ES2259251B1 - Variante hipoalergenica de aspf1 de "asperguillus fumigatus", metodo dde produccion y aplicaciones. - Google Patents
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Abstract
Variante hipoalergénica de Aspf1 de
"Aspergillus fumigatus", método de producción y
aplicaciones.
Para la producción de una variante
hipoalergénica de
Aspf1 se ha clonado y expresado el DNA recombinante que codifica una variante de delación de esta ribonucleasa fúngica. Las proteína mutante recombinante expresada en el procariota Escherichia coli, o en el eucariota Pichia pastoris, se aísla y purifica con gran rendimiento, está correctamente plegada, y exhibe propiedades inmunológicas, enzimáticas y citotóxicas similares a las de las proteínas fúngicas naturales, pero es hipoalergénica y su citotoxicidad se encuentra significativamente atenuada, por lo que puede ser empleada en protocolos de diagnosis y terapia.
Aspf1 se ha clonado y expresado el DNA recombinante que codifica una variante de delación de esta ribonucleasa fúngica. Las proteína mutante recombinante expresada en el procariota Escherichia coli, o en el eucariota Pichia pastoris, se aísla y purifica con gran rendimiento, está correctamente plegada, y exhibe propiedades inmunológicas, enzimáticas y citotóxicas similares a las de las proteínas fúngicas naturales, pero es hipoalergénica y su citotoxicidad se encuentra significativamente atenuada, por lo que puede ser empleada en protocolos de diagnosis y terapia.
Description
Variante hipoalergénica de Aspf1 de
Aspergillus fumigatus, método de producción y
aplicaciones.
La presente invención, según se expresa en el
enunciado de esta memoria descriptiva, se refiere a una variante de
la ribotoxina Aspf1 en la que se ha sustituido el fragmento
correspondiente a la secuencia que comprende los aminoácidos 6 a 21
(según la numeración original de la secuencia de la proteína
natural) por dos Gly y se ha añadido un residuo de valina en su
extremo amino-terminal, entre sus dos primeros
residuos (Ala-1 y Thr-2).
La invención también hace referencia al DNA
recombinante que la codifica, y a moléculas homólogas como otras
ribotoxinas u otras ribonucleasas fúngicas, producidas en
organismos heterólogos recurriendo a la tecnología del DNA
recombinante. El objeto de la invención consiste, además, en la
producción de estas moléculas mediante tecnología recombinante en
la bacteria Escherichia coli y en la levadura Pichia
pastoris, lo que implica el uso de la secuencia SEQ ID NO: 1, o
de otras secuencias nucleotídicas obtenidas por mutagénesis de SEQ
ID NO: 1.
La invención proporciona un eficaz método de
producción, aislamiento y purificación para estas proteínas, con un
alto rendimiento, a fin de utilizarlas con fines terapéuticos y de
diagnóstico.
Las ribonucleasas fúngicas extracelulares
constituyen una familia de proteínas con muy variadas funciones y
secuencias, aunque todas ellas presentan elementos homólogos de
estructura secundaria y centros activos muy parecidos. Dentro de
esta gran familia destaca el grupo de las denominadas ribotoxinas.
Las ribotoxinas son ribonucleasas microbianas extracelulares con
propiedades citotóxicas y antitumorales (Olson, 1963, patente
US3104204; Olson y Goerner, 1965, Applied Microbiol. 13,
314-321; Martínez-Ruiz et
al., 2001, Methods Enzymol. 341,
335-351). Estas funciones biológicas se basan en su
capacidad para atravesar membranas e inactivar los ribosomas. Esta
inactivación bloquea la maquinaria de biosíntesis proteica celular
y produce la muerte por apoptosis (Olmo et al., 2001,
Eur. J. Biochem. 268, 2113-2123). La
secuencia de ribonucleotidos donde se produce la ruptura está
presente en todos los ribosomas conocidos hasta la fecha. Sin
embargo, estas proteínas muestran una cierta selectividad, siendo
su acción mucho más efectiva cuando se trata de células tumorales o
infectadas por ciertos virus. Esta selectividad radica precisamente
en su capacidad para interaccionar con membranas biológicas y
entrar en ciertas células. Es por ello también, y por su gran poder
inmunogénico y estabilidad, por lo que participan en el
establecimiento de muchas de las alergias frente a
Aspergillus spp. y otros hongos filamentosos (Crameri, 1998,
Int. Arch. Allergy Immunol. 115, 99-114). Se
ha probado cómo estas proteínas son unos de los principales
alergenos responsables de este tipo de enfermedades (Crameri, 1998,
Int. Arch. Allergy Immunol. 115, 99-114;
Hemmann et al., 1999, J. Allergy. Clin. Immunol. 104,
601-607; Kao et al., 2001, Methods
Enzymol. 341, 324-335) y se ha producido en
forma recombinante el principal alergeno de A. fumigatus, la
proteína rAspfl, con la idea de utilizarlo con fines diagnósticos
(Arruda et al., 1990 J. Experi. Med. 172,
1529-1532).
Pese a todo, su utilización en el tratamiento y
diagnóstico de enfermedades (principalmente procesos de carácter
alérgico o cancerígeno) no ha sido posible hasta ahora debido a su
extremada toxicidad. Las ribotoxinas son los inhibidores de la
biosíntesis de proteínas más potentes que se conocen (Lamy et
al., 1992, Genetically Engineered Toxins, Ed.
Marcel-Dekker, 237-257). Es, por
tanto, del máximo interés poder disponer de formas suficientemente
activas pero con su citotoxicidad y/o alergenicidad atenuadas. La
ribonucleasa U2 (RNasa U2) de Ustilago sphaerogena es la
ribonucleasa fúngica extracelular no tóxica más próxima a las
ribotoxinas, desde un punto de vista filogenético. Como todas las
de la familia, comparte con ellas un núcleo estructural que
comprende los elementos de estructura secundaria ordenada y el
centro activo (Pérez-Cañadillas et al., 2000,
J. Mol. Biol. 299, 1061-1073). Sin embargo,
la RNasa U2 presenta una especificidad enzimática completamente
diferente y no parece ser capaz de interaccionar con membranas. Por
ello, no es citotóxica. Disponer de formas recombinantes puras
tanto de diversas ribotoxinas como de la RNasa U2, o de cualquier
variante de las mismas obtenida por mutagénesis, permite el
aislamiento de proteínas no naturales potencialmente aptas para su
utilización en la diagnosis y el tratamiento terapéutico. Cuando se
comparan las estructuras de las ribotoxinas y la de la RNasa U2, se
observa que la principal diferencia radica en la horquilla \beta
amino-terminal de la primera. Como se ha probado
que esta horquilla es determinante para el mantenimiento de las
características citotóxicas e inmunogénicas de la ribotoxina
\alpha-sarcina (García-Ortega
et al., 2001, Protein Sci. 10,
1658-1668; García-Ortega et
al., 2002, J. Biol. Chem. 277,
18632-18639; Patente de Invención Nº P200200562), se
decidió preparar una variante de Aspf1 en la que este elemento de
estructura se sustituyó por las dos Gly que constituyen el giro
\beta presente en la posición equivalente en la RNasa U2 y en la
que también se añadió un residuo extra de valina en su extremo
amino-terminal, entre sus dos primeros aminoácidos
(Ala-1 y Thr-2).
Hasta la fecha, no se ha descrito la preparación
de la variante objeto de la invención, pues se trata de una
proteína no natural obtenida mediante la tecnología del DNA
recombinante y distintas aproximaciones mutagénicas. Se ha descrito
una variante equivalente de la \alpha-sarcina
(García-Ortega et al., 2002, J. Biol.
Chem. 277, 18632-18639; Patente de Invención Nº
P200200562) pero esta ribotoxina no es el alergeno natural y tiene
propiedades inmunológicas significativamente distintas de las de
Aspf1 (Kao et al., 2001, Methods Enzymol. 341,
324-335; Patente de Invención Nº P200200562). Se ha
descrito también la producción de alguna de las proteínas naturales
en forma recombinante (Arruda et al., 1990, J. Experi.
Med. 172, 1529-1532; Fitton, 1993, patente
ZA9301832; Fitton, 1994, patente US5306626; Lacadena et al.,
1994, Gene 142, 147-151;
Martínez-Ruiz et al., 1998, Protein
Expression and Purification 12, 315-322;
Martínez-Ruiz et al., 2000, FEMS
Microbiology Letters 189, 165-169), pero éstas
no reúnen las propiedades adecuadas para su utilización en
diagnosis y terapia, por las razones apuntadas más arriba.
La presente invención se refiere a la producción
de una variante de Aspf1 que implica la sustitución del fragmento
de secuencia que comprende los aminoácidos que ocupan las
posiciones 6 a 21 por dos Gly, así como la adición de un residuo de
valina entre sus dos primeros aminoácidos (Ala-1 y
Thr-2), y de proteínas homólogas a ésta que se
produzcan mediante la tecnología recombinante. Los organismos
utilizados para su producción son el procariota Escherichia
coli y el eucariota Pichia pastoris. La invención
también se refiere a los protocolos de aislamiento y purificación
utilizados.
Por medio del procedimiento objeto de la
invención, se obtienen moléculas de DNA recombinante que codifican
polipéptidos que exhiben la funcionalidad de las ribotoxinas y/o de
la RNasa U2, y que, en muchos casos, son hipocitotóxicas y/o
hipoalergénicas.
Además, la invención dispone de secuencias
polinucleotídicas que hibridan en condiciones restrictivas con las
descritas antes -lo que implica un nivel de identidad de al menos
un 60% entre sus secuencias de nucleótidos-, o bien derivan de
ellas por degeneración del código genético, inserción, deleción o
mutagénesis.
El procedimiento de obtención de esta proteína
recombinante, \Delta(6-21)Aspf1,
incluye vectores de expresión y células huésped que contengan una
secuencia de nucleótidos como la descrita en SEQ ID NO: 1
codificante de \Delta(6-21)Aspf1,
proteínas homólogas o fragmentos suyos.
Mediante el procedimiento objeto de esta
invención se obtienen polipéptidos con actividad enzimática
endorribonucleolítica, con capacidad para interaccionar con
membranas lipídicas y/o propiedades antigénicas como las de las
ribotoxinas y/o la RNasa U2. Estos polipéptidos pueden contener la
secuencia caracterizada por SEQ ID NO: 1 y 2, o sus homólogas,
unidas a otros polipéptidos (por ejemplo, como proteínas de fusión
o como proteínas quiméricas), o haber sido modificados química o
enzimáticamente.
Los métodos de preparación de estos polipéptidos
implican su producción recombinante a partir de las moléculas
polinucleotídicas anteriormente mencionadas, en sistemas de cultivo
de células procariotas y eucariotas que contienen como vehículo de
esos DNA los vectores de expresión descritos. Una vez producida la
molécula polipeptídica concreta, ésta es aislada en forma soluble
mediante el adecuado fraccionamiento de las células y el medio
extracelular, utilizando cromatografías de intercambio iónico y
penetrabilidad, según se describe más adelante.
Los productos obtenidos mediante el
procedimiento objeto de la invención presentan actividad
ribonucleolítica y/o capacidad para interaccionar con membranas
lipídicas, así como reacción cruzada con anticuerpos IgG e IgE del
suero de pacientes alérgicos a hongos filamentosos, como los de
Aspergillus spp., sensibles a rAspfl (el alergeno principal
de la alergia frente a Aspergillus) (Arruda et al.,
1990 J. Experi. Med. 172, 1529-1532), o
segmentos antigénicos
suyos.
suyos.
Finalmente, con el procedimiento objeto de la
invención se dispone de moléculas homólogas a las ribotoxinas, pero
con propiedades biológicas alteradas, tanto a nivel de su actividad
y especificidad enzimática, como de su capacidad para atravesar
membranas, y, además son hipoalergénicas. Por ello, se pueden
utilizar para ser incorporadas para la fiel diagnosis de la
hipersensibilidad a Aspergillus spp. y a otros hongos
filogenéticamente relacionados con ellos. Además, también se pueden
emplear en las preparaciones de alergenos que se utilizan para
llevar a cabo la inmunoterapia correspondiente para el tratamiento
de la alergia a Aspergillus.
En resumen, lo que la invención aporta es un
método reproducible y estandarizado para la producción y
aislamiento de una variante de deleción de Aspf1 carente de
toxicidad y lo suficientemente hipoalergénica como para poder ser
utilizadas en distintos procedimientos de terapia y diagnosis.
En el procedimiento de obtención de la proteína
recombinante \Delta(6-21)Aspf1 se
utilizan los conocimientos acumulados durante los procesos de
clonación y producción de las proteínas naturales,
\alpha-sarcina y RNasa U2, también en forma
recombinante (Lacadena et al., Gene 142,
147-151,1994; Martínez-Ruiz et
al., Protein Expression and Purification 12,
315-322, 1998; Martínez-Ruiz et
al., FEMS Microbiology Letters 189,
165-169, 2000), así como la de una forma
delecionada equivalente de la \alpha-sarcina
(García-Ortega et al., 2002, J. Biol.
Chem. 277, 18632-18639; Patente de Invención Nº
P200200562). Así, a partir de las secuencias nucleotídicas conocidas
de estas proteínas se diseñan los desoxioligonucleotidos necesarios
para construir los mutantes mediante técnicas de mutagénesis
dirigida clásica, ya utilizadas en la preparación de otros mutantes
(Lacadena et al. Biochem. J. 309,
581-586, 1995; Lacadena et al.,
Proteins 37, 474-484, 1999;
García-Ortega et al. Prot. Sci. 10,
1658-1668, 2001; Martínez-Ruiz et
al., Methods Enzymol. 341, 335-351,
2001; Masip et al., 2001, European Journal of Biochemistry
268, 6190-6196; García-Ortega et
al., 2002, J. Biol. Chem. 277,
18632-18639; Solicitud de patente de Invención Nº
P200200562; Masip et al., 2003, Protein Science 22
12, 161-169).
Un modo de realización preferente se ha llevado
a cabo mediante las siguientes fases:
El método empleado es el que se conoce como
Método de Kunkel (Kunkel et al., Methods Enzymol.
154, 367-382,1987). Partiendo del DNA codificante
de la secuencia original de la proteína Aspf1 clonado en distintos
vectores (Lacadena et al., 1994, Gene 142,
147-151; Lacadena et al., 1999,
Proteins 37, 474-484), con un residuo de
valina insertado en su extremo amino-terminal. Uno
de ellos permite su biosíntesis en forma de DNA de una única hebra,
mediante la utilización de E. coli con genotipo F y la
utilización del fago filamentoso F1. Estas hebras de cadena
sencilla, que además se enriquecen en uridina, mediante el empleo
de cepas de E. coli con un genotipo ung^{-}
dut^{-}, se utilizan como molde para llevar a cabo la
mutagénesis y construir los mutantes objeto de la invención. El
desoxioligonucleótido mutagénico empleado para la preparación de
\Delta(6-21)Aspf1 es
5'-GTCACCTGGACATGCGGCGGCCTTCTA
TACAATCAA-3'. Tras la correspondiente elongación y ligación in vitro, se transforman células E. coli ung^{+} dut^{+} y se seleccionan las colonias que contenían las secuencias de DNA mutantes, cuya estructura se confirma mediante secuenciación.
TACAATCAA-3'. Tras la correspondiente elongación y ligación in vitro, se transforman células E. coli ung^{+} dut^{+} y se seleccionan las colonias que contenían las secuencias de DNA mutantes, cuya estructura se confirma mediante secuenciación.
Para la producción recombinante de estas
proteínas en E. coli la correspondiente secuencia
codificante de DNA se liga a los plásmidos pINPG (Lacadena et
al., Gene 142, 147-151,1994) o pET
(Novagen). Se utilizan construcciones que implican la fusión de las
secuencias codificantes a la del péptido señal de la proteína OmpA
de E. coli, lo que permite su exportación al periplasma y su
correcto procesamiento. Las células utilizadas son de la cepa
BL21(DE3). La inducción se lleva a cabo mediante la adición
de distintas cantidades de IPTG durante la fase logarítmica de
crecimiento de las bacterias. Tras la correspondiente incubación a
37ºC durante 16-36 horas, las bacterias se trataron
según protocolos estándar para obtener las distintas fracciones
celulares que contenían las proteínas recombinantes en estado
soluble y estas fracciones se utilizan para llevar a cabo su
purificación. Este proceso de fraccionamiento se detalla en
Martínez-Ruiz et al., Methods
Enzymol. 341, 335-351, 2001.
En este caso, los vectores empleados para ligar
las secuencias codificantes de las proteínas recombinantes son
pHILD2, pHILS1, pPIC9 y pPICZ\alpha (Invitrogen). Células GS115 o
KM71, convenientemente transformadas con las construcciones
correspondientes, se cultivan primero en medio mínimo tamponado de
glicerol (BMY), no inductor, para conseguir buenos niveles de
densidad celular. Una vez alcanzado este punto, las células se
recogen mediante centrifugación y se vuelven a resuspender en el
medio inductor, medio mínimo tamponado de metanol (BMM). Estas
células se incuban a 30ºC durante 2-4 días, con
fuerte agitación añadiendo metanol cada 12 horas (concentración
final del 0.5%) para que la producción de las proteínas
recombinantes sea máxima. Una vez acabado el cultivo, se separa el
medio extracelular mediante ultracentrifugación y se utiliza como
punto de partida para llevar a cabo el aislamiento y la
purificación de las proteínas.
Esta purificación se lleva a cabo mediante dos
etapas, una cromatografía de intercambio iónico en Amberlita IRC 50
y una cromatografía de penetrabilidad en Biogel P10. Cuando es
necesario concentrar las distintas fracciones de proteína se
recurre a la liofilización o a la ultrafiltración. Los cambios de
pH y/o de tampón se llevan a cabo mediante diálisis o cromatografía
de penetrabilidad en Biogel P2. Este procedimiento rinde una
preparación de proteína de una pureza superior al 99% de acuerdo
con su comportamiento en HPLC y PAGE-SDS, con su
composición de aminoácidos y con sus características
espectroscópicas. Además, es reconocida por el anticuerpo
policlonal específico de la \alpha-sarcina y la
Aspf1 fúngicas y naturales.
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:
1
La secuencia de DNA correspondiente a los
residuos 6 a 21 de Aspf1 fue delecionada. Esta secuencia de DNA
corresponde a una horquilla \beta que sobresale del núcleo
estructural principal de la \alpha-sarcina.
Se insertó una secuencia de DNA que codificaba
la incorporación de dos Gly. Estas dos glicocolas aparecen en una
posición equivalente en la RNasa U2 y permiten el establecimiento
de un giro \beta necesario para que la proteína se pliegue
correctamente.
La secuencia contiene además un codón
correspondiente a un residuo de valina en su porción
amino-terminal, situado entre los que serían los dos
primeros residuos de la proteína fúngica natural Aspf1
(Ala-1 y Thr-2).
SEQ ID NO:
2
La secuencia de aminoácidos correspondiente a
los residuos 6 a 21 de la Aspf1 ha sido delecionada. Esta secuencia
de aminoácidos corresponde a una estructura de horquilla \beta
presente en el extremo amino-terminal de la
\alpha-sarcina. Esta estructura sobresale del
núcleo estructural principal de la
\alpha-sarcina.
Se insertaron dos residuos de Gly. Estas dos
glicocolas están presentes en la RNasa U2 y permiten el
establecimiento de un giro \beta necesario para que la proteína
se pliegue correctamente.
La secuencia contiene además un residuo de
valina en su porción amino-terminal, situado entre
los que serían los dos primeros residuos de la proteína fúngica
natural Aspf1 (Ala-1 y Thr-2).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<110> Universidad Complutense de
Madrid
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Método de producción de una variante
hipoalergénica del alergeno principal de Aspergillus
fumigatus Aspf 1.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 424
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial Sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (19)...(24)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> The DNA sequence corresponding to
Aspf1 amino acid residues 6 to 21 has been deleted. This DNA
corresponds to a \beta-hairpin structure which
protudes out of the Aspf1 main structural core.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (19)...(24)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> The DNA sequence corresponding to
two GIy residues has been inserted. These two GIy are present in
RNase U2 and allow the establishment of a
\beta-turn required for the correct folding of the
protein.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4)...(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> The DNA sequence corresponding to an
additional valine residue located between Aspf1 residues 1 and 2,
and absent in the natural fungal protein, has been
incorporated.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 136
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial Sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (7)...(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> The amino acid sequence
corresponding to Aspf1 amino acid residues 6 to 21 has been
deleted. This amino acid sequence corresponds to the Aspf1
amino-terminal \beta-hairpin. This
structure protrudes out of the Aspf1 main structural core.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (7)...(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Two Gly residues have been inserted.
These two Gly are present in RNase U2 and allow the establishment
of a \beta-turn required for the correct folding
of the protein.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> An additional valine residue located
between Aspf1 residues 1 and 2, and absent in the natural fungal
protein, has been incorporated.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
Claims (19)
1. Moléculas de DNA recombinante
caracterizadas por SEQ ID NO: 1 que codifican péptidos con
actividad ribonucleolítica y que poseen al menos un epítopo
alergénico común con el alergeno principal de Aspergillus
spp. denominado Aspf1.
2. Moléculas de DNA recombinante
caracterizadas por SEQ ID NO: 1 que codifican péptidos con
propiedades citotóxicas y/o alergénicas atenuadas.
3. Moléculas de DNA recombinante
caracterizadas por SEQ ID NO: 1 que codifican péptidos con
capacidad alterada, con respecto a la
\alpha-sarcina y Aspf1, para interaccionar con
membranas lipídicas.
4. Moléculas de DNA recombinante, según
reivindicaciones anteriores, o modificaciones de dichas moléculas,
que codifican polipéptidos unidos a un polipéptido adicional, o
modificados química o enzimáticamente.
5. Polipéptidos recombinantes de
\Delta(6-21)Aspf1, o fragmentos de
dichos polipéptidos, según reivindicaciones anteriores,
caracterizados por la secuencia dada en SEQ ID NO: 1 y 2,
que presentan la antigenicidad de, al menos, un epítopo de
Aspf1.
6. Polipéptidos recombinantes de
\Delta(6-21)Aspf1, o fragmentos de
dichos polipéptidos, según reivindicaciones 1, 2, 3 y 4,
caracterizados por la secuencia dada en SEQ ID NO: 1 y 2,
que presentan actividad ribonucleolítica alterada con respecto a la
\alpha-sarcina, las Aspf1 y la RNasa U2.
7. Polipéptidos recombinantes de
\Delta(6-21)Aspf1, o fragmentos de
dichos polipéptidos, según reivindicaciones 1, 2, 3 y 4,
caracterizados por la secuencia dada en SEQ ID NO: 1 y 2,
que presentan actividad citotóxica alterada con respecto a la
\alpha-sarcina, las Aspf1 y la RNasa U2.
8. Polipéptidos recombinantes de
\Delta(6-21)Aspf1, o fragmentos de
dichos polipéptidos, según reivindicaciones 1, 2, 3 y 4,
caracterizados por la secuencia dada en SEQ ID NO: 1 y 2,
que presentan una capacidad alterada para interaccionar con
membranas con respecto a la \alpha-sarcina, la
Aspf1 y la RNasa U2.
9. Un vector de expresión procariota, y
preferentemente pINPG o pET, que contenga cualquiera de las
secuencias de nucleótidos descritas en las reivindicaciones 1 a 4, y
que permita la producción recombinante de cualquiera de los
polipéptidos según reivindicaciones 5 a 8.
10. Un vector de expresión eucariota, y
preferentemente pHILD2, pHILS1, pPIC9 o pPICZ\alpha, que contenga
cualquiera de las secuencias de nucleótidos descritas en las
reivindicaciones 1 a 4, y que permita la producción recombinante de
cualquiera de los polipéptidos según reivindicaciones 5 a 8.
11. Un organismo hospedador procariota,
transformado con un vector según reivindicación 9.
12. Un organismo hospedador eucariota,
transformado con un vector según reivindicación 10.
13. Un método para producir polipéptidos
recombinantes, según reivindicaciones 5, 6, 7, 8, 9 y 11, en el
sistema procariota de bacteria Escherichia coli y
preferentemente de la cepa BL21(DE3), caracterizado
porque se realiza una purificación mediante una cromatografía de
intercambio iónico en Amberlita IRC-50 y una de
penetrabilidad en Biogel P10.
14. Un método para producir polipéptidos
recombinantes, según reivindicaciones 5, 6, 7, 8, 10 y 12, en el
sistema eucariota de levadura Pichia pastoris y
preferentemente de las cepas GS115 y KM71, caracterizado
porque se realiza una purificación mediante una cromatografía de
intercambio iónico en Amberlita IRC-50 y una de
penetrabilidad en Biogel P10.
15. Utilización de los polipéptidos, según
reivindicaciones 5-8, en el diagnóstico in
vitro de la alergia.
16. Aplicación de las moléculas recombinantes,
según reivindicaciones 1-4, para el diseño de
vacunas destinadas a la inmunoterapia de la alergia.
17. Aplicación de las moléculas recombinantes
según reivindicaciones 1-4 para producir péptidos
que contengan al menos un epítopo T del alergeno Aspfl y sean
capaces de actuar como vacunas.
18. Aplicación de las moléculas recombinantes,
según reivindicaciones 1-4, para la producción de
isoformas recombinantes hipoalergénicas que tengan disminuida o
anulada su unión a IgE para el tratamiento de alergias.
19. Aplicación de las moléculas recombinantes,
según reivindicaciones 1-4, para la producción de
polipéptidos recombinantes con citotoxicidad modificada.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200301352A ES2259251B1 (es) | 2003-06-06 | 2003-06-06 | Variante hipoalergenica de aspf1 de "asperguillus fumigatus", metodo dde produccion y aplicaciones. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200301352A ES2259251B1 (es) | 2003-06-06 | 2003-06-06 | Variante hipoalergenica de aspf1 de "asperguillus fumigatus", metodo dde produccion y aplicaciones. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2259251A1 ES2259251A1 (es) | 2006-09-16 |
| ES2259251B1 true ES2259251B1 (es) | 2007-05-16 |
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ID=36998076
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES200301352A Expired - Fee Related ES2259251B1 (es) | 2003-06-06 | 2003-06-06 | Variante hipoalergenica de aspf1 de "asperguillus fumigatus", metodo dde produccion y aplicaciones. |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| ES (1) | ES2259251B1 (es) |
-
2003
- 2003-06-06 ES ES200301352A patent/ES2259251B1/es not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| GARCÍA-ORTEGA, L. et al. "Deletion of the NH2-terminal beta-hairpin of the ribotoxin alpha-Sarcin produces a nontoxic but active ribonuclease". THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY. 24.05.2002. Vol. 277, Nº 21, páginas 18632-18639, todo el documento. * |
| PROTEIN SEQUENCE DATABASE [en línea], NCBI, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA. 19.07.2000. "Major allergen I 18 kDa antigen [Aspergillus fumigatus]. Número de acceso AAF86369, resumen & SARMA, P.V.G.K. et al. "Expression of an epitopic region of AspfI, an allergen/antigen/cytotoxin of Aspergillus fumigatus". IMMUNOLOGY LETTERS. 1999. Vol. 70, páginas 151-155, todo el documento. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2259251A1 (es) | 2006-09-16 |
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