WO2017065096A1 - ポリアクリルアミドゲル - Google Patents

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WO2017065096A1
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ipg gel
acrylamide
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Inventor
節夫 木之下
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プロメディコ株式会社
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis

Definitions

  • the present invention relates to a strip-shaped, dried polyacrylamide gel having a fixed pH gradient, which is used for first-dimension isoelectric focusing in two-dimensional electrophoresis.
  • agarose gel and polyacrylamide gel are generally used.
  • substituted or unsubstituted acrylamide hereinafter referred to as “acrylamide monomer”.
  • acrylamide monomer substituted or unsubstituted acrylamide
  • the resulting polyacrylamide gel with a fixed pH gradient hereinafter referred to as “IPG gel” has the advantage that it exhibits a stable pH gradient during electrophoresis and a narrow pH range can be used. Yes.
  • the strip-shaped dried IPG gel can be stored at a low temperature, can be used simply by swelling, and is easy to handle, and thus is suitable for use.
  • Such a strip-shaped dried IPG gel generally forms a slab gel having a desired pH range and pH gradient on a rectangular hydrophilic plastic film, and the resulting gel is dried and applied to the surface of the dried gel. After the protective film is adhered, it is manufactured by cutting into strips of the desired width along the direction of the pH gradient.
  • strip-like dried IPG gels having various pH ranges and lengths (lengths in the longitudinal direction) are commercially available from GE Healthcare, Bio-Rad, Sigma-Aldrich, and the like. These gels are usually obtained from a polymerization solution containing acrylamide as an acrylamide monomer and N, N′-methylenebisacrylamide (BIS) as a crosslinking agent in amounts of 4.0% T and 3.0% C.
  • the gel has a width (length in the short direction) of 3 mm or 3.3 mm.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application Laid-Open No.
  • the IPG gel has the advantage of being excellent in the resolution of isoelectric focusing.
  • the protein spot in the two-dimensional electrophoresis image is perpendicular to the second-dimension electrophoresis direction.
  • the phenomenon of stretching has been pointed out. This phenomenon is caused by a lack of concentration of proteins with respect to the isoelectric point. This lack of concentration also leads to streaking.
  • Non-Patent Document 1 http://www.sharp.co.jp/sms/release/bm-100/na_auto2d — 005c.pdf
  • acrylamide and BIS are 4.0% T, 3.0% C
  • a two-dimensional electrophoresis image obtained by using an IPG gel obtained from a polymerization solution containing the amount of 3.6% T or the amount of 3.6% T, 2.7% C is shown. Stretching is observed in the direction perpendicular to the surface.
  • an object of the present invention is to provide a strip-like drying used for first-dimension isoelectric focusing, which can provide stable spot separation performance by suppressing spot extension in two-dimensional electrophoresis.
  • An IPG gel is provided.
  • the inventor changed the composition of the polymerization solution to produce various types of dried IPG gels in the form of strips, and then performed isoelectric focusing using this IPG gel and then performed the second slab gel electrophoresis.
  • the relationship between the direction of migration of the spot in the second dimension and the extension in the perpendicular direction was investigated.
  • a group of IPG gels were found that can suppress the extension of the spots in the direction perpendicular to the migration direction of the spot as compared with the case where a commercially available IPG gel is used.
  • it was found that the use of an IPG gel with a relatively low protein mobility suppresses the extension of the spot in the direction perpendicular to the migration direction.
  • it was found that using an IPG gel with a relatively low protein mobility the spot tends to extend in the second dimensional migration direction.
  • the two migration lines gradually approach as the width of the IPG gel decreases.
  • FIG. It turned out to be a book running line.
  • the IPG gel having a relatively small protein mobility is reduced to 1.5 mm or less and isoelectric focusing is performed using this IPG gel, the second slab gel electrophoresis is performed.
  • the extension of the spot in the migration direction is also suppressed, and thus stable in two-dimensional electrophoresis. It was found that spot separation performance was obtained. From this, it is considered that the cause of the extension of the spot in the migration direction in the two-dimensional electrophoresis is the above-described two migration lines.
  • the present invention is a strip-shaped dry IPG gel used for first-dimension isoelectric focusing in two-dimensional electrophoresis, having a width of 1.5 mm or less, and this IPG gel It relates to an IPG gel characterized in that the relative mobility of a marker protein having a molecular mass of 25 kDa measured by swelling the gel is 0.91 or less.
  • the value of the width of the gel (the length in the short direction) in the present invention means the width of the gel in a dry state.
  • the length of the gel of the present invention (length in the longitudinal direction) and the thickness of the gel are not particularly limited as long as they do not hinder the second-dimensional electrophoresis.
  • FIG. 1 is a diagram for explaining measurement of relative mobility
  • FIG. 1A is a schematic side sectional view of a measuring apparatus.
  • a swelling liquid for example, 250 mM trishydroxymethylaminomethane (Tris) -HCl pH 8.8 swelling liquid.
  • Tris trishydroxymethylaminomethane
  • a known swelling solution can be used without particular limitation, but the swelling time needs to be carried out until sufficient swelling of the IPG gel 1 is ensured.
  • the IPG gel 1 absorbs the swelling liquid, and the weight of the swollen IPG gel 1 increases as the swelling time elapses.
  • the relationship with the weight of the gel 1 is measured in advance, and the swelling is performed until the weight of the IPG gel 1 after swelling becomes substantially constant.
  • a notch with a width of 0.5 mm is formed at a position about 1 cm away from the plus extreme part of the gel, and a molecule is formed in the notch.
  • An aqueous solution containing at least a marker protein having a mass of 25 kDa, a trace amount of bromophenol blue (BPB) and agarose for fixation is introduced and solidified to form the sample portion 20.
  • a marker protein with a molecular mass of 25 kDa can be used in a commercial product in the amount specified in the product specification.
  • the sample part may contain a protein other than the marker protein having a molecular mass of 25 kDa.
  • a filter paper 30 soaked with a buffer containing 1% SDS is placed, and an electrode cylinder 20 having a semipermeable membrane 21 at the bottom is placed on the filter paper 30.
  • the SDS-PAGE electrophoresis buffer 22 described above is introduced into the electrode cylinder 20, and the electrode 23 connected to the power supply 40 is introduced into the electrophoresis buffer 22.
  • FIG. 1B shows a schematic plan view of the IPG gel 1 when electrophoresis is stopped.
  • the width of the strip-shaped dried IPG gel is 1.5 mm or less, and the relative mobility of the marker protein having a molecular mass of 25 kDa measured by swelling the IPG gel is 0.91 or less, preferably 0.71.
  • the slab gel for the second dimensional electrophoresis may have a concentrated gel part and a separation gel part, but the IPG gel of the present invention suitably suppresses the extension of spots in the migration direction.
  • the IPG gel of the present invention can be suitably used even when combined with a slab gel having only a separation gel portion.
  • the width of the IPG gel of the present invention is no problem as long as it is 1.5 mm or less, but is generally 0.5 mm or more in consideration of the ease of cutting during manufacture and the ease of handling during use.
  • the acrylamide monomer, crosslinking agent, and acrylamide derivative for producing the IPG gel of the present invention are not particularly limited. Although it can be used, it is preferred to use DATD as the cross-linking agent. By using DATD, the pore size of the IPG gel can be increased compared to the IPG gel obtained from the polymerization solution containing 4.0% T and 3.0% C of conventional acrylamide and BIS. Therefore, a high molecular weight protein can be introduced into the IPG gel of the present invention.
  • DATD crosslinking agent
  • a polymerization solution of 5.5% T or more and a polymerization solution of 20.0% C or more, more preferably 30.0% C or more. From such a polymerization solution, a high-strength IPG gel can be produced with high productivity.
  • the extension of the spots in the two-dimensional electrophoresis in the migration direction is performed. And the extension in the direction perpendicular to the migration direction are suppressed, and stable spot separation performance can be obtained.
  • FIG. 1 It is explanatory drawing about the measurement of a relative mobility, (A) has shown schematic side sectional drawing of the measuring apparatus, (B) has shown schematic plan view of IPG gel, respectively. It is an image showing the relationship between the width of the gel and the appearance of the migration line for IPG gels (polymerization solution; monomer is acrylamide, crosslinker is DATD, 5.5% T, 20.0% C) with different widths, (A) is an image about 1.5 mm width gel, (B) is an image about 3.0 mm width gel. 2A is a two-dimensional electrophoresis image obtained using IPG gels (polymerization solution; monomer is acrylamide, crosslinker is DATD, 5.5% T, 20.0% C).
  • the strip-shaped dry IPG gel of the present invention used for first-dimension isoelectric focusing in two-dimensional electrophoresis has a width of 1.5 mm or less, and the molecules measured by swelling the IPG gel.
  • the relative mobility of the marker protein having a mass of 25 kDa is 0.91 or less, preferably 0.71 or less.
  • the strip-shaped dried IPG gel of the present invention comprises an acrylamide monomer, a crosslinking agent copolymerizable with the acrylamide monomer, and a weakly acidic or weakly basic buffer group copolymerizable with the acrylamide monomer. And an acrylamide derivative having a polymerization solution.
  • acrylamide monomer compounds conventionally known as monomers for IPG gel can be used without particular limitation. Examples thereof include acrylamide, 2-methylacrylamide, N-methylacrylamide, and N-ethylacrylamide. N, N-dimethylacrylamide, N-isopropylacrylamide, diacetone acrylamide, and N-acryloylaminopropanol.
  • monomer a single compound may be used, or two or more compounds may be mixed and used.
  • a compound conventionally known as a cross-linking agent for IPG gel can be used without particular limitation. Examples thereof include BIS, PDA, DATD, N, N′-bisacryloylcystamine, Examples include dihydroxyethylene bisacrylamide and pentamethylene bisacrylamide.
  • the crosslinking agent a single compound may be used, or two or more compounds may be mixed and used. It is preferred to use DATD as the cross-linking agent.
  • DATD the pore size of the IPG gel can be increased compared to the IPG gel obtained from the polymerization solution containing 4.0% T and 3.0% C of conventional acrylamide and BIS. Therefore, a high molecular weight protein can be introduced into the IPG gel of the present invention.
  • acrylamide derivative a compound conventionally known as an acrylamide derivative for an IPG gel can be used without particular limitation, and examples thereof include an acrylamide derivative having a carboxy group and an acrylamide derivative having an amino group. .
  • These acrylamide derivatives are also known under the name Immobiline.
  • a plurality of acrylamide derivatives having different acid dissociation constants are mixed and used depending on a desired pH range for the IPG gel. Combinations and amounts of acrylamide derivatives used are, for example, P.I. G. It can be determined by referring to Righetti, Immobilized pH gradients: theory and methodology (1990).
  • the IPG gel is generally produced by the following steps. First, an acidic polymerization solution and a basic polymerization solution containing the acrylamide monomer, the crosslinking agent, an acrylamide derivative selected depending on the desired pH range, and a solvent are prepared.
  • the solvent of one of the acidic polymerization solution and the basic polymerization solution is water, but the solvent of the other polymerization solution is water and a solvent used for the purpose of increasing the specific gravity of the polymerization solution, preferably Is a mixed solvent with glycerol.
  • % T and% C of the acidic side polymerization solution and the basic side polymerization solution are adjusted to have the same value.
  • the values of% T and% C indicate that the relative mobility of the marker protein having a molecular mass of 25 kDa measured by swelling the obtained IPG gel is 0.91 or less depending on the type of acrylamide monomer and crosslinking agent used. These values can be easily determined by a preliminary experiment for preparing an IPG gel.
  • DATD as the crosslinking agent, it is preferable to use a polymerization solution of 5.5% T or more, and a polymerization solution of 20.0% C or more, more preferably 30.0% C or more. From such a polymerization liquid, an IPG gel suitable for use exhibiting high strength can be produced with high productivity.
  • the pH of the acidic side polymerization solution and the basic side polymerization solution is adjusted to neutral using an acetic acid / sodium hydroxide buffer solution, etc., and then a polymerization initiator and a polymerization accelerator are used.
  • a polymerization initiator ammonium persulfate can be preferably used, and as the polymerization accelerator used in combination with this, N, N, N ′, N′-tetramethylenediamine can be preferably used. .
  • the acidic side polymerization solution obtained using a mixer such as a gradient mixer and a static mixer and the basic side polymerization solution are mixed while continuously changing the mixing ratio, and the resulting mixture solution is a peristic pump, Using a pump such as a piezo pump or a natural fall phenomenon, the gel is filled between glass plates of a gel preparation jig having two glass plates arranged to face each other.
  • a hydrophilic plastic film for adhering the generated gel generally called a gel bond film, is installed in advance.
  • the distance between the two glass plates is adjusted to, for example, about 1 mm or less so that an IPG gel with a desired thickness can be obtained.
  • the filling amount of the polymerization solution is adjusted within a range of, for example, 50 mm to 240 mm so that an IPG gel having a desired length can be obtained.
  • the acrylamide monomer, the crosslinking agent, and the acrylamide derivative are copolymerized.
  • it may be heated to 20 to 50 ° C. in a nitrogen atmosphere as necessary.
  • the slab-like gel adhered to the hydrophilic plastic is removed from the glass plate, taken out, washed with pure water, and further immersed in glycerol for washing. Then, it is dried until the water of the slab-like gel almost disappears.
  • a plastic protective film is adhered to the gel surface after drying, and then the gel is cut along a pH gradient together with the hydrophilic plastic film and the protective film to obtain a dried IPG gel in the form of a strip.
  • the cutting is performed so that the width of the strip is 1.5 mm or less.
  • the width of the IPG gel of the present invention if it is 1.5 mm or less, but it is generally 0.5 mm or more in consideration of the ease of cutting during manufacture and the ease of handling during use.
  • the resulting strip of dried IPG gel can be stored at a low temperature of about -20 ° C.
  • the IPG gel of the present invention is used for the first-dimension isoelectric focusing in the two-dimensional electrophoresis, like the conventional IPG gel.
  • Conventionally known conditions can be used without particular limitation for the sample preparation conditions for isoelectric focusing, the applied voltage in isoelectric focusing, and the running conditions such as the running time.
  • the equilibration conditions for the second dimension SDS-PAGE of the IPG gel after electrophoresis, the electrophoresis conditions such as the applied voltage and the migration time in the second dimension SDS-PAGE are the same as those conventionally known. It can be used without particular limitation.
  • the slab gel for the second dimensional electrophoresis may have a concentrated gel part and a separation gel part, but the IPG gel of the present invention suitably suppresses the extension of spots in the migration direction.
  • the IPG gel of the present invention is suitably used in combination with a slab gel having only a separation gel part.
  • the second-dimensional electrophoresis may be performed in a state where the gel after subjecting the IPG gel of the present invention to isoelectric focusing is fixed to the end of the second-dimensional slab gel using an agarose aqueous solution,
  • the gel after subjecting the IPG gel of the present invention to isoelectric focusing may be carried out in a state where the gel is physically pressed against the end of the second slab gel.
  • the acidic side polymerization solution obtained using the gradient mixer and the basic side polymerization solution were mixed while continuously changing the mixing ratio, and the obtained mixed solution was placed oppositely by a peristaltic pump. It filled between the glass plates of the gel preparation jig which has a sheet of glass plates. A hydrophilic plastic film was placed on one surface of the glass plate before filling with the polymerization liquid.
  • the IPG gel of the conventional example is 10 hours or more, other IPG gels For more than two hours, to swell the IPG gel on standing.
  • the swollen IPG gel is set in an isoelectric focusing device, and the applied voltage is increased stepwise at 15 ° C. (250 V 30 minutes ⁇ linearly 1000 V for 30 minutes ⁇ linearly 8000 V for 90 minutes ⁇ 8000 V For 120 minutes) isoelectric focusing.
  • the number of electrophoresis lines was evaluated with the fluorescence imager. Table 2 summarizes the results.
  • FIG. 2 shows images of gels after electrophoresis for the gels of Example 2 and Comparative Example 8.
  • A has shown the image regarding the gel of Example 2
  • B has shown the image regarding the gel of the comparative example 8, respectively.
  • the gel of Comparative Example 8 has two migration lines, whereas the gel of Example 2 has only one migration line.
  • Table 2 regardless of the composition of the polymerization solution, when a strip-shaped dry IPG gel having a gel width of 1.5 mm or less is used, only one migration line is recognized, and the gel exceeds 1.5 mm. It can be seen that when a strip-shaped dried IPG gel having a width is used, two migration lines are observed.
  • a notch portion having a width of 0.5 mm was formed at a position about 1 cm away from the plus extreme portion of the gel, and a marker protein set containing a marker protein having a molecular mass of 25 kDa in this notch portion (Precision, manufactured by Bio-Rad).
  • filter paper soaked with SDS-PAGE electrophoresis buffer containing 25 mM Tris, 192 mM glycine, and 0.1% SDS is placed on both ends of the swollen IPG gel, and the bottom is semi-permeable on the filter paper.
  • An electrode cylinder provided with a membrane and having the SDS-PAGE electrophoresis buffer and electrodes introduced therein was disposed. Subsequently, after introducing into the said measurement container until the IPG gel which swelled mineral oil was covered, the voltage was applied between electrodes (80V6min-> 120V), and electrophoresis was implemented.
  • Table 3 shows the relative mobility values for the IPG gel having a gel width of 1.5 mm, together with the values for the conventional IPG gel. As is apparent from Table 3, the value of relative mobility greatly changed depending on the composition of the polymerization solution used.
  • a protein amount of 12 ⁇ g of the obtained liquid was collected, and a swelling buffer (7M urea, 2M thiourea, 4% CHAPS, 1.2% DeStrike Reagent (manufactured by GE Healthcare), 0.5% IPG Buffer pH3- 10 NL), dilute the total liquid volume to 125 ⁇ L for an IPG gel with a gel width of 3.0 mm, and 80 ⁇ L for the other gel width IPG gel to obtain a sample liquid It was.
  • a swelling buffer (7M urea, 2M thiourea, 4% CHAPS, 1.2% DeStrike Reagent (manufactured by GE Healthcare), 0.5% IPG Buffer pH3- 10 NL
  • the obtained sample liquid is linearly spread on a swelling tray, and in the swollen state, a strip-like dried IPG gel showing a relative mobility of a marker protein having a molecular mass of 25 kDa of 0.91 or less and the above-described conventional strip
  • Each of the dried IPG gels was immersed and allowed to stand for 2 hours or more (maximum 16 hours) to swell the IPG gel.
  • the swollen IPG gel is set in an isoelectric focusing device, and the applied voltage is increased stepwise at 15 ° C. (250 V 30 minutes ⁇ linearly 1000 V for 30 minutes ⁇ linearly 8000 V for 90 minutes ⁇ 8000 V For 120 minutes) isoelectric focusing.
  • the IPG gel was collected from the isoelectric focusing device, introduced into a 15 mL tube, and equilibrated with buffer A (375 mM Tris-HCl pH 8.8, 6 M urea, 2% SDS, 20% glycerol, 2% dithiothreitol (DTT). )) was introduced into the tube and shaken for 10 minutes.
  • the equilibration buffer A is then discarded, and instead equilibration buffer B (375 mM Tris-HCl pH 8.8, 6 M urea, 2% SDS, 20% glycerol, 4.5% iodoacetamide) is introduced into the tube, and an additional 10 Shake for a minute. Then, it was washed twice with a washing solution (125 mM Tris-HCl pH 6.8, 0.1% SDS).
  • Encapsulated agarose (0.5% agarose, 125 mM Tris-HCl pH 6.8, 0.1% SDS) was heated to dissolve the agarose, and then a slab gel having no concentrated gel part (monomer is acrylamide, crosslinker is BIS) 12.0% T) is poured into the upper end of the slab gel of the gel plate, and immediately after the equilibrated and washed IPG gel is horizontal to the position of the upper end of the slab gel in the enclosed agarose gel. Set.
  • the slab gel was set in an electrophoresis tank, filled with the electrophoresis buffer (0.3% Tris, 1.44% glycine, 0.1% SDS), and voltage was applied (80V for 30 minutes) ⁇ 200V for about 2 hours), the second-dimensional electrophoresis was performed. After the electrophoresis was completed, the slab gel was set on a fluorescence image scanner together with the gel plate, and the fluorescence of Cy5 in acrylamide was scanned to obtain a two-dimensional electrophoresis image.
  • FIG. 3 shows images obtained by photographing the gel after two-dimensional electrophoresis for the experiment using the IPG gel of Example 2 and Comparative Example 8.
  • (A) shows an image obtained using the gel of Example 2
  • (B) shows an image obtained using the gel of Comparative Example 8.
  • FIG. 3 in the image obtained using the gel of Comparative Example 8, the spots are extended in the migration direction, whereas in the image obtained using the gel of Example 2, The extension of the spot in the migration direction is greatly suppressed. It can also be seen that there is almost no difference in the extension of the spot in the direction perpendicular to the migration direction.
  • Table 4 summarizes the relationship between the used IPG strip gel and the extension of the spots in the migration direction.
  • FIG. 4 and FIG. 5 show the concentrated gel part (monomer) after performing isoelectric focusing using the strip-shaped dried IPG gel of Example 3 or the above-described conventional strip-shaped dried IPG gel.
  • BIS was BIS, 4.0% T
  • a separation gel part (monomer was acrylamide, BIS was 12.0% T).
  • the two-dimensional electrophoresis image is shown.
  • 4 is an image obtained using the IPG gel of Example 3
  • FIG. 5 is an image obtained using the conventional IPG gel.
  • the dried IPG gel in the form of a strip according to the present invention not only the extension of the spot in the two-dimensional electrophoresis but also the extension in the direction perpendicular to the migration direction is suppressed, and the spot in the two-dimensional electrophoresis is suppressed. It was found that the separation performance of was improved.
  • a dried IPG gel in the form of a strip that suppresses both extension of the spot in the two-dimensional electrophoresis in the migration direction and extension in the direction perpendicular to the migration direction.

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Abstract

二次元電気泳動におけるスポットの泳動方向への伸張と泳動方向と垂直な方向への伸張の両方を抑制し、スポットの分離性能を向上させることが可能な、一次元目の等電点電気泳動に用いられるポリアクリルアミドゲルを提供する。　本発明の二次元電気泳動における一次元目の等電点電気泳動に用いられるポリアクリルアミドゲルは、固定されたｐＨ勾配を有し、ストリップ状の、乾燥したゲルであって、１．５ｍｍ以下の幅を有し、且つ、上記ポリアクリルアミドを膨潤させて測定された分子質量２５ｋＤａのマーカータンパク質の相対移動度が０．９１以下であることを特徴とする。

Description

ポリアクリルアミドゲル
　本発明は、二次元電気泳動における一次元目の等電点電気泳動に用いられる、固定されたｐＨ勾配を有し、ストリップ状の、乾燥したポリアクリルアミドゲルに関する。
　生体内のタンパク質は生命活動の中心的な役割を担っており、生体の成長の過程や疾患などの様々なストレスによる生体の異変に応じて、翻訳修飾されて発現するタンパク質の種類や量が敏感に変化する。例えば、タンパク質の変化を捉えることにより、疾患の有無や程度を把握することができ、創薬や個人レベルでの治療につなげることが可能になる。そのため、タンパク質を網羅的に解析する技術が広く検討されており、中でも、等電点電気泳動によりタンパク質（ペプチドを含む）の荷電状態に基づく分離を行った後、スラブゲル電気泳動によりタンパク質の分子量に基づく分離を行う二次元電気泳動法は、数千種類に及ぶタンパク質を同時に分析することができる上に、分解能も高いため、極めて有効な技術である。
　このような二次元電気泳動における一次元目の等電点電気泳動のためには、アガロースゲルやポリアクリルアミドゲルが一般に使用されるが、特に、置換又は非置換のアクリルアミド（以下、「アクリルアミド系モノマー」と表す。）と、このアクリルアミド系モノマーと共重合可能な架橋剤と、上記アクリルアミド系モノマーと共重合可能であり弱酸性或いは弱塩基性の緩衝基を有するアクリルアミド誘導体とを重合させることにより得られる、固定されたｐＨ勾配を有するポリアクリルアミドゲル（以下、「ＩＰＧゲル」と表す。）は、泳動中も安定したｐＨ勾配を示し、狭いｐＨ範囲を使用することができるという利点を有している。そして、ストリップ状の乾燥したＩＰＧゲルは、低温で保存することができ、膨潤させるだけで使用することができ、取扱いも容易であるため、使用に適している。
　このようなストリップ状の乾燥したＩＰＧゲルは、一般に、矩形の親水性プラスチックフィルム上に所望のｐＨ範囲及びｐＨ勾配を有するスラブゲルを形成し、得られたゲルを乾燥させ、乾燥したゲルの表面に保護フィルムを接着させた後、ｐＨ勾配の方向に沿って所望の幅のストリップに切断することによって製造される。
　これまでに様々なｐＨ範囲と長さ（長手方向の長さ）とを有するストリップ状の乾燥したＩＰＧゲルが、ジーイーヘルスケア社、バイオ－ラッド社、シグマ－アルドリッチ社等から市販されている。これらのゲルは、通常、アクリルアミド系モノマーとしてのアクリルアミドと架橋剤としてのＮ，Ｎ´－メチレンビスアクリルアミド（ＢＩＳ）とを４．０％Ｔ、３．０％Ｃの量で含む重合液から得られたゲルであり、ゲルの幅（短手方向の長さ）は３ｍｍ或いは３．３ｍｍである。また、特許文献１（特開２０１４－９２４４９号公報）の実施例には、アクリルアミドと架橋剤としてのＢＩＳ、ピペラジンジアクリルアミド（ＰＤＡ）或いはＮ，Ｎ´－ジアリルタルタルジアミド（ＤＡＴＤ）とを５％Ｔ以下、１０％Ｃ以下の量で含む重合液から得られた、数ｍｍサイズに切断したストリップ状の乾燥したＩＰＧゲルが記載されている。特許文献２（特開２０１４－９２４５０号公報）の実施例には、アクリルアミドと架橋剤としてのペンタメチレンビスアクリルアミド或いはＢＩＳとを４％Ｔ、２．６％Ｃの量で含む重合液から得られたストリップ状の乾燥したＩＰＧゲルが記載されている。さらに、特許文献３（特開２００６－２４２８０２号公報）の実施例１では、インビトロジェン社製の厚さ０．０２ｍｍ×幅０．８ｍｍ×長さ５２ｍｍの乾燥したＩＰＧゲルが使用されており、特許文献４（特開２０１２－２４２０８４号公報）の実施例では、厚さ０．３５ｍｍ×幅１．１５ｍｍ×長さ５２ｍｍのサイズに切断した、膨潤させた際に０．５ｍｍ厚となる乾燥したＩＰＧゲルが使用されているが、これらの文献には上記ゲルの製造のために使用されたアクリルアミド系モノマーや架橋剤の種類や量については記載されていない。なお、重合液における％Ｔ及び％Ｃの語は、それぞれ以下の意味を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
特開２０１４－９２４４９号公報 特開２０１４－９２４５０号公報 特開２００６－２４２８０２号公報 特開２０１２－２４２０８４号公報
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｈａｒｐ．ｃｏ．ｊｐ／ｓｍｓ／ｒｅｌｅａｓｅ／ｂｍ－１００／ｎａ＿ａｕｔｏ２ｄ＿００５ｃ．ｐｄｆ
　上述したようにＩＰＧゲルは等電点電気泳動の分離能に優れるという利点を有している。しかし、従来のＩＰＧゲルを使用して等電点電気泳動を行った後に二次元目の電気泳動を行うと、二次元電気泳動画像においてタンパク質のスポットが二次元目の泳動方向と垂直な方向に伸張する現象が指摘されている。この現象は、タンパク質の等電点に対する集中度が不足していることが原因である。この集中度の不足はまた、ストリーキング現象につながる。例えば、非特許文献１（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｈａｒｐ．ｃｏ．ｊｐ／ｓｍｓ／ｒｅｌｅａｓｅ／ｂｍ－１００／ｎａ＿ａｕｔｏ２ｄ＿００５ｃ．ｐｄｆ）には、アクリルアミドとＢＩＳとを４．０％Ｔ、３．０％Ｃの量或いは３．６％Ｔ、２．７％Ｃの量で含む重合液から得られたＩＰＧゲルの使用によって得られた二次元電気泳動画像が示されているが、画像のスポットが泳動方向と垂直な方向に伸張しており、ストリーキング現象も認められる。
　二次元電気泳動画像には、一般に数百個～数千個のスポットが認められる。また、二次元電気泳動では、ストレスによる生体の異変等に応じてわずかな量で発現したか或いは発現量が変化したタンパク質の変化を分析することが求められている。しかし、二次元電気泳動において１つのスポットが泳動方向と垂直な方向に伸張すると、異なったタンパク質に起因する隣接するスポットが重なってしまうことがあるため、スポット体積の正確な定量が不可能になる。また、画像において薄く認められる微量のタンパク質に起因するスポットが泳動方向と垂直な方向に伸張すると、スポットがさらに薄くなり、スポットの発見自体が困難になる。また、二次元電気泳動におけるスポットの泳動方向への伸張も抑制されるのが好ましい。
　そこで、本発明の目的は、二次元電気泳動におけるスポットの伸張を抑制して、安定したスポットの分離性能を与えることが可能な、一次元目の等電点電気泳動に用いられるストリップ状の乾燥したＩＰＧゲルを提供することである。
　発明者は、重合液の組成を変更して多種類のストリップ状の乾燥したＩＰＧゲルを製造し、このＩＰＧゲルを用いて等電点電気泳動を行った後に二次元目のスラブゲル電気泳動を行い、スポットの二次元目の泳動方向と垂直な方向への伸張との関係を調査した。その結果、市販のＩＰＧゲルを使用した場合に比較して、スポットの泳動方向と垂直な方向への伸張を抑制することができる、一群のＩＰＧゲルを発見した。そして、さらなる検討の結果、タンパク質の移動度が比較的小さいＩＰＧゲルの使用により、スポットの泳動方向と垂直な方向への伸張が抑制されることがわかった。しかし、残念ながら、タンパク質の移動度が比較的小さいＩＰＧゲルを使用すると、スポットが二次元目の泳動方向に伸張しやすいことがわかった。
　そこで、発明者は、このスポットの二次元目の泳動方向への伸張についても解決すべく、検討を重ねた。まず、有色の等電点マーカータンパク質を含むサンプルについて、一般的な３ｍｍ幅のゲルを用いた等電点電気泳動を行うと、図２（Ｂ）に示すように、ゲルの長手方向に沿って２本のラインが出現し、このラインに沿って等電点マーカータンパク質が集中して泳動されることがわかった。等電点マーカータンパク質以外のタンパク質も、タンパク質であることには変わりがないことから、同様にゲルの長手方向に沿った２本のラインに集中して泳動されると考えられる。以下、ゲルの長手方向に沿ったタンパク質が集中して泳動されるラインを「泳動ライン」という。泳動ラインが発生する理由は現在のところ明確ではないが、上述したスラブゲルの切断によってストリップを製造する過程において、ストリップに切断面に沿ったストレスが発生し、等電点電気泳動における数千ボルトの電圧の印加によりストレス部分で絶縁破壊が生じ、この絶縁破壊部分で電流が流れやすくなることが原因であると考えられる。
　次に、ＩＰＧゲルの幅を減少させていくと、ＩＰＧゲルの幅の減少と共に２本の泳動ラインが徐々に接近し、図２（Ａ）に示すように、１．５ｍｍ以下の幅では一本の泳動ラインになることがわかった。そして、タンパク質の移動度が比較的小さいＩＰＧゲルについてゲルの幅を１．５ｍｍ以下に減少させ、このＩＰＧゲルを用いて等電点電気泳動を行った後に二次元目のスラブゲル電気泳動を行うと、スポットの泳動方向と垂直な方向への伸張が従来のＩＰＧゲル比較して抑制される現象が維持される上に、スポットの泳動方向への伸張も抑制され、したがって二次元電気泳動において安定したスポットの分離性能が得られることがわかった。このことから、二次元電気泳動におけるスポットの泳動方向への伸張の原因は、上述した２本の泳動ラインであると考えられる。
　したがって、本発明は、二次元電気泳動における一次元目の等電点電気泳動に用いられる、ストリップ状の乾燥したＩＰＧゲルであって、１．５ｍｍ以下の幅を有し、且つ、このＩＰＧゲルを膨潤させて測定された分子質量２５ｋＤａのマーカータンパク質の相対移動度が０．９１以下であることを特徴とするＩＰＧゲルに関する。本発明におけるゲルの幅（短手方向の長さ）の値は、乾燥状態におけるゲルの幅を意味する。本発明のゲルの長さ（長手方向の長さ）及びゲルの厚みには、二次元目の電気泳動に支障が生じなければ特に限定がない。
　本発明において、分子質量２５ｋＤａのマーカータンパク質の相対移動度は、以下の手順により測定される。図１は、相対移動度の測定を説明するための図であり、（Ａ）は測定装置の概略的な側面断面図を示している。まず、膨潤液、例えば、２５０ｍＭトリスヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ）－ＨＣｌｐＨ８．８膨潤液、を用いて乾燥したＩＰＧゲル１を膨潤させる。膨潤のためには、これまでに知られている膨潤液を特に限定なく使用することができるが、膨潤時間については、十分なＩＰＧゲル１の膨潤が確保されるまで行う必要がある。具体的には、乾燥したＩＰＧゲル１を膨潤させると、ＩＰＧゲル１が膨潤液を吸収し、膨潤後のＩＰＧゲル１の重量が膨潤時間の経過と共に増加するが、膨潤時間と膨潤後のＩＰＧゲル１の重量との関係を予め測定しておき、膨潤後のＩＰＧゲル１の重量がほぼ一定になる時間まで膨潤を行う。次いで、膨潤させたＩＰＧゲル１を、測定容器１０の底部に固定した後、ゲルのプラス極端部から約１ｃｍ離れた位置に０．５ｍｍ幅の切欠き部を形成し、この切欠き部に分子質量２５ｋＤａのマーカータンパク質と微量のブロムフェノールブルー（ＢＰＢ）と固定のためのアガロースとを少なくとも含む水溶液を導入して固化させ、試料部２０を形成する。分子質量２５ｋＤａのマーカータンパク質は、市販の製品をこの製品の仕様書において指定された量で使用することができる。また、試料部には分子質量２５ｋＤａのマーカータンパク質以外のタンパク質が含まれていても良い。
　次に、膨潤させたＩＰＧゲル１の両端に、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）用の、ＴｒｉｓとグリシンとＳＤＳとを含む泳動バッファー、例えば、２５ｍＭＴｒｉｓ，１９２ｍＭグリシン，０．１％ＳＤＳを含むバッファー、を浸み込ませたろ紙３０を配置し、ろ紙３０の上に、下部に半透膜２１を備えた電極筒２０を配置する。電極筒２０の内部には、上述したＳＤＳ－ＰＡＧＥ用泳動バッファー２２が導入されており、泳動バッファー２２の内部には、電源４０に接続された電極２３が導入されている。
　次いで、測定容器１０に鉱油（図示せず）を膨潤させたＩＰＧゲル１が覆われるまで導入し、電極２３，２３間に８０～１２０Ｖの範囲の固定電圧を印加して電気泳動を実施する。この電気泳動により、ＢＰＢと上記マーカータンパク質とが矢印Ｅの方向に移動する。ＢＰＢがマイナス極に接近したところで電気泳動を停止する。図１（Ｂ）は、電気泳動停止時のＩＰＧゲル１の概略的な平面図を示している。泳動開始位置Ｘ０と、ＢＰＢのバンド２の泳動先端位置Ｘ１と、分子質量２５ｋＤａのマーカータンパク質のバンド３の泳動先端位置Ｘ２とを用いて、以下の式により相対移動度Ｒｆを算出する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
　ストリップ状の乾燥したＩＰＧゲルの幅が１．５ｍｍ以下であり、且つ、このＩＰＧゲルを膨潤させて測定された分子質量２５ｋＤａのマーカータンパク質の相対移動度が０．９１以下、好ましくは０．７１以下である本発明のＩＰＧゲルを用いて一次元目の等電点電気泳動を行い、続いて二次元目のスラブゲル電気泳動を行うと、二次元電気泳動におけるスポットの泳動方向への伸張ばかりでなく泳動方向と垂直な方向への伸張も抑制され、安定したスポットの分離性能が得られる。二次元目の電気泳動のためのスラブゲルは、濃縮ゲル部と分離ゲル部とを有していても良いが、本発明のＩＰＧゲルによりスポットの泳動方向への伸張が好適に抑制されるため、本発明のＩＰＧゲルは分離ゲル部のみを有するスラブゲルと組み合わせても好適に使用することができる。
　本発明のＩＰＧゲルの幅については、１．５ｍｍ以下であれば問題がないが、製造時の切断の容易性及び使用時の取扱いの容易性を考慮すると、一般には０．５ｍｍ以上である。
　本発明のＩＰＧゲルの製造のための、アクリルアミド系モノマー、架橋剤、及びアクリルアミド誘導体としては、ＩＰＧゲルの製造のために従来提案されていたアクリルアミド系モノマー、架橋剤、及びアクリルアミド誘導体を特に限定なく使用することができるが、架橋剤としてＤＡＴＤを使用するのが好ましい。ＤＡＴＤの使用により、従来のアクリルアミドとＢＩＳとを４．０％Ｔ、３．０％Ｃの量で含む重合液から得られたＩＰＧゲルに比較して、ＩＰＧゲルのポアサイズを大きくすることができるため、高分子量のタンパク質を本発明のＩＰＧゲルに導入することができる。架橋剤としてＤＡＴＤを使用する場合には、５．５％Ｔ以上の重合液であって、２０．０％Ｃ以上、より好ましくは３０．０％Ｃ以上の重合液を使用するのが好ましい。このような重合液から、強度の高いＩＰＧゲルを生産性良く製造することができる。
　本発明のストリップ状の乾燥したＩＰＧゲルを用いて一次元目の等電点電気泳動を行い、続いて二次元目のスラブゲル電気泳動を行うと、二次元電気泳動におけるスポットの泳動方向への伸張と泳動方向と垂直な方向への伸張の両方が抑制され、安定したスポットの分離性能が得られる。
相対移動度の測定についての説明図であり、（Ａ）は測定装置の概略的な側面断面図を、（Ｂ）はＩＰＧゲルの概略的な平面図を、それぞれ示している 幅の異なるＩＰＧゲル（重合液；モノマーはアクリルアミド、架橋剤はＤＡＴＤ、５．５％Ｔ、２０．０％Ｃ）についての、ゲルの幅と泳動ラインの出現との関係を示す画像であり、（Ａ）は１．５ｍｍ幅のゲルについての画像であり、（Ｂ）は３．０ｍｍ幅のゲルについての画像である。 幅の異なるＩＰＧゲル（重合液；モノマーはアクリルアミド、架橋剤はＤＡＴＤ、５．５％Ｔ、２０．０％Ｃ）を用いて得られた二次元電気泳動画像であり、（Ａ）は１．５ｍｍ幅のＩＰＧゲルを用いて得られた画像であり、（Ｂ）は３．０ｍｍ幅のＩＰＧゲルを用いて得られた画像である。 本発明のＩＰＧゲル（重合液；モノマーはアクリルアミド、架橋剤はＤＡＴＤ、６．０％Ｔ、３０．０％Ｃ：ゲル幅；１．５ｍｍ）を用いて得られた二次元電気泳動画像である。 市販のＩＰＧゲル（重合液；モノマーはアクリルアミド、架橋剤はＢＩＳ、４．０％Ｔ、３．０％Ｃ：ゲル幅；３．０ｍｍ）を用いて得られた二次元電気泳動画像である。
　二次元電気泳動における一次元目の等電点電気泳動に用いられる本発明のストリップ状の乾燥したＩＰＧゲルは、１．５ｍｍ以下の幅を有し、このＩＰＧゲルを膨潤させて測定された分子質量２５ｋＤａのマーカータンパク質の相対移動度は０．９１以下、好ましくは０．７１以下である。
　本発明のストリップ状の乾燥したＩＰＧゲルは、アクリルアミド系モノマーと、このアクリルアミド系モノマーと共重合可能な架橋剤と、上記アクリルアミド系モノマーと共重合可能であり弱酸性或いは弱塩基性の緩衝基を有するアクリルアミド誘導体と、を含む重合液から得られる。
　上記アクリルアミド系モノマーとしては、従来ＩＰＧゲルのためのモノマーとして知られている化合物を特に限定なく使用することができ、例としては、アクリルアミド、２－メチルアクリルアミド、Ｎ－メチルアクリルアミド、Ｎ－エチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアクリルアミド、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド、ジアセトンアクリルアミド、Ｎ－アクリロイルアミノプロパノールが挙げられる。上記モノマーとして、単独の化合物を使用しても良く、２種以上の化合物を混合して使用しても良い。
　上記架橋剤としては、従来ＩＰＧゲルのための架橋剤として知られている化合物を特に限定なく使用することができ、例としては、ＢＩＳ、ＰＤＡ、ＤＡＴＤ、Ｎ，Ｎ´－ビスアクリロイルシスタミン、ジヒドロキシエチレンビスアクリルアミド、ペンタメチレンビスアクリルアミドが挙げられる。上記架橋剤として、単独の化合物を使用しても良く、２種以上の化合物を混合して使用しても良い。架橋剤としてＤＡＴＤを使用するのが好ましい。ＤＡＴＤの使用により、従来のアクリルアミドとＢＩＳとを４．０％Ｔ、３．０％Ｃの量で含む重合液から得られたＩＰＧゲルに比較して、ＩＰＧゲルのポアサイズを大きくすることができるため、高分子量のタンパク質を本発明のＩＰＧゲルに導入することができる。
　上記アクリルアミド誘導体としては、従来ＩＰＧゲルのためのアクリルアミド誘導体として知られている化合物を特に限定なく使用することができ、例としては、カルボキシ基を有するアクリルアミド誘導体、アミノ基を有するアクリルアミド誘導体が挙げられる。これらのアクリルアミド誘導体は、イモビラインの名称でも知られている。ＩＰＧゲル用重合液のためには、ＩＰＧゲルに対する所望のｐＨ範囲に依存して、異なる酸解離定数を有する複数のアクリルアミド誘導体が混合されて使用される。アクリルアミド誘導体の組み合わせ及び使用量は、例えば、Ｐ．Ｇ．Ｒｉｇｈｅｔｔｉ，　Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ　ｐＨ　ｇｒａｄｉｅｎｔｓ：ｔｈｅｏｒｙ　ａｎｄ　ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ（１９９０）を参照することにより、決定することができる。
　ＩＰＧゲルの製造は、一般的に以下の工程により行われる。まず、上記アクリルアミド系モノマー、上記架橋剤、所望のｐＨ範囲に依存して選択されたアクリルアミド誘導体、及び溶媒を含む、酸性側重合液及び塩基性側重合液を準備する。酸性側重合液及び塩基性側重合液の一方の重合液の溶媒は水であるが、他方の重合液の溶媒は、水と、この重合液の比重を高める目的で使用される溶媒、好適にはグリセロール、との混合溶媒である。酸性側重合液及び塩基性側重合液の％Ｔ及び％Ｃは、同一の値になるように調整される。％Ｔ及び％Ｃの値は、使用されるアクリルアミド系モノマー及び架橋剤の種類に応じて、得られるＩＰＧゲルを膨潤させて測定された分子質量２５ｋＤａのマーカータンパク質の相対移動度が０．９１以下になるように選定され、ＩＰＧゲルを作成する予備実験により、これらの値を簡単に求めることができる。架橋剤としてＤＡＴＤを使用する場合には、５．５％Ｔ以上の重合液であって、２０．０％Ｃ以上、より好ましくは３０．０％Ｃ以上の重合液を使用するのが好ましい。このような重合液から、高強度を示す使用に適したＩＰＧゲルを生産性良く製造することができる。
　必要に応じて重合効率を向上させる目的で酸性側重合液及び塩基性側重合液のｐＨを酢酸／水酸化ナトリウム緩衝液等を使用して中性に調整した後、重合開始剤及び重合促進剤を添加する。重合開始剤としては、過硫酸アンモニウムを好適に使用することができ、これと組み合わせて用いられる重合促進剤としては、Ｎ，Ｎ，Ｎ´，Ｎ´－テトラメチレンジアミンを好適に使用することができる。
　次いで、グラジエントミキサー、スタティックミキサー等のミキサーを用いて得られた酸性側重合液と塩基性側重合液とを混ぜ合わせる割合を連続的に変えながら混合し、得られた混合液をペリスティックポンプ、ピエゾポンプ等のポンプ又は自然落下現象を用いて、対向配置された２枚のガラス板を有するゲル作成治具のガラス板の間に充填する。なお、上記ゲル作成治具における一方のガラス板の他方のガラス板と対向する表面には、一般にゲルボンドフィルムと呼ばれる、生成したゲルを接着させるための親水性プラスチックフィルムが予め設置されており、２枚のガラス板の間隔は所望の厚みのＩＰＧゲルが得られるように、例えば約１ｍｍ以下に調整されている。また、重合液の充填量は、所望の長さのＩＰＧゲルが得られるように、例えば５０ｍｍ～２４０ｍｍの範囲で調整される。
　重合液の充填が完了した後、上記アクリルアミド系モノマー、上記架橋剤及び上記アクリルアミド誘導体を共重合させる。共重合を進行させるために、必要に応じて、窒素雰囲気下、２０～５０℃に加熱しても良い。共重合が完了した後、上記親水性プラスチックに接着したスラブ状のゲルを上記ガラス板から外して取り出し、ゲルを純水で洗浄し、さらにグリセロールに浸漬して洗浄する。その後、スラブ状のゲルの水がほとんど消失するまで乾燥する。乾燥後にゲル表面にプラスチック製保護フィルムを接着させた後、ゲルを親水性プラスチックフィルム及び保護フィルムと共にｐＨ勾配に沿って切断して、ストリップ状の乾燥したＩＰＧゲルを得る。本発明では、ストリップの幅が１．５ｍｍ以下になるように切断が行われる。本発明のＩＰＧゲルの幅については、１．５ｍｍ以下であれば問題がないが、製造時の切断の容易性及び使用時の取扱いの容易性を考慮すると、一般には０．５ｍｍ以上である。得られたストリップ状の乾燥したＩＰＧゲルは、約－２０℃の低温で保存することができる。
　本発明のＩＰＧゲルは、従来のＩＰＧゲルと同様に、二次元電気泳動における一次元目の等電点電気泳動のために使用される。等電点電気泳動のためのサンプル調整条件、等電点電気泳動における印加電圧、泳動時間等の泳動条件については、従来知られている条件を特に限定なく使用することができる。また、電気泳動後のＩＰＧゲルの二次元目のＳＤＳ－ＰＡＧＥのための平衡化条件、二次元目のＳＤＳ－ＰＡＧＥにおける印加電圧、泳動時間等の泳動条件についても、従来知られている条件を特に限定なく使用することができる。二次元目の電気泳動のためのスラブゲルは、濃縮ゲル部と分離ゲル部とを有していても良いが、本発明のＩＰＧゲルによりスポットの泳動方向への伸張が好適に抑制されるため、本発明のＩＰＧゲルは分離ゲル部のみを有するスラブゲルと組み合わせて好適に使用される。二次元目の電気泳動は、本発明のＩＰＧゲルを等電点電気泳動に供した後のゲルをアガロース水溶液を用いて二次元目のスラブゲルの端部に固定した状態で実施しても良く、本発明のＩＰＧゲルを等電点電気泳動に供した後のゲルを物理的に二次元目のスラブゲルの端部に押し付けた状態で実施しても良い。
　本発明を以下の実施例を用いて説明するが、本発明は以下の実施例に限定されない。
　（１）ストリップ状の乾燥したＩＰＧゲルの製造及び泳動ラインの本数の確認
　アクリルアミド系モノマーとしてのアクリルアミドと架橋剤とを表１に示した量で含み、さらにアクリルアミド誘導体と溶媒とを含む酸性側重合液及び塩基性側重合液を準備した。酸性側重合液の溶媒を水とし、塩基性側重合液の溶媒を水とグリセロールとした。アクリルアミド誘導体としては、シグマ－アルドリッチ社製の誘導体を、ｐＨ３～１０のゲルを製造するための量で使用した。酸性側重合液及び塩基性側重合液を酢酸／水酸化ナトリウム緩衝液を用いてｐＨ７．０に調整した後、各重合液７．５ｍＬ当たり、１００ｍｇの過硫酸アンモニウムを水１．０ｍＬに溶解した溶液を４０μＬと、Ｎ，Ｎ，Ｎ´，Ｎ´－テトラメチレンジアミン４μＬと、を添加した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　次いで、グラジエントミキサーを用いて得られた酸性側重合液と塩基性側重合液とを混ぜ合わせる割合を連続的に変えながら混合し、得られた混合液をペリスティックポンプによって、対向配置された２枚のガラス板を有するゲル作成治具のガラス板の間に充填した。なお、ガラス板の一方の表面には、親水性プラスチックフィルムを重合液の充填前に設置した。
　重合液を充填した後、静置して共重合を進行させた。共重合が完了した後、上記親水性プラスチックに接着したスラブ状のゲルを上記ガラス板から外して取り出し、ゲルを純水で洗浄し、さらにグリセロールに浸漬して洗浄した。その後、スラブ状のゲルの水がほとんど消失するまで減圧下において一晩乾燥し、乾燥後にゲル表面にプラスチック製保護フィルムを接着させ、ゲルを親水性プラスチックフィルム及び保護フィルムと共にｐＨ勾配に沿って切断して、表２に示すゲル幅を有するストリップ状の乾燥したＩＰＧゲルを得た。なお、ＩＰＧの長さは７ｃｍであった。得られたストリップ状の乾燥したＩＰＧゲルは、約－２０℃の低温で保存した。
　次いで、７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、４％３-［３-（コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、２ｍＭトリブチルホスフィン、０．５％ＩＰＧ　Ｂｕｆｆｅｒ　ｐＨ３－１０ＮＬ（ジーイーヘルスケア社製のキャリアアンフォライト溶液）を含む膨潤液にペプチドが蛍光標識されている等電点マーカーを混合した液を、膨潤トレイに線状に広げ、表２に示したストリップ状の乾燥したＩＰＧゲルと、従来例としての市販のストリップ状の乾燥したＩＰＧゲル（ジーイーヘルスケア社製、重合液は、モノマーがアクリルアミド、架橋剤がＢＩＳ、４．０％Ｔ、３．０％Ｃ、ゲル幅は３．０ｍｍ、長さは７．０ｃｍ）とを、それぞれ浸し、従来例のＩＰＧゲルについては１０時間以上、その他のＩＰＧゲルについては２時間以上、静置してＩＰＧゲルを膨潤させた。膨潤させたＩＰＧゲルを等電点電気泳動装置にセットし、１５℃にて、段階的に印加電圧を上げて（２５０Ｖ３０分→線形的に１０００Ｖまで３０分→線形的に８０００Ｖまで９０分→８０００Ｖで１２０分）、等電点電気泳動を行った。泳動後のゲルについて、蛍光イメージャーにて、泳動ラインの本数を評価した。表２にその結果をまとめて示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　図２には、実施例２及び比較例８のゲルについて、電気泳動後のゲルを撮影した画像を示す。（Ａ）は実施例２のゲルに関する画像を、（Ｂ）は比較例８のゲルに関する画像を、それぞれ示している。図２から明瞭に把握されるように、比較例８のゲルには２本の泳動ラインが認められるのに対し、実施例２のゲルには１本の泳動ラインのみが認められる。また、表２より、重合液の組成に関わらず、１．５ｍｍ以下のゲル幅を有するストリップ状の乾燥したＩＰＧゲルを用いると、１本の泳動ラインのみが認められ、１．５ｍｍを超えるゲル幅を有するストリップ状の乾燥したＩＰＧゲルを用いると、２本の泳動ラインが認められることが分かる。
　（２）相対移動度の確認
　２５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌｐＨ８．８膨潤液を膨潤トレイに線状に広げ、表２に示したストリップ状の乾燥したＩＰＧゲルと、上述した従来例のストリップ状の乾燥したＩＰＧゲルと、をそれぞれ浸し、２時間以上静置して、ＩＰＧゲルを十分に膨潤させた後、膨潤後のＩＰＧゲルを図１に示した測定容器の底部にシリコーングリースを用いて固定した。なお、膨潤は、各ＩＰＧゲルについて膨潤時間と膨潤後のＩＰＧゲルの重量との関係を予め測定し、膨潤後のＩＰＧゲルの重量がほぼ一定になる時間まで行った。次いで、ゲルのプラス極端部から約１ｃｍ離れた位置に０．５ｍｍ幅の切欠き部を形成し、この切欠き部に分子質量２５ｋＤａのマーカータンパク質を含むマーカータンパク質セット（バイオ－ラッド社製、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　Ｐｌｕｓ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄｕａｌ　Ｃｏｌｏｒ　Ｓｔａｎｄａｒｄ）と５％アガロース水溶液とを１：１に混合した液にＢＰＢ０．１μＬを添加した液を導入して固化させ、試料部を形成した。
　次に、膨潤させたＩＰＧゲルの両端に、２５ｍＭＴｒｉｓ，１９２ｍＭグリシン，０．１％ＳＤＳを含むＳＤＳ－ＰＡＧＥ用泳動バッファーを浸み込ませたろ紙を配置し、ろ紙の上に、下部に半透膜を備え、内部に上記ＳＤＳ－ＰＡＧＥ用泳動バッファー及び電極が導入された電極筒を配置した。次いで、上記測定容器に鉱油を膨潤させたＩＰＧゲルが覆われるまで導入した後、電極間に電圧を印加（８０Ｖ６分→１２０Ｖ）して電気泳動を実施した。ＢＰＢがマイナス電極付近まで泳動したところで泳動を停止し、泳動開始位置と、ＢＰＢのバンドの泳動先端位置と、分子質量２５ｋＤａのマーカータンパク質のバンドの泳動先端位置とから、相対移動度Ｒｆを算出した。表３に、ゲル幅１．５ｍｍのＩＰＧゲルに関する相対移動度の値を、従来例のＩＰＧゲルに関する値と共に示す。表３から明らかなように、使用した重合液の組成に依存して、相対移動度の値は大きく変化した。なお、１２０Ｖの電圧印加によってはタンパク質が集中して泳動される泳動ラインが生じにくくタンパク質がゲル幅の方向に比較的均一に泳動されるためであると思われるが、同じ重合液から得られたＩＰＧゲルは、ゲル幅に依存せずに略同一の相対移動度の値を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　（３）二次元電気泳動のスポットの評価
　カイコ由来Ｓｆ９細胞を、８Ｍ尿素、４％ＣＨＡＰＳ、３０ｍＭＴｉｓ－ＨＣｌｐＨ８．８膨潤液に分散させ、可溶性画分の１４．２０９μＬ（総タンパク質量５０μｇ）あたり、４００μＭのＩＣ５－ＯＳｕ蛍光試薬（溶媒はジメチルスルホキシド、同仁化学研究所製）１μＬと混合し、３０分間氷上で静置して、タンパク質を蛍光色素Ｃｙ５で標識した。次いで、この液に１０ｍＭのＬ－リシンの溶液１μＬを添加し、１０分間氷上で静置して、標識反応を停止させた。得られた液のタンパク質量１２μｇ分を分取し、膨潤バッファー（７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、４％ＣＨＡＰＳ、１．２％ＤｅＳｔｒｅａｋ　Ｒｅａｇｅｎｔ（ジーイーヘルスケア社製）、０．５％ＩＰＧ　Ｂｕｆｆｅｒ　ｐＨ３－１０ＮＬ）で、ゲル幅３．０ｍｍのＩＰＧゲルのためには総液量が１２５μＬ、その他のゲル幅のＩＰＧゲルのためには総液量が８０μＬ、になるように希釈し、サンプル液を得た。
　得られたサンプル液を、膨潤トレイに線状に広げ、膨潤状態で０．９１以下の分子質量２５ｋＤａのマーカータンパク質の相対移動度を示すストリップ状の乾燥したＩＰＧゲルと、上述した従来例のストリップ状の乾燥したＩＰＧゲルとを、それぞれ浸し、２時間以上（最大１６時間）静置して、ＩＰＧゲルを膨潤させた。膨潤させたＩＰＧゲルを等電点電気泳動装置にセットし、１５℃にて、段階的に印加電圧を上げて（２５０Ｖ３０分→線形的に１０００Ｖまで３０分→線形的に８０００Ｖまで９０分→８０００Ｖで１２０分）、等電点電気泳動を行った。
　等電点電気泳動装置からＩＰＧゲルを回収して体積１５ｍＬのチューブに導入し、平衡化バッファーＡ（３７５ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌｐＨ８．８、６Ｍ尿素、２％ＳＤＳ、２０％グリセロール、２％ジチオトレイトール（ＤＴＴ））を上記チューブに導入し、１０分間振とうした。次いで、平衡化バッファーＡを廃棄し、代わりに平衡化バッファーＢ（３７５ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌｐＨ８．８、６Ｍ尿素、２％ＳＤＳ、２０％グリセロール、４．５％ヨードアセトアミド）を上記チューブに導入し、さらに１０分間振とうした。その後、洗浄液（１２５ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌｐＨ６．８、０．１％ＳＤＳ）で２回洗浄した。
　封入アガロース（０．５％アガロース、１２５ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌｐＨ６．８、０．１％ＳＤＳ）を加熱してアガロースを溶解させた後、濃縮ゲル部を有していないスラブゲル（モノマーはアクリルアミド、架橋剤はＢＩＳ、１２．０％Ｔ）を有するゲル板の上記スラブゲルの上端に流し込み、直後に、平衡化及び洗浄を行った上記ＩＰＧゲルを、封入アガロースゲル中の上記スラブゲルの上端の位置に水平になるようにセットした。封入アガロースがゲル化した後、スラブゲルを電気泳動槽中にセットし、泳動バッファー（０．３％Ｔｒｉｓ、１．４４％グリシン、０．１％ＳＤＳ）でスラブゲルを満たし、電圧を印加（８０Ｖ３０分間→２００Ｖ約２時間）して、二次元目の電気泳動を行った。電気泳動が終了した後、上記スラブゲルをゲル板ごと蛍光イメージスキャナーにセットし、アクリルアミド中のＣｙ５の蛍光をスキャニングして、二次元電気泳動画像を得た。
　図３には、実施例２及び比較例８のＩＰＧゲルを用いた実験について、二次元電気泳動後のゲルを撮影した画像を示す。（Ａ）は実施例２のゲルを用いて得られた画像を、（Ｂ）は比較例８のゲルを用いて得られた画像を、それぞれ示している。図３から明瞭に把握されるように、比較例８のゲルを用いて得られた画像ではスポットが泳動方向に伸張しているのに対し、実施例２のゲルを用いて得られた画像ではスポットの泳動方向への伸張は大幅に抑制されている。また、スポットの泳動方向と垂直な方向への伸張にはほぼ相違が認められないことがわかる。表４に、使用したＩＰＧストリップゲルとスポットの泳動方向への伸張の関係をまとめた。表４では、スポットの泳動方向への伸張が図３（Ａ）と同程度である場合を「伸張なし」とした。表４から把握されるように、ＩＰＧゲルの幅を１．５ｍｍ以下にすることにより、二次元電気泳動におけるスポットの泳動方向への伸張が大幅に抑制された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　図４及び図５は、実施例３のストリップ状の乾燥したＩＰＧゲル或いは上述した従来例のストリップ状の乾燥したＩＰＧゲルを使用して等電点電気泳動を行った後、濃縮ゲル部（モノマーはアクリルアミド、架橋剤はＢＩＳ、４．０％Ｔ）と分離ゲル部（モノマーはアクリルアミド、架橋剤はＢＩＳ、１２．０％Ｔ）とを有するスラブゲルを用いて二次元目の電気泳動を行ったときの、二次元電気泳動画像を示している。図４は実施例３のＩＰＧゲルを用いて得られた画像であり、図５は従来例のＩＰＧゲルを用いて得られた画像である。これらの図を比較すると、実施例３のＩＰＧゲルを用いて得られた画像では、高分子量のタンパク質に相当するスポットが濃く認められており、実施例３のＩＰＧゲルが高分子量のタンパク質を効率よく吸収したことが分かる。また、実施例３のＩＰＧゲルを用いた場合には、従来例のＩＰＧゲルを使用した場合に比較して、スポットの泳動方向と垂直な方向への伸張が抑制されたことが分かる。したがって、本発明のストリップ状の乾燥したＩＰＧゲルの使用により、二次元電気泳動におけるスポットの泳動方向への伸張ばかりでなく泳動方向と垂直な方向への伸張も抑制され、二次元電気泳動におけるスポットの分離性能が向上したことがわかった。
　二次元電気泳動におけるスポットの泳動方向への伸張と泳動方向と垂直な方向への伸張の両方を抑制する、ストリップ状の乾燥したＩＰＧゲルが提供される。

Claims (2)

  1. 　二次元電気泳動における一次元目の等電点電気泳動に用いられる、固定されたｐＨ勾配を有し、ストリップ状の、乾燥したポリアクリルアミドゲルであって、
    　１．５ｍｍ以下の幅を有し、且つ、
    　前記ポリアクリルアミドを膨潤させて測定された、分子質量２５ｋＤａのマーカータンパク質の相対移動度が０．９１以下である
    　ことを特徴とするポリアクリルアミドゲル。
  2. 　前記ポリアクリルアミドゲルが、Ｎ，Ｎ´－ジアリルタルタルジアミドを架橋剤として用いて製造されたゲルである、請求項１に記載のポリアクリルアミドゲル。
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