WO2017126647A1 - 細胞の培養方法 - Google Patents

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cell
plastic fluid
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紀ノ岡正博
長森英二
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    • C12N2533/90—Substrates of biological origin, e.g. extracellular matrix, decellularised tissue

Definitions

  • This disclosure relates to a method for culturing cells using a plastic fluid.
  • Regenerative medicine using human iPS (induced pluripotent stem) cells is being used for techniques utilizing animal cells such as antibody drug production using CHO (Chinese Hamster Ovary) cells.
  • CHO Choinese Hamster Ovary
  • three-dimensional culture in which cells are cultured in a suspension state has advantages such as saving space and reducing the amount of medium used by increasing the cell concentration per unit volume.
  • the oxygen consumption rate of the cells increases, and the oxygen supply side is generated in the culture solution.
  • the concentration of oxygen that can be dissolved in the liquid at normal temperature and pressure is about 7-8 mg / L. It can be said that oxygen is a nutritional component that cannot be maintained at a sufficient concentration in the liquid.
  • Aeration in the culture of animal cells is mainly in small culture tanks by the surface aeration method that relies on oxygen transfer at the gas-liquid interface of the culture solution, and in the medium to increase the gas-liquid interface area per unit volume.
  • a hydrophobic membrane tube is stretched around.
  • the gas-liquid interface area per unit volume decreases as the amount of the culture solution increases, for example, for culture using a large volume of medium such as several to several tens of liters or more. Difficult to apply. Further, the latter method is expected to increase the risk of contamination due to a complicated structure in the culture tank, and is considered impractical.
  • Patent Document 1 discloses a medium composition containing a polymer compound or polysaccharide having an anionic functional group as a medium that can be cultured while maintaining the floating state of cells without stirring.
  • aeration by bubbling to animal cell culture is basically not realized.
  • bubbling to a large culture tank is performed in CHO cells
  • this is a state in which a certain amount of share stress damage to cells is allowed.
  • the culture of cells used for regenerative medicine or the like preferably has little physical stress on the cells.
  • the medium for regenerative medicine has a higher protein concentration than the medium for CHO cells, and foaming due to bubbling becomes a problem.
  • This disclosure provides, in one or a plurality of embodiments, a cell culture method capable of supplying oxygen with reduced physical stress.
  • the present disclosure in one aspect, relates to a cell culture method including disposing cells in a medium that is a plastic fluid and introducing bubbles into the medium.
  • the cell culture method in one or a plurality of embodiments, it is possible to perform floating cell culture in which suppression of physical stress on cells and improvement of oxygen supply are compatible.
  • the cell culture method in one or a plurality of embodiments, it is possible to achieve both suppression of physical stress on cells and improvement of oxygen supply even in floating cell culture with a large medium volume.
  • FIG. 1 shows an example of the result of examining the rising speed of bubbles in Newtonian fluid (normal medium) and plastic fluid medium A.
  • FIG. 2 shows an example of the result of examining the dispersion state of cell clumps in Newtonian fluid (normal medium) and plastic fluid medium A.
  • FIG. 3 shows an example of the result of examining the behavior ( ⁇ ) of cells near the bubble rising portion when bubbles are introduced (sparging) into the plastic fluid medium A.
  • FIG. 4 shows an example of the result of examining the behavior ( ⁇ ) of a cell at a position slightly away from the vicinity of the bubble rising portion when bubbles are introduced (sparging) into the plastic fluid medium A.
  • FIG. 1 shows an example of the result of examining the rising speed of bubbles in Newtonian fluid (normal medium) and plastic fluid medium A.
  • FIG. 2 shows an example of the result of examining the dispersion state of cell clumps in Newtonian fluid (normal medium) and plastic fluid medium A.
  • FIG. 3 shows an example of
  • FIG. 5 shows representative images at each time of cell agglomerates in a culture medium suspended in culture while introducing bubbles (sparging) with a control medium and plastic fluid medium A.
  • FIG. 6 shows an example of the change over time of the cell concentration in the culture medium cultured in suspension while introducing bubbles (sparging) with the control medium ( ⁇ ) and the plastic fluid medium A ( ⁇ ).
  • FIG. 7 is a result of confirming oxygen supply and cell growth under different yield value conditions, and shows an example of a microscopic observation photograph of a cell clump.
  • FIG. 8 is a result of confirming oxygen supply and cell growth under different yield value conditions, and shows an example of a graph of the cell density of the cell clump over time.
  • FIG. 9 shows a schematic diagram of a culture device in which the oxygen supply can only be from sparging.
  • FIG. 10 shows an example of a graph of cell density results after 24 hours in the culture with sparging in the culture apparatus of FIG. 9 and the control culture without.
  • FIG. 11 shows an example of a graph comparing apparent specific growth rates of cultures with and without sparging in the culture apparatus of FIG. 9 and cultures up to 24 hours after three-dimensional static culture.
  • the present disclosure is based on the knowledge that by combining an oxygen supply method that introduces bubbles into a plastic fluid, suspension cell culture in which suppression of physical stress on cells and improvement of oxygen supply are compatible is possible. .
  • the combination of the oxygen supply method of introducing bubbles into the plastic fluid and the mechanism that enables suspension cell culture that is compatible with the suppression of physical stress on the cells and the improvement of oxygen supply are speculated as follows.
  • the plastic fluid the cells are retained in the fluid without settling. For example, the floating state of the cells is maintained, or if the cells are dispersed, the dispersed state is maintained. This eliminates the need for agitation for suspending the cells, thereby eliminating physical stress.
  • the rising speed of the bubbles introduced into the plastic fluid is suppressed. This means that the bubble residence time in the plastic fluid is extended and the gas hold-up is increased.
  • the oxygen supply amount (mass transfer) per bubble is improved, the air flow rate can be reduced, and physical stress due to convection and foaming is suppressed.
  • the gas holdup is increased, the apparent dissolved oxygen amount per unit medium is increased, and cell culture at a high concentration becomes possible.
  • the movement of bubbles introduced into the plastic fluid is a temporary and local flow. The flow does not flow except for the rising part of the bubbles, and convection due to the rising of the bubbles is also suppressed. As a result, an environment in which physical stress such as share stress is suppressed is maintained.
  • the present disclosure need not be construed as being limited to these mechanisms.
  • a plastic fluid refers to a fluid that requires a yield stress to flow, that is, a fluid having a yield value.
  • the plastic fluid may be a Bingham fluid or a non-Bingham fluid.
  • the plastic fluid refers to a fluid that can hold the cells in the plastic fluid without settling in a stationary state.
  • a medium that is a plastic fluid refers to a plastic fluid containing a medium component and a specific compound, and in one or more non-limiting embodiments, a liquid medium and a specific compound are mixed to form a plastic fluid.
  • a medium component and the liquid medium a medium component and a liquid medium that can be usually used according to the cells cultured by the method according to the present disclosure can be used.
  • the said specific compound is a compound which can make the liquid or culture medium which is not a plastic fluid into a plastic fluid, and what is disclosed by WO2014 / 017513 can be used in one or some embodiment which is not limited.
  • a high molecular compound is mentioned, Preferably the high molecular compound which has an anionic functional group is mentioned.
  • the anionic functional group include a carboxy group, a sulfo group, a phosphate group, and salts thereof, and a carboxy group or a salt thereof is preferable.
  • the polymer compound one having one or more selected from the group of the anionic functional groups can be used.
  • the specific compound for forming a plastic fluid are not particularly limited, but polysaccharides obtained by polymerizing 10 or more monosaccharides (for example, triose, tetrose, pentose, hexose, heptose, etc.) More preferred is an acidic polysaccharide having an anionic functional group.
  • the acidic polysaccharide here is not particularly limited as long as it has an anionic functional group in its structure.
  • a polysaccharide having uronic acid for example, glucuronic acid, iduronic acid, galacturonic acid, mannuronic acid
  • hyaluronic acid gellan gum, deacylated gellan gum (hereinafter sometimes referred to as DAG), rhamzan gum, diyutan gum, xanthan gum, carrageenan, xanthan gum, hexuronic acid, fucoidan, pectin, pectinic acid, pectinic acid, Examples include heparan sulfate, heparin, heparitin sulfate, keratosulfate, chondroitin sulfate, deltaman sulfate, rhamnan sulfate, and one or two or more thereof from the group consisting of salts thereof.
  • the polysaccharide is preferably hyaluronic acid, DAG, Grotan gum, xanthan gum, carrageenan or a salt thereof, and can float cells or tissues with a low concentration, and can be easily collected.
  • DAG is more preferable.
  • the salt herein include salts of alkali metals such as lithium, sodium and potassium, salts of alkaline earth metals such as calcium, barium and magnesium, and salts of aluminum, zinc, steel, iron, ammonium, organic bases and amino acids. Is mentioned.
  • polysaccharides and the like preferably have a weight average molecular weight of 10,000 to 50,000,000, more preferably 100,000 to 20,000,000, and still more preferably 1,000,000. 000 to 10,000,000.
  • the molecular weight can be measured in terms of full run by gel permeation chromatography (GPC).
  • GPC gel permeation chromatography
  • phosphorylated DAG can be used. The phosphorylation can be performed by a known method.
  • the polysaccharide can be used in combination of plural kinds (preferably two kinds).
  • the type of polysaccharide combination is not particularly limited, but preferably the combination includes at least DAG or a salt thereof. That is, suitable polysaccharide combinations include DAG or a salt thereof, and a polysaccharide other than DAG or a salt thereof (eg, xanthan gum, alginic acid, carrageenan, dieutan gum, methylcellulose, locust bean gum or a salt thereof). Is included.
  • polysaccharides include DAG and rhamzan gum, DAG and diyutan gum, DAG and xanthan gum, DAG and carrageenan, DAG and xanthan gum, DAG and locust bean gum, DAG and ⁇ -carrageenan, DAG and sodium alginate, DAG And methyl cellulose, but are not limited thereto.
  • the specific compound for forming a plastic fluid include hyaluronic acid, deacylated gellan gum, diyutan gum, carrageenan, xanthan gum and salts thereof, and preferable examples include deacylated gellan gum or a salt thereof. Salt.
  • the deacylated gellan gum is a linear chain composed of four sugar molecules including 1-3 linked glucose, 1-4 bonded glucuronic acid, 1-4 bonded glucose, and 1-4 bonded rhamnose.
  • R 1 and R 2 are both hydrogen atoms
  • n is a polysaccharide represented by an integer of 2 or more.
  • the R 1 is a glyceryl group
  • R 2 may also include an acetyl group, but the content of acetyl group and glyceryl groups, preferably not more than 10%, more preferably 1% or less.
  • Deacylated gellan gum describes metal ions (for example, calcium ions) in a liquid medium when mixed with the liquid medium. ) To form an amorphous structure via the metal ion, and the cells and / or tissues are suspended.
  • the viscosity of the medium which is a plastic fluid prepared from deacylated gellan gum, is 8 mPa ⁇ s or less, preferably 4 mPa ⁇ s or less, and is easy to collect cells or tissues. Considering this point, it is more preferably 2 mPa ⁇ s or less.
  • the viscosity of the medium that is a plastic fluid in the cell culture method according to the present disclosure is not particularly limited and may be larger than the above value.
  • the specific compound for forming a plastic fluid can be obtained by a chemical synthesis method.
  • the compound when the compound is a natural product, conventional techniques from various plants, animals, and microorganisms containing the compound are used. It is preferable to obtain it by extraction and separation and purification. In the extraction, the compound can be extracted efficiently by using water or supercritical gas.
  • the produced microorganism is cultured in a fermentation medium, and the mucosa produced outside the cells is collected by a normal purification method, and after drying, pulverization, etc., it is powdered. Good.
  • deacylated gellan gum it may be recovered after subjecting the mucosa to an alkali treatment to deacylate glyceryl groups and acetyl groups bound to 1-3-bound glucose residues.
  • Purification methods include, for example, liquid-liquid extraction, fractional precipitation, crystallization, various ion exchange chromatography, gel leakage chromatography using Sephadex LH-20, etc., adsorption chromatography using activated carbon, silica gel, etc. It is possible to purify by removing impurities by using adsorption / desorption treatment of the active substance by thin layer chromatography or high-performance liquid chromatography using a reverse phase column alone or in combination in any order and repeatedly.
  • gellan gum producing microorganisms include, but are not limited to, Sphingomonas erodea and microorganisms modified from the genes of the microorganisms.
  • deacylated gellan gum In the case of deacylated gellan gum, commercially available products such as “KELCOGEL (registered trademark of CP Kelco) CG-LA” manufactured by Sanshin Co., Ltd. Can be used. Moreover, “Kelcogel (registered trademark of CPE Kelco) HT” manufactured by San-Ei Gen FFI Co., Ltd. can be used as native gellan gum.
  • concentration of a specific compound in a medium that is a plastic fluid depends on the type of the specific compound, and the plasticity that can hold the cells in the medium without settling in a stationary state Although it can be appropriately set within the range where the fluid can be used, it is usually 0.0005% to 1.0%, preferably 0.001% to 0.4%, more preferably 0.005% to 0.1%. %, More preferably 0.005% to 0.05%.
  • concentration of the specific compound in the medium that is a plastic fluid is usually 0.0005% to 1.0%, preferably 0.001% to 0.4%, more preferably 0.005% to 0.1%. %, More preferably 0.005% to 0.05%.
  • deacylated gellan gum 0.001% to 1.0%, preferably 0.003% to 0.5%, more preferably 0.005% to 0.1%, still more preferably 0.01.
  • % To 0.05% still more preferably 0.02% to 0.05%.
  • xanthan gum 0.001% to 5.0%, preferably 0.01% to 1.0%, more preferably 0.05% to 0.6%, and still more preferably 0.3% to 0.00%. 6%.
  • ⁇ -carrageenan and locust bean gum mixed system 0.001% to 5.0%, preferably 0.005% to 1.0%, more preferably 0.01% to 0.1%, most preferably 0.03% to 0.05%.
  • native gellan gum it is 0.05% to 1.0%, preferably 0.05% to 0.1%.
  • the concentration of the polysaccharides is suitably within a range that can be a plastic fluid that can hold cells in the medium without settling in a stationary state.
  • a range that can be a plastic fluid that can hold cells in the medium without settling in a stationary state.
  • the concentration of DAG or a salt thereof is 0.005 to 0.02%, preferably 0.01 to 0.02%.
  • the concentration of polysaccharides other than DAG or a salt thereof is 0005 to 0.4%, preferably 0.1 to 0.4%. The following are examples of specific combinations of concentration ranges.
  • DAG or a salt thereof 0.005 to 0.02% (preferably 0.01 to 0.02%)
  • Polysaccharide xanthan gum other than DAG 0.1-0.4%
  • Sodium alginate 0.1-0.4%
  • Bi-to bean gum 0.1-0.4%
  • Methyl cellulose 0.1 to 0.4% (preferably 0.2 to 0.4%)
  • Carrageenan 0.05-0.1%
  • Valtan gum 0.05-0.1%
  • Concentration (%) mass of specific compound (g) / medium volume (ml) ⁇ 100
  • the specific compound can be further changed to another derivative by a chemical synthesis method, and the derivative thus obtained can also be used effectively in the cell culture method according to the present disclosure.
  • the hydroxyl group corresponding to R 1 and / or R 2 of the compound represented by the general formula (I) is a C1-3 alkoxy group, a C1-3 alkylsulfonyl group, glucose or Derivatives substituted with monosaccharide residues such as fructose, oligosaccharide residues such as sucrose and lactose, and amino acid residues such as glycine and arginine can also be used in the present invention.
  • the compound can be cross-linked using a cross-linker such as 1-ethyl-3- (3-di-methylaminopropyI) carbodiimide (EDC).
  • the specific compound or a salt thereof may exist as an arbitrary product form depending on production conditions, and may exist as an arbitrary hydrate. These product forms, hydrates, and mixtures thereof are also included in the present invention. Contained in the range. Moreover, although it may exist as a solvate containing organic solvents, such as acetone, ethanol, and tetrahydrofuran, all of these forms are contained in the range of the cell culture method concerning this indication.
  • the specific compound used in the cell culture method according to the present disclosure is a tautomer, a geometric isomer, a tautomer or a mixture of geometric isomers generated by endocyclic or exocyclic isomerization, or a mixture thereof. May exist in the form.
  • the specific compound may be present in the form of resolved optical isomers or a mixture containing them in an arbitrary ratio regardless of whether the specific compound is generated by isomerization or not.
  • the medium used in the cell culture method according to the present disclosure may contain metal ions, for example, divalent metal ions (calcium ions, magnesium ions, zinc ions, iron ions, copper ions, etc.), preferably Contains calcium ions.
  • the metal ions can be used in combination of two or more, such as calcium ions and magnesium ions, calcium ions and zinc ions, calcium ions and iron ions, calcium ions and copper ions. Those skilled in the art can appropriately determine the combination.
  • the polymer compound aggregates through the metal ions, and the polymer compound forms a three-dimensional network (for example, the polysaccharide is microscopically through the metal ions.
  • a plastic fluid is formed (by forming a gel).
  • the concentration of the metal ions can be appropriately set within a range in which the specific compound can be used as a plastic fluid capable of holding the liquid medium without allowing the cells in the medium to settle in a stationary state.
  • the salt concentration is 0.1 mM to 300 mM, preferably 0.5 mM to 100 mM, but is not limited thereto.
  • the metal ions may be mixed with the specific compound together with a liquid medium, or a salt solution may be separately prepared and added to a medium in which the specific compound and medium components are mixed.
  • a medium that is a plastic fluid can be produced by adding a solution or dispersion of the specific compound to a liquid medium. Since the medium usually contains metal ions at a concentration sufficient for the specific compound to assemble via ions or to form a three-dimensional network, the solution or dispersion of the specific compound is A medium that is a plastic fluid can be obtained simply by adding to a liquid medium. Alternatively, a medium may be added to the solution or dispersion of the specific compound.
  • the culture medium which is a plastic fluid can be prepared by mixing a specific compound and a culture medium component in an aqueous solvent (for example, water containing ion-exchanged water or ultrapure water).
  • an aqueous solvent for example, water containing ion-exchanged water or ultrapure water.
  • a liquid medium and the specific compound (solution) are mixed, (2) the specific compound (solid such as powder) is mixed in the liquid medium, and (3) a solution of the specific compound
  • the powder medium is mixed with the dispersion, (4) the powder medium and the specific compound (solid such as powder) are mixed with an aqueous solvent, and the like, but are not limited thereto.
  • the aspect of (1) or (4) or (1) or (3) is preferable.
  • the yield value of the medium that is a plastic fluid used in the cell culture method according to the present disclosure is not limited as long as it is a plastic fluid that can hold cells in the medium without settling in a stationary state.
  • the yield value of the plastic fluid used in the cell culture method according to the present disclosure is preferably 0.02 Pa or more from the viewpoint of retaining the cells, and further, from the point of increasing the gas hold-up and improving the survival rate of the cultured cells. 0.03 Pa or more is more preferable, and 0.04 Pa or more is more preferable.
  • the yield value of the plastic fluid used in the cell culture method according to the present disclosure is, for example, 0.2 Pa or less or 0.1 Pa or less.
  • the yield value is a value measured by a rheometer, specifically a value measured by the method described in the examples.
  • any medium can be used as long as it is a medium used for culturing animal cells.
  • a medium include Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), Ham F12 Medium (Ham's Nutrient Mixture F12), DMEM / F12 Medium, McCoy 5AI Medium (McCoy's Medium) 5A Medium), Eagle MEM medium (Eagles's Minimum Essential Medium; EMEM), ⁇ MEM medium (Alpha Modified EgI's Minum Essential Medium; ⁇ MEM), MEM medium 's Modified Dulbecco's Medium; MDM), MCDB131 medium, William medium E, IPL41 medium, Fischer's medium, StemPro34 (manufactured by Invitrogen), X-VIVO10 (manufactured by Kenplex), X-VIVO 15 (manufactured by Ken
  • a medium component of the medium used in the cell culture method according to the present disclosure when the culture target is a plant-derived cell, Murashige-Skoog (MS) medium, Lindsmeyer-Skoog (LS), which is usually used for plant tissue culture.
  • Basic medium such as medium, white medium, Gamborg B5 medium, Niche medium, Heller medium, Morel medium, etc., or a modified medium in which these medium components are modified to optimum concentrations (for example, ammonia nitrogen concentration is halved, etc.)
  • auxins and, if necessary, plant growth regulators (plant hormones) such as cytokinins are added at an appropriate concentration can be mentioned as a medium.
  • auxins include 3-indoleacetic acid (IAA), 3-indolebutyric acid (IBA), 1-naphthaleneacetic acid (NAA), 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), and the like. However, it is not limited to them.
  • Auxins can be added to the medium, for example, at a concentration of about 0.1 to about 10 ppm.
  • cytokinins include, but are not limited to, kinetin, benzyladenine (BA), zeatin and the like. Cytokinins can be added to the medium, for example, at a concentration of about 0.1 to about 10 ppm.
  • the medium used in the cell culture method according to the present disclosure includes sodium, potassium, calcium, magnesium, phosphorus, chlorine, various amino acids, various vitamins, antibiotics, serum, fatty acids, sugars, and the like according to the purpose. You may add freely. When culturing animal-derived cells and / or tissues, those skilled in the art can add one or more other chemical components or biological components in combination according to the purpose.
  • Ingredients added to the medium of animal-derived cells include fetal calf serum, human serum, horse serum, insulin, transferrin, lactoferrin, cholesterol, ethanolamine, sodium selenite, monothioglycerol, 2-mercaft ethanol, Examples include bovine serum albumin, sodium pyruvate, polyethylene glycol, various vitamins, various amino acids, agar, agarose, collagen, methylcellulose, various cytokines, various hormones, various growth factors, various extracellular matrices, and various cell adhesion molecules.
  • the cells that are the subject of the cell culture method according to the present disclosure are not particularly limited, and include cells that can be cultured in suspension.
  • the cells may include animal-derived cells and plant-derived cells.
  • the cell culture method according to the present disclosure enables suspension cell culture in which both suppression of physical stress on cells and improvement of oxygen supply are possible, and thus the cell culture method is used for cells that are vulnerable to physical stress, such as regenerative medicine. Cells and plant cells can also be targeted.
  • the cell used as the object of the cell culture method concerning this indication contains the cell in a cell cluster, a sphere, and a tissue in one or a plurality of embodiments. Therefore, the cell culture method according to the present disclosure is also a cell mass, sphere, or tissue culture method in one or a plurality of embodiments.
  • Animal-derived cells include germ cells such as sperm and eggs, somatic cells that make up the living body, stem cells, progenitor cells, cancer cells that have been separated from the living body, and are immortalized by being separated from the living body and are stable outside the body.
  • Maintained cells cells isolated from living organisms and artificially modified, cells isolated from living organisms and artificially exchanged nuclei, and the like.
  • Plant-derived cells include cells isolated from each tissue of the plant body, and also include frothflasts in which cell walls have been artificially removed from the cells.
  • cells to be subjected to the cell culture method according to the present disclosure are pluripotent stem cells such as embryonic stem cells (ES cells) and induced pluripotent stem cells (iPS cells). Or, for example, multipotent stem cells such as mesenchymal stem cells, hematopoietic stem cells, tissue stem cells, and the like.
  • pluripotent stem cells such as embryonic stem cells (ES cells) and induced pluripotent stem cells (iPS cells).
  • ES cells embryonic stem cells
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • multipotent stem cells such as mesenchymal stem cells, hematopoietic stem cells, tissue stem cells, and the like.
  • the cell culture method includes disposing cells in a medium that is a plastic fluid.
  • the arrangement of the cells includes causing the cells to float in the medium, or causing the cells to be dispersed in the medium. In one or a plurality of embodiments, this step can be performed by the following method, but the arrangement method is not limited thereto.
  • cells or a dispersion liquid thereof are mixed and dispersed in a mixture of the specific chemical, medium component and water.
  • Cells placed in a medium that is a plastic fluid are maintained in a state in which sedimentation is suppressed (ie, a floating state).
  • the cells placed in the medium at the time of disclosure of the culture may be in the form of a single cell, a cell mass, a sphere, or a tissue obtained by separately preparing or culturing.
  • the cell culture method includes introducing bubbles into a medium that is a plastic fluid in which cells are arranged, and supplying oxygen to the cells to be cultured.
  • the rising speed of the bubbles introduced into the plastic fluid is suppressed as compared with the bubbles introduced into the liquid that is not the plastic fluid. This means that the bubble residence time in the plastic fluid is extended and the gas hold-up is increased. Therefore, the introduction of bubbles can be suppressed as long as oxygen necessary for cell growth can be supplied.
  • the introduction of bubbles may be continuous, or may be intermittent as long as oxygen supply necessary for cell growth can be supplied.
  • the size of the bubbles to be introduced is preferably small from the viewpoint of reducing physical stress due to foaming and reducing the rising speed, and microbubbles or sub-microbubbles are preferred.
  • Examples of the diameter of the bubbles include 500 ⁇ m or less, 100 ⁇ m or less, 50 ⁇ m or less, 25 ⁇ m or less, or 10 ⁇ m or less, and 0.1 ⁇ m or more, 1 ⁇ m or more, or 10 ⁇ m or more.
  • the method for introducing bubbles is not limited, but a sparger for culture can be used. Alternatively, a nozzle capable of introducing bubbles may be used. Air bubbles may be introduced from one place or from a plurality of places. The amount of bubbles introduced can be adjusted as appropriate depending on the relationship between the introduction location and the medium volume.
  • the medium may be agitated at a constant period in order to make the oxygen supply uniform.
  • the agitation can be a low frequency agitation within a range of physical damage that does not affect cell growth. Agitation may be continuous or intermittent.
  • the frequency of stirring can be adjusted as appropriate depending on the amount of bubbles introduced and the relationship between the introduction location and the volume of the medium.
  • the stirring step can be omitted.
  • the stirring method is not particularly limited, and may be stirring with a stirring blade, stirring by shaking the entire culture vessel, or a combination thereof. Shaking the whole culture container includes shaking or turning the culture container.
  • the medium volume in the cell culture method according to the present disclosure is not limited, but is several liters to several thousand liters, for example, 3 liters or more, 5 liters or more, 7 liters or more, 9 liters or more, 11 liters or more, 13 liters or more, or It can be 15 liters or more. Examples of the upper limit include 10,000 liters or less.
  • cell culture with a large volume of medium is possible.
  • cells that are difficult to cultivate due to physical stress by conventional mass culture methods for example, stem cells and plant cells used for regenerative medicine). Can be cultured in large quantities. This is because it is possible to achieve both suppression of physical stress on the cell and improvement of oxygen supply by introducing bubbles into the plastic fluid.
  • the cell culture method according to the present disclosure is performed in a closed culture system, for example, a closed culture container, a culture bag, a bioreactor, or a culture apparatus, from the viewpoint of preventing contamination or the like. It is preferable.
  • a method for culturing cells comprising disposing cells in a medium that is a plastic fluid in a dispersed state, and introducing bubbles into the medium.
  • the culture method according to [1] comprising disposing the cells in a state of being dispersed in a medium that is a plastic fluid.
  • the culture method according to [1] or [2], wherein the cells are cells that can be cultured in suspension.
  • [5] The culture method according to any one of [1] to [4], wherein the medium that is the plastic fluid is a medium that can retain cells in the medium without settling in a stationary state.
  • the stirring is performed by stirring with a stirring blade or shaking the entire culture vessel.
  • a cell suspension was prepared by adding a Rock inhibitor to 10 ⁇ M. This was adjusted to 1.0 ⁇ 10 5 cells / ml, seeded in a 30 ml single-use bioreactor BWV-S03A (manufactured by Able), and cultured for 24 hours to form cell clumps. Thereafter, the cells were cultured for up to 120 hours under the following two conditions. -Control of culture As a control, suspension culture of the normal medium was performed while changing the medium to the normal medium every 24 hours after 24 hours of culture.
  • plastic fluid medium A plastic fluid medium A, the same applies hereinafter
  • Compound A was added to a normal medium so that the concentration was 0.02%.
  • CO 2 Gas Mixer manufactured by Tokken
  • stirring was performed by intermittently rotating the stirring blade at 30 rpm.
  • the cell concentration was measured every 24 hours. Sampling was performed on a centrifuge tube 250 ⁇ l ⁇ 3 times. Those cultured in a normal medium were centrifuged at 170 ⁇ g for 3 minutes, and after removing the supernatant, 5 ml of Accumax (Innovative cell technologies) was added and reacted at room temperature for 10 minutes for monodisperse treatment. For cultures in plastic fluid medium A, after adding PBS and diluting 5 times, centrifuging at 170 ⁇ g for 3 minutes, removing the supernatant, adding 5 ml of Accumax and reacting at room temperature for 10 minutes. Monodispersed processing was performed.
  • centrifugation is performed again at 170 ⁇ g to remove the supernatant, and a normal medium is added for resuspension, followed by trypan blue dye exclusion using a TC20 TM fully automatic cell counter (Bio-Rad). Cell concentration was measured.
  • the beads could be retained (suppress bead sedimentation) at 0.3% or more, and the physical properties of the plastic fluid were exhibited. Further, as a result of suppressing the rising speed of the bubbles, the retention of the bubbles was observed when the compound B was 0.5% or more. The yield value could be measured when Compound B was 0.4% or more, and the yield value at 0.4% was 0.036 Pa. The yield value of the liquid composition containing 0.3% or less of Compound B was lower than the detection sensitivity of the substrate used.
  • FIG. 2 shows images at the time of pipetting, at the end of pipetting, and after 5 seconds and 15 seconds. From this image, it is confirmed that the cell agglomerates that were uniformly diffused in the medium after pipetting settled in the normal medium, whereas the cell agglomerates were retained in the culture medium in the plastic fluid medium A. It was done. Therefore, by using plastic fluid, it is possible to stir the culture fluid in a shear stress environment and generate a fluid flow, and it occurs by pipetting in a shearless (no or no shear stress) environment. The liquid flow immediately stops, suggesting that cell clumps can be retained in the liquid.
  • FIG. 5 shows representative images at various times of suspension culture in which sparging was performed using the control and plastic fluid medium A. As a result, it was confirmed that even in suspension culture with sparging, the agglomerate diameter increased in the same manner as in suspension culture of a normal medium as a control.
  • FIG. 6 shows the time-dependent change in cell concentration. From this result, it was confirmed that in the case of plastic fluid medium A, hiPS cells, which are animal cells, can be proliferated in the same manner as suspension culture of a normal medium even if sparging is performed. These results suggest that oxygen can be supplied by sparging even in larger scale bioreactors. On the other hand, in the case of suspension culture of a normal medium (that is, in the case of only oxygen supply by surface aeration), the gas-liquid interface area per unit volume decreases as the amount of the culture solution increases. In culture using a large volume of medium such as more than that, it is considered that oxygen supply is not in time.
  • FIG. 7 shows the state of cell clumps over time.
  • FIG. 8 shows the state of cell density over time.
  • concentration condition Compound A 0.02%
  • the concentration condition Compound A 0.052%
  • the cell aggregate diameter tends to decrease over time and the outline of the cell aggregate changes from a smooth shape to a distorted shape. It was done.
  • Cell density also decreased with time.
  • the cell aggregate diameter and the cell density tended to be maintained under the concentration condition (Compound A 0.05%) in which retention of bubbles in the liquid was confirmed.
  • the results of calculating the survival rate ⁇ after 24 hours of culture from the cell density results are shown in Table 3 below.
  • the cell density and viability showed a tendency to decrease under the concentration conditions where the bubbles were not retained (Compound A 0.02%), whereas under the concentration conditions where the bubbles were retained (Compound A 0.05%), An initial increase in cell density and subsequent maintenance was confirmed. From the above, it was confirmed that by using a plastic fluid medium, bubbles can be retained in the liquid and oxygen can be supplied accordingly.
  • Plastic fluid suspension culture under conditions where oxygen supply is limited to sparging As shown in FIG. 9, an apparatus was prepared in which oxygen supply was performed only from bubbles (sparging) supplied in the liquid. The apparatus continuously purges nitrogen from the upper part of the apparatus to replace the space above the liquid with nitrogen, and oxygen is supplied only from bubbles supplied into the liquid from one nozzle at the lower part. According to the apparatus, cell culture under bubble supply (sparging) can be achieved by performing cell culture with bubble ventilation.
  • HiPS cells (D2) pre-cultured on a two-dimensional plane were exfoliated and monodispersed from the culture surface using 5 mM EDTA / PBS, TrypLE TM select treatment.
  • the cell suspension was adjusted to a seeding density of 1.0 ⁇ 10 5 cells / mL with StemFit (trademark) AK02N adjusted to 10 mM Rock inhibitor Y-27632, seeded in 30 mL of Single use bioreactor, and pre-cultured for 48 hours. After 48 hours, the cell clumps were collected, and the cell clumps were seeded on a plastic medium containing Compound A.
  • BWV-S10A Single nozzle bioreactor (Fujimori Kogyo) Gas composition: 5% CO 2 Air Measurement environment: 37 °C Incubator Working volume: 90 mL Observation period: 24 h Reagents used: TrypLETM select (1X) (Gibco) : Rock inhibitor Y-27632 (Sigma) : Ethylenediamine-N, N, N ', N'-tetraacetic acid, disodium salt, dihydrate (EDTA, Dojindo) : Compound A: 0.05%
  • the cell density was higher after 24 hours of culture under the condition with sparging.
  • the specific growth rate ⁇ app (h ⁇ 1 ) up to 24 h of culture shows a higher value than that of the control under conditions with sparging, and apparent specific growth in the three-dimensional static culture. A value similar to the speed was shown. From these results, it was assumed that oxygen was insufficient for cell growth under control conditions and the growth rate was reduced. It was confirmed that oxygen supply to the hiPS cell culture system by sparging was possible using the plastic fluid medium. Moreover, since the specific growth rate of the same level as 3D static culture was shown in that case, it was confirmed that the shear stress by sparging was suppressed by the plastic fluid.
  • the cell culture method according to the present disclosure it is possible to perform floating cell culture in which suppression of physical stress on cells and improvement of oxygen supply are compatible. According to the cell culture method according to the present disclosure, even in suspension cell culture using a large amount of medium volume such as several to several tens of liters or more, it is possible to suppress physical stress on cells and to supply oxygen. It is considered that it is possible to achieve both improvement and mass culture of cells that are vulnerable to physical stress, such as cells and plant cells used in regenerative medicine.

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Abstract

物理的ストレスが低減された酸素供給が可能な、細胞の培養方法の提供。 塑性流体である培地中に細胞を分散した状態で配置すること、及び、該培地に気泡を導入することを含む細胞培養方法に関する。

Description

細胞の培養方法
　本開示は、塑性流体を用いた細胞の培養方法に関する。
　ヒトｉＰＳ（ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ）細胞を用いた再生医療が、ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｈａｍｓｔｅｒ　Ｏｖａｒｙ）細胞を用いた抗体医薬生産など、動物細胞を利用した技術の活用が進められている。２次元な平面培養と比べて、細胞を懸濁液状態で培養する３次元培養は単位体積当たりの細胞濃度を高められることで省スペース化や、使用培地量の削減できるなどメリットがある。
　一方で、高い細胞濃度に到達した培養では、細胞の酸素消費速度が大きくなり、培養液中において酸素供給律側が発生する。常温常圧で液中に溶解できる酸素濃度は７－８ｍｇ／Ｌ程度である。酸素は液中に十分な濃度で保持させることができない栄養成分といえる。
　気相から液相への酸素供給（物質移動）を増大させる方法として、気液接触面の面積を増やすことが挙げられる。微生物のような頑強な細胞の培養では、培地中にスパージャー等を用いて小さく砕かれた泡の通気（バブリング）を行うことができる。しかし、動物細胞一般はシェアストレスへの耐性が十分でなくバブリングが適用できない。
　他にも、泡の発生や、泡と細胞との接触を防ぐような構造を設けた方法がいくつか提案されている。しかしながら、基本的に、動物細胞培養へのバブリングによる通気は実現されていない。
　動物細胞の培養における通気は、主に小型培養槽においては、培養液の気液界面における酸素移動に頼った表面通気法によること、及び、単位体積当たりの気液界面面積を増やすために培地中に疎水性膜チューブを張り巡らす方法によることが一般的である。しかしながら、前者の方法は、培養液量が増加するに従い単位体積当たりの気液界面面積が低下するため、例えば数～数十リットル又はそれ以上などのような、大量の培地体積を用いる培養には適用が難しい。また、後者の方法は、培養槽内が複雑な構造となるため汚染（コンタミネーション）のリスクが高くなることが予想され、実用的でないと考えられる。
　一方、撹拌することなく細胞の浮遊状態を維持して培養できる培地として、特許文献１は、アニオン性官能基を有する高分子化合物又は多糖類を含有する培地組成物を開示する。
国際公開２０１４／０１７５１３パンフレット
　上述したとおり、基本的に、動物細胞培養へのバブリングによる通気は実現されていない。なお、ＣＨＯ細胞では大型培養槽へのバブリングが行われる事例も知られているが、これはある程度の細胞へのシェアストレスダメージを許容している状態である。再生医療等に用いる細胞の培養は、細胞への物理的ストレスは少ないことが好ましい。また、再生医療用の培地はＣＨＯ細胞用の培地に比べて含有するタンパク質の濃度が高く、バブリングによる発泡が問題となる。
　本開示は、一又は複数の実施形態において、物理的ストレスが低減された酸素供給が可能な、細胞の培養方法を提供する。
　本開示は、一態様において、塑性流体である培地中に細胞を配置すること、及び、該培地に気泡を導入することを含む、細胞培養方法に関する。
　本開示にかかる細胞培養方法によれば、一又は複数の実施形態において、細胞に対する物理的ストレスの抑制と、酸素供給の向上とが両立された浮遊細胞培養が可能となる。また、本開示にかかる細胞培養方法によれば、一又は複数の実施形態において、培地体積が大きな浮遊細胞培養においても、細胞に対する物理的ストレスの抑制と、酸素供給の向上との両立が可能となり、物理的ストレスに弱い細胞、例えば、再生医療に使用する細胞や植物細胞など、の大量培養が可能となる。
図１は、ニュートン流体（通常培地）と塑性流体培地Ａにおける気泡の上昇スピードを調べた結果の一例を示す。 図２は、ニュートン流体（通常培地）と塑性流体培地Ａにおける細胞集塊の分散状態を調べた結果の一例を示す。 図３は、塑性流体培地Ａに気泡導入（スパージング）した場合における気泡上昇部付近の細胞の挙動（○）を調べた結果の一例を示す。 図４は、塑性流体培地Ａに気泡導入（スパージング）した場合における気泡上昇部付近から少し離れた位置の細胞の挙動（○）を調べた結果の一例を示す。 図５は、コントロールの培地と塑性流体培地Ａで気泡導入（スパージング）しながら浮遊培養した培養液中の細胞集塊の各時間における代表的な画像を示す。 図６は、コントロールの培地（●）と塑性流体培地Ａ（◇）で気泡導入（スパージング）しながら浮遊培養した培養液中の細胞濃度の経時変化の一例を示す。 図７は、異なる降伏値条件下における酸素供給と細胞増殖を確認した結果であって、細胞集塊の顕微鏡観察写真の一例を示す。 図８は、異なる降伏値条件下における酸素供給と細胞増殖を確認した結果であって、細胞集塊の細胞密度の時間経過のグラフの一例を示す。 図９は、酸素供給がスパージングからのみとすることが可能な培養装置の概略図を示す。 図１０は、図９の培養装置にてスパージングを行った培養と行わないコントロール培養における２４時間後の細胞密度の結果のグラフの一例を示す。 図１１は、図９の培養装置にてスパージングを行った培養と行わないコントロール培養、並びに三次元静置培養における２４時間後までの培養のみかけの比増殖速度を比較するグラフの一例を示す。
　本開示は、塑性流体に気泡を導入するという酸素供給方法を組み合わせることで、細胞に対する物理的ストレスの抑制と、酸素供給の向上とが両立された浮遊細胞培養が可能となる、という知見に基づく。
　塑性流体に気泡を導入するという酸素供給方法を組み合わせることで、細胞に対する物理的ストレスの抑制と、酸素供給の向上とが両立された浮遊細胞培養が可能となるメカニズムは、以下にように推測される。
　塑性流体を使用することで、細胞が沈降することなく流体中に保持される。例えば、細胞の浮遊状態が維持され、或いは、細胞を分散させればその分散状態が維持される。これにより、細胞を浮遊させるための撹拌が必要なくなり、物理的ストレスを省くことができる。
　塑性流体中に導入された気泡は、その上昇速度が抑制される。これは、塑性流体における気泡の滞留時間が延長され、ガスホールドアップが増大することを意味する。
　気泡の滞留時間が延長されると、気泡１個当たりの酸素供給量（物質移動）が向上し、通気量を減じることができ、対流や発泡による物理的ストレスが抑制される。
　ガスホールドアップが増大すると、単位培地当たりの見かけの溶存酸素量が増大し、高濃度の細胞培養が可能となる。
　塑性流体中に導入された気泡の移動は、一時的かつ局所的な流動である。気泡の上昇部以外は流動せず、気泡上昇による対流も抑制される。これにより物理的ストレス、例えばシェアストレスなど、が抑制された環境が維持される。
　但し、本開示はこれらのメカニズムに限定して解釈されなくてもよい。
　［塑性流体］
　本開示において、塑性流体とは、流動させるために降伏応力が必要な流体、すなわち、降伏値を持つ流体をいう。塑性流体は、ビンガム流体であってもよく、非ビンガム流体であってもよい。本開示において、塑性流体とは、静置状態において、該塑性流体中の細胞を沈降させずに保持できるものをいう。
　［塑性流体である培地］
　本開示において、塑性流体である培地とは、培地成分と特定化合物とを含有する塑性流体をいい、限定されない一又は複数の実施形態において、液体培地と特定化合物とが混合されて塑性流体となったものが挙げられる。
　前記培地成分及び前記液体培地は、本開示にかかる方法で培養する細胞に応じて通常使用されうる培地成分及び液体培地が使用できる。
　前記特定化合物は、塑性流体ではない液体又は培地を塑性流体とすることができる化合物であり、限定されない一又は複数の実施形態において、ＷＯ２０１４／０１７５１３に開示されるものが使用できる。
　［塑性流体とするための特定化合物］
　塑性流体とするための前記特定化合物としては、特に制限されるものではないが、高分子化合物が挙げられ、好ましくはアニオン性の官能基を有する高分子化合物が挙げられる。
　アニオン性の官能基としては、カルボキシ基、スルホ基、リン酸基及びそれらの塩が挙げられ、カルボキシ基またはその塩が好ましい。
　前記高分子化合物は、前記アニオン性の官能基の群より選択される１種又は２種以上を有するものを使用できる。
　塑性流体とするための前記特定化合物の好ましい具体例としては、特に制限されるものではないが、単糖類（例えば、トリオース、テトロース、ペントース、ヘキソース、ヘプトース等）が１０個以上重合した多糖類が挙げられ、より好ましくは、アニオン性の官能基を有する酸性多糖類が挙げられる。ここにいう酸性多糖類とは、その構造中にアニオン性の官能基を有すれば特に制限されないが、例えば、ウロン酸（例えば、グルクロン酸、イズロン酸、ガラクツロン酸、マンヌロン酸）を有する多糖類、構造中の一部に硫酸基又はリン酸基を有する多糖類、或いはその両方の構造を持つ多糖類であって、天然から得られる多糖類のみならず、微生物により産生された多糖類、遺伝子工学的に産生された多糖類、或いは酵素を用いて人工的に合成された多糖類も含まれる。より具体的には、ヒアルロン酸、ジェランガム、脱アシル化ジェランガム（以下、ＤＡＧという場合もある）、ラムザンガム、ダイユータンガム、キサンタンガム、カラギーナン、ザンタンガム、ヘキスロン酸、フコイダン、ペクチン、ペクチン酸、ペクチニン酸、へパラン硫酸、ヘパリン、へパリチン硫酸、ケラト硫酸、コンドロイチン硫酸、デルタマン硫酸、ラムナン硫酸及びそれらの塩からなる群より１種又は２種以上から構成されるものが例示される。多糖類は、好ましくは、ヒアルロン酸、ＤＡＧ、ダイユータンガム、キサンタンガム、カラギーナン又はそれらの塩であり、低濃度の使用で細胞又は組織を浮遊させることができ、かつ細胞又は組織の回収のしやすさを考慮すると、より好ましくは、ＤＡＧである。ここでいう塩とは、例えば、リチウム、ナトリウム、カリウムといったアルカリ金属の塩、カルシウム、バリウム、マグネシウムといったアルカリ土類金属の塩又はアルミニウム、亜鉛、鋼、鉄、アンモニウム、有機塩基及びアミノ酸等の塩が挙げられる。
　これらの高分子化合物（多糖類等）の重量平均分子量は、好ましくは１０，０００～５０，０００，０００であり、より好ましくは１００，０００～２０，０００，０００、更に好ましくは１，０００，０００～１０，０００，０００である。例えば、当該分子量は、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によるフルラン換算で測定できる。さらに、ＤＡＧはリン酸化したものを使用することもできる。当該リン酸化は公知の手法で行うことができる。
　前記多糖類は、一又は複数の実施形態において、複数種（好ましくは２種）組み合わせて使用することができる。多糖類の組み合わせの種類は特に限定されないが、好ましくは、当該組合せは少なくともＤＡＧ又はその塩を含む。即ち、好適な多糖類の組合せには、ＤＡＧ又はその塩、及びＤＡＧ又はその塩以外の多糖類（例、キサンタンガム、アルギン酸、カラギ－ナン、ダイユータンガム、メチルセルロース、ローカストビーンガム又はそれらの塩）が含まれる。具体的な多糖類の組み合わせとしては、ＤＡＧとラムザンガム、ＤＡＧとダイユータンガム、ＤＡＧとキサンタンガム、ＤＡＧとカラギーナン、ＤＡＧとザンタンガム、ＤＡＧとローカストビーンガム、ＤＡＧとκ－カラギーナン、ＤＡＧとアルギン酸ナトリウム、ＤＡＧとメチルセルロース等が挙げられるが、これらに限定されない。
　塑性流体とするための前記特定化合物の更に好ましい具体例としては、ヒアルロン酸、脱アシル化ジェランガム、ダイユータンガム、カラギーナン及びキサンタンガム及びそれらの塩が挙げられ、好ましい例としては脱アシル化ジェランガムまたはその塩が挙げられる。本開示において脱アシル化ジェランガムとは、１－３結合したグルコース、１－４結合したグルクロン酸、１－４結合したグルコース及び１－４結合したラムノースの４分子の糖を構成単位とする直鎖状の高分子多糖類であり、以下の一般式（Ｉ）においてＲ1、Ｒ2が共に水素原子であり、ｎが２以上の整数で表わされる多糖類である。ただし、Ｒ1がグリセリル基を、Ｒ2がアセチル基を含んでいてもよいが、アセチル基及びグリセリル基の含有量は、好ましくは１０％以下であり、より好ましくは１％以下である。
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　前記特定化合物により塑性流体となるメカニズムは様々であるが、脱アシル化ジェランガムの場合について記載すると、脱アシル化ジェランガムは、液体培地と混合した際に、液体培地中の金属イオン（例えば、カルシウムイオン）を取り込み、当該金属イオンを介した不定形な構造体を形成し、細胞及び／又は組織を浮遊させる。脱アシル化ジェランガムから調製される塑性流体である培地の粘度は、一又は複数の実施形態において、８ｍＰａ・ｓ以下であり、好ましくは４ｍＰａ・ｓ以下であり、細胞または組織の回収のしやすさの点を考慮すると、より好ましくは２ｍＰａ・ｓ以下である。しかし、本開示にかかる細胞培養方法における塑性流体である培地の粘度は、特に制限されず、上記値より大きくてもよい。
　塑性流体とするための前記特定化合物は、化学合成法でも得ることができるが、当該化合物が天然物である場合は、当該化合物を含有している各種植物、各種動物、各種微生物から慣用技術を用いて抽出及び分離精製することにより得るのが好適である。その抽出においては、水や超臨界ガスを用いると当該化合物を効率よく抽出できる。例えば、ジェランガムの製造方法としては、発酵培地で生産微生物を培養し、菌体外に生産された粘膜物を通常の精製方法にて回収し、乾燥、粉砕等の工程後、粉末状にすればよい。また、脱アシル化ジェランガムの場合は、粘膜物を回収する際にアルカリ処理を施し、１－３結合したグルコース残基に結合したグリセリル基とアセチル基を脱アシル化した後に回収すればよい。精製方法としては、例えば、液－液抽出、分別沈澱、結品化、各種のイオン交換クロマトグラフィー、セファデックスＬＨ－２０等を用いたゲル漏過クロマトグラフィー、活性炭、シリカゲル等による吸着クロマトグラフィーもしくは薄層クロマトグラフィーによる活性物質の吸脱着処理、あるいは逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー等を単独あるいは任意の順序に組み合わせ、また反復して用いることにより、不純物を除き精製することができる。ジェランガムの生産微生物の例としてはこれに限定されるものではないが、スフィンゴモナス・エロディア（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ　ｅｌｏｄｅａ）及び当該微生物の遺伝子を改変した微生物が挙げられる。
　脱アシル化ジェランガムの場合、市販のもの、例えば、三品株式会社製「ＫＥＬＣＯＧＥＬ（シーピー・ケルコ社の登録商標）ＣＧーＬＡ」、三栄源エフ・エフ・アイ株式会社製「ケルコゲル（シーピー・ケルコ社の登録商標）」等を使用することができる。また、ネイティブ型ジェランガムとして、三栄源エフ・エフ・アイ株式会社製「ケルコゲル（シーピー・ケルコ社の登録商標）ＨＴ」等を使用することができる。
　［塑性流体である培地中の特定化合物の濃度］
　塑性流体である培地中の前記特定化合物の濃度（質量／容量％、以下単に％で示す）は、特定化合物の種類に依存し、静置状態において培地中の細胞を沈降させずに保持できる塑性流体とすることのできる範囲で適宜設定することができるが、通常０．０００５％～１．０％、好ましくは０．００１％～０．４％、より好ましくは０．００５％～０．１％、さらに好ましくは０．００５％～０．０５％である。例えば、脱アシル化ジェランガムの場合、０．００１％～１．０％、好ましくは０．００３％～０．５％、より好ましくは０．００５％～０．１％、更に好ましくは０．０１％～０．０５％、更により好ましくは０．０２％～０．０５％である。キサンタンガムの場合、０．００１％～５．０％、好ましくは０．０１％～１．０％、より好ましくは０．０５％～０．６％、更により好ましくは０．３％～０．６％である。κ－カラギーナンおよびローカストビーンガム混合系の場合、０．００１％～５．０％、好ましくは０．００５％～１．０％、より好ましくは０．０１％～０．１％、最も好ましくは０．０３％～０．０５％である。ネイティブ型ジェランガムの場合、０．０５％～１．０％、好ましくは０．０５％～０．１％である。
　上記多糖類を複数種（好ましくは２種）組み合わせて使用する場合、当該多糖類の濃度は、静置状態において培地中の細胞を沈降させずに保持できる塑性流体とすることのできる範囲で適宜設定することができる。例えば、ＤＡＧ又はその塩と、ＤＡＧ又はその塩以外の多糖類との組合せを用いる場合、ＤＡＧ又はその塩の濃度としては０．００５～０．０２％、好ましくは０．０１～０．０２％が例示され、ＤＡＧ又はその塩以外の多糖類の濃度としては、０００５～０．４％、好ましくは０．１～０．４％が例示される。具体的な濃度範囲の組合せとしては、以下が例示される。
ＤＡＧ又はその塩：０．００５～０．０２％（好ましくは０．０１～０．０２％）
ＤＡＧ以外の多糖類
キサンタンガム：０．１～０．４％
アルギン酸ナトリウム：０．１～０．４％
ロ一カトビーンガム：０．１～０．４％
メチルセルロース：０．１～０．４％（好ましくは０．２～０．４％）
カラギーナン：０．０５～０．１％
ダイユータンガム：０．０５～０．１％
　なお該濃度は、以下の式で算出できる。
濃度（％）＝特定化合物の質量（ｇ）／培地の容量（ｍｌ）×１００
　前記特定化合物は、化学合成法によってさらに別の誘導体に変えることもでき、そのようにして得た当該誘導体も、本開示にかかる細胞培養方法において有効に使用できる。具体的には、脱アシル化ジェランガムの場合、前記一般式（Ｉ）で表される化合物のＲ1及び／又はＲ2に当たる水酸基を、Ｃ１－３アルコキシ基、Ｃ１－３アルキルスルホニル基、グルコースあるいはフルクトースなどの単糖残基、スクロース、ラクトースなどのオリゴ糖残基、グリシン、アルギニンなどのアミノ酸残基などに置換した誘導体も本発明に使用できる。また、１－ｅｔｈｙｌ－３－（３－ｄｉ－ｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙＩ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ（ＥＤＣ）等のクロスリンカーを用いて当該化合物を架橋することもできる。
　前記特定化合物或いはその塩は製造条件により任意の結品形として存在することができ、任意の水和物として存在することができるがこれら結品形や水和物及びそれらの混合物も本発明の範囲に含有される。また、アセトン、エタノール、テトラヒドロフランなどの有機溶媒を含む溶媒和物として存在することもあるが、これらの形態はいずれも本開示にかかる細胞培養方法の範囲に含有される。
　本開示にかかる細胞培養方法に使用される特定化合物は、環内或いは環外異性化により生成する互変異性体、幾何異性体、互変異性体若しくは幾何異性体の混合物、又はそれらの混合物の形で存在しもよい。本開示において前記特定化合物は、異性化により生じるか否かに拘わらず、不斉中心を有する場合は、分割された光学異性体或いはそれらを任意の比率で含む混合物の形で存在してよい。
　本開示にかかる細胞培養方法に使用される培地には、金属イオン、例えば２価の金属イオン（カルシウムイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、鉄イオンおよび銅イオン等）が存在してもよく、好ましくはカルシウムイオンを含有する。当該金属イオンは、例えばカルシウムイオンとマグネシウムイオン、カルシウムイオンと亜鉛イオン、カルシウムイオンと鉄イオン、カルシウムイオンと銅イオンのように、２種類以上を組み合わせて使用することができる。当業者は適宜その組み合わせを決定することができる。一態様において、培地に金属イオンが含まれることにより、高分子化合物が金属イオンを介して集合し、高分子化合物が三次元ネットワークを形成することにより（例えば、多糖類が金属イオンを介してマイクロゲルを形成することにより）塑性流体が形成される。金属イオンの濃度は、特定化合物が液体培地を、静置状態において培地中の細胞を沈降させずに保持できる塑性流体とすることのできる範囲で、適宜設定することができる。塩濃度は０．１ｍＭ～３００ｍＭで、好ましくは０．５ｍＭ～１００ｍＭであるが、これらに限定されない。当該金属イオンは、液体培地と共に前記特定化合物と混合する、あるいは、塩溶液を別途調製しておき、特定化合物と培地成分とを混合した培地に添加してもよい。
　［塑性流体である培地の製造方法］
　塑性流体である培地は、一又は複数の実施形態において、前記特定化合物の溶液又は分散液を液体培地に添加することにより製造できる。培地には通常、前記特定化合物がイオンを介して集合、あるいは、前記特定化合物が三次元のネットワークを形成するのに十分な濃度の金属イオンが含まれるので、前記特定化合物の溶液又は分散液を液体培地に添加するのみで、塑性流体である培地を得ることができる。あるいは、前記特定化合物の溶液又は分散液に培地を添加してもよい。さらに、塑性流体である培地は、特定化合物と培地成分とを、水性溶媒（例えばイオン交換水や超純水等を含む水）中で混合して調製することもできる。混合の態様としては、（１）液体培地と前記特定化合物（溶液）とを混合する、（２）液体培地に前記特定化合物（粉末等の固体）を混合する、（３）前記特定化合物の溶液又は分散液に粉末培地を混合する、（４）粉末培地及び前記特定化合物（粉末等の固体）を水性溶媒と混合する、等が挙げられるが、これらに限定されない。塑性流体である培地における特定化合物の分布が不均一になるのを防ぐために、（１）若しくは（４）又は（１）若しくは（３）の態様が好ましい。
　［塑性流体である培地の降伏値］
　本開示にかかる細胞培養方法に用いる塑性流体である培地の降伏値は、静置状態において培地中の細胞を沈降させずに保持できる塑性流体であれば制限されない。本開示にかかる細胞培養方法で使用する塑性流体の降伏値は、細胞を保持する観点から、０．０２Ｐａ以上が好ましく、さらに、ガスホールドアップを増大させ培養細胞の生存率を向上させる点から、０．０３Ｐａ以上がより好ましく、０．０４Ｐａ以上がさらに好ましくい。本開示にかかる細胞培養方法で使用する塑性流体の降伏値は、例えば、０．２Ｐａ以下又は０．１Ｐａ以下である。降伏値は、レオメータで測定される値であり、具体的には実施例に記載の方法で測定される値である。
　［培地］
　本開示にかかる細胞培養方法に使用される培地の培地成分としては、培養対象が動物由来の細胞である場合、動物細胞の培養に用いられる培地であればいずれも用いることができる。このような培地としては、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ＥａｇＩｅｓ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ；ＤＭＥＭ）、ハムＦ１２培地（Ｈａｍ’ｓ　Ｎｕｔｒｉｅｎｔ　Ｍｉｘｔｕｒｅ　Ｆ１２）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、マッコイ５ＡＩ培地（ＭｃＣｏｙ’ｓ　５Ａ　Ｍｅｄｉｕｍ）、イーグルＭＥＭ培地（Ｅａｇｌｅｓ’ｓ　Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ；ＥＭＥＭ）、αＭＥＭ培地（ａｌｐｈａ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ＥａｇＩｅｓ’ｓ　Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ；αＭＥＭ）、ＭＥＭ培地（Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ）、ＲＰＭｌ１６４０培地、イスコフ改変ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ；ＩＭＤＭ）、ＭＣＤＢ１３１培地、ウィリアム培地Ｅ、ＩＰＬ４１培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、ＳｔｅｍＰｒｏ３４（インビトロジェン社製）、Ｘ－ＶＩＶ０　１０（ケンプレックス社製）、Ｘ－ＶＩＶＯ　１５（ケンプレックス社製）、ＨＰＧＭ（ケンプレックス社製）、ＳｔｅｍＳｐａｎ　Ｈ３０００（ステムセルテクノロジー社製）、ＳｔｅｍＳｐａｎＳＦＥＭ（ステムセルテクノロジー社製）、ＳｔｅｍｌｉｎｅｌＩ（シグマアルドリッチ社製）、ＱＢＳＦ－６０（クオリティバイオロジカル社製）、ＳｔｅｍＰｒｏｈＥＳＣＳＦＭ（インビトロジェン社製）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８（登録商標）培地（ギブコ社製）、ｍＴｅＳＲ１或いは２培地（ステムセルテクノロジー社製）、リプロＦＦ或いはリプロＦＦ２（リプロセル社製）、ＰＳＧｒｏｈＥＳＣ／ｉＰＳＣ培地（システムバイオサイエンス社製）、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（登録商標）培地（バイオロジカルインダストリーズ社製）、ＣＳＴＩ－７培地（細胞科学研究所社製）、ＭｅｓｅｎＰＲＯＲＳ培地（ギブコ社製）、ＭＦ－Ｍｅｄｉｕｍ（登録商標）閏葉系幹細胞増殖培地（東洋紡株式会社製）、Ｓｆ－９００ＩＩ（インビトロジェン社製）、Ｏｐｔｉ－Ｐｒｏ（インビトロジェン社製）、などが挙げられる。
　本開示にかかる細胞培養方法に使用される培地の培地成分としては、培養対象が植物由来の細胞である場合、植物組織培養に通常用いられるムラシゲ・スクーグ（ＭＳ）培地、リンズマイヤー・スクーグ（ＬＳ）培地、ホワイト培地、ガンボーグＢ５培地、ニッチェ培地、ヘラー培地、モーレル培地等の基本培地、或いは、これら培地成分を至適濃度に修正した修正培地（例えば、アンモニア態窒素濃度を半分にする等）に、オーキシン類及び必要に応じてサイトカイニン類等の植物生長調節物質（植物ホルモン）を適当な濃度で添加した培地が培地として挙げられる。これらの培地には、必要に応じて、カゼイン分解酵素、コーンスティーフリカー、ビタミン類等をさらに補充することができる。オーキシン類としては、例えば、３－インドール酢酸（ＩＡＡ）、３－インドール酪酸（ＩＢＡ）、１－ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、２，４－ジクロロフエノキシ酢酸（２，４－Ｄ）等が挙げられるが、それらに限定されない。オーキシン類は、例えば、約０．１～約１０ｐｐｍの濃度で培地に添加され得る。サイトカイニン類としては、例えば、カイネチン、ベンジルアデニン（ＢＡ）、ゼアチン等が挙げられるが、それらに限定されない。サイトカイニン類は、例えば、約０．１～約１０ｐｐｍの濃度で培地に添加され得る。
　本開示にかかる細胞培養方法に使用される培地には、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、リン、塩素、各種アミノ酸、各種ビタミン、抗生物質、血清、脂肪酸、糖などを当業者は目的に応じて自由に添加してもよい。動物由来の細胞及び／又は組織培養の際には、当業者は目的に応じてその他の化学成分あるいは生体成分を一種類以上組み合わせて添加することもできる。動物由来の細胞の培地に添加される成分としては、ウシ胎児血清、ヒト血清、ウマ血清、インシュリン、トランスフェリン、ラクトフエリン、コレステロール、エタノールアミン、亜セレン酸ナトリウム、モノチオグリセロール、２－メルカフトエタノール、ウシ血清アルブミン、ピルビン酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、各種ビタミン、各種アミノ酸、寒天、アガロース、コラーゲン、メチルセルロース、各種サイトカイン、各種ホルモン、各種増殖因子、各種細胞外マトリックスや各種細胞接着分子などが挙げられる。
　［培養される細胞］
　本開示にかかる細胞培養方法の対象となる細胞は、特に制限されず、懸濁培養可能な細胞が挙げられる。該細胞は、一又は複数の実施形態において、動物由来の細胞及び植物由来の細胞が含まれうる。本開示にかかる細胞培養方法は、細胞に対する物理的ストレスの抑制と、酸素供給の向上とが両立された浮遊細胞培養が可能となるから、物理的ストレスに弱い細胞、例えば、再生医療に使用する細胞や植物細胞なども対象とすることができる。
　本開示にかかる細胞培養方法の対象となる細胞は、一又は複数の実施形態において、細胞塊、スフィア、組織における細胞を含む。よって、本開示にかかる細胞培養方法は、一又は複数の実施形態において、細胞塊、スフィア、組織の培養方法でもある。
　動物由来の細胞には、精子や卵子などの生殖細胞、生体を構成する体細胞、幹細胞、前駆細胞、生体から分離された癌細胞、生体から分離され不死化能を獲得して体外で安定して維持される細胞（細胞株）、生体から分離され人為的に遺伝子改変が成された細胞、生体から分離され人為的に核が交換された細胞等が含まれうる。
　植物由来の細胞には、植物体の各組織から分離した細胞が含まれ、当該細胞から細胞壁を人為的に除いたフロトフラストも含まれる。
　本開示にかかる細胞培養方法の対象となる細胞は、一又は複数の実施形態において、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）などのような、多能性幹細胞であり、或いは、例えば、間葉系幹細胞、造血幹細胞及び組織幹細胞などのような、多分化能幹細胞が挙げられる。
　［細胞の配置］
　本開示にかかる細胞培養方法は、塑性流体である培地中に細胞を配置することを含む。細胞の配置は、細胞を該培地中に浮遊する状態となるようにすること、或いは、細胞を該培地中に分散した状態となるようにすることを含む。この工程は、一又は複数の実施形態において、以下の方法で行うことができるが、配置方法はこれらに限定されない。まず、前記特定化学物又はその溶液若しくは分散液を混合する前の液体培地に細胞を分散させておくことが挙げられる。次に、前記特定化学物と培地成分と水とが混合されたものに、細胞又はその分散液を混合して分散させることが挙げられる。
　塑性流体である培地に配置された細胞は、沈降が抑制された状態（すなわち、浮遊した状態）が維持される。
　本開示にかかる細胞培養方法において、培養の開示時に培地に配置される細胞は、別途調製又は培養されて得られた細胞単独、細胞塊、スフィア、又は組織の形態であってもよい。
　［気泡の導入］
　本開示にかかる細胞培養方法は、細胞が配置された塑性流体である培地に、気泡を導入し、培養される細胞に酸素を供給することを含む。
　塑性流体に導入された気泡は、塑性流体ではない液体に導入された気泡に比べ、その上昇速度が抑制される。これは、塑性流体における気泡の滞留時間が延長され、ガスホールドアップが増大することを意味する。したがって、気泡の導入は、細胞の増殖に必要な酸素供給ができる範囲で抑制することができる。気泡の導入は連続的でもよく、あるいは、細胞の増殖に必要な酸素供給ができる範囲で間欠的でもよい。
　［気泡］
　導入する気泡のサイズは、発泡による物理ストレスを低減する点及び上昇速度を低減する点から、小さいことが好ましく、マイクロバブル又はサブマイクロバブルが好ましい。気泡の直径としては、例えば、５００μｍ以下、１００μｍ以下、５０μｍ以下、２５μｍ以下、又は１０μｍ以下が挙げられ、そして、０．１μｍ以上、１μｍ以上、又は１０μｍ以上が挙げられる。
　［気泡の導入方法］
　気泡の導入方法は、限定されないが、培養用のスパージャーを利用できる。或いは、気泡の導入な可能なノズルを用いてもよい。気泡の導入は、一カ所からでもよく、複数カ所からでもよい。気泡の導入量は、導入箇所と培地体積との関係で適宜調節されうる。
　［撹拌］
　塑性流体中に導入された気泡の移動は、一時的かつ局所的な流動である。気泡の上昇部以外は流動せず、気泡上昇による対流も抑制される。よって、本開示にかかる細胞培養方法は、一又は複数の実施形態において、酸素供給を均一化するために一定周期で培地を撹拌してもよい。該撹拌は、細胞増殖に影響を及ぼさない程度の物理ダメージの範囲の低頻度の撹拌とすることができる。撹拌は連続的でもよく、あるいは、間欠的でもよい。撹拌の頻度は、気泡の導入量や導入箇所と培地体積との関係で適宜調節されうる。
　複数カ所から気泡を導入することで撹拌の工程は省くことも可能である。
　撹拌の方法は特に限定されず、攪拌翼による撹拌、培養容器全体の振とうによる撹拌、又はこれらの組み合わせであってよい。培養容器全体の振とうとしては、培養容器を揺らすこと又は回すことが挙げられる。
　［培地体積］
　本開示にかかる細胞培養方法における培地体積は、限定されないが、数リットル～数千リットル、例えば、３リットル以上、５リットル以上、７リットル以上、９リットル以上、１１リットル以上、１３リットル以上、又は１５リットル以上とすることができる。上限としては、例えば、１００００リットル以下が挙げられる。このように、本開示にかかる細胞培養方法によれば、大量の培地体積による細胞培養が可能である。
　また、本開示にかかる細胞培養方法によれば、従来の大量培養法では物理ストレスのため培養することが困難である物理的ストレスに弱い細胞（例えば、再生医療に使用する幹細胞や植物細胞など）の大量培養が可能となる。
　塑性流体に気泡を導入するという手法により、細胞に対する物理的ストレスの抑制と、酸素供給の向上との両立が可能となるからである。
　［培養システム］
　本開示にかかる細胞培養方法は、一又は複数の実施形態において、汚染等を予防する点から、閉鎖系培養系、例えば、閉鎖系の培養容器、培養バッグ、バイオリアクタ－、培養装置などで行うことが好ましい。
　本開示は、下記の実施形態に関し得る。
［１］　塑性流体である培地中に細胞を分散した状態で配置すること、及び該培地に気泡を導入することを含む、細胞の培養方法。
［２］　前記細胞を、塑性流体である培地中に分散した状態で配置することを含む、［１］に記載の培養方法。
［３］　前記細胞は、懸濁培養可能な細胞である、［１］又は［２］に記載の培養方法。
［４］　前記細胞は、多能性幹細胞又は多分化能幹細胞である、［１］から［３］のいずれかに記載の培養方法。
［５］　前記塑性流体である培地は、静置状態において、培地中の細胞を沈降させずに保持できる培地である、［１］から［４］のいずれかに記載の培養方法。
［６］　細胞培養容器又は細胞培養バックを用いて培養することを含む、［１］から［５］のいずれかに記載の培養方法。
［７］　気泡の導入は、間欠又は連続で行う、［１］から［６］のいずれかに記載の培養方法。
［８］　気泡が、マイクロバブル又はサブマイクロバブルである、［１］から［７］のいずれかに記載の培養方法。
［９］　さらに、培地の攪拌を間欠又は連続で行うことを含む、［１］から［８］のいずれかに記載の培養方法
［１０］　前記攪拌は、攪拌翼による撹拌又は培養容器全体の振とうによる撹拌である、［９］に記載の培養方法。
［１１］　前記培地の降伏値が、０．０３Ｐａ以上である、［１］から［１０］のいずれかに記載の培養方法。
　以下、実験例により本開示をさらに詳細に説明するが、これらは例示的なものであって、本開示はこれら実験例に制限されるものではない。
　［材料及び実験方法］
　１．使用細胞・培地、使用試薬及び培養条件
　１．１　使用細胞
　実験にはヒト人工多能性幹細胞（Ｈｕｍａｎ　ｉｎｄｕｃｅｄ　Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ、以下ｈｉＰＳ細胞という、Ｔｉｃ株，国立成育医療センター）を用いた。このｈｉＰＳ細胞はｉＭａｔｒｉｘ－５１１（Ｎｉｐｐｉ社製）コート面上で複数回継代培養を行ったものである。
　１．２　使用培地
　培地にはｍＴｅＳＲ（商標）１（ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製，以下ｍＴｅＳＲ１という）を用いた（以下、通常培地という）。
　１．３　使用試薬
　塑性流体とするための化合物として化合物Ａ：脱アシル化ジェランガム（日産化学社製）又は化合物Ｂ：キサンタンガム（シグマ－アルドリッチ社製）を用いた。
　１．４　培養条件
　培養はＣＯ2インキュベーター（ＭＣＯ－１７ＡＩ、三洋電機社製）で３７℃、５％ＣＯ2の条件下で行った。
　２．塑性流体培地の調製
　塑性流体とするための化合物Ａ及びＢ（上述）を通常培地に所定の濃度（質量／容量％、以下単に“％”で表す。）となるように溶解して調製した。
　３．培養
　３．１　スパージングを伴うｈｉＰＳ細胞の三次元浮遊培養
　ｉＭａｔｒｉｘ－５１１コート面上で前培養したｈｉＰＳ細胞をＰＢＳで洗浄した。ＥＤＴＡをＰＢＳで５ｍＭに調整したものに、１０μＭとなるＲｏｃｋ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを加えたＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液を培養面積１ｃｍ2あたり５５μｌ添加し室温で１０分間静置した。その後ＴｒｙｐＬＥ　ｓｅｌｅｃｔに１０μＭとなるようＲｏｃｋ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを加えたＴｒｙｐＬＥ　ｓｅｌｅｃｔ溶液を培養面積１ｃｍ2あたり５５μｌ添加し室温で７分間静置した。通常培地を１ｃｍ2あたり５５μｌ添加することで酵素中和を行い、単分散処理されたｈｉＰＳ細胞を回収した。１７０×ｇで室温にて遠心分離を３分間行い、上澄み液を除いたものに再び通常培地を加え再懸濁を行った。これにＲｏｃｋ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを１０μＭになるよう調整して添加し細胞懸濁液を用意した。これを１．０×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように調整し、３０ｍｌシングルユースバイオリアクターＢＷＶ－Ｓ０３Ａ（Ａｂｌｅ社製）に播種して２４時間培養を行い、細胞集塊形成を行った。その後以下の２条件で１２０時間まで培養を行った。
　・培養のコントロール
　コントロールとして、培養２４時間後から２４時間毎に通常培地に培地交換を行いながら通常培地の懸濁培養を行った。
　・スパージングを伴う浮遊培養
　培養２４時間から２４時間毎に、化合物Ａを濃度０．０２％となるように通常培地に添加した塑性流体培地（塑性流体培地Ａ，以下同じ）に培地交換を行った。培養期間中はＣＯ2　Ｇａｓ　Ｍｉｘｅｒ（トッケン社製）を用い０．０１ｍｌ／ｍｉｎの通気量でスパージングを行った。塑性流体培地Ａを用いた浮遊培養では、間欠的に撹拌翼を３０ｒｐｍで回転させて撹拌を行った。
　３．２　細胞濃度の測定
　２４時間毎に細胞濃度測定を行った。２５０μｌ×３回、遠沈管にサンプリングを行った。通常培地で培養したものは１７０×ｇで３分間遠心分離を行い、上澄み液を除いた後Ａｃｃｕｍａｘ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ　ｃｅｌｌ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を５ｍｌ添加し室温で１０分間反応させ単分散処理を行った。塑性流体培地Ａで培養をしたものはＰＢＳを添加し５倍希釈を行なった後、１７０×ｇで３分間遠心分離を行い、上澄み液を除いた後Ａｃｃｕｍａｘを５ｍｌ添加し室温で１０分間反応させ単分散処理を行った。その後１７０×ｇで再び遠心分離を行って上澄み液を除去し、通常培地を加えて再懸濁しＴＣ２０（商標）全自動セルカウンター（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）を用いてトリパンブルー色素排除法により生細胞濃度を測定した。
　４.塑性流体培地を用いた影響の観察
　４．１　気泡上昇への影響の観察
　ＣＯ2　Ｇａｓ　Ｍｉｘｅｒを用いて塑性流体培地Ａと通常培地に０．０１ｍｌ／ｍｉｎの通気量でスパージングを行い、その様子をビデオカメラ（ＨＤＲ－ＣＸ４２０，ＳＯＮＹ社製）を用いて観察した。
　４．２　細胞集塊への影響の観察
　塑性流体培地Ａと通常培地にピペッティングを行い、その様子をビデオカメラを用いて観察した。培地中に含まれる細胞集塊は３．１のコントロールと同手法で１２０時間培養を行い回収したものを用いた。
　４．３　液流への影響の観察
　ＣＯ2　Ｇａｓ　Ｍｉｘｅｒを用いて塑性流体培地Ａと通常培地に０．０１ｍｌ／ｍｉｎの通気量でスパージングを行い、その様子をビデオカメラを用いて観察した。培地中に含まれる細胞集塊は３．１のコントロールと同手法で１２０時間培養を行い回収したものを用いた。
　［結果及び考察］
　１．塑性流体の物性
　化合物Ａ又はＢを下記表１に示す濃度（質量／容量％）となるように通常培地に溶解した液体組成物を調製し、該液体組成物について下記２点の物性を調べた。その結果を下記表１に示す。
（１）ビーズ保持性
　模擬細胞としてのポリスチレンビーズ（Positive Charged Microcarriers、Corning社製、粒径160 - 200μm、密度1.09 - 1.15 g/cm3）を該液体組成物に懸濁して３７℃で静置し、懸濁した時間を始点として２４時間後にビーズの様子を観察した。
（２）気泡滞留性
　ピペッティングにて該液体組成物に気泡を封入して３７℃で静置し、懸濁した時間を始点として２４時間後に気泡の様子を観察した。
（３）降伏値の測定
　レオメータ（商品名ＭＣＲ３０２、アントンパール社製）を用い、３７℃における該液体組成物の降伏値を測定した。
　下記表１に示す通り、化合物Ａを添加した通常培地（液体組成物）では、化合物Ａが０．０２％以上でビーズを保持（ビーズ沈降を抑制）でき、塑性流体の物性を示した。また、気泡の上昇速度が抑制された結果、化合物Ａが０．０４％以上で気泡の滞留が認められた。降伏値は、化合物Ａが０．０３％以上で測定でき、０．０３％での降伏値は、０．０３０Ｐａであった。化合物Ａが０．０２％以下の液体組成物の降伏値は用いた基材の検出感度以下であった。
　また、下記表１に示す通り、化合物Ｂを添加した通常培地（液体組成物）では０．３％以上でビーズを保持（ビーズ沈降を抑制）でき、塑性流体の物性を示した。また、気泡の上昇速度が抑制された結果、化合物Ｂが０．５％以上で気泡の滞留が認められた。降伏値は、化合物Ｂが０．４％以上で測定でき、０．４％での降伏値は、０．０３６Ｐａであった。化合物Ｂが０．３％以下の液体組成物の降伏値は用いた基材の検出感度以下であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　２．気泡上昇に対する塑性流体の影響
　深部通気装置を用いて塑性流体培地Ａ（０．０２％　化合物Ａ）と通常培地に０．０１ｍｌ／分の通気量でスパージングを行いその様子を観察した。図１にそれぞれ０．１秒ごとの気泡の上昇を確認しその位置を点で示した。この画像から、気泡の０．１秒ごとの間隔は塑性流体培地Ａの方が通常培地より小さく、その上昇が遅いことが確認された。この実験の動画から平均的な気泡上昇速度を計測したものを表２に示す。これらの結果から塑性流体を用いることで気泡の上昇速度を抑え長時間液中に保持しガスホールドアップを上げることが可能であることが示唆される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　３．細胞集塊に対する塑性流体の影響
　細胞集塊を含む塑性流体培地Ａ及び通常培地にピペッティングを行い、その様子を観察した。図２にそれぞれのピペッティング時、ピペッティング終了時及びその５秒後及び１５秒後の画像を示す。この画像から、ピペッティングを行い培地中に均一に拡散した細胞集塊が、通常培地では沈降していくのに対し、塑性流体培地Ａでは細胞集塊が培養液中に保持される様子が確認された。このことから塑性流体を用いることで、シェアストレス環境下では培養液は撹拌し液流を発生させることが可能であり、シェアレス（シェアストレスがない又は抑制された）環境下ではピペッティングによって発生した液流はすぐに停止し、細胞集塊を液中に保持可能であることが示唆される。
　４．液流に対する塑性流体の影響
　１つの深部通気装置を用い塑性流体培地Ａに０．０１ｍｌ／ｍｉｎの通気量でスパージングを行い、その様子を観察した。気泡上昇部付近（図３）と、同一容器内の少し離れた位置（図４）での０．００～６．００秒の画像を示す。画像中の丸はその中心に同一の集塊を示している。画像に示すように気泡上昇部付近では細胞集塊も液流に沿って上昇していく様子が確認された。一方少し離れた位置では細胞集塊はほぼ動かず静止状態を保っている様子が確認された。これらのことから気泡上昇部付近のみでしかそれに伴う上昇流は発生せず、さらに少し離れた位置ではニュートン流体では上昇流によって生じる対流も抑制されていることが示唆される。
　５．スパージングを伴う浮遊培養
　これまでの実験により塑性流体を用いるとスパージングを行った際液流が抑えられ対流が生じないことが確認された。そのためスパージングを一カ所から行うだけでは、気泡上昇部付近のみでしか十分な酸素供給が行われず、離れた位置では酸素枯渇が生じることが予測されるため、短時間、低頻度に撹拌を行うことで均一な環境を作り出す必要があると考えられる。そこで塑性流体培地Ａでスパージングを行いながら、８時間毎に５分間撹拌を行いｈｉＰＳ細胞集塊を培養した。なお、短時間、低頻度の撹拌に替えてスパージングの箇所を増やすことでも均一な環境を作り出すことができると考えられる。
　５.１　細胞集塊の形態
　図５にコントロール及び塑性流体培地Ａを用いてスパージングを行った浮遊培養の各時間における代表的な画像を示す。この結果、スパージングを伴う浮遊培養でも、コントロールである通常培地の懸濁培養と同様集塊径が増大していく様子が確認された。
　５．２　細胞濃度の経時変化
　図６に細胞濃度の経時変化を示す。この結果から、塑性流体培地Ａであればスパージングを行っても動物細胞であるｈｉＰＳ細胞が通常培地の懸濁培養と同様に増殖可能であることが確認された。
　以上の結果からより大きなスケールのバイオリアクタでもスパージングによる酸素供給が可能となることが示唆された。一方、通常培地の懸濁培養の場合（すなわち、表面通気による酸素供給のみの場合）、培養液量が増加するに従い単位体積当たりの気液界面面積が低下するため、例えば数～数十リットル又はそれ以上などのような大量の培地体積を用いる培養では酸素供給が間に合わないと考えられる。
　６．異なる降伏値条件下における酸素供給と細胞増殖の確認
　0.02%及び0.05%となるように化合物Ａを通常培地に溶解し、降伏値が異なる２つの塑性流体培地を調製した（上記表１）。各溶液に対しピペッティング操作にて不均一径の気泡を液中に封入後、120時間の前培養をした細胞集塊を播種密度4.0 x 105 cells/mLで懸濁し、30 mlシングルユースバイオリアクター（同上）を用いて37℃インキュベーター内で培養を行った。培養6時間毎に細胞密度を測定し，時間経過における細胞密度の推移を培養24時間まで測定した。その結果を図７及び８に示す。
　図７に時間経過における細胞集塊の様子を示す。また、図８に時間経過における細胞密度の様子を示す。
　気泡が液中に保持されない濃度条件（化合物Ａ 0.02%）においては、時間経過とともに細胞集塊径が減少する傾向と細胞集塊の輪郭が滑らかな形状から歪な形状へと変化する傾向が確認された。また、細胞密度も時間経過とともに減少した。一方で気泡の液中保持が確認される濃度条件（化合物Ａ 0.05%）下では，細胞集塊径及び細胞密度は維持される傾向がみられた。細胞密度の結果から培養２４時間後における生存率αを算出した結果を下記表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　気泡が保持されない濃度条件下（化合物Ａ 0.02%）においては細胞密度及び生存率が減少していく傾向を示したのに対し、気泡が保持される濃度条件下（化合物Ａ 0.05%）においては，初期の細胞密度増加とその後の維持が確認された。以上のことにより、塑性流体培地を用いることにより、液中に気泡を保持しそれによる酸素供給が可能であることが確認された。
　７．酸素供給がスパージングに限定される条件下での塑性流体浮遊培養
　図９に示すような、液中に供給される気泡（スパージング）からのみ酸素供給が行われる装置を作成した。同装置は、装置上部から継続的に窒素を通気することにより液上部のスペースを窒素置換し，下部の１つのノズルから液中に供給される気泡からのみ酸素供給が行われる。同装置によれば、気泡通気を伴う細胞培養を行うことで，気泡通気（スパージング）における酸素供給下での細胞培養を達成できる。
　下記に示す実験概要にて実験を行った。二次元平面上で前培養したhiPS細胞 (D2) を5 mM EDTA/PBS、TrypLE（商標）select処理により培養面から剥離・単分散処理を行った．10 mM Rock inhibitor Y-27632に調整したStemFit（商標）AK02Nにより細胞懸濁液を播種密度 1.0 × 105 cells/mLに調整しSingle use bioreactor 30 mLに播種し48 h前培養を行った。48 h後に細胞集塊を回収し，化合物Ａ含有塑性培地に細胞集塊を播種した。スパージングを伴う条件、及び、コントロールとしてスパージングを行わない条件の2条件で培養を行った。両条件とも培養液上部は窒素ガス通気を行い常に置換した条件で培養を行った。培養24 h後に細胞密度測定を行った。その結果を図１０及び１１に示す。
　［実験概要］
細胞：Human induced pluripotent stem cells (hiPS細胞, D2)
培地：StemFit（商標） AK02N (Ajinomoto)
培養容器: Single use bioreactor 100 mL (Able. Co., Cat. No. BWV-S10A)
: Single nozzle bioreactor (Fujimori Kogyo)
ガス組成: 5 % CO2 Air
測定環境: 37 ℃ 恒温器内
Working volume: 90 mL
観察期間：24 h
使用試薬:TrypLETM select (1X) (Gibco)
　　: Rock inhibitor Y-27632 (Sigma)
　　: Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic acid, disodium salt, dihydrate (EDTA, Dojindo)
　　:化合物A：0.05 %
　図１０に示すとおり、スパージングをしないコントロール条件と比較し，スパージングを伴う条件では培養24 h後において高い細胞密度を示した。また、図１１に示すとおり、培養24 hまでの比増殖速度μapp (h-1) はスパージングを伴う条件ではコントロールと比較して高い値を示し，三次元静置培養でのみかけの比増殖速度と同程度の値を示した。これらの結果から、コントロール条件では細胞の増殖に酸素が不足し増殖速度が低下していることが想定された。塑性流体培地を用いれば、スパージングによるhiPS細胞培養系への酸素供給を可能であることが確認された。またその際三次元静置培養と同程度の比増殖速度を示すことから、スパージングによるシェアストレスは、塑性流体では抑制されていることが確認された。
　よって、本開示にかかる細胞培養方法によれば、細胞に対する物理的ストレスの抑制と、酸素供給の向上とが両立された浮遊細胞培養が可能となる。そして、本開示にかかる細胞培養方法によれば、例えば数～数十リットル又はそれ以上などのような大量の培地体積を用いる浮遊細胞培養においても、細胞に対する物理的ストレスの抑制と、酸素供給の向上との両立が可能となり、物理的ストレスに弱い細胞、例えば、再生医療に使用する細胞や植物細胞などの大量培養が可能となると考えられる。

Claims (8)

  1. 　塑性流体である培地中に細胞を配置すること、及び
    　該培地に気泡を導入することを含む、
    　細胞の培養方法。
  2. 　前記細胞は、懸濁培養可能な細胞である、請求項１に記載の培養方法。
  3. 　前記細胞は、多能性幹細胞又は多分化能幹細胞である、請求項１又は２に記載の培養方法。
  4. 　前記塑性流体である培地は、静置状態において、培地中の細胞を沈降させずに保持できる培地である、請求項１から３のいずれかに記載の培養方法。
  5. 　細胞培養容器又は細胞培養バックを用いて培養することを含む、請求項１から４のいずれかに記載の培養方法。
  6. 　気泡の導入は、間欠又は連続で行う、請求項１から５のいずれかに記載の培養方法。
  7. 　気泡が、マイクロバブル又はサブマイクロバブルである、請求項１から６のいずれかに記載の培養方法。
  8. 　前記培地の降伏値が、０．０３Ｐａ以上である、請求項１から７のいずれかに記載の培養方法。
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