WO2017054017A1 - Formulierung von hypericin zur photodynamischen therapie - Google Patents

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WO2017054017A1
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hypericin
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salt
photodynamic therapy
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Christina Abrahamsberg
Werner Frantsits
Klaus Gerdes
Jòzsef GUNGL
Beate Kälz
Gregor Medinger
Stefan Welzig
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Sanochemia Pharmazeutika Ag
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Definitions

  • the invention relates to a novel formulation of hypericin which can be used in photodynamic therapy.
  • Photodynamic therapy is a procedure suitable for the treatment of tumors and premalignant changes in the skin and mucosa of various hollow organs (Juarranz et al., 2008, Agostinis et al., 2011).
  • PDT is based on the interaction of three components:
  • Photosensitizer in malignant tissue With the help of light of suitable wavelength, the photosensitizer can be excited. In the excited state, energy becomes one
  • Reactants e.g. molecular oxygen
  • Reactive oxygen molecules are generated, which in turn damage cellular structures of the tumor tissue, initiating cellular processes such as apoptosis and necrosis (Agostinis, et al., 2011, Allison and Sibata, 2010).
  • Hypericin is hydrophobic and insoluble in water. For this reason, hypericin has been dissolved in the past by means of the organic solvent dimethylsulfoxide (DMSO) or a water-soluble polymer, polyethylene glycol (PEG).
  • DMSO dimethylsulfoxide
  • PEG polyethylene glycol
  • Hypericin was brought into the tumor cells with the aid of polyethylene glycol. With a hypericin dose of 30 ⁇ and irradiation with light (595 nm) at an intensity of 25 to 50 mW / cm 2 , up to 98% of the tumor cells could be killed (Kamuhabwa et al., 2003).
  • a water-soluble formulation of hypericin is needed that has tumor selectivity and can be excited with light in the visible range.
  • WO 01/89576 A2 describes how the solubility of hypericin can be increased by the adjuvant polyvinylpyrrolidone (povidone, PVP).
  • WO 2014/079972 Al deals with a device which can be used in the PDT of hollow organs, such as the human bladder.
  • PVP hypericin shows selective accumulation in tumor cells in vitro and in vivo (Kubin et al., 2008; Vandepitte et al., 2011).
  • the invention is based on the object to provide a sterile and stable formulation of hypericin, which is used for clinical application in PDT available.
  • the selective enrichment of the formulation of hypericin according to the invention and the surprisingly low light intensity required for a PDT in the animal model in applying the formulation of hypericin according to the invention allows its application in the therapy of lesions in various body cages reaching the required dose of light can be.
  • hypericin examples of the formulation of hypericin (hypericin-PVP complex) according to the invention are given below.
  • the formulation of the invention is prepared from a salt of hypericin, especially sodium hypericinate.
  • the hypericin content of the starting material in addition to the content determination mainly water content and in the case of sodium hypericinate the sodium content is recorded.
  • Chemical-physical properties may have an influence on the formulation of the pharmaceutical drug.
  • a stability of inventive formulation required.
  • the stability is ensured by the composition of the finished product and also affects the manufacturing process. Due to the buffer systems used, a sufficient stability of the bulk solution can also be achieved during production until lyophilization of the finished product.
  • various additives can be used, which preferably achieve a physiologically acceptable pH and an osmotic pressure after reconstitution with 50 ml of Aqua ad Injectabilia of 290 mOsmol / kg both for the bulk solution and for the reconstituted solution.
  • Citrate buffer systems can be used primarily.
  • the appropriate amount of the bulk solution is filled into injection bottles and lyophilized.
  • a solution is prepared with a target weight of 90.0 mg hypericin.
  • This solution is filled up quantitatively with a phosphate buffer solution to 250.0 g.
  • the final concentration of this solution is 0.0225 mg hypericin / g solution.
  • Example 1, 2 or 3 The procedure is as set forth in Example 1, 2 or 3, wherein instead of the phosphate buffer solution, a citric acid buffer solution is used.
  • the formulation according to the invention of hypericin for PDT in a preclinical, orthotopic bladder tumor model in rats was investigated.
  • Example 1 After a 2-hour instillation with 30 ⁇ of the inventive formulation of hypericin and different light intensities (5 or 25 mW / cm 2 ) with light of a wavelength of 595 nm, up to 98% of the tumor cells could be killed.
  • Example 2 After a 1-hour instillation with 20 ⁇ of the inventive formulation of hypericin and different light intensities (5 or 25 mW / cm 2 ) with light of wavelength 570 nm, up to 97% of the tumor cells could be killed.
  • Example 3 After a 15 or 30 minutes instillation with 40 ⁇ of the formulation of hypericin according to the invention and different light intensities (5 or 25 mW / cm 2 ) with light of wavelength 610 nm, up to 98% of the tumor cells could be killed.
  • Example 4 After a 2-hour instillation with 9 ⁇ of the inventive formulation of hypericin and different light intensities (5-25 mW / cm 2 ) with light of wavelength 600 nm, up to 95% of the tumor cells could be killed.
  • Figure 2 shows survival of tumor cells after treatment with the formulation of hypericin and light of the invention. 24 hours after the treatment, the bladder tissue was dissociated and the surviving cells were determined using a clonogenic assay compared to the control (without PVP hypericin and light).

Abstract

Eine als Photosensibilisator bei der Therapie von Krebs, wie beispielsweise Blasenkrebs, verwendbare Formulierung enthalt Polyvinylpyrrolidon gebundenes oder mit Polyvinylpyrrolidon komplexiertes Natrium-Hypericinat.

Description

FORMULIERUNG VON HYPERICIN ZUR PHOTODYNAMISCHEN THERAPIE
Die Erfindung betrifft eine neue Formulierung von Hypericin, die in der photodynamischen Therapie verwendet werden kann.
Die photodynamische Therapie (PDT) ist ein Verfahren, das zur Behandlung von Tumoren und prämalignen Veränderungen der Haut und Mukosa verschiedener Hohlorgane geeignet ist (Juarranz et al., 2008; Agostinis et al., 2011).
Die PDT beruht auf der Wechselwirkung dreier Komponenten:
Photosensibilisator, Licht im sichtbaren Bereich und Sauerstoff.
Nach systemischer oder topischer Applikation eines
Photosensibilisators erfolgt eine Akkumulation des
Photosensibilisators im malignen Gewebe. Mit Hilfe von Licht geeigneter Wellenlänge kann der Photosensibilisator angeregt werden. Im angeregten Zustand wird Energie auf einen
Reaktionspartner, z.B. molekularen Sauerstoff, übertragen. Dabei werden reaktive Sauerstoffmoleküle generiert, die wiederum zelluläre Strukturen des Tumorgewebes schädigen, wodurch zelluläre Prozesse wie Apoptose und Nekrose eingeleitet werden (Agostinis, et al., 2011; Allison and Sibata, 2010).
Ein idealer Photosensibilisator für die PDT zeigt selektive
Akkumulation in Tumorzellen, keine oder minimale systemische Toxizität und ist photochemisch effizient.
Hypericin 1,3,4,6,8, 13-Hexahydroxy-10 , 11-dimethylphenanthro
( 1 , 10 , 9 , 8 -opqra ) perylene-7 , 1 -dion wurde in der Literatur bereits als potentieller Photosensibilisator beschrieben (Agostinis et al . , 2002) .
In in vitro Untersuchungen konnte die Wirksamkeit von Hypericin in der PDT in einer Reihe von Zelllinien gezeigt werden (Karioti und Bilia, 2010) .
Darüber hinaus bestätigen in vivo Tierstudien das Potential Hypericins für eine Anwendung in der PDT ( Bhuvaneswari et al., 2010; Chen et al . , 2003; Liu et al., 2000; Sanovic et al., 2011).
Hypericin ist hydrophob und in Wasser unlöslich. Aus diesem Grund wurde in der Vergangenheit Hypericin mit Hilfe des organischen Lösungsmittels Dimethylsulfoxid (DMSO) oder eines wasserlöslichen Polymers, Polyethylenglycol (PEG), in Lösung gebracht.
Tierexperimente in einem Rattenmodell zeigten ermutigende
Ergebnisse hinsichtlich der PDT des Blasenkarzinoms. Dabei wurde Hypericin mit Hilfe von Polyethylenglykol in die Tumorzellen gebracht. Mit einer Hypericindosis von 30 μΜ und einer Bestrahlung mit Licht (595 nm) einer Intensität von 25 bis zu 50 mW/cm2 konnten bis zu 98% der Tumorzellen abgetötet werden (Kamuhabwa et al. 2003) .
Für eine klinische Anwendung wird jedoch eine wasserlösliche Formulierung von Hypericin benötigt, die Tumorselektivität besitzt, und mit Licht im sichtbaren Bereich angeregt werden kann.
Das Dokument WO 01/89576 A2 beschreibt, wie die Löslichkeit von Hypericin durch den Hilfsstoff Polyvinylpyrrolidon (Povidon, PVP) erhöht werden kann.
Die Verwendung von PVP-Hypericin in der PDT ist auch in der WO 2014/079972 AI beschrieben. Die WO 2014/079972 AI befasst sich insbesondere mit einem in der PDT von Hohlorganen, wie der menschlichen Blase, einsetzbarem Gerät.
PVP-Hypericin zeigt eine selektive Akkumulation in Tumorzellen in vitro und in vivo (Kubin et al., 2008; Vandepitte et al., 2011). Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, eine sterile und stabile Formulierung von Hypericin, die zur klinischen Anwendung in der PDT einsetzbar ist, zur Verfügung zu stellen.
Gelöst wird diese Aufgabe mit einer Formulierung von Hypericin, welche die Merkmale von Patentanspruch 1 aufweist.
Bevorzugte und vorteilhafte Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Formulierung von Hypericin sind Gegenstand der Unteransprüche.
Überraschenderweise hat sich gezeigt, dass die erfindungsgemäße Formulierung von Hypericin nur dann stabil und damit unter klinischen Bedingungen anwendbar ist, wenn Hypericin als Salz vorliegt.
Eine Evaluierung der erfindungsgemäßen Formulierung von Hypericin in Tierexperimenten hat überraschenderweise gezeigt, dass bei einer Dosis von 30 μΜ Hypericin in einer stabilen Formulierung mit PVP gemäß Beispiel 1 eine benötigte LichtIntensität von 5 oder 25 mW/cm2 bei einer Wellenlänge von 595 nm und 120 Minuten Einwirkzeit in der Blase
( Instillationszeit ) ausreicht, um 98% der Tumorzellen abzutöten . Das gleiche Ergebnis von 98% abgetöteten Tumorzellen wird auch bei gleicher Lichtintensität und 40 μΜ Hypericin bei 15 oder 30 Minuten Einwirkzeit und Behandlung mit Licht einer Wellenlänge von 610 nm erzielt. Ebenso erzielt eine Instillationszeit von 1 Stunde, bei 20 μΜ Hypericin, gleicher Lichtintensität und 570 nm Lichtfrequenz eine Abtötungsrate von 97% und eine Instillationszeit von 120 Minuten, bei 9 μΜ Hypericin, gleicher Lichtintensität und Behandlung bei 600 nm eine Abtötungsrate von 95%. Womit bei LichtIntensitäten von 5 bis 25 mW/cm2 bei Lichtfrequenzen von 570 bis 610 nm, Hypericinkonzentrationen von 9 bis 40 μΜ , Einwirkzeiten zwischen 15 und 120 Minuten eine Abtötungsrate von 95 bis 98% der Tumorzellen
(Anwendungsbesipiele 1, 2, 3 und 4) erzielt wird.
Die Effektivität einer PDT ist wesentlich von der Gesamtlichtmenge abhängig. Gleichzeitig ist mit steigender Lichtintensität die Wahrscheinlichkeit von lokalen Nebenwirkungen erhöht.
Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Formulierung wird eine verbesserte Akkumulation im malignen Gewebe erreicht, wodurch eine deutlich verminderte Lichtintensität von bereits 5 bis maximal 25 mW/cm2 ausreicht, um die Tumorzellen abzutöten.
Die selektive Anreicherung der erfindungsgemäßen Formulierung von Hypericin und die überraschenderweise niedrige Lichtintensität, die für eine PDT im Tiermodell beim Anwenden der erfindungsgemäßen Formulierung von Hypericin benötigt wurde, erlaubt die Anwendung in der Therapie von Läsionen in verschiedenen Kävitäten des Körpers, die mit der erforderlichen Lichtdosis erreicht werden können.
Nachstehend werden Beispiele der erfindungsgemäßen Formulierung von Hypericin (Hypericin-PVP-Komplex) wiedergegeben.
Allgemeine Verfahrensweise zum Herstellen einer Formulierung mit dem Wirkstoff Natrium-Hypericinat :
Ziel ist das Herstellen einer Hypericin enthaltenden Formulierung zur Anwendung als Photosensibilisator im Bereich der
photodynamischer Therapie.
Die erfindungsgemäße Formulierung wird aus einem Salz von Hypericin, insbesondere aus Natrium-Hypericinat, hergestellt.
Um den Hypericin-Gehalt des Ausgangsmaterials zu definieren, werden neben der Gehaltsbestimmung vor allem Wassergehalt und im Falle von Natrium-Hypericinat der Natrium Anteil festgehalten. Die
chemisch-physikalischen Eigenschaften können einen Einfluss auf die Formulierung des pharmazeutischen Arzneimittels haben.
Für die klinische Anwendung ist eine Stabilität der erfindungsgemäßen Formulierung erforderlich. Die Stabilität wird durch die Zusammensetzung des Fertigproduktes gewährleistet und betrifft gleichzeitig auch das Herstellungsverfahren. Durch die verwendeten Puffersysteme kann auch während des Herstellens bis zum Lyophilisieren des Fertigproduktes eine hinreichende Stabilität der Bulklösung erreicht werden.
Als Puffersysteme können verschiedene Zusatzstoffe herangezogen werden, die bevorzugt sowohl für die Bulklösung als auch für die rekonstituierte Lösung einen physiologisch verträglichen pH-Wert und einen osmotischen Druck nach der Rekonstitution mit 50 ml Aqua ad Injectabilia von 290 mOsmol/kg erzielen. Phosphat- oder
Zitrat-Puffersysteme können in erster Linie zum Einsatz kommen.
Nach dem Fertigstellen der Bulklösung aus den oben genannten Bestandteilen wird die entsprechende Menge der Bulklösung in Injektionsflaschen abgefüllt und lyophilisiert.
Beispiel 1:
Aus dem Natrium-Hypericinat wird eine Lösung mit einer Zieleinwaage von 90,0 mg Hypericin hergestellt.
Zu 1875 mg PVP k25 werden 5,0 g der Hypericin-Lösung zugesetzt und vollständig gelöst.
Diese Lösung wird quantitativ mit einer Phosphatpufferlösung auf 250,0 g aufgefüllt. Die Endkonzentration dieser Lösung ist 0,0225 mg Hypericin/g Lösung.
Für das Lyophilisieren wird eine definierte Menge der so erhaltenen Bulklösung in Injektionsflaschen abgefüllt und mit einem
entsprechenden Lyo-Programm das fertige Lyophilisat hergestellt. Beispiel 2:
Es wird so wie im Beispiel 1 angegeben gearbeitet, wobei statt PVP k25 zum Komplexieren vom Natrium-Hypericinat PVP kl7 verwendet wird.
Beispiel 3:
Es wird so wie im Beispiel 1 angegeben gearbeitet, wobei statt PVP k25 zum Komplexieren vom Natrium-Hypericinat PVP k30 verwendet wird.
Beispiel 4 :
Es wird so wie in Beispiel 1, 2 oder 3 angegeben gearbeitet, wobei statt der Phosphatpufferlösung eine Zitronensäure-Pufferlösung verwendet wird.
Die wie in den Beispielen 1 bis 4 beschrieben hergestellten
Bulklösungen können mit unterschiedlichen Hypericin-Gehalten produziert werden.
Die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Formulierung von Hypericin wurde in einer präklinischen Studie unter Verwenden der Formulierung als Beispiel 1 überprüft.
Anwendungsbeispiele :
Dazu wurde die erfindungsgemäße Formulierung von Hypericin für die PDT in einem präklinischen, orthotopen Blasentumormodell in Ratten untersucht. Bei allen Beispielen wurden die Tumore mit der erfindungsgemäße Formulierung von Hypericin in unterschiedlichen Konzentrationen von 9 bis 40 μΜ , bei unterschiedlichen
Lichtintensitäten von 5 oder 25 mW/cm2, unterschiedlichen
Lichtfrequenzen von 570 bis 610 nm und unterschiedlichen
Instillationszeiten behandelt. Beispiel 1. Nach einer 2-stündigen Instillation mit 30 μΜ der erfindungsgemäßen Formulierung von Hypericin und unterschiedlichen Lichtintensitäten (5 oder 25 mW/cm2) mit Licht einer Wellenlänge von 595 nm konnten bis zu 98% der Tumorzellen abgetötet werden.
Beispiel 2. Nach einer 1-stündigen Instillation mit 20 μΜ der erfindungsgemäßen Formulierung von Hypericin und unterschiedlichen LichtIntensitäten (5 oder 25 mW/cm2) mit Licht der Wellenlänge 570 nm konnten bis zu 97% der Tumorzellen abgetötet werden.
Beispiel 3. Nach einer 15 oder 30 Minuten Instillation mit 40 μΜ der erfindungsgemäßen Formulierung von Hypericin und unterschiedlichen Lichtintensitäten (5 oder 25 mW/cm2)mit Licht der Wellenlänge von 610 nm, konnten bis zu 98% der Tumorzellen abgetötet werden.
Beispiel 4. Nach einer 2-stündigen Instillation mit 9 μΜ der erfindungsgemäßen Formulierung von Hypericin und unterschiedlichen Lichtintensitäten (5-25 mW/cm2 ) mit Licht der Wellenlänge 600 nm konnten bis zu 95% der Tumorzellen abgetötet werden.
Die Ergebnisse der Untersuchungen am Rattenmodell sind in den Fig.
1 und 2 wiedergegeben. In den Diagrammen steht „ns" für „nicht signifikant" und „*" für „signifikant". Die Diagramme der Fig. 1 und
2 zeigen das Überleben von Tumorzellen nach Behandeln mit der erfindungsgemäßen Formulierung von Hypericin und Licht. 24 Stunden nach der Behandlung wurde das Blasengewebe dissoziiert und die überlebenden Zellen mit Hilfe eines klonogenen Assays im Vergleich zur Kontrolle (ohne PVP-Hypericin und Licht) bestimmt.
Das relative Überleben der Zellen unter PDT Bedingungen
(PVP-Hypericin gemäß Beispiel 1 und Behandlung mit Licht) beträgt (dargestellt als Mittelwert + SD): 7.4 (+/- 6.4) % bei Verwendung von 5 mW/cm2 und 2.4 (+/- 4.0) % bei 25 mW/cm2 und einer
Behandlungsdauer mit Licht von 60 Minuten. Dies ist in zwei Diagrammen (Fig. 1 und 2) dargestellt. Referenzen :
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Claims

Ansprüche :
Formulierung zur photodynamischen Therapie enthaltend an einem polymeren Komplexbildner gebundenes oder komplexiertes Hypericin, dadurch gekennzeichnet, dass das Hypericin als Salz vorliegt .
Formulierung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Komplexbildner ein Polyethylenglykol oder ein
Poly-N-vinylamid ist.
Formulierung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Poly-N-vinylamid Polyvinylpyrrolidon ( PVP ) verschiedenen Polymerisations- und Vernetzungsgrades ist.
Formulierung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Polyvinylpyrrolidon PVP kl7, PVP k25 oder PVP k30 ist.
Formulierung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Hypericinsalz ein Alkalimetallsalz, insbesondere das Kaliumsalz oder bevorzugt das Natriumsalz, ist .
Verfahren zum Herstellen einer Formulierung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das
Hypericinsalz an ein Polyethylenglykol oder an ein
Poly-N-vinylamid, bevorzugt Polyvinylpyrrolidon (PVP), gebunden oder komplexiert wird.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Komplexieren in wässeriger, gegebenenfalls gepufferter, Lösung vorgenommen wird.
8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Formulierung zur intravenösen, intrakavitären,
inhalativen, oralen, intraperitonealen und topischen
Verabreichung, in hydrophilen oder hydrophoben Trägerstoffen, vorzugsweise in Form einer Lösung, einer Creme, eines Gels, eines Aerosols, von Emulsionen oder als Pflaster
bereitgestellt wird.
9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass die wässerige Lösung in Injektionsflaschen abgefüllt und lyophilisiert wird.
10. Verwendung der Formulierung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder der nach einem der Ansprüche 6 bis 9 erhaltenen
Formulierung zum Herstellen eines bei der photophysikalischen oder photodynamischen Therapie zur Behandlung von Tumoren und prämalignen Veränderungen der Haut und der Mukosa einsetzbaren Photosensibilisators .
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