WO2017123056A1 - 나노 약물전달체; 및 인삼추출물 또는 이로부터 분리된 진세노사이드를 포함하는 나노 복합체 - Google Patents

나노 약물전달체; 및 인삼추출물 또는 이로부터 분리된 진세노사이드를 포함하는 나노 복합체 Download PDF

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Definitions

  • Nano drug carriers And it relates to a nanocomposite comprising ginseng extract or ginsenoside separated therefrom.
  • Ginseng is a plant belonging to the family Araliaceae. Compared with other plants, Ginseng (Panax ginseng) is a slow and perennial plant, most of which is found in Korea, the northeast of China, or the Siberian Far East. Ginseng has been cultivated and used in traditional medicines such as tonics, tonics, and anti-aging agents for a long time.
  • the main active ingredient is ginsenoside, which is known to exist more than 40. Most of them are anti-cancer, anti-diabetic, antioxidant, anti-inflammatory, It is known to have biological and pharmaceutical activities, such as alteration and control of immune function, radiation protection, anti forgetfulness, antiapoptosis or antistress. In addition, other studies have reported that some components of ginseng are effective in aging, disorders of major nervous systems, and neurodegenerative diseases.
  • Ginseng is mainly used for roots and fruits among many parts. This is because ginsenosides are known to be contained in the roots of ginseng in large quantities. On the other hand, despite the ginseng leaves occupy more areas than the roots, unlike the roots of ginseng, the frequency of manufacture of the medicine using it was significantly lower than that of the roots or fruits. Recently, however, the leaves of ginseng contain many active ingredients such as flavonoids, triterpenoids, polyacetylenic, alcohols, ginsenosides, amino acids, peptides, polysaccharides, volatile oils and fatty acids.
  • ginsenoside is a triterpene saponin, a major active compound of ginseng ( P. ginseng ), a herb used in traditional medicines of Korea, China and Japan.
  • Ginsenosides exhibit a wide range of pharmacological effects, including antitumor, anti-inflammatory, anti-obesity activity and protective effects against Alzheimer's disease. Accordingly, the composition for promoting angiogenesis containing ginsenoside Rg5 (Korean Patent Publication No. 2016-0018974), the use of ginsenoside F2 to prevent or treat liver disease (Korean Patent Publication No.
  • Nanotechnology is rapidly growing as an important field in modern science with potential effects in electrical and biotechnology.
  • development of drug delivery systems using nanocarriers has been actively made.
  • metal nanocomposites are considered important because of their unique physical and biological particle size and shape (Colloids Surf B Biointerfaces, 2013, 107, 227-34), and their unique electronic, magnetic, catalytic and optical properties. Due to its various applications in the fields of biomedical and optics, its importance is gradually increasing.
  • silver has long been used for the treatment of medical diseases for treating many bacterial infections due to its antimicrobial properties, and silver nanocomposites in the form of nanoparticles have reduced cytotoxicity than their ionic forms and have antibacterial effects. It is known to increase, and is known to be applied to many fields for antibacterial, anti-inflammatory or infection prevention.
  • its unique and harmonious surface plasmon oscillation allows drug delivery, tissue or cancer imaging, photo thermal therap, immune chromatographic identification of pathogens in a sample, biosensor, DNA labeling, or It has been used in various fields such as vapor sensing.
  • nanocarriers have been developed based on organic platforms (such as liposomes, polymers, and dendrimers) and inorganic systems (such as gold, semiconductor nanocrystals, magnetic NPs, and silica particles).
  • organic platforms such as liposomes, polymers, and dendrimers
  • inorganic systems such as gold, semiconductor nanocrystals, magnetic NPs, and silica particles.
  • nanocarrier Mesoporous silica nanoparticles (MSNP)
  • MSNP Mesoporous silica nanoparticles
  • silanol groups (Si-OH) covering the surface of the MSNP simplifies the design of drug delivery by facilitating modification after synthesis, and MSNP shows resistance to hydrolysis and enzymatic degradation.
  • the drug can be loaded at high levels.
  • most enzyme proteins have a diameter that is significantly larger than the nanopore of the MSNP, so the narrow boundaries of the nanopores provide a physical barrier that inhibits the invasion of enzymes.
  • drugs trapped on or connected to the inner wall of MSNP can be protected from hydrolysis and premature release in vivo.
  • the polymer-bound drug is in the spotlight as a promising drug delivery system that can overcome the problems of the above-mentioned anti-cancer drugs, the polymer protein exhibiting a unique characteristic that is preferentially absorbed by cancer cells or inflammatory tissues.
  • a charged group of proteins helps the protein physically capture the drug molecule, which makes the protein available as a candidate for ideal drug delivery.
  • Albumin is a plasma protein that performs a variety of biological processes. Plasma albumin has unique ligand-delivery properties that give it enhanced solubility for hydrophobic drugs bound to plasma albumin and improve the pharmacokinetic characteristics of drug molecules in biological environments. Help to show. Accordingly, many drugs using albumin have been developed. Specifically, abraxane (paclitaxel-albumin NPs) developed by nab TM as a treatment for non-small cell lung cancer and breast cancer has been approved by the US FDA.
  • abraxane paclitaxel-albumin NPs
  • albumin-based drugs or imaging agents have been put on the market, and about ten products have been clinically applied for the treatment of cancer, diabetes, hepatitis C and rheumatoid arthritis (Yu et al., 2014; Zhao et al., 2015).
  • the present inventors in manufacturing a metal nanocomposite using a ginseng extract the production time is significantly shorter than the conventional, uniform in size, and can be stably produced without the addition of a separate reducing agent or stabilizer
  • a method for preparing the complex was developed and it was confirmed that the composition comprising the metal nanocomposite prepared by the method had antimicrobial activity, biofilm degrading activity, anticoagulant, anticancer and anti-inflammatory activity.
  • the present inventors have diligently researched to develop a ginsenoside drug substance having improved target capacity and half-life for cancer cells, and as a result, nanocomposites in which ginsenosides are connected to nanoparticles have high solubility in water or are selective according to pH.
  • the present invention was completed by confirming that it has a drug release pattern and has high anticancer and anti-inflammatory activity.
  • One object of the present invention is a nano drug carrier; And it provides a nanocomposite comprising ginseng extract or ginsenoside separated therefrom.
  • Another object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, comprising the nanocomposite.
  • Still another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating an inflammatory disease, including the nanocomposite.
  • Still another object of the present invention is to provide a method of treating cancer, comprising administering the nanocomposite to a patient.
  • Still another object of the present invention is to provide a method of treating an inflammatory disease, comprising administering the nanocomposite to a patient.
  • Another object of the present invention is a nano drug carrier; And ginseng extract or ginsenoside separated from the mixture by reacting, to provide a method for producing a nanocomposite.
  • One aspect of the present invention for achieving the above object is a nano drug carrier; And it provides a nanocomposite comprising ginseng extract or ginsenoside separated therefrom.
  • the term "ginseng” is a plant belonging to the Araliaceae, and compared with other plants, the growth is very slow and perennial, and most of them are found in Korea, the northeast of China, or the Siberian Far East. Means plants.
  • the ginseng may be selected from ginseng (panax ginseng) or red ginseng (red ginseng), but is not limited thereto.
  • ginseng extract means a component or substance belonging to ginseng obtained by a conventional method using a ginseng solvent.
  • the ginseng extract may be prepared by a manufacturing method including the following steps, but is not limited thereto:
  • step 3 drying the filtered extract of step 2) under reduced pressure.
  • ginseng of step 1) may be used without limitation, such as grown or commercially available, and specifically, ginseng (panax ginseng) or red ginseng (red ginseng) may be used, but is not limited thereto.
  • the site of ginseng may include all the organs of natural, hybrid or cultivar training, for example, all ground parts such as roots, branches, stems, leaves, flowers, fruits, and more specifically, roots or leaves Can be used, but is not limited thereto.
  • the root or leaves of the collected ginseng panax ginseng
  • An extract was prepared.
  • the extract may be extracted with water, a solvent of C1 to C4 alcohol or a mixture thereof, and specifically, the alcohol may be ethanol or methanol, but is not limited thereto. More specifically, distilled water may be extracted as a solvent.
  • the extraction method conventional methods in the art such as filtration, hot water extraction, dipping extraction, reflux cooling extraction, and ultrasonic extraction may be used.
  • the hot water extraction method may be extracted from 1 to 5 times, specifically 3 times may be extracted repeatedly, but is not limited thereto.
  • the extraction solvent may be added 0.1 to 10 times to the dried ginseng, specifically 0.3 to 5 times, but is not limited thereto.
  • the extraction temperature may be specifically 20 °C to 40 °C but not limited to this, the extraction time may be specifically 12 to 48 hours, but is not limited thereto.
  • the reduced pressure concentration of step 3 may specifically use a vacuum decompression concentrator or a vacuum rotary evaporator, but is not limited thereto.
  • the drying may be performed under reduced pressure, vacuum drying, boiling drying, spray drying or freeze drying. But it is not limited thereto.
  • Ginseng saponins have a unique chemical structure that is different from those found in other plants, and their pharmacological effects are also called ginsenosides, meaning Ginseng glycosides.
  • the ginsenoside may be purchased from commercially available or may be used separated from ginseng grown or collected in nature, or may be synthesized by a synthetic method, but is not limited thereto.
  • the ginsenoside may be ginsenoside compound K (Compound K) or ginsenoside Rh2.
  • ginsenoside compound K does not exist in ginseng itself, but saponins such as ginsenosides Rb1, Rb2, Rc, and Rd present in ginseng or red ginseng are intestinal microorganisms such as Bifidobacteria. Or it means a saponin converted into an absorbable form in the body by the action of soil microorganisms, it can be represented by the formula (1).
  • the ginsenoside compound K (Compound K) may be used interchangeably as 'ginsenoside CK' or 'CK'.
  • ginsenoside Rh2 refers to a PPD (protopanaxadiol) family saponin isolated from ginseng. Also called 20 (S) -protopanaxdiol-3-O- ⁇ -D-glucopyranoside, represented by the chemical formula of C 36 H 62 O 8 , it may be represented by the following formula (2).
  • the ginsenoside Rh2 may be used interchangeably as 'Rh2'.
  • the ginsenoside CK has a nasopharyngeal cancer killing action (Law CK, Chin Med., 2014, 2, 9 (1): 11.), Antiallergic action (Choo MK, et al., Planta Med). , 69: 518-522, 2003), neurodegenerative disease prevention (Tohda C., et al., Neuropsychopharmacology, 29: 860-868, 2004), skin protective action (Shin YW, et al., J. Pharmacol Sci., 99: 83-88, 2005) and the like, wherein the ginsenoside Rh2 is liver cancer (Xiao-Xi Guo, Int. J. Mol.
  • pancreatic cancer Xi-Ping Tang, World J Gastroenterol., 2013, 19 (10), 1582-1592
  • inhibiting bone destruction He L., Bone., 2012, 50 (6), 1207-13. It is known to represent.
  • the ginsenoside CK or Rh2 has a poor water solubility and has limitations in being used as an anticancer agent because of toxicity to normal cells as well as cancer cells. Therefore, in the present invention, the nanocomposite was prepared to increase the water solubility of ginsenosides and have cancer cell specific activity, thereby completing the present invention.
  • Ginsenoside CK or Rh2 has low water solubility, no cancer cell specificity, and drug carriers do not have anticancer activity, but the combination of the two compounds overcomes these disadvantages.
  • the nanocomposite completed the present invention by confirming not only excellent anticancer activity, but also excellent anti-inflammatory activity that cannot be inferred from ginsenoside CK or Rh2 alone.
  • nanocomplex refers to a drug carrier; And ginseng extract or ginsenosides separated therefrom.
  • the nanocomposite may be a metal nanoparticle, BSA (Bovine serum albumin) or mesoporous silica nanoparticles (Mesoporous silica nanoparticles) and ginseng extract or nanocomposites of ginsenosides CK and Rh2 separated therefrom,
  • BSA Bovine serum albumin
  • mesoporous silica nanoparticles Mesoporous silica nanoparticles
  • ginseng extract or nanocomposites of ginsenosides CK and Rh2 separated therefrom
  • 'gold nanocomposite', 'silver nanocomposite', 'BSA-CK', 'BSA-CK nanocomposite', 'MSNP-CK', 'MSNP-CK nanocomposite' may be used interchangeably.
  • the nano drug carrier is a metal nanoparticle
  • using the root or leaf extract of ginseng as a natural extract, or red ginseng root extract as an active ingredient the manufacturing time is significantly shorter than before, and the size is not required without the addition of a separate reducing agent or stabilizer. It is possible to prepare a uniform nanocomposite.
  • the leaf extract it is possible to produce a nanocomposite of uniform and small particles, and has excellent stability.
  • the composition comprising a nanocomposite prepared by the above method has antimicrobial activity, biofilm degradation activity, anticoagulant activity, anticancer activity and anti-inflammatory activity can be utilized in various industries.
  • the term "metal nanoparticle” is an ultrafine particle having a size of at least 1 to 100 nm, which is made of a metal, and refers to a particle having specific and various properties due to its small size.
  • manufactured by using the ginseng root or leaf extract or red ginseng root extract of the present invention is a "metal nanocomposite" containing a bioactive substance. Therefore, the antimicrobial activity, biofilm degrading activity, anticoagulant activity, anticancer activity and anti-inflammatory activity, which are much better than metal nanoparticles prepared by other methods, are not limited thereto.
  • the "metal” may be one or more selected from the group consisting of gold (Au), silver (Ag), copper (Cu), palladium (Pd), platinum (Pt), and rhodium (Rd), and more specifically, As, it may be gold (Au) or silver (Ag), but is not limited thereto.
  • gold nanoparticles, gold nanocomposites and AuNP (s) are mixed, and silver nanoparticles, silver nanocomposites, AgP (s) are mixed.
  • the ginseng root or leaf extract or the red ginseng root extract and the extract is observed gold or silver by visually observing the color change of the reaction mixture resulting from reduction reaction with tetrachlorogold (III) acid or silver nitrate solution. The synthesis of the nanocomposites was confirmed.
  • gold or silver nanocomposites can be prepared using the ginseng leaf or root extract or red ginseng root extract.
  • the size of the nanocomposite may be specifically 3 to 80 nm, more specifically 5 to 50 nm, most specifically 10 to 40 nm, but is not limited thereto.
  • the size of 2 to 40nm, and in the case of the silver nanocomposite 100nm is compared to the known size, the size of the gold or silver nanocomposites prepared using the ginseng extract of the present invention is conventionally prepared It is smaller than metal nanoparticles, and its distribution is uniform.
  • the silver nanocomposite of the present invention is much smaller than the conventional size.
  • the metal nanocomposite using the ginseng extract forms a nanocomposite having a uniform size in the range of 10 to 40 nm.
  • the ginseng leaf extract was 10 to 30 nm in size
  • the ginseng root extract was 10 to 40 nm in size
  • the red ginseng root extract was 10 to 30 nm in size. The size was very uniform in size.
  • the size of the silver nanoparticles is also in a very uniform range.
  • BSA Bovine serum albumin
  • BSA Bovine serum albumin
  • bovine serum albumin which is a kind of protein contained in a large amount of about 60% in the plasma. It is used as a nutrient for cells in cell culture and used to prevent nonspecific binding in standards for obtaining calibration curves in protein quantification, or in various biochemical experiments (Western blot, Immunocytochemistry, ELISA, etc.).
  • the nanocomposite may include 0.05 to 0.15 mg of ginsenoside per mg.
  • the amount of ginsenosides loaded on the BSA-CK or BSA-Rh2 nanocomposite was calculated using HPLC, the amount of CK loaded on 1 mg of BSA-CK is 0.087 mg, It was confirmed that the amount of Rh2 loaded on 1 mg of BSA-Rh2 was 0.096 mg.
  • the lung cancer cell killing ability of BSA-CK is significantly increased than the lung cancer cell killing ability of CK alone.
  • “Mesoporous silica nanoparticles” refers to particles having a size of 1 to 100 nm while showing mesoporous forms of silica.
  • the term mesoporous refers to a plurality of pores with a diameter of 2 to 50 nm.
  • the mesoporous silica nanoparticles may be used interchangeably as 'MSNP'.
  • the nanocomposite may include 0.05 to 0.15 mg of ginsenoside per mg of the nanocomposite.
  • the amount of CK loaded on 1 mg of MSNP-CK is 0.087 mg, It was confirmed that the amount of Rh2 loaded on 1 mg of MSNP-Rh2 was 0.096 mg.
  • the nanocomposite in order to confirm the properties of the MSNP-CK or MSNP-Rh2 nanocomposite using 1 H NMR and FTIR, the nanocomposite is characterized by ginsenosides characteristic peaks As a result of confirming the shape of the MSNP-CK or MSNP-Rh2 nanocomposite using FE-TEM, it was confirmed that all of the nanocomposites exhibit the shape of spheres.
  • MSNP-CK lung cancer cell killing ability is significantly increased than CK alone lung cancer cell killing ability.
  • Another aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, comprising the nanocomposite.
  • the present invention also provides a method of treating cancer, comprising administering the nanocomposite to a patient.
  • nanocomposite of the present invention is as described above.
  • cancer refers to a disease causing malignant tumors by unlimited growth of cells in living tissues, and as long as symptoms can be alleviated, alleviated, ameliorated or treated by the pharmaceutical composition of the present invention. Although not limited, it may be lung cancer.
  • the cancer may include lung cancer, non-small cell lung cancer, colon cancer, bone cancer, pancreatic cancer, skin cancer, head or neck cancer, skin or intraocular melanoma, uterine cancer, ovarian cancer, rectal cancer, gastric cancer, anal muscle cancer, colon cancer, breast cancer, fallopian tube carcinoma, Endometrial carcinoma, cervical carcinoma, vaginal carcinoma, vulvar carcinoma, Hodgkin's disease, esophageal cancer, small intestine cancer, endocrine adenocarcinoma, thyroid cancer, parathyroid cancer, adrenal cancer, soft tissue sarcoma, urethral cancer, penile cancer, prostate cancer, Chronic or acute leukemia, lymphocytic lymphoma, bladder cancer, kidney or ureter cancer, renal cell carcinoma, renal pelvic carcinoma, central nervous system (CNS) tumor, primary central nervous system lymphoma, spinal cord tumor, brain stem glioma, pituitary adenoma, etc. May be, but is not limited thereto.
  • prevention refers to any action that inhibits or delays the onset of a disease by administration of a pharmaceutical composition comprising the nanocomplex of BSA and ginsenoside of the present invention as an active ingredient.
  • the 'disease' may be cancer or inflammatory disease.
  • treatment means any action by which administration of the pharmaceutical composition improves or advantageously alters the symptoms of the suspected and onset individual.
  • the 'disease' may be cancer or inflammatory disease.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may include 0.0001 to 50% by weight of the nanocomposite of BSA and ginsenosides relative to the weight of the total composition, and may specifically include 0.01 to 10% by weight, but is not limited thereto. Do not.
  • the pharmaceutical composition may further include a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent commonly used in the manufacture of the pharmaceutical composition, and the carrier may comprise a non-naturally occuring carrier. have.
  • the pharmaceutical compositions are formulated in the form of powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols and the like, oral preparations, suppositories, and sterile injectable solutions, respectively, according to conventional methods. Can be used.
  • carriers, excipients and diluents that can be included in the pharmaceutical composition include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, Calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • Solid form preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules and the like, and such solid form forms at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose or lactose. (lactose), gelatin, etc. are mixed and prepared.
  • lubricants such as magnesium styrate and talc are also used.
  • Liquid preparations for oral use may include various excipients, such as wetting agents, sweeteners, fragrances, preservatives, etc., in addition to water and liquid paraffin, which are commonly used to include suspensions, solutions, emulsions, and syrups. have.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories.
  • non-aqueous solvent and suspending agent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate and the like can be used.
  • As the base of the suppository witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.
  • the silver and gold nanocomposites showed cytotoxicity at concentrations of 100 ⁇ g / mL and 2 ⁇ g / mL, respectively, against human lung cancer cells (A549). This suggests that silver and gold nanocomposites biosynthesized by the leaf extract of ginseng have anticancer activity.
  • the BSA-CK or BSA-Rh2 nanocomposite exhibited high cytotoxicity against the A549 lung cancer cell line, and did not show cytotoxicity to the keratinocyte line which is a normal cell line at the same concentration. It was. This suggests that the nanocomplex of BSA and ginsenoside of the present invention shows cancer cell-specific cytotoxicity that does not act on normal cells, and thus can be usefully used for the treatment of cancer.
  • the MSNP-CK or MSNP-Rh2 nanocomposite exhibited high cytotoxicity against the A549 lung cancer cell line, which was a normal cell line at the same concentration. It was confirmed that keratinocytes do not exhibit cytotoxicity (FIG. 3). This suggests that the nanocomposite of MSNP and ginsenoside of the present invention shows cancer cell-specific cytotoxicity that does not act on normal cells, and thus can be usefully used for the treatment of cancer.
  • the term "administration” means the introduction of certain substances into an individual in a suitable manner.
  • the term "individual” refers to all animals, such as rats, mice, and livestock, including humans who may or may have a disease. As a specific example, it may be a mammal including a human. In the present invention, the 'disease' may be cancer or inflammatory disease.
  • the method for preventing or treating cancer of the present invention specifically comprises administering to a subject a pharmaceutically effective amount of a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, comprising a nanocomposite of MSNP and ginsenoside as an active ingredient. can do.
  • ⁇ pharmaceutically effective amount '' means an amount sufficient to treat the disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment and not causing side effects
  • the effective dose level may be the sex, age, Factors including body weight, health condition, type of disease, severity, drug activity, drug sensitivity, method of administration, time of administration, route of administration, and rate of release, duration of treatment, combination or drug used and other medical fields. It can be easily determined by those skilled in the art according to well-known factors.
  • composition of the present invention may be administered at 0.0001 to 100 mg / kg body weight per day, more specifically 0.001 to 100 mg / kg body weight based on solids. Dosing may include administering the recommended dose once daily, or in divided doses.
  • the route of administration and mode of administration of the composition are not particularly limited, and any route of administration and administration as long as the composition comprising the composition can be reached at the desired site of interest. You can follow the way.
  • the composition may be administered through various routes, oral or parenteral, and non-limiting examples of the route of administration include oral, rectal, topical, intravenous, intraperitoneal, intramuscular, intraarterial, transdermal, nasal What is administered through intralateral or inhalation etc. are mentioned.
  • Another aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating an inflammatory disease, comprising the nanocomposite.
  • the present invention also provides a method for treating an inflammatory disease, comprising administering the nanocomposite to a patient.
  • nanocomposite As described above.
  • the term "inflammatory disease” means a disease caused by inflammation.
  • the inflammatory disease is not particularly limited as long as the symptoms can be alleviated, alleviated, ameliorated or treated by the pharmaceutical composition of the present invention.
  • Specific examples include Crohn's disease, erythema, atopy, rheumatoid arthritis, Hashimoto's thyroiditis, pernicious anemia, Edison's disease, type 1 diabetes, lupus, chronic fatigue syndrome, fibromyalgia, hypothyroidism and hypertension, scleroderma, Behcet's disease, inflammatory bowel disease, multiple sclerosis, myasthenia gravis, Meniere's syndrome, Gillian-Barre Guilian-Barre syndrome, Sjogren's syndrome, vitiligo, endometriosis, psoriasis, vitiligo, systemic scleroderma or ulcerative colitis.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may include 0.0001 to 50% by weight of the nanocomposite of the nanocomposite relative to the weight of the total composition, and specifically, may include 0.01% to 10% by weight, but is not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition may further include a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent commonly used in the manufacture of the pharmaceutical composition, and the carrier may comprise a non-naturally occuring carrier. have.
  • the silver nanocomposite was found to have no cytotoxicity to RAW264.7 cells up to 1000 ⁇ M concentration and inhibited NO production in a concentration-dependent manner (FIG. 26).
  • the gold nanocomposite is not cytotoxic to RAW264.7 cells up to 100 ⁇ M concentration and inhibits NO production in a concentration-dependent manner.
  • the silver and gold nanocomposites biosynthesized by the leaf extract of ginseng have anti-inflammatory activity without cytotoxicity.
  • the BSA-CK or BSA-Rh2 nanocomposite can inhibit NO production of RAW 264.7 macrophage lines at low concentrations without causing severe cytotoxicity against RAW 264.7 macrophage lines. Confirmed. This suggests that the nanocomplex of BSA and ginsenoside of the present invention selectively inhibits NO production without direct toxicity to normal macrophages, and thus can be usefully used without side effects in the treatment of inflammatory diseases. .
  • the MSNP-CK or MSNP-Rh2 nanocomposites can inhibit NO production at RAW 264.7 macrophage lines without causing severe cytotoxicity against RAW 264.7 macrophage lines. It was confirmed. This suggests that the nanocomposite of MSNP and ginsenoside of the present invention selectively inhibits NO production without direct toxicity to normal macrophages, and thus can be usefully used without side effects in the treatment of inflammatory diseases. .
  • the method for preventing or treating an inflammatory disease may include administering to a subject a pharmaceutically effective amount of a pharmaceutical composition for preventing or treating an inflammatory disease, comprising the nanocomposite as an active ingredient.
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating an inflammatory disease comprising the nanocomposite as an active ingredient.
  • the composition of the present invention may be administered at 0.0001 to 100 mg / kg body weight per day, more specifically 0.001 to 100 mg / kg body weight based on solids. Dosing may include administering the recommended dose once daily, or in divided doses.
  • the route of administration and mode of administration of the composition are not particularly limited, and any route of administration can be reached as long as the composition comprising the composition can be reached at the desired site of interest.
  • the composition may be administered through various routes, oral or parenteral, and non-limiting examples of the route of administration include oral, rectal, topical, intravenous, intraperitoneal, intramuscular, intraarterial, transdermal, nasal What is administered through intralateral or inhalation etc. are mentioned.
  • Yet another aspect of the present invention provides a food composition for improving cancer comprising the nanocomposite as an active ingredient.
  • improvement means any action that at least reduces the parameters associated with the condition being treated, eg, the degree of symptoms.
  • the term "food” of the present invention meat, sausage, bread, chocolate, candy, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gum, dairy products including ice cream, various soups, drinks, tea, drinks, alcoholic beverages , Vitamin complexes, nutraceuticals and health foods, and includes all foods in the usual sense.
  • Functional food is the same term as food for special health use (FOSHU), in addition to the nutritional supply, the processed food, the medical effect is high so that the bioregulatory function appears efficiently Means food.
  • functionality means obtaining useful effects for health purposes such as nutrient control or physiological action on the structure and function of the human body.
  • the food of the present invention can be prepared by a method commonly used in the art, and the preparation can be prepared by adding the raw materials and ingredients commonly added in the art.
  • the formulation of the food may also be prepared without limitation as long as the formulation is recognized as a food.
  • Food composition of the present invention can be prepared in various forms of formulation, unlike the general medicine has the advantage that there is no side effect that can occur when taking a long-term use of the drug as a raw material, and excellent portability, the present invention Foods can be taken as a supplement to enhance the effect of preventing or ameliorating the disease.
  • the health food refers to foods having active health maintenance or promotion effect as compared to general foods
  • the health supplement food refers to foods for health supplement purposes.
  • nutraceutical, health food, dietary supplement are used.
  • the health functional food is a food prepared by adding the nanocomposite to food materials such as beverages, teas, spices, gums, confections, or the like, encapsulated, powdered, suspensions, etc.
  • food materials such as beverages, teas, spices, gums, confections, or the like, encapsulated, powdered, suspensions, etc.
  • the food composition of the present invention can be consumed on a daily basis, it is very useful because a high cancer prevention or improvement effect can be expected.
  • composition may further include a physiologically acceptable carrier, and the type of the carrier is not particularly limited and may be any carrier that is commonly used in the art.
  • the composition may include additional ingredients that are commonly used in food compositions to improve the smell, taste, time and the like.
  • additional ingredients may include vitamins A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, niacin, biotin, folate, panthotenic acid, and the like.
  • minerals such as zinc (Zn), iron (Fe), calcium (Ca), chromium (Cr), magnesium (Mg), manganese (Mn), copper (Cu) and chromium (Cr) may be included. It may also contain amino acids such as lysine, tryptophan, cysteine, valine and the like.
  • the composition is a preservative (potassium sorbate, sodium benzoate, salicylic acid, sodium dehydroacetic acid, etc.), fungicides (bleaching powder and highly bleaching powder, sodium hypochlorite, etc.), antioxidants (butylhydroxyanisol (BHA), butylhydroxy Toluene (BHT), etc.), colorants (such as tar pigments), colorants (sodium nitrite, sodium nitrite, etc.), bleach (sodium sulfite), seasonings (such as MSG glutamate), sweeteners (ducin, cyclate, saccharin, Food additives such as sodium), fragrances (vanillin, lactones, etc.), swelling agents (alum, potassium D-tartrate, etc.), reinforcing agents, emulsifiers, thickeners (foils), coatings, gum herbicides, antifoams, solvents, modifiers, etc. may contain food additives.
  • the additive may be selected according to the
  • the nanocomposite of the BSA and ginsenosides may be added as it is or used with other food or food ingredients, and may be appropriately used according to conventional methods.
  • the mixed amount of the active ingredient can be suitably determined according to the purpose of use (prevention, health or therapeutic treatment).
  • the food composition of the present invention may be added in an amount of 50 parts by weight or less, specifically 20 parts by weight or less based on the food or beverage in the manufacture of food or beverage.
  • the active ingredient may be used in an amount above the above range.
  • An example of the food composition of the present invention may be used as a health beverage composition, in which case it may contain various flavors or natural carbohydrates as additional ingredients, such as conventional drinks.
  • the above-mentioned natural carbohydrates include monosaccharides such as glucose and fructose; Disaccharides such as maltose and sucrose; Polysaccharides such as dextrin, cyclodextrin; Sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol.
  • Sweeteners include natural sweeteners such as taumartin, stevia extract; Synthetic sweeteners such as saccharin and aspartame;
  • the ratio of the natural carbohydrate may generally be about 0.01 to 0.04 g, specifically about 0.02 to 0.03 g per 100 mL of the composition of the present invention.
  • the health beverage composition includes various nutrients, vitamins, electrolytes, flavors, colorants, pectic acid, salts of pectic acid, alginic acid, salts of alginic acid, organic acids, protective colloid thickeners, pH regulators, stabilizers, preservatives, glycerin, Alcohol or carbonation agent and the like.
  • Others may contain fruit flesh for the production of natural fruit juices, fruit juice drinks, or vegetable drinks. These components can be used independently or in combination. The proportion of such additives is not critical but is generally selected in the range of 0.01 to 0.1 parts by weight per 100 parts by weight of the composition of the present invention.
  • the food composition of the present invention may be included in various weight percent if it can exhibit a preventive or ameliorating effect of cancer, specifically, the nanocomposite is included in 0.00001 to 100% by weight or 0.01 to 80% by weight relative to the total weight of the food composition can do.
  • Another embodiment provides a food composition for improving an inflammatory disease comprising the nanocomposite as an active ingredient.
  • the food composition of the present invention can be consumed on a daily basis, it can be expected to have a prophylactic or improvement effect of a high inflammatory disease, which is very useful.
  • composition may further include a physiologically acceptable carrier, and the type of the carrier is not particularly limited and may be any carrier that is commonly used in the art.
  • the nanocomposite may be added as it is or used with other food or food ingredients, and may be appropriately used according to conventional methods.
  • the mixed amount of the active ingredient can be suitably determined according to the purpose of use (prevention, health or therapeutic treatment).
  • the food composition of the present invention may be added in an amount of 50 parts by weight or less, specifically 20 parts by weight or less based on the food or beverage in the manufacture of food or beverage.
  • the active ingredient may be used in an amount above the above range.
  • the food composition of the present invention may include a variety of weight percent if it can exhibit an effect of preventing or improving inflammatory diseases, specifically, the nanocomposite is 0.00001 to 100% by weight or 0.01 to 80% by weight relative to the total weight of the food composition It may include.
  • Another aspect provides a quasi-drug composition for the prevention or improvement of cancer or inflammatory diseases comprising the nanocomposite as an active ingredient.
  • the ginsenoside may be ginsenoside compound K (Compound K) or ginsenoside Rh2.
  • the term "quasi drug” refers to a fiber, rubber product or the like used for the purpose of treating, alleviating, treating or preventing a disease of a human or animal, and has a weak action on the human body or does not directly act on the human body.
  • non-machinery and the like, or any of the agents used for sterilization, insecticide, and similar purposes for the prevention of infection, for the purpose of diagnosing, treating, reducing, treating or preventing human or animal diseases for the purpose of diagnosing, treating, reducing, treating or preventing human or animal diseases.
  • articles to be used which are not instruments, machines or devices, and articles which are used for the purpose of pharmacologically affecting the structure and function of a person or animal, except those which are not instruments, machines or devices. May be, but is not limited thereto.
  • the nanocomposite of the BSA and ginsenosides may be added as it is or used together with other quasi-drug components, and may be appropriately used according to a conventional method.
  • the mixing amount of the active ingredient can be suitably determined depending on the intended use.
  • the external preparation for the skin is not particularly limited thereto.
  • the skin external preparation may be used in the form of an ointment, a lotion, a spray, a patch, a cream, a powder, a suspension, a gel, or a gel.
  • the quasi-drug composition of the present invention may include various weight percents as long as it can exhibit an prevention or improvement effect of an inflammatory disease.
  • the nanocomposite is 0.01 to 100 wt%, more specifically 1 to 80 wt .-%, based on the total weight of the quasi-drug composition. May contain%.
  • Another aspect provides a cosmetic composition for preventing or improving inflammatory diseases comprising the nanocomposite as an active ingredient.
  • the cosmetic composition of the present invention may include 0.0001 to 50% by weight of the nanocomposite, and specifically 0.01 to 10% by weight, based on the total weight of the composition.
  • 0.0001 to 50% by weight of the nanocomposite and specifically 0.01 to 10% by weight, based on the total weight of the composition.
  • the cosmetic composition is a solution, external ointment, cream, foam, nourishing lotion, flexible lotion, pack, flexible water, latex, makeup base, essence, soap, liquid cleanser, bath, sunscreen cream, sun oil, suspension, emulsion, Pastes, gels, lotions, powders, soaps, surfactant-containing cleansing, oils, powder foundations, emulsion foundations, wax foundations, patches, and sprays may be prepared in a formulation selected from the group consisting of, but not limited to.
  • the cosmetic composition may further include one or more cosmetically acceptable carriers formulated in general skin cosmetics, and as common components, for example, oil, water, surfactants, moisturizers, lower alcohols, thickeners, chelating agents , Pigments, preservatives, fragrances and the like may be appropriately blended, but is not limited thereto.
  • one or more cosmetically acceptable carriers formulated in general skin cosmetics, and as common components, for example, oil, water, surfactants, moisturizers, lower alcohols, thickeners, chelating agents , Pigments, preservatives, fragrances and the like may be appropriately blended, but is not limited thereto.
  • the cosmetically acceptable carrier included in the cosmetic composition varies depending on the formulation of the cosmetic composition.
  • the carrier component is animal oil, vegetable oil, wax, paraffin, starch, tracant, cellulose derivative, polyethylene glycol, silicone, bentonite, silica, talc, zinc oxide and the like. May be used, but is not limited thereto. These may be used alone or in combination of two or more thereof.
  • the formulation of the present invention is a powder or a spray
  • lactose, talc, silica, aluminum hydroxide, calcium silicate, polyamide powder and the like can be used, and especially in the case of a spray, additionally chlorofluorohards.
  • Propellants such as carboxylic, propane / butane or dimethyl ether may be included, but are not limited thereto. These may be used alone or in combination of two or more thereof.
  • a solvent, solubilizer or emulsion may be used as the carrier component, such as water, ethanol, isopropanol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, Propylene glycol, 1,3-butylglycol oil, and the like can be used, and in particular, cottonseed oil, peanut oil, corn seed oil, olive oil, castor oil and sesame oil, glycerol aliphatic ester, polyethylene glycol or sorbitan fatty acid ester May be used, but is not limited thereto. These may be used alone or in combination of two or more thereof.
  • liquid carrier diluents such as water, ethanol or propylene glycol
  • suspending agents such as ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitol esters and polyoxyethylene sorbitan esters, micro Crystalline cellulose, aluminum metahydroxyde, bentonite, agar or tracant may be used, but is not limited thereto. These may be used alone or in combination of two or more thereof.
  • the formulation of the present invention is a soap
  • alkali metal salts of fatty acids fatty acid hemiester salts, fatty acid protein hydrolyzates, isethionates, lanolin derivatives, aliphatic alcohols, vegetable oils, glycerol, sugars and the like are used as carrier components. It may be, but is not limited thereto. These may be used alone or in combination of two or more thereof.
  • the formulation of the present invention is a surfactant-containing cleansing
  • it is an aliphatic alcohol sulfate, an aliphatic alcohol ether sulfate, a sulfosuccinic acid monoester, isethionate, an imidazolinium derivative, methyltaurate, sarcositate, fatty acid as a carrier component.
  • Amide ether sulfates, alkylamidobetaines, aliphatic alcohols, fatty acid glycerides, fatty acid diethanolamides, vegetable oils, lanolin derivatives or ethoxylated glycerol fatty acid esters and the like may be used, but are not limited thereto. These may be used alone or in combination of two or more thereof.
  • Another aspect of the invention provides an antimicrobial composition comprising the nanocomposite.
  • the nanocomposite of the present invention is prepared using ginseng root or leaf extract or red ginseng root extract, and contains a bioactive substance of each extract, and thus has very superior antimicrobial activity than metal nanoparticles prepared by other methods.
  • the antimicrobial composition of the present invention may have an antimicrobial activity against bacteria, fungi or yeast, in particular, Vibrio (Vibrio) into the microorganism is Salmonella (Salmonella) microorganism of the genus, stearyl Pyrococcus (Staphylococcus) in the microorganism is Escherichia (Escherichia) in the microorganism Bacillus (Bacillus) in microorganisms, and Candida may have an antimicrobial activity for at least one selected from the group consisting of (Candida) spp, more specifically, Vibrio para H.
  • Vibrio Vibrio into the microorganism is Salmonella (Salmonella) microorganism of the genus
  • stearyl Pyrococcus (Staphylococcus) in the microorganism is Escherichia (Escherichia) in the microorganism Bacillus (Bacillus) in microorganisms
  • Candida may have
  • Molina T kusu (Vibrio parahaemolyticus ), Salmonella enterica , Staphylococcus aureus , Escherichia coli ), Bacillus anthracis , Bacillus cereus , and Candida albicans may have antimicrobial activity against one or more selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • the silver nanocomposite or the composition comprising the silver nanocomposite of the present invention is much superior to the general silver nanocomposite against the pathogenic microorganisms, and can be widely used in various fields such as cosmetics, quasi-drugs, medicines, and foods. have.
  • the gold nanocomposite using the ginseng leaf extract was confirmed to have an antimicrobial activity against Vibrio parahemoliticus, Salmonella enterica, Escherichia coli, Stephylococcus aureus, Silver nanocomposite using ginseng root extract showed antimicrobial activity against Escherichia coli, Bacillus cereus, Stephylococcus aureus, Vibrio parahemolyticus and Bacillus anthracis.
  • the silver nanocomposite using red ginseng root extract has been confirmed to have antimicrobial activity against Vibrio parahemolyticus, Stephylococcus aureus, Bacillus cereus and Candida albicans, the largest against Candida albicans, Next, it was confirmed that Vibrio parahemoliticus, Stephylococcus aureus, Bacillus cereus in the order of having antimicrobial activity. Through the above results, it can be confirmed that the silver nanocomposite of the present invention has antimicrobial activity.
  • Another aspect of the present invention is to provide a composition for biofilm decomposition comprising the metal nanocomposite.
  • the nanocomposite of the present invention is prepared using ginseng root or leaf extract or red ginseng root extract, and contains a bioactive substance of each extract, and thus has a very superior biofilm degrading activity than metal nanoparticles prepared by other methods. .
  • biofilm refers to a group of bacteria that bacteria are thinly adhered like a film.
  • biofilms are produced by bacteria, which in turn provide a habitat for the bacteria, thereby accelerating bacterial growth.
  • the biofilm degrading composition of the present invention has a biofilm degrading activity and inhibits biofilm-related infection, thereby reducing the cost and pain of the patient.
  • the surface of plastic, metal, etc. is corroded. It can be used in a variety of fields, such as the industry to protect from, dental equipment industry, plumbing industry, but is not limited thereto.
  • Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa ( Pseudomonas)
  • silver nanocomposites prepared using ginseng leaf extract, Stepirococcus aureus in the silver nanocomposite of 4 ⁇ g / ml concentration Biofilm degrading activity against Pseudomonas eruginosa was the highest, and silver nanocomposite prepared using red ginseng root extract showed biodegrading activity against Stepilococcus aureus and Pseudomonas eruzinosa at the same concentration. Confirmed.
  • the nanocomposite prepared using ginseng extract may have a biofilm-degrading activity on the strain, thereby inhibiting biofilm-related infections and may play a role in reducing cost and patient pain.
  • Another aspect of the present invention is to provide an anticoagulant composition comprising the nanocomposite.
  • the metal nanocomposite of the present invention is prepared using ginseng root or leaf extract or red ginseng root extract, and contains a bioactive substance of each extract, and thus has an excellent anticoagulant activity than metal nanoparticles prepared by other methods. .
  • anticoagulant means inhibiting the normal blood coagulation properties of the body, it is also used as anticoagulant. Specifically, there are anticoagulants that inhibit coagulation by adding them to the blood, and antithrombin III and heparin that inhibit the actions of various coagulation factors as blood physiological anticoagulants for the active coagulation factors present in the blood. It is divided into anticoagulant which inhibits the activity of the coagulation factor by oral administration, and anticoagulant which appears in the pathological state and reversibly and irreversibly inhibits the activity of the coagulation factor.
  • the anticoagulant composition of the present invention includes nanocomposites prepared using ginseng extract, specifically, ginseng leaf or root extract or red ginseng root extract, thereby preventing blood coagulation.
  • the medical field or life It may be used in the field of engineering, and more specifically, may be used as a carrier of drugs and genes in direct contact with the blood or as a biosensor, an in vivo nanocarrier, but is not limited thereto. It can also be used for experimental purposes in vitro.
  • the anticoagulant composition may be used as a pharmaceutical, quasi-drug, cosmetics, food and feed composition.
  • the blood of healthy male and female volunteers ranging in age from 25 to 45 years old is collected in two vacuum collectors and labeled with A and B respectively, and then the anticoagulant effect of the synthesized gold nanocomposite Observed.
  • the gold nanocomposite prepared using the ginseng leaf extract inhibited coagulation formation when the gold nanocomposite was present, and the control group without the gold nanocomposite confirmed that blood was completely coagulated.
  • the gold nanocomposites biosynthesized by the leaf extract of ginseng has anticoagulant activity.
  • Another aspect of the invention is a nano drug carrier; And it provides a method for producing a nanocomposite comprising the step of reacting the ginseng extract or ginsenoside separated from it.
  • a metal nanocomposite is prepared using a ginseng extract, which is a natural extract, which is environmentally friendly and significantly shortens the preparation time compared to a chemical synthesis method and a physical synthesis method.
  • a metal nanocomposite capable of maintaining stabilization without a separate reducing agent or stabilizer may be prepared, and thus may be very useful in various industrial fields.
  • the manufacturing method of the present invention can produce a variety of metal nanoparticles according to the metal precursor to be used, specifically, gold (Au), silver (Ag), copper (Cu), palladium (Pd), platinum (Pt) and It may be one or more selected from the group consisting of rhodium (Rd), but is not limited thereto. More specifically, gold (Au) or silver (Ag) can be selected.
  • metal precursor means a compound added to prepare metal nanoparticles.
  • various kinds of compounds may be selected and used according to the metal type of the nanoparticles to be prepared.
  • the preparation of gold nanoparticles has available at least one selected from the group consisting of tetrachloro-gold (III) acid (HAuCl 4), NaAuCl 3, and AuCl 3, more specifically, tetrachloro-gold Acid (III) (HAuCl 4 ) may be used, but is not limited thereto.
  • At least one selected from the group consisting of AgBF 4 , AgCF 3 SO 3 , AgClO 4 , AgNO 3 , AgPF 6, and Ag (CF 3 COO) may be used to prepare silver nanoparticles, and more specifically, Silver nitrate (AgNO 3 ) may be used, but is not limited thereto.
  • the production of copper nanoparticles are selected from the group consisting of CuCl 2 , CuF 2 , CuBr 2 , CuI 2 , (CH 3 COO) 2 Cu, Cu (ClO 4 ) 2 , Cu (NO 3 ) 2 and CuSO 4 .
  • One or more may be used, but is not limited thereto.
  • the concentration of the metal precursor used for the reaction may affect the production of metal nanoparticles.
  • the concentration of the metal precursor of the present invention is not limited as long as the metal nanoparticles can be prepared by the composition for preparing metal nanoparticles, but specifically the concentration of the metal precursor is 0.01 to 100 mM, more specifically 0.01 to 50 mM, most specifically May be 0.01 to 10 mM.
  • the reaction temperature may affect the production of metal nanoparticles.
  • the reaction temperature of the present invention is not limited as long as the metal nanoparticles can be prepared as a composition for preparing metal nanoparticles, but specifically, the reaction temperature may be 10 to 100 ° C, more specifically 50 to 100 ° C.
  • the reaction time may affect the production of metal nanoparticles.
  • the reaction time of the present invention is not limited as long as the metal nanoparticles can be prepared as a composition for preparing metal nanoparticles, but specifically, when the metal is gold, the reaction time may be 1 minute to 1 hour, more specifically 1 minute to 50 minutes. When the metal is silver, the reaction time may be 30 minutes to 5 hours, more specifically 30 minutes to 2 hours.
  • the reaction mixture containing tetrachlorogold (III) acid when preparing gold or silver nanoparticles using leaf extract of panax ginseng, the reaction mixture containing tetrachlorogold (III) acid turned dark purple within 3 minutes. (A of FIG. 1), the reaction mixture containing silver nitrate turned completely brown within 45 minutes (b of FIG. 1). In addition, in the case of using the root extract of Panax ginseng, the reaction mixture containing silver nitrate took 2 hours to turn from white to brown (FIG. 1 d), and the reaction mixture containing tetrachlorogold (III) acid. Took 5 minutes (e of FIG. 1).
  • the gold or silver nanoparticles prepared using the leaves or roots of the ginseng and the iris root extract are synthesized in a very short time compared to the nanoparticles prepared using other natural extracts or other site extracts of ginseng.
  • a stable metal nanoparticles are synthesized in an economical and environmentally friendly way in a remarkably fast time.
  • the manufacturing method of the present invention may further include the step of recovering the metal nanoparticles by centrifuging the reaction solution.
  • the composition for preparing metal nanoparticles containing ginseng extract is added to 1 mM tetrachlorogold (III) acid and silver nitrate solution, respectively, and then maintained at 80 ° C. and centrifuged at 16,000 rpm for 20 minutes. To prepare a metal nanoparticle (Example 3).
  • Yet another aspect of the present invention is to provide a metal nanoparticle produced by the above production method.
  • Metal nanoparticles of the present invention is prepared using ginseng root or leaf extract or red ginseng root extract, containing the bioactive material of each extract, antimicrobial activity, biofilm very superior to the metal nanoparticles prepared by other methods It has degradation activity, anticoagulant activity, anticancer activity and anti-inflammatory activity and can be usefully used in various industries.
  • the metal nanoparticles of the present invention can be used for medical, biological analysis, fuel, and electronic component materials.
  • the gold nanoparticles are used for organic solar cells, sensor probes, and biomedical medicines due to their inherent light conducting properties. It can be used as drag delivery, conductive material and catalyst, and silver nanoparticles can be used for antibacterial agent, biosensor for quantitative detection, optical analysis method and the like due to optical properties, conductivity and antimicrobial properties.
  • the metal nanoparticles of the present invention can control the optical and electronic characteristics of the particles by changing the size or shape, the chemical properties or the aggregation state of the surface.
  • the shape of the metal nanoparticles prepared by the manufacturing method of the present invention may be generally spherical, but is not limited thereto.
  • the size of the metal nanoparticles prepared by the method of the present invention may be specifically 3 to 80 nm, more specifically 5 to 50 nm, most specifically 10 to 40 nm, but is not limited thereto.
  • the size of gold or silver nanoparticles prepared using the ginseng extract of the present invention is conventionally manufactured. It is small compared to metal nanoparticles, and its distribution is uniform. In particular, silver nanoparticles of the present invention are much smaller than conventional sizes.
  • the metal nanoparticles prepared by using ginseng extract to produce nanoparticles of uniform size in the range of 10 to 40 nm (Example 3).
  • the ginseng) leaf extract was 10 to 30 nm in size
  • the root extract of ginseng was 10 to 40 nm
  • the red ginseng root extract was 10 to 30 nm. The size was very uniform.
  • the size of 10 to 20nm when using the leaf extract of ginseng the size of 10 to 30nm when using the root extract of ginseng, 10 to 30nm of the root extract of red ginseng It was confirmed that the size of the silver nanoparticles is also in a very uniform range.
  • the drug carrier is BSA (Bovine serum albumin)
  • BSA Bovine serum albumin
  • the drug carrier specifically (a) dissolving BSA (Bovine serum albumin) in water to prepare a mixed solution; (b) adding a ginsenoside to the mixture to prepare a reaction mixture; And (c) dialysis of the reaction mixture to prepare a nanocomposite.
  • the step (a) is to prepare a BSA aqueous solution so that the BSA can react with ginsenoside, it may be a process for improving the reactivity of the BSA.
  • an additional treatment may be added to the BSA aqueous solution, and specific examples may be sonication, but are not limited thereto.
  • the step (b) is a step of combining the BSA with ginsenoside, it can be carried out by adding the ginsenoside to the BSA aqueous solution prepared in step (a).
  • the ginsenoside may be in a dissolved state in a solvent, and the kind of the solvent may include water, an alcohol having 1 to 4 carbon atoms, or a polar solvent such as ethyl acetate or acetone, hexane or dichloromethane. It may be a nonpolar solvent, more specifically ethanol, but is not limited thereto.
  • the ginsenoside may be added to the BSA aqueous solution in a drop wise manner, but is not limited thereto.
  • Step (c) is a step of purifying the nanocomposite of the prepared BSA and ginsenosides, a process of removing the remaining material or impurities without reacting. It may be performed by using a dialysis membrane or by a solvent, but is not limited thereto.
  • ginsenoside CK or Rh2 dissolved in ethanol was added dropwise, the reaction mixture was transferred to the dialysis membrane, and methanol / distilled water. And through the additional dialysis process using distilled water to prepare a nanocomposite of BSA and ginsenosides.
  • the drug carrier is mesoporous silica nanoparticles
  • the step (a) is a step of modifying MSNP in order to efficiently bind MSNP to ginsenoside, and may be a process of binding an amine group to the surface of MSNP.
  • the amination may be derived using ammonium hydroxide (NH 4 OH), but is not limited thereto.
  • Step (b) is a step of coupling MSNP with ginsenoside, wherein the amine group of MSNP reacts with ginsenoside to form a covalent bond.
  • the ginsenoside may be in a dissolved state in a solvent, and the kind of the solvent may be water, an alcohol having 1 to 4 carbon atoms, a polar solvent such as ethyl acetate or acetone, or a nonpolar solvent of hexane or dichloromethane. It may be, and more specifically may be ethanol, but is not limited thereto.
  • MSNP was functionalized with a free amine group using NH 4 OH, and a nanocomposite of MSNP and ginsenoside was prepared by adding and stirring ginsenoside to the MSNP.
  • Nanocomposite of the present invention is significantly shorter manufacturing time than the conventional metal nanoparticles, it is possible to produce a metal nanocomposite of uniform size without the addition of a separate reducing agent or stabilizer.
  • it has high solubility in water and high target ability for cancer cells, which is advantageous for development into drugs.
  • since it exhibits high anti-cancer, anti-inflammatory activity, etc. it can be usefully used for the prevention and treatment of cancer and inflammatory diseases, and furthermore, it can be used in various business fields with antibacterial activity, biofilm degradation activity, anticoagulant activity.
  • ginseng leaf extract (a to c), ginseng root extract (d and e) or red ginseng (f and g) extract with tetrachlorogold (III) acid (HAuCl 4 3H 2 O) or silver nitrate solution
  • control control
  • AgNPs silver nanocomposite
  • AuNPs gold nanocomposite
  • 3 is a view confirming the production of gold or silver nanocomposites prepared using ginseng root extract through UV-vis.
  • FIG. 5 is a view showing the structural characteristics of the gold or silver nanocomposite prepared using ginseng leaf extract through FE-TEM.
  • Figure 6 is a view showing the structural features of the gold or silver nanocomposite prepared using ginseng root extract through FE-TEM.
  • Figure 7 shows the simple dispersion, fringe spacing of the nanocomposite fringe spacing of the structural features of the gold or silver nanocomposite prepared using ginseng root extract through FE-TEM.
  • FIG. 8 is a view showing the structural characteristics of the gold or silver nanocomposite prepared using the red ginseng root extract through FE-TEM.
  • Figure 9 shows the purity of the gold or silver nanocomposite prepared using ginseng leaf extract through EDAX analysis.
  • Figure 10 shows the purity of the gold or silver nanocomposite prepared using ginseng root extract through EDAX analysis.
  • Figure 11 shows the purity of the gold or silver nanocomposite prepared using the red ginseng leaf extract through EDAX analysis.
  • FIG. 13 is an analysis of element mapping results of gold or silver nanocomposites prepared using ginseng root extract through TEM.
  • FIG. 15 shows a diffraction pattern of a gold or silver nanocomposite prepared using ginseng leaf extract through X-ray diffraction.
  • Figure 16 shows the diffraction pattern of the gold or silver nanocomposite prepared using ginseng root extract through X-ray diffraction.
  • FIG. 17 is a diagram showing a size distribution profile result based on volume, intensity and number of gold or silver nanocomposites prepared using ginseng leaf extract through dynamic light scattering analysis.
  • FIG. 18 is a diagram showing a size distribution profile result based on the volume, intensity, and number of gold or silver nanocomposites prepared using red ginseng root extracts through dynamic light scattering analysis.
  • Figure 19 shows the antimicrobial activity of the gold or silver nanocomposite prepared using the leaf extract of ginseng.
  • Figure 20 shows the antimicrobial activity of the silver nanocomposite prepared using the root extract of ginseng.
  • Figure 21 shows the antimicrobial activity of the silver nanocomposite prepared using the root extract of red ginseng.
  • FIG. 22 shows biofilm degradation activity of silver nanocomposites prepared using leaf extracts of ginseng.
  • Figure 23 shows the biofilm degradation activity of the silver nanocomposite prepared using the root extract of red ginseng.
  • Figure 24 shows the anticoagulant activity of the gold or silver nanocomposite prepared using the leaf extract of ginseng.
  • FIG. 25 shows cytotoxicity against Keratinocyte cells and lung cancer cells (A549 cells) of gold or silver nanocomposites prepared using leaf extracts of ginseng.
  • Figure 26 shows the anti-inflammatory activity of the gold or silver nanocomposite prepared using the leaf extract of ginseng.
  • a to C are related to BSA-CK
  • D to F are related to BSA-Rh2.
  • a and D show HPLC analysis of the two nanocomposites
  • B and E show 1 H NMR spectra
  • C and F show FTIR spectra.
  • Figure 28 relates to the physicochemical properties of BSA-CK and BSA-Rh2, A to C relates to BSA-CK, and D to F relates to BSA-Rh2. Specifically, A and D show FE-TEM images, B and E show particle size distribution analysis results, and C and F show zeta potential analysis results.
  • BSA-CK CK alone or BSA-CK
  • B represents Rh2 alone or the solubility of BSA-Rh2.
  • FIG. 30 is a graph showing the cytotoxicity of BSA-CK and BSA-Rh2 against A549 lung cancer cells or keratinocytes.
  • a and B are the results of BSA-CK
  • C and D are the results of BSA-Rh2.
  • Statistical significance was confirmed using student's t-test. It was judged to be significant when P ⁇ 0.05, and it is indicated by an asterisk (*).
  • Figure 31 relates to the anti-inflammatory activity of BSA-CK and BSA-Rh2, showing the cytotoxicity and LPS-induced NO production inhibitory effect on the mouse macrophage line RAW 264.7.
  • L-NMMA NG-monomethyl L-arginine
  • a and B are the results of BSA-CK
  • C and D are the results of BSA-Rh2.
  • Statistical significance was confirmed using student's t-test. It was judged to be significant when P ⁇ 0.05, and it is indicated by an asterisk (*).
  • a to C are for MSNP-CK
  • D to F are for MSNP-Rh2.
  • a and D show HPLC analysis of the two nanocomposites
  • B and E show 1 H NMR spectra
  • C and F show FTIR spectra.
  • FIG. 34 is a graph showing cytotoxicity of A549 lung cancer cells or keratinocytes of MSNP-CK and MSNP-Rh2.
  • a and B represent MSNP-CK
  • C and D represent MSNP-Rh2.
  • Statistical significance was confirmed using student's t-test. It was judged to be significant when P ⁇ 0.05, and it is indicated by an asterisk (*).
  • 35 relates to the anti-inflammatory activity of MSNP-CK and MSNP-Rh2, showing the cytotoxicity and LPS-induced NO production inhibitory effect on the rat macrophage line RAW 264.7.
  • L-NMMA NG-monomethyl L-arginine
  • a and B represent MSNP-CK
  • C and D represent MSNP-Rh2.
  • Statistical significance was confirmed using student's t-test. It was judged to be significant when P ⁇ 0.05, and it is indicated by an asterisk (*).
  • Tetrachlorogold (III) acid HuCl 4 -3H 2 O
  • silver nitrate AgNO 3
  • Sigma-Aldrich Chemicals, USA media were purchased and purchased from Difco (MB cell, Seoul, Republic of Korea). Also, the roots and leaves of ginseng were collected from 4 year old ginseng in Gochang, Korea.
  • Standard antibiotic discs are commercially available vancomycin (VA30) 30 ⁇ g / disc, rifampicin (RD5) 5 ⁇ g / disk, oleandomycin (OL15) 15 ⁇ g / disk, penicillin G (P10) 10 ⁇ g / disk, 30 ⁇ g / disk of novobiocin (NV30), 15 ⁇ g / disk of lincomycin (MY15) and 30 ⁇ g / disc of tetracycline (TE30) were purchased (Oxoid Ltd., England). .
  • Pathogenic bacterial strains include Vibrio parahemoliticus parahaemolyticus) [ATCC 33844], Salmonella enteric [ATCC 13076], Escherichia coli) [ATCC 10798], stearyl Pyrococcus OY Russ (Staphylococcus aureus) [ATCC 6538] , Bacillus anthraquinone system (Bacillus anthracis) [NCTC 10340] , Bacillus cereus (Bacillus cereus) [ATCC 14579] , Candida albicans (Candida albicans ) [KACC 30062], and Pseudomonas aeruginosa [ATCC 27853]. The bacterial strains were cultured in agar nutrient medium at 37 ° C. and stored at ⁇ 0 ° C. in glycerol stock vials.
  • ginseng roots collected in Preparation Example 1-1 25 g was cleaned, and then washed with distilled water several times to remove dust or suspended substances. The roots were then cut into small pieces and ground with mortar and pestle. Then, the pieces were heated in 100 ml of sterile water for 30 minutes, and the extract obtained by leaching the components of ginseng into water was filtered with Whatman filter paper, and then centrifuged at 10,000 rpm for 10 minutes. The filtered liquid was placed in 100 ml of sterile water and stored at 4 ° C.
  • red ginseng root was ground to obtain red ginseng root powder
  • 10 g of root powder was mixed with 100 ml of sterile water, heated for 30 minutes, and the liquid obtained by leaching the red ginseng component in water was filtered through Whatman filtration paper and centrifuged at 10,000 rpm for 10 minutes. The filtered liquid was placed in 100 ml of sterile water and stored at 4 ° C.
  • Production Example 1-3-1 Synthesis method of gold or silver nanocomposite using ginseng leaf extract
  • the gold or silver nanocomposite prepared using the leaf extract of ginseng is synthesized in a very short time compared to the nanocomposite prepared using other natural extracts or other site extracts of ginseng.
  • leaf extract of ginseng it can be seen that it is possible to synthesize a stable metal nanocomposite in an economical and environmentally friendly manner in a very fast time, through the phenolic acid, flavonoids, ginsenosides present in the ginseng leaf It can be confirmed indirectly that, and polysaccharides affect the formation of metal nanocomposites.
  • the reaction mixture turned brown and ruby red within 1 hour and 10 minutes, respectively.
  • gold or silver nanocomposites prepared using red ginseng root extracts are synthesized more slowly than those using ginseng leaf extracts, but are synthesized in a significantly faster time than the synthesis time of metal nanocomposites prepared using other natural extracts. It could be confirmed.
  • the nanocomposite prepared using the ginseng extract was UV / visible spectroscopy (UV-vis), field-emission transmission electron microscopy (FE-TEM), energy dispersive X
  • UV-vis UV / visible spectroscopy
  • FE-TEM field-emission transmission electron microscopy
  • EDX spectra energy dispersive X-ray spectrometer
  • elemental mapping dynamic light scattering (DLS)
  • stability analysis EDX-ray spectrometer
  • the size analysis profile of the nanocomposite was analyzed by using dynamic light scattering (DLS), Particles size analyzer, Photal, Otsuka Electronics, Japan. Specifically, hydrodynamic diameters and polydispersity index (PDI) were analyzed at 25 ° C., and pure water having a refractive index of 1.3328, viscosity 0.8878 and dielectric constant 78.3 was used as a reference dispersion medium. It was.
  • DLS dynamic light scattering
  • Particles size analyzer Photal
  • Otsuka Electronics Japan.
  • PDI polydispersity index
  • X-ray diffraction (XRD) analysis of the prepared nanocomposite was carried out with a CuK ⁇ radiation of 40 kv and 40 mA on an X-ray diffractometer (DX Advance, Bruker, Germany). A scan rate of 6 ° / min, a step site of 0.02, and a 2 ⁇ range of 20 to 80 ° were performed.
  • XRD X-ray diffraction
  • the red ginseng root extract was used, the silver nanocomposite at 410 nm and the gold nanocomposite at 560 nm confirmed the main absorption peak. Through this, it was confirmed that the gold and silver nanocomposites using the red ginseng root extract were prepared. (A and b in FIG. 4).
  • This main absorption peak is a specific peak of the gold or silver nanocomposite, which corresponds to the surface plasmon resonance of the nanocomposite.
  • the gold or silver nanocomposites synthesized using the leaves, roots or root extracts of red ginseng did not change the UV-vis spectrum for several months even when stored at 20 ° C. It indicates that it is stable.
  • Example 1-2-2 Field emission scanning electron microscope (Field-emission transmission electron microscopy, FE-TEM) analysis
  • the gold nanocomposite when prepared with the leaf extract of ginseng has a size of 10 to 30 nm and has a spherical shape (a and b in FIG. 5), and the interference fringe spacing is 0.23 nm (FIG. 5 c).
  • the selected electron diffraction pattern of the purified spherical gold nanocomposite having a ring corresponding to [111], [200], [220], [311], and [222]. diffraction pattern, SEAD) could be confirmed (FIG. 5 d).
  • the silver nanocomposite has a spherical shape of 10 to 20 nm (e and f in Fig.
  • Silver nanocomposite prepared with the root extract of ginseng is 10 to 30nm in size and spherical (a and b in Fig. 6), gold nanocomposite is 10 to 40nm in size, it was confirmed that the spherical (Fig. 6c, d ).
  • the silver and gold nanocomposites were uniform and simple dispersion type (a of FIG. 7), it was confirmed that the nanocomposite interference fringe spacing (fringe spacing) of 0.23nm (b, c of FIG. 7).
  • SEAD images of silver and gold nanocomposites with ring-like diffraction patterns showing that the particles are crystals corresponding to [111], [200], [220], and [311] were identified (FIG. 7). D to f).
  • Gold and silver nanocomposites prepared using the red ginseng root extract was confirmed to have a size of 10 to 30 nm, a spherical shape, and a uniform simple dispersion (FIG. 8 a and b).
  • the gold and silver nanocomposites prepared using the ginseng leaf, root extract or red ginseng root extract were confirmed again.
  • the size of the gold and silver nanocomposites produced is uniform and smaller than those of the conventionally prepared metal nanocomposites.
  • the silver nanocomposites are significantly larger than the conventional sizes of 100 nm. It was confirmed that the reduction.
  • Example 1-2-3 Energy Dispersive X-Ray Dispersive X-Ray Analysis (EDAX) Analysis
  • the gold nanocomposite is 2.15 keV and the silver nanocomposite is optical at 3 keV. Absorption was observed (a and b in Fig. 9), and when the root extract of ginseng was used, optical absorption was observed at 3 keV of silver nanocomposite and 2.2 keV of gold nanocomposite (a and b of Fig. 10). ). In addition, in the case of using the root extract of red ginseng, optical absorption was observed at 3 keV for silver nanocomposites and 2.3 keV for gold nanocomposites (a and b in FIG. 11). And as a property of the silver nanocrystals, it can be seen that the gold and silver nanocomposites were prepared.
  • Example 1-2-4 Transmission electron microscope, TEM ) analysis
  • the distribution of gold nanocomposites prepared using ginseng leaf extract was found to be 54.73% (a and b in FIG. 12) and 47.70% in silver nanocomposites (c and d in FIG. 12).
  • the distribution of silver nanocomposites when prepared using the extract was found to be 54.73% (c and d in FIG. 13), and the gold nanocomposite was 52.16% (c and d in FIG. 13).
  • the element mapping results when synthesized using the red ginseng root extract was confirmed through a to d of FIG. The results obtained from the elemental mapping confirmed that the gold and silver nanocomposites of the present invention are excellent particles in each material.
  • Example 1-2-5 X-ray diffraction, XRD ) analysis
  • the gold nanocomposites prepared using the ginseng leaf extract showed intense peaks in the 2 ⁇ value full spectrum ranging from 20 to 80 corresponding to [111], [200], [220], [311] and [222].
  • the silver nanocomposite was able to identify peaks at 2 ⁇ values corresponding to [111], [200], [331], [241], and [311] in the XRD spectrum (FIGS. 15A and 15B).
  • intense peaks were observed in the 2 ⁇ value full spectrum corresponding to [111], [200], [331], [241] and [311] (FIGS. 16A and 16B). This shows similar values to Bragges's reflections of gold and silver nanocrystals, indicating that gold and silver nanocomposites were prepared from these results.
  • Example 1-2-6 Dynamic Light Scattering (Dynamic Light Scattering, DLS) Analysis
  • the size distribution of the particles was checked based on the volume, intensity, and number of the gold and silver nanocomposites prepared in Preparation Examples 1-3.
  • the gold nanocomposite when prepared using ginseng leaf extract is in the range of 50 to 150 nm with a polydispersity index (PDI) of 0.191 (a to c in FIG. 17), and the silver nanocomposite to It was confirmed that the dispersion index (polydispersity index) is in the range of 70 to 140 nm, 0.13 (Fig. 17 d to f), the average particle size of the gold and silver nanocomposites, that is, the hydrodynamic diameter of the nanocomposites, respectively It was confirmed that it is 97nm and 80nm.
  • PDI polydispersity index
  • the silver nanocomposite using red ginseng root extract has a polydispersity index (PDI) of 0.190, an average diameter of 83 nm (a to c in FIG. 18), and the gold nanocomposite has a polydispersity index (polydispersity). index) was 0.159 and the average diameter was 183 nm (d to f in FIG. 18).
  • PDI polydispersity index
  • index was 0.159 and the average diameter was 183 nm (d to f in FIG. 18).
  • the gold and silver nanocomposites synthesized using the ginseng leaf or root extract or the red ginseng extract exhibit stability without the addition of additional reducing agents or stabilizers.
  • the above results indicate that phenolic acids and flavonoids exhibit antioxidant activity present in ginseng leaves, and ginsenosides such as Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re, Rg1, F1, F2, and F4.
  • the ginseng leaf extract acts as a reducing agent and stabilizer by itself without any other reducing agent or stabilizer
  • Gold and silver nanocomposites, prepared using ginseng leaf extracts suggest the potential for application to drug carriers over a wide range of pH.
  • MHA Muller-Hinton agar
  • Pathogenic microorganisms used in the evaluation of antimicrobial activity include Vibrio parahaemolyticus , Salmonella enterica , Staphylococcus aureus , Escherichia coli , and Bacillus antra Bacillus anthracis , Bacillus cereus and Candida albicans were selected and used.
  • each strain to 100 ⁇ l of MHA medium plate evenly and incubate for one day, and apply 30 ⁇ l (100 mg / L) or 50 ⁇ l (100 mg / L) of the prepared silver and gold nanocomposite reaction mixture. Incubated at 37 ° C for 24 hours. After incubation, inhibition zones around the silver and gold nanocomposites were measured and compared to the inhibition zones of each antibiotic disc.
  • one or more standard antibiotics are selected from the group consisting of vancomycin, novobiocin, tetracycline, rifampicin, oleandomycin, penicillin, and lincomycin. It was used by.
  • Gold nanocomposite prepared using the ginseng leaf extract prepared in Preparation Example 1-3-1 as can be seen in Figure 19, Vibrio parahemoliticus, Salmonella enterica, Escherichia coli and Stepirococcus It was confirmed that it has antimicrobial activity against Orus, and the silver nanocomposite had antimicrobial activity against Vibrio parahemoliticus, Salmonella enterica, and Escherichia coli. The results are shown in Table 1 below.
  • silver nanocomposite is Escherichia coli Antimicrobial activity against, Bacillus cereus, Stephylococcus aurus, Vibrio parahemolyticus and Bacillus anthracis showed antimicrobial activity, but no activity was observed for the gold nanocomposite at the same concentration.
  • Biofilm-degrading activity of silver nanocomposites was investigated by Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa ) was confirmed by the colorimetric method (colorimetric method). Specifically, the wells of a 96-well micro-titer plate were filled with 100 ⁇ l of S. aureus strains and Pseudomonas aeruginosa strains and incubated for 24 hours in a log phase. Then, the silver nanocomposite was added in the range of 1 to 4 ⁇ g, the cell culture plate was incubated at 37 ° C. for 4 hours, the medium was removed, and the wells were washed three times with 200 ⁇ l of sterile water. .
  • micro-titer plate was then air dried for 45 minutes, 200 ⁇ l of a solution of 0.1% crystal violet added to water was added to each well for 4 minutes, followed by 3 times with 300 ⁇ l of sterile water. Excess strain was removed by washing with water. The stain integrated by adjacent cells through this was lysed together in 200 ⁇ l of 95% ethanol. Absorption of each well was measured at 595 nm using a micro-titer ELISA reader, and then the percentage of biofilm activity inhibition was calculated using the following formula: [1- (A595 of test / A595 of control)] ⁇ 100 (Gurunathan et al., 2014). The experiment was performed repeatedly and the results analyzed under mean ⁇ SD.
  • Silver nanocomposite of Preparation Example 1-3-1 prepared using ginseng leaf extract, Stepirococcus aureus and Pseudomonas eruji at a concentration of 4 ⁇ g / ml of silver nanocomposite, as can be seen in FIG.
  • Biofilm degradation activity for the labor and management was found to be the highest, as shown in Figure 23 in the silver nanocomposite prepared using the red ginseng root extract prepared in Example 3-3, 4 ⁇ g / It was confirmed that there is biodegradation activity against Stepirococcus Ourus and Pseudomonas aeruginosa at ml concentration.
  • the nanocomposite prepared using ginseng extract may have a biofilm-degrading activity on the strain, thereby inhibiting biofilm-related infections and may play a role in reducing cost and patient pain.
  • Gold nanocomposite of Preparation Example 1-3-1 prepared using ginseng leaf extract as can be seen in Figure 24, it was confirmed that the presence of gold nanocomposite inhibits the formation of coagulation (Fig. 24 a). In comparison, the control without anticoagulant completely coagulates blood (FIG. 24B). In addition, even after 24 hours, no specific change in the stability of the gold nanocomposite was observed.
  • the gold nanocomposite was not cytotoxic to RAW264.7 cells up to a concentration of 100 ⁇ M, it was confirmed that the concentration-dependent NO inhibition (Fig. 26). Through this, it was confirmed that the silver and gold nanocomposites biosynthesized by the leaf extract of ginseng have anti-inflammatory activity without cytotoxicity.
  • BSA-CK or BSA-Rh2 nanocomposites having BSA bonded to the ginsenoside were prepared.
  • BSA-CK The synthesis of BSA-CK was carried out via a desolvent method. Specifically, BSA was dissolved in water and sonicated for 5-10 minutes. Thereafter, the BSA-water mixture was stirred vigorously, and ginsenoside CK dissolved in ethanol was added dropwise to the BSA-water mixture. The BSA-ginsenoside reaction mixture was stored at room temperature for 24 hours. The reaction mixture was then transferred to a dialysis membrane (Mw. Cut off: 3,000), dialyzed in methanol / distilled water (75:25, v / v) for one day, further dialyzed with distilled water for two days, and then lyophilized. It was.
  • Mw. Cut off: 3,000 dialysis membrane
  • BSA-Rh2 nanocomposites were also synthesized using ginsenoside Rh2 in the same manner as above.
  • Example 7-1 Determination of ginsenoside amounts of BSA-CK and BSA-Rh2
  • the amount of ginsenosides loaded on the BSA-CK or BSA-Rh2 nanocomposites was calculated using HPLC.
  • BSA-CK showed the same clear peak as CK alone, it was confirmed that the amount of CK loaded on BSA-CK is 0.087 mg per 1 mg nanocomposite.
  • BSA-Rh2 showed the same clear peak as alone, and it was confirmed that the amount of Rh2 loaded on BSA-Rh2 was 0.096 mg per 1 mg of the nanocomposite.
  • Example 7-2 Identifying Ginsenosides' Unique Properties of BSA-CK and BSA-Rh2
  • 1 H NMR spectra were recorded at 300 MHz (JEOL, Tokyo, Japan) and samples dissolved in D 2 O or C D 3 OD.
  • FT-IR spectra were identified using a Perkin-Elmer FT-IR spectrophotometer using KBr pellets.
  • FE-TEM JEM-2000F, JEOL operated at an acceleration voltage of 200 kV was used.
  • FE-TEM sample Specifically, in order to prepare the FE-TEM sample, one drop of the sample solution was placed on a carbon-coated 200-mesh copper grid to dry naturally. The size distribution and stability of the nanocomposites were confirmed by particle analyzer and zeta potential, and samples were dispersed in phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.4) or acetate buffer (pH 5.0).
  • PBS phosphate-buffered saline
  • pH 5.0 acetate buffer
  • DLS dynamic light scattering
  • the nanocomposite of the present invention was prepared by forming a stable system.
  • High water solubility advantageously improves pharmacokinetic properties such as bioavailability, membrane permeability and therapeutic activity.
  • solubility in water is the most important physiochemical factor in drug absorption, solubility of the BSA-CK and BSA-Rh2 nanocomposites of the present invention was analyzed.
  • the nanocomposite of the present invention can be usefully used as a drug because it has a high solubility.
  • human lung cancer cells (A549) were cultured in RPMI 1640 medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and 100 IU / mL penicillin and 100 ⁇ g / mL streptomycin (Gibco-Brl. Gaithersburg, MD, USA). . Wet the cells in a humid atmosphere containing 5% CO 2 Incubation was carried out at 37 ° C under conditions.
  • FBS fetal bovine serum
  • streptomycin Gibco-Brl. Gaithersburg, MD, USA
  • MTT 4, 5-dimethylthiazol-2-yl) -2-5-diphenyletrazolium bromide assay. Specifically, cells were dispensed into 96-well plates at a density of 1 ⁇ 10 5 cells / mL, and after incubation for 24 hours, various concentrations of BSA-Rh2, BSA-CK, ginsenoside CK or Rh2 were applied to the cells 24 Treated for hours. After the designated incubation time, 10 ⁇ l of MTT stock solution (5 mg / ml) was placed in each well and incubated for 4 hours. The supernatant was then removed and 100 ⁇ l of DMSO was added to the wells.
  • MTT 4, 5-dimethylthiazol-2-yl
  • the amount of formazan formed by the viable cells was measured at a wavelength of 570 nm using a multi-model plate reader, and the reference wavelength was 630 nm.
  • cytotoxicity against keratinocytes was measured in the same manner as above.
  • BSA-CK has an excellent anticancer activity by toxic to A549, and showed cancer cell specific cytotoxicity that does not act on normal cells.
  • the culture and survival rate of the A549 lung cancer cell line was confirmed by performing the method according to Example 4-1.
  • BSA-Rh2 showed slightly lower toxicity than Rh2 alone against A549 lung cancer cell line.
  • BSA-Rh2 was not toxic to keratinocytes at a concentration of up to 15 ⁇ M, but Rh2 alone was toxic at the same concentration.
  • BSA-Rh2 shows cancer cell specific cytotoxicity.
  • the rat macrophage line (RAW 264.7) was 5 x 10 3 Dispense into 96-well microplates at a density of cells / well.
  • RPMI 1640 medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and 100 IU / mL penicillin and 100 ⁇ g / mL streptomycin (Gibco-Brl. Gaithersburg, MD, USA) was used.
  • FBS fetal bovine serum
  • streptomycin Gibco-Brl. Gaithersburg, MD, USA
  • the BSA-CK nanocomposite did not inhibit the growth of macrophages at a concentration of 5 ⁇ g / mL, but inhibited the growth at a high concentration of 10 ⁇ g / mL.
  • nitric acid (NO) produced RAW 264.7 cells were pretreated for 1 hour with BSA-Rh2, BSA-CK, ginsenoside CK alone or Rh2 alone, after which the conditions in which the sample was present Stimulated with 1 ⁇ g / ⁇ L lipopolysaccharide (LPS). After incubating the cells for 24 hours, 100 ⁇ l of the supernatant of the cell culture was mixed with an equal volume of Gries reagent, and the absorbance was measured at 540 nm using a microreader (Bio-Tek Instruments, Inc.). It was. Standard sodium nitrate curves were included in each experiment.
  • BSA-CK nanocomposite significantly inhibited the NO production of macrophages at a low concentration of 1 ⁇ g / mL that does not exhibit cytotoxicity.
  • BSA-CK exhibited excellent anti-inflammatory activity by selectively inhibiting only NO production without direct toxicity to normal macrophage lines.
  • the BSA-Rh2 nanocomposite did not inhibit the growth of macrophages at a concentration of 5 ⁇ g / mL, but inhibited the growth at a high concentration of 10 ⁇ g / mL.
  • MSNP-CK or MSNP-Rh2 nanocomposites in which mesoporous silica nanoparticles (MSNP) were combined with the ginsenoside were synthesized.
  • MSP Mesoporous silica nanoparticles
  • TEOS tetraethyl orthosilicate
  • APTEOS 3-aminopropyltriethoxy-silane
  • FITC Staining reagent fluorescein isothiocyanate
  • MSNP-CK was synthesized through the following three steps. As a first step, 250 mg of FITC and 10 ml of pure ethanol were first added to three necked bottles of 50 mL volume. Then, 2.5 ml of water and NH 4 OH were added, and stirred at room temperature for 30 minutes. 15 ml of TEOS and 200 ⁇ L of APTMS were added to the mixed solution and stirred for 12 hours in dark to prevent bleaching of the staining reagent. The obtained FITC / APTMS complex was stored under dark condition to block photobleaching. The prepared nanocomposite solution was distilled to remove the ethanol solvent before use.
  • MSNP was functionalized with free amine groups and silica was FITC coated. Specifically, 100 mg of MSNP was dissolved in 15 ml of toluene, and the mixed solution was well dispersed and stirred. Then 10 ⁇ l of APTMS was added dropwise and 1 drop of HCl (1M) was added. The reaction mixture was stirred for 24 hours, rinsed several times with water and dried.
  • MSNP-Rh2 nanocomposites were also synthesized using ginsenoside Rh2 in the same manner as above.
  • Example 12-1 Determination of ginsenosides in MSNP-CK and MSNP-Rh2
  • the amount of ginsenosides loaded on the MSNP-CK or MSNP-Rh2 nanocomposites was calculated using HPLC.
  • MSNP-CK showed the same clear peak as CK alone, it was confirmed that the amount of CK loaded on MSNP-CK is 0.066 mg per 1 mg nanocomposite.
  • MSNP-Rh2 showed the same clear peak as alone, it was confirmed that the amount of Rh2 loaded on MSNP-Rh2 was 0.072 mg per 1 mg of the nanocomposite.
  • MSNP-CK and MSNP-Rh2 nanocomposites of the present invention were well prepared, the structures of MSNP-CK and MSNP-Rh2, and intermediates thereof were confirmed using 1 H NMR and FT-IR.
  • 1 H NMR spectra were recorded at 300 MHz (JEOL, Tokyo, Japan) and samples dissolved in D 2 O or C D 3 OD.
  • FT-IR spectra were identified using a Perkin-Elmer FT-IR spectrophotometer using KBr pellets.
  • MSNP-CK and MSNP-Rh2 nanocomposites have unique characteristics of CK and Rh2, respectively.
  • FE-TEM JEM-2000F, JEOL operated with an acceleration voltage of 200 kV was used.
  • a FE-TEM sample was prepared by preparing a FE-TEM sample. Specifically, in order to prepare a FE-TEM sample, one drop of the sample solution was placed on a carbon-coated 200-mesh copper grid to dry naturally, and the sample was phosphate-buffered saline (PBS, pH). 7.4) or in acetate buffer (pH 5.0).
  • PBS phosphate-buffered saline
  • pH 5.0 acetate buffer
  • MSNP-CK and MSNP-Rh2 has the shape of a sphere having a uniform size distribution.
  • human lung cancer cells (A549) were cultured in RPMI 1640 medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and 100 IU / mL penicillin and 100 ⁇ g / mL streptomycin (Gibco-Brl. Gaithersburg, MD, USA). . Wet the cells in a humid atmosphere containing 5% CO 2 Incubation was carried out at 37 ° C under conditions.
  • FBS fetal bovine serum
  • streptomycin Gibco-Brl. Gaithersburg, MD, USA
  • MTT 4, 5-dimethylthiazol-2-yl) -2-5-diphenyletrazolium bromide assay. Specifically, cells were dispensed in 96-well plates at a density of 1 ⁇ 10 5 cells / mL, and after incubation for 24 hours, various concentrations of MSNP-Rh2, MSNP-CK, Ginsenoside CK or Rh2 were applied to the cells. Treated for hours. After the designated incubation time, 10 ⁇ l of MTT stock solution (5 mg / ml) was placed in each well and incubated for 4 hours. The supernatant was then removed and 100 ⁇ l of DMSO was added to the wells.
  • MTT 4, 5-dimethylthiazol-2-yl
  • the amount of formazan formed by the viable cells was measured at a wavelength of 570 nm using a multi-model plate reader, and the reference wavelength was 630 nm.
  • cytotoxicity against keratinocytes was measured in the same manner as above.
  • the MSNP-CK nanocomposite exhibited significantly higher cytotoxicity, inhibiting about 50% cell growth at a low concentration of 1 ⁇ g / mL. It was confirmed that, at a concentration of 10 ⁇ g / mL it was confirmed that the cytotoxicity of about 90% or more. In addition, it was confirmed that the cytotoxicity was significantly superior to CK alone. On the other hand, it was confirmed that the keratinocyte line did not show cytotoxicity even at a high concentration of 15 ⁇ g / mL.
  • MSNP-CK exhibited excellent anticancer activity by toxic to A549, and showed cancer cell specific cytotoxicity which does not act on normal cells.
  • the culture and survival rate of the A549 lung cancer cell line was confirmed by performing the method according to Example 3-1.
  • MSNP-Rh2 nanocomposites showed significantly higher cytotoxicity, inhibiting about 50% cell growth at low concentrations of 1 ⁇ g / mL. It was confirmed that, at a concentration of 15 ⁇ g / mL showed about 90% or more cytotoxicity. In addition, it was confirmed that the cytotoxicity was significantly superior to CK alone. On the other hand, it was confirmed that the keratinocyte line did not show cytotoxicity even at a high concentration of 15 ⁇ g / mL.
  • MSNP-Rh2 has a good anticancer activity by toxic to A549, cancer cell-specific cytotoxicity does not act on normal cells.
  • rat macrophage cell line (RAW 264.7) at a density of 5 x 10 3 cells / well.
  • RPMI 1640 medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and 100 IU / mL penicillin and 100 ⁇ g / mL streptomycin (Gibco-Brl. Gaithersburg, MD, USA) was used, which contained 5% CO 2 .
  • FBS fetal bovine serum
  • streptomycin Gibco-Brl. Gaithersburg, MD, USA
  • Wet atmosphere Incubated at 37 ° C. for 24 hours. Thereafter, the viability of the cells was measured by the MTT assay method according to Example 3-1.
  • MSNP-CK nanocomposite did not inhibit the growth of macrophages at a concentration of 5 ⁇ g / mL, it was confirmed that inhibiting the growth at a high concentration of 10 ⁇ g / mL.
  • nitric acid (NO) produced RAW 264.7 cells were pretreated for 1 hour with MSNP-Rh2, MSNP-CK, ginsenoside CK alone or Rh2 alone, after which the conditions in which the sample was present Stimulated with 1 ⁇ g / ⁇ L lipopolysaccharide (LPS). After incubating the cells for 24 hours, 100 ⁇ l of the supernatant of the cell culture was mixed with an equal volume of Gries reagent, and the absorbance was measured at 540 nm using a microreader (Bio-Tek Instruments, Inc.). It was. Standard sodium nitrate curves were included in each experiment.
  • MSNP-CK exhibits excellent anti-inflammatory activity by selectively inhibiting only NO production without direct toxicity to normal macrophage lines.
  • MSNP-Rh2 nanocomposite did not inhibit the growth of macrophages at a concentration of 5 ⁇ g / mL, it was confirmed that inhibiting the growth at a high concentration of 10 ⁇ g / mL.
  • MSNP-Rh2 significantly inhibited the NO production of macrophages at a low concentration of 1 ⁇ g / mL did not exhibit cytotoxicity.
  • MSNP-Rh2 exhibits excellent anti-inflammatory activity by selectively inhibiting only NO production without direct toxicity to normal macrophage lines.

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Abstract

나노 약물전달체; 및 인삼추출물 또는 이로부터 분리된 진세노사이드를 포함하는 나노 복합체와 이의 제조방법에 관한 것으로, 상기 나노 복합체는 암 및 염증성 질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다. 본 발명의 나노 복합체는 종래 금속 나노입자보다 제조시간이 현저히 단축되고, 별도의 환원제 또는 안정제의 부가 없이도 크기가 균일한 금속 나노 복합제를 제조할 수 있다. 또한, 물에대한 용해도가 높고, 암세포에 대한 타겟 능력이 높아 약물로 개발되기에 유리하다. 또한, 높은 항암, 항염 활성 등을 나타내므로 암 및 염증 질환의 예방, 치료에 유용하게 활용될 수 있으며, 나아가 항균활성, 바이오필름 분해 활성, 항응고 활성을 가져 다양한 사업분야에서 활용될 수 있다.

Description

나노 약물전달체; 및 인삼추출물 또는 이로부터 분리된 진세노사이드를 포함하는 나노 복합체
나노 약물전달체; 및 인삼추출물 또는 이로부터 분리된 진세노사이드를 포함하는 나노 복합체에 관한 것이다.
인삼(Panax ginseng)은 두릅나무과(Araliaceae)에 속한 식물로, 다른 식물과 비교할 때, 성장이 매우 느리고, 다년생인 식물이며, 대부분은 한국, 중국의 북동쪽, 또는 시베리아 극동지역에서 발견된다. 인삼은 오랫동안 토닉, 강장제, 안티 에이징제 등의 전통적 약재로 재배되어 사용되어 왔는데, 주요 활성성분은 진세노사이드로 40개 이상 존재한다고 알려져 있으며, 대부분이 항암, 항당뇨, 산화방지제, 항염증, 면역기능의 변화 및 통제, 방사선 방호, 항건망증, 항아포프토시스 또는 항스트레스 등의 생물학적이고 약학적인 활성을 가진다고 알려져 있다. 또한, 다른 연구에서도 인삼의 일부 성분이 노화, 주요 신경 시스템의 장애나 신경변성질환에 효과가 있다고 보고되고 있다.
인삼은 여러 부위 중에서도 주로 뿌리나 열매가 많이 사용되고 있다. 그 이유는, 인삼의 뿌리에 진세노사이드가 대량으로 함유되어 있다고 알려져 있기 때문이다. 반면, 인삼의 뿌리와 다르게 인삼의 잎은 뿌리보다 많은 부위를 차지하고 있음에도 불구하고, 그것을 활용한 약재의 제조 빈도는 뿌리나 열매에 에 비해 현저히 낮았다. 그러나 최근 인삼의 잎에 플라보노이드(flavonoids), 트리터페노이드(triterpenoids), 폴리아세틸렌(polyacetylenic), 알코올, 진세노사이드, 아미노산, 펩타이드, 폴리사카라이드, 휘발성 기름 및 지방산과 같은 많은 활성 성분을 포함되어 있고, 이러한 활성 성분들이 심혈관, 생식 및 대사시스템 뿐 아니라, 주요 신경 시스템에 많은 중요한 약학적인 효과를 생산하고, 그 외에도 항-피로, 항-고혈당, 항당뇨, 항암, 산화방지제 및 항노화의 특성을 가진다고 보고되고 있어(Biomaterials, 2009, 30(10), 1857-69), 인삼의 잎을 이용한 연구가 점차 증대되고 있는 중이다. 다만, 아직까지 인삼의 잎 추출물을 이용하여 금속 나노입자를 제조한 바 없다.
또한, 진세노사이드는 트리테르펜(triterpene) 사포닌으로, 한국, 중국 및 일본의 전통 의약에서 사용되는 약초인 인삼(P. ginseng)의 주된 활성 화합물이다. 진세노사이드는 항종양, 항염, 항비만 활성 및 알츠하이머병에 대한 보호 효과 등의 광대한 범위의 약리 효과를 나타낸다. 이에 따라, 진세노사이드 Rg5를 유효성분으로 함유하는 혈관형성 촉진용 조성물(한국 공개특허 제2016-0018974호), 진세노사이드 F2의 간 질환 예방 또는 치료 용도(한국 공개특허 제2016-0029894호) 등의 치료용 조성물을 비롯하여, 진세노사이드 Rd가 강화된 발효 인삼 또는 홍삼 추출물의 제조방법(한국 공개특허 제2016-0018147호), 녹강균을 이용한 진세노사이드 함량이 증가된 홍삼 제제 및 이의 제조방법(한국 공개특허 제2015-0125785호) 등 진세노사이드 관련 기술의 개발이 활발히 이루어지고 있다. 그러나, 이러한 다양한 약리학적 활성에도 불구하고, 타겟 세포로의 전달 효율이 현저히 떨어지며, 용해도가 낮아 약물로 개발하기에 많은 문제점이 있었다.
나노 테크놀로지는 전기공학 및 생물공학에서 잠재적인 효과를 가지는 현대과학에서 중요한 분야로 급격하게 성장하고 있다. 또한, 상기와 같은 문제점을 극복하기 위하여 나노운반체를 이용한 약물 전달 시스템의 개발이 활발히 이루어지고 있다.
그 중에서도 금속 나노 복합체는 이화학적이고 생물학적인 독특한 입자 크기와 그의 모양 때문에 중요하게 여겨지고 있으며(Colloids Surf B Biointerfaces, 2013, 107, 227-34), 특유의 전자성, 자기성, 촉매성 및 광학적인 특성으로 인하여 생의학, 광학 등의 분야에서 다양하게 응용되고 있어 그의 중요성은 점차 높아져 가고 있다.
여러 금속 중, 은은 오랫동안 그것의 항균 특성으로 많은 세균 감염을 치료하기 위한 의학적 질병의 치료를 위해 사용되어 왔고, 나노입자 형태로서의 은 나노 복합체는 그의 이온 형태보다 세포독성이 감소되고 항박테리아의 효과를 증대시킨다고 알려져 있어, 항균, 항염증 또는 감염 방지를 위해 많은 분야에 적용된다고 알려져 있다. 금 또한, 그것의 독특하고 조화스러운 표면 플라즈몬 진동으로 약 전달자, 조직 또는 암 이매징, 포토 광열 치료(photo thermal therap), 검체에서 병원균의 면역 색층 확인(immune chromatographic identification), 바이오센서, DNA 라벨링 또는 베이포 센싱(vapor sensing) 등의 다양한 분야에서 사용되어져 왔다.
일반적으로 이러한 금속 나노 복합체를 제조하기 위하여 화학적, 물리적 또는 생물학적 합성방법 등이 이용되고 있는데, 화학적 합성방법은 비교적 공정이 간단하나 비용이 많이 들고 시약의 부작용 등이 문제시 되고 있다. 또한, 물리적 방법은 나노입자의 크기 제어가 어렵고 고가의 제조 설비가 요구되는 등의 문제가 있어 효과적인 금속 나노 복합체의 제조가 어렵다는 단점이 있다.
이러한 이유로, 최근 박테리아 또는 균주에 의한 제조방법이나, 천연 추출물을 유효성분으로 포함하는 친환경적인 금속 나노 복합체의 제조방법에 대한 연구가 많이 진행되고 있다. 그러나 종래 박테리아 또는 균주에 의해 금속 나노 복합체를 합성하는 방법은 짧게는 하루에서 길게는 며칠까지 합성을 위한 긴 시간이 필요하고, 합성된 나노입자의 안정화를 위해 부가적인 환원제 또는 안정화제와 같은 캡핑제(capping agent)가 필요하다는 단점이 존재하였다. 이에, 여전히 친환경적이면서 동시에 안정하고, 화학적 또는 물리적인 합성방법과 비교할 때 제조시간의 한계를 극복한 금속 나노 복합체에 대한 개발은 계속 요구되고 있는 실정이다.
또한, 최근에는 유기적 플랫폼(리포좀, 폴리머 및 덴드리머 등) 및 무기적 시스템(금, 반도체 나노크리스탈, 자성 NP 및 실리카 입자 등) 등을 기반으로 한 여러 나노운반체가 개발되었으며, 이 중에서도 무기물을 기반으로 한 나노운반체인 메조다공성 실리카 나노입자(Mesoporous silica nanoparticle; MSNP)는 약물 운반체로서의 주목할 만한 특징을 갖는다.
구체적으로, 상기 MSNP의 표면을 덮고 있는 많은 실라놀기(silanol groups, Si-OH)는 합성 후 변형을 용이하게 하여 약물 전달의 디자인을 단순화하며, MSNP는 가수분해 및 효소적 분해에 저항성을 보이므로, 약물을 높은 수준으로 적재할 수 있다. 또한, 대부분의 효소 단백질은 상기 MSNP의 나노기공(nanopore)보다 상당히 큰 직경을 가지고 있어, 나노기공의 좁은 경계는 효소의 침입을 저해하는 물리적 장벽을 제공한다. 따라서, MSNP의 내부 벽에 갇히거나 벽에 연결된 약물들은 생체 내 가수분해 및 조기 방출로부터 보호될 수 있다.
또한, 단백질에 결합한 약물은 암세포나 염증 조직에 우선적으로 흡수되는 고유한 특성을 나타내는 고분자 단백질은 상기 언급된 항암제의 문제점을 극복할 수 있는 유망한 약물 전달 시스템으로 주목받고 있다. 또한, 단백질의 전하기(charged group)는 단백질이 약물 분자를 물리적으로 포획하는 것을 돕는데, 이러한 단백질의 특성은 단백질을 이상적인 약물 전달의 후보자로 사용될 수 있게 한다.
최근, 알부민(albumin) 기반 나노입자를 임상에 적용하기 위하여 많은 연구가 수행되고 있다. 알부민은 혈장 단백질로서 다양한 생물학적 과정을 수행하는데, 혈장 알부민은 독특한 리간드-전달 특성을 가지고 있어 혈장 알부민에 결합된 소수성 약물에 대하여 향상된 용해도를 부여하고, 생물학적 환경에서 약물 분자가 향상된 약물 동력학적 특징을 나타낼 수 있도록 돕는다. 이에 따라, 알부민을 이용한 많은 약물이 개발된 상태이며, 구체적인 예로 비소세포성 폐암 및 유방암에 대한 치료제로서 nab™사에서 개발한 아브락산(Abraxane, paclitaxel-albumin NPs)이 미국 FDA의 승인을 받았다. 또한, 약 7가지 알부민 기반 약물 또는 조영제(imaging agents)가 시장에 출시되었으며, 약 10가지의 상품이 암, 당뇨, C형 간염 및 류마티스성 관절염 등의 치료에 임상 적용되었다(Yu et al., 2014; Zhao et al., 2015).
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 인삼 추출물을 이용하여 금속 나노 복합체를 제조하는 데 있어, 종래보다 제조시간이 현저히 단축되고 크기가 균일하며, 별도의 환원제 또는 안정제의 부가 없이도 안정하게 제조할 수 있는 금속 나노 복합체의 제조방법을 개발하고, 상기 방법에 의해 제조된 금속 나노 복합체를 포함하는 조성물이 항균활성, 바이오필름 분해활성, 항응고, 항암 및 항염증 활성을 가짐을 확인하였다.
또한, 본 발명자들은 암세포에 대한 타겟 능력 및 반감기가 향상된 진세노사이드 약물체를 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 나노입자에 진세노사이드가 연결된 나노 복합체는 물에 대한 용해도가 높거나 pH에 따른 선택적인 약물 방출 패턴을 가지며, 높은 항암 및 항염 활성을 가짐을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 나노 약물전달체; 및 인삼추출물 또는 이로부터 분리된 진세노사이드를 포함하는 나노 복합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 나노 복합체를 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 나노 복합체를 포함하는, 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 나노 복합체를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 나노 복합체를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 염증성 질환을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 나노 약물전달체; 및 인삼추출물 또는 이로부터 분리된 진세노사이드를 혼합하여 반응시키는 단계를 포함하는, 나노 복합체의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 나노 약물전달체; 및 인삼추출물 또는 이로부터 분리된 진세노사이드를 포함하는 나노 복합체를 제공한다.
본 발명에서 용어, "인삼"은 두릅나무과(Araliaceae)에 속한 식물로, 다른 식물과 비교할 때, 성장이 매우 느리고, 다년생인 식물이며, 대부분은 한국, 중국의 북동쪽, 또는 시베리아 극동지역에서 발견되는 식물을 의미한다. 구체적으로, 상기 인삼은 인삼(panax ginseng) 또는 홍삼(red ginseng)을 선택할 수 있으나, 이에 한정된 것은 아니다.
본 발명에서 용어, "인삼 추출물"은 인삼을 용매를 이용하여 통상적인 방법으로 얻어낸 인삼에 속한 성분이나 물질을 의미한다.
상기 인삼 추출물은 하기의 단계들을 포함하는 제조방법에 의해 제조될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다:
1) 인삼에 추출용매를 가하여 추출하는 단계;
2) 단계 1)의 추출물을 식힌 후 여과하는 단계; 및
3) 단계 2)의 여과한 추출물을 감압 농축한 후 건조하는 단계.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 인삼은 재배한 것 또는 시판되는 것 등 제한 없이 사용할 수 있으며, 구체적으로는, 인삼(panax ginseng) 또는 홍삼(red ginseng)을 이용할 수 있으나, 이에 한정된 것은 아니다. 또한, 인삼의 부위로는 천연, 잡종 또는 변종 수련의 모든 기관, 예를 들어, 뿌리, 가지, 줄기, 잎, 꽃, 열매와 같은 지상부를 모두 포함할 수 있고, 보다 구체적으로는 뿌리 또는 잎을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에서는, 채취한 인삼(panax ginseng)의 뿌리 또는 잎을 세척 및 건조한 후, 조각으로 잘라 멸균수에서 가열하여 인삼의 성분들을 물에 침출시킨 추출물이나, 홍삼(red ginseng) 뿌리 추출물을 제조하였다.
상기 방법에 있어서, 상기 추출물은 물, C1 내지 C4의 알코올 또는 이들의 혼합물인 용매로 추출되는 것일 수 있으며, 구체적으로 상기 알코올은 에탄올 또는 메탄올일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 보다 구체적으로는, 증류수를 용매로 하여 추출되는 것일 수 있다.
상기 추출 방법으로는 여과법, 열수추출, 침지추출, 환류냉각추출 및 초음파추출 등 당업계의 통상적인 방법을 이용할 수 있다. 상기 열수추출 방법으로는 1회 내지 5회 추출할 수 있고, 구체적으로는 3회 반복 추출할 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 상기 추출용매는 건조된 인삼에 0.1 내지 10배 첨가할 수 있으며, 구체적으로는 0.3 내지 5배 첨가할 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 또한, 추출온도는 구체적으로 20 ℃ 내지 40℃일 수 있으나 이에 한정하지 않으며, 추출시간은 구체적으로 12 내지 48시간일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 3)의 감압농축은 구체적으로 진공감압농축기 또는 진공회전증발기를 이용할 수 있으나 이에 한정되지 않으며, 상기 건조는 구체적으로 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무건조 또는 동결건조할 수 있으나 이에 한정하지 않는다.
한편, 본 발명의 용어, "진세노사이드(ginsenosides)"는 인삼에 있는 사포닌을 의미한다. 인삼 사포닌은 다른 식물에서 발견되는 사포닌과는 다른 특이한 화학구조를 가지고 있으며, 약리효능도 특이하여 인삼(Ginseng) 배당체(Glycoside)란 의미로 진세노사이드(ginsenosides)라 불린다.
본 발명에서, 상기 진세노사이드는 상업적으로 판매되는 것을 구입하거나 또는 자연계에서 재배 또는 채취한 인삼으로부터 분리된 것을 사용할 수 있으며, 또는 합성방법에 의해 합성된 것을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 진세노사이드는 진세노사이드 화합물 K(Compound K) 또는 진세노사이드 Rh2일 수 있다.
본 발명의 용어, "진세노사이드 화합물 K(Compound K)"는 인삼 자체에는 존재하지 않으나, 인삼 또는 홍삼에 존재하는 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rd 등의 사포닌이 비피더스 균과 같은 장내 미생물 또는 토양미생물의 작용에 의하여 체내에서 흡수가능한 형태로 전환된 사포닌을 의미하며, 하기 화학식 1로 표시될 수 있다. 본 발명에서, 상기 진세노사이드 화합물 K(Compound K)는 '진세노사이드 CK' 또는 'CK'로 혼용되어 명명될 수 있다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2017000489-appb-I000001
본 발명의 용어, "진세노사이드 Rh2"는 인삼으로부터 분리된 PPD(protopanaxadiol) 계열 사포닌을 의미한다. 20(S)-protopanaxdiol-3-O-β-D- glucopyranoside라고도 하고, C36H62O8의 화학식으로 표시되며, 하기 화학식 2로 표시될 수 있다. 본 발명에서, 상기 진세노사이드 Rh2는 'Rh2'로 혼용되어 명명될 수 있다.
[화학식 2]
Figure PCTKR2017000489-appb-I000002
지금까지 연구된 바에 의하면 상기 진세노사이드 CK는 비인두암 사멸 작용(Law CK, Chin Med., 2014, 2, 9(1):11.), 항알레르기 작용(Choo MK, et al., Planta Med., 69:518-522, 2003), 신경퇴행성질환 예방작용(Tohda C., et al., Neuropsychopharmacology, 29:860-868, 2004), 피부보호 작용(Shin YW, et al., J. Pharmacol. Sci., 99:83-88, 2005) 등의 효과를 나타내며, 상기 진세노사이드 Rh2는 간암(Xiao-Xi Guo, Int. J. Mol. Sci., 2012, 13, 15523-15535), 췌장암(Xi-Ping Tang, World J Gastroenterol., 2013, 19(10), 1582-1592), 골파괴 억제(He L., Bone., 2012, 50(6), 1207-13.) 등의 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다.
그러나 상기 진세노사이드 CK 또는 Rh2는 수용성이 떨어지고, 암세포뿐만 아니라 정상 세포에도 독성을 가져 항암제로 사용되는데 한계가 있었다. 따라서 본 발명에서는 진세노사이드의 수용성을 증가시키고, 암세포 특이적 활성을 가지도록 나노 복합체를 제조하여 본 발명을 완성하였다. 진세노사이드 CK 또는 Rh2는 수용성이 낮고, 암세포 특이성이 없으며, 약물 전달체는 항암 활성이 없으나, 상기 두 화합물의 결합에 의해 이와 같은 단점을 모두 극복한 것이다. 또한, 상기 나노 복합체는 우수한 항암 활성뿐만 아니라, 진세노사이드 CK 또는 Rh2 단독으로부터 유추할 수 없는 우수한 항염 활성을 나타냄을 확인하여 본 발명을 완성하였다
본 발명의 용어 "나노 복합체"는 약물 전달체; 및 인삼추출물 또는 이로부터 분리된 진세노사이드를 화학적으로 연결한 형태를 의미한다.
본 발명에서, 상기 나노 복합체는 금속 나노입자, BSA(Bovine serum albumin) 또는 메조다공성 실리카 나노입자(Mesoporous silica nanoparticle)와 인삼 추출물 또는 이로부터 분리된 진세노사이드 CK 및 Rh2의 나노 복합체일 수 있으며, 예컨대 '금 나노 복합체', '은 나노 복합체','BSA-CK', 'BSA-CK 나노 복합체', 'MSNP-CK', 'MSNP-CK 나노 복합체'등으로 혼용되어 명명될 수 있다.
상기 나노 약물 전달체가 금속 나노입자인 경우, 천연 추출물인 인삼의 뿌리 또는 잎 추출물, 또는 홍삼 뿌리 추출물을 유효성분으로 이용하여, 종래보다 제조시간이 현저히 단축되고, 별도의 환원제 또는 안정제의 부가 없이도 크기가 균일한 나노 복합체를 제조할 수 있다. 특히, 잎 추출물을 이용할 경우, 균일하며 작은입자의 나노 복합체를 제조할 수 있으며, 우수한 안정성을 가진다. 또한, 상기 방법에 의해 제조된 나노 복합체를 포함하는 조성물은 항균 활성, 바이오필름 분해 활성, 항응고 활성, 항암 활성 및 항염증 활성을 가져 다양한 산업분야에서 활용될 수 있다.
본 발명에서 용어, "금속 나노입자"는 금속으로 이루어진, 크기가 최소한 1~100nm인 초미세 입자로, 작은 크기에 기인하는 특이하고도 다양한 성질을 보이는 입자를 의미한다. 특히, 본 발명의 인삼 뿌리 또는 잎 추출물이나 홍삼 뿌리 추출물을 이용하여 제조된 것은 생리활성 물질을 포함하고 있는"금속 나노 복합체"이다. 따라서, 다른 방법으로 제조된 금속 나노입자보다 매우 우수한 항균 활성, 바이오필름 분해 활성, 항응고 활성, 항암 활성 및 항염증 활성을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 상기 "금속"은 금(Au), 은(Ag), 구리(Cu), 팔라듐(Pd), 백금(Pt) 및 로듐(Rd)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 보다 구체적으로는, 금(Au) 또는 은(Ag)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 금 나노입자, 금 나노 복합체 및 AuNP(s)는 혼용되고, 은 나노입자, 은 나노 복합체, AgP(s)는 혼용된다.
본 발명의 일 실시예에서는, 인삼 뿌리 또는 잎 추출물이나 홍삼 뿌리 추출물과 상기 추출액을 테트라클로로금(III)산 또는 질산은 용액과 환원반응을 일으켜 나타나는 반응 혼합액의 색 변화를 육안으로 관찰하여 금 또는 은 나노 복합체의 합성을 확인하였다.
따라서 인삼 추출물을 유효성분으로 이용하여 나노 복합체를 제조하기 위한 것으로, 특히, 인삼의 잎 또는 뿌리 추출물이나 홍삼 뿌리 추출물을 이용하여 금 또는 은 나노 복합체를 제조할 수 있다.
이 경우, 상기 나노 복합체의 크기는 구체적으로 3 내지 80 nm, 더욱 구체적으로 5 내지 50 nm, 가장 구체적으로 10 내지 40nm일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 종래 금 나노 복합체의 경우 2 내지 40nm의 크기이고, 은 나노 복합체의 경우 100nm가 일반적인 크기라고 공지된 것과 비교할 때, 본 발명의 인삼 추출물을 이용하여 제조된 금 또는 은 나노 복합체의 크기는 종래 제조된 금속 나노입자에 비해 작으며, 그 분포가 균일하며, 특히, 본 발명의 은 나노 복합체의 경우는 종래의 크기보다 매우 작다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 인삼 추출물을 이용한 금속 나노 복합체가 10 내지 40 nm 범위의 균일한 크기의 나노 복합체가 형성된다는 것을 확인하였다. 구체적으로, 금 나노 복합체의 경우, 인삼 잎 추출물을 이용한 경우는 10 내지 30nm의 크기이고, 인삼의 뿌리 추출물을 이용한 경우에는 10 내지 40nm의 크기였으며, 홍삼의 뿌리 추출물을 이용한 경우에는 10 내지 30nm의 크기로 그 크기가 매우 균일하였다.
또한, 은 나노 복합체의 경우, 인삼의 잎 추출물을 이용한 경우에는 10 내지 20nm의 크기이고, 인삼의 뿌리 추출물을 이용한 경우에는 10 내지 30nm의 크기였으며, 홍삼의 뿌리 추출물을 이용한 경우에는 10 내지 30nm의 크기로 은 나노입자의 크기 또한, 매우 균일한 범위임을 확인하였다.
상기 나노 약물 전달체가 BSA(Bovine serum albumin)인 경우, "BSA(Bovine serum albumin)"는 소혈청알부민을 의미하며, 혈장 내에 약 60% 정도로 다량 함유되어 있는 단백질의 일종이다. 세포 배양 시 세포의 영양분으로서 첨가되어 사용되며, 단백질의 정량에서 검정곡선을 얻기 위한 표준물, 또는 다양한 생화학적 실험(Western blot, Immunocytochemistry, ELISA 등)에서 비특이적 결합을 방지하는데 사용된다.
이 경우, 나노 복합체 1 mg 당 0.05 내지 0.15 mg의 진세노사이드를 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, HPLC를 이용하여 BSA-CK 또는 BSA-Rh2 나노 복합체에 적재된 진세노사이드의 양을 계산한 결과, 1 mg의 BSA-CK에 적재된 CK의 양은 0.087 mg, 1 mg의 BSA-Rh2에 적재된 Rh2의 양은 0.096 mg임을 확인하였다.
또한, FE-TEM을 이용하여 BSA-CK 또는 BSA-Rh2 나노 복합체의 형태를 확인한 결과, 상기 나노 복합체 모두 구의 모양을 나타냄을 확인하였고; 동적광산란(dynamic light scattering; DLS)을 통해 BSA-CK 또는 BSA-Rh2 나노 복합체의 크기를 확인한 결과, 각각 157.2 nm, 175.8 nm의 평균 유체역학적 크기를 갖는 것을 확인하였고; BSA-CK 또는 BSA-Rh2 나노 복합체의 제타 전위값을 측정한 결과, 각각 -70.80 mV, -80.2 mV임을 확인하였다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, BSA-CK의 폐암세포 사멸능력이 CK 단독의 폐암세포 사멸능력보다 현저히 증가됨을 확인하였다.
상기 나노 약물 전달체가 메조다공성 실리카 나노입자(Mesoporous silica nanoparticle)인 경우, "메조다공성 실리카 나노입자(Mesoporous silica nanoparticle)"는 실리카의 메조다공성 형태를 나타내면서 1 내지 100 nm의 크기를 갖는 입자를 의미하며, 상기 용어 '메조다공성'(mesoporous)은 지름 2 내지 50 nm의 다수의 기공을 의미한다. 본 발명에서, 상기 메조다공성 실리카 나노입자는 'MSNP'로 혼용되어 명명될 수 있다.
이 경우, 상기 나노 복합체는 나노 복합체 1 mg 당 0.05 내지 0.15 mg의 진세노사이드를 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, HPLC를 이용하여 MSNP-CK 또는 MSNP-Rh2 나노 복합체에 적재된 진세노사이드의 양을 계산한 결과, 1 mg의 MSNP-CK에 적재된 CK의 양은 0.087 mg, 1 mg의 MSNP-Rh2에 적재된 Rh2의 양은 0.096 mg임을 확인하였다.
본 발명의 다른 구체적인 일 실시예에서는, MSNP-CK 또는 MSNP-Rh2 나노 복합체의 특성을 확인하기 위하여 1H NMR과 FTIR를 이용하여 분석한 결과, 상기 나노 복합체는 진세노사이드 고유의 특징적인 피크를 나타냄을 확인하였고, FE-TEM을 이용하여 MSNP-CK 또는 MSNP-Rh2 나노 복합체의 형태를 확인한 결과, 상기 나노 복합체 모두 구의 모양을 나타냄을 확인하였다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, MSNP-CK의 폐암세포 사멸능력이 CK 단독의 폐암세포 사멸능력보다 현저히 증가됨을 확인하였다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 나노 복합체를 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 또한, 상기 나노 복합체를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 용어 "나노 복합체"는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명의 용어, "암"은 생체 조직 안에서 세포가 무제한으로 증식하여 악성 종양을 일으키는 질환을 의미하며, 본 발명의 약학적 조성물에 의하여 증상이 완화, 경감, 개선 또는 치료될 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 구체적인 예로, 폐암일 수 있다.
상기 암은 폐암, 비소세포성 폐암, 결장암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부 암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 위암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS; central nervous system) 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종, 뇌하수체 선종 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어, "예방"은 본 발명의 BSA와 진세노사이드의 나노 복합체를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물의 투여에 의해 질병의 발병을 억제시키거나 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 본 발명에서, 상기 '질병'은 암 또는 염증성 질환일 수 있다.
본 발명의 용어, "치료"는 상기 약학적 조성물의 투여에 의해 질병의 의심 및 발병 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다. 본 발명에서, 상기 '질병'은 암 또는 염증성 질환일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 총 조성물의 중량 대비 BSA와 진세노사이드의 나노 복합체를 0.0001 내지 50 중량%로 포함할 수 있으며, 구체적으로 0.01 중량% 내지 10 중량%로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있고, 상기 담체는 비자연적 담체(non-naturally occuring carrier)를 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명에서, 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 은 및 금 나노 복합체가 인간 폐암 세포(A549)에 대해 각각 100㎍/mL 및 2㎍/mL 농도에서 세포독성을 나타냄을 확인하였다. 이를 통해 인삼의 잎 추출물에 의해 생합성된, 은 및 금 나노 복합체가 항암 활성을 가짐을 알 수 있었다.
다른 본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, BSA-CK 또는 BSA-Rh2 나노 복합체는 A549 폐암 세포주에 대하여 높은 세포독성을 나타냄을 확인하였고, 동일한 농도에서 정상 세포주인 각질세포주에는 세포독성을 나타내지 않음을 확인하였다. 이는, 본 발명의 BSA와 진세노사이드의 나노 복합체는 정상 세포에는 작용하지 않는 암세포 특이적인 세포독성을 나타내므로, 암의 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 시사하는 것이다.
또 다른 본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, MSNP-CK 또는 MSNP-Rh2 나노 복합체는 A549 폐암 세포주에 대하여 높은 세포독성을 나타냄을 확인하였고, 동일한 농도에서 정상 세포주인 각질세포주에는 세포독성을 나타내지 않음을 확인하였다(도 3). 이는, 본 발명의 MSNP와 진세노사이드의 나노 복합체는 정상 세포에는 작용하지 않는 암세포 특이적인 세포독성을 나타내므로, 암의 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 시사하는 것이다.
본 발명의 용어, "투여"는 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미한다.
본 발명의 용어, "개체"는 질병이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 가축 등의 모든 동물을 의미한다. 구체적인 예로, 인간을 포함한 포유동물일 수 있다. 본 발명에서, 상기 '질병'은 암 또는 염증성 질환일 수 있다.
본 발명의 암의 예방 또는 치료 방법은 구체적으로, 개체에 MSNP와 진세노사이드의 나노 복합체를 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 약학적으로 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 용어, '약학적으로 유효한 양'은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 성별, 연령, 체중, 건강상태, 질병의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로, 및 배출 비율, 치료 기간, 배합 또는 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 조성물은 고형분을 기준으로 1일 0.0001 내지 100 mg/체중 kg으로, 더욱 구체적으로 0.001 내지 100 mg/체중 kg으로 투여할 수 있다. 투여는 상기 권장 투여량을 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다.
본 발명의 암의 예방 또는 치료 방법에서, 상기 조성물을 투여하는 투여 경로 및 투여 방식은 특별히 제한되지 않으며, 목적하는 해당 부위에 상기 조성물을 포함하는 조성물이 도달할 수 있는 한 임의의 투여 경로 및 투여 방식에 따를 수 있다. 구체적으로, 상기 조성물은 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 그 투여 경로의 비제한적인 예로는, 구강, 직장, 국소, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 경피, 비측내 또는 흡입 등을 통하여 투여되는 것을 들 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 나노 복합체를 포함하는, 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 또한, 상기 나노 복합체를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 염증성 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 용어 "나노 복합체", "예방", "치료"는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명의 용어, "염증성 질환"은 염증에 의해 야기되는 질환을 의미한다. 상기 염증성 질환은, 본 발명의 약학 조성물에 의하여 증상이 완화, 경감, 개선 또는 치료될 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 구체적인 예로, 크론씨병, 홍반병, 아토피, 류마티스 관절염, 하시모토 갑상선염, 악성빈혈, 에디슨씨 병, 제1형 당뇨, 루프스, 만성피로증후군, 섬유근육통, 갑상선기능저하증과 항진증, 경피증, 베체트병, 염증성 장질환, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 메니에르 증후군(Meniere's syndrome), 길리안-바레 증후군(Guilian-Barre syndrome), 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 백반증, 자궁내막증, 건선, 백반증, 전신성 경피증 또는 궤양성 대장염일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 약학적 조성물은 총 조성물의 중량 대비 상기 나노 복합체의 나노 복합체를 0.0001 내지 50 중량%로 포함할 수 있으며, 구체적으로 0.01 중량% 내지 10 중량%로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있고, 상기 담체는 비자연적 담체(non-naturally occuring carrier)를 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 은 나노 복합체는 1000μM 농도까지 RAW264.7 세포에 대해 세포독성이 없으며, 농도의존적으로 NO 생산을 억제함을 확인하였다(도 26). 또한, 금 나노 복합체는 100μM 농도까지 RAW264.7 세포에 대해 세포독성이 없으며, 농도의존적으로 NO 생산을 억제함을 확인하였다. 이를 통해, 인삼의 잎 추출물에 의해 생합성된, 은 및 금 나노 복합체가 세포독성 없이 항염증 활성을 가짐을 확인하였다.
다른 본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, BSA-CK 또는 BSA-Rh2 나노 복합체는 RAW 264.7 대식세포주에 대해서는 심각한 세포독성을 야기하지 않으면서, 낮은 농도에서도 RAW 264.7 대식세포주의 NO 생산은 억제할 수 있음을 확인하였다. 이는, 본 발명의 BSA와 진세노사이드의 나노 복합체는 정상 대식세포에 대하여 직접적으로 독성을 나타내지 않으면서 NO 생산만을 선택적으로 억제하므로, 염증성 질환의 치료에 부작용 없이 유용하게 사용될 수 있음을 시사하는 것이다.
또 다른 본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, MSNP-CK 또는 MSNP-Rh2 나노 복합체는 RAW 264.7 대식세포주에 대해서는 심각한 세포독성을 야기하지 않으면서, 낮은 농도에서도 RAW 264.7 대식세포주의 NO 생산은 억제할 수 있음을 확인하였다. 이는, 본 발명의 MSNP와 진세노사이드의 나노 복합체는 정상 대식세포에 대하여 직접적으로 독성을 나타내지 않으면서 NO 생산만을 선택적으로 억제하므로, 염증성 질환의 치료에 부작용 없이 유용하게 사용될 수 있음을 시사하는 것이다.
본 발명의 염증성 질환의 예방 또는 치료 방법은 구체적으로, 개체에 상기 나노 복합체를 유효성분으로 포함하는, 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 약학적으로 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 조성물은 고형분을 기준으로 1일 0.0001 내지 100 mg/체중 kg으로, 더욱 구체적으로 0.001 내지 100 mg/체중 kg으로 투여할 수 있다. 투여는 상기 권장 투여량을 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다.
본 발명의 염증성 질환의 예방 또는 치료 방법에서, 상기 조성물을 투여하는 투여 경로 및 투여 방식은 특별히 제한되지 않으며, 목적하는 해당 부위에 상기 조성물을 포함하는 조성물이 도달할 수 있는 한 임의의 투여 경로 및 투여 방식에 따를 수 있다. 구체적으로, 상기 조성물은 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 그 투여 경로의 비제한적인 예로는, 구강, 직장, 국소, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 경피, 비측내 또는 흡입 등을 통하여 투여되는 것을 들 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 나노 복합체를 유효성분으로 포함하는 암의 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어, "개선"은 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 용어, "식품"은 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료, 비타민 복합제, 건강기능식품 및 건강식품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다.
상기 건강기능(성)식품(functional food)이란, 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)와 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미한다. 여기서 "기능(성)"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 식품은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당 업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 상기 식품의 제형 또한 식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 본 발명의 식품용 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나, 본 발명의 식품은 질병의 예방 또는 개선의 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.
상기 건강식품(health food)은 일반식품에 비해 적극적인 건강유지나 증진 효과를 가지는 식품을 의미하고, 건강보조식품(health supplement food)는 건강보조 목적의 식품을 의미한다. 경우에 따라, 건강 기능 식품, 건강식품, 건강보조식품의 용어는 호용된다.
구체적으로, 상기 건강기능식품은 상기 나노 복합체를 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용이 없는 장점이 있다.
본 발명의 식품 조성물은 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 높은 암의 예방 또는 개선 효과를 기대할 수 있어 매우 유용하다.
상기 조성물은 생리학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있는데, 담체의 종류는 특별히 제한되지 않으며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다.
또한, 상기 조성물은 식품 조성물에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예들 들어, 비타민 A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, 니아신(niacin), 비오틴(biotin), 폴레이트(folate), 판토텐산(panthotenic acid) 등을 포함할 수 있다. 또한, 아연(Zn), 철(Fe), 칼슘(Ca), 크롬(Cr), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 구리(Cu), 크륨(Cr) 등의 미네랄을 포함할 수 있다. 또한, 라이신, 트립토판, 시스테인, 발린 등의 아미노산을 포함할 수 있다.
또한, 상기 조성물은 방부제(소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 데히드로초산나트륨 등), 살균제(표백분과 고도 표백분, 차아염소산나트륨 등), 산화방지제(부틸히드록시아니졸(BHA), 부틸히드록시톨류엔(BHT) 등), 착색제(타르색소 등), 발색제(아질산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제(아황산나트륨), 조미료(MSG 글루타민산나트륨 등), 감미료(둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료(바닐린, 락톤류 등), 팽창제(명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제(호료), 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물(food additives)을 포함할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용될 수 있다.
상기 BSA와 진세노사이드의 나노 복합체는 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 식품 조성물은 식품 또는 음료에 대하여 50 중량부 이하, 구체적으로 20 중량부 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 장기간 섭취할 경우에는 상기 범위 이하의 함량을 포함할 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물의 일 예로 건강음료 조성물으로 사용될 수 있으며, 이 경우 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드; 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드; 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드; 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 감미제는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제; 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 mL 당 일반적으로 약 0.01 ∼ 0.04 g, 구체적으로 약 0.02 ∼ 0.03 g이 될 수 있다.
상기 외에 건강음료 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산, 펙트산의 염, 알긴산, 알긴산의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 또는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일주스, 과일주스 음료, 또는 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부당 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명의 식품 조성물은 암의 예방 또는 개선 효과를 나타낼 수 있다면 다양한 중량%로 포함할 수 있으나, 구체적으로 상기 나노 복합체를 식품 조성물의 총 중량 대비 0.00001 내지 100 중량% 또는 0.01 내지 80 중량%로 포함할 수 있다.
또 다른 하나의 양태는 상기 나노 복합체를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 식품 조성물은 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 높은 염증성 질환의 예방 또는 개선 효과를 기대할 수 있어 매우 유용하다.
상기 조성물은 생리학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있는데, 담체의 종류는 특별히 제한되지 않으며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다.
상기 나노 복합체는 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 식품 조성물은 식품 또는 음료에 대하여 50 중량부 이하, 구체적으로 20 중량부 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 장기간 섭취할 경우에는 상기 범위 이하의 함량을 포함할 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 염증성 질환의 예방 또는 개선 효과를 나타낼 수 있다면 다양한 중량%로 포함할 수 있으나, 구체적으로 상기 나노 복합체를 식품 조성물의 총 중량 대비 0.00001 내지 100 중량% 또는 0.01 내지 80 중량%로 포함할 수 있다.
또 다른 하나의 양태는 상기 나노 복합체를 유효성분으로 포함하는 암 또는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공한다.
본 발명에서, 상기 진세노사이드는 진세노사이드 화합물 K(Compound K) 또는 진세노사이드 Rh2일 수 있다.
본 발명의 용어, "의약외품"은 사람이나 동물의 질병을 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 섬유, 고무제품 또는 이와 유사한 것, 인체에 대한 작용이 약하거나 인체에 직접 작용하지 아니하며, 기구 또는 기계가 아닌 것과 이와 유사한 것, 감염 예방을 위하여 살균, 살충 및 이와 유사한 용도로 사용되는 제제 중 하나에 해당하는 물품으로서, 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것 및 사람이나 동물의 구조와 기능에 약리학적 영향을 줄 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것을 제외한 물품을 의미하며, 구체적으로 피부 외용제일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 나노 복합체를 염증성 질환의 예방 또는 개선을 목적으로 의약외품 조성물에 첨가할 경우, 상기 BSA와 진세노사이드의 나노 복합체를 그대로 첨가하거나 다른 의약외품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 사용 목적에 따라 적합하게 결정할 수 있다.
상기 피부 외용제는 특별히 이에 제한되지 않으나, 예를 들어 연고제, 로션제, 스프레이제, 패취제, 크림제, 산제, 현탁제, 겔제 또는 젤의 형태로 제조되어 사용될 수 있다.
본 발명의 의약외품 조성물은 염증성 질환의 예방 또는 개선 효과를 나타낼 수 있다면 다양한 중량%로 포함할 수 있으나, 구체적으로 상기 나노 복합체를 의약외품 조성물의 총중량 대비 0.01 내지 100 중량%, 더욱 구체적으로 1 내지 80 중량%로 포함할 수 있다.
또 다른 하나의 양태는 상기 나노 복합체를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 화장료 조성물은 총 조성물의 중량 대비 상기 나노 복합체를 0.0001 내지 50 중량%로 포함할 수 있으며, 구체적으로 0.01 중량% 내지 10 중량%로 포함할 수 있다. 상기 범위 내에서 우수한 염증성 질환의 예방 또는 개선 효과를 나타내는 이점이 있으며, 조성물의 제형이 안정화되는 이점이 있다.
상기 화장료 조성물은 용액, 외용 연고, 크림, 폼, 영양 화장수, 유연 화장수, 팩, 유연수, 유액, 메이크업 베이스, 에센스, 비누, 액체 세정료, 입욕제, 선 스크린 크림, 선 오일, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 파우더, 비누, 계면 활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 패취 및 스프레이로 이루어진 군으로부터 선택되는 제형으로 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 화장료 조성물은 일반 피부 화장료에 배합되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 추가로 포함할 수 있으며, 통상의 성분으로 예를 들면 유분, 물, 계면 활성제, 보습제, 저급 알코올, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 화장료 조성물에 포함되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체는 화장료 조성물의 제형에 따라 다양하다.
본 발명의 제형이 연고, 페이스트, 크림 또는 젤인 경우에는, 담체 성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화 아연 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실케이트, 폴리아미드 파우더 등이 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로하드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진제를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제 등이 이용될 수 있으며, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일 등이 이용될 수 있고, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브 오일, 피마자 오일 및 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타하이드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 제형이 비누인 경우에는, 담체 성분으로서 지방산의 알칼리 금속 염, 지방산 헤미에스테르 염, 지방산 단백질 히드롤리제이트, 이세티오네이트, 라놀린 유도체, 지방족 알코올, 식물성 유, 글리세롤, 당 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는, 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시테이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 오일, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 나노 복합체를 포함하는 항균용 조성물을 제공한다.
본 발명의 나노 복합체는 인삼 뿌리 또는 잎 추출물이나 홍삼 뿌리 추출물을 이용하여 제조되어, 각 추출물의 생리활성 물질을 포함하고 있는 바, 다른 방법으로 제조된 금속 나노입자보다 매우 우수한 항균 활성을 가진다.
본 발명의 항균용 조성물은 세균, 진균 또는 효모에 대해 항균활성을 가질 수 있으며, 구체적으로, 비브리오(Vibrio) 속 미생물, 살모넬라(Salmonella) 속 미생물, 스테피로코커스(Staphylococcus) 속 미생물, 에스케리치아(Escherichia) 속 미생물, 바실러스(Bacillus) 속 미생물, 및 칸디다(Candida)속 미생물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상에 대해 항균 활성을 가질 수 있으며, 더욱 구체적으로는, 비브리오 파라헤몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica), 스테피로코커스 오우러스(Staphylococcus aureus), 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 및 칸디다 알비칸스(Candida albicans)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상에 대해 항균 활성을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 본 발명의 은 나노 복합체 또는 상기 은 나노 복합체를 포함하는 조성물은 병원성 미생물에 대한 항균활성이 일반적인 은 나노 복합체보다 매우 우수한 바, 화장품, 의약외품, 의약품, 식품 등의 다양한 분야에서 널리 사용될 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 인삼 잎 추출물을 이용하는 금 나노 복합체는 비브리오 파라헤몰리티쿠스, 살모넬라 엔테리카, 에스케리치아 콜라이, 스테피로코커스 오우러스에 대해 항균활성을 가짐을 확인할 수 있었고, 인삼 뿌리 추출물을 이용하는 은 나노 복합체는 에스케리치아 콜라이, 바실러스 세레우스, 스테피로코커스 오우러스, 비브리오 파라헤몰리티쿠스 및 바실러스 안트라시스에 대하여 항균활성을 보여주었다. 또한, 홍삼 뿌리 추출물을 이용하는 은 나노 복합체는 비브리오 파라헤몰리티쿠스, 스테피로코커스 오우러스, 바실러스 세레우스 및 칸디다 알비칸스에 대한 항균 활성을 가짐이 확인되었는데, 칸디다 알비칸스에 대해 가장 크고, 그 다음으로 비브리오 파라헤몰리티쿠스, 스테피로코커스 오우러스, 바실러스 세레우스의 순서로 항균활성을 가지고 있음을 확인할 수 있었다. 상기 결과를 통해 본 발명의 은 나노 복합체가 미생물에 대하여 항균활성을 가짐을 확인할 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 금속 나노 복합체를 포함하는 바이오필름 분해용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 나노 복합체는 인삼 뿌리 또는 잎 추출물이나 홍삼 뿌리 추출물을 이용하여 제조되어, 각 추출물의 생리활성 물질을 포함하고 있는 바, 다른 방법으로 제조된 금속 나노입자보다 매우 우수한 바이오필름 분해 활성을 가진다.
본 발명에서 용어, "바이오필름"은 세균의 집합체로서 세균이 얇게 필름처럼 들러붙어 있는 것을 의미한다. 즉, 바이오필름은 세균으로 인해 생성되며 다시 그것은 세균에게 서식처를 제공하여 세균 증식을 가속화하는 원인이 된다.
본 발명의 바이오필름 분해 조성물은 바이오필름 분해 활성을 가져 바이오필름-관련 감염을 저해함으로써, 비용적인 측면이나 환자의 고통을 경감시키는 역할을 하는바, 구체적으로, 플라스틱, 금속 등의 표면을 부식 등으로부터 보호하기 위한 산업이나, 치과기기 산업, 배관 산업 등의 다양한 분야에서 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 스테피로코커스 오우러스(Staphylococcus aureus) 및 슈도모나스에루지노사(Pseudomonas aeruginosa)에 대한 비색법(colorimetric method)으로 본 발명의 바이오필름 분해 활성을 확인한 결과, 인삼 잎 추출물을 이용하여 제조된 은 나노 복합체는, 4 ?g/ml 농도의 은 나노 복합체에서 스테피로코커스 오우러스와 슈도모나스에루지노사에 대한 바이오필름 분해 활성이 최고조였으며, 홍삼 뿌리 추출물을 이용하여 제조된 은 나노 복합체에서도 상기와 같은 농도에서 스테피로코커스 오우러스와 슈도모나스에루지노사에 대한 바이오 분해 활성이 있음을 확인하였다.
이를 통해, 인삼 추출물을 이용하여 제조된 나노 복합체가 균주에 대한 바이오필름 분해 활성을 가져 바이오필름-관련 감염을 저해함으로써 비용적인 측면이나 환자의 고통을 경감시키는 역할을 할 수 있다는 것을 확인할 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 나노 복합체를 포함하는 항응고용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 금속 나노 복합체는 인삼 뿌리 또는 잎 추출물이나 홍삼 뿌리 추출물을 이용하여 제조되어, 각 추출물의 생리활성 물질을 포함하고 있는 바, 다른 방법으로 제조된 금속 나노입자보다 매우 우수한 항응고 활성을 가진다.
본 발명에서 용어, "항응고"는 신체의 정상적인 혈액응고 성질을 저해하는 것을 의미하며, 항응혈이라고도 쓰인다. 구체적으로는, 혈액에 첨가함으로써 응고를 저지하는 항응혈제, 혈액에 존재하는 활성형 혈액응고인자에 대한 혈액의 생리적 항응혈소로 여러 혈액응고인자의 작용을 저지하는 항트롬빈III나 헤파린 등이 있고, 경구 투여에 의해 응혈인자의 활성을 저해하는 항응혈약제, 및 병적 상태에서 후천적으로 출현하여 가역적, 비가역적으로 혈액응고인자의 활성을 억제하는 항응혈물질로 나뉜다.
본 발명의 항응고용 조성물은 인삼 추출물, 구체적으로는 인삼의 잎 또는 뿌리 추출물이나 홍삼 뿌리 추출물을 이용하여 제조된 나노 복합체를 포함함으로써, 혈액의 응고를 저지하는바, 구체적으로는, 의학 분야나 생명공학 분야에서 사용될 수 있으며, 보다 구체적으로는, 혈액과 직접적으로 접촉하는 약 및 유전자의 전달자나 또는 바이오센서, 생체 내 나노캐리어로서 변형하여 사용될 수 있으나, 이에 제한된 것은 아니다. 또한, in vitro 상에서 실험을 위한 목적으로도 사용될 수 있다.
본 발명에서 상기 항응고용 조성물을 약학, 의약외품, 화장품, 식품 및 사료 조성물로 사용될 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 나이 25 내지 45세 범위의 건강한 남성 및 여성 자원자의 혈액을 채취하여 2 개의 진공 채혈기에 넣고 각각 A 및 B로 표시한 후 합성된 금 나노 복합체의 항응고 효과를 관찰하였다. 그 결과, 인삼 잎 추출물을 이용하여 제조된 금 나노 복합체는, 금 나노 복합체가 존재할 시 응혈 형성이 저해되었으며, 금 나노 복합체가 포함되지 않은 대조군은 혈액이 완전히 응고됨을 확인하였다. 이와 같은 결과를 통하여, 인삼의 잎 추출물에 의해 생합성된 금 나노 복합체가 항응고 활성을 가짐을 확인할 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 나노 약물전달체; 및 인삼추출물 또는 이로부터 분리된 진세노사이드를 혼합하여 반응시키는 단계를 포함하는, 나노 복합체의 제조방법을 제공한다.
상기 나노 복합체의 제조방법에 있어서 약물 전달체가 금속 나노입자인 경우, 천연 추출물인 인삼 추출물을 이용하여 금속 나노 복합체를 제조하는바, 화학적 합성방법 및 물리적 합성방법에 비해 친환경적이고 제조시간을 현저히 단축시키며, 동시에 별도의 환원제 또는 안정제 없이 안정화를 유지할 수 있는 금속 나노 복합체를 제조할 수 있어, 다양한 산업 분야에서 매우 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 제조방법은 사용하는 금속 전구체에 따라 다양한 금속 나노입자를 제조할 수 있으며, 구체적으로, 금(Au), 은(Ag), 구리(Cu), 팔라듐(Pd), 백금(Pt) 및 로듐(Rd)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정된 것은 아니다. 보다 구체적으로는, 금(Au) 또는 은(Ag)을 선택할 수 있다.
본 발명에서 용어, "금속 전구체"는 금속 나노입자를 제조하기 위하여 첨가하는 화합물을 의미한다. 구체적으로, 금속 전구체로는 제조하고자 하는 나노입자의 금속 종류에 따라 다양한 종류의 화합물을 선택하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 금 나노입자의 제조에는 테트라클로로금(III)산 (HAuCl4), NaAuCl3, 및 AuCl3로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 사용할 수 있으며, 보다 구체적으로는, 테트라클로로금(III)산 (HAuCl4)을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 은 나노입자의 제조에는 AgBF4, AgCF3SO3, AgClO4, AgNO3, AgPF6 및 Ag(CF3COO)로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 사용할 수 있으며, 보다 구체적으로는, 질산은(AgNO3)을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 구리 나노입자의 제조에는 CuCl2, CuF2, CuBr2, CuI2, (CH3COO)2Cu, Cu(ClO4)2, Cu(NO3)2 및 CuSO4로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 제조방법에서, 반응에 사용되는 금속 전구체의 농도는 금속 나노입자 제조에 영향을 미칠 수 있다. 본 발명의 금속 전구체의 농도는 금속 나노입자 제조용 조성물로 금속 나노입자를 제조할 수 있는 한 제한되지 않으나, 구체적으로 금속 전구체의 농도는 0.01 내지 100 mM, 더욱 구체적으로는 0.01 내지 50mM, 가장 구체적으로는, 0.01 내지 10mM일 수 있다.
본 발명의 제조방법에서, 반응 온도는 금속 나노입자 제조에 영향을 미칠 수 있다. 본 발명의 반응 온도는 금속 나노입자 제조용 조성물로 금속 나노입자를 제조할 수 있는 한 제한되지 않으나, 구체적으로 반응 온도는 10 내지 100℃, 더욱 구체적으로 50 내지 100℃일 수 있다.
본 발명의 제조방법에서, 반응 시간은 금속 나노입자 제조에 영향을 미칠 수 있다. 본 발명의 반응 시간은 금속 나노입자 제조용 조성물로 금속 나노입자를 제조할 수 있는 한 제한되지 않으나, 구체적으로 금속이 금인 경우 반응 시간은 1분 내지 1시간, 더욱 구체적으로 1분 내지 50분일 수 있으며, 금속이 은인 경우, 반응 시간은 30분 내지 5시간, 더욱 구체적으로는 30분 내지 2시간일 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 인삼(panax ginseng)의 잎 추출물을 이용하여 금 또는 은 나노입자를 제조하는 경우, 테트라클로로금(III)산을 넣은 반응 혼합액은 3분 내에 어두운 자주색으로 변하였고(도 1의 a), 질산은을 넣은 반응 혼합액은 45분 내에 완전히 갈색으로 변하였다(도 1의 b). 또한, 인삼(panax ginseng)의 뿌리 추출물을 이용하는 경우는, 질산은을 넣은 반응 혼합액은 하얀색에서 갈색으로 변하는데 2시간이 소요되었고(도 1의 d), 테트라클로로금(III)산을 넣은 반응 혼합액은 5분이 소요되었다(도 1의 e). 또한, 홍삼 뿌리 추출액을 이용하여 제조한 경우에는, 반응 혼합액이 각각 은 나노입자의 제조시에는 1시간, 금 나노입자의 제조시에는 10분 이내에 각각 갈색과 루비색(ruby red)으로 변하는 것을 확인하였다(도 1의 f 및 g).
상기의 결과를 통해, 인삼의 잎 또는 뿌리, 홍상 뿌리 추출물을 이용하여 제조되는 금 또는 은 나노입자가 다른 천연 추출물이나 인삼의 다른 부위 추출물을 이용하여 제조되는 나노입자에 비해 매우 짧은 시간 안에 합성되는 것을 확인할 수 있었으며, 특히, 인삼의 잎 추출물을 이용할 경우, 현저히 빠른 시간 내에 경제적이고 친환경적인 방법으로 안정적인 금속 나노입자가 합성된다는 것을 알 수 있다.
상기 약물 전달체가 금속 나노입자인 경우, 본 발명의 제조방법은 반응액을 원심분리하여 금속 나노입자를 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 인삼 추출물을 함유하는 금속 나노입자 제조용 조성물을 1mM의 테트라클로로금(III)산과 질산은 용액에 각각 첨가한 후, 80℃로 유지하고, 16,000rpm에서 20분간 원심분리하여 금속 나노입자를 제조하였다(실시예 3).
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 제조방법에 의해 제조된 금속 나노입자를 제공하는 것이다.
본 발명의 금속 나노입자는 인삼 뿌리 또는 잎 추출물이나 홍삼 뿌리 추출물을 이용하여 제조되어, 각 추출물의 생리활성 물질을 포함하고 있는 바, 다른 방법으로 제조된 금속 나노입자보다 매우 우수한 항균 활성, 바이오필름 분해 활성, 항응고 활성, 항암 활성 및 항염증 활성을 가져 다양한 산업에 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명의 금속 나노입자는 의료용, 생물학적 분석용, 연료용, 전자부품 재료의 용도로 사용될 수 있으며, 구체적으로, 금 나노입자는 고유의 빛 전도 특성으로 인해 유기태양전지, 센서프로브, 생물의학용 드러그 딜리버리, 전도재료 및 촉매제로 이용될 수 있고, 은 나노입자는 광학특성, 전도성 및 항균성으로 인해, 항균제, 정량검출을 위한 바이오센서, 광학분석법 등에 이용될 수 있다. 또한, 본 발명의 금속 나노입자는 크기나 형태, 표면의 화학적 특성 또는 응집상태를 변화시킴으로써, 입자의 광학적, 전자적 특정을 조절할 수 있다.
본 발명의 제조방법에 의해 제조된 금속 나노입자의 모양은, 일반적으로 구형의 모양을 띨 수 있으나, 이에 한정된 것은 아니다.
또한, 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 금속 나노입자의 크기는 구체적으로 3 내지 80 nm, 더욱 구체적으로 5 내지 50 nm, 가장 구체적으로 10 내지 40nm일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 종래 금 나노입자의 경우 2 내지 40nm의 크기이고, 은 나노입자의 경우 100nm가 일반적인 크기라고 공지된 것과 비교할 때, 본 발명의 인삼 추출물을 이용하여 제조된 금 또는 은 나노입자의 크기는 종래 제조된 금속 나노입자에 비해 작으며, 그 분포가 균일하며, 특히, 본 발명의 은 나노입자의 경우는 종래의 크기보다 매우 작다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 인삼 추출물을 이용하여 제조한 금속 나노입자가 10 내지 40 nm 범위의 균일한 크기의 나노입자를 제조한다는 것을 확인하였다(실시예 3). 구체적으로, 금 나노입자의 경우, 인삼) 잎 추출물을 이용한 경우는 10 내지 30nm의 크기이고, 인삼의 뿌리 추출물을 이용한 경우에는 10 내지 40nm의 크기였으며, 홍삼의 뿌리 추출물을 이용한 경우에는 10 내지 30nm의 크기로 그 크기가 매우 균일하였다.
또한, 은 나노입자의 경우, 인삼의 잎 추출물을 이용한 경우에는 10 내지 20nm의 크기이고, 인삼의 뿌리 추출물을 이용한 경우에는 10 내지 30nm의 크기였으며, 홍삼의 뿌리 추출물을 이용한 경우에는 10 내지 30nm의 크기로 은 나노입자의 크기 또한, 매우 균일한 범위임을 확인하였다.
상기 나노 복합체의 제조방법에 있어서 약물 전달체가 BSA(Bovine serum albumin)인 경우, 구체적으로 (a) BSA(Bovine serum albumin)를 물에 용해하여 혼합액을 제조하는 단계; (b) 상기 혼합액에 진세노사이드를 첨가하여 반응 혼합액을 제조하는 단계; 및 (c) 상기 반응 혼합액을 투석하는 단계를 포함하여 나노 복합체를 제조할 수 있다.
상기 (a) 단계는 BSA가 진세노사이드와 반응할 수 있도록 BSA 수용액을 제조하는 단계로서, BSA의 반응성을 향상시키기 위한 과정일 수 있다. 또한, 상기 BSA 수용액에 추가의 처리를 가할 수 있으며, 구체적인 예로 초음파 처리할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 (b) 단계는 BSA를 진세노사이드와 결합시키는 단계로서, 상기 (a) 단계에서 제조한 BSA 수용액에 진세노사이드를 첨가함으로써 수행될 수 있다. 구체적으로, 상기 진세노사이드는 용매에 용해된 상태일 수 있으며, 상기 용매의 종류는 구체적으로 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올이나, 에틸아세테이트 또는 아세톤 등의 극성용매, 헥산 또는 디크로로메탄의 비극성용매일 수 있고, 더욱 구체적으로 에탄올일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 진세노사이드는 BSA 수용액에 드롭 방식(drop wise)으로 첨가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 (c) 단계는 제조된 BSA와 진세노사이드의 나노 복합체를 정제하는 단계로서, 반응하지 않고 남은 물질 또는 불순 물질을 제거하는 과정이다. 투석막을 이용하여 수행하거나, 또는 용매에 의하여 수행할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, BSA 수용액을 초음파 처리한 이후, 에탄올에 용해된 진세노사이드 CK 또는 Rh2를 드롭 방식(drop wise)으로 첨가하였고, 상기 반응 혼합액을 투석막에 옮긴 후, 메탄올/증류수 및 증류수를 이용한 추가의 투석 과정을 거쳐 BSA와 진세노사이드의 나노 복합체를 제조하였다.
상기 나노 복합체의 제조방법에 있어서 약물 전달체가 메조다공성 실리카 나노입자인 경우, 구체적으로 (a) 메조다공성 실리카 나노입자를 자유 아민기(amine group)로 기능화하는 단계; 및(b) 상기 기능화된 메조다공성 실리카 나노입자에 진세노사이드를 결합시키는 단계를 포함하여 나노 복합체를 제조할 수 있다.
상기 (a) 단계는 MSNP가 진세노사이드와 효율적으로 결합하도록 하기 위해 MSNP에 변형을 가하는 단계로서, MSNP의 표면에 아민기를 결합시키는 과정일 수 있다. 특히, 상기 아민화는 수산화암모늄(NH4OH)을 이용하여 유도된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 (b) 단계는 MSNP를 진세노사이드와 결합시키는 단계로서, MSNP의 아민기가 진세노사이드와 반응하여 공유결합을 형성하는 단계이다. 상기 진세노사이드는 용매에 용해된 상태일 수 있으며, 상기 용매의 종류는 구체적으로 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올이나, 에틸아세테이트 또는 아세톤 등의 극성용매, 헥산 또는 디크로로메탄의 비극성용매일 수 있고, 더욱 구체적으로 에탄올일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, MSNP을 NH4OH를 이용하여 자유 아민기로 기능화하였고, 상기 MSNP에 진세노사이드를 첨가하여 교반함으로써 MSNP와 진세노사이드의 나노 복합체를 제조하였다.
본 발명의 나노 복합체는 종래 금속 나노입자보다 제조시간이 현저히 단축되고, 별도의 환원제 또는 안정제의 부가 없이도 크기가 균일한 금속 나노 복합제를 제조할 수 있다. 또한, 물에대한 용해도가 높고, 암세포에 대한 타겟 능력이 높아 약물로 개발되기에 유리하다. 또한, 높은 항암, 항염 활성 등을 나타내므로 암 및 염증 질환의 예방, 치료에 유용하게 활용될 수 있으며, 나아가 항균활성, 바이오필름 분해 활성, 항응고 활성을 가져 다양한 사업분야에서 활용될 수 있다.
도 1은 인삼 잎 추출물(a 내지 c), 인삼 뿌리 추출물(d 및 e) 또는 홍삼(f 및 g) 추출물과 테트라클로로금(III)산(HAuCl4·3H2O)또는 질산은 용액을 반응시킨 후의 색 변화를 나타낸 도이다(control :대조군, AgNPs:은 나노 복합체, AuNPs:금 나노 복합체).
도 2는 UV-vis를 통한 인삼 잎 추출물을 이용하여 제조된 금 또는 은 나노 복합체의 생성여부를 확인한 도면이다.
도 3은 UV-vis를 통한 인삼 뿌리 추출물을 이용하여 제조된 금 또는 은 나노 복합체의 생성여부를 확인한 도면이다.
도 4는 UV-vis를 통한 홍삼 뿌리 추출물을 이용하여 제조된 금 또는 은 나노 복합체의 생성여부를 확인한 도면이다.
도 5는 FE-TEM을 통한 인삼 잎 추출물을 이용하여 제조된 금 또는 은 나노 복합체의 구조적 특징을 나타낸 도면이다.
도 6은 FE-TEM을 통한 인삼 뿌리 추출물을 이용하여 제조된 금 또는 은 나노 복합체의 구조적 특징을 나타낸 도면이다.
도 7은 FE-TEM을 통한 인삼 뿌리 추출물을 이용하여 제조된 금 또는 은 나노 복합체의 구조적 특징의 단순분산형, 나노 복합체 간섭무늬 간격(fringe spacing)을 나타낸 것이다.
도 8은 FE-TEM을 통한 홍삼 뿌리 추출물을 이용하여 제조된 금 또는 은 나노 복합체의 구조적 특징을 나타낸 도면이다.
도 9는 EDAX 분석을 통해, 인삼 잎 추출물을 이용하여 제조된 금 또는 은 나노 복합체의 순도를 나타낸 것이다.
도 10은 EDAX 분석을 통해, 인삼 뿌리 추출물을 이용하여 제조된 금 또는 은 나노 복합체의 순도를 나타낸 것이다.
도 11은 EDAX 분석을 통해, 홍삼 잎 추출물을 이용하여 제조된 금 또는 은 나노 복합체의 순도를 나타낸 것이다.
도 12는 TEM을 통해, 인삼 잎 추출물을 이용하여 제조된 금 또는 은 나노 복합체의 원소 매핑 결과를 분석한 것이다.
도 13은 TEM을 통해, 인삼 뿌리 추출물을 이용하여 제조된 금 또는 은 나노 복합체의 원소 매핑 결과를 분석한 것이다.
도 14는 TEM을 통해, 홍삼 뿌리 추출물을 이용하여 제조된 금 또는 은 나노 복합체의 원소 매핑 결과를 분석한 것이다.
도 15는 X선 회절을 통해, 인삼 잎 추출물을 이용하여 제조된 금 또는 은 나노 복합체의 회절패턴을 나타낸 것이다.
도 16은 X선 회절을 통해, 인삼 뿌리 추출물을 이용하여 제조된 금 또는 은 나노 복합체의 회절패턴을 나타낸 것이다.
도 17은 동적광산란법 분석을 통해, 인삼 잎 추출물을 이용하여 제조된 금 또는 은 나노 복합체의 용량(volume), 강도(intensity) 및 수(number)를 바탕으로 크기분포 프로파일 결과를 나타낸 도면이다.
도 18은 동적광산란법 분석을 통해, 홍삼 뿌리 추출물을 이용하여 제조된 금 또는 은 나노 복합체의 용량(volume), 강도(intensity) 및 수(number)를 바탕으로 크기분포 프로파일 결과를 나타낸 도면이다.
도 19는 인삼의 잎 추출물을 이용하여 제조된 금 또는 은 나노 복합체의 항균활성을 나타낸 것이다.
도 20은 인삼의 뿌리 추출물을 이용하여 제조된 은 나노 복합체의 항균활성을 나타낸 것이다.
도 21은 홍삼의 뿌리 추출물을 이용하여 제조된 은 나노 복합체의 항균활성을 나타낸 것이다.
도 22은 인삼의 잎 추출물을 이용하여 제조된 은 나노 복합체의 바이오필름 분해 활성을 나타낸 것이다.
도 23은 홍삼의 뿌리 추출물을 이용하여 제조된 은 나노 복합체의 바이오필름 분해 활성을 나타낸 것이다.
도 24는 인삼의 잎 추출물을 이용하여 제조된 금 또는 은 나노 복합체의 항응고활성을 나타낸 것이다.
도 25는 인삼의 잎 추출물을 이용하여 제조된 금 또는 은 나노 복합체의 모모세포(Keratinocyte cell) 및 폐암 세포(A549 cell)에 대한 세포 독성을 나타낸 것이다.
도 26은 인삼의 잎 추출물을 이용하여 제조된 금 또는 은 나노 복합체의 항염 활성을 나타낸 것이다.
도 27은 BSA-CK 및 BSA-Rh2의 제조 결과에 관한 것으로, A 내지 C는 BSA-CK, 및 D 내지 F는 BSA-Rh2에 관한 것이다. 구체적으로, A 및 D는 상기 두 나노 복합체의 HPLC 분석 결과, B 및 E는 1H NMR 스펙트럼, C 및 F는 FTIR 스펙트럼을 보여준다.
도 28은 BSA-CK 및 BSA-Rh2의 물리화학적 특성에 관한 것으로, A 내지 C는 BSA-CK, 및 D 내지 F는 BSA-Rh2에 관한 것이다. 구체적으로, A 및 D는 FE-TEM 이미지, B 및 E는 입자 크기 분포 분석 결과, C 및 F는 제타 전위(zeta potential) 분석 결과를 보여준다.
도 29는 BSA-CK 및 BSA-Rh2의 물에 대한 용해도에 관한 것으로, 각각 현미경 이미지 및 상층액의 HPLC 분석 결과를 보여준다. A는 CK 단독 또는 BSA-CK, B는 Rh2 단독 또는 BSA-Rh2의 용해도에 대한 결과를 나타낸다.
도 30은 BSA-CK 및 BSA-Rh2의 A549 폐암 세포 또는 각질세포(keratinocyte)에 대한 세포 독성을 보여주는 그래프이다. A 및 B는 BSA-CK, C 및 D는 BSA-Rh2의 결과를 나타낸다. 통계적 유의성은 student's t-test를 이용하여 확인하였다. P < 0.05인 경우에 유의하다고 판단하였으며, 별표(*)로 표시하였다.
도 31은 BSA-CK 및 BSA-Rh2의 항염 활성에 관한 것으로, 쥐 대식세포주 RAW 264.7에 대한 세포 독성 및 LPS-유도 NO 생산 저해 효과를 보여준다. NO 생산 저해 효과 분석에 있어서, 질산 합성효소의 저해제인 L-NMMA(NG-monomethyl L-arginine)이 양성 대조군으로 사용되었다. A 및 B는 BSA-CK, C 및 D는 BSA-Rh2의 결과를 나타낸다. 통계적 유의성은 student's t-test를 이용하여 확인하였다. P < 0.05인 경우에 유의하다고 판단하였으며, 별표(*)로 표시하였다.
도 32는 MSNP-CK 및 MSNP-Rh2의 합성 결과에 관한 것으로, A 내지 C는 MSNP-CK, 및 D 내지 F는 MSNP-Rh2에 관한 것이다. 구체적으로, A 및 D는 상기 두 나노 복합체의 HPLC 분석 결과, B 및 E는 1H NMR 스펙트럼, C 및 F는 FTIR 스펙트럼을 보여준다.
도 33은 MSNP-CK 및 MSNP-Rh2의 FE-TEM 이미지이며, A는 MSNP-CK, B는 MSNP-Rh2에 관한 것이다.
도 34는 MSNP-CK 및 MSNP-Rh2의 A549 폐암 세포 또는 각질세포(keratinocyte)에 대한 세포 독성을 보여주는 그래프이다. A 및 B는 MSNP-CK, C 및 D는 MSNP-Rh2의 결과를 나타낸다. 통계적 유의성은 student's t-test를 이용하여 확인하였다. P < 0.05인 경우에 유의하다고 판단하였으며, 별표(*)로 표시하였다.
도 35는 MSNP-CK 및 MSNP-Rh2의 항염 활성에 관한 것으로, 쥐 대식세포주 RAW 264.7에 대한 세포 독성 및 LPS-유도 NO 생산 저해 효과를 보여준다. NO 생산 저해 효과 분석에 있어서, 질산 합성효소의 저해제인 L-NMMA(NG-monomethyl L-arginine)이 양성 대조군으로 사용되었다. A 및 B는 MSNP-CK, C 및 D는 MSNP-Rh2의 결과를 나타낸다. 통계적 유의성은 student's t-test를 이용하여 확인하였다. P < 0.05인 경우에 유의하다고 판단하였으며, 별표(*)로 표시하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
제조예 1. 금속-인산추출물 나노 복합체의 제조
제조예 1-1. 재료
테트라클로로금(III)산(HAuCl4?3H2O) 및 질산은(AgNO3)을 시그마-알드리치 케미칼(Sigma-Aldrich Chemicals, USA)에서 구입하고, 배지들은 구입하고 Difco에서 구입하였다(MB cell, Seoul, Republic of Korea). 또한, 인삼의 뿌리와 잎은 한국 고창에서 4년생 인삼으로부터 채취하였다.
표준 항생제 디스크(discs)로는 시판되는 반코마이신(vancomycin , VA30) 30 ㎍/disc, 리팜피신(rifampicin, RD5) 5㎍/disk, 올레안도마이신(oleandomycin, OL15) 15㎍/disk, 페니실린 G(P10) 10㎍/disk, 노보비오신(novobiocin, NV30) 30 ㎍/disk, 린코마이신(lincomycin, MY15) 15㎍/disk 및 테트라사이클린(tetracycline, TE30) 30㎍/disc을 구입하였다(Oxoid Ltd., England).
병원 박테리아 균주로는 비브리오 파라헤몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus) [ATCC 33844], 살모넬라 엔테리카(Salmonella enteric) [ATCC 13076], 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) [ATCC 10798], 스테피로코커스 오우러스(Staphylococcus aureus) [ATCC 6538], 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis) [NCTC 10340], 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) [ATCC 14579], 칸디다 알비칸스(Candida albicans) [KACC 30062], 및 슈도모나스에루지노사(Pseudomonas aeruginosa) [ATCC 27853]로 구성된 군에서 선택하여 사용하였다. 상기 박테리아 균주들은 37℃의 아가 영양배지에서 배양하였고, 글리세롤 스탁 바이알에서 -0℃로 보존하였다.
그 외 인간의 혈액은 건강한 남성 및 여성 자원자로부터 채혈하여 진공 채혈기 튜브에 저장하였다(Greiner Bio-One).
제조예 1- 2. 인삼 추출물의 제조
제조예 1-2-1. 인삼의 잎 추출물의 제조
상기 제조예 1-1에서 채취한 인삼 잎 15g을 깨끗이 한 후, 증류수에서 여러번 씻어 먼지나 현탁된 물질들을 제거하고, 6~8 시간동안 실온에서 그늘 건조하였다. 이후, 상기 잎들을 작은 조각으로 잘라 절구와 막자로 빻았다. 그런 다음, 상기 조각들을 100 ml의 멸균수에서 20분간 가열하여 인삼의 성분들을 물에 침출시킨 추출액을 Whatman 필터 페이퍼로 여과한 후, 15분간 10,000rpm에서 원심분리하였다. 여과시킨 액체를 멸균수 100 ml에 두고 4℃에서 저장하였다.
제조예 1-2-2. 인삼의 뿌리 추출물 제조
상기 제조예 1-1에서 채취한 인삼 뿌리 25g을 깨끗이 한 후, 증류수에서 여러번 씻어 먼지나 현탁된 물질들을 제거하였다. 이후, 상기 뿌리를 작은 조각으로 잘라 절구와 막자로 빻았다. 그런 다음, 상기 조각들을 100ml의 멸균수에서 30분간 가열하여 인삼의 성분들을 물에 침출시킨 추출액을 Whatman 필터 페이퍼로 여과한 후, 10분간 10,000rpm에서 원심분리하였다. 여과시킨 액체를 멸균수 100ml에 두고 4℃에서 저장하였다.
제조예 1-2-3. 홍삼의 뿌리 추출물 제조
홍삼뿌리를 빻아 홍삼뿌리 파우더를 획득한 후, 뿌리 파우더 10g을 멸균수 100ml와 혼합하고 30분간 가열하여 홍삼 성분을 물에 침출시킨 액체를 Whatman 여과 페이퍼로 여과하고 10분간 10,000rpm으로 원심분리하였다. 여과시킨 액체를 멸균수 100 ml에 두고 4℃에서 저장하였다.
제조예 1-3. 금 또는 은 나노 복합체의 합성
제조예 1-3-1. 인삼 잎 추출물을 이용한 금 또는 은 나노 복합체의 합성방법
상기 제조예 1-2-1에서 제조된 인삼 잎 여과액 100 ml에서 5 ml의 여과액을 25 ml의 멸균수와 혼합하고, 최종농도 1 mM의 테트라클로로금(III)산과 질산은 용액을 상기 반응 혼합액 각각 첨가하였다. 이후, Au3 +가 Auº로, Ag+가 Agº원자로 환원될 수 있도록 반응 혼합액을 80℃로 유지한 후, 나노 복합체의 형성을 나타내는 색 변화를 지속적으로 관찰하였다. 상기 반응 혼합액을 2,000rpm에서 10분 동안 원심분리하여 원하지 않는 성분들을 제거하고, 16,000rpm에서 15분간 원심분리하여 펠릿으로 만들고 멸균수로 여러 번 수세한 후, 밤새도록 공기 중에서 건조하였다. 여기서, 반응 혼합액의 색 변화를 육안으로 관찰하여 금 또는 은 나노 복합체(AuNP, AgNP)의 합성을 확인하였다.
도 1의 a 내지 c에서 확인할 수 있는 바와 같이, 테트라클로로금(III)산을 넣은 반응 혼합액은 3분 내에 어두운 자주색으로 변하였고(도 1의 a), 질산은을 넣은 반응 혼합액은 45분 내에 완전히 갈색으로 변하였다(도 1의 b). 반면, 인삼 잎 추출물과 멸균수가 같은 비율로 존재하고 상기의 반응 혼합액과 유사한 조건인 대조군에서는 색 변화가 관찰되지 않았다(도 1의 c). 상기의 색 변화는 표면 플라즈몬(surfacde plasmon) 진동에 의한 것으로, 반응 혼합액 중에서 금 또는 은 나노 복합체의 형성에 의해 발생되는 것이다.
즉, 상기의 결과를 통해, 인삼의 잎 추출물을 이용하여 제조된 금 또는 은 나노 복합체가 다른 천연 추출물이나 인삼의 다른 부위 추출물을 이용하여 제조되는 나노 복합체에 비해 매우 짧은 시간 안에 합성되는 것을 확인할 수 있는바, 인삼의 잎 추출물을 이용하면, 매우 빠른 시간 내에 경제적이고 친환경적인 방법으로 안정적인 금속 나노 복합체를 합성할 수 있다는 것을 알 수 있으며, 이를 통해 인삼 잎에 존재하는 페놀산, 플라보노이드, 진세노사이드, 및 폴리사카라이드가 금속 나노 복합체 형성에 영향을 미친다는 것을 간접적으로 확인할 수 있다.
제조예 1-3-2. 인삼 뿌리 추출물을 이용한 금 및 은 나노 복합체의 합성방법
상기 제조예 1-2-2에서 제조된 인삼 뿌리 여과액 100ml에서 5ml의 여과액을 25 ml의 멸균수와 혼합하고, 최종농도 1mM의 테트라클로로금(III)산과 질산은 용액을 반응 혼합액에 각각 첨가한 후, 80℃로 유지하였다. 상기 반응 혼합액을 2,000rpm에서 10분 동안 원심분리하여 원하지 않는 성분들을 제거하고, 16,000rpm에서 20분간 원심분리하여 펠릿으로 만들고 멸균수로 여러 번 수세한 후, 밤새도록 공기 중에서 건조하였다. 여기서, 반응 혼합액의 색 변화를 육안으로 관찰하여 금 및 은 나노 복합체의 합성을 확인하였다.
도 1의 d 및 e에서 확인할 수 있는 바와 같이, 질산은을 넣은 반응 혼합액은 하얀색에서 갈색으로 변하는데 2시간이 소요되었고, 테트라클로로금(III)산을 넣은 반응 혼합액은 5분 후에 핑크색으로 완전히 변하였다. 반면, 대조군에서는 색 변화가 관찰되지 않았다. 역시 상기의 색 변화는 표면 플라즈몬(surfacde plasmon) 진동에 의한 것으로, 반응 혼합액 중에서 금 또는 은 나노 복합체의 형성에 의해 발생되는 것으로, 이를 통해, 인삼 잎 추출물보다는 합성시간이 느리나, 다른 천연 추출물을 이용하여 제조되는 금 또는 은 나노 복합체의 합성시간에 비해서는 빠른 시간 내에 합성되는 것을 확인할 수 있었다.
제조예 1-3-3. 홍삼 뿌리 추출물을 이용한 금 및 은 나노 복합체의 합성방법
상기 제조예 1-2-3에서 제조된 홍삼 뿌리 여과액 100ml에서 5ml의 여과액을 25ml의 멸균수와 혼합하고 최종농도 1 mM의 테트라클로로금(III)산과 질산은 용액을 반응 혼합액에 각각 첨가한 후, 환원반응이 일어날 수 있도록 80℃로 유지하였다. 이후, 2,000rpm에서 10분 동안 원심분리하여 원하지 않는 성분들을 제거하고, 16,000rpm에서 15분간 원심분리하여 펠릿으로 만들고 멸균수로 여러 번 수세한 후, 밤새도록 공기 중에서 건조하였다. 여기서, 반응 혼합액의 색 변화를 육안으로 관찰하여 금 및 은 나노 복합체의 합성을 확인하였다.
그 결과 도 1의 f 및 g에서 확인할 수 있는 바와 같이, 상기 반응 혼합액은 각각 1시간 및 10분 이내에 갈색과 루비색(ruby red)으로 변하였다. 이를 통해서도 역시 홍삼 뿌리 추출물을 이용하여 제조된 금 또는 은 나노 복합체는 인삼 잎 추출물을 이용하는 경우보다는 느리게 합성되나, 다른 천연 추출물을 이용하여 제조되는 금속 나노 복합체의 합성시간에 비해서는 현저히 빠른 시간 내에 합성되는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 1. 인삼 추출물을 이용하여 제조된 금속 나노 복합체의 특성분석
실시예 1-1. 분석방법
상기 인삼 추출물을 이용하여 제조되는 나노 복합체를 자외선/가시광선 분광법(Ultraviolet/Visible Spectroscopy, UV-vis), 전계 방출형 주사전자현미경(Field-emission transmission electron microscopy, FE-TEM), 에너지 분산형 X선 분석 (energydispersive X-ray spectrometer, EDX spectra), 원소 매핑 (elemental mapping), 동적광산란법 (Dynamic Light Scattering, DLS) 및 안정성 분석을 이용하여 나노 복합체의 크기, 모양, 구성 및 특성을 분석하였다.
구체적으로, 각 용액을 UV-vis 분광광도계(Ultrospec 2100 Pro, Amersham, Biosciences)에서 300 내지 800 nm의 파장 범위내에 걸쳐 흡광도를 스캔함으로써, 금 및 은 이온의 환원을 확인하였다. 또한, 전계 방출형 주사전자현미경(field emission transmission electron microscopy, FE-TEM), 에너지 분산형 X선 분석(energy dispersive X-ray spectroscopy, EDAX), 및 200 kV에서 작동되는 JEM-2100F (JEOL) 장치로 원소매핑(elemental mapping)을 이용하여 상기 제조된 나노 복합체의 크기, 모양, 형태(morphology) 및 분포를 분석하였다.
또한, FM-TEM, EDAX 및 원소 매핑 분석을 위해, 탄소 코팅된 구리 그리드(carbon coated copper grid) 상에 정제한 나노 복합체 소량을 적하하고, 60℃의 오븐에서 건조하여 시료를 제조하였다. 제조된 시료를 FE-TEM을 통해 나노 복합체의 구조적 특성을 분석하였고, EDX 및 원소 매핑을 통해 원소의 분포를 분석하였다.
또한, 동적 광산란법((Dynamic light scattering, DLS), Particles size analyzer, Photal, Otsuka Electronics, Japan)을 이용하여 나노 복합체의 사이즈 분석 프로파일을 분석하였다. 구체적으로, 유체역학적 직경(hydrodynamic diameters)과 다분산지수(polydispersity index, PDI)를 25℃에서 분석하고, 참고 분산매질로서, 굴절률 1.3328, 점성 0.8878 및 유전율(dielectric constant) 78.3을 가지는 순수 물을 사용하였다.
상기 제조된 나노 복합체의 X선 회절(X-ray diffraction, XRD) 분석은 X선 회절계(X-ray diffractometer, D8 Advance, Bruker, Germany) 상에서, 40 kv, 40 mA의 CuKα방사(radiation)로 6°/분의 스캔률, 0.02의 스텝사이트, 20 내지 80°의 2θ범위에 걸쳐 수행하였다.
또한, 나노 복합체의 안정성 분석을 수산화나트륨을 상기 나노 복합체에 첨가하기 전 및 후로 나누어 관찰하였다. 상기 나노 복합체의 안정성에서의 pH 변화에 따른 효과를 pH 3 내지 12 범위에서 관찰하였다.
실시예 1-2. 인삼 추출물을 이용하여 제조된 금 또는 은 나노 복합체의 특성분석 결과
실시예 1-2-1. 자외선/가시광선 분광법 (Ultraviolet/Visible Spectroscopy, UV-vis) 분석
상기 제조예 1-3-1 내지 1-3-3에서 제조된 인삼 잎, 뿌리 추출물과 홍삼 뿌리 추출물을 이용하여 제조되는 금 또는 은 나노 복합체의 제조여부를 UV-vis 분석을 통해 확인한 결과, 인삼 잎 추출물을 이용한 경우에는 금 나노 복합체의 경우 578nm에서, 은 나노 복합체의 경우 420nm에서 주요 흡수 피크가 확인되어, 인삼 잎 추출물을 이용하여 금 및 은 나노 복합체가 제조되었음을 확인할 수 있었다(도 2의 a 및 b). 또한, 인삼 뿌리 추출물을 이용한 경우에는 은 나노 복합체는 412nm에서, 금 나노 복합체는 534 nm에서 주요 흡수 피크가 확인되어 역시 인삼 뿌리 추출물을 이용한 경우에도 금 및 은 나노 복합체가 제조되었음을 확인할 수 있었다(도 3의 a 및 b).
마지막으로, 홍삼 뿌리 추출물을 이용한 경우는, 은 나노 복합체는 410nm에서, 금 나노 복합체는 560nm에서 주요 흡수 피크를 확인하였는바, 이를 통해 홍삼 뿌리 추출물을 이용한 금 및 은 나노 복합체가 제조되었음을 확인할 수 있었다(도 4의 a 및 b).
이와 같은 주요 흡광 피크는 금 또는 은 나노 복합체의 특이적인 피크로, 나노 복합체의 표면 플라즈몬 공명(Surface Resonance Plasmon)에 대응하는 것이다. 상기 인삼의 잎, 뿌리 또는 홍삼의 뿌리 추출물을 이용하여 합성된 금 또는 은 나노 복합체는 20℃에 저장되어도 UV-vis 스펙트럼이 몇 달 동안 변하지 않았으며, 이것은 상기 금속 나노 복합체가 물에서 오랜 시간동안 안정하다는 것을 나타내는 것이다.
실시예 1-2-2. 전계 방출형 주사전자현미경 (Field-emission transmission electron microscopy, FE-TEM) 분석
FE-TEM을 통해, 제조예 1-3-1 내지 1-3-3에서 제조된 인삼의 잎, 뿌리 또는 홍삼의 뿌리 추출물을 이용하여 제조한 금 또는 은 나노 복합체의 구조적 특징을 분석하였다.
그 결과, 인삼의 잎 추출물로 제조한 경우의 금 나노 복합체는 10 내지 30nm의 크기이고 구형을 가지며(도 5의 a 및 b), 간섭무늬 간격(fringe spacing)이 0.23nm임을 확인할 수 있었다(도 5의 c). 또한, 도 5의 d에서는 [111], [200], [220], [311] 및 [222] 상에 대응되는 링을 가지는 정제된 구형모양의 금 나노 복합체가 가지는 선택된 전자 회절 패턴(selected electron diffraction pattern, SEAD)을 확인할 수 있었다(도 5의 d). 은 나노 복합체의 경우는 10 내지 20nm의 크기의 구형이고(도 5의 e 및 f), 간섭무늬 간격을 0.24nm이며(도 5의 g), [111], [200], [220], [311], 및 [222] 상에 대응되는 링을 가지는 은 나노 복합체의 SEAD 이미지를 확인할 수 있었다(도 5의 h).
인삼의 뿌리 추출물로 제조된 은 나노 복합체는 10 내지 30nm의 크기이고 구형이며(도 6의 a 및 b), 금 나노 복합체는 10 내지 40nm의 크기이고, 구형임을 확인하였다(도 6의 c, d). 또한, 상기 은 및 금 나노 복합체는 균일하고 단순분산형이며(도 7의 a), 나노 복합체 간섭무늬 간격(fringe spacing)이 0.23nm임을 확인할 수 있었다(도 7의 b, c). 입자가 크리스탈 임을 보여주는 링-유사(ring-like) 회절 패턴이 [111], [200], [220], 및 [311] 상에 대응되는 은 및 금 나노 복합체의 SEAD 이미지를 확인하였다(도 7의 d 내지 f).
홍삼 뿌리 추출물을 이용하여 제조된 금 및 은 나노 복합체는 모두 10 내지 30nm의 크기이고 구형을 가지며, 균일한 단순 분산형임을 확인하였다(도 8의 a 및 b).
이와 같은 결과를 통하여, 인삼의 잎, 뿌리 추출물 또는 홍삼의 뿌리 추출물을 이용하여 제조되는 금 및 은 나노 복합체가 제조되었음을 다시 확인할 수 있었다. 또한, 제조된 금 및 은 나노 복합체의 크기가 종래 제조된 금속 나노 복합체에 비해 그 분포가 균일하고 작은 크기로 존재한다는 것을 확인할 수 있었으며, 특히, 은 나노 복합체의 경우가 종래의 크기인 100nm보다 현저히 줄어들었음을 확인할 수 있었다.
실시예 1-2-3. 에너지 분산형 X선 (Energy Dispersive X-Ray Analysis, EDAX) 분석
EDAX 분석을 통해, 제조예 1-3에서 제조된 금 및 은 나노 복합체의 순도를 각각 측정하였다.
그 결과, 인삼의 잎 추출물을 이용하여 제조한 금 또는 은 나노 복합체의 경우, 도 9의 a 및 b에서 확인할 수 있는 바와 같이, 금 나노 복합체는 2.15 keV에서, 은 나노 복합체는 3 keV에서 광학적인 흡광이 관찰되었으며(도 9의 a 및 b), 인삼의 뿌리 추출물을 이용한 경우에는, 은 나노 복합체가 3 keV에서, 금 나노 복합체는 2.2 keV에서 광학적인 흡광이 관찰되었다(도 10의 a 및 b). 또한, 홍삼의 뿌리 추출물을 이용하여 제조한 경우에는, 은 나노 복합체는 3 keV에서, 금 나노 복합체는 2.3 keV에서 광학적인 흡광이 관찰되었는바(도 11의 a 및 b), 상기의 결과는 금 및 은 나노결정의 특성으로, 이를 통해 금 및 은 나노 복합체가 제조되었음을 확인할 수 있다.
실시예 1-2-4. 투과전자현미경 (Transmission electron microscope, TEM ) 분석
TEM을 통해, 제조예 1-3에서 제조된 금 및 은 나노 복합체의 분포를 분석하였으며, 상기 원소 매핑 결과는 합성된 나노 복합체 펠렛 용액을 전자현미경을 통해 확인하였다.
그 결과, 인삼 잎 추출물을 이용하여 제조한 금 나노 복합체의 분포는 54.73%이고(도 12의 a 및 b), 은 나노 복합체는 47.70%임을 확인할 수 있었으며(도 12의 c 및 d), 인삼 뿌리 추출물을 이용하여 제조한 경우의 은 나노 복합체의 분포는 54.73%이고(도 13의 c 및 d), 금 나노 복합체는 52.16%임을 확인할 수 있었다(도 13의 c 및 d). 또한, 홍삼 뿌리 추출물을 이용하여 합성된 경우의 원소 매핑 결과는 도 14의 a 내지 d를 통해 확인하였다. 원소 매핑에서 얻은 상기 결과를 통해 본원발명의 금 및 은 나노 복합체가 각각의 물질에서 우수한 입자임을 확인할 수 있었다.
실시예 1-2-5. X선 회절 (X-ray diffraction, XRD ) 분석
XRD 분석을 통해, 제조예 1-3에서 제조된 금 및 은 나노 복합체의 회절패턴을 분석하였다.
그 결과, 인삼 잎 추출물을 이용하여 제조된 금 나노 복합체는 [111], [200], [220], [311] 및 [222]에 대응되는 20 내지 80 범위의 2θ값 전체 스펙트럼에서 강렬한 피크를 확인할 수 있었으며, 은 나노 복합체는 XRD 스펙트럼에서 [111], [200], [331], [241] 및 [311]에 대응되는 2θ값에서 피크를 확인할 수 있었다(도 15의 a 및 b). 인삼 뿌리 추출물을 이용한 경우에는, [111], [200], [331], [241] 및 [311]에 대응되는 2θ값 전체 스펙트럼에서 강렬한 피크를 확인할 수 있었다(도 16의 a 및 b). 이는 금 및 은 나노 크리스탈의 Bragges's reflection과 유사한 값을 나타내므로, 이러한 결과로부터 금 및 은 나노 복합체가 제조되었음을 확인할 수 있다.
실시예 1-2-6. 동적광산란법 (Dynamic Light Scattering, DLS) 분석
동적광산란법 분석을 통해, 제조예 1-3에서 제조된 금 및 은 나노 복합체의 용량(volume), 강도(intensity) 및 수(number)를 바탕으로 입자의 크기 분포를 프로파일을 확인하였다.
그 결과, 인삼 잎 추출물을 이용하여 제조한 경우의 금 나노 복합체는 다분산지수(polydispersity index, PDI)가 0.191인, 50 내지 150nm의 범위이고(도 17의 a 내지 c), 은 나노 복합체는 다분산지수(polydispersity index)가 0.13인, 70 내지 140 nm의 범위임을 확인하였으며(도 17의 d 내지 f), 금 및 은 나노 복합체의 평균 입자 크기, 즉 나노 복합체의 역학적 직경(hydrodynamic diameter)은 각각 97nm 및 80nm임을 확인하였다. 또한, 홍삼 뿌리 추출물을 이용한 경우의 은 나노 복합체는 다분산지수(polydispersity index, PDI)가 0.190이고, 평균지름이 83 nm이며(도 18의 a 내지 c), 금 나노 복합체는 다분산지수(polydispersity index)가 0.159이고, 평균지름이 183 nm 임을 확인하였다(도 18의 d 내지 f).
실시예 1-2-7. 안정성 분석
마지막으로, 제조예 1-3에서 제조된 금 및 은 나노 복합체의 안정성 분석을 위해, pH가 각각 5.6과 6인 나노 복합체 합성을 위한 반응 혼합액에 0.1M의 수산화나트륨을 첨가하였다.
그 결과, 인삼의 잎 또는 뿌리 추출물을 이용하여 제조한 금 또는 은 나노 복합체의 경우, 수산화나트륨이 첨가되었어도, 주요한 변화(shift)가 나타나지 않아 안정하다는 것을 확인할 수 있었으며, 특히, pH 3 내지 12의 범위의 흡수에서 주요한 변화가 나타나지 않았다. 또한, 합성 후 3주가 지난 뒤 반은 혼합액의 UV-vis 스펙트럼을 확인해본 결과, 아무런 변화가 관측되지 않았다. 또한, 홍삼 뿌리 추출물을 이용하여 합성한 경우에도, 상기 pH 범위에서 주요한 변화(shift)가 나타나지 않아 안정하다는 것을 확인할 수 있었으며, 합성 후 3주가 지난 뒤 반은 혼합액의 UV-vis 스펙트럼을 확인해본 결과에서도, 아무런 변화가 관측되지 않았다.
이것은 인삼의 잎 또는 뿌리 추출물이나 홍삼 추출물을 이용하여 합성된 금 및 은 나노 복합체는 별도의 환원제나 안정제의 부가 없이도 안정성을 나타낸다는 것을 의미하는 것이다. 특히, 잎의 추출물의 경우, 상기의 결과는 인삼 잎에 존재하는 산화방지제 활성을 나타내는 페놀산 및 플라보노이드와, Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re, Rg1, F1, F2, 및 F4와 같은 진세노사이드와 같은 성분들이 합성된 금 및 은 나노 복합체의 안정성에 중요한 역할을 한다는 것을 시사하는 것이며, 이에 따라, 인삼 잎 추출물은 다른 환원제나 안정제 없이 그 자체로 환원제 및 안정제의 역할을 하고, 본 발명의 인삼 잎 추출물을 이용하여 제조된, 금 및 은 나노 복합체는 넓은 범위의 pH에 걸쳐 약 전달자에 적용할 수 있는 가능성이 있음을 시사하는 것이다.
실시예 2. 나노 복합체의 항균활성 평가
실시예 2-1. 측정방법
나노 복합체의 항균활성을 측정하기 위해, 디스크 확산법(disc diffusion method)을 이용하여 뮐러-힌톤 아가(Muller-Hinton agar, MHA) 플레이트에서 측정하였다. 항균활성 평가 시험에 사용된 병원성 미생물은 비브리오 파라헤몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica), 스테피로코커스 오우러스(Staphylococcus aureus), 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 및 칸디다 알비칸스(Candida albicans)로 구성된 군에서 선택하여 이용하였다.
상기 각 균주를 MHA 배지 플레이트에 100㎕를 균등하게 펴 바른 후 하룻동안 배양하고, 제조된 은 및 금 나노 복합체 반응 혼합액 30㎕(100 mg/L) 또는 50㎕ (100 mg/L)를 도포하여 37℃에 24시간 배양하였다. 배양 후, 은 및 금 나노 복합체 주위의 저해영역(inhibition zone)을 측정하고 각 항생제 디스크의 저해영역과 비교하였다. 대조군으로는, 반코마이신(vancomycin), 노보비오신(novobiocin), 테트라사이클린, 리팜피신(rifampicin), 올렌도마이신(oleandomycin), 페니실린, 및 린코마이신(lincomycin)으로 이루어진 군에서 하나 이상의 표준 항생물질을 선택하여 이용하였다.
실시예 2-2. 항균활성 측정 결과
제조예 1-3-1에서 제조된 인삼 잎 추출물을 이용하여 제조되는 금 나노 복합체는 도 19에서 확인할 수 있는 바와 같이, 비브리오 파라헤몰리티쿠스, 살모넬라 엔테리카, 에스케리치아 콜라이 및 스테피로코커스 오우러스에 대해 항균활성을 가짐을 확인하였으며, 은 나노 복합체는 비브리오 파라헤몰리티쿠스, 살모넬라 엔테리카, 및 에스케리치아 콜라이에 대해 항균 활성을 가짐을 확인할 수 있었다. 상기의 결과는 하기 표 1과 같다.
Figure PCTKR2017000489-appb-T000001
또한, 제조예 1-3-2에서 제조된 인삼 뿌리 추출물을 이용하여 제조되는 금 및 은 나노 복합체의 항균활성을 측정한 결과, 도 20에서 확인할 수 있는 바와 같이, 은 나노 복합체는 에스케리치아 콜라이, 바실러스 세레우스, 스테피로코커스 오우러스, 비브리오 파라헤몰리티쿠스 및 바실러스 안트라시스에 대하여는 항균활성을 보여주었으나, 금 나노 복합체는 같은 농도에서 어떤 활성도 관측되지 않았다.
마지막으로, 제조예 1-3-3에서 제조된 홍삼 뿌리 추출물을 이용하여 제조되는 은 나노 복합체는 도 21에서 확인할 수 있는 바와 같이, 비브리오 파라헤몰리티쿠스, 스테피로코커스 오우러스, 바실러스 세레우스 및 칸디다 알비칸스에 대한 항균 활성을 가짐을 확인하였다. 그 중에서도, 특히 칸디다 알비칸스에 대한 항균활성이 가장 컸고, 그 다음으로 비브리오 파라헤몰리티쿠스, 스테피로코커스 오우러스, 바실러스 세레우스의 순서였다. 이에 대한 결과는 하기 표 2에서 나타내었다. 상기 결과를 통해 본 발명의 금 또는 은 나노 복합체는 미생물에 대한 항균활성을 가짐을 확인할 수 있다.
Figure PCTKR2017000489-appb-T000002
실시예 3. 나노 복합체의 바이오필름 분해 활성 평가
실시예 3-1. 측정방법
은 나노 복합체의 바이오필름 분해 활성은 스테피로코커스 오우러스(Staphylococcus aureus) 및 슈도모나스에루지노사(Pseudomonas aeruginosa)에 대한 비색법(colorimetric method)으로 확인하였다. 구체적으로, 96-웰 마이크로-티터 플레이트의 웰에 100㎕의 스테피로코커스 오우러스와 슈도모나스에루지노사 균주로 채워 로그 기(log phase)로 24시간 배양하였다. 이후, 은 나노 복합체를 1 내지 4 ㎍의 범위로 추가하고, 상기 세포배양 플레이트를 4시간 동안 37℃에서 배양한 후, 상기 배지를 제거하고, 상기 웰을 200㎕의 멸균수로 3회 수세하였다. 그런 다음 마이크로-티터 플레이트를 45분 동안 공기 건조하고, 물에 0.1%의 크리스털 바이올렛(crystal violet)이 첨가된 용액 200㎕을 각 웰에 첨가하여 4분 동안 둔 후 300㎕의 멸균수로 3회 수세하여 과도한 균주를 제거하였다. 이를 통해 근접한 세포에 의해 통합된 염색은 95%의 에탄올 200㎕에 함께 용해되었다. 각 웰의 흡수를 마이크로-티터 ELISA 리더를 사용하여 595 nm에서 측정한 후, 하기의 식을 이용하여 바이오필름 활성 저해의 퍼센트를 계산하였다: [1-(A595 of test /A595 of control)]×100 (Gurunathan et al., 2014). 상기 실험은 반복하여 수행되며 결과는 평균±SD 하에서 분석하였다.
실시예 3-2. 바이오필름분해활성 측정결과
인삼 잎 추출물을 이용하여 제조된, 제조예 1-3-1의 은 나노 복합체는, 도 22에서 확인할 수 있는 바와 같이, 은 나노 복합체 4 ㎍/ml의 농도에서 스테피로코커스 오우러스와 슈도모나스에루지노사에 대한 바이오필름 분해 활성이 최고조임을 확인할 수 있었으며, 실시예 3-3에서 제조된 홍삼 뿌리 추출물을 이용하여 제조되는 은 나노 복합체에서 도 23에서 확인할 수 있는 바와 같이, 은 나노 복합체의 4 ㎍/ml 농도에서 스테피로코커스 오우러스와 슈도모나스에루지노사에 대한 바이오 분해 활성이 있음을 확인하였다.
이를 통해, 인삼 추출물을 이용하여 제조된 나노 복합체가 균주에 대한 바이오필름 분해 활성을 가져 바이오필름-관련 감염을 저해함으로써 비용적인 측면이나 환자의 고통을 경감시키는 역할을 할 수 있다는 것을 확인할 수 있다.
실시예 4. 나노 복합체의 항응고 활성 평가
실시예 4-1. 측정방법
건강한 남성 및 여성 자원자(나이 25 내지 45세의 나이범위)에게 인간 혈액을 채취하여 2 개의 진공 채혈기에 넣고 각각 A 및 B로 표시하였다. 시간이 경과된 후, 합성된 금 나노 복합체의 항응고 효과를 관찰하였다.
실시예 4-2. 항응고 활성의 측정결과
인삼 잎 추출물을 이용하여 제조된, 제조예 1-3-1의 금 나노 복합체는, 도 24에서 확인할 수 있는 바와 같이, 금 나노 복합체가 존재하면 응혈 형성이 저해되는 것을 확인할 수 있었다(도 24의 a). 이와 비교하여, 항응고제가 포함되지 않은 대조군은 혈액이 완전히 응고된다(도 24의 b). 또한, 24 시간 후에도, 금 나노 복합체의 안정성에 대한 특이적인 변화는 관찰되지 않았다.
이와 같은 결과를 통하여, 인삼의 잎 추출물에 의해 생합성된 금 나노 복합체의 항응고 활성을 알 수 있으며, 또한, 이러한 결과는 상기 금 나노 복합체를 혈액과 직접적으로 접촉하는 약 및 유전자의 전달자나 또는 바이오센서, 생체 내 나노캐리어로서 변형하여 사용할 수 있음을 시사하는 것이다.
실시예 5. 나노 복합체의 모모세포 및 암세포에 대한 세포 독성 평가
인삼 잎 추출물을 이용하여 제조된, 제조예 1-3-1의 나노 복합체의 항암 활성을 측정하기 위하여, 인간 폐암 세포(A549) 및 모모 세포(HaCaT Skin)에서 금 나노 복합체 및 은 나노 복합체의 세포독성을 MTT 분석법을 통해 측정하였다. 그 결과, 은 나노 복합체는 모모 세포에 대해 1000㎍/mL 농도에서도 세포 독성이 없어, 생체적합성을 가짐을 알 수 있었다(도 25). 그러나, 은 나노 복합체는 A549 폐암 세포에 대해서는 100㎍/mL 농도에서도 세포독성을 나타내었다. 또한, 금 나노입나의 경우, 모모 세포에 대해 20㎍/mL 농도에서도 세포 독성이 없어, 생체적합성을 가짐을 알 수 있었다(도 25). 그러나, 금 나노 복합체는 A549 폐암 세포에 대해서는 2㎍/mL 농도에서도 세포독성을 나타내었다. 따라서, 은 나노 복합체는 약 전달을 위한 생체적합성을 가지고, 금 나노 복합체는 항암제로서 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 6. 나노 복합체의 항염 활성 평가
인삼 잎 추출물을 이용하여 제조된, 제조예 1-3-1의 은 또는 금 나노 복합체를 처리한 후 RAW264.7 세포의 생존능을 측장하고, 은 또는 금 나노 복합체와 함께 LPS (1㎍/ml)를 RAW264.7 세포에 처리한 후, NO의 생성량을 측정하였다. 이때, L-NMMA(monomethylarginine)를 양성 대조군으로 사용하였다. 그 결과, 은 나노 복합체는 1000μM 농도까지 RAW264.7 세포에 대해 세포독성이 없으며, 농도의존적으로 NO 생산을 억제함을 확인하였다(도 26). 또한, 금 나노 복합체는 100μM 농도까지 RAW264.7 세포에 대해 세포독성이 없으며, 농도의존적으로 NO 생산을 억제함을 확인하였다(도 26). 이를 통해, 인삼의 잎 추출물에 의해 생합성된, 은 및 금 나노 복합체가 세포독성 없이 항염증 활성을 가짐을 확인하였다.
제조예 2. BSA-CK 및 BSA-Rh2의 제조 방법
진세노사이드 CK 또는 Rh2의 용해도를 향상시키기 위하여, 상기 진세노사이드에 BSA를 결합시킨 BSA-CK 또는 BSA-Rh2 나노 복합체를 제조하였다.
구체적으로, 나노 복합체를 제조하기 위하여, 다음과 같은 시약을 사용하였다. 소 혈청 알부민(Bovine serum albumin; BSA, Mw = 66000)은 Sigma Aldrich(St. Louis, MO, USA) 사에서 구입하였고, 진세노사이드 CK 및 Rh2는 인삼소재은행(Kyung Hee University, Yongin, South Korea)에서 구입하였다. 다른 모든 화학물질은 분석 수준의 등급인 것을 사용하였다.
BSA-CK의 합성은 탈용매 방법을 통해 수행하였다. 구체적으로, BSA를 물에 용해하였으며, 5 내지 10분 동안 초음파를 처리하였다. 이후, BSA-물 혼합액을 격렬하게 교반하였고, 에탄올에 용해된 진세노사이드 CK를 BSA-물 혼합액에 드롭 방식(drop wise)으로 첨가하였다. 상기 BSA-진세노사이드 반응 혼합액을 실온에서 24시간 동안 보관하였다. 이후, 상기 반응 혼합액을 투석 막(Mw. cut off: 3,000)에 옮겼고, 메탄올/증류수(75:25, v/v)에서 하루 동안 투석하였으며, 증류수로 2일 동안 추가로 투석한 후, 동결건조하였다.
BSA-Rh2 나노 복합체도 상기와 같은 방법으로, 진세노사이드 Rh2를 이용하여 합성하였다.
실시예 7. BSA-CK 및 BSA-Rh2의 합성 결과 분석
실시예 7-1. BSA-CK 및 BSA-Rh2의 진세노사이드 양 확인
BSA-CK 또는 BSA-Rh2 나노 복합체에 적재된 진세노사이드의 양은 HPLC를 이용하여 계산하였다.
그 결과, 도 27의 A에서 볼 수 있듯이, BSA-CK는 CK 단독과 동일한 명확한 피크를 보였고, BSA-CK에 적재된 CK의 양은 나노 복합체 1 mg 당 0.087 mg임을 확인하였다. 아울러, 도 27의 D에서 볼 수 있듯이, BSA-Rh2는 단독과 동일한 명확한 피크를 보였고, BSA-Rh2에 적재된 Rh2의 양은 나노 복합체 1 mg 당 0.096 mg임을 확인하였다.
실시예 7-2. BSA-CK 및 BSA-Rh2의 진세노사이드 고유 특성 확인
본 발명의 BSA-CK 및 BSA-Rh2 나노 복합체가 잘 제조되었는지 확인하기 위하여, BSA-CK 및 BSA-Rh2, 및 이의 중간체의 구조를 1H NMR과 FT-IR을 이용하여 확인하였다.
구체적으로, 1H NMR 스펙트럼은 300 MHz(JEOL, Tokyo, Japan)에서 기록하였고, 샘플은 D 2O 또는 CD 3OD에 용해하였다. FT-IR 스펙트럼은 KBr 펠렛을 이용한 Perkin-Elmer FT-IR 분광광도계를 이용하여 확인하였다.
그 결과, 도 27의 B 및 C에서 볼 수 있듯이, BSA-CK의 1H NMR 결과와 FTIR의 결과는 CK의 특징적인 피크를 나타냄을 확인하였다. 아울러, 도 27의 E 및 F에서 볼 수 있듯이, BSA-Rh2의 1H NMR 결과와 FTIR의 결과는 Rh2의 특징적인 피크를 나타냄을 확인하였다.
상기 결과를 통해, BSA-CK 및 BSA-Rh2 나노 복합체는 각각 CK 및 Rh2의 고유한 특성을 지니고 있음을 알 수 있었다.
실시예 8. BSA-CK 및 BSA-Rh2의 물리화학적 특징 분석
실시예 8-1. 형태 분석
본 발명의 BSA-CK 및 BSA-Rh2 나노 복합체의 형태를 확인하기 위하여, 200 kV의 가속 전압으로 작동한 FE-TEM(JEM-2000F, JEOL)을 이용하였다.
구체적으로, FE-TEM 샘플을 준비하기 위하여 샘플 용액의 한 방울을 탄소가 코팅된 200-메쉬(mesh) 구리 그리드(grid)에 두어 자연건조하였다. 상기 나노 복합체의 크기 분포 및 안정성은 입자 분석기 및 제타 전위를 통해 확인하였고, 샘플은 인산염-완충된 살린(PBS, pH 7.4) 또는 아세테이트 버퍼(pH 5.0)에 분산시켰다.
그 결과, 도 28의 A 및 D에서 볼 수 있듯이, BSA-CK 및 BSA-Rh2는 균일한 크기 분포를 갖는 구의 형태를 가짐을 확인하였다.
실시예 8-2. 크기 분포 분석
본 발명의 BSA-CK 및 BSA-Rh2 나노 복합체의 크기 분포를 확인하기 위하여, 동적광산란(dynamic light scattering; DLS)을 수행하였다.
그 결과, 도 28의 B 및 E에서 볼 수 있듯이, BSA-CK 및 BSA-Rh2의 평균 유체역학적 크기는 각각 157.2 및 175.8 nm임을 확인하였다.
실시예 8-3. 안정성 분석
나노 복합체 표면의 음전하간의 높은 정전기적 반발력은 콜로이드 상태에서 응집을 방지하여 높은 안정성을 제공한다. 이에 따라, 본 발명의 BSA-CK 및 BSA-Rh2 나노 복합체의 용액 내 안정성을 확인하기 위하여, 제타 전위(zeta potential) 값을 측정하여 비교하였다.
그 결과, 도 28의 C 및 F에서 볼 수 있듯이, BSA-CK 및 BSA-Rh2의 제타 전위값은 각각 -70.80 mV 및 -80.2 mV임을 확인하였고, BSA 자체가 -17.9 mV임을 비교하였을 때, BSA-CK 및 BSA-Rh2는 상당히 높은 제타 전위에 속하며, 안정된 범위 안에 속함을 확인하였다.
이를 통해, 본 발명의 나노 복합체는 안정된 시스템을 형성함으로써 제조됨을 확인하였다.
실시예 9. BSA-CK 및 BSA-Rh2의 용해도 분석
높은 수용성 용해도는 생물이용성, 막투과성 및 치료학적 활성 등 약물동태학적 특성을 유리하게 향상시킨다. 약물 흡수에는 물에 대한 용해도가 가장 중요한 생리화학적 요인임에 따라, 본 발명의 BSA-CK 및 BSA-Rh2 나노 복합체의 용해도를 분석하였다.
그 결과, 도 29의 A 및 B에서 볼 수 있듯이, 진세노사이드 CK 또는 Rh2 단독은 낮은 농도에서도 불용성인 반면, BSA-CK 및 BSA-Rh2는 물에 쉽게 용해됨을 확인하였다. 상기 결과를 통해, 본 발명의 나노 복합체는 높은 용해도를 가지므로 약물로서 유용하게 이용될 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 10. BSA-CK 및 BSA-Rh2의 항암 활성 분석
본 발명의 BSA-CK 및 BSA-Rh2 나노 복합체의 항암 활성을 분석하기 위하여, 폐암 세포에 대한 독성을 하기 실시예 10-1 및 10-2를 통해 확인하였다.
실시예 10-1. BSA-CK의 세포 독성 확인
BSA-CK 나노 복합체의 항암 활성을 분석하기 위하여, 폐암세포에 대한 독성을 확인하였다.
먼저, 인간 폐암 세포(A549)를 10% 소 태아 혈청(FBS)과 100 IU/mL 페니실린 및 100 ㎍/mL 스트렙토마이신(Gibco-Brl. Gaithersburg, MD, USA)이 보충된 RPMI 1640 배지에서 배양하였다. 세포를 5% CO2가 포함된 습윤 대기 조건의 37℃에서 배양하였다.
이후, 세포 생존율을 MTT(3, 4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2-5-diphenyletrazolium bromide) 어세이를 이용하여 평가하였다. 구체적으로, 세포를 1 × 105 세포/mL의 밀도로 96-웰 플레이트에 분주하였고, 24시간 동안 배양 후, 다양한 농도의 BSA-Rh2, BSA-CK, 진세노사이드 CK 또는 Rh2를 세포에 24시간 동안 처리하였다. 지정된 배양시간이 끝난 후, MTT 스톡 용액(5 mg/ml) 10 ㎕를 각 웰에 넣었고, 4시간 동안 배양하였다. 이후, 상층액을 제거하고, DMSO 100 ㎕를 상기 웰에 넣었다. 생존한 세포에 의해 형성되는 포마잔(formazan)의 양을 multi-model 플레이트 리더기를 이용하여 570 nm의 파장에서 측정하였으며, 기준파장은 630 nm로 하였다. 추가로, 각질 세포주(keratinocyte)에 대한 세포독성을 상기와 같은 방법으로 측정하였다.
그 결과, 도 30의 A 및 B에서 볼 수 있듯이, A549 폐암 세포주에 대하여, BSA-CK 나노 복합체는 5 ㎍/mL에서 약 80% 정도의 세포 성장을 저해하는 상당히 높은 세포독성을 나타냄을 확인하였다. 또한, CK 단독에 비하여 월등히 우수한 세포 독성을 나타냄을 확인하였다. 반면, BSA-CK는 각질세포주에 대해서는 10 ㎍/mL의 높은 농도에서도 세포독성을 나타내지 않음을 확인하였다.
상기 결과를 통해, BSA-CK는 A549에 대하여 독성을 나타냄으로써 우수한 항암활성을 가짐을 알 수 있었고, 정상 세포에는 작용하지 않는 암세포 특이적인 세포독성을 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 10-2. BSA-Rh2의 세포 독성 확인
BSA-Rh2 나노 복합체의 항암 활성을 분석하기 위하여, 폐암세포에 대한 독성을 확인하였다.
구체적으로, A549 폐암 세포주의 배양과 세포의 생존율은 상기 실시예 4-1에 따른 방법을 수행하여 확인하였다.
그 결과, 도 30의 C 및 D에서 볼 수 있듯이, A549 폐암 세포주에 대하여, BSA-Rh2는 Rh2 단독보다는 약간 낮은 독성을 나타냄을 확인하였다. 아울러, BSA-Rh2는 각질세포주에 대해서는 최대 15 μM의 농도에서도 독성을 나타내지 않았지만, Rh2 단독은 동일한 농도에서 독성을 나타냄을 확인하였다.
상기 결과를 통해, BSA-Rh2는 암세포 특이적인 세포독성을 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 11. BSA-CK 및 BSA-Rh2의 항염 활성 분석
본 발명의 BSA-CK 및 BSA-Rh2 나노 복합체의 항염 활성을 분석하기 위하여, 대식세포에 대한 독성을 하기 실시예 5-1 및 5-2를 통해 확인하였으며, LPS-유도된 대식세포의 NO 생성 저해 활성을 하기 실시예 5-3 및 5-4를 통해 확인하였다.
실시예 11-1. BSA-CK의 항염 활성 분석
실시예 11-1-1. BSA-CK의 세포 독성 확인
BSA-CK 나노 복합체의 항염 활성을 분석하기 위하여, 대식세포에 대한 독성을 확인하였다.
먼저, 쥐 대식세포주(RAW 264.7)를 5 x 103 세포/웰의 밀도로 96-웰 마이크로플레이트에 분주하였다. 이때, 10% 소 태아 혈청(FBS)과 100 IU/mL 페니실린 및 100 ㎍/mL 스트렙토마이신(Gibco-Brl. Gaithersburg, MD, USA)이 보충된 RPMI 1640 배지를 사용하였으며, 5% CO2가 포함된 습윤 대기 조건의 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 이후, 세포의 생존율을 상기 실시예 4-1에 따른 MTT 어세이 방법으로 측정하였다.
그 결과, 도 31의 A에서 볼 수 있듯이, BSA-CK 나노 복합체는 5 ㎍/mL의 농도에서는 대식세포의 생장을 저해하지 않으며, 10 ㎍/mL의 고농도에서 생장을 저해함을 확인하였다.
실시예 11-1-2. BSA-CK의 NO 생산 억제 활성 확인
BSA-CK 나노 복합체의 항염 활성을 분석하기 위하여, 대식세포의 NO 생산 억제 활성을 확인하였다.
구체적으로, 생성된 질산(NO)의 양을 측정하기 위하여, RAW 264.7 세포를 BSA-Rh2, BSA-CK, 진세노사이드 CK 단독 또는 Rh2 단독으로 1시간 동안 선처리하였고, 이후 상기 샘플이 존재하는 조건에서 1 ㎍/㎕의 지질다당류(LPS)로 자극하였다. 세포를 24시간 동안 배양한 후, 세포 배양액의 상층액 100 ㎕를 동등한 부피의 그리스 시약(Griess reagent)과 혼합하였고, 마이크로리더기(Bio-Tek Instruments, Inc.)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준 질산나트륨 곡선을 각 실험에 포함시켰다.
그 결과, 도 31의 B에서 볼 수 있듯이, BSA-CK 나노 복합체는 세포독성을 나타내지 않은 1 ㎍/mL의 낮은 농도에서 대식세포의 NO 생산을 유의하게 저해함을 확인하였다. 또한, CK 단독에 비하여 근소하지만 더 우수한 정도로 대식세포의 NO 생산을 억제함을 확인하였고, 이러한 효과는 BSA-CK 나노 복합체의 농도가 높아질수록 향상됨을 확인하였다.
상기 결과를 통해, BSA-CK는 정상 대식세포주 대하여 직접적으로 독성을 나타내지 않으면서 NO 생산만을 선택적으로 억제함으로써, 우수한 항염활성을 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 11-2. BSA-Rh2의 항염 활성 분석
실시예 11-2-1. BSA-Rh2의 세포 독성 확인
BSA-Rh2 나노 복합체의 항염 활성을 분석하기 위하여, 대식세포에 대한 독성을 확인하였다.
구체적으로, RAW 264.7의 배양과 세포의 생존율은 상기 실시예 5-1-1에 따른 방법을 수행하여 확인하였다.
그 결과, 도 31의 C에서 볼 수 있듯이, BSA-Rh2 나노 복합체는 5 ㎍/mL의 농도에서는 대식세포의 생장을 저해하지 않으며, 10 ㎍/mL의 고농도에서 생장을 저해함을 확인하였다.
실시예 11-2-2. BSA-Rh2의 NO 생산 억제 활성 확인
BSA-Rh2 나노 복합체의 항염 활성을 분석하기 위하여, 대식세포의 NO 생산 억제 활성을 확인하였다.
구체적으로, BSA-Rh2의 처리에 따른 RAW 264.7의 NO 생산 정도는 상기 실시예 5-1-2에 따른 방법을 수행하여 확인하였다.
그 결과, 도 31의 D에서 볼 수 있듯이, BSA-Rh2 나노 복합체는 세포독성을 나타내지 않은 1 ㎍/mL의 낮은 농도에서 대식세포의 NO 생산을 유의하게 저해함을 확인하였다. 또한, Rh2 단독에 비하여 근소하지만 더 우수한 정도로 대식세포의 NO 생산을 억제함을 확인하였고, 이러한 효과는 BSA-Rh2 나노 복합체의 농도가 높아질수록 향상됨을 확인하였다.
상기 결과를 통해, BSA-Rh2는 정상 대식세포주에 대하여 직접적으로 독성을 나타내지 않으면서 NO 생산만을 선택적으로 억제함으로써, 우수한 항염활성을 나타냄을 알 수 있었다.
제조예 3. MSNP-CK 및 MSNP-Rh2의 합성 방법
진세노사이드 CK 또는 Rh2의 타겟 능력 및 반감기를 향상시키기 위하여, 상기 진세노사이드에 메조다공성 실리카 나노입자(Mesoporous silica nanoparticle; MSNP)를 결합시킨 MSNP-CK 또는 MSNP-Rh2 나노 복합체를 합성하였다.
구체적으로, 나노 복합체를 제조하기 위하여, 다음과 같은 시약을 사용하였다. 메조다공성 실리카 나노입자(Mesoporous silica nanoparticle; MSNP, 200 nm, 4 nm의 기공 크기)는 Sigma Aldrich(St. Louis, MO, USA). 사에서 구입하였다. 실리카의 재료로서 테트라에틸 오소실리케이트(Tetraethyl orthosilicate; TEOS, 98%), 3-아미노프로필트리에톡시-살린(3-aminopropyltriethoxy-silane; APTEOS, 98%)을 커플링(coupling) 물질로 사용하였고, 염색시약인 플루오레세인이소티오시안산염(fluorescein isothiocyanate; FITC)를 Aldrich-Sigma Chemical 사(USA)에서 구입하였다. 진세노사이드 CK 및 Rh2는 인삼소재은행(Kyung Hee University, Yongin, South Korea)에서 구입하였다. 다른 모든 화학물질은 분석 수준의 등급인 것을 사용하였다.
MSNP-CK의 합성은 다음과 같은 세 단계를 통해 합성하였다. 1단계로서, 먼저 FITC 250 mg과 순수 에탄올 10 ml을 50 mL 부피의 세 개의 목이 긴 병에 첨가하였다. 이후, 물 2.5 ml과 NH4OH를 첨가하였고, 상온에서 30분 동안 교반하였다. TEOS 15 ml 및 APTMS 200 μL을 상기 혼합 용액에 첨가하였고, 염색 시약의 표백을 방지하기 위하여 암조건에서 12시간 동안 교반하였다. 수득한 FITC/APTMS 복합체는 광표백을 피하기 위하여 빛을 차단한 암조건에서 보관하였다. 상기 제조한 나노 복합체 용액은 사용 전에 에탄올 용매를 제거하기 위하여 증류하였다.
2단계로서, 진세노사이드를 효율적으로 결합시키기 위하여, MSNP를 자유 아민기(amine group)로 기능화하였고, 실리카를 FITC 코팅하였다. 구체적으로, MSNP 100 mg을 톨루엔(toluene) 15 ml에 용해하였고, 혼합액을 잘 분산시키고, 교반하였다. 이후, APTMS 10 μl을 드롭 방식으로 첨가하였고, HCl(1M) 1방울을 첨가하였다. 반응 혼합액을 24시간 동안 교반하였고, 물로 여러 번 헹군 뒤, 건조하였다.
마지막 3단계로서, 진세노사이드에 MSNP를 결합시키기 위하여, 활성화된 MSNP(100 mg)를 물 5 ml에 첨가하였고, 에탄올 10ml에 용해된 진세노사이드 CK(30 mg)를 드롭 방식으로 첨가하였다. FITC 염색 시약이 코팅된 실리카를 추가로 20 mg 첨가하였고, 이후 48시간 동안 교반하였으며, 수득한 나노입자를 10,000 rpm에서 20분 동안 원심분리하였다. 이후, 순수 에탄올로 세 번 헹구고, 반응되지 않은 화학물질을 제거하기 위하여 물로 세 번 헹구었고, 건조하였다. 이후, MSNP-CK 및 MSNP-Rh2를 수득하기 위하여, 투석된 용액을 동결건조하였다.
MSNP-Rh2 나노 복합체도 상기와 같은 방법으로, 진세노사이드 Rh2를 이용하여 합성하였다.
실시예 12. MSNP-CK 및 MSNP-Rh2의 합성 결과 분석
실시예 12-1. MSNP-CK 및 MSNP-Rh2의 진세노사이드 양 확인
MSNP-CK 또는 MSNP-Rh2 나노 복합체에 적재된 진세노사이드의 양은 HPLC를 이용하여 계산하였다.
그 결과, 도 32의 A에서 볼 수 있듯이, MSNP-CK는 CK 단독과 동일한 명확한 피크를 보였고, MSNP-CK에 적재된 CK의 양은 나노 복합체 1 mg 당 0.066 mg임을 확인하였다. 아울러, 도 32의 D에서 볼 수 있듯이, MSNP-Rh2는 단독과 동일한 명확한 피크를 보였고, MSNP-Rh2에 적재된 Rh2의 양은 나노 복합체 1 mg 당 0.072 mg임을 확인하였다.
실시예 12-2. MSNP-CK 및 MSNP-Rh2의 진세노사이드 고유 특성 확인
본 발명의 MSNP-CK 및 MSNP-Rh2 나노 복합체가 잘 제조되었는지 확인하기 위하여, MSNP-CK 및 MSNP-Rh2, 및 이의 중간체의 구조를 1H NMR과 FT-IR을 이용하여 확인하였다.
구체적으로, 1H NMR 스펙트럼은 300 MHz(JEOL, Tokyo, Japan)에서 기록하였고, 샘플은 D 2O 또는 CD 3OD에 용해하였다. FT-IR 스펙트럼은 KBr 펠렛을 이용한 Perkin-Elmer FT-IR 분광광도계를 이용하여 확인하였다.
그 결과, 도 32의 B 및 C에서 볼 수 있듯이, MSNP-CK의 1H NMR 결과와 FTIR의 결과는 CK의 특징적인 피크를 나타냄을 확인하였다. 아울러, 도 32의 E 및 F에서 볼 수 있듯이, MSNP-Rh2의 1H NMR 결과와 FTIR의 결과는 Rh2의 특징적인 피크를 나타냄을 확인하였다.
상기 결과를 통해, MSNP-CK 및 MSNP-Rh2 나노 복합체는 각각 CK 및 Rh2의 고유한 특성을 지니고 있음을 알 수 있었다.
실시예 13. MSNP-CK 및 MSNP-Rh2의 형태 분석
본 발명의 MSNP-CK 및 MSNP-Rh2 나노 복합체의 형태를 확인하기 위하여, 200 kV의 가속 전압으로 작동한 FE-TEM(JEM-2000F, JEOL)을 이용하였다.
구체적으로, FE-TEM 샘플을 준비하기 위하여 샘플 용액의 한 방울을 탄소가 코팅된 200-메쉬(mesh) 구리 그리드(grid)에 두어 자연건조하였고, 상기 샘플은 인산염-완충된 살린(PBS, pH 7.4) 또는 아세테이트 버퍼(pH 5.0)에 분산시켰다.
그 결과, 도 33의 A 및 B에서 볼 수 있듯이, MSNP-CK 및 MSNP-Rh2는 균일한 크기 분포를 갖는 구의 형태를 가짐을 확인하였다.
실시예 14. MSNP-CK 및 MSNP-Rh2의 항암 활성 분석
본 발명의 MSNP-CK 및 MSNP-Rh2 나노 복합체의 항암 활성을 분석하기 위하여, 폐암 세포에 대한 독성을 하기 실시예 3-1 및 3-2를 통해 확인하였다.
실시예 14-1. MSNP-CK의 세포 독성 확인
MSNP-CK 나노 복합체의 항암 활성을 분석하기 위하여, 폐암세포에 대한 독성을 확인하였다.
먼저, 인간 폐암 세포(A549)를 10% 소 태아 혈청(FBS)과 100 IU/mL 페니실린 및 100 ㎍/mL 스트렙토마이신(Gibco-Brl. Gaithersburg, MD, USA)이 보충된 RPMI 1640 배지에서 배양하였다. 세포를 5% CO2가 포함된 습윤 대기 조건의 37℃에서 배양하였다.
이후, 세포 생존율을 MTT(3, 4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2-5-diphenyletrazolium bromide) 어세이를 이용하여 평가하였다. 구체적으로, 세포를 1 × 105 세포/mL의 밀도로 96-웰 플레이트에 분주하였고, 24시간 동안 배양 후, 다양한 농도의 MSNP-Rh2, MSNP-CK, 진세노사이드 CK 또는 Rh2를 세포에 24시간 동안 처리하였다. 지정된 배양시간이 끝난 후, MTT 스톡 용액(5 mg/ml) 10 ㎕를 각 웰에 넣었고, 4시간 동안 배양하였다. 이후, 상층액을 제거하고, DMSO 100 ㎕를 상기 웰에 넣었다. 생존한 세포에 의해 형성되는 포마잔(formazan)의 양을 multi-model 플레이트 리더기를 이용하여 570 nm의 파장에서 측정하였으며, 기준파장은 630 nm로 하였다. 추가로, 각질 세포주(keratinocyte)에 대한 세포독성을 상기와 같은 방법으로 측정하였다.
그 결과, 도 34의 A 및 B에서 볼 수 있듯이, A549 폐암 세포주에 대하여, MSNP-CK 나노 복합체는 1 ㎍/mL의 낮은 농도에서 약 50% 정도의 세포 성장을 저해하는 상당히 높은 세포독성을 나타냄을 확인하였고, 10 ㎍/mL의 농도에서는 약 90% 이상의 세포독성을 나타냄을 확인하였다. 또한, CK 단독에 비하여 월등히 우수한 세포 독성을 나타냄을 확인하였다. 반면, 각질세포주에 대해서는 15 ㎍/mL의 높은 농도에서도 세포독성을 나타내지 않음을 확인하였다.
상기 결과를 통해, MSNP-CK는 A549에 대하여 독성을 나타냄으로써 우수한 항암활성을 가짐을 알 수 있었고, 정상 세포에는 작용하지 않는 암세포 특이적인 세포독성을 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 3-2. MSNP-Rh2의 세포 독성 확인
MSNP-Rh2 나노 복합체의 항암 활성을 분석하기 위하여, 폐암세포에 대한 독성을 확인하였다.
구체적으로, A549 폐암 세포주의 배양과 세포의 생존율은 상기 실시예 3-1에 따른 방법을 수행하여 확인하였다.
그 결과, 도 35의 C 및 D에서 볼 수 있듯이, A549 폐암 세포주에 대하여, MSNP-Rh2 나노 복합체는 1 ㎍/mL의 낮은 농도에서 약 50% 정도의 세포 성장을 저해하는 상당히 높은 세포독성을 나타냄을 확인하였고, 15 ㎍/mL의 농도에서는 약 90% 이상의 세포독성을 나타냄을 확인하였다. 또한, CK 단독에 비하여 월등히 우수한 세포 독성을 나타냄을 확인하였다. 반면, 각질세포주에 대해서는 15 ㎍/mL의 높은 농도에서도 세포독성을 나타내지 않음을 확인하였다.
상기 결과를 통해, MSNP-Rh2는 A549에 대하여 독성을 나타냄으로써 우수한 항암활성을 가짐을 알 수 있었고, 정상 세포에는 작용하지 않는 암세포 특이적인 세포독성을 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 15. MSNP-CK 및 MSNP-Rh2의 항염 활성 분석
본 발명의 MSNP-CK 및 MSNP-Rh2 나노 복합체의 항염 활성을 분석하기 위하여, 대식세포에 대한 독성을 하기 실시예 15-1-1 및 15-2-1를 통해 확인하였으며, LPS-유도된 대식세포의 NO 생성 저해 활성을 하기 실시예 15-1-2 및 15-2-2를 통해 확인하였다.
실시예 15-1. MSNP-CK의 항염 활성 분석
실시예 15-1-1. MSNP-CK의 세포 독성 확인
MSNP-CK 나노 복합체의 항염 활성을 분석하기 위하여, 대식세포에 대한 독성을 확인하였다.
먼저, 쥐 대식세포주(RAW 264.7)를 5 x 103 세포/웰의 밀도로 96-웰 마이크로플레이트에 분주하였다. 이때, 10% 소 태아 혈청(FBS)과 100 IU/mL 페니실린 및 100 ㎍/mL 스트렙토마이신(Gibco-Brl. Gaithersburg, MD, USA)이 보충된 RPMI 1640 배지를 사용하였으며, 5% CO2가 포함된 습윤 대기 조건의 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 이후, 세포의 생존율을 상기 실시예 3-1에 따른 MTT 어세이 방법으로 측정하였다.
그 결과, 도 35의 A에서 볼 수 있듯이, MSNP-CK 나노 복합체는 5 ㎍/mL의 농도에서는 대식세포의 생장을 저해하지 않으며, 10 ㎍/mL의 고농도에서 생장을 저해함을 확인하였다.
실시예 15-1-2. MSNP-CK의 NO 생산 억제 활성 확인
MSNP-CK 나노 복합체의 항염 활성을 분석하기 위하여, 대식세포의 NO 생산 억제 활성을 확인하였다.
구체적으로, 생성된 질산(NO)의 양을 측정하기 위하여, RAW 264.7 세포를 MSNP-Rh2, MSNP-CK, 진세노사이드 CK 단독 또는 Rh2 단독으로 1시간 동안 선처리하였고, 이후 상기 샘플이 존재하는 조건에서 1 ㎍/㎕의 지질다당류(LPS)로 자극하였다. 세포를 24시간 동안 배양한 후, 세포 배양액의 상층액 100 ㎕를 동등한 부피의 그리스 시약(Griess reagent)과 혼합하였고, 마이크로리더기(Bio-Tek Instruments, Inc.)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준 질산나트륨 곡선을 각 실험에 포함시켰다.
그 결과, 도 35의 B에서 볼 수 있듯이, MSNP-CK 나노 복합체는 세포독성을 나타내지 않은 1 ㎍/mL의 낮은 농도에서 대식세포의 NO 생산을 유의하게 저해함을 확인하였다. 또한, CK 단독에 비하여 근소하지만 더 우수한 정도로 대식세포의 NO 생산을 억제함을 확인하였고, 이러한 효과는 MSNP-CK 나노 복합체의 농도가 높아질수록 향상됨을 확인하였다.
상기 결과를 통해, MSNP-CK는 정상 대식세포주 대하여 직접적으로 독성을 나타내지 않으면서 NO 생산만을 선택적으로 억제함으로써, 우수한 항염활성을 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 15-2. MSNP-Rh2의 항염 활성 분석
실시예 15-2-1. MSNP-Rh2의 세포 독성 확인
MSNP-Rh2 나노 복합체의 항염 활성을 분석하기 위하여, 대식세포에 대한 독성을 확인하였다.
구체적으로, RAW 264.7의 배양과 세포의 생존율은 상기 실시예 4-1-1에 따른 방법을 수행하여 확인하였다.
그 결과, 도 35의 C에서 볼 수 있듯이, MSNP-Rh2 나노 복합체는 5 ㎍/mL의 농도에서는 대식세포의 생장을 저해하지 않으며, 10 ㎍/mL의 고농도에서 생장을 저해함을 확인하였다.
실시예 15-2-2. MSNP-Rh2의 NO 생산 억제 활성 확인
MSNP-Rh2 나노 복합체의 항염 활성을 분석하기 위하여, 대식세포의 NO 생산 억제 활성을 확인하였다.
구체적으로, MSNP-Rh2의 처리에 따른 RAW 264.7의 NO 생산 정도는 상기 실시예 4-1-2에 따른 방법을 수행하여 확인하였다.
그 결과, 도 35의 D에서 볼 수 있듯이, MSNP-Rh2는 세포독성을 나타내지 않은 1 ㎍/mL의 낮은 농도에서 대식세포의 NO 생산을 유의하게 저해함을 확인하였다. 또한, Rh2 단독에 비하여 근소하지만 더 우수한 정도로 대식세포의 NO 생산을 억제함을 확인하였고, 이러한 효과는 MSNP-Rh2 나노 복합체의 농도가 높아질수록 향상됨을 확인하였다.
상기 결과를 통해, MSNP-Rh2는 정상 대식세포주에 대하여 직접적으로 독성을 나타내지 않으면서 NO 생산만을 선택적으로 억제함으로써, 우수한 항염활성을 나타냄을 알 수 있었다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (19)

  1. 나노 약물전달체; 및 인삼추출물 또는 이로부터 분리된 진세노사이드를 포함하는 나노 복합체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 나노 약물전달체는 금속 나노입자, BSA(Bovine serum albumin) 또는 메조다공성 실리카 나노입자(Mesoporous silica nanoparticle)인 것인, 나노 복합체.
  3. 제2항에 있어서, 상기 금속은 금(Au), 은(Ag), 구리(Cu), 팔라듐(Pd), 백금(Pt) 및 로듐(Rd)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것인, 나노 복합체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 인삼추출물은 인삼(panax ginseng) 잎 추출물, 인삼(panax ginseng) 뿌리 추출물 및 홍삼(red ginseng) 뿌리 추출물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것인, 나노 복합체.
  5. 제1항에 있어서, 상기 인삼추출물은 물, C1 내지 C4의 알코올 및 이들의 혼합 용매로 구성되는 군으로부터 선택되는 용매로 추출된 것인, 나노 복합체.
  6. 제1항에 있어서, 상기 인삼추출물로부터 분리된 진세노사이드는 진세노사이드 화합물 K(Compound K) 또는 진세노사이드 Rh2인 것인, 나노 복합체.
  7. 제1항에 있어서, 상기 나노 복합체 1 mg 당 0.05 내지 0.15 mg의 진세노사이드를 포함하는 것인, 나노 복합체.
  8. 제2항에 있어서, 크기가 5 내지 40 nm인 것인, 나노 복합체.
  9. 제1항의 나노 복합체를 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 암은 폐암인 것인, 약학적 조성물.
  11. 제1항의 나노 복합체를 포함하는, 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 염증성 질환은 크론씨병, 홍반병, 아토피, 류마티스 관절염, 하시모토 갑상선염, 악성빈혈, 에디슨씨 병, 제1형 당뇨, 루프스, 만성피로증후군, 섬유근육통, 갑상선기능저하증과 항진증, 경피증, 베체트병, 염증성 장질환, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 메니에르 증후군(Meniere's syndrome), 길리안-바레 증후군(Guilian-Barre syndrome), 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 백반증, 자궁내막증, 건선, 백반증,　전신성 경피증 및 궤양성 대장염으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  13. 제1항의 나노 복합체를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법.
  14. 제1항의 나노 복합체를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 염증성 질환을 치료하는 방법.
  15. 나노 약물전달체; 및 인삼추출물 또는 이로부터 분리된 진세노사이드를 혼합하여 반응시키는 단계를 포함하는, 나노 복합체의 제조방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 나노 약물 전달체는 금속 나노입자이며, 상기 반응은 10 내지 100℃에서 수행되며, 상기 반응에 사용되는 금속 전구체의 농도는 0.01 내지 100mM인 것인, 나노 복합체의 제조방법.
  17. 제16항에 있어서, 반응액을 원심분리하여 나노 전달체를 회수하는 단계를 추가로 포함하는, 나노 복합체의 제조방법.
  18. 제13항에 있어서, 상기 나노 약물 전달체는 BSA(Bovine serum albumin)이며, 상기 단계에서 혼합하여 얻은 반응액을 투석하는 단계를 포함하는, 나노 복합체의 제조방법.
  19. 제13항에 있어서, 상기 나노 약물 전달체는 메조다공성 실리카 나노입자이고 APTEOS(3-aminopropyltriethoxy-silane)의 자유 아민기(amine group)로 기능화 된 것인, 나노 복합체의 제조 방법.
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