKS {-), descritas anteriormente, fueron usadas como templados para reaamplificar por PCR los genes de las toxinas y proseguir con su subcionación en el vector de expresión pET22b-Thio. Los oligonucleótidos externos que codifican para el N-terminal de cada toxina contienen un sitio de clonación BamHI el cual permite clonar al gen de la toxina en el mismo marco de lectura que el gen de la tiorredoxina del vector de expresión, seguido por una secuencia que codifica para el sitio de corte de la enterocinasa bovina (Asp-Asp-Asp-Asp-Lys) para poder separarla de! último gen que codifica para la toxina. Esta construcción se hizo para cada una de las toxinas recombinantes utilizadas en el proyecto. El oligonucleótido reverso introduce un sitio de restricción Xhol diseñado para mantener la construcción en el marco de lectura de la secuencia que codifica para las 8 histidinas del vector de expresión.
Por lo tanto, los plásmidos conteniendo a los genes de las toxinas fueron digeridos con las enzimas BamHI y Xhol (New England Bioiabs, USA) y los insertos liberados fueron purificados por electroforesis de gel de agarosa utilizando el kit "QIAQuick gei extraction" (QIAGEN). Los fragmentos de restricción purificados fueron ligados al vector de expresión pET22b-Thio previamente digerido con BamHI y Xhol. Véase la Figura 2.
Cada uno de ios vectores de expresión conteniendo el gen codificante para la toxina fue eiectrotransformado dentro de células bacterianas. La bacteria que se utiliza es E. coli cepa BL21 (DE3) (Stratagene, Agilent Technologies Co.), esta cepa no es patógena, está modificada genéticamente en funciones relacionadas con recombinación de su material genético, síntesis de aminoácidos, producción de proteasas, entre otras funciones, con el fin de hacerla más eficiente para ia expresión de proteínas recombinantes. La principal característica de BL21 (DE3) es que incluye DE3, un profago Π , que contiene el gen de la T7 2 ϋ
RNA poíimerasa bajo el control del promotor lacUVS, por lo cual es posible utilizarla para producir proteínas a partir de un gen clonado en un vector de expresión bajo el control del promotor T7.
La E. coü cepa BL21 (DE3) es descendiente de la cepa E. coü B utilizada por el Instituto Pasteur en París, en los primeros estudios con bacteriófagos. E. coü B es el hospedero más común de los fagos T1-T7, por lo cual las cepas derivadas de E. coü B son ampliamente usadas junto con ¡os derivados de E. coü K-12. Ambas consideradas corno organismos de bajo riesgo {Nivel 1 ) (NIH Guideíines, U.S. Departament of Health and Human Services, 1986). E. coü BL21 (DE3) codifica para proteínas que le otorgan resistencia al antibiótico ampicilina. El gen que codifica para la proteína que confiere la resistencia al antibiótico, es obtenido de la naturaleza y es utilizado en ingeniería genética para seleccionar e identificar al organismo ya modificado. Los métodos utilizados para la introducción de material genético en ¡a cepa modificada son transformación, conjugación o transfección. En nuestro proyecto de investigación solo utilizamos el método de electrotransformación para introducir en E. coü BL21 (DE3), el plásmido portador dei gen que codifica para ia toxina de interés.
Para la expresión de las proteínas de fusión Tiorredoxina-Toxina, se procedió de la siguiente manera: Se creció pre-inóculo en medio LB con ampicilina a una concentración fina! de 100 fig/rni. El cultivo se obtiene de cepas recién transformadas con el vector correspondiente o directamente de un vial de glíceroi de la cepa de interés. Se crecieron cultivos de 750 mi de LB a 37°C y 200 rpm de la cepa BL21 transformada con el plásmido de expresión. Previamente, se adicionó ampicilina al medio de cultivo, a una concentración final de 200 μθ/ΕτιΙ, Después de crecer hasta una DO entre 0.7-1 , medida a 600 nm, se indujo la expresión con IPTG (Isopropy! β-D- -thiogalactopyranoside) a concentración final de 1 rn por un periodo de 6 a 12 h manteniendo los cultivos a 30 °C. Después se centrifugó a 5,000 x g durante 10 min a 4°C en tubos para centrífuga de 250 mi, con el fin de obtener todo el precipitado celular. Se congelaron las células -20°C, hasta su uso.
Para la obtención del extracto peripiásmico bacteriano conteniendo a la proteína de fusión expresada, se resuspendieron completamente las células precipitadas en 20 mi de buffer PPB (200 mg/ml de sacarosa, 1 mlVI EDTA, 30 m Tris-HCI pH8) y se incubó en hielo durante 30 minutos. Se centrifugó 20 minutos a 5,000 x g y se recuperó el sobrenadante. Posteriormente, se resuspendió el precipitado celular en 20 mi de H20, se incubó por una hora en hielo y se centrifugó nuevamente a 5,000 x g por 20 min a 4"C. Se recuperó el sobrenadante y las células fueron resuspendidas en 5 mi de Tris 50 mM, pH 8. Las células se rompieron utilizando sonicador, dando pulsos de 30 segundos de encendido y 10 segundos de descanso. Esto se realizó siempre en hielo, para evitar que se calentase la muestra. Luego se centrifugó a 5,000 x g a 4°C durante 20 min y se recuperó el sobrenadante. Se adicionó DNAsa a los sobrenadantes recuperados ^g de DNAsa por cada 1 mi de cóiuias iisadas), se incubó 15 minutos en hielo y se centrifugó 5,000 x g a 4°C durante 20 min o hasta eliminar completamente ¡os restos celulares de ¡a muestra. Se recuperó el sobrenadante y se filtraba la muestra, en caso de ser necesario. Se adicionó azida de sodio (concentración final 0,02%) para evitar contaminación. Este extracto se utilizó para ¡a purificación de la proteína utilizando columnas de afinidad. Véase ia Figura 3 (carriles 2 y 3).
Las proteínas de fusión expresadas se purificaron mediante cromatografía de afinidad y HPLC. Utilizamos columnas de afinidad que contenían resina Ni-NTA agarose (QIAGEN), siguiendo las recomendaciones del proveedor. Una vez obtenido el extracto, se empacó la resina en una columna adecuada al voiumen usado (10 mi), se equilibró con tampón fosfato salino, comúnmente conocido como buffer PBS (por sus siglas en inglés, PBS, de phosphate buñered saüne) concentración 1X y pH=8, adicionando 20 mM de imidazoi. Previo a la elución de ias proteínas, se realizó un lavado con PBS + 30 mlvl de imidazoi. Las proteínas se eluyeron con 400 mM de imidazoi en PBS 1X (véase ejempio en la Figura 3). Se colectaron de 3-5 fracciones de 1 mi cada una. Posteriormente se realizó la repurificación por RP HPLC, usando como solvente A 0.1 % TFA en H20 y solvente B 0.1 % TFA en acetonitriio. Los péptidos obtenidos fueron separados en una columna C18 (25mm x 4.1 mm) con un gradiente de 20 a 80% de solvente B en un lapso de 40 min y se colectaron manualmente por monitoreo de absorbancia a 230 nm. Véanse Figuras 4A - 4J.
Las proteínas fueron separadas por electroforesis en un gel discontinuo de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE) de acuerdo con el método descrito por Laemmíi (Laemmli, 1970). Se utilizó una cámara Mighty small II (Hoefer Scienfific Instruments, San Francisco, USA), con geles de 0.75 mm de espesor. Un gel concentrador al 5 % precede al gel de separación al 12%. Cada una de las muestras se diluyó en una solución de desnaturalización que contiene 125 mM Tris pH 8.8, 4% dodecil sulfato de sodio (SDS), 20% de glicerol, 10% β-mercaptoetanol, 0.05% (v/v) de azul de bromofenol y se incubaron durante 5 min a 95 °C. La separación se efectuó a corriente constante de 30 mA. Después de la migración el gel se incubó en una solución de ácido acético (10% v/v), metanol (30% v/v) y azul de Coomassie (0.2% v/v). Posteriormente se realizaron lavados del gel en una solución de agua: metano!: ácido acético en una relación 6:3:1 respectivamente, para quitar el exceso de colorante. Véase ejemplo en la Figura 3 (carriles 2 y 3).
Las digestiones de las proteínas de fusión se realizaron con la proteasa enteracinasa (EK) (Roche Applied Science, Alemania), siguiendo las especificaciones del proveedor. La reacción de proteólisis se iievó a cabo después de purificar la proteína con aprox. 98 % de pureza. La concentración final de proteína de fusión para la proteólisis fue de 1 mg/m! en una solución de Tris 10 mM, pH 8. La reacción se reaiizó a 16 °C durante 14 h.
Las masas moleculares de los péptidos recorrí binantes obtenidos fueron determinadas mediante ¡VIALDI-TOF o ESi-ION-TRAP (Romeo et ai., 2008), en el laboratorio de proteómica del instituto de Biotecnología de la UNAM.
Los inmunoensayos ligados a enzima (ELISA) se realizaron en placas de polivinilo de 96 pozos (Costar, Cambridge MA. U.S.A.) acoplando 3 μg por pozo de la toxina nativa disueíta en una solución de NaHC03 0.05 M H 9.4 incubado a 37 °C por 1 h. Se realizaron 3 lavados con PBS 1X adicionado con 0.1 % de tween 20 (a esta solución de PBS 1X + Tween lo abreviamos como PBST). Los sitios de unión no específica fueron bloqueados con una solución saturante de BSA (albúmina sérica bovina) al 0.5% en PBST coiocando 200 μΙ por pozo e incubando a 37 °C durante 2 h ó a 4°C durante toda la noche. Se realizaron 3 lavados con PBST. Se prepararon diluciones seriales del suero con PBS colocando 100 μΙ de cada dilución por triplicado e incubando a 37°C durante 1 b. Después de los correspondientes 3 lavados con PBST se adicionaron 100 μΙ de una dilución 1 :2,000 (v/v) del anticuerpo cabra- antiratón acoplado a peroxídasa en PBST incubando a 37°C durante 1 h. Para la reacción enzirnáiica se preparó una solución de fosfatos 0.1 M a pH 5 adicionado con 0.4 de orto- feniídiamina, y 0.4 μΙ de peróxido de hidrógeno a! 30% por mililitro. Se coíocaron 100 μΙ por pozo. Se incubó protegiendo de la luz por 10 min a 37°C y se detuvo la reacción adicionando 100 μΙ de HCI 6 N en cada pozo. Se midió la absorbancia a 492 nm inmediatamente, ya que la reacción de oxidación continúa.
La actividad tóxica de cada antígeno recombinante fue evaluada en ratones cepa murina CD1 , a los cuales se les inyectó vía intraperitoneal diez veces la dosis letal media (DLS0) reportada para cada toxina.
El resultado obtenido fue que a esa concentración la proteína no ejerce ningún efecto tóxico sobre el ratón, debido a que la toxina al tener fusionada a la tiorredoxina en su extremo N- terminal, afecta su actividad probablemente por impedimento estérico. Sin embargo, el hecho de que como proteína de fusión la toxina no sea tóxica es una de las principales ventajas al utilizarla como antígeno, ya que al inmunizar animales no hay peligro de que el animal sujeto al proceso de inmunización sufra ei efecto tóxico de la recombinante, permitiendo de esta forma inmunizarlos con altas dosis del antígeno.
Además en varios experimentos (se describe con detenimiento más adelante) se inmunizaron ratones y conejos con las toxinas recombinantes y al realizar experimentos de desafío, estos mostraron haber desarrollado anticuerpos que son capaces de reconocer el veneno y proteger en contra de ¡as toxinas. Por esta razón resolvimos también realizar ¡os experimentos de inmunización en caballos, que son ios animales experimentales de elección para ¡a producción de faboterápicos (anticuerpos neutralizantes), y que además son ios procedimientos autorizados por ¡as autoridades de salud, tanto nacional como de ¡a Organización Mundial de ía Salud. Los antivenenos actualmente en uso para humanos, en su mayoría son hechos mediante hfper-inmunización de caballos. Ejemplo de esto es el llamado "Alacramyn", que es uno de los antivenenos actualmente en uso en la población Mexicana que requiere de este producto.
Los venenos totales de alacranes empleados en ios experimentos que sustentan ¡a presente descripción fueron comprados a la compañía Latoxan (Francia).
A continuación se describe la inmunización en ratones y los resultados de neutralización utilizando los sueros obtenidos. Se inmunizaron inicialmente grupos de 10 ratones de la cepa CD1 de 17 g en promedio. Los inmunógenos utilizados fueron las proteína de fusión r(toxina)His (SEC ID No 12, SEC ID No 13, SEC ID No 14, SEC ID No 16, y SEC ID No 18). La inyección de ¡as toxinas se realizó por vía subcutánea. La emu¡sión se preparó con la toxina disuelta en PBS ai 1X con adyuvante completo de Freund (rockiand) en la primera inmunización, e incompleto o alúmina en las siguientes inmunizaciones. La inmunización se realizó inyectando la toxina en 100 μΙ de solución por ratón en cada ocasión, con un periodo de aproximadamente 10 días entre inmunizaciones. Se comprobó la generación y el incremento de anticuerpos en suero contra el veneno total y las toxinas nativas o recombinantes por ensayos de ELISA. Después de la última inmunización se realizaron pruebas de neutralización de 1 a 3 DL50 de veneno total con grupos de 3 o más ratones (Ver Tablas 1-3 de datos de neutralización, de acuerdo al esquema de inmunización que les precede.
Para la presente invención se inmunizaron grupos de ratones: con cada uno de los híbridos de ¡as toxinas recombinantes (formato de proteína de fusión): rThio-toxina (rThio-EK-toxina- 8His) (SEC ID No 11- SEC ¡D No 20). Se realizaron dos esquemas de inmunización: a) para Sas toxinas recombinantes rThioAaHIl, y rThioAmmV + rThioAmmVlli (se inmunizo con ambas toxinas), se ¡levaron a cabo 5 inmunizaciones usando cantidades de rThio-toxina (desde 5 a 25 μο) y volumen de PBS (en μΙ) variables (ver detalles en el esquema i), b) Para la toxina rThraLqh2 se realizaron 6 inmunizaciones usando una cantidad de toxoide (30 μο) y volumen de PBS (en μΙ) fijos (ver detalles en el Esquema ii). Para ambos esquemas, en la primera inmunización se inyectó un adyuvante completo de Freund (Rockiand), para desarrollar ¡a respuesta inmunológica del ratón; ias siguientes fueron con adyuvante incompleto o alúmina, alternadamente. A continuación se muestran los esquemas de inmunización y ios resultados de la neutralización correspondiente:
Esquema de inmunización I: Se inmunizaron 10 ratones con la proteína de fusión:
Tiorredoxsrs®-EK-AaHH-8His
TIorredoxina-EK-AmmV-fiHis
TiorredQxlna-E -AmmVIÍI-8His
1a. inmunización 5 9 de proteica tota! / Adyuvante completo
28. Inmunización 10 μο de proteína total / Adyuvante incompleto
3a. Inmunización 15 μ3 de pro-teína total / Alúmina
4a. inmunización 2ϋμρ de proteína total / Adyuvante incompleto
5a. inmunización 25 ¡ig de proteína total / Alúmina
Volumen inyectado a cada ratón: 50 μί Una vez terminado el protocolo de inmunización se procedió a desafiar la capacidad protectora del proceso de inmunización con ias proteíns híbridas, inyectando directamente el los anímales previamente inmunizados los venenos solubles de lo alacranes a ¡as dosis indicadas en la Tablas 1 a 3.
Tabla 1. Reto directo de Sos ratones inmunizados CO! n ia proteina de fusión
Tlorred© xsrsa~EK-AaHil-6His con el veneno de Androct onu. s austraiis.
Suero OLso eneno usado Proporción de ratones sobrevivientes con respecto al total de ratones ensayados
Suero d e ratones inmunizados 3 DL.50 de veneno de 8/1 1
con ia proteina de fusión Androctonus austraiis
Tiorredox ina-EK-AaHli-6His
Controles 3 DL.50 de veneno de 0/3
Androctonus austraiis
Síntomas observados en el ratón d e prueba: 6 de los ratón es n stados mostraron síntomas severos c ie intoxicación, pero sobre ■¡vivieron a ia inyección.
En el caso de los ratones controles: todos murieron entre un tiempo de 25 minutos a 1 y media ho ra. Tabla 2, Reto directo de Sos ra tomes inmunizados, cos fas proteínas de fusión Tiorredaxina-EK-AmmVHI-6Hís y Tiorredoxina-EK-AmmV- 6His, con el veneno de Androctonus australls.
Suero DLSQ veneno usado Proporción de ratones sobrevivientes con respecto ai total de ratones ensayados
Suero de ratones inmunizados 3 DLso de veneno de 8/10
con ¡as proteína de fusión Androctonus australis
Tiorredoxina-EK-AmmVüi-BHis y
Tsorredoxina-EK-AmmV-6His
Controles 3 DLso de veneno de 0/3
Androctonus australis
Síntomas observados en ios ratones inmunizados: Se observaron síntomas de intoxicación severa en 4 ratones, pero 3 horas posteriores a la inyección y sobrevivieron 8 ratones de un grupo de 10 Síntomas observados en los ratones control: todos murieron entre un tiempo de 25 minutos a 1 hora y media.
Nota: Es importante notar que ios ratones fueron inmunizados con Sa mezcia de las proteínas de fusión de AmmV y AmmV! í i (de Androctonus mauretanicus mauretanicus) y e! reto fue con veneno de Androctonus austraiis.
Esquema de inmunización II:
Esquema de inmunización utilizado par a inmunizar un grupo de rator ses (cepa CD1) cor, ia proteína fusión Tiorredoxina-E -Lqhi!-6His.
No, No. DE CANTIDAD DE Te txina ADYUVANTE INMUNIZACIÓN RATONES > ( ¡g) tola! (tipo)
1 10 30 Completo
2 10 30 Incompleto
3 10 30 Aiúmfna
4 10 30 Incompleto
5 10 30 Alúmina
6 10 30 Incompleto
Figure imgf000028_0001
También obtuvimos los títulos de anticuerpos en conejos después de someterse a inmunizaciones con ia mezcla de las proteínas de fusión correspondientes a las toxinas recombinantes AaHI y AaHN de Androctonus austraiis, ArnmV y AmmVIII de Androctonus maur&tanicus, Lqhll y LqhlV de Leirus quinqueshiatus y Boíl de Buthus occitanus, mediante ensayos de ELISA. Así como, la evaluación de la capacidad neutralizante de los sueros obtenidos contra el veneno total de los alacranes ya antes mencionados, tal y como se describe a continuación: A partir de los sueros obtenidos se purificaron anticuerpos mendiante 3a cromatografía de afinidad a Proteína A. Los anticuerpos purificados se evaluaron mediante ensayos de ELISA y Western blot para determinar la capacidad de reconcimiento hacia cada una de las toxinas recombinantes.
Partiendo de Sas proteínas de fusión correspondientes a las toxinas AaHÍ. AaHIl, ArnrnV, AmmVIII, Lqhll, LqhlV y Boti tratando de cubrir los tres grupos inmunogénicos: I
AaHf KRDGYIVYPNNCVYHCVPP-CDGLCKK GGSSGSCS—
VPSGLAC CICOLPDNVPSKDTS CT
Lq lV GVRDAYiADDKNCWTCGANSYCNTECTKNGAESGYCQWFGKY- GNACWCIKLPDKVPIRIPG-KC-R
U
AaH2 V DGYIVDDVNCWCGR AYCNEECTKLKGESGYCQ ASPY- G ACYCY LPDHVRTKGPGR-CH
AmmV L DGYIVND! CTYFCGR AYCNELCf LKGESGYCQWASPY- GNSGYCY LPDHVRT GPGR-CN
Lqhil fKDGYfVDDVNCTYFCGRNAYCMEECTKL GESGYCQWASPY- GNACYCY LPDH¥RT GPGR-C~
Amm¥ L DGYI1DDL CTFFCGR AYCDDEC K GGESGYCQ ASPY- G N AC WC Y LPD RVSf KE KG R-C
GRDAYIAQPENCVYECAQNSYCMDLCTKNGATSGYCQWLGKY'
G AC CKOLPDNVPIRIPGK-CHF
Ai incluir las toxinas en los tres grupos inmogenicos en los protocolos de inmunización en conejos de la cepa Nueva Zelanda, se espera obtener anticuerpos con la capacidad de neutralizar al veneno completo de los diversos alacranes que contienen estas toxinas. A continuación se muestra el esquema de inmunización en conejos que se siguió:
Esquema de inmunización en conejos (05, 06, 08} con las toxinas recombinantes AaHI, AaHIl, AmmV, AmmVIII, LqhIL LqhlV y Botl. μ!
5íi¡rtiiE!;s Facha Adyuvante Toxina bcutén Sangría
ciór¾ (añs 2014- m Recomb 80/
16) imante conejo
1B 31 de Complet 250 30 500 Pr nm n
Octubre o e
2a 14 de fncomple 300 50 600
Noviembr to
e
3a 28 de Alúmina 300 100 600
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@
4a 12 d® Ineomple 300 200 600
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5a 26 de Alúmina 300 250 600
Oicsembr
e
6a 09 de ¡ncomple 300 300 600 1a Sangría
Enero to
7a 27 de Alúmina 300 350 600
Enero
8a 13 ¡ncompS© 300 400 600 2a
Febrero to Sangría
9a 27 Alúmina 300 4S0 600
Febrero
10a 13 de Ineomp 300 SOO 600 3a Sangría
to
11a 28 de Alúmina 300 700 600
arzo
7 de Abril 4a Sangría
12a 14 de fncomplle 300 600
Abril to
23 da 5a Sangría
Abril
Para evaluar ía capacidad del suero de los conejos hiperínmunizados se determinaron los títulos de ¡os anticuerpos mediante ensayos ELISA por el método convencional con anticuerpo anti-conejo acoplado a peroxidasa se detectó absorbancia a 490 nrn.
Quince días después de ¡a quinta inmunización se realizó la primera sangría y se evaluaron los títulos de anticuerpos contra las toxinas recombinantes así como con veneno total. En ía tabla 4 se muestran los valores obtenidos contra las toxinas recombínantes y contra la 2.9 proteína acarreadora Tiorredoxina. En la figura 5 Se puede observar que las toxinas son más inmunogénicas que el acarreador.
Figure imgf000031_0001
Los títulos de anticuerpos obtenidos después de la quinta inmunización contra el veneno diversos alacranes del norte de África se muestran en la Tabla 5 y en la Figura 6.
Figure imgf000031_0002
Como se puede observar en !a Figura 6 hay un mejor reconocimiento del veneno de Androctonus mauretanicus en ios tres conejos, mientras que el suero del conejo 08 comienza a tener reconocimiento del veneno de A. austraiis.
Posteriormente, se reaíizaron cuatro sangrías con una diferencia de un mes cada una. Con los sueros obtenidos se evaluaron los títulos de anticuerpos contra el veneno de las especies de alacrán ya empleadas, mediante ensayos de ELISA. Los resultados se muestran en la tabla 6 y en la figura 7. Tabla 6. Títulos de anticuerpos del Conejo 05
Veneno \ Segunda Sangría Tercera Sangría Cuarta Sangría
Androctonus australis i 3,353 ± 642 7,497 ± 1 ,004 10,465 ± 1 ,231
Androctonus rnauretanicus j 2,494 ± 480 5,653 ± 918 10,510 ± 1 ,11 1
Buthus occítanus 3,994 ± 1 ,067 6,591 ± 1 ,237 6,976 ± 959
Leiurus quinquestriaíus j 3,519 ± 686 6,873 ± 649 j 7,997 ± 857
Tabla 7. Títulos de anticuerpos del Conejo 08
Veneno Segunda Sangría Tercera Sangría Cuarta Sangría
Androctonus australis 3,160 ± 629 6,725 ± 750 10,228 + 978
Androctonus rnauretanicus 2,491 ± 551 6,617 ± 900 13,165 ± 839
Buthus occítanus 24,895 ± 2,068 6,649 ± 901 7,589 ± 584
Leiurus quínquestriatus 12,422 ± 1 ,068 6,998 ± 635 9,120 ± 1 ,390
Tabla 8. Títulos de anticuerpos del Conejo 08
Veneno Segunda Sangría Tercera Sangría Cuarta Sangría Androctonus austraiis 2,230 ± 304 6,718 + 746 8,321 ± 1 ,057 |
Androctonus maurítanicus 2,155 ± 614 6,631 ± 832 8,371 ± 708 |
Buthus occítanus 14,009 ± 1 ,593 21 ,196 ± 2,1 14 7,146 ± 71 1 |
Leirus quínquestriatus 11 ,43 1 1 ,255 8,995 ± 387 7.330 ± 780 I
Como se puede observar en los datos anteriores, el conejo 08 es el que presenta mejores títulos contra los venenos de A. austraiis, A. rnauretanicus, B. occítanus y L quínquestriatus, por lo que se decidió usar el suero de este conejo para realizar de ensayos de neutralización contra Sos cuatro venenos en ratones hembra de la cepa CD1 de 18 a 20 g de peso. Ver figuras 8 y 9, Debido a que los títulos contra ¡os venenos no fueron tan altos se decidió comenzar a probar 2 DL50 de cada veneno solo en dos ratones control y dos más para el ensayo de neutralización con 250 μΙ de suero. En los casos en donde hubo muerte de los ratones en presencia del suero se redujo a 1 DL50, mientras que en otro caso se dejaron las 2 DL50 debido a que se observaron síntomas severos de intoxicación de los ratones y en otro se aumentó a 3 DL50.
En las siguientes tablas se muestran ios resultados obtenidos del ensayo de neutralización realizado con el suero obtenido del conejo 06 después de ¡a doceava inmunización. Para todos los experimentos se usaron 250 μΙ de suero.
Figure imgf000033_0001
En la tabla 9 se muestran los ensayos de neutralización del veneno de A. australis, en donde se observa que con 2 DL50 el 100% de la población de los ratones tanto en los controles como con el suero mueren. Por lo que se retaron los ratones solo con 1 DL50 de veneno y en los ratones control se observa la muerte en 30 minutos, aquí se esperaría solo la muerte del 50 % de ia población por lo que esto ndica que tal vez no estamos usando la cantidad de veneno correcta o este grupo de ratones fue muy sensible, por lo que habría que hacer más ensayos. Ahora bien, cuando se compara el grupo control con los del suero se observa que muere el 50% de la población y el tiempo en el que se presentan los síntomas se retarda, en el control los ratones mueren alrededor de los 30 minutos, mientras que en el otro grupo mueren a ios 70 minutos.
Figure imgf000034_0001
En la tabla 10, se muestra que con 2 DL5o del veneno de A. mauretanicus muere el 100% de la población, mientras que aplicando el suero solo muere un 50%. Por esta razón, se decidió retarlos solo con una DL50 y se observa que el 100% de la población control muere, mientras que al inyectar esta misma dosis del veneno con el suero hay una sobrevivencia del 100%. Estos resultados indican que los anticuerpos del suero del conejo 06 son capaces de neutralizar una DL50 del veneno de A. inaureíanícus.
Figure imgf000035_0002
Figure imgf000035_0001
En la tabla 11 , se muestra que se inyectan solo dos ratones con 3 DL50 del veneno total de L. quinquestriatus. Se observa que el 100% de la población muere tanto en el grupo de los ratones control como en los que se administra el veneno mezclado con los 250 μΙ de suero. Con base en estos resultados, se decidió retar a un grupo de 8 ratones solo con 2 DL50 del veneno con y sin suero. Se observa que el 100% de los ratones control muere mientras que en el otro grupo sobreviven el 100%, Estos resultados indican que el suero del conejo 08 es capaz de neutralizar 2 DL50 del veneno de L. quinquestriatus.
Figure imgf000036_0001
En la tabla 12 se muestra el ensayo de neutralización con el veneno de Buthus occitanus, en la cual es evidente que el suero del conejo 06 es capaz de neutralizar 2 DL50 del veneno total.
Como se puede observar en las tablas anteriores, el suero del conejo 06 no solo tiene una buena capacidad de reconocer a los diferentes venenos de los alacranes del norte de África, sino que también es capaz de neutralizar 1 DL50, 2 DL50 y 3 DL50 de los venenos de A. austraiis, A, mauretanicus, B. occitanus y L quinquestriatus, respectivamente.
En los resultados anteriores se muestra que los anticuerpos obtenidos en este protocolo de inmunización no fueron capaces de neutralizar 3 DL50 de todos los venenos empleados. Como se recordará nosotros empleamos en el protocolo de inmunización las toxinas recombinantes que conforman los tres grupos inmunogénicos, por lo que tai vez al inyectarlas todas se está generando una distracción inmunológica. Sin embargo, resultados previos obtenidos tanto en caballos como en ratones, muestran que al inmunizar estos animales con las toxinas recombinantes que pertenecen al grupo ínmonogénico II (AaHIl, Lh2, Amm5 y Amm8) los anticuerpos que se generan son capaces de neutralizar a 3 DL50 de los venenos de A. australis, A, mauretanicus y L quinquestriatus. Por lo tanto, para protocolos posteriores se recomienda inmunizar con las toxinas que pertenecen a cada grupo por separado. De acuerdo con los resultados anteriores se decidió purificar ios anticuerpos del suero del conejo 03 mediante cromatografía de afinidad a Protesna A, Ver resultado en la figura 10. La Proteína A tiene la característica de unirse a la región Fe (fragmento constante) de las inmunogíobulinas a través de la interacción con la cadena pesada. El protocolo para la purificación de los anticuerpos se basa en el uso de cromatografía de afinidad con agarosa acoplada a Proteína A, ésta permite que los anticuerpos presentes en el suero diluido en buffer de unión queden unidos a la columna como lo marca la técnica convencional y utilizando un flujo lento se van colectando fracciones de 1 mi. Se deja de pasar buffer hasta que la absorbancia a 280 nm sea igual o menor a 0.07, se usa buffer 2M Tris-HCI pH 8.0 para prevenir la desnaturalización de los anticuerpos. Las fracciones de interés se dializan contra 10 volúmenes de la muestra con PBS1X, se realizan cuatro cambios de 1 hora a 4 °C. Los anticuerpos se almacenan en PBS1X + 50% de Glicerol + 0.02% NaN3> se preparan alícuotas de 750 pg/1.5 mi y se guardan a -70°C. Con estas alícuotas se determinó el título de anticuerpos contra las toxinas recombínaníes AaHI, AaHIi, AmmV, AmmVII, Lqhll, LqhlV y Botl. Ver Figura 1 1.
Con ¡os anticuerpos purificados se puede monitorear la expresión de las toxinas recombínaníes ya mencionadas. Para evaluar el reconocimiento de estos anticuerpos, se corrió un gei de SDS-PAGE al 12%, aplicando en cada carril 10 pg de praíeína de fusión reconnbinaníe pura (Thio-EK-AaHI, Thio-EK-AaHIl, Thio-E -AmmV, Thio-EK-AmmVIII, Thio- EK-Lqhll, Thío-EK-LqhJV, Thio-EK-Bofl). Cada proteína se cargó por duplicado en el gel; una parte se tiñó con azul de Coomassíe y la otra mitad se transfirió a una membrana de nitroceluíosa para el inmunoensayo Western Blot (WB), empleando el método Semihúmedo de Kyhse-Andersen. El anticuerpo purificado se utilizó a una dilución típicamente de 1 :50000, sin embargo, la dilución usada depende del suero del respectivo conejo inmunizado. Se incubó 1 h a 37° C. En la Figura 12 se muestra el reconocimiento de las proteínas de fusión recombinante por el anticuerpo purificado. Como se muestra en la Figura 12A, se observan bandas alrededor de los 20 kDa correspondiente a las proteínas de fusión de interés, así como un dímero de estas proteínas entre 35 y 40 kDa. En el caso del WB, se observa un buen reconocimiento de las proteínas obteniéndose bandas alrededor de los 20, 40 y 80 kDa, indicando que el anticuerpo está reconociendo también dímeros y trímeros de las proteínas de fusión.
Estos resultados indican que estos anticuerpos pueden ayudar a monitorear tanto la expresión como la purificación de las proteínas de fusión Thio-EK-AaHI, Thio-EK-AaHI I, Thio- EK-AmmV, Thío-EK-AmmVlli, Thio-EK-Lqhll, Thio-EK-LqhlV, Thio-EK-Botl.
Posteriormente, se procedió a la realización de ensayos ahora para la especie Parabuthus granuiatus. Con el fin de obtener el suero suficiente para realizar ensayos de neutralización contra el veneno de esta especie, se propuso un esquema de inmunización en conejos que se detalla enseguida, como inmunógenos se empleó tanto la toxina recombinante Pg8 digerida sin tiorredoxina (para evitar distracción del sistema inmune), y también se usó ¡a proteina recombinante Pg8 sin digerir.
Se inmunizaron dos grupos de conejos Nueva Zelanda de 2,5 Kg con cada uno de estos inmunógenos, ¡a administración fue vía subcutánea, inyectando la toxina recombinante en un volumen final de 500 μ! de PBS 1X. Se realizaron 8 inmunizaciones con lapsos de 10 días entre ellas. Una vez terminado el protocolo de inmunización, se llevaron a cabo ensayos de neutralización del veneno total con los sueros obtenidos. Se emplearon 3 grupos de ratones con peso aproximado de 17 a 20 gramos e inoculados vía intraperitoneaí. Para el control se usaron 4 ratones a los que se les inyectó únicamente el veneno total de Parabuthus granulatus. Para cada uno de ios retos se emplearon 6 ratones a los que se les inyectaron 250 μΙ de suero preinmune previamente incubado a 37°C durante 60 min con 3 DLSo del veneno total.
Durante este ensayo murieron los 4 ratones control, sobrevivieron 5 de 6 ratones inmunizados con la toxina digerida y 3 de 5 con !a toxina sin digerir. Los resultados de ELISA Indican que la proteína digerida promueve la generación de títulos más altos de anticuerpos contra el veneno total de Parabuthus granulatus, lo cual correlaciona con la neutralización. Los títulos obtenidos fueron de 158,206 para los sueros obtenidos de ratones inmunizados con la proteina digerida y de 66,724 para los generados con la toxina sin digerir.
Un protocoüo similar de inmunización se llevo a cabo para tres conejos inmunizados con los híbridos de las toxinas Acra4 y Bul .
De forma resumida, para la generación de anticuerpos en otros mamíferos se inmunizaron grupos de dos conejos con las siguientes toxinas: a) con toxina recombinante rThioPgS (SEQ ID NO: 18, fusionada a tiorredoxina), b) con toxina recombinante rPg8 digerida (sin la proteína tiorredoxina), (SEC ID No 8 más 6 histidinas en el carboxilo terminal) y usando tres conejos c) inmunizando simultáneamente con las toxinas recombinantes Acra4 (SEC ID No 19) y Bu1 (G ID No 20).
Las inmunizaciones se realizaron de manera similar a la realizada en el sistema con ratones y en las siguientes tablas de esquemas de inmunización {III y IV) se pueden observar los detalles de cada inmunización y al final de cada esquema se encuentra la tabla de la neutralización correspondiente donde se valoró la capacidad protectora de cada suero: Esquema II!. InmunízaGiones en conejos con la proíeína de fusión Tlorredox na-EK-Pg8-6His o Protefna Pg8 sola {digerida). Se usaron 2 conejos por cada inmunógeno, 500 μί subcutáneo/conejo.
Fecha de Adyuvante Toxina de Toxina
Inmuniz ción Inmunización fusión- FgS ecombinanl® Pg8
(Año 2011} recombinante sola,
í ) digerida fpg)
Sangrado 6 mayo
Pre-ínmyne
1a 6 mayo Completo 30 30
2a 16 mayo Incompleto 30 30
3a 28 mayo Alúmina 50 50
1a Sangría 6 junio
4» 6 Junio Incompleto 50 50
58 16 junio Alúmina eo 80
6a 27 junio Incompleto eo 80
2a Sangría T julio
7a T juiio Alúmina 100 100
8a 19 julio Incompleto 100 100
Sangrado total 29 julio
Tabla 13. Ensayos de neutralización utilizando el veneno de Parabuthus granuíatus y el suero de los conejos inmunizados con la toxina recombinante Pg8 digerida (Pg8 - hsstidinas).
DLso de Suero de conejo Proporción de
Prueba veneno de inmunizados ratones
Parabuthus con la proteína sobrevivientes granuíatus recombinante Pg8 respecto a los digerida ratones inyectados
Grupo de ratones control (solo
se les inyectó veneno) 2 DLso 1/4
Ratones inyectados con 250 μ! 6/6 veneno y suero del Conejo 45, 2 DL50
inmunizado
con la toxina recombinante
Pg8 digerida
Ratones inyectados con 250 μΙ 4/4 veneno y suero del Conejo 46, 2 DLso
inmunizado
con ¡a toxina recombinante
Pg8 digerida
Grupo de ratones control (solo
se les inyectó veneno) 3 ,DLso - 1/4
Ratones inyectados con 250 μ! 5/6 veneno y suero del Conejo 45, 3 DL50
inmunizado
con la toxina recombinante
Pg8 digerida
Ratones inyectados con 250 μ| 2/6 veneno y suero del Conejo 48, 3 DL50
inmunizado
con la toxina recombinante
Pg8 digerida DLso de veneno de P. granuíatus- 44.9 pg/20 g de ratón, vía intraperitoneal Tabla 14, Ensayos de neutralización utilizando el veneno de Parabufhus granulatus y el suero de los conejos inmunizados con la toxina de fusión con Pg8 recombinante.
DLso de Veneno Proporción de ratones
Prueba de sobrevivientes respecto al total
Parabufhus de ratones inyectados
granulatus
Grupo de ratones control (solo se les
inyectó veneno) 2 DLso 1/4
Ratones inyectados con veneno y 2 DLso 6/8
suero del Conejo 47, inmunizado
con la toxina de fusión de Pg8
recombinante
Ratones inyectados con veneno y 2 DLso
suero del Conejo 48, inmunizado 4/4
con la toxina de fusión de Pg8
recombinante
Esquema IV. Inmunización de 3 conejos (números 37, 38 y 39) con la proteína de fusión de la toxina Acra4 y con la proteína de fusión de la toxina Bul , Este esquema de inmunización se realizó inmunizando con una mezcla equimolar de proteína de fusión de la toxina Acra4 más proteína de fusión de ¡a toxina Bul , debido a que ambas provienen de venenos de alacranes de Turquía.
Figure imgf000041_0001
Tabla 15. Ensayos de neutralización utilizando el veneno de Androctonus crassicauda y el suero de los conejos inmunizados con la toxina de fusión con Acra4 recombinante.
DL.50 de Veneno de Proporción de ratones
Prueba Androctonus sobrevivientes respecto al total de crassicauda ratones inyectados
Grupo de ratones control 1 DL50
(solo se les inyectó veneno) 0/3
Ratones inyectados con 1 DL50 3/3
veneno y suero del Conejo
37
Ratones inyectados con 1 DLsc
veneno y suero dei Conejo 2/3
38
Ratones inyectados con 1 DL50
veneno y suero del Conejo 2/3
39
Debido a ios resultados obtenidos en las inmunizaciones realizadas en ratones y conejos, se decidió inmunizar caballos con la mezcla de ias toxinas de los alacranes del norte de África. Se propuso un sistema de inmunización empleando ias proteínas híbridas de las toxinas recombinantes AaHH de Androctonus australis Héctor; Amm5 y Amm8 de Androctonus mauretanicus mauretanicus y Lqh2 de Leiurus quinquestriatus hebraeus, todas ellas consideradas las más tóxicas de su respectivo veneno. Se emplearon 3 caballos a los que se les inyectó la mezcla de las 4 toxinas recombinantes mencionadas. Se realizaron 9 inoculaciones, la primera se inyectó con adyuvante completo de Freunds (Rockland) para desarrollar la respuesta inmunológica del caballo; las siguientes fueron con adyuvante incompleto o alúmina. Los volúmenes de las inoculaciones y cantidad de antígeno (μο) vanaron durante el esquema de inmunización (Ver esquema V). A continuación se muestra el esquema V de inmunización en caballos y diferentes tablas con los resultados de la neutralización utilizando el suero obtenido. Esquema V de inmunización en caballos con mezcia de las proteínas de fusión de AaHIL ArnmV, AmmVIfi y Lqhll. Se usaron 3 caballos: caballo 42, caballo 43 y caballo 44: dna Volumen
Día (fecha) Ad vant por cabaüo por
(año 2011) @ { ο de ¡a caballo
intradórmic
1 0 (20 abril) Completo 250 2.0
a
Incompíet
2 7 (27 abril) 250 2.0 Subcutánea
0
3 21 (11 mayo) Alúmina 250 1.5 Subcutánea
Incompíet
4 35 (25 mayo) 250 2.0 Subcutánea
0
5 49 (8 junio) Alúmina 250 1.5 Subcutánea
Sin
6 63 (22 junio) acarreado 250 1.0 Subcutánea r
Incompíet
7 (Sangría) 77 (8 julio) 300 2.0 Subcutánea
0
8 (Sangría) 91 (20 julio) Alúmina 300 1.5 Subcutánea incompíet
9 (Sangría) 105 (3 agosto) 500 2.0 Subcutánea o
1 19 (17
Sangría
agosto)
Al finalizar la novena inmunización se realizaron pruebas de neutralización en ratones contra el veneno de Androdonus mauretanicus mauretanicus, Androdonus australís y Leiurus quinquestríatus hebraeus (ver Tabla 16), utilizando el suero de los caballos inmunizados. Para fines prácticos solamente se muestran ios resultados obtenidos con el suero de un solo caballo, pero los resuitados obtenidos son comparables a ios dos otros caballos también inmunizados. Tabla 16. Ensayos de neutralización con e! suero de caballos inmunizados con la mezcla de ¡as proteínas de fusión de AaHI!, AmmV, AmmVlll y Lqhll. Para facilidad se muestran ios resultados de solo uno de los caballos.
Proporción de ratones
Prueba DL50 de Veneno sobrevivientes respecto al total de ratones inyectados
Grupo de ratones control 2 DL50 de Veneno de
(solo se les inyectó Androctonus 0/2
veneno) mauretanicus
mauretanicus
Ratones inyectados con 2 DL.50 de Veneno de
veneno y 300 μΙ de suero Androctonus 2/2
del Caballo 43 mauretanicus
mauretanicus
Grupo de ratones control 2 DL50 de Veneno de
(solo se les inyectó Androctonus australis 1/2
veneno)
Ratones inyectados con 2 DL50 de Veneno de 2/2
veneno y 300 μΙ de suero Androctonus australis Nota: Los ratones presentaron del Caballo 43 síntomas ligeros de intoxicación pero
30 minutos después con respecto a los ratones control
Grupo de ratones control 2 DL50 de Veneno de
(solo se les inyectó Leiurus quinquestriatus 0/2
veneno) hebraeus
Ratones inyectados con 2 DL50 de Veneno de 1/2
veneno y 300 μΙ de suero Leiurus quinquestriatus Se observaron síntomas ligeros como del Caballo 43 hebraeus parálisis de las patas traseras. El veneno de Leiurus tiene otras toxinas de importancia médica, y solo se uso una de ellas para inmunizar al caballo, lo cual puede ser la razón de la parcial neutralización que se obtuvo.
Con ios resultados de neutralización anteriores {Tabla 16) se puede observar que los híbridos de las toxinas recombinantes empleadas funcionaron muy bien como inmunógenos. Se hizo una verificación de esos resultados utilizándose una cantidad reducida de suero (300 microlifros), logrando neutralizar hasta 2 DL50 tanto del veneno de Androctonus austraíis Héctor como del veneno de Androctonus mauretanicus mauretanicus y un 50% de neutralización con 2 DL50 del veneno de L&iurus quinquestríatus hebraeus, Es importante considerar que este úiíimo veneno es más complejo ya que tiene otras toxinas que participan en el envenenamiento por la picadura de este alacrán). Con el objetivo de incrementar la potencia del suero de ¡os caballos previamente inmunizados, se decidió aplicar inmunizaciones extras con los venenos de Androctonus austraiis Héctor, Androctonus mauretanicus mauretanicus y Leiurus quinquestríatus hebraeus, a tos caballos 42, 43 y 44 previamente inmunizados con las proteínas de fusión de AaHI!, AmmV, AmmVili y Lqhll, El esquema de estos refuerzos con veneno se muestran a continuación en el Esquema VI. La idea de esta ampliación del proceso de inmunización tiene dos razones de ser: La primera es que confirma la eficiencia de las toxinas híbridas como primadoras de una respuesta inmune. Por tratarse de inmunógenos híbridos la toxicidad de los péptidos se ve inhibida de tal forma que se pueden hacer protocolos de inmunización con una cantidad más elevada de antígeno. El segundo punto, como se demostrará a continuación, con un refuerzo dado con e! material compleío (veneno soluble completo de tos alacranes) esto madura ia respuesta inmune en un periodo muy corto y produce sueros altamente neutralizantes.
Esquema VI. Refuerzos de inmunización con la mezcla del veneno total de Androctonus austraíis Héctor, Androctonus mauretanicus mauretanicus y Leiurus quinquestríatus hebraeus a caballos previamente inmunizados con la mezcla de las proteínas de fusión de Aa
Figure imgf000045_0001
10 sangría 0 /6 juí lncompleto/1.3 1000 2.0 Subcutánea
1 1 sangría 14 /20 jul Alúmina/1.0 3000 2.0 Subcutánea
12 sangría 28 /3 ago Sncompleto/1.3 6000 2.Q Subcutánea
Sangría 35/17ago
Para evaluar la efectividad del suero de los caballos previamente inmunizados con los híbridos recorn binantes de las toxinas AaHIl, AmmV, AmmVIII y Lqhll y reforzados con tres inmunizaciones de veneno total de los alacranes Androctonus austraüs Héctor, Androctonus mauretanicus mauretanicus y Leiurus quinquestríatus hebraeus, se realizaron ensayos de neutralización por cada veneno iota! y para ello se utilizaron ratones cepa CD1 con peso aproximado de 17 a 20 gramos. Se usaron grupos de 4 ratones, un grupo se empleó como control a! que únicamente se le inyectó a cada ratón 3 DL50 del veneno a neutralizar. A los otros grupos de ratones se les inyectó diferentes cantidades del suero obtenido de los caballos inmunizados, previamente incubado a 37°C durante 80 min con 3 DL50 del veneno total a evaluar (ver Tablas 17 a 20). Para fines prácticos solamente se muestran los resultados obtenidos con el suero de un solo caballo, sin embargo, esencialmente el mismo tipo de resultados se obtuvieron con los otros dos caballos ensayados. Para el caso de la neutralización del veneno de Androctonus austraiis Héctor, los 4 ratones del grupo control inyectados con 3 DL50 de veneno murieron, en contraste el grupo de cuatro ratones inyectados con la mezcla de este veneno y con 100 μΙ de suero del caballo 43 (Tabla 17) todos sobrevivieron, además se logró neutralizar 3 DL50 del veneno de A. austraiis con tan solo 40 μΙ de este suero (Tabla 20). Estos resultados son extremadamente positivos, pues con un mililitro de este suero seguramente se puede neutralizar 75 DL50 del veneno en cuestión. Para el caso de la neutralización del veneno de Androctonus rnauretanicus mauretanícus, todos los ratones del grupo control inyectados solo con veneno, murieron, mientras que los cuatro ratones que se inyectaron con la mezcla de 100 μΙ de suero del caballo 43 más 3 DL5e de veneno sobrevivieron (Tabla 18). Para el caso del ensayo de neutralización del veneno de Leiurus quinquestriatus hebraeus, se evaluaron dos grupos control de ratones, con 4 ratones cada uno, a ios cuates se les inyectó, respectivamente, 1.5 DL50 y 3 DL50 de veneno tota! de L quinquestriatus hebraeus, en ambos grupos todos los ratones murieron. Las mismas dosis de veneno (1.5 DL50 y 3 DL50), pero adicionando 300 μΙ, 150, 100 μΙ o tan soto 70 μΙ del suero del caballo 43, fue aplicada a otros grupos de ratones y el resultado fue que todos los ratones sobrevivieron (Tabla 19 y Tabla 20).
Tabla 17. Ensayos de neutralización contra el veneno de Androctonus austraiis Héctor y usando el suero de caballos reforzados con el veneno total de Androctonus austraiis Héctor, Androctonus mauretanicus mauretanicus y Leiurus quinquestriatus hebraeus. Vía: intraperitoneal. Para facilidad se muestran ios resultados de solo uno de los caballos.
Proporción de ratones
Prueba DL50 de Veneno sobrevivientes respecto de Androctonus austraiis al total de ratones
Héctor inyectados
Grupo de ratones control 3 DL50
(solo se les inyectó veneno) 0/4
Ratones inyectados con 3 DL50
veneno y 300 μΙ de suero del 2/2
Caballo 43
Ratones inyectados con 3 DL«o
veneno y 100 μΙ de suero dei 4/4
Caballo 43
Tabla 18. Ensayos de neutralización contra el veneno de Androctonus mauretanicus mauretanicus y usando el suero de caballos reforzados con el veneno total de Androctonus austraiis Héctor, Androctonus mauretanicus mauretanicus y Leiurus quinquestriatus hebraeus. Vía: intraperitoneal. Para facilidad se muestran los resultados de solo uno de los caballos.
Prueba DL5o de Veneno Proporción de ratones de Androctonus sobrevivientes respecto mauretanicus mauretanicus al total de ratones inyectados
Grupo de ratones control
(solo se les inyectó veneno) 3 DL¾o 0/4
Ratones inyectados con
veneno y 300 μΙ de suero 3 DL50 2/2 del Caballo 43
Ratones inyectados con
veneno y 100 μΙ de suero 3 DL50 4/4 del Caballo 43 Tabla 19. Ensayos de neutralización contra el veneno de Leiurus quinquestríatus ebraeus y usando el suero de caballos reforzados con el veneno total de Androctonus austtalis Héctor, Androctonus mauretanicus mauretanicus y Leiurus quinquestríatus hebraeus. Vía: inlraperitonea!. Para facilidad se muestran los resultados de solo uno de os caballos.
LDgo de Veneno Proporción de ratones
Prueba De Leiurus quinquestríatus sobrevivientes respecto a! total hebraeus de ratones inyectados
Grupo de ratones
control (solo se les 1.5 LD50 0/4
inyecto veneno)
Ratones inyectados con
veneno y 300 μΙ de 1.5 LDgo 2/2
suero dei Caballo 43
Grupo de ratones
control (solo se ¡es 3 LDso 0/4
inyecto veneno)
Ratones inyectados con
veneno y 150 μΙ de 3 LD50 4/4
suero del Caballo 43
Figure imgf000049_0001
Los resultados anteriores destacan Sa eficacia del uso de los híbridos recombinantes (proteínas de fusión) de las toxinas de alacrán para generar anticuerpos neutralizantes contra el veneno de las especies de alacrán de los géneros Androctonus, Buthus, Leiurus y Parabuthus que son de las mas peligrosas en ías regiones del Norte de África, Sahel Africano, Este y Sur de África, Cercano y Medio Oriente y se prueba también, que estos híbridos recombinantes de toxinas de alacrán funcionan perfectamente como inrnunógenos y tienen ia capacidad de inducir la producción de anticuerpos neutralizantes en diferentes mamíferos desde ratones hasta caballos,
AdicionaSmente, con el objetivo de optimizar la generación de anticuerpos neutralizantes para los venenos de los alacranes peligrosos de las regiones del Norte de África, Sahel Africano, Este y Sur de África, Cercano y Medio Oriente, permitieron confirmar que las alfa-toxinas del veneno de alacranes de las regiones mencionadas se agrupan en 4 grupos aníigénicos. Esto significa que una toxina de un grupo aníigónico dado, puede inducir anticuerpos que reconocen a toxinas de ese mismo grupo pero no reconocen a toxinas de los otros grupos aníigénicos (Deiori et al., 1981 ; E! Ayeb y Pierre Delorl, 1984). Por tai razón se incluye en la presente a un representante de cada grupo antigénico: la toxina AaHI del alacrán Androctonus australis (perteneciente al grupo antigénico 1 ), ¡a toxina AaHH del alacrán Androctonus australis (perteneciente grupo antigénico 2), la toxina Bot1 del alacrán Buthus occitanus tunetanus (perteneciente ai grupo antigénico 3) y la toxina LqhlV del alacrán Leiurus quinquestriatus hebraeus (perteneciente ai grupo antigénico 4). Con esta estrategia. aunada a la capacidad inmunogénica que tienen ¡os híbridos de todas las toxinas recombinantes propuestas en ia presente, se tiene una combinación de inmunógenos recombinantes que producen sueros neutralizantes (o sus derivados) de venenos de diversas especies de alacrán de ios géneros Androctonus, Buthus, Leiurus y Parabuthus, que son de los mas peligrosos a nivel mundial.
Dicha combinación inmunogénica puede acompañarse de ai menos un excipiente farmacéuticamente aceptable para conformar una composición farmacéutica utiíizabie como inmunógeno que permita inducir ¡a generación de antivenenos contra diversas especies de alacrán.
Inmunógenos recombinantes de alacranes de México.
Para estos inmunógenos de manera similar a los anteriores, se diseñaron 2 oligonucleótidos externos y 4 internos para ensamblar a cada una de las toxinas: Cn2 de! alacrán Ceníruroides noxius, CIH deí alacrán Centruroides Iimpidus, CII2 del alacrán Centruroides iimpidus, Cssil del alacrán Centruroides suffusus, con uso preferencia! de codones de Escherichia coii. Ver figura 13. Estos oligonucleótidos se sintetizaron mediante síntesis química, en la unidad de síntesis de oügonucleótidos del Instituto de Biotecnología de la UNAM. Véanse Figuras 14A-14D.
Realizamos el ensamble de la secuencia nucleotídica mediante PCR recursivo y la donación del producto en el vector pBluescriptKS(-)tal y como se describió para el grupo de antígenos recombinantes del primer grupo. Las construcciones fueron secuenciadas para verificar que el ensamble y secuencia clonada de cada toxina fuera correcta. Se muestra un ejemplo con la toxina Cn2 en la Figura 15. De manera similar al grupo anterior, se preparó el vector de expresión pET22b-Tiorredoxina-sitio de corte para Enterocinasa. (Ver Figura 18).
Las secuencias que codifican para cada toxina de Centruroides clonada en el vector pBluescriptKS (-), descritas anteriormente, fueron usadas como templados para obtener los genes de las toxinas mediante subclonación en el vector de expresión pET22b-Thío. La inserción en este vector de expresión de los genes que codifican para ¡as toxinas, se realizó de la misma manera que la descrita para el grupo de recombinantes anteriores.
Cada uno de ios vectores de expresión conteniendo el gen codificante para la toxina fue eiectroporado en £. coü cepa BL21 (DE3) de la misma manera que ia ya descrita para el primer grupo de antígenos. El proceso de expresión se inició al crecer un preinóculo en medio LB con ampiciiína, Después de crecer el cultivo hasta una DO entre 0.7-1 , determinada a 600 nm, se indujo la expresión con IPTG (Isopropyl p-D~1 ~ thiogalactopyranoside) durante 6 a 12 h a 30 °C. El cultivo se centrifugó a 5,000 x g durante 10 min a 4 °C en tubos para centrifuga de 250 m!, con el fin de obtener todo el precipitado celular. Se congelaron las células -20°C, hasta su uso. Se procedió a obtener un extracto periplásmico bacteriano conteniendo a la proteína de fusión expresada, de la misma manera descrita anteriormente. Este extracto se utilizó para la purificación de la proteína utilizando columnas de afinidad.
Las proteínas de fusión expresadas se purificaron mediante cromatografía de afinidad y HPLC, tal y como se describió para el grupo anterior, Las proteínas se eluyeron con 400 mM de imidazol en PBS 1X (véase ejemplo en la Figura 15 (A) III). Los péptidos obtenidos fueron separados en una columna C18 (25mm x 4.1 mm) con un gradiente de 20 a 80% de solvente B en un lapso de 40 min y se colectaron manualmente por monitoreo de absorbancia a 230 nm (Figuras 17A-17D).
Las proteínas fueron separadas por electroforesis en un gel discontinuo de poliacrilamída en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE), por el método también ya descrito anteriormente Véase como ejemplo la Figura 15 A.
Las digestiones de las proteínas de fusión de centruroides, se realizaron con la proíeasa enterocinasa {EK}, también se obtuvieron sus masas moleculares mediante MALDI-TOF o ESI-ION-TRAP como ya se describió para otras proteínas. Los ensayos de ELISA también se realizaron de manera similar a la descrita y Sos resultados se muestra en la Figura 15 (B) y en la Figura 18.
La actividad tóxica de cada antígeno recombinante de fusión (híbrido) de centruroides, fue evaluada la cepa murína CD1 , a los cuales se les inyectó vía intra perifonea i la cantidad de proteína de fusión calculada para contener el equivalente a diez veces ia dosis letal media (DL50) reportada para cada toxina, E! resultado obtenido fue que a esa concentración la proteina no ejerce ningún efecto tóxico sobre el ratón, debido a que ia toxina al tener fusionada a la tiorredoxina en su extremo N-terminal, afecta su actividad sobre los canales de sodio probablemente por impedimento estérico. Sin embargo, el hecho de que como proteína de fusión la toxina no sea tóxica es precisamente una de las principales ventajas al utilizaría corno antígeno, ya que al inmunizar animales no hay peligro de que el anima! sujeto al proceso de inmunización sufra el efecto tóxico de ia recombinante, permitiendo de esta forma inmunizarlos con aítas dosis del antígeno.
Si bien que para los experimentos de neutralización se utilizaron los venenos totales de tos animales inmunizados con las toxinas recombinantes, también se purificaron las toxinas correspondientes, con la posibilidad de ensayadas separadamente. En en el caso de que los anticuerpos generados no fueran capaces de proteger en contra deí veneno tota!, ai menosse sabría si neutralizan a ¡as toxinas. Sin embargo, los resultados obtenidos como se demuestra a seguir fueron excelentes y no se necesitó usar las toxinas puras. No obstante ío anterior, los protocolos fueron ejecutados y la toxina Cn2 del alacrán Ceníruroid&s noxius fue purificada de acuerdo a la metodología reportada en: Zamudio et ai., 1992. Las toxinas CII1 y CII2 fueron purificadas de acuerdo a la metodología reportada en: Ramírez et al. ,1994. La toxina Cssii fue purificada de acuerdo a la metodología reportada en Martin et al., 1987. Para los ensayos de neutralización se inmunizaron iniciaimente grupos de 10 ratones de la cepa CD1 de 17 g en promedio (ver esquemas de inmunización 1 , 2 y 3 siguientes). Los inmunógenos utilizados fueron las proteínas de fusión r(toxina)Hís (SEC ID No. 25 - SEC ID No. 28). La inyección de las toxinas se realizó por via subcutánea. La emulsión se preparó con ia toxina disuelta en PBS IX con adyuvante completo de Freund (aceite mineral y micobacterias muertas) en la primera inmunización, e incompleto (aceite mineral) o alúmina en las siguientes inmunizaciones. La inmunización se realizó inyectando la toxina en 100 μί de solución por ratón en cada ocasión, con un periodo de aproximadamente 10 días entre inmunizaciones. Se comprobó ia generación y el incremento de anticuerpos en suero contra el veneno total y las toxinas nativas por ensayos de ELISA (ver ejemplo en la Figura 19). Después de ia última inmunización se realizaron pruebas de neutralización en ratones usando de 1 a 3 DL50. Ver Tablas 21 a 25.
A continuación se describe el esquema de inmunización 1 que se llevó a cabo utilizando 2 grupos de 8 ratones de ia cepa CD1. Uno de los grupos se inmunizó con la proteína de fusión de ia toxina Cn2 recombinante de Centruroides noxius, y otro grupo con la proteína de fusión de la toxina CII1 recombinante de C. linipidus ümpidus. Los 15 \ig inyectados. corresponden a la cantidad de toxina Cn2 presente en la proteína de fusión:
1a inmunización: 15 ο + Adyuvante completo 10 días
T inmunización: 15 μ + Adyuvante incompleto 10 días
3a inmunización: 15 μ + Adyuvante incompleto 10 días
(sangrado para evaluar titulación def suero) 4a inmunización: 15 + Adyuvante incompleto 10 días
5" inmunización: 15 + Adyuvante incompleto 10 días
obtención de suero
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1 DL50 de Cn2= 0.25 § de toxina Cn2 por cada 20 gr de ratón
2 DL50 de Cn2= 0.50 μ§ de toxina Cn2 por cada 20 gr de ratón
Tabla 22. Neutralización de la toxina nativa CEU , utilizando suero de ratones inmunizados con la proteina de fusión de CII1 recombinante.
Suero inmunizado Proporción de
Prueba DLso de CII1 con la proteína de ratones
nativa fusión TEkCIH His Sobrevivientes
respecto a los ratones inyectados
Grupo de ratones
control 2 DL50 de CII1 - 1/4
(solo se les inyectó
toxina)
Grupo de ratones
inyectados con 2 DL50 de CÜ1 250 μ! 6/6 mezcla
de toxina y suero de
ratones inmunizados
con
CII1 1 DLso de 0111= 1 ,73 μο de toxina CII1 por cada 20 g de ratón (determinada en ratones cepa Balb/C, por la Dra. Georgina Curróla, IBT-UNAM)
2 DL50 de Cil1 = 3.46 μ§ de toxina CII1 por cada 20 g de ratón
Como puede observarse en los resultados de las Tablas 21 y 22, tanto la proteína de fusión con la toxina Cn2 recombinante, como la proteína de fusión con la toxina CII1 recombínante, funcionan como excelentes inmunógenos ya que tienen la capacidad de inducir en ios ratones inmunizados la producción de anticuerpos neutralizantes de las respectivas toxinas nativas Cn2 o CII1 (aisladas directamente del veneno de C. noxius o C. Hmpidus iimpidus, respectivamente). En el caso dei suero de ratones inmunizados con ¡a proteina de fusión de la toxina Cn2, este tiene la capacidad de neutralizar 2 y 3 DL50 de toxina nativa Cn2 (Tabla 21 ) y los ratones a los cuales se les inyectó la mezcla de toxina Cn2 nativa y el suero de los ratones inmunizados no presentaron síntomas de intoxicación.
Respecto al suero de ratones inmunizados con la proteina de fusión de la toxina CII1, éste tiene la capacidad de neutralizar 2 DLSo de toxina nativa OH (Tabla 22) y los ratones a los cuales se ¡es inyectó la mezcla de toxina CI11 nativa y el suero de los ratones inmunizados tampoco presentaron síntomas de intoxicación.
Con el éxito de ¡os resultados anteriores, se decidió realizar otro esquema de inmunización con la proteína de fusión de la toxina Cn2, con el objetivo de evaluar la capacidad del suero neutralizante y evaluarlo contra el veneno total de C. noxius. Se realizó el siguiente esquema (2) de inmunización:
Esquema de inmunización 2 en ratones (CD1 ) ensayando el híbrido de la toxina Cn2 de Centruroides noxius:
Toxina ( ,g) (tipo)
Sangría tota! §3 Tabla 23. Reto de ratones inmunizados con el híbrido de la toxina Cn2
DL50 de Veneno
Prueba Proporción de ratones sobrevivientes de Cen uroides
respecto ai total de ratones inyectados noxius
Grupo de ratones control
(solo se íes inyectó 3 DLso 0/3
veneno)
Grupo de ratones
inmunizados con la toxina 3 DL50 9/10
recombinante Cn2 Siguiendo el esquema de inmunización descrito anteriormente, detallaremos los resultados obtenidos con el híbrido (proteína de fusión) de la toxina recombinante Cn2 de Centruroidles noxius. Primero, se inmunizaron 10 ratones de la cepa CD1. Se comenzó inyectando 5 μ9 de hibrido rCn2His hasta llegar a 25 μ9 en la ultima inoculación, en un volumen final de 100 μΙ de solución. Con ei fin de evaluar la efectividad de ios anticuerpos generados por los ratones inmunizados, estos mismos se retaron directamente (mediante inyección) con veneno total de C. noxius. Para el reto se usaron un grupo control de 3 ratones (a ios cuales se les inyectó solo veneno total de C. noxius) y el grupo de los ratones previamente inmunizados. Los ratones fueron inyectados por vía subcutánea con 3 DL50 de veneno tota! de C. noxius en un volumen final de 200 μΙ de PBS. En este ensayo murieron todos los ratones del grupo control mientras que en ei grupo de los ratones previamente inmunizados únicamente murió uno de los 10 ratones (Tabla 23). Los 9 ratones inmunizados y retados con el veneno total de C. noxius que sobrevivieron (Tabla 23) fueron sangrados 48 horas después del reto para determinar los títulos de anticuerpos presentes en ei suero obtenido. La inmunización dio como resultado la generación de anticuerpos que reconocen específicamente a la toxina recombinante Cn2 y al veneno total. La titulación de los sueros por ELISA, reveló que ios títulos finales de la mezcla de suero, de los 9 ratones sobrevivientes, fueron de 18997 contra el hibrido de la toxina Cn2 recombinante y de 9165 contra el veneno total (Figura 19).
Dado el éxito obtenido con el híbrido de la toxina Cn2 y sus propiedades inmunogénicas para generar suero neutralizante del veneno total de C. noxius, se decidió realizar otro esquema de inmunización con una mezcla de la proteína de fusión de la toxina CII1 y la proteína de fusión de la toxina C¡!2, con el objetivo de evaluar la capacidad del suero neutralizante generado y evaluarlo contra el veneno total de C, ¡impidas ümpidus. De manera similar, se inmunizaron ratones con la protefna de fusión de la toxina Cssll, con el objetivo de evaluar la capacidad neutralizante del suero generado contra el veneno total de C. sufíusus suffusus. En ambos casos se siguió el siguiente esquema (3) de inmunización:
Esquema de inmunización 3 en ratones (CD1 ) empleado con la mezcla de los híbridos de ¡as toxinas CH1 y CII2 de Centruroides ümpidus límpidas y para la toxina Cssll de Centruroides suffusus suffusus:
Toxina {μ§) total m 10
3
6 DIc 2010
16 Dic 2010
Figure imgf000056_0001
Nota: se determinó previamente la DL5Ü para ei veneno usado en esta prueba: 1 DL50 por 20 g peso de ratón, Vía intraperitoneal. 5 b
Figure imgf000057_0001
Nota: 1 DL50 de veneno de C. suffusus suffusus = 10.3 μg por 20 g peso de ratón. Vía intraperitonea!.
Una vez concluido el esquema de inmunización se decidió retar directamente a los ratones inmunizados con el veneno total correspondiente. Para eí caso del reto con el veneno total de C, Iimpidus iimpidus, se utilizó un grupo control de 6 ratones a los cuales se les inyectó 1 DLso de veneno de C. Iimpidus Iimpidus y un segundo grupo integrado por 8 de ios ratones inmunizados con ia mezcia de los híbridos de ias toxinas Cl!1 y CII2, a los cuales se les inyectó directamente 1 DL50 de veneno de C, Iimpidus iimpidus. Dos de ios seis ratones del grupo control murieron pero los cuatro ratones restantes presentaron síntomas graves de intoxicación por mas de 24 horas (Tabla 24). En el grupo de los ratones inmunizados retados con el veneno, soio murió un ratón pero este sobrevivió tres horas mas con respecto a los ratones que murieron en el grupo controi (Tabla 24). Los 5 ratones sobrevivientes no presentaron sintomatoiogía grave de intoxicación, Este resultado sugiere que los híbridos de las toxinas recombinantes CII1 y CÍI2 funcionan como inmunogenos y son capaces de generar en el anima! inmunizado, anticuerpos que reconocen a las toxinas nativas CII1 y CII2, respectivamente y por lo tanto logran neutralizar eí veneno del alacrán C. iimpidus iimpidus.
De la misma forma se evaluó el híbrido de ia toxina Cssll recombinante y su capacidad de generar anticuerpos neutralizantes contra el veneno total de Centruroides suffusus su usus. Para el objetivo mencionado se inmunizaron 10 ratones de la cepa CD1 bajo el esquema de inmunización anterior: Se realizaron 6 inmunizaciones vía subcutánea inyectando 30 μg de rCssilHis en cada una de ellas, en un volumen final de 100 μΙ de solución de PBS 1X. Se obtuvieron dos sangrías a ¡o largo de las inmunizaciones para estimar y comparar los anticuerpos que iban generando los ratones. Una vez terminado el protocolo de inmunización, se evaluó la efectividad de los anticuerpos generados retando a ios ratones inmunizados con veneno total Se usaron como control un grupo de 3 ratones de aproximadamente 20 gramos. Los ratones fueron inyectados por vía intraperitoneal con 3 DL50 de veneno total de Centruroides suffusus suffusus en un volumen final de 200 μ! de PBS 1X. No se observó sobrevivencia de ninguno (¡o que era esperado pues se usaron 3 DL5r>) de los ratones control mientras que de los ratones retados, sobrevivió el 100% (Tabla 25). Los ratones inmunizados y que sobrevivieron al ser retados con el veneno de C. suffusus suffusus, fueron sangrados 48 horas después del reto para determinar el título de tos anticuerpos generados y esto se determinó mediante ensayo de ELISA utilizando a la toxina rCn2 y al veneno total como antígenos, el título de los anticuerpos generados. Los títulos finales de la mezcla de suero de los 10 ratones fueron de 11 ,011 contra la toxina de fusión con Cssll recombinante y de 1 ,890 contra el veneno total (Figura 20).
Los resultados anteriores permiten concluir que las toxinas recombinantes fueron capaces de inducir la generación de anticuerpos neutralizantes y con ello proteger a los ratones contra de la intoxicación por veneno de alacranes de este género,
fnmunógenos recombinantes de alacranes de Sudamérica.
También se diseñaron oíigonucleótidos externos e internos para ensamblar los segmentos de DNA que codifican para cada una de ías 3 toxinas del veneno del alacrán Tityus serrulatus: Ts1 , Ts3 y TsNTXp del alacrán Tityus serruiatus con uso preferencia! de codones de Escherichia cois. Ver figuras 21 y 22. Estos oíigonucleótidos se sintetizaron mediante síntesis química. Véase Figuras 23A-23C.
Realizamos el ensamble de Sa secuencia nucleotídica mediante PCR recursívo y su clonación en el vector pBluescriptKS{-)tai y como se describió para los antígenos recombinantes anteriores. Las construcciones fueron secuenciadas para verificar que el ensamble y secuencia clonada de cada segmento de DNA que codifica para la toxina corespondiente fuera correcta. De manera similar al grupo anterior, se preparó el vector de expresión pET22b-Tiorredoxina que contiene también un sitio de corte para la enzima enteroquinasa. La inserción en este vector de expresión, de ios segmentos de DNA que codifican para las respectivas toxinas, se realizó de la misma manera que ia descrita para las recombinantes anteriores. Ver Figura 24.
Cada uno de los vectores de expresión conteniendo el gen codificante para ia toxina fue etectroporado en E. coli cepa BL21 (DE3) también de la misma manera que la ya descrita para ios antígenos anteriores. Se procedió a obtener un extracto periplásmico bacteriano conteniendo a la proteína de fusión bajo el control deS promotor T7. Este extracto se utilizó para la purificación de la proteína utilizando columnas de afinidad. Véase ejemplo en la figura 25,
Las proteínas de fusión expresadas se purificaron mediante cromatografía de afinidad y HPLC, tal y como se describió para el grupo anterior, Las proteínas se eluyeron con 400 mM de imidazoí en PBS 1 X (véase ejemplo en la Figura 25 (A) III). Los péptidos obtenidos fueron separados en una columna C18 (25mm x 4.1 mm) con un gradiente de 20 a 80% de solvente B en un lapso de 40 min y se colectaron manualmente por monitoreo de absorbancia a 230 nm (Figuras 26A-28C).
Las proteínas fueron separadas por electroforesis en un gel discontinuo de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes(SDS-PAGE), por el método también ya descrito anteriormente Véase como ejemplo la Figura 25 A.
Las digestiones de las proteínas de fusión de Tityus se realizaron con la proteasa enterocinasa (EK), también se obtuvieron sus masas moleculares mediante MALDI-TOF o ESI-.ION-TRAP como ya se describió. Los ensayos de ELISA también se realizaron de manera similar a la descrita y los resultados se muestran en la Figura 27.
La actividad tóxica de cada antígeno recombinante de T. serruiatus fue evaluada en ratones cepa CD1 , a los cuales se les inyectó vía intraperitoneal diez veces la dosis DL50 reportada para cada toxina. El resultado obtenido fue que a esa concentración la proteína no ejerce ningún efecto tóxico sobre el ratón, debido a que la toxina ai tener fusionada a la tiorredoxina en su extremo N~termina¡, afecta su actividad sobre los canales de sodio probablemente por impedimento esférico. Sin embargo, el hecho de que co o proteína de fusión la toxina no sea tóxica es una de las principales ventajas al utilizarla como antígeno, ya que al inmunizar animales no hay peligro de que el animal sujeto al proceso de inmunización sufra el efecto tóxico de la recombinante, permitiendo de esta forma inmunizarlos con altas dosis del antígeno.
Para los ensayos de neutralización, primero se inmunizaron 10 ratones de la cepa CD1 de 17 g en promedio (ver Esquema de inmunización 1). El inmunógeno utilizado fue la proteína de fusión de Tsi (SEC ID No1a). La inyección del Inmunógeno se realizó por vía subcutánea. La emulsión se preparó con la toxina disuelta en PBS al 1X con adyuvante completo de Freund en la primera inmunización, e incompleto (aceite mineral) o alúmina en las siguientes inmunizaciones. La inmunización se realizó inyectando la toxina en 100 μΙ de solución por ratón en cada ocasión, con un período de aproximadamente 10 días entre inmunizaciones. Se comprobó la generación y el incremento de anticuerpos en suero contra el veneno total y las toxinas nativas por ensayos de ELISA. Esquema de inmunización 1 : Inmunización de ratones cepa CD1 con ¡a proteina de fusión de Ts1 de Tityus serrulatus.
Figure imgf000060_0001
1 13 0c! 2012 10 30 Completo
2 25 Oct 2012 10 30 Incompleto
3 4 Nov 2012 10 30 Alúmina
4 16 Nov 2012 10 30 incompleto
5 26 Nov 2012 10 30 Alúmina
6 6 Dic 2010 10 30 Incompleto
Reto 16 Dic 2010
Sangría tota! 21 Dic 2010
Después de la última inmunización se realizaron pruebas de neutralización de 1 y 3 DL50 de veneno (ver Tabla 28).
Figure imgf000060_0002
Nota: 1 DL50 de veneno de T. Serrulatus- 13.2 μ por 20 g peso de ratón, Via intraperitoneal.
Como puede observarse en los resultados de neutralización del veneno tota! de Tityus serruiatus (Tabla 26), el híbrido de la toxina Ts1 recombinante funciona como inmunogeno, ya que seis de los siete ratones inmunizados con esta proteina sobrevivieron al ser refados directamente con 1 DL50 de veneno tota! de T. serrulatus. Dos de los ratones inmunizados con el híbrido de ¡a toxina Ts1 no sobrevivieron a! ser retados directamente con 3 DL50 el veneno total, pero esto era de esperarse ya que como se mencionó en la introducción de este documento, existen otras toxinas en el veneno de T. serruíatus que participan de manera importante en el envenenamiento por ia picadura de este alacrán,
Con el fin de obtener un suero mas potente y capaz de neutralizar e! veneno de Tityus serruiaíus, se propuso un esquema de inmunización en conejos. Con la finalidad de neutralizar no solo a ¡a toxina Ts1 presente en dicho veneno sino a otras toxinas importantes, se decidió emplear, como inmunógenos, los híbridos de las toxinas recombinantes Ts1 , Ts3 y TsNTxP. Para este fin, se inmunizaron tres conejos Nueva Zelanda de 2.5 kg, con ia mezcla de los tres inmunógenos recombinantes, la administración fue vía subcutánea, inyectando la mezcla de toxinas recombinantes en un volumen final de 500 μΙ de PBS 1X.
Los 3 conejos (números 33, 34 y 38) se inmunizaron, como se mencionó anteriormente, con la mezcla de las toxinas recombinantes Ts1 , Ts3 y TsNTxP del Alacrán Tityus serrulatus (ver esquema de inmunización 2), En el caso del conejo 33 se realizaron solo 6 inmunizaciones con la mezcla de las toxinas recombinantes y los conejos 34 y 38 recibieron además 3 inmunizaciones adicionales con veneno de Tityus serru!atus (ver esquema de inmunización 3). Las inmunizaciones se aplicaron con un lapso aproximado de 10 días entre ellas. Esquema de inmunización 2: Inmunización de los conejos 33, 34 y 36, con la mezcla de los híbridos de toxinas recombinantes Ts1 , Ts3 y TsNTxP del alacrán Tityus serrulatus.
Figure imgf000061_0001
2a inmunización incompleto 250 30 500
Figure imgf000061_0002
58 inmunización Alúmina 250 80 500 β3 inmunización 80 500 Únicamente Sos conejos 33 y 34 recibieron 3 refuerzos de veneno total como se muestra el siguiente esquema:
Esquema de inmunización 3: refuerzos con veneno a los conejos 34 y 38.
REFUERZO CON VENENO TOTAL
Adyuvante {≠ Veneno μί subcutáneo/
7S ¡inmunización Alúmina 250 30
8a inmunización incompleto 250 30
9a inmunización Alúmina 2513 30
Después del último refuerzo, ya sea con la mezcla de los híbridos de las toxinas recombinantes, para el caso de¡ conejo 33, o con refuerzo de veneno total, para el caso de los conejos 34 y 35, se realizaron ensayos de ELISA con el suero de los conejos, para observar el reconocimiento de los anticuerpos generados por las inmunizaciones contra las toxinas recombinantes y contra el veneno de Títyus serru!atus. Un ejemplo de esta evaluación puede verse en ia Figura 27,
Posterior a los ensayos de ELISA, se evaluó la capacidad neutralizante de cada uno de los sueros de ios conejos inmunizados con las toxinas recombinantes en contra del veneno de Tityus serrulatus (ver Tabla 27}. A continuación se muestra los datos del ensayo de neutralización y los resultados obtenidos:
Tabla 27. Ensayos de neutralización con veneno de Tityus serruiatus utilizando el suero de los conejos inmunizados con la mezcla de los híbridos de las toxinas recombinantes Ts1 , Ts3 y TsNTxP.
DLso de Proporción de ratones
Prueba veneno de sobrevivientes respecto a los
Tityus ratones inyectados
serruiatus
Grupo de ratones control
(solo se les inyectó veneno) 2 DLso 0/6
Grupo de ratones inyectados con
veneno y suero del e©n@jo 33 2 DL50 0/6
Grupo de ratones inyectados con
veneno y suero del conejo 34 2 DL50 5/8
Grupo de ratones inyectados con
veneno y suero del conejo 36 2 DLso e/6
Grupo de ratones control 3 DLso 0/6
(solo se les inyectó veneno)
Grupo de ratones inyectados con
veneno y suero del conejo 34 3 DLso 1/6
Grupo de ratones inyectados con
veneno y suero del conejo 36 3 DLso 6/6
1 DL50 =13.2 pg/ 20g ratón; 2 DL50 = 28.4 pg/ 20g ratón; 3 DL50 = 39,6 pg/ 20g ratón
Stock veneno = 2.5 pg/pl.
Con base en los resultados de neutralización mostrados en la Tabla 27, puede notarse que, como era de esperarse, los grupos de ratones control que fueron inyectados con 2 DL50 ó 3 DL50 de veneno total de Tityus serruiatus, todos murieron.
El suero del conejo 36, fue el mejor en cuanto a capacidad neutralizante, ya que se pudieron neutralizar tanto 2 DL50 como 3 DLS0 de veneno total de Tityus serruiatus. Este resultado indica que la mezcla de los híbridos recombinantes de ias toxinas Ts1 , Ts3 y TsNTxP induce una buena respuesta inmune, la cual se ve incrementada al aplicar veneno tota! en los últimos refuerzos de inmunización. Es importante señalar que solamente dos inmunizaciones con veneno total no serian suficientes para lograr ¡os títulos de anticuerpos encontrados con el uso de las mezclas de ¡as proteínas de fusión. Es evidente que las toxinas de fusión descritas enriquecen la respuesta inmunológica.
Con el objetivo de no utilizar ningún refuerzo extra de veneno en ¡as inmunizaciones, se planteó la estrategia de inmunizar solo con ¡as toxinas recombinantes Ts1 , Ts3 y TsNTxP, pero sin protefna de fusión (tiorredoxina), por lo cual se decidió expresarlas en el sistema de expresión pQE30. Se produjeron las proteínas recombinantes solo fusionadas a 8-His y al sitio de corte para enterocinasa (EK) de manera contigua para conferir estabilidad y un piegamiento adecuado. Con esto se espera que al inmunizar con ellas se enriquezca más la respuesta inmunológica, o mejor aún, no se requiera refuerzo con veneno total. Al final se obtendrían sueros con mayor potencia en su capacidad neutralizante. Esta alternativa fue exitosa en el caso de la expresión de las toxinas Pg8 y Cssll (ambas toxinas protegidas con sus respectivas patentes García-Gómez et al., 2008 y Corzo-Burguete et al., 2011 ).
Para expresar las toxinas Ts1 , Ts3 y TsNTxP, sin la proteína de fusión, se decidió utilizar el sistema de expresión en el vector pQE30 que como mencionamos, fue exitoso en el caso de la expresión de la toxina Pg8 y Cssll (ambas toxinas protegidas en sus respectivas patentes García-Gómez et al., 2008 y Corzo-Burguete et al, 2011 ). Esto con el objetivo de centralizar la generación de anticuerpos neutralizantes enriquecidos solo contra ¡as toxinas recombinantes Ts1 , Ts3 y TsNTxP.
La secuencia nucleotídica del gen que codifica para el péptido Tsl , del alacrán Tityus serrulaíus con uso preferencial de codones de E. coit y su traducción en aminoácidos es la siguiente:
K E G L M D H E G C K L S C F I
aaa gaa ggc ta T. ctg atg gat cat: gaa tgc aaa ctg age tgc ttt att ttt ctt ccg ata gac tac cta gta ctt ccg acg ttt gac teg acg aaa taa
R P S G Y C G R E C G I G S S
cgc ccg age ggc tat tgc ggc cgc ¾3. tgc ggc att aaa aaa ggc age age
ggc teg ccg ata acg ccg gcg ctt acg ccg taa ttt ttt ccg teg teg
Q Y C A W F A C y C Y G L P N W V
ggc tat tgc gcg tgg ccg gcg tgc tat tgc tat ggc ctg ccg aac tgg gtg ccg acg cgc acc ggc cgc acg ata acg ata ccg gac ggc ttg acc cae aa gtg tgg gat cgc gcg acc aac aaa tqc
tt cac acc cta gcg cqc tgg ttg ttt acg
La secuencia nucleotídica del gen que codifica para el póptido TsNTxP, dei alacrán Tityus serrulatus con uso preferenciai de codones de E. coü y su traducción en aminoácidos es la siguiente:
6 R E G Y P Λ D S G C K ϊ T C F
ggt cgt Q33 ggt tac ceg gcg gac tet ggt gc aaa ate acc tgc ttc cea gca ctt cea atg ggc cgc ctg aga tt cea acg tag tgg acg aag
L T A A G Y C N T E C T L K X G S
ctg acc gcg gcg ggt tac tgc aac acc gaa tgc acc ctg aaa aaa ggt tet gac tgg coc cgc cea atg acg ttg tgg ct acg tgg gac ttt ttt cea aga s G Y C A W P A C Y c Y G L P D S
tet ggt tac tgc gcg tgg ceg gcg tgc tac. tgc tac ggt ctg ceg gac tet aga cea atg acg cgc acc ggc cgc acg atg acg atg cea gac ggc ctg aga
V ϊ w T s E T N K C G
gtt aaa ate tgg acc tet gaa acc aac aaa tgc ggt
caá teg acc tec aga ctt tgg ttg ttt acg cea
La secuencia nucieoiídica del gen que codifica para ¡a toxina Ts3, del alacrán Tityus serrulatus con uso preferencia! de codones de £. coü y su traducción en aminoácidos es la siguiente:
K K D G Y P V I Y D N C A Y X C W
a a aaa gac ggt tac ceg gtt gaa tac gac aac tgc gcg tac ate tgc tgg ttt ttt ctg cea atg ggc cgg ctt atg ctg ttg acg cae atg tag acg acc
M Y D N A Y C D L C K D K A D
aac tac gac aac gcg tac tgc gac aaa ctg tgc aaa gac aaa aaa gcg gac ttg atg ctg ttg cgc atg acg ctg ttt gac acg ttt ctg ttt ttt cgc ctg
S S Y C Y W V H Ϊ L C Y C Y G L P
tet ggc tac to tac tgg gtt cac ate ctg c tac tgc tac ggt ctg ceg aga ceg atg acg atg acc C3ci gtg tag gac acg atg acg tg cea gac ggc D S E P T T N G K C K S
gac tct gaa ccg acc aaa acc aac ggt aaa tgc aaa tct
ctg aga ctt ggc tgg ttt tgg ttg cca ttt acg ttt aqa Una vez obtenido el gen recombinaníe por PCR que codifica para Ts1 , se analizó la secuencia nucleotídíca para observar el uso preferencial de codones de E. col! y el resultado de este análisis puede verse en la Figura 21.
El vector utilizado para su expresión fue el vector pGE-30 (QIAGEN) y la cepa Bacteriana: Escherichia coli Origami. En la figura 28 se muestra unb esquema de la construcción del vector de expresión. Para la donación en pQE30 se realizó PCR recursivo. El ensamble de cada gen se realizó utilizando Vent DNA Polymerase (New England Biolabs, USA), siguiendo las instrucciones del proveedor. Los dos oligonucieótidos externos se usaron a una concentración final de 0.2 pmol/μΙ y los oligonucieótidos internos a una concentración de 0.02 pmoi/μΙ. Las condiciones de PCR fueron: 5 min a 94t!C, seguido por 8 ciclos con una temperatura baja de alineamiento (94°C 30 seg, 50°C 1 min ,72°C 1 min), y luego 25 ciclos cortos con una temperatura alia de alineamiento (94°C 30 seg, 55°C 30 seg, 72°C 30 seg), finalizando con 10 min de incubación a 72°C.
Los productos de PCR se separaron en un gel de agarosa al 1 % y purificados con el kií QIAQuick gel extractíon kií (QIAGEN, USA). Se empleó la enzima T4 DNA ligasa (Fermentas, Canadá) para clonar los productos de PCR dentro del vector pQE30 (digeridos previamente con las enzimas Ba Hl y Pst\; New England BioLabs, USA), Con el producto de la ligación se transforma a las células electrocompetentes DH5a y subsecuentemente son plaqueadas en cajas Petri con medio 2xYT adicionado con ampiciiina (200 pg/ml). Las clonas resultantes se verifican por PCR con los oligonucieótidos pQE30Forw (5!-GAG CGG ATA ACA ATT ATA A-3") y pQE30Rev (5 -GGT CAT TAC TGG ATC TAT-3'). Las clonas que por PCR dieron el tamaño esperado (-250 pb), se amplificaron y el DNA plasmidico se purificó por medio del método de lisis alcalina.
Las construcciones se secuenciaron para verificar que la secuencia clonada que codifica para cada toxina se encuentre en el marco de lectura correcto. A continuación se muestran las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos correspondientes a cada una de las toxinas recombinantes clonadas en el vector de expresión pQE30.
M~8His-Fxa-Tsi (77 aa)
Peso Molecular = 8744.9 Da
SEQ ID NO: 38
M R G S H H H H H H G S I E G R K E G Y atgagaggatcgcatcaccatcaccatcacggatccatcgagggaaggaaagaaggctat
L M D H E G C K L S C F I R P S S Y C G
ctgatggatcatgaaggctgcaaactgagctgctttattcgcccgagcggctattgcggc
R E C G I K K G S S G Y C A W P A C Y C
cgcgaatgcggcattaaaaaaggcagcagcggctattgcgcgtggccggcgtgctattgc
Y G L P N V K V D R A T N K C
tatggcctqccqaactgggtgaaagtgtgggatcgcgcgaccaacaaatgc
M-6His-EK-Js% (82 aa)
Peso Molecular = 9499.4 Da
SEQ SD NO: 37
M R G S H H H H H H G 5 G D D D D K K atgagaggatcgcatcaccatcaccatcacggatccggtgatgacgatgacaaaaaaaaa D G Y P V E Y D N C A Y I C N Y D H A
gacggttacccggttgaatacgacaactgcgcgtacatctgctggaactacgacaacgcg
Y C D K L C D K K A D S G Y C Y W V H
tactgcgacaaactgtgcaaagacaaaaaagcggactctggctactgctactgggttcac
I L G Y C Y G L P D S E P T K T N G C
atcctgtgctactgctacggtctgccggactctgaaccgaccaaaaccaacggtaaa gc S
aaatct
M-6H/s-£ -TsNTxP (81 aa)
Peso Molecular = 8748.7 Da
SEQ ID NO: 38
M R G S H H H H H H G S G D D D D K G R
atgagaggatcgcatcacea caceatcacggatccggtgatgacgatgacaaagg bcgt E G Y P A D S K G C K I T C F L T A A G
gaaggttacccggcggactctaaagg tgcaaaatcacctgcttcctgaccgcggcgggt
Y C N T E C T L K K G S S G Y C A W P A
tactgcaacaccgaatgcaccctgaaaaaaggttcttctggttactgcgcgtggccggcg
C Y C Y G L P D S V K I W T S E T N K C
tgctactgctacggtctgccggactctgttaaaatctggacctctgaaaccaacaaatgc G
ggt
Para ia expresión de las toxinas recombinantes IV1~8His-FXa-Ts1, -6His-FXa-Ts3 y IV1-8His- FXa-TsNTxP, se utilizó a ¡a cepa E. coii Origami, transformada mediante choque térmico. Después de que el cultivo ¡legó a la DO recomendada, se indujo ¡a expresión de las recombinantes con ¡PTG a una concentración final de 0.5 mM y se mantuvo el crecimiento por 6 a 8 h más a 30 °C agitando a 120 rprn. Posteriormente, se centrifugó a 6,500 x g durante 5 min a 4 °C en botellas para centrífuga de 250 mi. El paquete celular se lavó con 200 mi de una solución de Tris 50 mM, pH 8 y se centrifugó nuevamente a 8,500 x g por 5 min a 4 °C. Se desechó el sobrenadante y las células se resuspendieron en 25 mi de la misma solución adicionada con 0.3 mg lisoz¡ma/ml. Las células se rompieron utilizando 3 ciclos de sonscación de 8 minutos con pulsos de 40 s y 20 s de reposo permitiendo 10 minutos entre cada ciclo, las muestras se mantuvieron en hielo durante todo el proceso. El extracto se centrifugó a 8,000 x g por 20 min, y se eliminó e¡ sobrenadante (Fracción soluble). La pastilla celular se lavó con 20 mi de Tris 20 mM pH 8, se centrifugó a 8000 x g por 15 min, se eliminó el sobrenadante y se realizaron dos lavados más. La pastilla resultante se trató con 15 mi de una solución desnaturalizante de Tris 50 mM, 6 M de cloruro de guanidina a pH 8 y agitación suave, para extraer la proteína insoluble que se aglomera como cuerpos de inclusión. Finalmente la preparación se centrifugó a 8,000 x g a 4 °C durante 1h. La proteina de interés se obtiene tanto en forma insoluble como soluble, por ¡o que se purifica la proteina de ambas fracciones.
Para ¡a purificación de las proteínas recombinantes de fusión presentes en la fracción soluble, se siguió el protocolo de afinidad a Níquel (QIAexpress® System, QUIAGEN), aprovechando que las proteínas de fusión a las toxinas contienen en e! extremo N-terminal una cola de histidinas las cuales son afines al níquel y nos permiten separarlas fácilmente de otras proteínas de E. coii. La metodología fue la siguiente: 1. Preparar una mini columna conteniendo 1.5 mi de resina de Níquel-NTA Agarosa (Qiagen).
2. Equilibrar cada columna con 10 volúmenes de buffer 20 rnM de imidazoí en 50 m Tris-HCI pH 8.0.
3. Cargar ¡as muestras de proteína en ia columna y dejar fluir por gravedad hasta pasar el total de la muestra.
4. Lavar con 10 volúmenes de buffer 30 mM de ímidazoi en 50 mM Tris-HCI pH 8.0, para eliminar ei pegado inespecífico.
5. E ulr ia proteína recombinante con 5 volúmenes de buffer 300 mM de ímidazoi en 50 mM Tris-HCI pH 8.0.
Para la purificación de las proteínas recombinantes de fusión de la fracción insolubie el protocolo fue el siguiente:
1. Preparar una mini columna conteniendo 1.5 mi de resina de Níquel-NTA Agarosa (Qiagen).
2. Equilibrar cada columna con 10 volúmenes de buffer 20 mM de imidazoí en 50 mM Tris-HCI pH 8.0 y 8 M de Cloruro de guanidinio.
3. Cargar las muestras de proteína en la columna y dejar fluir por gravedad hasta pasar el total de la muestra.
4. Lavar con 10 volúmenes de buffer 30 mM de imidazoí en 50 mM Tris-HCI pH 8 y 6 M de Cloruro de guanidinio, para eliminar el pegado inespecífico.
5. Eluir la proteína recombinante con 5 volúmenes de buffer 300 mM de imidazoí en 50 mM Tris-HCÍ pH 8.0 y 6 M de Cloruro de guanidinio.
Se continuó con el ensayo de píegamiento in vitro. Las condiciones de piegamienío fueron ias siguientes: Tris 0.2 M, cloruro de guanidina 2 M, pH 8 con GSH:GSSG 1 mM:0.1 m respectivamente, durante 4 °C durante 72 horas. Posteriormente, las proteínas plegadas se purificaron por cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa (RP-HPLC).
Se evaluó la expresión y purificación de la proteína de fusión M-6His-FXa-Ts1 en un gel de poíiacriiarnida al 15% (ver figura 29).
Después de la purificación por afinidad y del ensayo de píegamiento, se realizó una purificación de la recombinante M-6His-Fxa-7s/ por cromatografía de líquidos de alta presión por fase reversa (RP-HPLC). Para la ímplemeníación de este paso, se empleó una columna analítica C18 (Vydac, U.S.A) y un gradieníe de buffer A (Agua + 0.12% de TFA) a buffer B (Acetonitrilo + 0.1% de TFA) de 20- 60 % en 40 minutos. La proteína de fusión de interés eiuye en un tiempo de 16 minutos, como se indica con una flecha en la Figura 30. A ¡a fracción correspondiente ai tiempo de retención de 16 minutos se te determinó ¡a masa molecular por espectrometría de masas, obteniendo ia serie iónica observada en la Figura 31 , la cual indica que la masa experimental es la misma que ia teórica, la cual corresponde a 8,741 ,98 Da.
Para la proteína de fusión M-Fxa-EK-Ts3 también se evaluó la expresión y purificación en un gel de poiiacriiamida al 15% (ver figura 32).
Para ia proteína de fusión recombinante M~6His-EK-Ts3, posterior a su purificación por afinidad y al ensayo de píegamiento también se realizó su purificación por cromatografía de líquidos de alta presión por fase reversa (RP-HPLC) de manera similar que corno se describe anteriormente para -8His-Fxa-Ts1. La proteína de fusión de interés es eluída alrededor de los 15.8 minutos, como se muestra en la Figura 33.
A ía fracción correspondiente a! tiempo de retención de 16 minutos se le determinó ia masa molecular a través de un espectrómetro de masas, obteniendo la serie iónica observada en la Figura 34, ia cual indica que ía masa experimental es la misma que la teórica, la cual corresponde a 9,493.8 Da,
Se evaluó la expresión y purificación de la proteína de fusión M-6His-EK-TsNTxP en un gel de poüacrilamida al 15%, Ver figura 35.
Para la proteína de fusión recombinante -6His~EK-TsNTxP, posterior a su purificación por afinidad y ai ensayo de píegamiento también se realizó su purificación por cromatografía de líquidos de alta presión por fase reversa (RP-HPLC) de manera similar que como se describe anteriormente para M-8His~Fxa-Ts1. La proteína de fusión de interés eluye a ios 15 minutos, como se muestra en la Figura 36.
A la fracción correspondiente al tiempo de retención de 15 minutos se Se determinó la masa molecular a través de un espectrómetro de masas, obteniendo la serie iónica observada en la Figura 37, ía cual indica que la masa experimental es la misma que la teórica, la cual corresponde a 8,742.2 Da.
Una vez purificadas las proteínas de fusión correspondientes a las proteínas Ts1 , Ts3 y TsNTxP se realizó la inmunización en conejos de de 2.5 kg de ia cepa Nueva Zelanda, esperando producir con ello anticuerpos con la capacidad de neutralizar a! veneno completo del alacrán Tityus serrulatus. La administración fue vía subcutánea, inyectando la mezcla de toxinas en un volumen final de 500 μΙ de PBS 1X. A continuación, se muestra el Esquema de inmunización empleado:
Esquema de inmunización en conejos (71 , 72 y 73) con las toxinas recombinantes Ts1, Ts3 y TsNTxP (Expresadas en pGE-30): Θ POR
TOXi SA
¡mUNiZACIÓ FECHA RECO BSNAN SUBCUTÁNE
(AÑO 2014) ADYUVANTE (μί) TE O/CONEJO SANGRÍA
1a 1 de Julio Completo 250 10 500 ? 3reinmune
2a 11 de J fio incompleto 300 10 600 ■
3a 22 d Julio Alúmina 300 20 600 -
4a 1 de Agosto incompleto 300 20 600 1a Sangría
5* 11 de Agosto Alúmina 300 30 600
6a 22 de Agosto Incompleto 300 30 600 2a Sangría
1 de
Septiembre Alúmina 300 40 600
11 de
8a Septiembre Incompleto 3Q0 40 600 4a Sangría
Se realizaron ensayos de ELISA de reconocimiento dei suero de ios conejos inmunizados (Tablas 28 y 29) contra las toxinas recombinantes y contra el veneno total de Tityus s&rru!atus.
Tabla 28. Títuios de anticuerpos del suero de ios conejos inmunizados contra los antígenos recombinantes durante la 8a Inmunización.
Título contra ia Títuío contra la Título contra la
Suero Toxina rTsl Toxina rTs3 Toxina rTsNTxP
Conejo 71 90621 ± 10652 17090 1 1236 9361 ± 1286
Conejo 72 381427 ± 37731 139034 ± 15248 84679 ± 14176
Conejo 73 305391 ± 53702 86627 ± 1 1816 71598 ± 7127 Tabla 29. Títulos de anticuerpos de los sueros de conejos inmunizados contra el veneno total de Tityus serruiatus durante la 6a Inmunización. suero Título contra veneno de Tityus serruiatus
Conejo 71 1384 ± 228
Conejo 72 15210 ± 205
Conejo 73 887 ± 143
Los resultados de esta Tabla en la que se muestran los títulos de anticuerpos obtenidos contra el veneno total de Tityus serruiatus, indican que se estaría neutralizando completamente el veneno utilizando como ínmunógeno únicamente la mezcla de ¡as toxinas recombinantes Ts1 , Ts3 y TsNTxP.
A continuación se muestra el esquema de inmunización que se siguió:
Esquema de inmunización en conejos (71 , 72 y 73) con las toxinas recombinantes Ts1 , Ts3 y TsNTxP (expresadas en pQE~30)
Mg or
Fecha Adyuvars Toxina i¡! subcutáneo/
inmunización Adyuvante Sangría
{año 2Q1 ) te {μ!) aeojü í conejo
ríante
S 1a Preinmu
1 de Julio Completo 250 10 500
incomplet
2a 11 de Julio 300 10 600
0 -
3a 22 de Julio Alúmina 300 20 600 -
4a Incomplet 1a
1 de Agosto 300 20 600
0
0 Sangría
5a 11 de Agosto Alúmina 300 30 600
Incomplet 2a
6a 22 de Agosto 300 30 600
0 Sangría ja 1 de Septiembre Alúmina 300 40 600
Incomplet 3aS 8a 11 de Septiembre 300 40 600
0 Sangría
9a 22 de Septiembre PBS 60 600
4a
26 de Se ptiembre de 2014
Sangría
10a 02 de Octubre Alúmina 300 120 600
0 Incomplet 5a
11a 17 de Octubre 300 40 600
0 Sangría
REFUERZO CON VENENO
128 29 de Octubre Alúmina 300 50 600
Incomplet
138 14 de Noviembre 300 50 600 5a Sangría o
28 de Noviembre . ,
a D¾anco
Para evaluar el suero de cada uno de los conejos inmunizados y determinar si el suero es capaz de reconocer a! veneno total de Tityus serruiatus y se determinaron los títulos de cada0 uno de los sueros mediante ensayos ELISA y el protocolo a seguir fue el siguiente:
Ensayo de ELISA
1. En placas de ELISA se agregó 100 μΙ/ pozo del antígeno (Veneno total de Tityus serruiatus 10 fig/ml) en buffer de bicarbonato de sodio 50 mM pH=9.4. Se incubó toda la noche (12- 8 horas) a 4°C. Se Lavó 3 veces con PBS 1X + Tween (0.1%). 2. Se agregó a cada pozo 200 μΙ de una solución de BSA al 0.5% en buffer de PBS 1X . Se incubaron por 2 h a 37 C y se lavaron 3 veces con PBS 1X + Tween (0.1 %).
3. Se agregó el anticuerpo (las diferentes diluciones del suero del respectivo conejo inmunizado) + PBS 1X (100 μ! por pozo). Se incubaron por 1 h a 37 °C y se lavaron 3 veces con PBS 1X + Tween (0.1%).
4. Se agregó anticuerpo anti-conejo acoplado a peroxidasa + PBS 1X 1 :2000 (100 μΙ por pozo). Se incubó por 1 h a 37 C y se lavaron 3 veces con PBS 1X + Tween (0.1 %).
5. Se preparó la solución de revelado con 11 mi buffer de fosfato de Na 0.1 N pH 5.0, 4.4 mg Orto-fenilendiamina y 4.4 μΙ H202 y se agregó a cada pozo 100 μΙ de la solución. Se cubrió la píaca de ELISA con aluminio de 3 a 10 min a temperatura ambiente, hasta que se observó una coloración. Se agregó 10 μί de HCf 6NS para detener la reacción. Se midió ía absorbancia a 490 nm en el lector de ELISA.
Los sueros obtenidos en e! suero preinmune y en la primera sangría se titularon contra mezcla de toxinas recombinantes como se muestra en la siguiente tabla. Ver figura 38.
©ando con arm
± ?73± 32 236 ± 58 sangría 8150 ± 1802 ± 89 2079Í8 ± 251
e la segunda sangría se realizaron las titulaciones de los sueros contra el veneno de Tityus serru!atus. En la gráfica de la Figura 39 s¡ e muestra la comparación de la seg sangría con la séptima y en la siguiente tabla se os valores de los títulos » de cada sangría.
Figure imgf000075_0001
A partir de la tercera sangría como los títulos de anticuerpos contra el veneno completo de T. serru!atus fueron altos sobretodo en el conejo 72 (1 :70000) se comenzaron a realizar ensayos de neutralización, para evaluar la capacidad de neutralizar al veneno completo. En las siguientes tablas se muestran los resultados obtenidos en cada ensayo de neutralización realizado con ios sueros obtenidos de la tercera, cuarta y séptima sangría. Para todos los casos el guión (--} indica que el ratón no murió.
Figure imgf000076_0001
1 DL50 =13.2 pg/ 20g ratón. 3 DLS0 = 39.6 pg/ 20g ratón. Stock veneno = 2.2 μρ/μΙ Títyus serrulatus.
Figure imgf000077_0001
)L50=13.2 MC / 20g raíór i.2 DL50 = 26. 4 μ§ί 20g rat ón. Stock ve neno = 3.5 §/μ! Tit us serrulatus.
Figure imgf000078_0001
L50 =13.2 pg/ 20g ratón. Stock veneno = 3.5 Mg/μΙ Tityus serru!afus.
Figure imgf000079_0001
1 DL50 =13.2 μ 1 20g ratón. 3 DLS0 = 39.6 \igl 20g ratón. Stock veneno = 5.7 Mg/μί. NOTA: El guión {--) indica que el ratón no murió. Con base en los resultados, el mejor suero obtenido fue el del conejo 72, el cual fue capaz de neutralizar 3 DL50 del veneno total de Tityus serrulatus.
Los antígenos recombinant.es son capaces de primar la respuesta inmune, lo cual se confirma al usar ei suero final después de los dos refuerzos dados con el veneno total de Tityus serrulatus, el cual es capaz de neutralizar las 3 DL5o, como se observa en la tabla 7, en donde todos los ratones tratados con el suero del conejo 72 sobreviven. Sin embargo, hay una variación dependiente de la respuesta inmune de cada conejo para producir sueros con buena capacidad neutralizante. La producción de antivenenos a nivel industrial basado por ejemplo en ¡a obtención de suero usando caballos, existe ¡a opción de seleccionar a ¡os mejores ejemplares respondedores, y a pesar de tal variabilidad en ¡as respuestas, con eí uso de ¡as toxinas recombinantes, motivo de esta invención, la conclusión es ciara: se recomienda su uso para potenciar la respuesta inmune y representan una ventaja para la producción de antívenenos de alta calidad, como ya se ha argumentado a So ¡argo de la descripción.
Habiendo descrito la invención son modalidades de la misma ¡as siguientes:
Una vez probada la eficacia de las toxinas recombinantes para generar anticuerpos neutralizantes contra toxinas y/o venenos de alacranes de diferentes géneros aplicando esquemas de inmunización en especies de mamíferos, es el objeto principal de la invención proveer de composiciones inmunogénicas con los antígenos descritos ya probados y en diferentes combinaciones o mezclas, las que resulten convenientes para la zona geográfica y más aún las que resulten sinérgicas o que muestren una protección cruzada.
Es modalidad de la invención la posibilidad de obtener un antiveneno utilizando los antígenos recombinantes de manera separada o preparando mezclas con al menos dos de las mismas:
* AaH¡ del alacrán Androctonus austraüs (Norte de África, de Argelia a Egipto), SEQ ID No:1 y ¡a profeína de fusión Tíorredoxina-EK-AaHI-6His SEQ ID No:1 1
® AaHI! del alacrán Androctonus austraüs (Norte de África, de Argelia a Egipto), SEQ ID No:2, y ¡a proteína de fusión Tiorredoxina-EK-AaHII-6His SEQ ID No:12
* AmmV de¡ alacrán Androctonus mauretanicus mauretanicus (Norte de África, Marruecos), SEQ ID No:3 y la proteína de fusión Tiorredoxina~EK-AmmV-8His SEQ ID No:13
« AmmVIII del alacrán Androctonus mauretanicus mauretanicus (Norte de África, Marruecos), SEQ ID No:4 y la proteína de fusión Tiorredoxina-EK-AmmV¡il-8His SEQ ID No:14
* Bol I del alacrán Buthus occitanus tunetanus (Norte de África, Este de ¡a cuenca mediterránea y el Sahel Africano), SEQ ID No:5 y la proteína de fusión Tiorredoxina-EK- Botl-6His, SEQ ID No:15 * Lqhll del alacrán Leiurus quinquestriatus hebraeus (África y Medio Oriente), SEQ ID No:6 y la proteína de fusión Tiorredoxina-E -LqHI¡-6His, SEQ ID No:16
® Lqh!V del alacrán Leiurus quinquestriatus hebraeus (África y Medio Oriente), SEQ ¡D No:7 la proteína de fusión Tiorredoxina-EK-LqbíV-6His, SEQ ID No;17
* Pg8 del alacrán Parabuthus granuiatus (Sur de África), SEQ ID No:8 la proteína de fusión Tiorredoxina-E -Pg8-6His, SEQ ID No; 18
® Acra4 del alacrán Androctonus crassicauda (Norte de África a Arabia Saudita y Turquía), SEQ ID No:9 y la proteína de fusión T¡orredoxina-EK-Acra4-6His, SEQ ID No:19
* Bul del alacrán Bufhacus acrocentrus (Norte de África a Arabia Saudita y Turquía), SEQ ID No:10 y la profeína de fusión Tiorredoxina-E -Bu1-6His, SEQ ID No:20
Es modalidad de la invención la posibilidad de obtener un antiveneno utilizando los siguientes antígenos recombinantes de especies de México de manera separada o aplicando mezclas con a! menos dos de las mismas, (híbrido es la profeína de fusión):
* Cn2 del alacrán Centruroides noxius (México), SEQ ÍD No: 21 híbrido Tíorredoxina-EK- Cn2-6His SEQ ID No:25
« ClU del alacrán Centruroides iimpidus (México), SEQ ID No: 22 híbrido Tiorredoxina-EK-
CIÍ1 -6HÍS SEQ ID No:26
» CII2 del alacrán Centruroides iimpidus (México), SEQ ID No: 23 híbrido Tiorredoxína-EK-
CII2-6HÍS SEQ ID No:27
® Cssl! del alacrán Centruroides suffusus (México), SEQ ID No: 24 híbrido Tiorredoxina- EK-Cssll-6His SEQ ID No:28
» Péptido híbrido His-Fxa-Cssií SEQ ID No:29
Es modalidad de la invención la posibilidad de obtener un antiveneno en un procedimiento que implica el uso de los siguientes antigenos recombinantes de la especie Tityus serruiatus de Sudamérica, de manera separada o aplicando mezclas con al menos dos de ias mismas:
• Ts1 SEQ ID No:30
» Ts3 SEQ ID No:31
• TsNTXp SEQ ID No:32
• Híbrida de Ts1 Tiorredoxína-EK-Ts1-8His SEQ ID No:33
· Híbrida de Ts3 Tiorredoxina-EK-Ts3-6His SEQ ID No:34
• Híbrida de TsNTXp Tiorredoxína-EK-TsNTXp-6His SEQ ID No:35
• Híbrida de Ts1 -6Hís-FXa-Ts1 SEQ ID No:36
• Híbrida de Ts3 M~6His-EK- Ts3 SEQ ID IMo:37
• Híbrida de TsNTXp M-6His-Ek-TsNTXp SEQ ID No:38 Dicha mezcla o combinación puede acompañarse de a! menos un excipiente farmacéuticamente aceptable para conformar una composición farmacéutica utílizable como mezcla inmunogénica, para obtener antivenenos de diversas especies de alacrán. Es modalidad de la invención que estos antivenenos sean fragmentos F{ab) o bien F{ab*)2 de ios anticuerpos policlonales obtenidos de piasma hiperinmune de mamíferos, incluyendo caballos.
Con ias estrategias descritas de mezclas de antígenos recombinantes con o sin fusión, con el empleo de esquemas de inmunización adecuados diseñados por expertos en el campo de la invención, aunado a la capacidad inmunogénica que tienen los híbridos de todas las toxinas recombinantes propuestas en la presente, se tiene la posibilidad de seleccionar combinaciones de inmunógenos recombinantes que producen sueros neutralizantes de venenos de diversas especies de alacrán.
Dichas combinaciones pueden acompañarse de a! menos un excipiente farmacéuticamente aceptabie para conformar una composición farmacéutica utílizable como inmunógenos para obtener antivenenos de diversas especies de alacrán.
Es mcdaiidad de la invención la preparación de composiciones farmacéuticas que comprendan a las proteínas de la invención, solas ó bien en fas posibles combinaciones de las mismas, como el componente activo, pueden venir en estado liofilizado y antes de su inoculación, deberán ser reconstituidas en un disolvente que es un vehículo farmacéuticamente aceptable, quedando éste último como el componente inactivo y/o como un segundo componente adyuvante de la respuesta inmune de la composición farmacéutica. Para formulaciones iiofilizadas de ios antígenos pueden contener: al menos un protector de la Siofilización tales como: sucrosa, Ficoll 70, polivinilpirrolidona; al menos un agente para ganar volumen, por ejemplo manito!.
En las vacunas de antígenos que se presenten iiofilizados habrá que mezclar e! principio activo (liofilizado) con el disolveníe.y homogenizar perfectamente antes de su inoculación, el disolvente puede ser por ejemplo solución salina (como puede ser de NaCI) isotónica.
Para el uso de las composiciones inmunogénicas para la obtención de sueros antitóxicos, se puede manejar un pían de inmunización de equinos adecuado para obtener un suero con aíto título de anticuerpos (hiperinmune), los equinos deberán ser adultos jóvenes mestizos, estar en buen estado de salud y recibir una dieta balanceada y con refuerzos de vitaminas y minerales, negativos para anemia infecciosa equina y piroplasmosis y desparasitados con afbendazoí-praziquante!. Deben ser mantenidos de acuerdo a condiciones éticas estrictas de acuerdo con la "International Animal Welfare Recommendations" y por el "Committee Members, International Society on Toxinology". Los equinos pueden ser inoculados con ia composición antigénica de la invención, siguiendo un esquema de inmunización definido por personal experto en el área técnica, utilizando o no adyuvantes que confirmen la presentación de ¡os antígenos, por ejemplo: adyuvante de Freund Compieto o Adyuvante de Freund Incompleto, opcionalmente se puede manejar como adyuvante fosfato de aluminio u otras sales de aluminio. También es modalidad de la invención el uso de vehículos de liberación de los antígenos de la invención, que sean conocidos en el estado de la técnica, por ejemplo: micelas anfifílicas, nanotubos de carbón, nanopartículas o microesferas de polímeros como poli (D,L-Lactida-co-glicolido) (PLG) y poli lactida (PLA), entre otros.
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Claims

1. Una composición ¡nmunogénica, caracterizada porque comprende al menos una de ¡as proteínas recombinantes del veneno de alacranes de especies del Norte de África, Este de ¡a cuenca mediterránea, el Sahel Africano y Arabia Saudita, seleccionada del grupo que
a) AaH I del alacrán Androctonus australis, SEQ ID No:1 y la proteína de fusión Tiorredoxina-EK-AaHI-8His SEQ ID No: 1 1
b) AaH II del alacrán Androctonus australis {SEQ ID No:2, y la proteína de fusión Tiorredoxina~EK~AaHII-6His, SEQ ID No:12
c) Amm V del alacrán Androctonus mauretanicus mauretanicus (Norte de África, Marruecos), SEQ ID No:3 y la proteína de fusión Tiorredoxina-EK-AmmV-8His, SEQ ID No:13
d) Amm VIII del alacrán Androctonus mauretanicus mauretanicus (Norte de África, Marruecos), SEQ ID No:4 y la proteína de fusión TiorredQxina-EK-AmmVIII~8His,
SEQ ID No: 14
e) Bot I del alacrán Buthus occitanus tuneíanus (Norte de África,), SEQ ID No:5 y la proteina de fusión Tiorredoxina-EK-Botl-6His. SEQ ID No:15
f) Lqhll del alacrán Leiurus quinquestriatus hebraeus (África y Medio Oriente), SEQ ID No:6 y la proteína de fusión Tiorredoxina-EK-LqHII-6His, SEQ ID No:18
g) LqhlV del alacrán Leiurus quinquestriatus hebraeus (África y Medio Oriente), SEQ ID No:7 la proteina de fusión Tiorredox¡na-EK-LqhlV-6His, SEQ ID No:17
h) Acra4 del alacrán Androctonus crassicauda,(SEQ ¡D No:9 y la proteína de fusión Tíorredoxina-EK-Acra4-8Hís, SEQ ID No: 19
i) Bul del alacrán Buthscus macrocentrus, SEQ ID No:10 y la proteina de fusión Tiorredoxina-EK-Bu1-6His, SEQ ID No:20
2. La composición ¡nmunogénica de la reivindicación 1 , caracterizada porque además comprende a la proteína recombinante de la especie del sur de África Pg8 del alacrán Parabuthus granu!atus, SEQ ÍD No:8 y/o a la proteína de fusión Tíorredoxina-EK-Pg8~6His, SEQ ID No:18.
3. La composición inrnunogéniea de la reivindicación 1 caracterizada porque comprenden la mezcla de al menos dos de las proteínas recombinantes de venenos de alacrán de especies del Norte de África, Este de ía cuenca mediterránea, eí Sahel Africano y Arabia Saudita, seleccionada del grupo que consiste de: j) AaH i del alacrán Androctonus ausfraüs, SEQ ID No:1 y la proteina de fusión Tiorredoxina-EK-AaHI-BHis SEQ ID No:1 1
k) AaH II del alacrán Androctonus ausfraüs (SEQ ID No:2, y la proteína de fusión Tíorredoxina-EK~AaH!í-6His, SEQ ID No:12
I) Amm V del alacrán Androctonus mauretanicus mauretanicus (Norte de África, Marruecos), SEQ ID No:3 y la proteína de fusión Tiorredoxina-EK-AmmV-6His, SEQ ID No:13
m) Amm VIH del alacrán Androctonus mauretanicus mauretanicus (Norte de África, Marruecas), SEQ ID No:4 y la proteína de fusión Tíorredoxina-EK-AmmVIII-eHis, SEQ ID No:14
n) Bot í del alacrán Buthus occitanus tunetanus (Norte de África,), SEQ ID No:5 y la proteina de fusión Tiorredoxina-EK-Botl-6His, SEQ ID No:15
o) Lqhfi del alacrán Leiurus quinquestriatus hebra&us (África y Medio Oriente), SEQ ID No:6 y la proteina de fusión Tiorredoxina-EK-LqHil-8His, SEQ ID No:16
p) LqhlV del alacrán Leiurus quinquestriatus hebraeus (África y Medio Oriente), SEQ ID No.7 la proteina de fusión Ttorredoxina~EK-LqhlV-6His, SEQ ID No: 17
q) Bul del alacrán Buthacus macrocentrus, SEQ ID No:1 Q y la proteina de fusión Tiorredoxina-EK-Bul-eHis, SEQ ID No:20
4. La composición ínmunogénica de la reivindicación 1 , caracterizada porque comprende ia mezcla de las proteínas recombinantes de las especies Androctonus crassícauda y Buthacus macrocentrus de Turquía:
a) Acra4, SEQ ID No:9 y/o Sa proteina de fusión Tiorredoxina-E -Acra4-6His, SEQ
ID o:19
b) Bul , SEQ ID No:10 y/o la proteína de fusión Tiorredoxina-EK-Bu1-8His, SEQ ID No:20 5, La mezcla de proteínas recombinantes de venenos de alacrán, de la reivindicación 3, caracterizada porque comprende la mezcla de al menos dos de las proteínas recombinantes de venenos de alacrán de especies del Norte de África Androctonus australis y Androctonus mauretanicus mauretanicus seleccionadas del grupo que consiste de:
a) AaH II del alacrán Androctonus austraiis, SEQ iD No:2,
b) La proteina de fusión Tiorredoxina-EK-AaH!l-6His, SEQ ID No:12
c) Amm V del alacrán Androctonus mauretanicus mauretanicus, SEQ ID No:3, d) La proíefna de fusión Tiorredoxina-EK-A mV-6His, SEQ ID No:13 e) Amm VIH del alacrán Androctonus maumtanicus auretanicus, SEQ ID No:4, f) La proteína de fusión Tiorredoxina-EK-AmmVIII-BHis, SEQ ID No:14
y caracterizada porque induce anticuerpos neutralizantes de veneno nativo de Androctonus auretanicus mauretanicus, Androcíonus austraüs con capacidad neutralizante potenciada por la presencia de ambos antigenos y para ambas especies debido a cruce antigénico.
8. Una composición inmunogénica, caracterizada porque comprende ai menos una de las proteínas recombinantes de venenos de alacrán de! género Centruroides seleccionada siste de: a) Cn2 del alacrán Centruroides noxius, SEQ ID No:21
b) La proteína de fusión Tiorredoxina-EK-Cn2-6His SEQ ID No:25
c) Cííldel alacrán Centruroides ¡impidus, SEQ ID No: 22
d) La proteína de fusión Tiorredoxina~E -CÍI1-6His SEQ ID No:26
e) CII2 del alacrán Centruroides iimpidus, SEQ ID No:23
f) La proteína de fusión Tiorredoxina-EK-CII2-6His SEQ ID No:27
g) Cssll del alacrán Centruroides suffusus, SEQ ID No: 24
h) La proteína de fusión Tiorredoxina-EK-Css¡l-6hfis SEQ ID No:28
i) La proteína de fusión His-Fxa-Cssll SEQ ID No: 29
Una composición inmunogénica, caracterizada porque comprende al menos una de proteínas recombinantes de venenos de alacrán de la especie Tityus serrulatus eccionada del grupo que consiste de: a) Ts1 SEQ ID No:30
b) Ts3 SEQ ID No:31
c) TsNTXp SEQ ¡D No:32
d) La proteína de fusión Tiorredoxina~EK-Ts1~6His SEQ ID No:33
e) La proteína de fusión Tiorredoxina-EK-Ts3-6His SEQ ¡D No:34
f) La proteína de fusión Tiorredoxina-EK-TsNTXp-8His SEQ ID No:35
g) La proteína de fusión M-8His-FXa-Ts1 SEQ ID No:36
h) La proteína de fusión M-6His-EK-Ts3 SEQ ID No:37
i) La proteína de fusión iV1-8His-Ek-TsNTXp SEQ ID No:38
8. Uso de la composición inmunogénica de cualquiera de ias reivindicaciones 1 a 7, para preparar un antiveneno en donde eí principio activo son anticuerpos o fragmentos funcionales de ¡os mismos, incluyendo fragmentos F(ab*}2.
9. Un procedimiento para obtener antivenenos de anticuerpos o fragmentos funcionales de los mismos incluyendo fragmentos F(ab)' 2. caracterizado porque comprende un paso de inmunización de mamíferos con cualquiera de las composiciones inmunogénicas de las reivindicaciones 1 a 7. y obtener de plasma del mamífero.
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