WO2017033809A1 - 細胞測定方法 - Google Patents

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WO2017033809A1
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cell measurement
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祐子 南條
宏幸 浅野
宮川　功
高田　仁夫
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倉敷紡績株式会社
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    • G01N2021/1734—Sequential different kinds of measurements; Combining two or more methods

Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring a cell amount.
  • cancer cells that have been brought into contact with anticancer drugs and cancer cells that have not been brought into contact are cultured under the same conditions, and the degree of proliferation of cancer cells after culture is compared.
  • Patent Documents 1 to 5 describe a method in which cancer cells are embedded in a collagen gel and cultured. This collagen gel-embedded culture method is known to proliferate cancer cells better than a surface culture method in which cancer cells are cultured on the surface of agar or the like.
  • Patent Document 1 discloses that cancer cells that have proliferated are imaged with a TV camera or the like, and the obtained image information is electronically analyzed to calculate an estimated volume of cancer cell colonies. How to do is described.
  • Patent Document 3 describes a method in which cancer cells cultured in a collagen gel are stained with a dye and imaged, and the cancer cells are quantified based on the image density.
  • Patent Literature 1 and Patent Literature 3 have a problem of further improvement in quantification accuracy.
  • susceptibility testing of anticancer agents has been conducted using as starting materials surgical materials removed from cancer patients.
  • the biopsy material has a small tissue piece that can be collected compared to the surgical material, and the anticancer drug sensitivity test requires accurate quantification of a cell volume of 1/10 or less of the conventional method.
  • Patent Document 1 and Patent Document 3 it was difficult to accurately quantify such a small amount of cancer cells.
  • the present invention has been made in consideration of the above, and an object thereof is to provide a cell measurement method with higher quantitative accuracy.
  • the cell measurement method of the present invention obtains a first image and a second image, which are a transmitted image with respect to a first light and a second light, which are different in absorbance due to the dye, by staining the cultured target cells with a dye. Dividing each of the first image and the second image into a plurality of divided regions, comparing the first image and the second image for each divided region, and eliminating noise, And evaluating the target cell amount by integrating an index of the cell amount for each of the divided regions in an image from which noise has been eliminated.
  • the target cell is a cell to be measured.
  • Noise refers to unnecessary image information that does not originate from a stained target cell.
  • the cell quantity index means an index that increases or decreases in accordance with the number of cells, such as image density and absorbance calculated from the image density.
  • the step of eliminating the noise is performed by comparing the first image and the second image for each divided region, and when the difference or ratio of the brightness of the compared divided regions is less than a predetermined value, This is a step of excluding divided areas from the data used as the basis for the evaluation of the target cell amount.
  • the first image and the second image are compared for each divided region, and when the difference or ratio of the absorbances of the compared divided regions is less than a predetermined value.
  • This is a step of excluding the divided area from the data that is the basis for the evaluation of the target cell amount.
  • the target cell is a cancer cell.
  • the target cell is a cell that has been three-dimensionally cultured, and more preferably a cell in which the cell is embedded and cultured in a collagen gel.
  • the first image and the second image are acquired by simultaneously irradiating the first light and the second light and performing color separation on an image captured by a single color camera.
  • the first image and the second image are acquired by sequentially irradiating the first light and the second light and capturing images with one camera each time.
  • the target cell amount is evaluated by calculating the absorbance from the image brightness for each of the divided regions, integrating the obtained absorbance over the plurality of divided regions, and calculating the estimated volume value of the target cells. Done.
  • the amount of cells can be accurately evaluated even if the amount of cultured target cells is small.
  • FIG. 1 shows the structural example of the cell measuring device used in the 1st Embodiment of this invention. It is a flowchart of the cancer cell quantification method of a 1st embodiment of the present invention. It is a figure for demonstrating the brightness of an image. It is a figure for demonstrating the original image obtained with the cancer cell quantification method of the 1st Embodiment of this invention. It is an absorption spectrum of neutral red. It is the original image of the sample which quantified the cancer cell in the Example. It is the original image of the sample which quantified the cancer cell in the Example.
  • tissue collected from a living body Prior to culturing, tissue collected from a living body is subjected to dispersion treatment such as chopping and digestion of cell stroma by cell dispersion enzyme treatment. In some cases, this is followed by a separation process in which unnecessary cells such as blood are removed by pre-culture and living cells are collected.
  • dispersion treatment such as chopping and digestion of cell stroma by cell dispersion enzyme treatment.
  • this is followed by a separation process in which unnecessary cells such as blood are removed by pre-culture and living cells are collected.
  • Various known methods can be used for preparing the culture sample. Among these, it is preferable to use a three-dimensional culture method. More preferably, a collagen gel embedded culture method is used. In this method, even if the amount of cancer cells used for culture is small, good culture and subsequent quantification of cancer cells can be performed.
  • the procedure by the collagen gel embedding culture method is as follows.
  • the separated / dispersed cells are mixed with the collagen solution.
  • various components necessary for culture can be added to the collagen solution.
  • a buffer solution that is the same as or close to the physiological condition of the target cell can be added to the collagen solution.
  • the collagen solution containing the cancer cells is dropped on the support surface in the culture vessel to form a droplet-like collagen gel, and a liquid medium is added to the culture vessel.
  • several samples are prepared. In some samples, an anticancer agent is added to the culture container, and after a predetermined time has passed, the anticancer agent is washed away and cultured again.
  • a dye is added to the culture vessel to stain the target cancer cell.
  • a staining method a normal staining method in cancer cell culture can be applied. Specific examples include Giemsa solution staining method, crystal violet staining method, neutral red (NR) staining method, fluorescein diacetate (FDA) staining method, and staining methods using other fluorescent reagents.
  • the staining method a method that can selectively stain cancer cells and that does not stain components other than cancer cells as much as possible is preferable.
  • the use of a live cell staining method that selectively stains live cells is suitable for measuring the sensitivity and the like of anticancer agents.
  • the NR staining method is preferable as a method that can selectively stain only living cells among cancer cells.
  • the dried collagen gel has a flat surface as the moisture is removed from the droplet-like collagen gel.
  • FIG. 2 shows a flowchart of the process.
  • the measurement apparatus 10 of this embodiment includes a sample stage 11 on which a sample 20 is placed, an illumination 12 that irradiates the sample from below, a color camera 16 that captures a transmission image of the sample, and an image processing device 17. .
  • the illumination 12 has one LED package 13 and is connected to an illumination power source 14.
  • a light diffusing plate 15 is inserted between the illumination and the sample stage.
  • Each LED package includes an LED chip (not shown) that emits first light and an LED chip (not shown) that emits second light.
  • 1st light and 2nd light differ in the light absorbency with respect to the pigment
  • the first light and the second light are irradiated toward the sample at the same time, and an image is captured by one color camera to acquire one original image.
  • an image is captured by one color camera to acquire one original image.
  • a first image that is a transmission image for the first light and a second image that is a transmission image for the second light are acquired.
  • the first light and the second light are more preferable as the difference in absorbance with respect to the dye is larger.
  • the ratio of the attenuation when the first light and the second light pass through the sample is preferably 1.5 times or more, and more preferably 2 times or more.
  • the difference in absorbance between the two is preferably log 1.5 ⁇ 0.18 or more, more preferably log 2 ⁇ 0.30 or more. Since the absorbance varies depending on the measurement conditions, it is preferable to select the wavelengths of the first light and the second light so that such a difference is obtained under the actual measurement conditions.
  • NR has an absorption band in the range of about 380 nm to 600 nm, and has absorption peaks at 462 nm and 518 nm.
  • green light whose wavelength distribution overlaps with this absorption band can be selected as the first light
  • red light whose wavelength distribution does not overlap with this absorption band can be selected as the second light.
  • an LED as the illumination light source. This is because the LED has a narrow wavelength distribution and the difference between the first image and the second image tends to appear clearly.
  • the physical form of illumination is not specifically limited.
  • the number of LED packages is not particularly limited.
  • an LED chip that emits the first light and an LED chip that emits the second light may be incorporated into one LED package as in the present embodiment, or the first light is emitted.
  • the LED package and the LED package that emits the second light may be alternately arranged.
  • An image is configured as a collection of many pixel data.
  • Each pixel includes information indicating brightness corresponding to the intensity of light captured by the image sensor of the camera.
  • the brightness is represented by 256 numerical values from 0 to 255, for example, when the captured gradation of the imaging is 8 bits. If there is absorption when light passes through the sample, the portion is dark on the transmission image, that is, the lightness appears small.
  • the first image which is a transmission image with respect to the first light
  • the transmitted light intensity of that portion is reduced.
  • the transmitted light intensity decreases and the brightness of the image decreases.
  • the second image which is a transmission image for the second light, does not reflect the abundance of cancer cells.
  • each of the first image and the second image is divided into a plurality of divided regions by the same method. Dividing by the same method means that the divided areas corresponding to the first image and the second image have the same size and are a copy of the same location of the sample.
  • the image processing described below is performed for each divided region.
  • one pixel is set as one divided region. Since the first image and the second image are obtained from one original image, each pixel is an area obtained by dividing both images by the same method.
  • a blank image is an image in the brightest state obtained by imaging a blank sample processed through the same process as a cultured sample of cancer cells except that no cancer cells are added. However, since a collagen gel matrix exists, it is not a complete white image.
  • the dark image is an image in the darkest state in which the shutter of the photographing lens is closed to prevent light from entering. As shown in FIG. 3, the brightness T 1 of the first image brightness T 2 of the second image is between the brightness B of lightness W and dark image of the blank image.
  • the first image and the second image are compared to eliminate the influence of noise.
  • the pixel data is excluded from the data that is the basis for the later evaluation of the amount of cancer cells.
  • the first image may be corrected and the brightness of the pixel may be overwritten with the brightness of the blank image. Thereby, the brightness of the pixel does not affect the evaluation of the amount of cancer cells and is substantially excluded.
  • the threshold value can be set to 1/8 of the number of lightness gradations. That is, when the lightness is expressed by 8 bits and 256 gradations, the pixel may be excluded when the lightness difference between the first image and the second image is smaller than 32. Alternatively, when the lightness ratio is used as a reference, the pixel may be excluded when the lightness ratio between the first image and the second image is smaller than a predetermined threshold. More preferably, these threshold values are obtained by preliminary experiments.
  • the absorbance may be obtained from the brightness of each pixel, and when the difference or ratio of absorbance is smaller than a predetermined threshold, it may be determined that the pixel area is not a cancer cell.
  • Opaque dust does not transmit light regardless of wavelength, so it appears dark in both the first and second images.
  • the bubbles contained in the dried collagen gel appear dark on the image due to light refraction, they also appear dark in the first image and the second image, regardless of the wavelength of the light source. Therefore, these noises can be eliminated by excluding an area where there is no difference in brightness between the first image and the second image.
  • Air bubbles are particularly problematic when the amount of cells is small in the collagen gel embedding culture method. If the amount of cells is small, bubbles may remain in the dried collagen gel. The cause is not clear, but when the amount of cells is large, the gas in the gel escapes through the interface between the cells and the substrate in the gel droplet mass, whereas when the amount of cells decreases, the gas in the gel Is considered to remain without leaving.
  • FIG. 4 shows a transmission image (original image) of the sample stained with NR.
  • the first light was green light having a dominant wavelength of 528 nm
  • the second light was red light having a dominant wavelength of 625 nm.
  • FIG. 4 shows an original image which is a color image converted into a monochrome image, and the resolution is also converted.
  • the circular range at the center is the sample (collagen gel dried product).
  • Fine dark spots scattered in the sample are cancer cells or colonies thereof, which are red in the original image, appear dark in the first image, and do not appear in the second image.
  • the dark spot surrounded by the dotted line is dust, gray in the original image, and appears dark in the first image and the second image.
  • the upper solid ellipse and the lower hollow ellipse are noises caused by bubbles, which are gray in the original image and appear dark in the first and second images.
  • fibroblast contamination is fibroblast contamination.
  • the influence of fibroblasts can be eliminated by the method described in Patent Document 3.
  • Fibroblasts are stained together with cancer cells with a dye such as NR, but are much less likely to be stained than cancer cells, and the brightness of the image is clearly higher than that of cancer cells. Therefore, in the first image, when the brightness of a certain pixel exceeds a predetermined threshold, it is determined that the area of the pixel is a fibroblast and the pixel is excluded. Specifically, for example, the first image may be corrected and the brightness of the pixel may be overwritten with the brightness of the blank image.
  • the threshold value can be obtained by a preliminary experiment.
  • cancer cells and fibroblasts are identified from their shapes by image analysis, and information on only cancer cells is extracted. May be.
  • cancer cells are quantified from the image from which noise has been eliminated.
  • Cancer cell mass can be evaluated by integrating the cell mass index for each pixel.
  • the amount of cancer cells is evaluated by an estimated volume value. This is because according to the collagen gel embedding culture method, cancer cell colonies develop three-dimensionally, and therefore more accurate evaluation can be performed by considering the thickness thereof.
  • the estimated volume value is obtained by obtaining the absorbance from the brightness of each pixel and integrating the absorbance over the entire sample range. This is because the absorbance is linearly correlated with the cell thickness in each region.
  • the absorbance A is calculated from the corrected first image.
  • A log ⁇ (WB) / (T 1 -B) ⁇ Is required.
  • W is the brightness of the pixel of the blank image
  • B is the brightness of the pixel of the dark image
  • T 1 is the brightness of the pixel of the corrected first image.
  • C is a constant.
  • the estimated volume value of a cell can be calculated
  • the lightness of each pixel may be integrated, and the absorbance may be obtained from the integrated value.
  • the sensitivity of the anticancer drug is evaluated by comparing the amount of cancer cells after culture between a control sample to which no anticancer drug is added and a sample to which the anticancer drug is added.
  • the estimated volume value of the cancer cell can be calculated more accurately by obtaining the absorbance for each divided region of the sample image according to the above formula 1 and integrating it.
  • This embodiment like the first embodiment, relates to a method for quantifying cancer cells in an anticancer drug sensitivity test.
  • the method of the present embodiment is different from the first embodiment in the method of acquiring the first image and the second image.
  • Other processes are the same as those in the first embodiment.
  • the first light source that emits the first light and the second light source that emits the second light are sequentially turned on, and each camera performs imaging with one camera. Accordingly, a first image is obtained by imaging when the first light source is turned on, and a second image is obtained by imaging when the second light source is turned on.
  • the physical form of the light source is not particularly limited.
  • the LED chip as the first light source and the LED chip as the second light source may be incorporated into one LED package, or separate LED packages are used as the first light source and the second light source, and they are alternately used. You may arrange them.
  • a monochrome camera can be used. In that case, since a monochrome camera having a higher resolution than a color camera is available, a more detailed image can be obtained.
  • HCT-116 As a cancer cell, HCT-116, a human colon cancer-derived cell line, was used and cultured by a collagen gel embedding method.
  • As a collagen gel solution for embedding cells 8 volumes of cell matrix TypeCD (Kurashiki Boseki Co., Ltd.), 1 volume of 10 times ham F12 culture solution (without sodium bicarbonate), buffer solution for reconstitution (260 mM sodium bicarbonate and 200 mM HEPES) 1 volume) was added and stored in ice.
  • the collagen solution was prepared by adding the HCT-116 strain to the collagen solution so that the final density was 4 ⁇ 10 4 cells / mL and mixing well.
  • the dried collagen gel obtained was placed on a sample stage, illuminated with illumination from below, and a transmission image was taken with a color camera.
  • One LED package (CREE Inc., MC-E Color) was used for illumination.
  • the LED package is mounted with RGB three-color LED chips, and only the R and G chips are lit and used.
  • the first light was green light having a main wavelength of 528 nm
  • the second light was red light having a main wavelength of 625 nm.
  • a color camera (Sony Corporation, XCL5005CR) used a lens having a pixel number of 2448 ⁇ 2050, RGB 8-bit gradation, and an optical magnification of 1.3 times. At this time, the resolution of the image was about 2.7 ⁇ m.
  • FIG. 6 (sample without bubbles) and FIG. 7 (sample with many bubbles) are obtained by converting the captured original image into a black and white image.
  • the samples shown in FIGS. 6 and 7 contain approximately the same amount of cancer cells.
  • FIG. 4 described above is also an image obtained by the same method as in this embodiment.
  • the original image was color-separated into three colors, RGB, and the G image was the first image and the R image was the second image.
  • the first image and the second image were compared for each pixel, and when the difference in brightness was within 35, it was determined that the cells were not cancer cells.
  • Absorbance was calculated for each pixel by the above-mentioned formula 1, and integrated over the entire range of the sample to obtain an estimated volume value of cancer cells.
  • the value of the constant C in Equation 1 was 2.0 ⁇ 10 ⁇ 4 .
  • the absorbance was calculated from the brightness of the first image and integrated over the entire range of the sample, and the estimated volume value of the cancer cells was similarly determined.
  • the estimated volume value obtained by the method of the example was 0.42 in FIG. 6 and 0.44 in FIG.
  • FIG. 6 was 0.47 and FIG. 7 was 1.54.
  • FIG. 6 having no bubbles estimated volume values of the same degree were obtained in the example and the comparative example.
  • the estimated volume value by the comparative example was about three times that of the example. This is an influence of noise caused by bubbles, and in the example, noise caused by bubbles could be eliminated.
  • the cell measurement method of the present invention is not limited to the above-described embodiments and examples, and various modifications are possible within the scope of the technical idea.
  • brightness relativity blade correction
  • noise elimination of dust and bubbles by comparison between the first image and the second image and noise elimination of fibroblasts are performed in this order. You may carry out by changing order, respectively.
  • the first image and the second image may be acquired by sequentially switching the color filter provided in front of the camera using white illumination.
  • the first image and the second image may be obtained by using a white light source having a continuous spectrum for illumination and performing color separation by imaging with a color camera.
  • a white light source having a continuous spectrum for illumination and performing color separation by imaging with a color camera.
  • an image sensor of a color camera generally has a wide sensitivity spectrum and a part thereof overlaps, the difference between the first image and the second image can be clearly obtained by using two light sources having different wavelengths.

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Abstract

［課題］精度の高い細胞測定方法を提供する。 ［解決手段］培養された標的細胞を色素で染色する工程と、前記色素による吸光度が異なる第１の光および第２の光に対する透過像である第１画像および第２画像を取得する工程と、前記第１画像および前記第２画像のそれぞれを複数の分割領域に分割し、前記分割領域毎に前記第１画像と前記第２画像を比較してノイズを排除する工程と、前記ノイズを排除した画像において前記分割領域毎の細胞量の指標を積算することにより、前記標的細胞量を評価する工程とを有する細胞測定方法である。

Description

細胞測定方法
　本発明は、細胞量の測定方法に関する。
　上皮性悪性腫瘍や肉腫等に対する抗癌剤の感受性試験では、抗癌剤と接触させた癌細胞と接触させなかった癌細胞とを同じ条件で培養して、培養後の癌細胞の増殖度を比較することで癌細胞の抗癌剤に対する感受性を評価する。癌細胞の増殖が少ないほど優れた抗癌剤となる。
　癌細胞の培養法として、特許文献１～５には癌細胞をコラーゲンゲルに包埋して培養する方法が記載されている。このコラーゲンゲル包埋培養法は、寒天等の表面で癌細胞を培養する表面培養法に比べて、癌細胞の増殖が良好に行われることが知られている。
　培養した癌細胞の定量方法として、特許文献１には、増殖した癌細胞をＴＶカメラ等で撮像し、得られた画像情報を電子的に画像解析して、癌細胞コロニーの推定体積値を算出する方法が記載されている。また、特許文献３には、コラーゲンゲル内で培養した癌細胞を色素で染色して撮像し、画像濃度に基づいて癌細胞を定量する方法が記載されている。
特開平３－２８５６９６号公報 国際公開第９５／１８２１６号 特開平１０－１１５６１２号公報 特許第３３６３４４５号公報 特開２００８－１１７９７号公報
　特許文献１や特許文献３に記載された癌細胞の定量方法には、さらなる定量精度の向上という課題があった。抗癌剤の感受性試験は、従来、癌患者から摘出された外科手術材料を出発材料として行われている。近年、患者の身体的負担の軽減を目的として、穿刺針等を用いて細胞を採取する生検材料を出発材料とする抗癌剤感受性試験への要望が高まっている。しかし、生検材料では、手術材料と比べて採取できる組織片が小さく、抗癌剤感受性試験においては、従来の１０分の１以下の細胞量を精度よく定量することが求められる。特許文献１や特許文献３では、このような少量の癌細胞を精度良く定量することが難しかった。
　本発明は上記を考慮してなされたものであり、より定量精度の高い細胞測定方法を提供することを目的とする。
　本発明の細胞測定方法は、培養された標的細胞を色素で染色する工程と、前記色素による吸光度が異なる第１の光および第２の光に対する透過像である第１画像および第２画像を取得する工程と、前記第１画像および前記第２画像のそれぞれを複数の分割領域に分割し、前記分割領域毎に前記第１画像と前記第２画像を比較してノイズを排除する工程と、前記ノイズを排除した画像において前記分割領域毎の細胞量の指標を積算することにより、前記標的細胞量を評価する工程とを有する。
　ここで、標的細胞とは測定しようとする細胞をいう。また、ノイズとは染色された標的細胞に由来しない、不要な画像情報をいう。また、細胞量の指標とは、画像の濃淡や、画像の濃淡から算出される吸光度など、細胞の多寡に対応して増減する指標を意味する。この方法により、誤差の原因となるノイズの影響を排除して、細胞量を精度よく測定することができる。
　好ましくは、前記ノイズを排除する工程は、前記分割領域毎に前記第１画像と前記第２画像を比較して、比較した分割領域の明度の差または比が所定値未満であるときは、当該分割領域を前記標的細胞量の評価の基になるデータから除外する工程である。
　あるいは、好ましくは、前記ノイズを排除する工程は、前記分割領域毎に前記第１画像と前記第２画像を比較して、比較した分割領域の吸光度の差または比が所定値未満であるときは、当該分割領域を前記標的細胞量の評価の基になるデータから除外する工程である。
　好ましくは、前記標的細胞が癌細胞である。
　好ましくは、前記標的細胞が三次元培養された細胞であり、より好ましくは、前記細胞がコラーゲンゲルに包埋して培養された細胞である。
　好ましくは、前記第１画像および前記第２画像は、前記第１の光および前記第２の光を同時に照射して、１台のカラーカメラで撮像した画像を色分解することにより取得される。
　あるいは、好ましくは、前記第１画像および前記第２画像は、前記第１の光と前記第２の光を順次照射して、１台のカメラで都度撮像することにより取得される。
　好ましくは、前記標的細胞量の評価は、前記分割領域毎に画像明度から吸光度を算出し、得られた吸光度を複数の該分割領域にわたって積算して、標的細胞の推定体積値を算出することにより行われる。
　本発明の細胞測定方法によれば、培養された標的細胞が少量であっても、細胞量を精度よく評価することができる。
本発明の第１の実施形態で用いる細胞測定装置の構成例を示す図である。 本発明の第１の実施形態の癌細胞定量方法のフロー図である。 画像の明度を説明するための図である。 本発明の第１の実施形態の癌細胞定量方法で得られる元画像を説明するための図である。 ニュートラルレッドの吸光スペクトルである。 実施例で癌細胞を定量した試料の元画像である。 実施例で癌細胞を定量した試料の元画像である。
　本発明の細胞測定方法の第１の実施形態として、抗癌剤感受性試験における癌細胞の定量方法を以下に説明する。
　生体から採取された組織に対しては、培養に先立って、細切、細胞分散酵素処理による細胞間質の消化などの分散処理が行われる。場合によっては、この後に、予備培養で血液などの不要な細胞を除去して、生細胞を回収する分離処理が行われる。
　培養試料の作製は、種々公知の方法を用いることができる。なかでも、三次元培養法を用いるのが好ましい。より好ましくはコラーゲンゲル包埋培養法を用いるのがよい。この方法では、培養に使用する癌細胞の量が少なくても良好な培養およびその後の癌細胞の定量が行える。
　コラーゲンゲル包埋培養法による手順は次のとおりである。分離・分散処理された細胞をコラーゲン溶液に混合する。このとき、コラーゲン溶液に、コラーゲン以外にも培養に必要な各種成分を添加しておくことができる。例えば、コラーゲン溶液に、目的とする細胞の生理的条件と同一または近似した緩衝液を添加することができる。この癌細胞を含むコラーゲン溶液を、培養容器内の支持面上に滴下して滴塊状のコラーゲンゲルを形成させ、培養容器内に液体培地を添加する。同様にいくつかの試料を調製する。一部の試料では、培養容器に抗癌剤を添加し、所定時間経過後に抗癌剤を洗浄除去して、再度培養を行う。
　培養終了後、培養容器に色素を添加して、標的細胞である癌細胞を染色する。染色方法としては、通常の癌細胞培養における染色方法が適用できる。具体的には、ギムザ液染色法、クリスタルバイオレット染色法、ニュートラルレッド（ＮＲ）染色法、フルオレセインジアセテート（ＦＤＡ）染色法あるいはその他の蛍光試薬を用いた染色法が挙げられる。染色法としては、癌細胞を選択的に染色でき、癌細胞以外の成分を出来るだけ染色しない方法が好ましい。生細胞を選択的に染色する生細胞染色法を用いれば、抗癌剤の感受性等を測定するのに適している。ＮＲ染色法は、癌細胞のうち生細胞だけを選択的に染色できる方法として好ましい。
　染色完了後、ホルマリンにより色素を細胞内に固定して、乾燥させる。コラーゲンゲル乾燥物は、滴塊状コラーゲンゲルから水分が抜けて、平坦な面状になる。
　次に、標的細胞を含む試料の撮像と画像処理の方法を説明する。図２に処理のフローチャートを示す。
　図１において、本実施形態の測定装置１０は、試料２０を載せる試料ステージ１１と、試料を下方から照射する照明１２と、試料の透過像を撮像するカラーカメラ１６と、画像処理装置１７を有する。照明１２は１個のＬＥＤパッケージ１３を有し、照明電源１４に接続されている。照明と試料ステージの間には光拡散板１５が挿入されている。各ＬＥＤパッケージには、第１の光を出射するＬＥＤチップ（図示せず）と、第２の光を出射するＬＥＤチップ（図示せず）が組み込まれている。
　第１の光および第２の光は試料を染色した色素に対する吸光度が異なる。本実施形態では、第１の光と第２の光を同時に試料に向けて照射し、１台のカラーカメラで撮像して１枚の元画像を取得する。この元画像を色分解することにより、第１の光に対する透過像である第１画像と、第２の光に対する透過像である第２画像が取得される。
　第１の光および第２の光は、前記色素に対する吸光度の違いが大きいほど好ましい。十分な測定精度を得るには、第１の光および第２の光が試料を透過する際の減衰量の比が１．５倍以上あることが好ましく、２倍以上あることがさらに好ましい。そのためには、両者の吸光度の差は、好ましくはｌｏｇ１．５≒０．１８以上であり、より好ましくｌｏｇ２≒０．３０以上である。吸光度は測定条件によって変化するので、実際の測定条件の下でこのような差が得られるように、第１の光および第２の光の波長を選択するのが好ましい。
　例として、図５にニュートラルレッド（ＮＲ）のｐＨ＝７．１における吸光スペクトルを示す（小畠りから、中和滴定と酸塩基指示薬の可視吸収スペクトル、慶応義塾大学日吉紀要自然科学、２０１１年９月、Ｎｏ．５０、ｐｐ．７７－１０２を基に作成）。ＮＲはこのｐＨでは約３８０ｎｍ～６００ｎｍの範囲に吸収帯があり、４６２ｎｍと５１８ｎｍに吸収ピークを有する。この場合、第１の光には波長分布がこの吸収帯と重なる緑色の光を、第２の光には波長分布がこの吸収帯と重ならない赤色の光を選択することができる。
　照明の光源としては、ＬＥＤを用いるのが好ましい。ＬＥＤは波長分布が狭く、第１画像と第２画像の違いが明瞭に出やすいからである。なお、照明の物理的な形態は特に限定されない。例えば、ＬＥＤパッケージの数は特に限定されない。また、例えば、本実施形態のように第１の光を出射するＬＥＤチップと第２の光を出射するＬＥＤチップが一つのＬＥＤパッケージに組み込まれていてもよいし、第１の光を出射するＬＥＤパッケージと第２の光を出射するＬＥＤパッケージを交互に並べてもよい。
　画像は多数の画素データの集合として構成される。各画素には、カメラの撮像素子に捉えられた光の強度に対応した明度を表す情報が含まれている。明度は、例えば、撮像の取込階調が８ビットであれば０～２５５の２５６通りの数値で表される。光が試料を通過する際に吸収があると、透過像上でその部分は暗く、すなわち明度が小さく写る。
　第１の光に対する透過像である第１画像は、ＮＲによる吸収が大きいので、培養試料中にＮＲに染色された癌細胞が存在すれば、その部分の透過光強度は小さくなる。そして、癌細胞の厚さが大きいほど、透過光強度は小さく、画像の明度は小さくなる。他方、第２の光に対する透過像である第２画像は、癌細胞の存在量をあまり反映しない。
　ここで、第１画像および第２画像のそれぞれを同じ方法で複数の分割領域に分割する。同じ方法で分割するとは、第１画像と第２画像の対応する分割領域同士が同じ大きさであって、試料の同じ場所を写したものであるように分割することをいう。以下に述べる画像の処理は各分割領域毎に行われる。本実施形態では、一つの画素を一つの分割領域とする。第１画像および第２画像は一つの元画像から得られるので、各画素は両画像を同じ方法で分割した領域である。
　まず、癌細胞を含まない試料の画像情報から得られるブランク画像明度Ｗと、暗黒状態の画像情報から得られる暗画像明度Ｂとを上下限として、画素毎に前記上下限値に対する明度の相対値を求めて、第１画像および第２画像を補正する。ブランク画像は、癌細胞を添加しないことを除いて癌細胞の培養試料と同じ工程を経て処理されたブランク試料を撮像して得られた、最も明るい状態の画像である。ただし、コラーゲンゲル基質などは存在するので、完全な白画像ではない。暗画像は、撮影レンズのシャッターを閉じるなどして光が入らないようにした最も暗い状態での画像である。図３に示すように、第１画像の明度Ｔ１と第２画像の明度Ｔ２は、ブランク画像の明度Ｗと暗画像の明度Ｂとの間にある。
　次に、第１画像と第２画像を比較して、ノイズの影響を排除する。
　第１画像と第２画像の各画素を比較して、明度の差または比が所定の閾値より小さい場合は、その画素の領域は癌細胞ではないと判断して、当該画素を除外する。より詳しくは、当該画素のデータを、後に癌細胞量を評価する際の基になるデータから除外する。具体的には、例えば、第１画像を修正して、当該画素の明度を上記ブランク画像の明度で上書きすればよい。これにより、当該画素の明度は癌細胞量の評価に影響を及ぼさず、実質的に除外される。
　上記閾値として、明度の差を基準とする場合は、例えば、閾値を明度の階調数の８分の１とすることができる。つまり、明度が８ビット・２５６階調で表されるときは、第１画像と第２画像の明度の差が３２より小さい場合に当該画素を除外すればよい。あるいは、明度の比を基準とする場合は、第１画像と第２画像の明度の比が所定の閾値より小さい場合に当該画素を除外すればよい。より好ましくは、これらの閾値は予備実験により求めておく。
　あるいは、各画素の明度から吸光度を求め、吸光度の差または比が所定の閾値より小さい場合に、その画素の領域が癌細胞ではないと判断してもよい。
　不透明なゴミは、波長によらず光を透過しないので、第１画像でも第２画像でも同様に暗く写る。また、コラーゲンゲル乾燥物に含まれる気泡は、光の屈折によって画像上で暗く写るので、やはり光源の波長によらず、第１画像でも第２画像でも同様に暗く写る。したがって、第１画像と第２画像で明度に差がない領域を除外することによって、これらのノイズを排除することができる。
　なお、気泡は、コラーゲンゲル包埋培養法において細胞量が少ない場合に特に問題となる。細胞量が少ないと、コラーゲンゲル乾燥物に気泡が残ることがある。その原因は明らかでないが、細胞量が多い場合は、ゲル内の気体がゲル滴塊中の細胞と基質の界面を通って外部に抜けるのに対して、細胞量が少なくなると、ゲル内の気体が抜けきらずに残存するものと考えられる。
　図４に、ＮＲで染色した試料の透過像（元画像）を示す。第１の光は主波長が５２８ｎｍの緑色の光、第２の光は主波長が６２５ｎｍの赤色の光であった。ただし、図４はカラー画像である元画像を白黒画像に変換したもので、解像度も変換している。中央部の円形の範囲が試料（コラーゲンゲル乾燥物）である。試料中に多数散在する細かな暗点が癌細胞またはそのコロニーで、元画像では赤く、第１画像には暗く現れ、第２画像には現れない。ただし、点線で囲んだ暗点はゴミで、元画像では灰色で、第１画像および第２画像に暗く現れる。上方の中実の楕円と下方の中空の楕円が気泡によるノイズで、元画像では灰色で、第１画像および第２画像に暗く現れる。
　ノイズの他の原因に、線維芽細胞の混入がある。線維芽細胞の影響は、特許文献３に記載された方法によって排除することができる。線維芽細胞は、癌細胞とともにＮＲ等の色素で染色されるが、癌細胞に比べて格段に染色され難く、画像の明度が癌細胞に比べて明らかに高くなる。そこで、第１画像において、ある画素の明度が所定の閾値を超える場合は、その画素の領域が線維芽細胞であると判断して、当該画素を除外する。具体的には、例えば、第１画像を修正して、当該画素の明度を上記ブランク画像の明度で上書きすればよい。閾値は、予備実験により求めておくことができる。
　あるいは、線維芽細胞の影響を排除する他の方法として、特許文献１に記載されたように、画像解析により、癌細胞と線維芽細胞をその形状から識別して、癌細胞のみの情報を取り出してもよい。
　以上の処理を試料の全範囲にわたって繰り返すことで、癌細胞による光吸収に起因しないノイズの影響を排除することができる。
　次に、ノイズを排除した画像から、癌細胞を定量する。
　癌細胞量は、各画素毎の細胞量の指標を積算することによって評価できる。好ましくは、癌細胞量は推定体積値によって評価される。コラーゲンゲル包埋培養法によれば、癌細胞のコロニーは３次元的に発達するので、その厚さを考慮することで、より的確な評価ができるからである。推定体積値は、各画素の明度から吸光度を求め、吸光度を試料範囲全体にわたって積算することで求められる。各領域において、吸光度は細胞厚さとリニアに相関しているからである。
　ランベルト・ベールの法則により、試料への入射光強度をＩ０、透過光強度をＩとすると、
　　Ｉ／Ｉ０＝ｅｘｐ（－αＬ）
の関係がある。ここで、αは染色された癌細胞の吸光係数、Ｌは癌細胞中を光が通過する距離、すなわち癌細胞の厚さである。各画素の癌細胞による吸光度Ａは、
　　Ａ＝－ｌｏｇ（Ｉ／Ｉ０）
　　　＝（αＬ）／２．３０３
で表されるので、吸光度Ａは癌細胞厚さＬに比例する。吸光度Ａは当該画素の細胞量の指標であり、これを試料の全範囲にわたって積算することにより細胞の体積を求めることができる。なお、ｌｏｇは常用対数である。
　一方、吸光度Ａは、修正された第１画像から、
　　Ａ＝ｌｏｇ｛（Ｗ－Ｂ）／（Ｔ１－Ｂ）｝
で求められる。ここで、Ｗはブランク画像の画素の明度、Ｂは暗画像の画素の明度、Ｔ１は修正された第１画像の画素の明度である。
　以上より、癌細胞量の推定体積値Ｖは、
　　Ｖ＝ΣＬ＝ＣΣＡ＝ＣΣ［ｌｏｇ｛（Ｗ－Ｂ）／（Ｔ１－Ｂ）｝］　　（式１）
で求められる。ここで、Ｃは定数である。このように、各画素の明度から吸光度を求め、吸光度を試料範囲全体にわたって積算することによって、細胞の推定体積値を求めることができる。
　なお、何らかの理由によって、修正された第１画像の画素の明度Ｔ１が暗画像の画素の明度Ｂに等しい（Ｔ１＝Ｂ）ときは、式１の右辺対数の真数の分母が０になり、計算ができない。これに対しては、試料画像が暗くなりすぎないように光源の明るさ等を調節するとともに、Ｔ１＝Ｂになる場合に適当な例外処理を行うのが好ましい。
　なお、簡易的には、各画素の明度を積算して、その積算値から吸光度を求めてもよい。推定体積値Ｖｐは、
　　Ｖｐ＝ＣｐＡｐ＝Ｃｐｌｏｇ｛（ΣＷ－ΣＢ）／（ΣＴ１－ΣＢ）｝
で表される。ここで、Ｃｐは定数、Ａｐは吸光度である。この式は試料範囲全体を一つの領域として吸光度を求めているが、細胞量が多ければ、例えば手術材料を出発材料とするような場合には、十分な精度が得られる。この式を用いる場合でも、上記画像処理によって、ゴミ等に起因するノイズの影響はすでに排除されている。
　抗癌剤の感受性試験では、抗癌剤を加えなかったコントロール試料と抗癌剤を加えた試料とで、培養後の癌細胞量を比較することにより、抗癌剤の感受性を評価する。
　本実施形態の癌細胞定量方法の効果を改めて述べる。
　ゴミや気泡によるノイズは、従来の技術では排除することが難しかった。本実施形態の方法によれば、第１の光および第２の光を用いることにより、ゴミの混入や気泡の残存の影響を排除して、癌細胞を精度良く定量することができる。不透明なゴミは、第１画像のみでは癌細胞と誤認識され、さらに画像に暗く写るため厚い癌細胞と誤認識されるので、定量精度を大きく損なう。気泡は、第１画像のみではやはり癌細胞と誤認識され、癌細胞のコロニーに比べて大きなものが多いので、定量精度を大きく損なう。
　さらに、上記式１により、試料画像の分割領域毎に吸光度を求めて、それを積算すれば、癌細胞の推定体積値をより正確に算出することができる。
　次に、本発明の細胞測定方法の第２の実施形態を説明する。
　本実施形態は、第１の実施形態と同じく、抗癌剤感受性試験における癌細胞の定量方法に関する。本実施形態の方法は、第１画像および第２画像の取得方法が第１の実施形態と異なる。その他の工程は第１の実施形態と同様である。
　本実施形態では、第１の光を発する第１光源と第２の光を発する第２光源を順次点灯させ、各光源点灯時に１台のカメラで都度撮像を行う。これにより、第１光源点灯時の撮像によって第１画像が、第２光源点灯時の撮像によって第２画像が得られる。なお、本実施形態においても、光源の物理的な形態は特に限定されない。例えば、第１光源であるＬＥＤチップと第２光源であるＬＥＤチップが一つのＬＥＤパッケージに組み込まれていてもよいし、第１光源と第２光源として別個のＬＥＤパッケージを用い、それらを交互に並べてもよい。
　本実施形態では、モノクロカメラを使用することができる。その場合は、モノクロカメラの方がカラーカメラよりも高解像度のものが入手可能であるので、より精細な画像を得ることができる。
　上記第１の実施形態を、実施例により、さらに具体的に説明する。
　癌細胞としてヒト大腸癌由来細胞株であるＨＣＴ－１１６を用い、コラーゲンゲル包埋法で培養した。細胞を包埋するコラーゲンゲル溶液として、セルマトリックスＴｙｐｅＣＤ（倉敷紡績株式会社）８容量に、１０倍のハムＦ１２培養液（重曹不含）１容量、再構成用緩衝溶液（２６０ｍＭ重曹および２００ｍＭ－ＨＥＰＥＳを含む５０ｍＭ－ＮａＯＨ溶液）１容量を加え、氷中に保存した。コラーゲン溶液にＨＣＴ－１１６株を、最終密度が４×１０４セル／ｍＬになるように加え、良く混合してコラーゲン混合液を調製した。このコラーゲン混合液を、マイクロ・ピペットを用いて、２４ウェルプレートの１ウェルに１０μＬずつ、適当な間隔をあけて３個所に滴下した。その後、ＣＯ２インキュベータ中で３７℃で１時間加温し、癌細胞を含むコラーゲン基質を作製した。得られたコラーゲンゲル基質に、１０％ＦＢＳ含有ＤＦ培地を１ｍＬ加えて、１６時間培養を行った。その後、ウェルにＮＲ染色剤を注入し、ホルマリン固定・乾燥を行って、コラーゲンゲル乾燥物を得た。
　得られたコラーゲンゲル乾燥物を試料ステージに載せ、下方から照明で照らし、カラーカメラで透過像を撮像した。照明は、ＬＥＤパッケージ（ＣＲＥＥ　Ｉｎｃ．、ＭＣ－Ｅ　Ｃｏｌｏｒ）を１個使用した。ＬＥＤパッケージにはＲＧＢ３色のＬＥＤチップが搭載されており、この内ＲおよびＧのチップのみを点灯させて使用した。第１の光は主波長５２８ｎｍの緑色の光、第２の光は主波長６２５ｎｍの赤色の光であった。カラーカメラ（ソニー株式会社、ＸＣＬ５００５ＣＲ）は、画素数２４４８×２０５０、ＲＧＢ各８ビット階調で、光学倍率１．３倍のレンズを用いた。このとき画像の解像度は約２．７μｍであった。
　撮像された元画像を白黒画像に変換したものが図６（気泡のない試料）および図７（気泡の多い試料）である。図６および図７に示す試料には、ほぼ同程度の量の癌細胞が含まれる。なお、前述の図４も本実施例と同じ方法で得られた画像である。元画像をＲＧＢの３色に色分解して、Ｇ画像を第１画像、Ｒ画像を第２画像とした。第１画像と第２画像を画素毎に比較して、明度の差が３５以内の場合に、癌細胞ではないと判断した。前述の式１によって、画素毎に吸光度を算出し、試料の全範囲にわたって積算して、癌細胞の推定体積値を求めた。このとき、式１の定数Ｃの値は２．０×１０－４を用いた。
　比較例として、第２画像を利用せず、第１画像の明度から吸光度を算出し、試料の全範囲にわたって積算して、癌細胞の推定体積値を同様に求めた。
　実施例の方法で得られた推定体積値は、図６が０．４２、図７が０．４４であった。比較例の方法では、図６が０．４７、図７が１．５４であった。気泡のない図６では、実施例と比較例で同程度の推定体積値が得られた。他方、気泡の多い図７では、比較例による推定体積値は、実施例のそれの約３倍であった。これは、気泡によるノイズの影響であり、実施例では気泡によるノイズが排除できた。
　本発明の細胞測定方法は、上記の実施形態や実施例に限定されるものではなく、その技術的思想の範囲内で様々な変形が可能である。
　例えば、上記の実施形態では、明度の相対化（ブランク補正）、第１画像と第２画像の比較によるゴミ・気泡等のノイズ排除、線維芽細胞のノイズ排除の順に実施されるが、これらはそれぞれ順番を入れ替えて実施してもよい。
　また、例えば、白色照明を用いて、カメラの前方に設けたカラーフィルタを順次切り替えて撮影し、第１画像および第２画像を取得してもよい。
　また、例えば、照明に連続スペクトルを有する白色光源を用い、カラーカメラで撮像して色分解をすることで、第１画像と第２画像を取得してもよい。ただし、カラーカメラの撮像素子は一般に感度スペクトルが広く一部が重複しているため、波長の異なる２つの光源を用いる方が、第１画像と第２画像の違いが明瞭に得られる。
　１０　測定装置
　１１　試料ステージ
　１２　照明
　１３　ＬＥＤパッケージ
　１４　照明電源
　１５　光拡散板
　１６　カラーカメラ
　１７　画像処理装置
　２０　試料

Claims (8)

  1. 　培養された標的細胞を色素で染色する工程と、
    　前記色素による吸光度が異なる第１の光および第２の光に対する透過像である第１画像および第２画像を取得する工程と、
    　前記第１画像および前記第２画像のそれぞれを複数の分割領域に分割し、前記分割領域毎に前記第１画像と前記第２画像を比較してノイズを排除する工程と、
    　前記ノイズを排除した画像において前記分割領域毎の細胞量の指標を積算することにより、前記標的細胞量を評価する工程と、
    を有する細胞測定方法。
  2. 　前記ノイズを排除する工程は、前記分割領域毎に前記第１画像と前記第２画像を比較して、比較した分割領域の明度の差または比が所定値未満であるときは、当該分割領域を前記標的細胞量の評価の基になるデータから除外する工程である、
    請求項１に記載の細胞測定方法。
  3. 　前記ノイズを排除する工程は、前記分割領域毎に前記第１画像と前記第２画像を比較して、比較した分割領域の吸光度の差または比が所定値未満であるときは、当該分割領域を前記標的細胞量の評価の基になるデータから除外する工程である、
    請求項１に記載の細胞測定方法。
  4. 　前記標的細胞が癌細胞である、
    請求項１～３のいずれか一項に記載の細胞測定方法。
  5. 　前記標的細胞がコラーゲンゲルに包埋して培養された細胞である、
    請求項１～４のいずれか一項に記載の細胞測定方法。
  6. 　前記第１画像および前記第２画像は、前記第１の光および前記第２の光を同時に照射して、１台のカラーカメラで撮像した画像を色分解することにより取得される、
    請求項１～５のいずれか一項に記載の細胞測定方法。
  7. 　前記第１画像および前記第２画像は、前記第１の光と前記第２の光を順次照射して、１台のカメラで都度撮像することにより取得される、
    請求項１～５のいずれか一項に記載の細胞測定方法。
  8. 　前記標的細胞量の評価は、前記分割領域毎に画像明度から吸光度を算出し、得られた吸光度を複数の該分割領域にわたって積算して、標的細胞の推定体積値を算出することにより行われる、
    請求項１～７のいずれか一項に記載の細胞測定方法。
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