WO2017077163A1 - Dispositivo y sistema microfluídico para el estudio de cultivos celulares - Google Patents

Dispositivo y sistema microfluídico para el estudio de cultivos celulares Download PDF

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WO2017077163A1
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wells
ports
capillary
culture
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PCT/ES2016/070782
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Inventor
Luis J. FERNÁNDEZ LEDESMA
Rosa MONGE PRIETO
Guillermo LLAMAZARES PRIETO
José María AYUSO DOMÍNGUEZ
María VIRUMBRALES MUÑOZ
Jorge Santolaria Mazo
Ignacio OCHOA GARRIDO
Original Assignee
Universidad De Zaragoza
Centro De Investigación Biomédica En Red (Ciber)
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    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/16—Microfluidic devices; Capillary tubes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
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    • C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
    • C12M29/10—Perfusion
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/34—Internal compartments or partitions

Definitions

  • the present invention falls within the scope of microfluidic systems for the study of cell samples, both in surface and volume cultures. More specifically, the invention relates to a chip-type device and a microfluidic system equipped with culture wells, and rapid filling means thereof through capillary forces.
  • microfluidic circuits comprising a plurality of microchannels for the circulation of cells and corresponding culture media, as well as various chambers for culture. and the monitoring of said cells.
  • microfluidic chip device also referred to as a "bioreactor” for the cultivation and maintenance of living systems, which comprises a configuration of channels that allow a flow of perfused with diffusion exchange to the cultured tissue cells, but limiting cell migration.
  • the device comprises an arrangement of layers configured to give rise, within said chip, to at least one channel for receiving cells and liquid media, and an outer housing chamber to said channel, intended for the cultivation of samples cell phones.
  • the layers of the device can be formed with materials such as glass, Mylar, PDMS, silicon, polymers, semiconductor materials, or any combination thereof.
  • the described device comprises a porous barrier, which allows fluid communication between the reception channel and the culture chamber.
  • Said barrier can be constituted, for example, as a succession of separation partitions, to prevent or favor the passage of certain cells of the channel to the volume of the culture chamber.
  • the channel can also be subjected to a biocompatible coating layer that improves cell adhesion to the walls of the channel, promoting cell organization and the growth of introduced cells, thus giving rise to cultures located on the immediately higher volume. to formed by the three-dimensional culture chamber.
  • known pumps and infusion syringes represent a barrier to the operational efficiency of the systems known and used to date, being therefore necessary to find new filling systems that overcome this disadvantage.
  • known culture systems are preferably intended for the study of surface samples (for example, of cells seeded on a flat substrate of greater or lesser extent), also referred to as two-dimensional (2D) samples, or for the study of said samples in culture volumes, also referred to as three-dimensional (3D).
  • 2D two-dimensional
  • the present invention proposes a new microfluidic system based on fast capillarity filling media, whose design and technical elements allow, in addition, the cultivation and study of both surface cell samples, and arranged in a culture volume.
  • an object of the present invention is, therefore, to obtain cell culture devices that improve the perfusion means of the prior art systems, avoiding the use of complex elements to inject the fluid media (eg syringe pumps).
  • another object of the invention is the obtaining of cell culture devices and systems that allow, simultaneously, studies of two-dimensional and three-dimensional cultures. Said object is preferably achieved by means of a microfluidic device for the cultivation of cell samples comprising:
  • capillary channels for the circulation of cells and / or fluid media, said channels being connected to the wells as a means of perfusion thereof;
  • the ports of the device comprise volumes of liquid housing at a different level than the capillary channels, by way of pressure cylinders on said channels.
  • the device also comprises an upper region of access to the wells, which provides a two-dimensional cell culture surface adjacent thereto.
  • the inlet and outlet ports of the channels have an opening adaptable to a pipette and a fluidic connector. This achieves a versatile medium that allows both the seeding of cells and the circulation of fluid for the commissioning of the device.
  • the input ports of the device have a housing volume of at least 25 ⁇ . More preferably, the channels follow a curved path in the device and its cross section has a diameter between 300 and 500 microns. This achieves a configuration that enhances the generation of capillary forces in the channels, thus reducing the loading times of fluids in the device, compared to other alternatives of the prior art.
  • each capillary channel communicates several culture wells, these being distributed in rows. Thus, by the circulation of cells or fluid through said channel it is possible to perfuse a plurality of said culture wells.
  • the device comprises one or more walls that confine the perimeter of the upper region, for the maintenance of fluids in said region. It is thus possible to provide a means of accommodation for two-dimensional crops (that is, distributed on the surface of the upper region), communicated with the wells of the device.
  • Another object of the present invention relates to a microfluidic system for the study of cell cultures, which comprises a device according to any of the embodiments described herein, in combination with a closure cover for encapsulating the upper region of said device, coupling by way of independent pieces.
  • a fluid suspension for example, a hydrogel
  • the cover that acts as the upper part acts as a cover for the system, isolating the cultivation surface generated by the hydrogel and the upper surface of the lower part.
  • this upper part there are preferably cavities that will allow the formation of independent channels for each line of wells.
  • the closure cover of the system comprises a plurality of capillary fluidic channels, with a path coinciding with the distribution of the wells of the microfluidic device. More preferably, a plurality of fluidic inlet and outlet ports connected to each channel, where the ports comprise volumes of liquid housing at a different level than the capillary channels, by way of pressure cylinders on said channels. That is, both the device of the invention and its closing cover employ similar charging ports.
  • the channels are physically delimited, being isolated from each other.
  • the fluidic entrances of the upper part can act as a reservoir of culture medium, allowing its renewal by gravity.
  • connection via connector to an external fluidic system is also possible, allowing a flow to be generated through each channel in the system.
  • Figures 1a and 1b of the present document show, respectively, an elevation view and a top view of the device of the invention, in a preferred embodiment of said device where three capillary channels are used, and where each channel communicates nine culture wells three-dimensional
  • Figure 2 shows a perspective view of the device of Figures 1 a-1 b, including the internal detail of its components (channels and input / output ports).
  • Figure 3 shows an external perspective view of the device of Figures 1a-1 b.
  • Figures 4a-4b show, respectively, an elevation view and a top view of the closure cover of the invention, according to a preferred embodiment thereof.
  • Figure 5 shows a perspective view of the device of Figures 4a-4b, including the internal detail of its components.
  • Figure 6 shows a perspective view detailing the layers of the system of the invention (showing both the microfluidic device and the closure cover), according to a preferred embodiment of said system.
  • Figures 1a-1b show elevation and top views of a cell culture device, where its main elements are shown.
  • the device comprises one or more channels (1) for the circulation of cells and / or fluid media, for example media suitable for cell culture.
  • Each of said channels (1) is connected to a plurality of culture wells (2), which form cell housing volumes, in which it is possible to perform three-dimensional culture assays.
  • culture wells (2) which form cell housing volumes, in which it is possible to perform three-dimensional culture assays.
  • the device of the invention comprises an input port (3) and an output port (3 ') connected to the ends of each channel (2).
  • Said ports (3, 3 ') preferably have the ability to serve for the sowing of cells inside the device, as well as for the flow into the device through the circulation of fluid inside.
  • the sowing process is preferably carried out with a pipette that will fit in the inlet port (3), and in turn will allow the exit of gases, thus limiting the possibility of introducing bubbles into the system.
  • the upper part of the fluidic inlet of the port (3) can also be used to be coupled to a tube, thus allowing the device to be flowed.
  • the input ports (3) of the device allow generating an interface between the extracellular matrix and the completely flat culture medium.
  • These inlet ports (3) are located, as a pressure cylinder, above the level of the culture wells (2) and preferably house a volume of liquid of at least 25 ⁇ . This column of liquid exerts a hydrostatic pressure on the interface generated in these wells (2), which keeps said interface fixed in its completely flat position, thus avoiding any type of retraction.
  • the channels (1) follow a curved path in the device, and its cross section has a diameter between 300 and 500 microns.
  • the wells (2) will preferably have a larger diameter than the section of the channels (1).
  • the cross section of the channel (1) that circulates between the wells (2) favors the appearance of capillary forces that allow, without the use of pumps, a fluidic circuit filling that takes place in a few seconds. This phenomenon also occurs very quickly with viscous liquids, such as unpolymerized hydrogels. That is why, for these liquids, the section of the channel (1) cannot be less than 300 microns, thus preventing the hydrogel from clogging the channel (1) during the polymerization process, due to the small volume of hydrogel and the rapid tempering of the same in said case.
  • the device of the invention also comprises an upper region (4) for access to the wells (2), which configures it as an open chip and allows a fluid medium to be applied in said upper region (4), and can be used as mechanical stimulation of cultured cells.
  • the device of the invention allows at least three main modes of operation: analysis of the surface behavior (2D) of cells in different substrates (when fluid media are applied to the upper region (4)), analysis of three-dimensional cell cultures (3D) inside the wells (2) and, finally, a combined analysis of 2D and 3D cultures, given the openness of the wells (2), also accessible from the upper region (4) of the device .
  • the ability of the device to work in 2D, 3D and in a combination of both modes, allows to study complex multicellular processes, whose conditions can be replicated within the device.
  • An example for the application of these techniques would be the study of tissue invasion by tumor cell cultures in a three-dimensional matrix, or for example the simulation of complex cellular microenvironments, such as renal microtubules or pancreatic islets.
  • Other studies achievable by the device of the invention are, for example, analysis of fixed cell topography, gel stiffness measurements, microstructure topography of circulating gels, etc.
  • it also comprises a plurality of walls (5) confining the perimeter of the upper region (4), which allows said region (4) to be used to accommodate a small volume of culture medium.
  • Such measures include topography, cell-protein adhesion tests, cell-cell adhesion tests under different conditions, mechanical stimulation of the cells, or measures related to hydrogels in a liquid medium, more relevant for the characterization of the latter.
  • Other microscopy measurements for example by fluorescence microscopy, confocal laser microscopy or electron microscopy, are also realizable on the device of the invention.
  • the embodiments of the device of the invention can preferably be carried out by means of a design consisting of several layers of biocompatible polymeric materials (for example, PDMS, SU-8, etc.), which define the channels (1) and the wells (2) open, whose filling will be carried out, as described, by perfusion by capillary forces.
  • biocompatible polymeric materials for example, PDMS, SU-8, etc.
  • the different layers of device material can be manufactured, for example, by photolithography or injection molding.
  • Another object of the present invention relates to a microfluidic system for the study of cell cultures comprising the device described in preceding paragraphs, in combination with a closure cover (6) attachable on the upper region (4) of said device.
  • the device of the invention acts as a base support piece for the system, and said closing cover (6) acts as a closure thereof.
  • FIG. 4-6 of this document show how said cover (6) comprises, like the microfluidic device to which it is coupled, a plurality of fluidic distribution channels (7) coinciding with the wells (2) thereof.
  • the closure cover (6) provides, when its closure elements are applied on the upper region (4) of the device, a plurality of surface (two-dimensional, or 2D) culture matrices in the spaces immediately superior to the wells (2), thus communicating with them.
  • the closure cover (6) comprises a plurality of fluidic ports (8, 8 ') inlet and outlet connected to each channel (7).
  • the system of the invention allows to perform 3D crop analysis (in the wells (2)), in 2D (in the upper spaces formed in the interface of the upper accesses with the closing cover (6)) or in a combination of both, thus allowing combined 2D and 3D analysis.
  • the cultivation spaces are encapsulated and configured with their corresponding 3D culture chambers and storage surfaces.
  • Reversing the assay allows a detailed study of the cell monolayer. This is because it is closer to the base of the system, so the working distance is greatly reduced. This fact allows the use of very high magnification microscopy objectives, which have a very short working distance. Thus, very high resolution images of the monolayer cells could be obtained.
  • Reversal testing also facilitates other procedures. For example, by removing the bottom sheet of the device (for example, a bonded polystyrene sheet), it is possible to leave the monolayer exposed, thus facilitating the performance of immunofluorescence or atomic force microscopy tests in fixed cells, among other applications.
  • the bottom sheet of the device for example, a bonded polystyrene sheet

Abstract

La presente invención se refiere a un novedoso dispositivo y a un sistema microfluídico para el cultivo de muestras celulares, basado en: uno o más pocillos (2) de cultivo que conforman volúmenes de alojamiento de células para el cultivo tridimensional de las mismas; uno o más canales (1) capilares para la circulación de células y/o de medios fluidos, estando dichos canales (1) conectados a los pocillos (2) como medio de perfusión de los mismos; y un puerto de entrada (3) y un puerto de salida (3') para el sembrado de células y/o para la circulación de fluido en dicho canal (1), conectados dichos puertos (3, 3') a los extremos de cada canal (1) capilar. La novedosa configuración de los puertos (3, 3') y de sus canales (1) correspondientes permite mejorar los medios de perfusión microfluídicos conocidos, evitando el uso de elementos complejos para inyectar los medios fluidos, como por ejemplo, bombas de jeringa. Asimismo, la invención permite realizar, de forma simultánea, estudios de cultivo bidimensional y tridimensional.

Description

DISPOSITIVO Y SISTEMA MICROFLUÍDICO PARA EL ESTUDIO DE CULTIVOS CELULARES
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se enmarca en el ámbito de los sistemas microfluídicos para el estudio de muestras celulares, tanto en cultivos superficiales como de volumen. Más concretamente, la invención se refiere a un dispositivo de tipo chip y a un sistema microfluídico equipados con pocilios de cultivo, y medios de llenado rápido de los mismos a través de fuerzas capilares.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
En la actualidad, son conocidos diferentes sistemas de cultivo y análisis celular de tipo "laboratorio en chip", basados en circuitos microfluídicos que comprenden una pluralidad de microcanales para la circulación de células y de medios de cultivo correspondientes, así como diversas cámaras para el cultivo y la monitorización de dichas células.
Un ejemplo de los citados sistemas se describe en la solicitud de patente estadounidense US 2012/0003729 A1. Dicho documento se refiere a un dispositivo microfluídico de chip (también denominado como "biorreactor") para el cultivo y mantenimiento de sistemas vivos, que comprende una configuración de canales que permiten un flujo de perfundido con intercambio por difusión a las células del tejido cultivadas, pero limitando la migración celular. Para este fin, el dispositivo comprende una disposición de capas configuradas para dar lugar, en el interior de dicho chip, a al menos un canal para recibir células y medios líquidos, y una cámara de alojamiento exterior a dicho canal, destinada al cultivo de muestras celulares. Las capas del dispositivo pueden conformarse con materiales tales como vidrio, Mylar, PDMS, silicio, polímeros, materiales semiconductores, o cualquier combinación de los mismos.
Asimismo, el dispositivo descrito comprende una barrera porosa, que permite la comunicación de fluidos entre el canal de recepción y la cámara de cultivo. Dicha barrera puede estar constituida, por ejemplo, como una sucesión de tabiques de separación, para prevenir o favorecer el paso de determinadas células del canal al volumen de la cámara de cultivo. Por su parte, el canal puede estar también sometido a una capa de recubrimiento biocompatible que mejore la adhesión celular a las paredes del canal, promoviendo la organización celular y el crecimiento de las células introducidas, dando así lugar a cultivos localizados sobre el volumen inmediatamente superior al formado por la cámara de cultivo tridimensional. Para la utilización de los sistemas de cultivo celular del estado de la técnica, como el descrito en US 2012/0003729 A1 , resulta necesario equipar a los mismos con medios de perfusión para la introducción de las células y de los medios de cultivo, que se basan habitualmente en el uso de de bombas o jeringas aplicadas a entradas microfluídicas configuradas al efecto. No obstante, dicha necesidad supone una limitación en el uso de los sistemas de cultivo, ya que los citados medios de perfusión exigen periodos prolongados de llenado y de introducción de flujo al circuito microfluídico, que resultan excesivamente lentos y que limitan, pues, el rendimiento de los sistemas. Este inconveniente se ve agravado en equipos de alta miniaturización que comprenden un gran número de chips de cultivo, ya que los tiempos de llenado son directamente proporcionales al número de cámaras de dichos chips. Por tanto, las bombas y jeringas de perfusión conocidas suponen una barrera a la eficiencia operativa de los sistemas conocidos y empleados hasta la fecha, siendo en consecuencia necesario encontrar nuevos sistemas de llenado que superen esta desventaja. Adicionalmente, los sistemas de cultivo conocidos se destinan, preferentemente, bien al estudio de muestras superficiales (por ejemplo, de células sembradas sobre un sustrato plano de mayor o menor extensión), también denominadas como muestras bidimensionales (2D), o bien al estudio de dichas muestras en volúmenes de cultivo, también denominados como tridimensionales (3D). No obstante, no son conocidos los equipos que permiten, bajo un mismo diseño, albergar y estudiar ambos tipos de cultivos simultáneamente.
Con el objetivo de solucionar estos problemas planteados en el estado de la técnica (esto es, los tiempos excesivos durante la perfusión de los canales del sistema microfluídico, y la imposibilidad de analizar bajo un mismo diseño muestras en 2D y 3D), la presente invención plantea un novedoso sistema microfluídico basado en medios de llenado rápido por capilaridad, cuyo diseño y elementos técnicos permiten, además, el cultivo y estudio tanto de muestras celulares superficiales, como dispuestas en un volumen de cultivo.
DESCRIPCION BREVE DE LA INVENCION
Según la información planteada en el apartado anterior, un objeto de la presente invención es, pues, la obtención de dispositivos de cultivo celular que mejoren los medios de perfusión de los sistemas del estado de la técnica, evitando el uso de elementos complejos para inyectar los medios fluidos (por ejemplo, bombas de jeringa). Asimismo, otro objeto de la invención es la obtención de dispositivos y sistemas de cultivo celular que permitan, de forma simultánea, estudios de cultivos bidimensionales y tridimensionales. Dicho objeto se consigue, preferentemente, mediante un dispositivo microfluídico para el cultivo de muestras celulares que comprende:
- uno o más pocilios de cultivo que conforman volúmenes de alojamiento de células para el cultivo tridimensional de las mismas;
- uno o más canales capilares para la circulación de células y/o de medios fluidos, estando dichos canales conectados a los pocilios como medio de perfusión de los mismos; y
- un puerto de entrada y un puerto de salida para el sembrado de células y/o para la circulación de fluido en dichos canales, conectados dichos puertos a los extremos de cada canal capilar.
Ventajosamente, los puertos del dispositivo comprenden volúmenes de alojamiento de líquido a un nivel diferente al de los canales capilares, a modo de cilindros de presión sobre dichos canales. Adicionalmente, el dispositivo comprende también una región superior de acceso a los pocilios, que proporciona una superficie de cultivo celular bidimensional adyacente a los mismos.
Como consecuencia de este diseño especialmente concebido se consigue que, a través del contacto de cualquier fluido con las entradas de fluido del dispositivo, se produzca la perfusión completa del mismo por medio de fuerzas capilares. En otras palabras, el dispositivo se llena automáticamente como resultado de depositar una gota de líquido en cualquiera de los puertos de entrada de fluido. De este modo, el llenado no se debe a ningún protocolo especial de perfusión, sino que se lleva a cabo a través de fuerzas capilares, que resultan suficientes para perfundir la matriz de micro pocilios abiertos del dispositivo, llenándolos con el medio de cultivo deseado.
En una realización preferente de la invención, los puertos de entrada y de salida de los canales poseen una abertura adaptable a una pipeta y a un conector fluídico. Se consigue con ello un medio versátil que permite tanto el sembrado de células como la circulación de fluido para la puesta a punto del dispositivo.
En otra realización preferente de la invención, los puertos de entrada del dispositivo poseen un volumen de alojamiento de, al menos, 25 μΙ. Más preferentemente, los canales siguen una trayectoria curva en el dispositivo y su sección transversal posee un diámetro comprendido entre 300 y 500 mieras. Se consigue con ello una configuración que potencia la generación de fuerzas capilares en los canales, reduciendo así los tiempos de carga de fluidos en el dispositivo, comparado con otras alternativas del estado de la técnica. En otra realización preferente de la invención, cada canal capilar comunica varios pocilios de cultivo, estando éstos distribuidos en filas. De este modo, mediante la circulación de células o fluido por dicho canal es posible realizar la perfusión de una pluralidad de dichos pocilios de cultivo.
En otra realización preferente de la invención, el dispositivo comprende una o más paredes que confinan el perímetro de la región superior, para el mantenimiento de fluidos en dicha región. Se consigue con ello proporcionar un medio de alojamiento para cultivos bidimensionales (esto es, distribuidos sobre la superficie de la región superior), comunicados con los pocilios del dispositivo.
Otro objeto de la presente invención se refiere a un sistema microfluídico para el estudio de cultivos celulares, que comprende un dispositivo según cualquiera de las realizaciones aquí descritas, en combinación con una cubierta de cierre para el encapsulamiento de la región superior de dicho dispositivo, acoplándose a modo de piezas independientes. Ello permite configurar el dispositivo antes referido como una pieza inferior que contiene los canales inferiores por los que va a circular una suspensión de fluido (por ejemplo, un hidrogel), así como los pocilios que darán acceso a dicho fluido a la superficie del dispositivo. Por su parte, la cubierta que actúa como pieza superior hace las veces de tapa del sistema, aislando la superficie de cultivo generada por el hidrogel y la superficie superior de la pieza inferior. En esta pieza superior se disponen, preferentemente, oquedades que permitirán la formación de canales independientes para cada línea de pocilios.
En una realización preferente de la invención, la cubierta de cierre del sistema comprende una pluralidad de canales fluídicos capilares, de trazado coincidente con la distribución de los pocilios del dispositivo microfluídico. Más preferentemente, una pluralidad de puertos fluídicos de entrada y salida conectados a cada canal, donde los puertos comprenden volúmenes de alojamiento de líquido a un nivel diferente al de los canales capilares, a modo de cilindros de presión sobre dichos canales. Es decir, que tanto el dispositivo de la invención como su cubierta de cierre emplean puertos de carga análogos.
Cuando se realiza la unión de las dos piezas (es decir, cuando se aplica la cubierta de cierre sobre el dispositivo microfluídico), los canales quedan delimitados físicamente, quedando aislados unos de otros. En esta posición, es posible la siembra de cultivos bidimensionales de una suspensión celular, sobre la superficie delimitada por cada canal que a su vez comprende cada hilera de pocilios de fluido. Las entradas fluídicas de la pieza superior pueden actuar como reservorio de medio de cultivo, permitiendo la renovación del mismo por gravedad. De igual forma, también es posible la conexión vía conector a un sistema fluídico exterior, que permita generar un flujo a través de cada canal en el sistema.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Las Figuras 1a y 1 b del presente documento muestran, respectivamente, una vista en alzado y una vista superior del dispositivo de la invención, en una realización preferente de dicho dispositivo donde se emplean tres canales capilares, y donde cada canal comunica nueve pocilios de cultivo tridimensional.
La Figura 2 muestra una vista en perspectiva del dispositivo de las Figuras 1 a-1 b, incluyendo el detalle interno de sus componentes (canales y puertos de entrada/salida).
La Figura 3 muestra una vista externa en perspectiva del dispositivo de las Figuras 1a-1 b.
Las Figuras 4a-4b muestran, respectivamente, una vista en alzado y una vista superior de la cubierta de cierre de la invención, según una realización preferente de la misma.
La Figura 5 muestra una vista en perspectiva del dispositivo de las Figuras 4a-4b, incluyendo el detalle interno de sus componentes.
La Figura 6 muestra una vista en perspectiva detallando las capas del sistema de la invención (mostrando tanto el dispositivo microfluídico como la cubierta de cierre), según una realización preferente de dicho sistema.
- Descripción de las referencias numéricas de las Figuras: (1) Canales microfluídicos.
(2) Pocilios de cultivo tridimensional (3D).
(3, 3') Puertos de entrada y salida microfluídicos.
(4) Región superior de acceso a los pocilios para el cultivo bidimensional (2D).
(5) Paredes de confinamiento de la región superior de acceso a los pocilios.
(6) Cubierta de cierre del sistema microfluídico.
(7) Canales fluídicos de la cubierta de cierre.
(8, 8') Puertos de entrada y salida de la cubierta de cierre. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Se expone, a continuación, una descripción detallada de la invención, referida a una realización preferente de la misma basada en la Figuras 1-6 del presente documento. Dicha realización se aporta con fines ilustrativos y no limitativos.
Las Figuras 1a-1 b muestran vistas en alzado y superior de un dispositivo de cultivo celular, donde se muestran sus elementos principales. Preferentemente, el dispositivo comprende uno o más canales (1) para la circulación de células y/o de medios fluidos, por ejemplo medios aptos para el cultivo celular. Cada uno de dichos canales (1) está conectado a una pluralidad de pocilios (2) de cultivo, que conforman volúmenes de alojamiento de células, en los cuales es posible realizar ensayos de cultivo tridimensionales. De este modo, al circular las células o fluidos a través de cada canal (1), éstos ocuparán los volúmenes de cultivo al introducirse en los pocilios (2).
En las Figuras 1-3 del presente documento, se muestra una realización del dispositivo donde los pocilios (2) se encuentran dispuestos en la región superior de los canales (1). No obstante, otras realizaciones permiten también la configuración inversa, situando los pocilios (2) en una zona inferior.
Adicionalmente, el dispositivo de la invención comprende un puerto de entrada (3) y un puerto de salida (3') conectados a los extremos de cada canal (2). Dichos puertos (3, 3') poseen, preferentemente, la capacidad de servir para la siembra de células en el interior del dispositivo, así como para la puesta a flujo del mismo mediante la circulación de fluido en su interior. El proceso de siembra se realiza, preferentemente, con una pipeta que encajará en el puerto de entrada (3), y a su vez permitirá la salida de gases, limitando así la posibilidad de introducir burbujas en el sistema. Además, la parte superior de la entrada fluídica del puerto (3) puede utilizarse también acoplarse a un tubo, permitiendo así la puesta en flujo del dispositivo.
Los puertos de entrada (3) del dispositivo permiten generar una interfase entre la matriz extracelular y el medio de cultivo completamente plana. Estos puertos de entrada (3) se sitúan, a modo de cilindro de presión, sobre el nivel de los pocilios (2) de cultivo y albergan, preferentemente, un volumen de líquido de al menos 25 μΙ. Esta columna de líquido ejerce una presión hidrostática sobre la interfase generada en estos pocilios (2), lo que mantiene dicha interfase fija en su posición completamente plana, evitando así cualquier tipo de retracción.
En una realización preferente de la invención, los canales (1) siguen una trayectoria curva en el dispositivo, y su sección transversal posee un diámetro comprendido entre 300 y 500 mieras. Por su parte, los pocilios (2) poseerán preferentemente un diámetro superior al de la sección de los canales (1).
La sección transversal del canal (1) que circula entre los pocilios (2) favorece la aparición de fuerzas capilares que permiten, sin necesidad del uso de bombas, un llenado del circuito fluídico que se lleva a cabo en escasos segundos. Este fenómeno tiene lugar también de manera muy rápida con líquidos viscosos, como son los hidrogeles sin polimerizar. Es por ello que, para estos líquidos, la sección del canal (1) no puede ser inferior a 300 mieras, evitándose así que el hidrogel obstruya el canal (1) durante el proceso de polimerización, debido al escaso volumen de hidrogel y el rápido atemperamiento del mismo en dicho caso.
El dispositivo de la invención comprende, asimismo, una región superior (4) de acceso a los pocilios (2), que lo configura como un chip abierto y que permite aplicar un medio fluido en dicha región superior (4), pudiendo ser utilizado como estimulación mecánica de células cultivadas. De este modo, el dispositivo de la invención permite, al menos, tres modos principales de operación: análisis del comportamiento superficial (2D) de células en diferentes sustratos (cuando se aplican medios de fluido a la región superior (4)), análisis de cultivos celulares tridimensionales (3D) en el interior de los pocilios (2) y, finalmente, un análisis combinado de cultivos 2D y 3D, dado el carácter abierto de los pocilios (2), accesibles también desde la región superior (4) del dispositivo. La capacidad del dispositivo de trabajar en 2D, 3D y en una combinación de ambos modos, permite estudiar procesos multicelulares complejos, cuyas condiciones pueden ser replicadas dentro del dispositivo. Un ejemplo para la aplicación de estas técnicas sería el estudio de la invasión de tejidos por los cultivos de células tumorales en una matriz tridimensional, o por ejemplo la simulación de microambientes celulares complejos, tales como microtúbulos renales o islotes pancreáticos. Otros estudios realizables mediante el dispositivo de la invención son, por ejemplo, análisis de la topografía de células fijadas, medidas de rigidez del gel, topografía de la microestructura de los geles circulantes, etc. En una realización preferente del dispositivo, éste comprende también una pluralidad de paredes (5) confinando el perímetro de la región superior (4), lo que permite utilizar dicha región (4) para alojar un pequeño volumen de medio de cultivo. Esto permite, en equipos con características apropiadas para ello, la realización de medidas de microscopía de fuerza atómica en célula viva. Dichas medidas incluyen topografía, ensayos de adhesión célula- proteína, ensayos de adhesión célula-célula en diferentes condiciones, estimulación mecánica de las células, o medidas relacionadas con los hidrogeles en un medio líquido, más relevante para la caracterización de estos últimos. Otras medidas de microscopía, por ejemplo mediante microscopía de fluorescencia, microscopía láser confocal o microscopía electrónica, son también realizables sobre el dispositivo de la invención. Adicionalmente, al quedar los pocilios (2) al descubierto, cabe también la posibilidad de extraer los hidrogeles mediante troquelado específico, por ejemplo con un émbolo. Esto permite el análisis posterior de las células inmersas en la matriz, si así se desea.
Las realizaciones del dispositivo de la invención se pueden llevar a cabo, preferentemente, mediante un diseño consistente en varias capas de materiales poliméricos (por ejemplo, PDMS, SU-8, etc.) biocompatibles, que definen los canales (1) y los pocilios (2) abiertos, cuyo llenado se realizará, como se ha descrito, mediante perfusión por fuerzas capilares. En este sentido, el diseño del dispositivo de la invención hace que sea fácil de manejar, ya que los pocilios (2) se perfunden automáticamente en cuestión de microsegundos. Las diferentes capas de material del dispositivo pueden fabricarse, por ejemplo, mediante fotolitografía o moldeo por inyección.
Otro objeto de la presente invención se refiere a un sistema microfluídico para el estudio de cultivos celulares que comprende el dispositivo descrito en párrafos precedentes, en combinación con una cubierta de cierre (6) acoplable sobre la región superior (4) de dicho dispositivo. De este modo, el dispositivo de la invención actúa como pieza base de soporte al sistema, y la citada cubierta de cierre (6) actúa como cierre del mismo.
Una realización preferente de la cubierta de cierre (6) de la invención se muestra en las Figuras 4-6 del presente documento. En ellas se aprecia cómo dicha cubierta (6) comprende, al igual que el dispositivo microfluídico al que se acopla, una pluralidad de canales fluídicos (7) de distribución coincidente con los pocilios (2) del mismo. De este modo, la cubierta de cierre (6) proporciona, al aplicarse sus elementos de cierre sobre la región superior (4) del dispositivo, una pluralidad de matrices de cultivo superficiales (bidimensionales, o 2D) en los espacios inmediatamente superiores a los pocilios (2), estando así comunicados con éstos.
Adicionalmente, para la introducción de células y medios fluidos en las cámaras superficiales, la cubierta de cierre (6) comprende una pluralidad de puertos fluídicos (8, 8') de entrada y salida conectados a cada canal (7). Con ello, el sistema de la invención permite realizar análisis de cultivos en 3D (en los pocilios (2)), en 2D (en los espacios superiores formados en la interfaz de los accesos superiores con la cubierta de cierre (6)) o en una combinación de ambos, permitiendo así análisis combinados 2D y 3D. Cuando se realiza el cierre del sistema (por medio de la aplicación de la pieza de cierre (6) sobre el dispositivo, que hace de pieza base), los espacios de cultivo quedan encapsulados y configurados con sus correspondientes cámaras de cultivo 3D y superficies de cultivo 2D. Según los ensayos que se desee realizar, también resulta factible la perfusión de las matrices de forma inversa en el sistema de la invención. En otras palabras, es posible perfundir el canal superior (7) (normalmente destinado a flujo) con un hidrogel a elección del usuario. Esto es posible debido a las entradas bifuncionales (3, 3', 8, 8') pipeta-conector con las que cuenta el dispositivo y el sistema de la invención. El hidrogel quedaría, así, confinado en la parte superior del dispositivo. Una vez polimerizado el hidrogel en la parte superior del sistema, una suspensión celular puede ser pipeteada a través de los puertos (3, 3') y canales (1) de la pieza inferior, llenando el volumen destinado a los pocilios (2). Invirtiendo posteriormente el dispositivo, puede sembrarse una monocapa sobre la interfaz de gel situada en dichos pocilios (2). Consecuentemente, una vez adheridas las células, puede aplicarse flujo a través de los canales inferiores (1).
La realización del ensayo de manera inversa, permite un estudio detallado de la monocapa celular. Esto es debido a que ésta queda más próxima a la base del sistema, por lo que la distancia de trabajo se reduce considerablemente. Este hecho posibilita el uso de objetivos de microscopía de muy alto aumento, que cuentan con una muy corta distancia de trabajo. Así pues, podrían obtenerse imágenes de muy alta resolución de las células en monocapa.
La realización de los ensayos de forma inversa facilita también otros procedimientos. Por ejemplo, eliminando la lámina inferior del dispositivo (por ejemplo, una lámina de poliestireno adherida), es posible dejar la monocapa al descubierto, facilitando así la realización de ensayos de inmunofluorescencia o de microscopía de fuerza atómica en célula fijada, entre otras aplicaciones.

Claims

REIVINDICACIONES
1. - Dispositivo microfluídico para el cultivo de muestras celulares que comprende:
- uno o más pocilios (2) de cultivo que conforman volúmenes de alojamiento de células para el cultivo tridimensional de las mismas;
- uno o más canales (1) capilares para la circulación de células y/o de medios fluidos, estando dichos canales (1) conectados a los pocilios (2) como medio de perfusión de los mismos;
- un puerto de entrada (3) y un puerto de salida (3') para el sembrado de células y/o para la circulación de fluido en dicho canal (1), conectados dichos puertos (3, 3') a los extremos de cada canal (1) capilar;
donde dicho dispositivo está caracterizado por que los puertos (3, 3') comprenden volúmenes de alojamiento de líquido a un nivel diferente al de los canales (1) capilares, a modo de cilindros de presión sobre dichos canales (1); y donde el dispositivo comprende una región superior (4) de acceso a los pocilios (2), que proporciona una superficie de cultivo celular bidimensional adyacente a los mismos.
2. - Dispositivo según la reivindicación anterior, donde los puertos de entrada (3) y de salida (3') de los canales (1) poseen una abertura adaptable a una pipeta o a un conector fluídico.
3. - Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde los puertos de entrada (3) poseen un volumen de alojamiento de, al menos, 25 μΙ.
4.- Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde los canales
(1) siguen una trayectoria curva en el dispositivo y su sección transversal posee un diámetro comprendido entre 300 y 500 mieras.
5. - Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde cada canal (1) capilar comunica varios pocilios (2) de cultivo, estando éstos distribuidos en filas.
6. - Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, formado por uno o más materiales poliméricos biocompatibles.
7.- Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende una o más paredes (5) confinando el perímetro de la región superior (4) para el alojamiento de fluidos en dicha región superior (4).
8. - Sistema microfluídico para el estudio de cultivos celulares caracterizado por que comprende un dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en combinación con una cubierta de cierre (6) para el encapsulamiento de la región superior (4) de dicho dispositivo.
9. - Sistema según la reivindicación anterior, donde la cubierta de cierre (6) comprende una pluralidad de canales fluídicos (7) capilares, de trazado coincidente con la distribución de los pocilios (2) del dispositivo microfluídico.
10. - Sistema según cualquiera de las reivindicaciones 8-9, donde la cubierta de cierre (6) comprende una pluralidad de puertos fluídicos (8, 8') de entrada y salida conectados a cada uno de los canales capilares (7), donde los puertos (8, 8') comprenden volúmenes de alojamiento de líquido a un nivel diferente al de los canales (7) capilares, a modo de cilindros de presión sobre dichos canales (7).
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