WO2017109828A1 - 色素含有熱硬化性樹脂粒子の製造方法 - Google Patents

色素含有熱硬化性樹脂粒子の製造方法 Download PDF

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健作 高梨
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Definitions

  • the present invention relates to a method for producing dye-containing thermosetting resin particles that can be used for immunostaining performed in immunological observation.
  • tissue sample obtained by slicing a tissue specimen obtained by organ excision or needle biopsy to a thickness of about several microns is tissue. It is widely performed to make a specimen and to observe it with an optical microscope. Specifically, immunostaining, called immunostaining, is performed to diagnose functional abnormalities such as abnormal expression of genes and proteins after staining to confirm the expression of antigens and genes to be detected contained in tissue specimens. It is done.
  • staining methods used for immunostaining include dye staining methods using enzymes such as DAB staining.
  • an enzyme staining method such as the DAB staining method has a drawback in that it is difficult to calculate the actual amount of antigen or the like from the staining concentration because the staining concentration greatly depends on environmental conditions such as temperature and time. .
  • the fluorescent labeling method is a method of measuring the amount of antigen by staining and observing an antigen of interest using an antibody modified with a fluorescent dye as a fluorescent label.
  • an antigen of interest on a pathological tissue section is labeled by binding an antibody modified with a resin particle containing a fluorescent dye (hereinafter also referred to as a fluorescent dye-containing resin particle), and this is observed with a fluorescence microscope.
  • the fluorescent dye-containing resin particles are characterized by high brightness and capable of measuring the number of particles. By observing the bright spots derived from the fluorescent dye-containing resin particles appearing in the fluorescence microscopic image of the tissue section, the state and amount of the antigen can be confirmed.
  • the number of fluorescent dye-containing resin particles is measured by obtaining the luminance per resin particle based on a calibration curve. For this reason, if the luminescent spot intensity varies for each fluorescent dye-containing resin particle, the determination accuracy of the fluorescent signal emitted from the resin particle deteriorates. As a cause of the variation in the intensity of the bright spot, there is a variation in the particle diameter of the fluorescent dye-containing resin particles. That is, the luminance changes depending on the particle size of the fluorescent dye-containing resin particles, and the luminance decreases when the particle size of the dye-containing resin particles is small. When the resin particles are present, there arises a problem that a fluorescent signal is not detected despite the presence of the fluorescent dye-containing resin particles. Conversely, if there are fluorescent dye-containing resin particles with a particle size that has a luminance far exceeding the fluorescence signal detection threshold, there is a problem that the bright spots are fused together by saturation, making it impossible to distinguish individual bright spots. To do.
  • Fluorescent dye-containing resin particles are generally produced by polymerizing monomers in the presence of a fluorescent dye.
  • the fluorescent dye-containing resin particles obtained by the conventional production method have a particle diameter variation coefficient of about 10 to 15% and a large variation in the particle diameter. Detection accuracy is low. In order to obtain fluorescent dye-containing resin particles with high detection accuracy of the number of bright spots, it was necessary to perform post-treatment such as centrifuging the produced fluorescent dye-containing resin particles to make the particle diameters uniform.
  • the fluorescent dye tends to ooze into the oil-based encapsulant used for the preparation of the permanent slice, and thus the determination accuracy of the fluorescent signal tends to deteriorate.
  • the present invention is to provide a method for producing resin particles containing a dye such as a fluorescent dye (hereinafter also referred to as dye-containing resin particles) that can be detected with high accuracy.
  • a dye such as a fluorescent dye (hereinafter also referred to as dye-containing resin particles) that can be detected with high accuracy.
  • the present invention relates to a dye-containing heat in which seed particles formed of a thermosetting resin are dispersed in a dispersion medium, and a monomer for thermosetting resin synthesis is polymerized in the obtained dispersion in the presence of the dye and an acid catalyst. This is a method for producing curable resin particles.
  • the seed particles preferably have an average particle diameter of 20 to 150 nm.
  • the acid catalyst is preferably a mixture of two acids including dodecylbenzenesulfonic acid.
  • the dye-containing thermosetting resin particles preferably have an average particle diameter of 60 to 750 nm.
  • a resin obtained by polymerizing a monomer for thermosetting resin synthesis in the dispersion is formed from melamine, urea, guanamine, phenol, xylene or a derivative thereof. It is preferable that the structural unit is included.
  • thermosetting resin forming the seed particles is the same type as a thermosetting resin obtained by polymerizing a monomer for thermosetting resin synthesis in the dispersion. Preferably there is.
  • the seed particles can be prepared by polymerizing a monomer for thermosetting resin synthesis.
  • the seed particle can be produced by polymerizing a monomer for thermosetting resin synthesis in the presence of a dye.
  • the dye existing at the time of producing the seed particles can be the same as the dye existing at the time of polymerization of the thermosetting resin synthesis monomer in the dispersion.
  • the dye is preferably an organic fluorescent dye.
  • the organic fluorescent dye is preferably rhodamine or an aromatic dye.
  • pigment-containing resin particles having a small coefficient of variation in particle diameter for example, 8% or less
  • post-treatment such as centrifugation.
  • the dye-containing resin particles produced by the method for producing the dye-containing thermosetting resin particles of the present invention the dye is hardly separated from the resin particles. For this reason, when immunological observation is performed by a fluorescent labeling method using fluorescent dye-containing resin particles produced by the method of producing the dye-containing thermosetting resin particles of the present invention, bleeding of bright spots is suppressed during fluorescent observation. can do.
  • thermosetting resin particle In the method for producing a dye-containing thermosetting resin particle according to the present invention, seed particles formed from the thermosetting resin are dispersed in a dispersion medium, and the resulting dispersion is heated in the presence of the dye and the acid catalyst. A monomer for synthesizing the curable resin is polymerized.
  • the pigment-containing thermosetting resin particles are particles formed from a thermosetting resin, and are particles containing a pigment.
  • thermosetting resin is not particularly limited as long as it can contain a pigment. Specific examples thereof include melamine, urea, guanamine, phenol, xylene, or a structural unit formed from a melamine, urea, guanamine, phenol, or xylene derivative.
  • the thermosetting resin which consists of a polymer containing can be mentioned.
  • the seed particles are particles that become seeds of the dye-containing thermosetting resin particles.
  • a thermosetting resin is formed on the surface of the seed particles, and the particles grow to become dye-containing thermosetting resin particles.
  • the average particle diameter of the seed particles is preferably 20 to 150 nm, more preferably 40 to 120 nm, still more preferably 60 to 100 nm.
  • the coefficient of variation of the particle diameter of the dye-containing resin particles can be reduced, specifically, 8% or less.
  • the variation coefficient of the particle diameter of the seed particles is not particularly limited, but is usually 8 to 14%, preferably 8 to 12%.
  • the average particle diameter and the coefficient of variation of the particle diameter of the resin particles shown in the present invention are obtained by performing SEM observation of the resin particles, arbitrarily measuring the particle diameter of 1000 resin particles from the obtained SEM image, and from the measured values. The calculated average particle size and coefficient of variation.
  • the seed particles are formed of the thermosetting resin.
  • the thermosetting resin forming the seed particles may be different from the thermosetting resin obtained by polymerizing the monomer for thermosetting resin synthesis in the dispersion, but is preferably the same type.
  • the seed particles can be produced, for example, by polymerizing a monomer for thermosetting resin synthesis by a dispersion polymerization method or the like.
  • the thermosetting resin forming the seed particles is the same type as the thermosetting resin obtained by polymerizing the thermosetting resin synthesis monomer in the dispersion
  • the thermosetting resin synthesis used for the preparation of the seed particles The monomer for use can be the same type as the monomer for thermosetting resin synthesis used for polymerization in the dispersion.
  • the monomer for thermosetting resin synthesis will be described later.
  • the dispersion polymerization method for example, a monomer for thermosetting resin synthesis, an acid catalyst, a surfactant, and the like are dissolved in a dispersion medium, polymerized with stirring, and particles generated in the dispersion medium are filtered and obtained.
  • the acid catalyst include dodecylbenzenesulfonic acid, sulfamic acid, formic acid, acetic acid, sulfuric acid, hydrochloric acid, nitric acid, and paratoluenesulfonic acid.
  • the surfactant will be described later.
  • a solvent such as N, N-dimethylformamide (DMF), ethanol, dimethyl sulfoxide (DMSO), acetone, acetonitrile, tetrahydrofuran (THF), dioxane or the like may be mixed with water.
  • a liquid material capable of carrying out the polymerization can be selected and used.
  • thermosetting resin synthesis monomer The blending amount of the thermosetting resin synthesis monomer, the acid catalyst, the emulsifier, and the like, the polymerization temperature, and the polymerization time can be appropriately determined according to the thermosetting resin synthesis monomer, the acid catalyst, and the like.
  • seed particles formed of melamine resin can be produced by the following process.
  • An emulsion emulsifier for emulsion polymerization “Emulgen (registered trademark)” polyoxyethylene oleyl ether, manufactured by Kao Corporation
  • Emgen registered trademark
  • Polyoxyethylene oleyl ether polyoxyethylene oleyl ether, manufactured by Kao Corporation
  • melamine resin raw material “Nicalak MX-035” manufactured by Nippon Carbide Industries Co., Ltd.
  • 10% aqueous solution of dodecylbenzenesulfonic acid manufactured by Kanto Chemical Co., Ltd.
  • the temperature is raised to 88 to 92 ° C. and stirred for 20 to 40 minutes.
  • a dispersion containing resin particles is obtained by the above steps. The resin particles are separated from the dispersion and used as seed particles.
  • the polymerization of the thermosetting resin synthesis monomer may be carried out in the presence of a pigment.
  • the polymer produced by the polymerization grows while wrapping the dye, so that seed particles containing the dye can be obtained. Since the polymer produced by this polymerization has a three-dimensional network structure, the dye encapsulated in the polymer is not easily detached from the seed particles.
  • the pigment may be added to water together with an emulsifier in the above step.
  • the dye used when preparing the seed particles can be the same type as the dye present during the polymerization of the thermosetting resin synthesis monomer in the dispersion. The dye will be described later.
  • the seed particles produced as described above may contain unreacted monomers for thermosetting resin synthesis, it is preferable to remove these impurities by washing with pure water or the like. If the seed particles contain an unreacted thermosetting resin synthesis monomer, it may be difficult to reduce the coefficient of variation in the particle diameter of the dye-containing resin particles.
  • Centrifugation or the like can be used for separation of the resin particles from the dispersion and washing with pure water or the like.
  • the seed particles are dispersed in a dispersion medium, and a monomer for thermosetting resin synthesis is polymerized in the obtained dispersion in the presence of the dye and the acid catalyst.
  • the dispersion medium is not particularly limited, but water can be suitably used.
  • a mixture of water and a solvent such as N, N-dimethylformamide (DMF), ethanol, dimethyl sulfoxide (DMSO), acetone, acetonitrile, tetrahydrofuran (THF), or dioxane may be used.
  • a liquid material capable of carrying out the polymerization can be selected and used.
  • thermosetting resin synthesis Add monomer for thermosetting resin synthesis, acid catalyst and dye to dispersion medium.
  • the order of adding seed particles, thermosetting resin synthesis monomer, acid catalyst and dye to the dispersion medium is as follows. First, the dye, seed particles and thermosetting resin synthesis monomer are added to the dispersion medium, and finally the acid catalyst is added. It is preferable to add.
  • the monomer for thermosetting resin synthesis means a compound that becomes a thermosetting resin by polymerization.
  • examples of the thermosetting resin synthesis monomer include melamine, urea, guanamine, phenol, xylene, and melamine, urea, guanamine, phenol, and xylene derivatives.
  • thermosetting resin synthesis a melamine resin is obtained by polymerization, and if urea or a derivative thereof is used, a urea resin is obtained by the polymerization, and if guanamine or a derivative thereof is used, A guanamine resin is obtained by the polymerization, and if phenol or a derivative thereof is used, a phenol resin is obtained by the polymerization. If xylene or a derivative thereof is used, a xylene resin is obtained by the polymerization.
  • the thermosetting resin synthesis monomer used for the preparation of the seed particles is the same as the thermosetting resin synthesis monomer described here.
  • the addition amount of the thermosetting resin synthesis monomer required for the target particle size can be obtained by calculation.
  • the number of seed particles to be introduced is 6.0 ⁇ 10 14 or less, and the monomer amount is determined based on the number of particles in this range.
  • the coefficient of variation of the particle diameter of the dye-containing resin particles can be easily reduced, and can be preferably 8% or less.
  • the acid catalyst is a catalyst for the polymerization reaction of the monomer for thermosetting resin synthesis, and promotes the formation of resin particles.
  • the monomer for thermosetting resin synthesis is polymerized using the acid catalyst in the seed particle dispersion, the coefficient of variation of the particle diameter of the dye-containing resin particles can be reduced, specifically 8% or less.
  • the acid catalyst include dodecylbenzenesulfonic acid, sulfamic acid, formic acid, acetic acid, sulfuric acid, hydrochloric acid, nitric acid, paratoluenesulfonic acid, and the like.
  • dodecylbenzenesulfonic acid and other acids such as dodecylbenzenesulfonic acid and sulfamic acid, dodecylbenzenesulfonic acid and formic acid, dodecylbenzenesulfonic acid and acetic acid, dodecylbenzenesulfonic acid and paratoluenesulfonic acid are particularly preferable.
  • the amount of acid catalyst added is usually 30 to 200 mg, preferably 50 to 150 mg, with respect to 20 mL of water.
  • the dye is not particularly limited, but an organic fluorescent dye is preferable when the dye-containing resin particles are used for immunostaining.
  • the organic fluorescent dye can be selected from dyes of various systems such as rhodamine dyes, BODIPY (registered trademark, manufactured by Invitrogen), squarylium dyes, aromatic dyes, and the like.
  • aromatic dyes such as aromatic hydrocarbon dyes, rhodamine dyes and the like are preferable because of their relatively high light resistance, and among them, perylene, pyrene, and perylene belonging to aromatic dyes.
  • Diimide is preferred.
  • rhodamine dyes and perylene diimide are excellent in quantum yield, light absorption, and the like, and are excellent in luminous efficiency. Therefore, resin particles containing these have excellent emission intensity compared to resin particles containing other dyes.
  • rhodamine dyes include 5-carboxy-rhodamine, 6-carboxy-rhodamine, 5,6-dicarboxy-rhodamine, rhodamine 6G, tetramethylrhodamine, X-rhodamine, Texas Red, Spectrum Red, LD700 PERCHLORATE, those Derivatives and the like.
  • BODIPY dye examples include BODIPY FL, BODIPY TMR, BODIPY 493/503, BODIPY 530/550, BODIPY 558/568, BODIPY 564/570, BODIPY 576/589, BODIPY 581/591, 3061 BODIPY 650/665 (manufactured by Invitrogen), derivatives thereof and the like.
  • squarylium-based dye examples include SRfluor680-Carboxylate, 1,3-Bis [4- (dimethylamino) -2-hydroxyphenyl] -2,4-dihydroxycyclobutenedidium dihydroxide, bis, 1,3-bis (1,3-Bis (1,3-Bis) phenyl] -2,4-dihydroxycyclobutenedidium dihydroxide, bis, 2- (4- (Diethylamino) -2-hydroxyphenyl) -4- (4- (diethyliminothio) -2-hydroxy-cyclodioxy-3cyclo-cyclodioxy-3cyclo-cyclodioxy-3cyclo-cyclodioxy-3cyclo-cyclo-cyclo-cyclo-cyclo-cyclo-cyclo-cyclo-cyclo-cyclo-cyclo-cyclo-cyclo-cyclo-cyclo-cyclo-cyclo-cyclo-cyclo-cyclo-cyclo-cyclo-cyclo-cyclo-cycl
  • aromatic hydrocarbon dye examples include N, N-Bis- (2,6-diisopropylphenyl) -1,6,7,12- (4-tert-butylphenoxy) -perylene-3,4,9, 10-tetracarbonacidimide, N, N′-Bis (2,6-diisopropyphenyl) -1,6,7,12-tetraphenoxyperylene-3, 4: 9,10-tetracarbodiimide, N, N′-bis (2,6-pylido (2,6-pylidine) ) Perylene-3,4,9,10-bis (dicarbimide), 16, N, N'-Bis (2,6-dimethylphenyl) perylene-3,4,9,10-tetracarb xylicimide, 4,4 ′-[(8,16-Dihydro-8,16-dioxodibenzo [a, j] perylene-2,10-diyl) dioxy]
  • the amount of the pigment added is usually 17 to 27 mg, preferably 20 to 25 mg, based on 1 g of the thermosetting resin synthesis monomer.
  • the dye used for preparing the seed particles is the same as the dye described here.
  • the average particle size of the dye-containing thermosetting resin particles produced as described above is preferably 60 to 750 nm, and more preferably 60 to 500 nm.
  • a surfactant to the dispersion.
  • the particle diameter of the obtained pigment-containing resin particles can be adjusted.
  • the surfactant is added in an amount of 10 to 60% by weight based on the thermosetting resin synthesis monomer, particles having a particle size of 30 to 300 nm can be easily produced.
  • the ratio of the surfactant is increased, the particle diameter can be reduced, and particles of 30 nm or less can be produced.
  • the ratio of the surfactant is reduced, the particle diameter can be increased, and particles of 300 nm or more can be produced.
  • anionic surfactant examples include sodium dodecylbenzenesulfonate.
  • nonionic surfactants examples include polyethylene glycol and polyoxyethylene alkyl ether.
  • cationic surfactant examples include dodecyltrimethylammonium bromide.
  • Emulgen registered trademark, manufactured by Kao Corporation
  • Neoperex registered trademark, manufactured by Kao Corporation
  • the active ingredient of emulgen is polyoxyethylene alkyl ether
  • the active ingredient of neoperex is sodium dodecylbenzenesulfonate.
  • the surfactant it is necessary to select a surfactant having a cloud point higher than the thermosetting reaction temperature in the polymerization step.
  • a surfactant having a cloud point lower than the thermosetting reaction temperature the surfactant loses its hydration power with water and does not perform its function, and resin particles cannot be formed, resulting in a resin mass. Because it ends up.
  • the surfactant used for the preparation of the seed particles is the same as the surfactant described here.
  • the reaction conditions such as the thermosetting temperature and the polymerization time in the polymerization of the thermosetting resin synthesis monomer are determined according to the type of the thermosetting resin synthesis monomer, and can be determined according to a known method.
  • the reaction conditions need to be within the reaction conditions where the performance of the dye does not deteriorate, that is, within the heat resistant temperature range of the dye.
  • thermosetting resin when the thermosetting resin is a melamine resin, the polymerization reaction of the thermosetting resin synthesizing monomer is usually performed at 70 to 200 ° C., preferably 150 to 200 ° C.
  • the heat resistant temperature of the dye is, for example, 200 ° C. for rhodamine dyes, 200 ° C. for BODIPY (registered trademark, manufactured by Invitrogen), 200 ° C. for squarylium dyes, and 300 ° C. or more for aromatic hydrocarbon dyes. It is necessary to make the reaction conditions that the dyes can withstand.
  • thermosetting resin particles having seed particles in the center and thermosetting resin in the outer periphery are formed. Since the polymer produced in this polymerization reaction grows while wrapping the pigment, the pigment is contained in the thermosetting resin in the outer peripheral portion, and the formed particles become pigment-containing thermosetting resin particles.
  • the seed particles contain a dye, dye-containing thermosetting resin particles in which both the seed particles and the outer peripheral portion contain the dye are obtained.
  • the dye encapsulated in the polymer is not easily detached from the resin particles. If the polymerization reaction is inadequate and the detachment of the dye from the dye-containing resin particles occurs, the dye-containing resin particles are at a temperature lower than the decomposition temperature or melting temperature of the resin, and the dye and resin particles are adversely affected. Further heat treatment may be performed at a non-temperature, and heat curing, that is, crosslinking may be promoted to suppress separation of the dye.
  • the dye-containing thermosetting resin particles generated by this reaction are dispersed in the reaction solution, the dye-containing resin particles are separated from the reaction solution by centrifugation or the like. Since the obtained dye-containing resin particles usually contain unreacted thermosetting resin synthesis monomer, excess dye, acid catalyst, etc., the obtained dye-containing resin particles are washed to remove these impurities. Is preferably removed. For example, washing is performed by adding ultrapure water to the resin separated from the reaction solution, dispersing again by ultrasonic irradiation, and centrifuging to remove the supernatant.
  • the series of washing operations such as redispersion in ultrapure water, centrifugation, and removal of the supernatant is preferably repeated a plurality of times until no absorbance or fluorescence derived from the resin or pigment is observed in the supernatant.
  • the pigment-containing thermosetting resin particles produced by the production method of the present invention have a small coefficient of variation in particle diameter, specifically 8% or less. That is, the dye-containing thermosetting resin particles produced by the production method of the present invention have high monodispersity. For this reason, when immunological observation is performed by the fluorescent labeling method using the fluorescent dye-containing resin particles produced by the method for producing the dye-containing thermosetting resin particles of the present invention, the bright spots due to the particle size variation of the resin particles Since the intensity variation is small, the bright spot detection accuracy is high, the pigment-containing resin particles can be detected with high accuracy, and the number of particles can be accurately measured.
  • the dye-containing resin particles produced by the method for producing the dye-containing thermosetting resin particles of the present invention are contained in a state where the dye is wrapped with a polymer having a three-dimensional network structure. Therefore, the coloring matter is held by the resin particles and is not easily detached to the outside of the resin particles. For this reason, when immunological observation is performed by the fluorescent labeling method using the fluorescent dye-containing resin particles produced by the method for producing the dye-containing thermosetting resin particles of the present invention, the bright spot bleeding that occurs during the fluorescent observation is observed. Can be suppressed.
  • thermoplastic resin instead of a thermosetting resin in the above production method
  • dye-containing resin particles having a small coefficient of variation in particle diameter are obtained, but the polymer constituting this has a three-dimensional network structure. Therefore, it is difficult to encapsulate the dye with the polymer, and the dye tends to be released to the outside of the resin particles. For this reason, when immunological observation is performed by a fluorescent labeling method using fluorescent dye-containing resin particles obtained by using a thermoplastic resin, bright spots are likely to blur during fluorescent observation.
  • Example 1 Preparation of seed particles 5 of “Emulgen (registered trademark) 430” (polyoxyethylene oleyl ether, manufactured by Kao Corporation) as an emulsifier for emulsion polymerization was added to a solution obtained by dissolving 4.4 mg of perylene diimide as a fluorescent dye in 20 mL of water. 2 mL of a mass% aqueous solution was added. This solution was heated to 70 ° C. while stirring on a hot stirrer, and then 0.14 g of “Nicarac MX-035” (manufactured by Nippon Carbide Industries Co., Ltd.), a melamine resin raw material, was added to this solution as a solid content.
  • “Emulgen (registered trademark) 430” polyoxyethylene oleyl ether, manufactured by Kao Corporation
  • Separation of the resin particles from the obtained dispersion of resin particles, and washing for removing impurities such as excess resin raw materials and fluorescent dyes adhering to the resin particles were performed as follows.
  • the dispersion is centrifuged at 20000 G for 90 minutes in a centrifuge (Kubota Co., Ltd., micro cooling centrifuge 3740), the supernatant is removed, ultrapure water is added to the separated particles, and ultrasonic irradiation is performed. Went and redispersed.
  • the treatment by centrifugation, removal of the supernatant and redispersion in ultrapure water was repeated 5 times.
  • the obtained resin particles were used as seed particles 1.
  • the average particle size of the seed particles 1 was 20 nm, and the variation coefficient of the particle size was 12%.
  • Piggen (registered trademark) 430 polyoxyethylene oleyl ether, manufactured by Kao Corporation
  • an emulsifier for emulsion polymerization in a solution obtained by adding 1.9 mg of fluorescent dye perylene diimide to 20 mL of water and dissolving it 2 mL of 5 mass% aqueous solution of was added. The solution was heated to 70 ° C.
  • Separation of the resin particles from the obtained dispersion of resin particles, and washing for removing impurities such as excess resin raw materials and fluorescent dyes adhering to the resin particles were performed as follows.
  • the dispersion is centrifuged at 20000 G for 90 minutes in a centrifuge (Kubota Co., Ltd., micro cooling centrifuge 3740), the supernatant is removed, ultrapure water is added to the separated particles, and ultrasonic irradiation is performed. Went and redispersed.
  • the treatment by centrifugation, removal of the supernatant and redispersion in ultrapure water was repeated 5 times.
  • the obtained resin particles were designated as dye-containing thermosetting resin particles 1.
  • the average particle size of the dye-containing thermosetting resin particles 1 was 50 nm, and the coefficient of variation of the particle size was 10%.
  • the pigment-containing thermosetting resin particles 1 were evaluated for bright spot variation and pigment retention. The results are shown in Table 1.
  • Seed particles 2 were prepared in the same manner as “(Preparation of seed particles)” in Example 1 except that 4.9 mg of perylene diimide and 0.18 g of Nicalac MX-035 were used as the solid content.
  • the average particle size of the seed particles 2 was 30 nm, and the variation coefficient of the particle size was 11%.
  • the pigment-containing thermosetting resin particles 2 were evaluated for bright spot variation and pigment retention. The results are shown in Table 1.
  • Seed particles 3 were prepared in the same manner as “(Preparation of seed particles)” in Example 1 except that 7.8 mg of perylene diimide and 0.24 g of Nicalac MX-035 were used as the solid content.
  • the average particle size of the seed particles 3 was 60 nm, and the variation coefficient of the particle size was 12%.
  • the seed particles 3 1.0 ⁇ 10 14 pieces that were used as the seed particles, it was 0.3g using NIKALAC MX-035 as a solid content, except that 9.5mg using perylene diimide of Example 1 "( Dye-containing thermosetting resin particles 3 were produced in the same manner as in “Manufacture of dye-containing thermosetting resin particles”.
  • the average particle size of the dye-containing thermosetting resin particles 3 was 150 nm, and the coefficient of variation of the particle size was 8%.
  • the pigment-containing thermosetting resin particles 3 were evaluated for bright spot variation and pigment retention. The results are shown in Table 1.
  • Seed particles 4 were prepared in the same manner as “(Preparation of seed particles)” in Example 1 except that 9.9 mg of perylene diimide and 0.32 g of solid content of Nicalac MX-035 were used. The average particle size of the seed particles 4 was 80 nm, and the variation coefficient of the particle size was 12%.
  • the pigment-containing thermosetting resin particles 4 were evaluated for bright spot variation and pigment retention. The results are shown in Table 1.
  • Seed particles 5 were prepared in the same manner as “(Preparation of seed particles)” in Example 1, except that 14.4 mg of perylene diimide and 0.45 g of Nicalac MX-035 were used as the solid content.
  • the average particle size of the seed particles 5 was 150 nm, and the variation coefficient of the particle size was 14%.
  • the pigment-containing thermosetting resin particles 5 were evaluated for bright spot variation and pigment retention. The results are shown in Table 1.
  • Example 6 “(Production of dye-containing thermosetting resin particles)”, the dye was the same as Example 2 except that 2.9 mg of “sulforhodamine 101” (manufactured by Sigma-Aldrich) was used as the fluorescent dye. Contained thermosetting resin particles 6 were produced. The average particle size of the dye-containing thermosetting resin particles 6 was 60 nm, and the coefficient of variation of the particle size was 6%.
  • Example 7 In Example 3, “(Production of dye-containing thermosetting resin particles)”, a dye was prepared in the same manner as Example 3 except that 9.1 mg of “sulforhodamine 101” (manufactured by Sigma-Aldrich) was used as the fluorescent dye. Contained thermosetting resin particles 7 were produced. The average particle size of the dye-containing thermosetting resin particles 7 was 150 nm, and the coefficient of variation of the particle size was 8%.
  • the pigment-containing thermosetting resin particles 7 were evaluated for bright spot variation and pigment retention. The results are shown in Table 1.
  • Example 8 In “(Production of dye-containing thermosetting resin particles)” in Example 4, the same method as in Example 4 except that 12.8 mg of “sulforhodamine 101” (manufactured by Sigma-Aldrich) was used as the fluorescent dye. Contained thermosetting resin particles 8 were produced. The average particle size of the dye-containing thermosetting resin particles 8 was 300 nm, and the coefficient of variation in particle size was 7%.
  • the dye-containing thermosetting resin particles 8 were evaluated for bright spot variation and dye retention. The results are shown in Table 1.
  • Example 9 In Example 5 “(Production of dye-containing thermosetting resin particles)”, a dye was prepared in the same manner as in Example 5 except that 19.0 mg of “sulforhodamine 101” (manufactured by Sigma-Aldrich) was used as the fluorescent dye. Contained thermosetting resin particles 9 were produced. The average particle diameter of the dye-containing thermosetting resin particles 9 was 750 nm, and the coefficient of variation of the particle diameter was 6%.
  • the pigment-containing thermosetting resin particles 9 were evaluated for bright spot variation and pigment retention. The results are shown in Table 1.
  • Example 10 A 10% by weight aqueous solution of dodecylbenzenesulfonic acid from an acid solution obtained by mixing an acid catalyst solution with a 2.47% by weight aqueous solution of sulfamic acid and a 10% by weight aqueous solution of dodecylbenzenesulfonic acid in a ratio of 1: 3. Except having changed to, dye-containing thermosetting resin particles 10 were produced in the same manner as in Example 3. The average particle size of the dye-containing thermosetting resin particles 10 was 150 nm, and the coefficient of variation in particle size was 10%.
  • the pigment-containing thermosetting resin particles 10 were evaluated for bright spot variation and pigment retention. The results are shown in Table 1.
  • “Emulgen (registered trademark) 430” polyoxyethylene oleyl ether, manufactured by Kao Corp.
  • an emulsifier for emulsion polymerization in a solution obtained by dissolving 10.0 mg of perylene diimide, a fluorescent dye, in 20 mL of water 2 mL of a 5 mass% aqueous solution of was added. The solution was heated to 70 ° C.
  • Separation of the resin particles from the obtained dispersion of resin particles, and washing for removing impurities such as excess resin raw materials and fluorescent dyes adhering to the resin particles were performed as follows.
  • the dispersion is centrifuged at 20000 G for 15 minutes in a centrifuge (Kubota Co., Ltd., micro cooling centrifuge 3740), the supernatant is removed, ultrapure water is added to the separated particles, and ultrasonic irradiation is performed. Went and redispersed.
  • the treatment by centrifugation, removal of the supernatant and redispersion in ultrapure water was repeated 5 times.
  • the obtained resin particles were designated as pigment-containing resin particles R1.
  • the particle diameter of the dye-containing resin particles R1 was 60 nm, and the coefficient of variation was 12%.
  • the pigment-containing resin particles R1 were evaluated for bright spot variation and pigment retention. The results are shown in Table 2.
  • Dye-containing resin particles R2 were produced in the same manner as in Comparative Example 1 except that 0.45 g of “Nicalac MX-035” was used as the solid content and 14.4 mg of perylene diimide was used. The average particle size of the dye-containing resin particles R2 was 150 nm, and the coefficient of variation in particle size was 13%.
  • the pigment-containing resin particles R2 were evaluated for bright spot variation and pigment retention. The results are shown in Table 2.
  • Dye-containing resin particles R3 were produced in the same manner as in Comparative Example 1, except that 0.60 g of “Nicalac MX-035” was used as the solid content, and 18.0 mg of perylene diimide was used. The average particle size of the dye-containing resin particles R3 was 300 nm, and the coefficient of variation in particle size was 17%.
  • the pigment-containing resin particles R3 were evaluated for bright spot variation and pigment retention. The results are shown in Table 2.
  • Dye-containing resin particles R2 were produced in the same manner as in Comparative Example 1, except that 0.84 g of “Nicalac MX-035” was used as the solid content and 27.0 mg of perylene diimide was used.
  • the average particle size of the dye-containing resin particles R4 was 750 nm, and the coefficient of variation in particle size was 18%.
  • the dye-containing resin particles R4 were evaluated for bright spot variation and dye retention. The results are shown in Table 2.
  • [Comparative Example 5] (Preparation of seed particles) 20 mL of water, 0.20 g of styrene, and 0.04 g of glycidyl methacrylate were placed in a reaction vessel, and Ar bubbling was performed. To this solution, 0.20 mL of an aqueous solution obtained by dissolving 50 mg of 2,2-Azobis (2-methylpropionamide) dihydrochloride, which is a water-soluble radical generator, in 0.50 mL of water was added. The reaction vessel was covered and heated to 70 ° C. for reaction for 12 hours.
  • the cloudy reaction liquid containing the produced resin particles was centrifuged at 20000 G for 90 minutes in a centrifuge (Microcooled Centrifuge 3740 manufactured by Kubota Corporation) to collect resin particles. After removing the supernatant, ultrapure water was added to the separated particles, and ultrasonic dispersion was performed to redisperse. The treatment by centrifugation, removal of the supernatant and redispersion in ultrapure water was repeated three times. The obtained resin particles were designated as seed particles R5. The average particle size of the seed particles R5 was 60 nm, and the variation coefficient of the particle size was 11%.
  • the cloudy reaction liquid containing the produced resin particles was centrifuged at 20000 G for 90 minutes in a centrifuge (Microcooled Centrifuge 3740 manufactured by Kubota Corporation) to collect resin particles. After removing the supernatant, ultrapure water was added to the separated particles, and ultrasonic dispersion was performed to redisperse. The treatment by centrifugation, removal of the supernatant and redispersion in ultrapure water was repeated three times. The same amount of methanol was added to the aqueous dispersion of the resin particles obtained, and 9.5 mg of perylene diimide was added as a methanol solution while stirring vigorously at room temperature using a stirrer.
  • a centrifuge Microcooled Centrifuge 3740 manufactured by Kubota Corporation
  • the aqueous dispersion was centrifuged at 20000 G for 90 minutes in a centrifuge (Microcooled Centrifuge 3740 manufactured by Kubota Corp.) to collect resin particles. After removing the supernatant, the recovered resin particles were dispersed in water and filtered through a 1.0 ⁇ m filter to remove excess pigment. The resin particles separated by filtration were redispersed in water, and the treatment by centrifugation, removal of supernatant and redispersion in water under the same conditions as described above was repeated three times. The obtained particles were designated as dye-containing resin particles R5. The average particle size of the dye-containing resin particles R5 was 150 nm, and the coefficient of variation in particle size was 7%.
  • the dye-containing resin particles R5 were evaluated for bright spot variation and dye retention. The results are shown in Table 2.
  • Dye-containing resin particles R6 were produced in the same manner as “(Production of dye-containing thermosetting resin particles)” in Example 3 except that seed particles R5 were used as seed particles.
  • the average particle size of the dye-containing resin particles R6 was 150 nm, and the coefficient of variation in particle size was 8%.

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Abstract

本発明は、熱硬化性樹脂により形成されたシード粒子を分散媒に分散させ、得られた分散液中で色素及び酸触媒の存在下に熱硬化性樹脂合成用モノマーを重合させる、色素含有熱硬化性樹脂粒子の製造方法である。本発明の色素含有熱硬化性樹脂粒子の製造方法によれば、遠心分離などの後処理を行うことなく粒子径の変動係数が小さい、例えば８％以下の色素含有樹脂粒子を製造することができる。このため、本発明の色素含有熱硬化性樹脂粒子の製造方法により製造された蛍光色素含有樹脂粒子を用いた蛍光標識法により免疫観察を行うと、高い輝点検出精度が得られる。

Description

色素含有熱硬化性樹脂粒子の製造方法
　本発明は、免疫観察において行われる免疫染色等に利用することができる色素含有熱硬化性樹脂粒子の製造方法に関する。
　医学的診断の１つとして行われている病理診断では、様々な所見を得るために、臓器摘出や針生検によって得た組織検体を厚さ数ミクロン程度に薄切して得られた切片を組織標本とし、これを光学顕微鏡により拡大観察することが広く行われている。具体的には、免疫染色と呼ばれる、組織標本に含まれる検出対象である抗原や遺伝子の発現を確認するための染色を行なった後、遺伝子やタンパクの発現異常といった機能異常を診断する免疫観察が行なわれている。
　免疫染色に用いられる染色法としては、例えば、ＤＡＢ染色法などの酵素を用いた色素染色法がある。しかし、ＤＡＢ染色法のような酵素による染色法は、染色濃度が温度や時間などの環境条件により大きく左右されるため、染色濃度から実際の抗原等の量を算出することが難しいという欠点がある。
　そのため、病理診断における免疫観察では、蛍光標識体を用いる蛍光標識法が行われることが多い。この方法はＤＡＢ染色と比べて定量性に優れるという特徴がある。蛍光標識法は、蛍光色素により修飾された抗体を蛍光標識体として用いて、対象となる抗原を染色して観察することで抗原量を測定する方法である。例えば、病理組織切片上で興味のある抗原に、蛍光色素を含有する樹脂粒子（以下、蛍光色素含有樹脂粒子ともいう。）で修飾された抗体を結合することで標識化し、これを蛍光顕微鏡観察する。蛍光色素含有樹脂粒子には輝度が高いことや、粒子数計測が可能といった特徴がある。組織切片の蛍光顕微鏡像に現れる蛍光色素含有樹脂粒子に由来する輝点を観察する事で、抗原の状態や量を確認することができる。
　蛍光色素含有樹脂粒子数の計測は、検量線を基にして樹脂粒子の１粒子当たりの輝度を求めて行っている。このため、蛍光色素含有樹脂粒子ごとの輝点強度にバラツキがあると、樹脂粒子から発せられる蛍光シグナルの判定精度が悪化する。この輝点強度のバラツキの原因として、蛍光色素含有樹脂粒子の粒子径のバラツキが挙げられる。すなわち、蛍光色素含有樹脂粒子の粒子径の大小により輝度が変化し、色素含有樹脂粒子の粒子径が小さいと輝度が低くなるので、例えば蛍光シグナル検出閾値未満の輝度の粒子径を有する蛍光色素含有樹脂粒子が存在する場合、蛍光色素含有樹脂粒子が存在するにもかかわらず、蛍光シグナルが検出されないという問題が生ずる。逆に、蛍光シグナル検出閾値をはるかに超える輝度となる粒子径を有する蛍光色素含有樹脂粒子が存在する場合、サチレーションにより輝点同士が融合して個々の輝点の判別がつかなくなるという問題が発生する。
　蛍光色素含有樹脂粒子は、一般に蛍光色素存在下でモノマーを重合させて製造される。従来の製造方法で得られる蛍光色素含有樹脂粒子は、粒子径の変動係数が１０～１５％程度であり、粒子径のバラツキが大きいので、この樹脂粒子を用いると輝度のバラつきにより、輝点数の検出精度が低い。輝点数の検出精度が高い蛍光色素含有樹脂粒子を得るには、製造された蛍光色素含有樹脂粒子に遠心分離などを施して、粒子径をそろえるなどの後処理を行う必要があった。
　また、永久切片を作製する際には、切片に含まれる水分をエタノールおよびキシレンで置換する透徹を行う。この透徹によって蛍光色素が溶出するという問題が発生することがある。例えば、蛍光色素を含有する電荷を有しないポリスチレン粒子を蛍光色素含有樹脂粒子として含む染色剤を用いて染色した切片を透徹すると、蛍光色素が滲み出て、輝点の観察が困難となって、蛍光シグナルの判定精度が悪化する。特に、化学構造中にベンゼン環を含む蛍光色素の場合、永久切片の作製に使用される油系封入剤に蛍光色素が滲み出やすいので、蛍光シグナルの判定精度が悪化する傾向が強い。
特願平８－４８４９２号公報 ＷＯ２０１４／１３６８８５号公報
　本発明は、高精度で検出することが可能な、蛍光色素などの色素を含有する樹脂粒子（以下、色素含有樹脂粒子ともいう。）の製造方法を提供することである。
　本発明は、熱硬化性樹脂により形成されたシード粒子を分散媒に分散させ、得られた分散液中で色素及び酸触媒の存在下に熱硬化性樹脂合成用モノマーを重合させる、色素含有熱硬化性樹脂粒子の製造方法である。
　前記色素含有熱硬化性樹脂粒子の製造方法において、前記シード粒子の平均粒子径が２０～１５０ｎｍであることが好ましい。
　前記色素含有熱硬化性樹脂粒子の製造方法において、前記酸触媒がドデシルベンゼンスルホン酸を含む２種の酸の混合物であることが好ましい。
　前記色素含有熱硬化性樹脂粒子の製造方法において、前記色素含有熱硬化性樹脂粒子の平均粒子径が６０～７５０ｎｍであることが好ましい。
　前記色素含有熱硬化性樹脂粒子の製造方法において、前記分散液中で熱硬化性樹脂合成用モノマーを重合させて得られる樹脂が、メラミン、尿素、グアナミン、フェノール、キシレンまたはこれらの誘導体から形成される構成単位を含むことが好ましい。
　前記色素含有熱硬化性樹脂粒子の製造方法において、前記シード粒子を形成する熱硬化性樹脂が、前記分散液中で熱硬化性樹脂合成用モノマーを重合させて得られる熱硬化性樹脂と同種であることが好ましい。
　前記色素含有熱硬化性樹脂粒子の製造方法において、前記シード粒子を、熱硬化性樹脂合成用モノマーを重合させて作製することができる。
　前記色素含有熱硬化性樹脂粒子の製造方法において、前記シード粒子を、色素の存在下で熱硬化性樹脂合成用モノマーを重合させて作製することができる。
　前記色素含有熱硬化性樹脂粒子の製造方法において、前記シード粒子の作製時に存在した色素を、前記分散液中における熱硬化性樹脂合成用モノマーの重合時に存在した色素と同種とすることができる。
　前記色素含有熱硬化性樹脂粒子の製造方法において、前記色素は有機蛍光色素であることが好ましい。
　前記色素含有熱硬化性樹脂粒子の製造方法において、前記有機蛍光色素がローダミンまたは芳香族系色素であることが好ましい。
　本発明の色素含有熱硬化性樹脂粒子の製造方法によれば、遠心分離などの後処理を行うことなく粒子径の変動係数が小さい、例えば８％以下の色素含有樹脂粒子を製造することができる。このため、本発明の色素含有熱硬化性樹脂粒子の製造方法により製造された蛍光色素含有樹脂粒子を用いた蛍光標識法により免疫観察を行うと、高い輝点検出精度が得られる。
　また、本発明の色素含有熱硬化性樹脂粒子の製造方法により製造された色素含有樹脂粒子においては、色素は樹脂粒子から離脱しにくい。このため、本発明の色素含有熱硬化性樹脂粒子の製造方法により製造された蛍光色素含有樹脂粒子を用いた蛍光標識法により免疫観察を行った場合、蛍光観察の際に輝点の滲みを抑制することができる。
　本発明に係る色素含有熱硬化性樹脂粒子の製造方法においては、熱硬化性樹脂により形成されたシード粒子を分散媒に分散させ、得られた分散液中で色素及び酸触媒の存在下に熱硬化性樹脂合成用モノマーを重合させる。
　前記色素含有熱硬化性樹脂粒子とは、熱硬化性樹脂から形成される粒子であって、色素を含有する粒子である。
　前記熱硬化性樹脂は、色素を含有できれば特に制限はなく、その具体例としては、メラミン、尿素、グアナミン、フェノール、キシレン、またはメラミン、尿素、グアナミン、フェノールもしくはキシレンの誘導体から形成される構成単位を含むポリマーからなる熱硬化性樹脂を挙げることができる。
　前記シード粒子は、前記色素含有熱硬化性樹脂粒子の種となる粒子である。本発明の製造方法における後の工程において、シード粒子の表面に熱硬化性樹脂が形成され、粒子が成長し、色素含有熱硬化性樹脂粒子となる。
　シード粒子の平均粒子径は、好ましくは２０～１５０ｎｍ、より好ましくは４０～１２０ｎｍ、さらに好ましくは６０～１００ｎｍである。シード粒子の平均粒子径が前記範囲内であると、色素含有樹脂粒子の粒子径の変動係数を小さくすることができ、具体的には８％以下にすることができる。シード粒子の粒子径の変動係数は、特に制限はないが、通常８～１４％であり、好ましくは８～１２％である。
　本発明において示される樹脂粒子の平均粒子径および粒子径の変動係数は、樹脂粒子のＳＥＭ観察を行い、得られたＳＥＭ像から任意に樹脂粒子１０００個の粒子径を計測し、その計測値から算出された平均粒子径及び変動係数である。
　前記シード粒子は前記熱硬化性樹脂により形成される。シード粒子を形成する熱硬化性樹脂は、前記分散液中で熱硬化性樹脂合成用モノマーを重合させて得られる熱硬化性樹脂と異なっていてもよいが、同種であることが好ましい。
　シード粒子は、例えば、熱硬化性樹脂合成用モノマーを分散重合法等により重合させて作製することができる。シード粒子を形成する熱硬化性樹脂が前記分散液中で熱硬化性樹脂合成用モノマーを重合させて得られる熱硬化性樹脂と同種である場合、シード粒子の作製に使用する熱硬化性樹脂合成用モノマーは、前記分散液中における重合に使用する熱硬化性樹脂合成用モノマーと同種にすることができる。熱硬化性樹脂合成用モノマーについては後述する。
　前記分散重合法としては、例えば、熱硬化性樹脂合成用モノマー、酸触媒、界面活性剤等を分散媒に溶解し、撹拌下で重合させ、分散媒中に生成された粒子を濾過して取得する方法を挙げることができる。酸触媒としては、ドデシルベンゼンスルホン酸、スルファミン酸、ギ酸、酢酸、硫酸、塩酸、硝酸、パラトルエンスルホン酸等を挙げることができる。界面活性剤については後述する。分散媒としては、特に制限はないが、水を好適に用いることができる。水にＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（DMF）、エタノール、ジメチルスルホキシド（DMSO）、アセトン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン（THF）、ジオキサンなどの溶媒を混合して用いても良い。分散媒としては、前記重合を実施することができる液材を選択して使用することができる。
　熱硬化性樹脂合成用モノマー、酸触媒及び乳化剤等の配合量ならびに重合温度及び重合時間は、熱硬化性樹脂合成用モノマー、酸触媒等に応じて適宜決定することができる。
　例えば、メラミン樹脂により形成されたシード粒子は、次のような工程により作製することができる。乳化重合用乳化剤「エマルゲン（登録商標）」（ポリオキシエチレンオレイルエーテル、花王（株）製）の５％水溶液１．５～２．０ｍＬを水２０ｍＬに加え、この溶液を攪拌しながら６８～７２℃に加温する。この溶液にメラミン樹脂原料「ニカラックＭＸ－０３５」（日本カーバイド工業（株）製）を０．１～０．５ｇ、酸触媒としてドデシルベンゼンスルホン酸（関東化学（株）製）の１０％水溶液を４００～７５０μＬ加え、４０～９０分間攪拌する。その後８８～９２℃に昇温して２０～４０分間撹拌する。以上の工程により樹脂粒子を含有した分散液が得られる。この分散液から樹脂粒子を分離し、これをシード粒子とする。
　上記熱硬化性樹脂合成用モノマーの重合は色素の存在下で行ってもよい。色素の存在下で重合を行うと、重合により生成したポリマーが色素を包み込みながら成長するので、色素を含有したシード粒子が得られる。この重合により生成したポリマーは三次元的な網目構造を有するので、これに包み込まれた色素はシード粒子から離脱しにくい。メラミン樹脂により形成されたシード粒子の作製において色素を用いる場合、例えば、上記工程において乳化剤とともに色素を水に加えればよい。シード粒子の作製時に使用する色素は、前記分散液中における熱硬化性樹脂合成用モノマーの重合時に存在する色素と同種とすることができる。色素については後述する。
　上記のように作製されたシード粒子は、未反応の熱硬化性樹脂合成用モノマーなどを含んでいることがあるので、純水等による洗浄によりこれらの不純物を除去することが好ましい。シード粒子が未反応の熱硬化性樹脂合成用モノマーなどを含んでいると、色素含有樹脂粒子の粒子径の変動係数を小さくすることが困難になる場合がある。
　前記分散液からの樹脂粒子の分離及び純水等による洗浄には遠心分離等を用いることができる。
　本発明の色素含有熱硬化性樹脂粒子の製造方法においては、前記シード粒子を分散媒に分散させ、得られた分散液中で色素及び酸触媒の存在下に熱硬化性樹脂合成用モノマーを重合させる。
　前記分散媒としては、特に制限はないが、水を好適に用いることができる。水にＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、エタノール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アセトン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジオキサンなどの溶媒を混合して用いても良い。分散媒としては、前記重合を実施することができる液材を選択して使用することができる。
　熱硬化性樹脂合成用モノマー、酸触媒及び色素を分散媒に添加する。シード粒子、熱硬化性樹脂合成用モノマー、酸触媒及び色素を分散媒に添加する順序としては、分散媒に、まず色素、シード粒子及び熱硬化性樹脂合成用モノマーを加え、最後に酸触媒を加えることが好ましい。
　前記熱硬化性樹脂合成用モノマーとは、重合することにより熱硬化性樹脂となる化合物を意味する。熱硬化性樹脂合成用モノマーとしては、例えば、メラミン、尿素、グアナミン、フェノール、キシレン、ならびにメラミン、尿素、グアナミン、フェノール及びキシレンの誘導体等が挙げられる。熱硬化性樹脂合成用モノマーとしてメラミンまたはその誘導体を用いれば、その重合によりメラミン樹脂が得られ、尿素またはその誘導体を用いれば、その重合により尿素樹脂が得られ、グアナミンまたはその誘導体を用いれば、その重合によりグアナミン樹脂が得られ、フェノールまたはその誘導体を用いれば、その重合によりフェノール樹脂が得られ、キシレンまたはその誘導体を用いれば、その重合によりキシレン樹脂が得られる。前述のシード粒子の作製に用いられる熱硬化性樹脂合成用モノマーについてもここで述べた熱硬化性樹脂合成用モノマーと同様である。
　前記シード粒子の投入粒子数と熱硬化性樹脂合成用モノマーの体積から、目的とする粒径に必要な熱硬化性樹脂合成用モノマーの添加量を計算により求めることができる。投入するシード粒子数は６．０×１０14個以下とし、この範囲での粒子数を基にモノマー量を決定する。熱硬化性樹脂合成用モノマー及びシード粒子の添加量をこのように決定すると、色素含有樹脂粒子の粒子径の変動係数を小さくしやすく、好適には８％以下にすることができる。
　前記酸触媒は、熱硬化性樹脂合成用モノマーの重合反応の触媒であり、樹脂粒子の形成を促進する。シード粒子の分散液中で前記酸触媒を用いて熱硬化性樹脂合成用モノマーの重合を行うと、色素含有樹脂粒子の粒子径の変動係数を小さくすることができ、具体的には８％以下にすることができる。酸触媒としては、例えば、ドデシルベンゼンスルホン酸、スルファミン酸、ギ酸、酢酸、硫酸、塩酸、硝酸、パラトルエンスルホン酸等が挙げられる。特に、ドデシルベンゼンスルホン酸とスルファミン酸、ドデシルベンゼンスルホン酸とギ酸、ドデシルベンゼンスルホン酸と酢酸、ドデシルベンゼンスルホン酸とパラトルエンスルホン酸、といった、ドデシルベンゼンスルホン酸と他の酸の組み合わせが特に好ましい。
　酸触媒の添加量は、水２０ｍＬに対し、通常３０～２００ｍｇ、好ましくは５０～１５０ｍｇである。
　前記色素としては、特に制限がないが、色素含有樹脂粒子を免疫染色に使用する場合には、有機蛍光色素が好ましい。有機蛍光色素としては、例えば、ローダミン系色素、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標、インビトロジェン社製）、スクアリリウム系色素、芳香族系色素等の各系統の色素の中から選択することができる。
　このうち、芳香族炭化水素系色素などの芳香族系色素、ローダミン系色素などは、比較的耐光性が高いので好ましく、なかでも芳香族系色素に属するペリレン（ｐｅｒｙｌｅｎｅ）やピレン（Ｐｙｒｅｎｅ）、ペリレンジイミド（ｐｅｒｙｌｅｎｅ　ｄｉｉｍｉｄｅ）が好ましい。さらにローダミン系色素やペリレンジイミドは量子収率や吸光等が優れており、発光効率が優れるので、これらを含有した樹脂粒子は、他の色素を含有した樹脂粒子と比べて発光強度が優れる。
　ローダミン系色素の具体例としては、５－カルボキシ－ローダミン、６－カルボキシ－ローダミン、５，６－ジカルボキシ－ローダミン、ローダミン　６Ｇ、テトラメチルローダミン、Ｘ－ローダミン、テキサスレッド、ＳｐｅｃｔｒｕｍＲｅｄ、ＬＤ７００ＰＥＲＣＨＬＯＲＡＴＥ、それらの誘導体などが挙げられる。
　ＢＯＤＩＰＹ系色素の具体例としては、ＢＯＤＩＰＹ　ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ　ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ　４９３／５０３、ＢＯＤＩＰＹ　５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ　５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ　５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ　５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ　５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ　６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ　６５０／６６５（以上インビトロジェン社製）、それらの誘導体などが挙げられる。
　スクアリリウム系色素の具体例としては、ＳＲｆｌｕｏｒ６８０－Ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ、１，３－Ｂｉｓ［４－（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）－２－ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ］－２，４－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｃｙｃｌｏｂｕｔｅｎｅｄｉｙｌｉｕｍ　ｄｉｈｙｄｒｏｘｉｄｅ，　ｂｉｓ、１，３－Ｂｉｓ［４－（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｈｅｎｙｌ］－２，４－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｃｙｃｌｏｂｕｔｅｎｅｄｉｙｌｉｕｍ　ｄｉｈｙｄｒｏｘｉｄｅ，　ｂｉｓ、２－（４－（Ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）－２－ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）－４－（４－（ｄｉｅｔｈｙｌｉｍｉｎｉｏ）－２－ｈｙｄｒｏｘｙｃｙｃｌｏｈｅｘａ－２，５－ｄｉｅｎｙｌｉｄｅｎｅ）－３－ｏｘｏｃｙｃｌｏｂｕｔ－１－ｅｎｏｌａｔｅ、２－（４－（Ｄｉｂｕｔｙｌａｍｉｎｏ）－２－ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）－４－（４－（ｄｉｂｕｔｙｌｉｍｉｎｉｏ）－２－ｈｙｄｒｏｘｙｃｙｃｌｏｈｅｘａ－２，５－ｄｉｅｎｙｌｉｄｅｎｅ）－３－ｏｘｏｃｙｃｌｏｂｕｔ－１－ｅｎｏｌａｔｅ、２－（８－Ｈｙｄｒｏｘｙ－１，１，７，７－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ－１，２，３，５，６，７－ｈｅｘａｈｙｄｒｏｐｙｒｉｄｏ［３，２，１－ｉｊ］ｑｕｉｎｏｌｉｎ－９－ｙｌ）－４－（８－ｈｙｄｒｏｘｙ－１，１，７，７－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ－２，３，６，７－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－１Ｈ－ｐｙｒｉｄｏ［３，２，１－ｉｊ］ｑｕｉｎｏｌｉｎｉｕｍ－９（５Ｈ）－ｙｌｉｄｅｎｅ）－３－ｏｘｏｃｙｃｌｏｂｕｔ－１－ｅｎｏｌａｔｅ、それらの誘導体などが挙げられる。
　芳香族炭化水素系色素の具体例としては、Ｎ, Ｎ－Ｂｉｓ－（２，６－ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｐｈｅｎｙｌ）－１，６，７，１２－（４－ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌｐｈｅｎｏｘｙ）－ｐｅｒｙｌｅｎｅ－３，４，９，１０－ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｎａｃｉｄｄｉｉｍｉｄｅ、Ｎ,Ｎ'－Ｂｉｓ（２，６－ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｐｈｅｎｙｌ）－１，６，７，１２－ｔｅｔｒａｐｈｅｎｏｘｙｐｅｒｙｌｅｎｅ－３，４：９，１０－ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｄｉｉｍｉｄｅ、Ｎ，Ｎ'－Ｂｉｓ（２，６－ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｐｈｅｎｙｌ）ｐｅｒｙｌｅｎｅ－３，４，９，１０－ｂｉｓ（ｄｉｃａｒｂｉｍｉｄｅ）、１６，Ｎ,Ｎ'－Ｂｉｓ（２，６－ｄｉｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）ｐｅｒｙｌｅｎｅ－３,４,９,１０－ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃｄｉｉｍｉｄｅ、４，４'－[（８，１６－Ｄｉｈｙｄｒｏ－８,１６－ｄｉｏｘｏｄｉｂｅｎｚｏ[ａ,ｊ]ｐｅｒｙｌｅｎｅ－２,１０－ｄｉｙｌ）ｄｉｏｘｙ]ｄｉｂｕｔｙｒｉc ａｃｉｄ、２，１０－Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ－ｄｉｂｅｎｚｏ[ａ,ｊ]ｐｅｒｙｌｅｎｅ－８,１６－ｄｉｏｎｅ、２，１０－Ｂｉｓ（３－ａｍｉｎｏｐｒｏｐｏｘｙ）ｄｉｂｅｎｚｏ[ａ,ｊ]ｐｅｒｙｌｅｎｅ－８,１６－ｄｉｏｎｅ, ３，３'－[（８，１６－Ｄｉｈｙｄｒｏ－８,１６－ｄｉｏｘｏｄｉｂｅｎｚｏ[ａ,ｊ]ｐｅｒｙｌｅｎ－２,１０－ｄｉｙｌ）ｄｉｏｘｙ]ｄｉｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｅ、１７－ＢＩＳ（Ｏｃｔｙｌｏｘｙ）Ａｎｔｈｒａ［９，１，２－ｃｄｅ－］Ｂｅｎｚｏ［ＲＳＴ］Ｐｅｎｔａｐｈｅｎｅ－５－１０－Ｄｉｏｎｅ、Ｏｃｔａｄｅｃａｎｏｉｃａｃｉｄ, ５，１０－ｄｉｈｙｄｒｏ－５,１０－ｄｉｏｘｏａｎｔｈｒａ[９，１，２－ｃｄｅ]ｂｅｎｚｏ[ｒｓｔ]ｐｅｎｔａｐｈｅｎｅ－１６,１７－ｄｉｙｌｅｓｔｅｒ、Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｄｉｂｅｎｚａｎｔｈｒｏｎｅ、Ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ, ４，４'，４''，４'''－[[２，９－ｂｉｓ[２，６－ｂｉｓ(１－ｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌ)ｐｈｅｎｙｌ]－１,２,３,８,９,１０－ｈｅｘａｈｙｄｒｏ－１,３,８,１０－ｔｅｔｒａｏｘｏａｎｔｈｒａ[２，１，９－ｄｅｆ：６，５，１０－ｄ'ｅ'ｆ']ｄｉｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ－５，６，１２，１３－ｔｅｔｒａｙｌ]ｔｅｔｒａｋｉｓ（ｏｘｙ）]ｔｅｔｒａｋｉｓ-，Ｂｅｎｚｅｎｅｅｔｈａｎａｍｉｎｉｕｍ、４，４'，４''，４'''－［［２，９－ｂｉｓ［２，６－ｂｉｓ（１－ｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］－１,２,３,８,９,１０－ｈｅｘａｈｙｄｒｏ－１,３,８,１０－ｔｅｔｒａｏｘｏａｎｔｈｒａ[２，１，９－ｄｅｆ：６，５，１０－ｄ'ｅ'ｆ']ｄｉｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ－５，６，１２，１３－ｔｅｔｒａｙｌ]ｔｅｔｒａｋｉｓ（ｏｘｙ）]ｔｅｔｒａｋｉｓ[Ｎ,Ｎ,Ｎ－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ－］、それらの誘導体などが挙げられる。
　色素の添加量は、熱硬化性樹脂合成用モノマー１ｇに対し、通常１７～２７ｍｇ、好ましくは２０～２５ｍｇである。
　前述のシード粒子の作製に用いられる色素についてもここで述べた色素と同様である。
　上記のように製造された色素含有熱硬化性樹脂粒子の平均粒子径は６０～７５０ｎｍであることが好ましく、６０～５００ｎｍであることがより好ましい。
　前記分散液には界面活性剤を加えることが好ましい。界面活性剤を加えて前記重合を行うことにより、得られる色素含有樹脂粒子の粒子径を調整することができる。界面活性剤を熱硬化性樹脂合成用モノマーに対して１０～６０重量％添加すると、粒子径３０～３００ｎｍの粒子を作製しやすい。界面活性剤の割合を増やすと粒子径を小さくすることができ、３０ｎｍ以下の粒子を作製することもできる。界面活性剤の割合を減らすと粒子径を大きくすることができ、３００ｎｍ以上の粒子を作製することもできる。
　界面活性剤としては、アニオン系、ノニオン系およびカチオン系の全ての界面活性剤を用いることができる。アニオン系の界面活性剤としては、例えば、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム等が挙げられる。ノニオン系の界面活性剤としては、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレンアルキルエーテル等が挙げられる。カチオン系の界面活性剤としては、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド等が挙げられる。
　市販の界面活性剤としては、例えば、「エマルゲン」（登録商標、花王（株）製）や「ネオペレックス」（登録商標、花王（株）製）を好適に用いることができる。エマルゲンの有効成分はポリオキシエチレンアルキルエーテルであり、ネオペレックスの有効成分はドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムである。
　界面活性剤は、重合工程で行う熱硬化反応温度より曇点が高いものを選択する必要がある。熱硬化反応温度より曇点が低い界面活性剤を選択すると、界面活性剤が水との水和力を失って、その機能を果たさなくなり、樹脂粒子ができずに、樹脂の塊状物となってしまうからである。
　前述のシード粒子の作製に用いられる界面活性剤についてもここで述べた界面活性剤と同様である。
　熱硬化性樹脂合成用モノマーの重合における熱硬化温度、重合時間等の反応条件は、熱硬化性樹脂合成用モノマーの種類に応じて決定され、公知の方法に即して決定することができる。反応条件は、色素の性能が低下しない反応条件、すなわち色素の耐熱温度範囲内である必要がある。
　例えば、熱硬化性樹脂がメラミン樹脂である場合、熱硬化性樹脂合成用モノマーの重合反応は通常７０℃～２００℃、好ましくは１５０～２００℃で行われる。色素の耐熱温度は、例えば、ローダミン系色素で２００℃、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標、インビトロジェン社製）で２００℃、スクアリリウム系色素で２００℃、芳香族炭化水素系色素で３００℃以上であるので、これらの色素が耐えうる反応条件とする必要がある。
　この重合反応により、シード粒子表面を覆いながらポリマーが生成される。その結果、中央部にシード粒子、外周部に熱硬化性樹脂を有する熱硬化性樹脂粒子が形成される。この重合反応において生成したポリマーは色素を包み込みながら成長するので、外周部の熱硬化性樹脂に色素が含有され、形成された粒子は色素含有熱硬化性樹脂粒子となる。シード粒子が色素を含有する場合には、シード粒子及び外周部がともに色素を含有する色素含有熱硬化性樹脂粒子が得られる。
　この重合により生成したポリマーは三次元的な網目構造を有するので、これに包み込まれた色素は樹脂粒子から離脱しにくい。重合反応が不十分で、色素含有樹脂粒子からの色素の離脱が生じる場合には、色素含有樹脂粒子を、樹脂の分解温度や溶融温度以下の温度であって、色素及び樹脂粒子に悪影響が出ない温度においてさらに加熱処理して、熱硬化、つまり架橋を促進させて、色素の離脱を抑制させる処理を行ってもよい。
　この反応により生成した色素含有熱硬化性樹脂粒子は反応液中に分散しているので、遠心分離等により反応液から色素含有樹脂粒子を分離する。得られた色素含有樹脂粒子は、通常、未反応の熱硬化性樹脂合成用モノマー、余剰の色素や酸触媒等を含んでいるので、得られた色素含有樹脂粒子を洗浄して、これらの不純物を除去することが好ましい。例えば、反応液から分離された樹脂に超純水を加えて、超音波照射して再度分散させ、遠心分離して上澄みを除去することで洗浄を行う。前記超純水への再分散、遠心分離、上澄み除去の一連の洗浄操作は、上澄みに樹脂や色素に由来する吸光や蛍光が見られなくなるまで、複数回繰り返し行うことが好ましい。
　本発明の製造方法により製造された色素含有熱硬化性樹脂粒子は、粒子径の変動係数が小さく、具体的には８％以下である。すなわち、本発明の製造方法により製造された色素含有熱硬化性樹脂粒子は単分散性が高い。このため、本発明の色素含有熱硬化性樹脂粒子の製造方法により製造された蛍光色素含有樹脂粒子を用いた蛍光標識法により免疫観察を行うと、樹脂粒子の粒子径のバラツキに起因する輝点強度のバラツキが小さいので、輝点検出精度が高く、色素含有樹脂粒子を高精度で検出でき、粒子数計測を正確に行える。
　また、本発明の色素含有熱硬化性樹脂粒子の製造方法により製造された色素含有樹脂粒子においては、前述のとおり、三次元的な網目構造を有するポリマーにより色素が包まれた状態で含有されているので、色素は樹脂粒子に保持され、樹脂粒子の外側に離脱しにくい。このため、本発明の色素含有熱硬化性樹脂粒子の製造方法により製造された蛍光色素含有樹脂粒子を用いた蛍光標識法により免疫観察を行った場合、蛍光観察の際に起こる輝点の滲みを抑制できる。
　一方、上記製造方法において熱硬化性樹脂ではなく熱可塑性樹脂を用いた場合、粒子径の変動係数が小さい色素含有樹脂粒子は得られるが、これを構成するポリマーは三次元的な網目構造を有しないので、色素をポリマーにより包に込むことが困難であり、色素は樹脂粒子の外側に離脱しやすい。このため、熱可塑性樹脂を用いて得られた蛍光色素含有樹脂粒子を用いて蛍光標識法による免疫観察を行った場合、蛍光観察の際に輝点の滲みが生じやすい。
　実施例で行った測定方法及び評価方法を以下に示す。
[樹脂粒子の平均粒子径及び粒子径の変動係数測定]
　樹脂粒子分散液を基板上で乾燥させて、樹脂粒子のＳＥＭ観察を行い、得られたＳＥＭ像から任意に粒子１０００個の粒子径を計測し、平均粒子径と粒子径の変動係数を算出した。
[輝点バラつき評価]
　ガラス基板上に樹脂粒子分散液を塗布し、蛍光顕微鏡画像を撮影した。その後同視野でSEM観察を行った。得られた蛍光顕微鏡画像とSEM画像から、任意に1粒子の輝点１００個について輝点輝度を計測した。輝点輝度の平均値を算出し、平均値の１／２～２倍の範囲から外れる粒子の数が１個以内である場合を「Ａ」、２～４個である場合を「Ｂ」、５個以上である場合を「Ｃ」として評価した。
［色素保持性評価］
　粒子含有量が１ｍｇ/ｍＬである粒子分散液１ｍＬを２本のプラスチック遠心チューブにそれぞれ入れ、遠心分離を行って粒子を分離した。ここにエタノールを加えて超音波分散し、粒子液をエタノールで置換した状態とした。再度、遠心分離し上澄みを除去後片方のチューブにはＤＭＦを、もう一方のチューブにはキシレンをそれぞれのチューブに１ｍＬずつ加え、超音波分散を行った。１０分間放置後、遠心分離を行ない、沈殿生成の有無を評価した。沈殿が生成し上澄みが無色のものは色素保持性が「Ａ」、沈殿が生成せずに液が着色しているものは色素保持性が「Ｃ」とした。
［実施例１］
（シード粒子の作製）
　蛍光色素であるペリレンジイミド４．４ｍｇを水２０ｍＬに溶解して得られた溶液に乳化重合用乳化剤である「エマルゲン（登録商標）４３０」（ポリオキシエチレンオレイルエーテル、花王（株）製）の５質量％水溶液を２ｍＬ加えた。この溶液をホットスターラー上で撹拌しながら７０℃まで昇温させた後、この溶液にメラミン樹脂原料である「ニカラックＭＸ－０３５」（日本カーバイド工業（株）製）を固形分量として０．１４ｇ加えた。さらに、この溶液に酸触媒であるドデシルベンゼンスルホン酸（関東化学（株）製）の１０質量％水溶液を０．７０ｍＬ加え、７０℃に加熱して５０分間撹拌し、さらに９０℃に昇温して２０分間撹拌して、メラミン樹脂の合成を行った。
　得られた樹脂粒子の分散液からの樹脂粒子の分離、さらに樹脂粒子に付着する余剰の樹脂原料や蛍光色素等の不純物を除くための洗浄を次のように行った。上記分散液を遠心分離機（クボタ（株）製マイクロ冷却遠心機３７４０）にて２００００Ｇで９０分間遠心分離し、上澄みを除去した後、分離された粒子に超純水を加え、超音波照射を行って再分散した。遠心分離、上澄み除去および超純水への再分散による処理を５回繰り返した。得られた樹脂粒子をシード粒子１とした。シード粒子１の平均粒子径は２０ｎｍ、粒子径の変動係数は１２％であった。
（色素含有熱硬化性樹脂粒子の製造）
　蛍光色素であるペリレンジイミド１．９ｍｇを水２０ｍＬに加えて溶解して得られた溶液に乳化重合用乳化剤である「エマルゲン（登録商標）４３０」（ポリオキシエチレンオレイルエーテル、花王（株）製）の５質量％水溶液を２ｍＬ加えた。この溶液をホットスターラー上で撹拌しながら７０℃まで昇温させた後、この溶液にシード粒子１を５．０×１０14個加え、得られた分散液にメラミン樹脂原料である「ニカラックＭＸ－０３５」（日本カーバイド工業（株）製）を固形分量として０．０６ｇ加えた。この分散液に、酸触媒であるスルファミン酸（関東化学（株）製）の２．４７質量％水溶液と酸触媒であるドデシルベンゼンスルホン酸の１０質量％水溶液とを１：３の比率で混合して得られた酸溶液を０．７０ｍＬ加え、７０℃に加熱して５０分間攪拌し、さらに９０℃に昇温して２０分間撹拌して、メラミン樹脂の合成を行った。
　得られた樹脂粒子の分散液からの樹脂粒子の分離、さらに樹脂粒子に付着する余剰の樹脂原料や蛍光色素等の不純物を除くための洗浄を次のように行った。上記分散液を遠心分離機（クボタ（株）製マイクロ冷却遠心機３７４０）にて２００００Ｇで９０分間遠心分離し、上澄みを除去した後、分離された粒子に超純水を加え、超音波照射を行って再分散した。遠心分離、上澄み除去および超純水への再分散による処理を５回繰り返した。得られた樹脂粒子を色素含有熱硬化性樹脂粒子１とした。色素含有熱硬化性樹脂粒子１の平均粒子径は５０ｎｍ、粒子径の変動係数は１０％であった。
　色素含有熱硬化性樹脂粒子１につき輝点バラつき評価及び色素保持性評価を行った。結果を表１に示す。
[実施例２]
（シード粒子の作製）
　ペリレンジイミドを４．９ｍｇ、ニカラックＭＸ－０３５を固形分量として０．１８ｇとしたこと以外は実施例１の「（シード粒子の作製）」と同様にしてシード粒子２を作製した。シード粒子２の平均粒子径は３０ｎｍ、粒子径の変動係数は１１％であった。
（色素含有熱硬化性樹脂粒子の製造）
　シード粒子としてシード粒子２を４．０×１０14個使用したこと、ニカラックＭＸ－０３５を固形分量として０．１ｇ使用したこと、ペリレンジイミドを３．２ｍｇ使用したこと以外は実施例１の「（色素含有熱硬化性樹脂粒子の製造）」と同様にして色素含有熱硬化性樹脂粒子２を製造した。色素含有熱硬化性樹脂粒子２の平均粒子径は６０ｎｍ、粒子径の変動係数は８％であった。
　色素含有熱硬化性樹脂粒子２につき輝点バラつき評価及び色素保持性評価を行った。結果を表１に示す。
[実施例３]
（シード粒子の作製）
　ペリレンジイミドを７．８ｍｇ、ニカラックＭＸ－０３５を固形分量として０．２４ｇとしたこと以外は実施例１の「（シード粒子の作製）」と同様にしてシード粒子３を作製した。シード粒子３の平均粒子径は６０ｎｍ、粒子径の変動係数は１２％であった。
（色素含有熱硬化性樹脂粒子の製造）
　シード粒子としてシード粒子３を１．０×１０14個使用したこと、ニカラックＭＸ－０３５を固形分量として０．３ｇ使用したこと、ペリレンジイミドを９．５ｍｇ使用したこと以外は実施例１の「（色素含有熱硬化性樹脂粒子の製造）」と同様にして色素含有熱硬化性樹脂粒子３を製造した。色素含有熱硬化性樹脂粒子３の平均粒子径は１５０ｎｍ、粒子径の変動係数は８％であった。
　色素含有熱硬化性樹脂粒子３につき輝点バラつき評価及び色素保持性評価を行った。結果を表１に示す。
[実施例４]
（シード粒子の作製）
ペリレンジイミドを９．９ｍｇ、ニカラックＭＸ－０３５を固形分量として０．３２ｇとしたこと以外は実施例１の「（シード粒子の作製）」と同様にしてシード粒子４を作製した。シード粒子４の平均粒子径は８０ｎｍ、粒子径の変動係数は１２％であった。
（色素含有熱硬化性樹脂粒子の製造）
　シード粒子としてシード粒子４を２．７×１０13個使用したこと、ニカラックＭＸ－０３５を固形分量として０．６ｇ使用したこと、ペリレンジイミドを１３．３ｍｇ使用したこと以外は実施例１の「（色素含有熱硬化性樹脂粒子の製造）」と同様にして色素含有熱硬化性樹脂粒子４を製造した。色素含有熱硬化性樹脂粒子４の平均粒子径は３００ｎｍ、粒子径の変動係数は７％であった。
　色素含有熱硬化性樹脂粒子４につき輝点バラつき評価及び色素保持性評価を行った。結果を表１に示す。
[実施例５]
（シード粒子の作製）
　ペリレンジイミドを１４．４ｍｇ、ニカラックＭＸ－０３５を固形分量として０．４５ｇとしたこと以外は実施例１の「（シード粒子の作製）」と同様にしてシード粒子５を作製した。シード粒子５の平均粒子径は１５０ｎｍ、粒子径の変動係数は１４％であった。
（色素含有熱硬化性樹脂粒子の製造）
　シード粒子としてシード粒子５を２．８×１０12個使用したこと、ニカラックＭＸ－０３５を固形分量として０．９ｇ使用したこと、ペリレンジイミドを１９．９ｍｇ使用したこと以外は実施例１の「（色素含有熱硬化性樹脂粒子の製造）」と同様にして色素含有熱硬化性樹脂粒子５を製造した。色素含有熱硬化性樹脂粒子５の平均粒子径は７５０ｎｍ、粒子径の変動係数は６％であった。
　色素含有熱硬化性樹脂粒子５につき輝点バラつき評価及び色素保持性評価を行った。結果を表１に示す。
[実施例６]
　実施例２の「（色素含有熱硬化性樹脂粒子の製造）」において、蛍光色素として「スルホローダミン１０１」（シグマアルドリッチ社製）を２．９ｍｇ使用したこと以外は実施例２と同様にして色素含有熱硬化性樹脂粒子６を作製した。色素含有熱硬化性樹脂粒子６の平均粒子径は６０ｎｍ、粒子径の変動係数は６％であった。
　色素含有熱硬化性樹脂粒子６につき輝点バラつき評価及び色素保持性評価を行った。結果を表１に示す。
[実施例７]
　実施例３の「（色素含有熱硬化性樹脂粒子の製造）」において、蛍光色素として「スルホローダミン１０１」（シグマアルドリッチ社製）を９．１ｍｇ使用したこと以外は実施例３と同様にして色素含有熱硬化性樹脂粒子７を作製した。色素含有熱硬化性樹脂粒子７の平均粒子径は１５０ｎｍ、粒子径の変動係数は８％であった。
　色素含有熱硬化性樹脂粒子７につき輝点バラつき評価及び色素保持性評価を行った。結果を表１に示す。
[実施例８]
　実施例４の「（色素含有熱硬化性樹脂粒子の製造）」において、蛍光色素として「スルホローダミン１０１」（シグマアルドリッチ社製）を１２．８ｍｇ使用したこと以外は実施例４と同様にして色素含有熱硬化性樹脂粒子８を作製した。色素含有熱硬化性樹脂粒子８の平均粒子径は３００ｎｍ、粒子径の変動係数は７％であった。
　色素含有熱硬化性樹脂粒子８につき輝点バラつき評価及び色素保持性評価を行った。結果を表１に示す。
[実施例９]
　実施例５の「（色素含有熱硬化性樹脂粒子の製造）」において、蛍光色素として「スルホローダミン１０１」（シグマアルドリッチ社製）を１９．０ｍｇ使用したこと以外は実施例５と同様にして色素含有熱硬化性樹脂粒子９を作製した。色素含有熱硬化性樹脂粒子９の平均粒子径は７５０ｎｍ、粒子径の変動係数は６％であった。
　色素含有熱硬化性樹脂粒子９につき輝点バラつき評価及び色素保持性評価を行った。結果を表１に示す。
[実施例１０]
酸触媒溶液を、スルファミン酸の２．４７質量％水溶液とドデシルベンゼンスルホン酸の１０質量％水溶液とを１：３の比率で混合して得られた酸溶液からドデシルベンゼンスルホン酸の１０質量％水溶液に変更した以外は実施例３と同様にして色素含有熱硬化性樹脂粒子１０を作製した。色素含有熱硬化性樹脂粒子１０の平均粒子径は１５０ｎｍ、粒子径の変動係数は１０％であった。
　色素含有熱硬化性樹脂粒子１０につき輝点バラつき評価及び色素保持性評価を行った。結果を表１に示す。
［比較例１］
　蛍光色素であるペリレンジイミド１０．０ｍｇを水２０ｍＬに加えて溶解して得られた溶液に乳化重合用乳化剤である「エマルゲン（登録商標）４３０」（ポリオキシエチレンオレイルエーテル、花王（株）製）の５質量％水溶液を２ｍＬ加えた。この溶液をホットスターラー上で撹拌しながら７０℃に昇温させた後、この溶液にメラミン樹脂原料である「ニカラックＭＸ－０３５」（日本カーバイド工業（株）製）を固形分として０．３１ｇ加えた。さらに、この溶液に酸触媒であるドデシルベンゼンスルホン酸（関東化学（株）製）の１０質量％水溶液を０．７０ｍＬ加え、７０℃に加熱して５０分間撹拌し、さらに９０℃に昇温して２０分間撹拌して、メラミン樹脂の合成を行った。
　得られた樹脂粒子の分散液からの樹脂粒子の分離、さらに樹脂粒子に付着する余剰の樹脂原料や蛍光色素等の不純物を除くための洗浄を次のように行った。上記分散液を遠心分離機（クボタ（株）製マイクロ冷却遠心機３７４０）にて２００００Ｇで１５分間遠心分離し、上澄みを除去した後、分離された粒子に超純水を加え、超音波照射を行って再分散した。遠心分離、上澄み除去および超純水への再分散による処理を５回繰り返した。得られた樹脂粒子を色素含有樹脂粒子Ｒ１とした。色素含有樹脂粒子Ｒ１の粒子径は６０ｎｍ、変動係数は１２％であった。
　色素含有樹脂粒子Ｒ１につき輝点バラつき評価及び色素保持性評価を行った。結果を表２に示す。
［比較例２］
　「ニカラックＭＸ－０３５」を固形分量として０．４５ｇ使用したこと、ペリレンジイミドを１４．４ｍｇ使用したこと以外は比較例１と同様にして色素含有樹脂粒子Ｒ２を製造した。色素含有樹脂粒子Ｒ２の平均粒子径は１５０ｎｍ、粒子径の変動係数は１３％であった。
　色素含有樹脂粒子Ｒ２につき輝点バラつき評価及び色素保持性評価を行った。結果を表２に示す。
［比較例３］
　「ニカラックＭＸ－０３５」を固形分量として０．６０ｇ使用したこと、ペリレンジイミドを１８．０ｍｇ使用したこと以外は比較例１と同様にして色素含有樹脂粒子Ｒ３を製造した。色素含有樹脂粒子Ｒ３の平均粒子径は３００ｎｍ、粒子径の変動係数は１７％であった。
　色素含有樹脂粒子Ｒ３につき輝点バラつき評価及び色素保持性評価を行った。結果を表２に示す。
［比較例４］
　「ニカラックＭＸ－０３５」を固形分量として０．８４ｇ使用したこと、ペリレンジイミドを２７．０ｍｇ使用したこと以外は比較例１と同様にして色素含有樹脂粒子Ｒ２を製造した。色素含有樹脂粒子Ｒ４の平均粒子径は７５０ｎｍ、粒子径の変動係数は１８％であった。
　色素含有樹脂粒子Ｒ４につき輝点バラつき評価及び色素保持性評価を行った。結果を表２に示す。
［比較例５］
（シード粒子の作製）
　反応容器に水２０ｍＬ、スチレン０．２０ｇ、グリシジルメタクリレート０．０４ｇを入れ、Ａｒバブリングを行った。この溶液に、水溶性ラジカル発生剤である２，２－Ａｚｏｂｉｓ（２－ｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｉｎｅ）ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ ５０ｍｇを水０．５０ｍＬに溶解して得られた水溶液を０．２０ｍＬ添加した。反応容器にふたをして、７０℃に加熱して１２時間反応を行った。生成した樹脂粒子を含む白濁した反応液を遠心分離機（クボタ（株）製マイクロ冷却遠心機３７４０）にて２００００Ｇで９０分間遠心分離して、樹脂粒子を回収した。上澄みを除去した後、分離された粒子に超純水を加え、超音波照射を行って再分散した。遠心分離、上澄み除去および超純水への再分散による処理を３回繰り返した。得られた樹脂粒子をシード粒子Ｒ５とした。シード粒子Ｒ５の平均粒子径は６０ｎｍ、粒子径の変動係数は１１％であった。
（色素含有樹脂粒子の製造）
　反応容器に水２０ｍＬ、スチレン０．２０ｇ、グリシジルメタクリレート０．０４ｇ、１．０×１０14個のシード粒子Ｒ５を入れ、Ａｒバブリングを行った。この分散液に、２，２－Ａｚｏｂｉｓ（２－ｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｉｎｅ）ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ５０ｍｇを水０．５０ｍＬに溶解して得られた水溶液２０ｍｇを添加した。反応容器にふたをして、７０℃に加熱して１２時間反応を行った。生成した樹脂粒子を含む白濁した反応液を遠心分離機（クボタ（株）製マイクロ冷却遠心機３７４０）にて２００００Ｇで９０分間遠心分離して、樹脂粒子を回収した。上澄みを除去した後、分離された粒子に超純水を加え、超音波照射を行って再分散した。遠心分離、上澄み除去および超純水への再分散による処理を３回繰り返した。得られた樹脂粒子の水分散液に、これと同量のメタノールを加え、スターラーを用いて室温で激しく攪拌しながら、ペリレンジイミド９．５ｍｇをメタノール溶液として加えた。８時間後、水分散液を遠心分離機（クボタ（株）製マイクロ冷却遠心機３７４０）にて２００００Ｇで９０分間遠心分離して、樹脂粒子を回収した。上澄みを除去した後、回収した樹脂粒子を水に分散し、１．０μｍのフィルターでろ過し、余剰の色素を除去した。ろ別された樹脂粒子を水に再分散し、上記と同条件での遠心分離、上澄み除去および水への再分散による処理を３回繰り返した。得られた粒子を色素含有樹脂粒子Ｒ５とした。色素含有樹脂粒子Ｒ５の平均粒子径は１５０ｎｍ、粒子径の変動係数は７％であった。
　色素含有樹脂粒子Ｒ５につき輝点バラつき評価及び色素保持性評価を行った。結果を表２に示す。
［比較例６］
　シード粒子としてシード粒子Ｒ５を使用したこと以外は実施例３の「（色素含有熱硬化性樹脂粒子の製造）」と同様にして色素含有樹脂粒子Ｒ６を製造した。色素含有樹脂粒子Ｒ６の平均粒子径は１５０ｎｍ、粒子径の変動係数は８％であった。
　色素含有樹脂粒子Ｒ６につき輝点バラつき評価及び色素保持性評価を行った。結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002

Claims (11)

  1. 　熱硬化性樹脂により形成されたシード粒子を分散媒に分散させ、得られた分散液中で色素及び酸触媒の存在下に熱硬化性樹脂合成用モノマーを重合させる、色素含有熱硬化性樹脂粒子の製造方法。
  2. 　前記シード粒子の平均粒子径が２０～１５０ｎｍである請求項１に記載の色素含有熱硬化性樹脂粒子の製造方法。
  3. 　前記酸触媒がドデシルベンゼンスルホン酸を含む２種の酸の混合物である請求項１または２に記載の色素含有熱硬化性樹脂粒子の製造方法。
  4. 　前記色素含有熱硬化性樹脂粒子の平均粒子径が６０～７５０ｎｍである請求項１～３のいずれかに記載の色素含有熱硬化性樹脂粒子の製造方法。
  5. 　前記分散液中で熱硬化性樹脂合成用モノマーを重合させて得られる樹脂が、メラミン、尿素、グアナミン、フェノール、キシレンまたはこれらの誘導体から形成される構成単位を含む請求項１～４のいずれかに記載の色素含有熱硬化性樹脂粒子の製造方法。
  6. 　前記シード粒子を形成する熱硬化性樹脂が、前記分散液中で熱硬化性樹脂合成用モノマーを重合させて得られる熱硬化性樹脂と同種である請求項１～５のいずれかに記載の色素含有熱硬化性樹脂粒子の製造方法。
  7. 　前記シード粒子を、熱硬化性樹脂合成用モノマーを重合させて作製する請求項１～６のいずれかに記載の色素含有熱硬化性樹脂粒子の製造方法。
  8. 　前記シード粒子を、色素の存在下で熱硬化性樹脂合成用モノマーを重合させて作製する請求項７に記載の色素含有熱硬化性樹脂粒子の製造方法。
  9. 　前記シード粒子の作製時に存在した色素が、前記分散液中における熱硬化性樹脂合成用モノマーの重合時に存在した色素と同種である請求項８に記載の色素含有熱硬化性樹脂粒子の製造方法。
  10. 　前記色素が有機蛍光色素である請求項１～９のいずれかに記載の色素含有熱硬化性樹脂粒子の製造方法。
  11. 　前記有機蛍光色素がローダミンまたは芳香族系色素である請求項１０に記載の色素含有熱硬化性樹脂粒子の製造方法。
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