WO2017029799A1 - イネ科又はウリ科の草本植物由来化合物の製造方法 - Google Patents

イネ科又はウリ科の草本植物由来化合物の製造方法 Download PDF

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WO2017029799A1
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sugar
fermentation
cucurbitaceae
herbaceous plant
concentrate
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PCT/JP2016/003714
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建吾 佐々木
千秋 荻野
近藤　昭彦
川島　敏行
雅彦 廣瀬
貴久 小西
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日東電工株式会社
国立大学法人神戸大学
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • C12P7/14—Multiple stages of fermentation; Multiple types of microorganisms or re-use of microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a herbaceous plant-derived compound of the family Gramineae or Cucurbitaceae.
  • grasses of grasses such as sorghum and the herbaceous plants of cucurbitaceae such as watermelon contain high concentrations of sugar.
  • sorghum has a large yield because it has a short growth period and is resistant to drying and salt damage and has a wide range of cultivation. Therefore, in recent years, the production of bioethanol from the juice of grass or cucurbitaceae herbaceous plants by fermentation has attracted attention, and various techniques have been proposed.
  • Non-Patent Document 1 sugar (sucrose) is further added to the sorghum juice in order to suppress the energy consumption of distillation and dehydration in the ethanol production process by producing ethanol at a high concentration from the sorghum juice.
  • sugar sucrose
  • Non-Patent Document 2 proposes increasing the initial concentration of the sugar solution used for fermentation by concentrating the sorghum juice by a two-stage membrane separation process.
  • Non-Patent Document 3 proposes a method of producing ethanol from sorghum juice by repeated batch fermentation using yeast immobilized on corn cobs.
  • a new sorghum juice in which nutrient sources necessary for fermentation such as nitrogen source such as yeast extract and peptone and sugar (sucrose) are further added. Is used.
  • the present invention uses a sugar solution obtained from a grass plant of the family Gramineae or Cucurbitaceae as a raw material for fermentation, and more efficiently a herbaceous plant-derived compound of the family Gramineae or Cucurbitaceae such as ethanol by fermentation, And it aims at providing the method which can be manufactured more simply.
  • the first aspect of the present invention is: The first sugar concentrate obtained by concentrating a sugar solution obtained from a herbaceous plant of the family Gramineae or Cucurbitaceae with at least one of a nanofiltration membrane and a reverse osmosis membrane is added to yeast, E. coli and The first sugar concentrate is fermented by adding at least one microorganism selected from bacteria belonging to the genus Corynebacterium, and the obtained first fermentation broth is solid-liquid separated into a solid component and a liquid component. 1 fermentation process, The solid solution obtained in the first fermentation step is concentrated with at least one of a nanofiltration membrane and a reverse osmosis membrane with a sugar solution obtained from a grass plant of the family Gramineae or Cucurbitaceae.
  • the obtained second sugar concentrate is added to ferment the second sugar concentrate using the microorganism used in the first fermentation step, and the obtained second fermentation liquid is converted into a solid component and a liquid.
  • a second fermentation step for solid-liquid separation into components Including From the liquid component obtained in at least any one fermentation step selected from the first fermentation step and the second fermentation step, obtain a herbaceous plant or cucurbitaceae herbaceous plant-derived compound, Provided is a method for producing a herbaceous plant compound of the family Gramineae or Cucurbitaceae.
  • the second aspect of the present invention is: The first sugar concentrate obtained by concentrating a sugar solution obtained from a herbaceous plant of the family Gramineae or Cucurbitaceae with at least one of a nanofiltration membrane and a reverse osmosis membrane is added to yeast, E. coli and The first sugar concentrate is fermented by adding at least one microorganism selected from bacteria belonging to the genus Corynebacterium, and the obtained first fermentation broth is solid-liquid separated into a solid component and a liquid component. 1 fermentation process, The solid solution obtained in the first fermentation step is concentrated with at least one of a nanofiltration membrane and a reverse osmosis membrane with a sugar solution obtained from a grass plant of the family Gramineae or Cucurbitaceae.
  • the obtained second sugar concentrate is added to ferment the second sugar concentrate using the microorganism used in the first fermentation step, and the obtained second fermentation liquid is converted into a solid component and a liquid.
  • the solid solution obtained by solid-liquid separation of the fermentation broth obtained in the above step is converted into a sugar solution obtained from a grass plant of the family Gramineae or Cucurbitaceae, and at least one of a nanofiltration membrane and a reverse osmosis membrane.
  • the concentrated L-sugar obtained by concentrating with a membrane is added, and the concentrated L-sugar is obtained using the microorganism used in the fermentation process of any of the first to L-1 fermentation processes.
  • the production method according to the first aspect of the present invention is a method for producing a herbaceous plant or cucurbitaceae herbaceous plant-derived compound by repeated batch fermentation including at least a first fermentation step and a second fermentation step.
  • a sugar concentrate obtained by concentrating a sugar solution obtained from a grass plant of the family Gramineae or Cucurbitaceae with a specific membrane is used as a first fermentation step.
  • a nutrient source such as a nitrogen source or a new microorganism is further added even though the microorganism used in the first fermentation step is repeatedly used in the second fermentation step.
  • the herbaceous plant or cucurbitaceae herbaceous plant-derived compound can be produced.
  • membrane By using the obtained sugar concentrate as a fermentation raw material, a microorganism can be obtained without further addition of a nutrient source such as a nitrogen source or a new microorganism, as in the production method according to the first aspect of the present invention. It can be used repeatedly to produce a herbaceous or cucurbitaceae herbaceous plant-derived compound.
  • the production method according to the first and second aspects of the present invention can repeatedly use microorganisms for fermentation, and does not need to further add nutrient sources such as nitrogen sources or new microorganisms.
  • nutrient sources such as nitrogen sources or new microorganisms.
  • the herbaceous plant or cucurbitaceae herbaceous plant-derived compound can be produced more efficiently and more easily.
  • NF membrane nanofiltration membrane
  • RO membrane reverse osmosis membrane
  • a first fermentation step for solid-liquid separation into components The first fermented liquid obtained in the first fermentation step is subjected to solid-liquid separation, and the obtained solid component is converted into a sugar liquid obtained from grass or cucurbitaceae herbaceous plants as raw materials at least of the NF membrane and the RO membrane. It is obtained by adding the second sugar concentrate obtained by concentrating on any one kind of membrane and fermenting the second sugar concentrate using the microorganism used in the first fermentation step.
  • the production method of the present embodiment is a method for producing a herbaceous plant or cucurbitaceae herbaceous plant-derived compound by repeated batch fermentation, including at least a first fermentation step and a second fermentation step.
  • a sugar solution obtained from a grass plant of the family Gramineae or Cucurbitaceae is obtained by concentrating with a specific membrane (at least one of an NF membrane and an RO membrane).
  • the obtained sugar concentrate is used as a fermentation raw material.
  • This sugar concentrate is a liquid capable of culturing microorganisms without adding a nutrient source such as a nitrogen source necessary for culturing microorganisms.
  • the manufacturing method of this embodiment uses this sugar concentrate as a fermentation raw material, the nutrient source such as a nitrogen source is further added even though the microorganism used in the first fermentation step is repeatedly used in the second fermentation step. Even if it does not add, fermentation progresses and the herbaceous plant-derived compound of Gramineae or Cucurbitaceae can be manufactured. Moreover, since the cultivation of microorganisms proceeds in parallel with fermentation by using this sugar concentrate, it is not necessary to add new microorganisms in the second fermentation step. Although it is not clear why microorganisms can be cultured without adding a nitrogen source to the sugar concentrate, a sugar liquid obtained from a grass plant of the family Gramineae or Cucurbitaceae is used as the above specific membrane. By concentrating in this step, not only sugar but also nutrients necessary for culturing microorganisms such as amino acids are sufficiently concentrated. Therefore, culturing of microorganisms is not possible without newly adding a nitrogen source or the like. It is thought.
  • the conventional method for producing a plant-derived compound such as ethanol by repeated batch fermentation is different from the production method of the present embodiment, and is proposed in a common sugar solution obtained from sugar cane and the like, and Non-Patent Document 3.
  • Such sorghum juice is used as it is without being concentrated by the specific membrane.
  • These sugar solutions used in conventional production methods are difficult to culture microorganisms when no nutrient source is added. Therefore, in the conventional production method using repeated batch fermentation, it is necessary to add a nutrient source such as a nitrogen source or a new microorganism when repeating the fermentation.
  • the production method of the present embodiment can repeatedly use microorganisms for fermentation, and further does not need to add a nutrient source such as a nitrogen source or new microorganisms, so compared with the conventional method.
  • a nutrient source such as a nitrogen source or new microorganisms
  • the new addition of the above-mentioned nutrient source and microorganisms is not excluded at all.
  • the fermentation step may be carried out three times or more. That is, the method for producing a grass plant or cucurbitaceae herbaceous plant-derived compound of the present embodiment includes the third to Nth fermentation steps (N is an integer of 3 or more) performed after the second fermentation step. Further, it may be included. In that case, in the L-th fermentation step included in the second to N-th fermentation steps (L is an integer satisfying 2 ⁇ L ⁇ N), any one of the first to L-1 fermentation steps.
  • the solid solution obtained by solid-liquid separation of the fermentation broth obtained in the above step is converted into a sugar solution obtained from a grass plant of the family Gramineae or Cucurbitaceae, and at least one of a nanofiltration membrane and a reverse osmosis membrane.
  • the L sugar concentrate obtained by concentrating on the membrane is added, and the L sugar concentrate is fermented using the microorganism used in any one of the first to L-1 fermentation processes.
  • the obtained Lth fermentation broth is solid-liquid separated into a solid component and a liquid component.
  • the fermentation process is carried out three times or more, instead of the liquid component obtained in at least one fermentation process selected from the first fermentation process and the second fermentation process, selected from the first to Nth fermentation processes It is preferable to obtain a herbaceous plant or cucurbitaceae herbaceous plant-derived compound from the liquid component obtained in at least one of the fermentation processes.
  • the fermentation process is carried out three times or more, it is desirable to perform fermentation using the microorganisms used in the previous fermentation process in each fermentation process in order to improve the efficiency and simplification of the production method. That is, in the Lth fermentation step, the Lth sugar concentrate is added to the solid component obtained in the L-1 fermentation step and the microorganism used in the L-1 fermentation step is used to add the Lth sugar concentrate. It is desirable to ferment.
  • grass plants include sorghum.
  • Sorghum is suitable as biomass because it has a short growth period and is resistant to drying and salt damage and has a wide range of cultivation applications, so its yield is large.
  • sorghum is an annual plant of the grass family, and there are various types.
  • a kind of sorghum having a high sugar content such as white sorghum is preferably used.
  • An example of the herbaceous plant of the family Cucurbitaceae is watermelon.
  • the herbaceous plant or cucurbitaceae herbaceous plant-derived compound means all compounds obtained by fermenting a sugar solution produced using a herbaceous or cucurbitaceae herbaceous plant as a raw material.
  • examples thereof include alcohols such as ethanol and butanol, lactic acid which is a raw material for bioplastics, and succinic acid.
  • sorghum is used as the raw material for the sugar solution and the fermentation process is repeated three times or more, that is, the first to Nth fermentation processes are performed.
  • the production method of the present invention is not limited to the following examples, and other grasses or cucurbits may be used instead of sorghum, and the number of repetitions of the fermentation process is set to 2 times. Also good.
  • the sugar liquid obtained using sorghum as a raw material is, for example, a sorghum juice obtained by pressing sorghum, and a known sugar liquid using sorghum as a raw material can be used.
  • sorghum juice obtained by squeezing sorghum often contains sorghum scum, garbage, and the like. Therefore, it is desirable that the sugar solution obtained using sorghum as a raw material is passed through an ultrafiltration membrane (UF membrane) and filtered, and the residue on the UF membrane is removed and pretreated.
  • UF membrane ultrafiltration membrane
  • the UF membrane is a membrane having an average pore diameter of about 0.001 ⁇ m to 0.01 ⁇ m.
  • the material of the UF membrane is not particularly limited, and for example, a polymer material such as cellulose ester polymer such as cellulose acetate, polyethylene, polypropylene, polysulfone, polyvinylidene fluoride, polyethersulfone, or the like can be used. Polyvinylidene fluoride and polyethersulfone are preferable from the viewpoint of durability and detergency.
  • the shape of the UF membrane is not particularly limited, and can be selected from a flat membrane shape, a hollow fiber membrane shape, a pleated membrane shape, a tuple membrane shape, and the like.
  • a so-called spiral element film which is formed by processing a flat film into an envelope shape and winding the film in a spiral shape together with a support such as a net, is preferable because the film area can be increased.
  • the method for filtering the sugar solution using the UF membrane is not particularly limited, and a known filtration method using a UF membrane can be used.
  • a sugar concentrate preparation step is performed.
  • a sugar liquid obtained using sorghum as a raw material is concentrated with at least one of an NF membrane and an RO membrane to prepare a sugar concentrate.
  • the concentration of the sugar solution by the membrane can be performed by allowing the sugar solution to permeate through at least one of the NF membrane and the RO membrane and collecting the non-permeate side solution. Since a substance having a lower molecular weight than sugar permeates the membrane, the liquid on the non-permeate side is a solution in which sugar is purified and concentrated.
  • the sugar concentrate prepared in the sugar concentrate preparation step can be used for the first to Nth sugar concentrates used in the first to Nth fermentation steps described later. Note that all of the sugar concentrates used as the first to Nth sugar concentrates may be prepared in advance in this step. That is, as shown in the flowchart of FIG. 1, a part of the sugar concentrate obtained in this step may be used as the first to Nth sugar concentrates. It is also possible to prepare a sugar concentrate in each fermentation step.
  • the RO membrane is a membrane having a sodium chloride removal rate of 93% or more when a test solution having a sodium chloride concentration of 500 to 2,000 mg / L is filtered at an operating pressure of 0.5 to 3.0 MPa. is there.
  • NF membrane is generally a semi-permeable membrane that has lower blocking performance than RO membranes and is superior in performance of removing divalent ions, but is also used for organic matter and decolorization.
  • the NF membrane is a membrane having a sodium chloride removal rate of 5% or more and less than 93% when a test solution having a sodium chloride concentration of 500 to 2,000 mg / L is filtered at an operating pressure of 0.3 to 1.5 MPa. That is.
  • the material of the NF membrane and the RO membrane is not particularly limited.
  • a polymer material such as cellulose ester polymer such as cellulose acetate, polyamide, polyester, polyimide, vinyl polymer, polyethersulfone, sulfonated polyethersulfone, polyamide, etc. Can be used. Multiple materials may be used.
  • polyamide is suitably used for the RO membrane because it has a proven record of high blocking performance.
  • polyamide, polyethersulfone, polyvinyl alcohol, or a mixture thereof is preferably used.
  • the shape of the NF membrane and RO membrane is not particularly limited, and can be selected from flat membranes, hollow fiber membranes, pleated membranes, tubular membranes, and the like.
  • a so-called spiral element film which is formed by processing a flat film into an envelope shape and winding the film in a spiral shape together with a support such as a net, is preferable because the film area can be increased.
  • the membrane concentration method using the NF membrane and / or the RO membrane is not particularly limited, and a known membrane concentration method can be used.
  • membrane concentration may be repeated a plurality of times in succession. In that case, the same type of film may be used at all times, or different types of films may be used at each time.
  • the membrane concentration by the NF membrane and / or the RO membrane may be repeated a plurality of times until the sugar concentration reaches a desired concentration.
  • the desired sugar concentration of the finally obtained sugar concentrate is, for example, 230 g / L or more.
  • the first fermentation process is performed.
  • yeast, Escherichia coli and corynebacterium are added to the first sugar concentrate obtained by concentrating the sugar solution obtained from sorghum as a raw material with at least one of the NF membrane and the RO membrane. At least any one microorganism selected from the genus bacteria is added to ferment the first sugar concentrate.
  • the sugar concentrate prepared in the sugar concentrate preparation step can be used as the first sugar concentrate.
  • a known method can be used as a fermentation method using the first sugar concentrate as a fermentation raw material.
  • the microorganism used for the fermentation at least one kind of known microorganisms selected from yeast, Escherichia coli and Corynebacterium can be used.
  • the microorganism to be used may be isolated from the natural environment, or may be partially modified by mutation or genetic recombination.
  • Microorganisms used for fermentation may be cultured in advance using a known medium such as a YPD medium until a sufficient concentration is obtained.
  • the microorganisms used for fermentation can also be cultured using a sugar concentrate prepared from the sorghum prepared in this embodiment.
  • the production method of the present embodiment may include a culture step for culturing the microorganism used in the first fermentation step, and the sugar concentration specified in the present embodiment as a culture solution used in this culture step.
  • a liquid a sugar concentrate obtained by concentrating a sugar solution obtained from a herbaceous plant of the family Gramineae or Cucurbitaceae with at least one of an NF membrane and an RO membrane
  • this culture process may be implemented before a 1st fermentation process, and is implemented simultaneously with the fermentation in a 1st fermentation process, ie, the 1st fermentation process may serve as a culture process.
  • this sugar concentrate When this sugar concentrate is used for culturing microorganisms, culturing is possible without further adding nutrient sources necessary for culturing microorganisms such as nitrogen sources.
  • nutrient sources necessary for culturing microorganisms such as nitrogen sources.
  • the reason why microorganisms can be cultured without adding a nitrogen source to the sugar concentrate is not clear, but by concentrating the sugar liquid obtained using sorghum as a raw material with an NF membrane and / or an RO membrane,
  • nutrient sources necessary for culturing microorganisms such as amino acids are sufficiently concentrated, and it is considered that culturing of microorganisms is possible without newly adding a nitrogen source or the like.
  • the first fermentation broth obtained in the first fermentation step is solid-liquid separated into a solid component and a liquid component.
  • the method of solid-liquid separation is not particularly limited, and a known method for solid-liquid separation of a fermentation broth such as centrifugation can be used.
  • the second fermentation process is performed.
  • the second sugar concentrate obtained by concentrating the sugar liquid obtained using sorghum as a raw material with at least one of the NF membrane and the RO membrane is added. And fermenting the second sugar concentrate.
  • the solid component obtained in the first fermentation step contains microorganisms.
  • the microorganisms used in the first fermentation step are used for fermentation of the second sugar concentrate.
  • the sugar concentrate prepared in the sugar concentrate preparation step can be used as the second sugar concentrate.
  • the fermentation ability of microorganisms is maintained.
  • a new nitrogen source may not be added to the solid component, and only the second sugar concentrate may be added for fermentation.
  • sufficient fermentation can be performed without adding new microorganisms, but new microorganisms can also be added.
  • the second fermentation broth obtained in the second fermentation step is solid-liquid separated into a solid component and a liquid component.
  • the method of solid-liquid separation is not particularly limited, and a known method for solid-liquid separation of a fermentation broth such as centrifugation can be used.
  • the third fermentation process is performed.
  • a third sugar concentrate obtained by concentrating the sugar liquid obtained from sorghum with at least one of the NF membrane and the RO membrane is added. And fermenting the third sugar concentrate. That is, the microorganism used in the second fermentation step is used for fermentation of the third sugar concentrate.
  • the sugar concentrate prepared in the sugar concentrate preparation step can be used as the third sugar concentrate.
  • a nitrogen source may not be newly added to the solid component, and only the third sugar concentrate may be added for fermentation.
  • the third fermentation broth obtained in the third fermentation step is separated into a solid component and a liquid component.
  • the method of solid-liquid separation is not particularly limited, and a known method for solid-liquid separation of a fermentation broth such as centrifugation can be used.
  • a fermentation process is performed using a solid component (microorganism) obtained by solid-liquid separation of the fermentation liquid obtained in the previous fermentation process.
  • a solid component microorganism obtained by solid-liquid separation of the fermentation liquid obtained in the previous fermentation process.
  • the present invention is not necessarily limited to this. It is possible to use not only the microorganism used in the previous fermentation process but also the microorganism used in the previous fermentation process.
  • a fermentation product (a compound derived from a herbaceous plant of the family Gramineae or Cucurbitaceae) such as ethanol is recovered.
  • the method for recovering the fermentation product is not particularly limited, and a known recovery method can be appropriately selected according to the obtained fermentation product.
  • the method for producing a compound derived from a grass family or cucurbitaceae herbaceous plant uses a sugar solution obtained from a grass plant of the family Gramineae or cucurbitaceae as a raw material in repeated batch fermentation.
  • a sugar concentrate obtained by membrane concentration with an RO membrane the fermentation ability of microorganisms can be maintained without newly adding a nitrogen source, and a high-concentration fermentation product can be obtained.
  • the method for producing a herbaceous plant or cucurbitaceae herbaceous plant-derived compound of the second embodiment is the method of the first embodiment, wherein the herbaceous plant or cucurbitaceae herbaceous plant is used as a raw material before the sugar concentrate preparation step
  • the production method further includes a sugar separation step of separating the obtained sugar solution into a sucrose high-concentration sugar solution and a reducing sugar high-concentration sugar solution using an NF membrane.
  • the reducing sugar high-concentration sugar solution obtained in this sugar separation step is used as a sugar solution in the sugar concentrate preparation step, and a sugar concentrate used in the fermentation step is prepared.
  • the sucrose high-concentration sugar solution obtained in the sugar separation step can be used as a raw material for producing sugar. Therefore, the production method of the present embodiment may also include a sugar production step of producing sugar using a sucrose high-concentration sugar solution.
  • FIG. 2 is a flowchart showing an example of the manufacturing method of the present embodiment.
  • the example shown in FIG. 2 is a manufacturing method in which the sugar separation step and the sugar making step are further included in the example of the manufacturing method of the first embodiment shown in FIG. Therefore, since each process other than the sugar separation process and the sugar production process is as described in the first embodiment, only the sugar separation process and the sugar production process will be described here.
  • the sugar separation step is a sugar solution after the pretreatment using the UF membrane is performed on the sorghum juice obtained by pressing the sorghum, and the sugar concentrate preparation step is performed. Is also performed on the previous sugar solution.
  • the sugar solution is separated into a sucrose high-concentration sugar solution and a reducing sugar high-concentration sugar solution using an NF membrane.
  • NF membrane used in the sugar separation step, a membrane having a sucrose blocking performance of at least twice that of glucose is used. That is, in the sugar separation step, an NF membrane that satisfies the following formula (1) is used.
  • sucrose blocking performance / glucose blocking performance ⁇ 2 (1)
  • the sucrose blocking performance of the NF membrane is the removal rate of sucrose when a test solution having a sucrose concentration of 2000 ppm is filtered at 25 ° C. under an operating pressure of 1 MPa.
  • the glucose blocking performance is the glucose removal rate when a test solution having a glucose concentration of 2000 ppm is filtered at 25 ° C. under an operating pressure of 1 MPa.
  • the method of sugar separation using a membrane is not particularly limited, and a known membrane separation method can be used.
  • sugar separation may be repeated a plurality of times in succession.
  • the same type of film may be used at all times, or different types of films may be used at each time.
  • the degree of separation of sucrose and reducing sugar can be increased by performing sugar separation using a membrane multiple times.
  • the concentration of each can be increased.
  • the liquid on the non-permeating side of the membrane can be recovered as a sucrose high-concentration sugar liquid.
  • the liquid that has permeated the membrane is recovered as a reducing sugar high-concentration sugar liquid and used as a sugar liquid to be concentrated in the next sugar concentration preparation step.
  • the sugar concentrate preparation step and the subsequent fermentation step are as described in the first embodiment.
  • the sugar separation step is performed only once, but may be performed a plurality of times.
  • the sugar solution on the non-permeate side of the membrane is collected, the collected sugar solution is diluted with water and permeated through a membrane for sugar separation, and the sugar solution that has permeated the membrane is used as a reducing sugar high-concentration sugar solution. It may be used in the sugar concentration step, and the liquid on the non-permeate side of the membrane may be used in the sugar production step as a high-concentration sucrose sugar solution.
  • the sucrose high-concentration sugar solution obtained in the sugar separation process is used as a raw material for producing sugar in the sugar production process.
  • a known sugar production method can be used except that a sucrose high-concentration sugar solution obtained from the sorghum juice is obtained as a raw material.
  • a sugar solution obtained using a grass plant of the family Gramineae or Cucurbitaceae as a raw material a fermentation raw material for producing a compound derived from the herbaceous plant of the family Gramineae or Cucurbitaceae such as ethanol. It can be used not only as a raw material for sugar production. Therefore, according to the production method of the present embodiment, both a herbaceous plant-derived compound and sugar obtained by fermentation can be produced from a sugar solution obtained using a grass plant of the family Gramineae or Cucurbitaceae as a raw material.
  • the production method of the present embodiment by using a reducing sugar high-concentration sugar liquid obtained in the sugar separation step as a fermentation raw material, compared with the case where the sugar liquid obtained without going through the sugar separation step is used as the fermentation raw material. And the fermentation efficiency in repeated batch fermentation can be improved. As a result, the fermentation rate can be improved, and the production efficiency of the herbaceous plant-derived compound of the grass family or cucurbitaceae can be further increased.
  • the reason why the fermentation efficiency can be improved when the high-concentration reducing sugar solution obtained by the sugar separation step is used as a fermentation raw material is not clear, but the reducing sugar obtained by the sugar separation step in this embodiment is not clear.
  • the high-concentration sugar solution concentrates monosaccharides such as glucose and fructose that are easily decomposed by microorganisms, and also concentrates asparagine, arginine, serine, and valine, which are amino acids suitable for microorganisms, to improve fermentation efficiency. Can be improved.
  • Example 1 [Preparation of sugar concentrate] First, a sorghum juice was prepared.
  • sorghum obtained from Togo Field, Field Science Education and Research Center attached to graduate School of Bioagricultural Sciences, Nagoya University, cultivated variety "SIL-05"
  • SIL-05 a squeezing machine
  • a sorghum juice (a sugar solution made from sorghum) was obtained.
  • the obtained sorghum juice (pH 5.2) contained 62.3 g / L sucrose, 35.9 g / L glucose, and 26.8 g / L fructose.
  • the sorghum juice was filtered through a UF membrane (“RS50” manufactured by Nitto Denko Corporation, fractional molecular weight 150,000 Da) to remove the residue (UF membrane filtration).
  • the sugar concentration (concentration of sucrose, glucose and fructose) of the sorghum juice obtained by removing the residue was the same as before removing the residue.
  • the UF membrane filtration was performed by installing a UF membrane in a batch type flat membrane test cell (“Membrane Master C40-B” manufactured by Nitto Denko Corporation, diameter 104 mm, height 147 mm, maximum capacity 380 mL). Specifically, as shown in FIG.
  • the test cell 21 provided with the UF membrane 25 was installed on the magnetic stirrer 22, and the sorghum juice 23 in the test cell 21 was stirred with a stirrer 24.
  • Filtration was performed at a room temperature of 25 ° C. by applying a pressure of 0.5 MPa into the test cell 21 with nitrogen gas. By this filtration, the residue on the non-permeate side of the UF membrane 25 was removed, and the UF membrane permeate was obtained as a sorghum juice from which the residue was removed.
  • NF membrane concentration fractionated molecular weight 150 Da, “ESNA3” manufactured by Nitto Denko Corporation
  • NF membrane concentration was performed using a batch type flat membrane test cell (“Membrane Master C40-B” manufactured by Nitto Denko Corporation) that was also used in UF membrane filtration. Specifically, as shown in FIG. 3, the test cell 21 in which the NF film 25 is installed is placed on the magnetic stirrer 22, and the sorghum juice 23 from which the residue in the test cell 21 has been removed is used as the stirrer 24. And stirred. The NF membrane concentration was performed at a room temperature of 25 ° C.
  • the sugar concentrate contained 164.4 g / L sucrose, 60.0 g / L glucose, and 54.2 g / L fructose.
  • BY4741 strain of Saccharomyces cerevisiae was prepared. This was pre-cultured in 5 mL of YPD medium (10 g / L yeast extract, 20 g / L polypeptone, 20 g / L glucose) at 30 ° C. and 150 rpm for 24 hours, and then cultured in 500 mL of the same YPD medium for 24 hours. Was recovered and used as BY4741 strain.
  • the yeast BY4741 strain was added to 50 wet-g / L (corresponding to 10 g / L in a dry state) of the sugar concentrate obtained by the above method, and ethanol fermentation was performed at 30 ° C. for 48 hours (first fermentation). Process). Fermentation was performed while rotating the fermentation liquor in a 50 mL bottle (working volume 10 mL) equipped with an exhaust port for releasing CO 2 gas. After ethanol fermentation for 48 hours, the obtained fermentation broth (first fermentation broth) was subjected to solid-liquid separation by centrifugation to remove liquid components. A sugar concentrate (second sugar concentrate) having the same volume as the removed liquid component was added to the obtained solid component, and ethanol fermentation was performed at 30 ° C. for 48 hours (second fermentation step).
  • the 3rd fermentation process, the 4th fermentation process, and the 5th fermentation process were implemented by the same procedure as the 2nd fermentation process. That is, the same yeast was used, and 5 batch fermentations were performed while adding only a sugar concentrate obtained by concentrating a sugar solution obtained using sorghum as a raw material by NF membrane concentration.
  • the sugar concentrates used in the first to fifth fermentation steps were all sugar concentrates prepared by the above method in this example.
  • Example 2 [Preparation of sugar concentrate] A sugar concentrate was prepared in the same manner as in Example 1.
  • Example 2 unlike Example 1, the sugar concentrate obtained by using the sorghum prepared by the above method as a raw material was used for the culture of Saccharomyces cerevisiae BY4741 strain without using YPD medium. That is, in Example 2, yeast culture was performed in parallel with the fermentation process. Specifically, the concentration of yeast BY4741 strain added to the sugar concentrate in the first fermentation step was set to 0.04 wet-g / L lower than that in Example 1, and the number of repeated fermentation steps was 7 times. Except for the points made and the point that the sugar concentrate added when repeating the fermentation process is half the amount of the separated liquid component (the point where only half of the liquid component is replaced with the sugar concentrate) Ethanol fermentation was performed by the same method as ethanol fermentation of 1.
  • Example 2 how much yeast was cultured in the sugar concentrate during the first to seventh fermentation steps, that is, the yeast concentration in the fermentation broth was determined using the turbidity method. Specifically, the fermentation broth was collected and the absorbance at 600 nm was measured with a spectrophotometer (“UVmini-1240” manufactured by Shimadzu Corporation). The results are shown in FIG.
  • the sugar solution used for ethanol fermentation is not a sugar concentrate prepared from the sorghum used in Example 1, but a sugar solution (sucrose 149 g / L, glucose 56 g) containing only sugar (only sucrose, glucose and fructose). / L and fructose 46 g / L), ethanol fermentation was performed in the same manner as in Example 1. Moreover, the measurement of each component density
  • the sugar solution used for ethanol fermentation is not a sugar concentrate prepared from the sorghum used in Example 1, but a sugar solution containing only molasses (sucrose 127 g / L, glucose 75 g / L and fructose 83 g / L).
  • the ethanol fermentation was performed in the same manner as in Example 1 except that was used.
  • concentration in a fermented liquor was performed by the same method as Example 1.
  • FIG. The results are shown in FIGS. 8A and 8B.
  • the yeast maintained high-concentration ethanol production in five repeated batch fermentations, even though only the sugar concentrate to which no nitrogen source was added was used.
  • the ethanol concentration obtained in the fifth ethanol fermentation is 113.7 ⁇ 3.1 g / L, which is the ethanol concentration obtained in the first ethanol fermentation (115.2 ⁇ 7.3 g / L). L).
  • yeast can be cultured with a sugar concentrate obtained using sorghum as a raw material without adding nutrients such as a nitrogen source.
  • the ethanol concentration produced in the first and second ethanol fermentations was low, which is considered to be because the yeast concentration was low due to insufficient yeast culture.
  • high-concentration ethanol was produced by the yeast using only the sugar concentrate as shown in FIG.
  • Example 2 using yeast cultured with a sugar concentrate obtained from sorghum as a raw material, as in Example 1, only a sugar concentrate to which no nitrogen source was added was used. The yeast continued to maintain high-concentration ethanol production in multiple repeated batch fermentations.
  • Comparative Example 1 instead of a sugar concentrate obtained from sorghum as a raw material, a batch fermentation was performed using a sugar solution containing only sugar without adding a nitrogen source, as shown in FIG. In the second fermentation, the ethanol production concentration was very low, and no ethanol was produced in the third and subsequent fermentations. Moreover, in Comparative Example 2, batch fermentation was performed repeatedly using a sugar solution containing molasses without adding a nitrogen source. However, as shown in FIG. It was very low compared to the second ethanol fermentation.
  • a sorghum juice was prepared.
  • sorghum obtained from Togo Field, Field Science Education and Research Center attached to graduate School of Bioagricultural Sciences, Nagoya University, cultivated variety "SIL-05"
  • SIL-05 a squeezing machine
  • a sorghum juice a sugar solution made from sorghum
  • the obtained sorghum juice contained 84.0 g / L sucrose, 26.2 g / L glucose, and 18.0 g / L fructose.
  • the sorghum juice was filtered through a UF membrane (“RS50” manufactured by Nitto Denko Corporation, fractional molecular weight 150,000 Da) to remove the residue (UF membrane filtration).
  • the sugar concentration (concentration of sucrose, glucose and fructose) of the sorghum juice obtained by removing the residue was the same as before removing the residue.
  • the UF membrane filtration was performed by installing a UF membrane in a batch type flat membrane test cell (“Membrane Master C40-B” manufactured by Nitto Denko Corporation, diameter 104 mm, height 147 mm, maximum capacity 380 mL). Specifically, as shown in FIG.
  • the test cell 21 provided with the UF membrane 25 was installed on the magnetic stirrer 22, and the sorghum juice 23 in the test cell 21 was stirred with a stirrer 24.
  • Filtration was performed at a room temperature of 25 ° C. by applying a pressure of 0.5 MPa into the test cell 21 with nitrogen gas. By this filtration, the residue on the non-permeate side of the UF membrane 25 was removed, and the UF membrane permeate was obtained as a sorghum juice from which the residue was removed.
  • NF membrane manufactured by Nitto Denko Corporation
  • sucrose high-concentration sugar solution sucrose high-concentration sugar solution
  • reducing sugar high-concentration sugar solution sucrose separation sugar solution
  • NF membrane a membrane having a sucrose blocking performance / glucose blocking performance value of 2.4 and a molecular weight cut-off of about 1000 Da.
  • Sugar separation was carried out using a batch-type flat membrane test cell (“Membrane Master C40-B” manufactured by Nitto Denko Corporation) that was also used in UF membrane filtration. Specifically, as shown in FIG.
  • the test cell 21 in which the NF film 25 is installed is placed on the magnetic stirrer 22, and the sorghum juice 23 from which the residue in the test cell 21 has been removed is used as the stirrer 24. And stirred.
  • the sugar separation was performed at room temperature of 25 ° C. by applying a pressure of 2.0 MPa in the test cell 21 with nitrogen gas. By this sugar separation, a sugar solution (sucrose high-concentration sugar solution) in which sucrose was concentrated on the non-permeating side of the NF membrane 25 and the concentration of reducing sugars such as glucose and fructose was reduced was obtained.
  • sucrose high-concentration sugar solution was diluted 5-fold, and sugar separation was again performed using a (second) NF membrane (“NTR-7450” manufactured by Nitto Denko Corporation).
  • the second sugar separation is performed in the same manner as the first sugar separation, and the sugar solution in which the concentration of reducing sugars such as glucose and fructose is reduced is obtained on the non-permeating side of the NF membrane 25.
  • the sucrose high-concentration sugar solution obtained as a starting material was used as a raw material for the sugar-making process.
  • the sucrose high-concentration sugar solution finally obtained contained 143.2 g / L sucrose, 8.5 g / L glucose, and 4.5 g / L fructose.
  • the sugar solution that permeated through the NF membrane 25 in the first and second sugar separations was used as a reducing sugar high-concentration sugar solution for preparing a sugar concentrate in the subsequent step.
  • a sugar concentrate was prepared in the same manner as in Example 1 except that the reducing sugar high-concentration sugar liquid obtained in the sugar separation step was used as a raw material for sugar concentration.
  • the resulting sugar concentrate contained 96.3 g / L sucrose, 76.1 g / L glucose, and 55.5 g / L fructose.
  • BY4741 strain of Saccharomyces cerevisiae was prepared. This was pre-cultured in 5 mL of YPD medium (10 g / L yeast extract, 20 g / L polypeptone, 20 g / L glucose) at 30 ° C. and 150 rpm for 24 hours, and then cultured in 500 mL of the same YPD medium for 48 hours. Was recovered and used as BY4741 strain.
  • the yeast BY4741 strain was added to 50 wet-g / L (corresponding to 10 g / L in a dry state) of the sugar concentrate obtained by the above method, and ethanol fermentation was performed at 30 ° C. for 48 hours (first fermentation). Process). Fermentation was performed while rotating the fermentation liquor in a 50 mL bottle (working volume 10 mL) equipped with an exhaust port for releasing CO 2 gas. After the ethanol fermentation for 24 hours, the obtained fermentation broth (first fermentation broth) was subjected to solid-liquid separation by centrifugation to remove liquid components. To the obtained solid component, a sugar concentrate (second sugar concentrate) having the same volume as the removed liquid component was added, and ethanol fermentation was performed at 30 ° C. for 24 hours (second fermentation step).
  • the 3rd fermentation process, the 4th fermentation process, and the 5th fermentation process were implemented by the same procedure as the 2nd fermentation process. That is, while adding only a sugar concentrate obtained by concentrating a reducing sugar high-concentration sugar solution obtained by subjecting a sugar solution obtained from sorghum as a raw material to a sugar separation step using the same yeast, Repeated batch fermentation was performed.
  • the sugar concentrates used in the first to fifth fermentation steps were all sugar concentrates prepared by the above method in this example.
  • Example 3 in which the sugar separation step was performed, the time for each fermentation step was 24 hours. Despite being half the time (48 hours) of each fermentation process, ethanol having a concentration similar to that of Example 1 was obtained in each fermentation process. From this result, when the reducing sugar high-concentration sugar liquid obtained by the sugar separation process is used as a fermentation raw material, repeated batches are compared with the case where the sugar liquid obtained without going through the sugar separation process is used as a fermentation raw material. It can be seen that fermentation efficiency is improved by improving fermentation efficiency in fermentation.
  • a herbaceous or cucurbitaceae herbaceous plant-derived compound such as ethanol can be efficiently and simply produced by repeated batch fermentation. Therefore, this invention can be utilized for the wide use which converts the sugar liquid obtained by using the grass plant of the Gramineae or Cucurbitaceae to a chemical by fermentation.

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Abstract

本発明の製造方法は、イネ科又はウリ科の草本植物を原料として得られた糖液をナノろ過膜及び／又は逆浸透膜で濃縮して得られた第１糖濃縮液に、酵母、大腸菌及びコリネバクテリウム属細菌から選ばれる少なくともいずれか１種の微生物を添加して第１糖濃縮液を発酵させ、得られた第１発酵液を固液分離する第１発酵工程と、第１発酵工程で得られた固体成分に、イネ科又はウリ科の草本植物を原料として得られた糖液をナノろ過膜及び／又は逆浸透膜で濃縮して得られた第２糖濃縮液を添加し、第１発酵工程で用いられた微生物を用いて第２糖濃縮液を発酵させて、得られた第２発酵液を固液分離する第２発酵工程を含み、前記第１発酵工程及び前記第２発酵工程から選ばれる少なくともいずれか１つの発酵工程で得られた液体成分から、イネ科又はウリ科の草本植物由来化合物を得る。

Description

イネ科又はウリ科の草本植物由来化合物の製造方法
　本発明は、イネ科又はウリ科の草本植物由来化合物の製造方法に関する。
　ソルガム等のイネ科の草本植物や、スイカ等のウリ科の草本植物には、高濃度の糖が含まれている。例えばソルガムは、生育期間が短いことや、乾燥や塩害に強く栽培適用範囲が広いことから、その収穫量も多い。したがって、近年、発酵による、イネ科又はウリ科の草本植物の搾汁液からのバイオエタノールの製造が注目されており、様々な技術が提案されている。
　例えば、非特許文献１には、ソルガム搾汁液から高濃度にエタノールを製造することによって、エタノール製造プロセスにおける蒸留・脱水のエネルギー消費を抑えるために、ソルガム搾汁液に糖（スクロース）をさらに添加して、発酵に用いられる糖液の初期濃度を高めることが提案されている。また、非特許文献２には、ソルガム搾汁液を２段階の膜分離工程によって濃縮することによって、発酵に用いられる糖液の初期濃度を高めることが提案されている。
　また、非特許文献３には、トウモロコシの穂軸に固定化された酵母による繰り返し回分発酵によって、ソルガム搾汁液からエタノールを製造する方法が提案されている。非特許文献３で提案されている方法では、回分発酵を繰り返す毎に、酵母エキスやペプトン等の窒素源や糖（スクロース）等の発酵に必要な栄養源がさらに添加された新たなソルガム搾汁液が用いられる。
Ｌ．　Ｌａｏｐａｉｂｏｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，　"Ｅｔｈａｎｏｌ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ　ｓｗｅｅｔ　ｓｏｒｇｈｕｍ　ｊｕｉｃｅ　ｕｓｉｎｇ　ｖｅｒｙ　ｈｉｇｈ　ｇｒａｖｉｔｙ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｃａｒｂｏｎ　ａｎｄ　ｎｉｔｒｏｇｅｎ　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎｓ"，　Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１００　（２００９），　４１７６－４１８２ Ｋ．　Ｓａｓａｋｉ　ｅｔ　ａｌ．，　"Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｅｔｈａｎｏｌ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ　ｓｗｅｅｔ　ｓｏｒｇｈｕｍ　ｊｕｉｃｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ　ｂｙ　ａ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｐｒｏｃｅｓｓ"，　Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１６９　（２０１４），　８２１－８２５ Ｌ．　Ｌａｏｐａｉｂｏｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，　"Ｅｔｈａｎｏｌ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ　ｓｗｅｅｔ　ｓｏｒｇｈｕｍ　ｊｕｉｃｅ　ｉｎ　ｒｅｐｅａｔｅｄ－ｂａｔｃｈ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｂｙ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ　ｏｎ　ｃｏｒｎｃｏｂ"，　Ｗｏｒｌｄ　Ｊ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　（２０１２）　２８，　５５９－５６６
　上記のように、従来、発酵によってソルガム等の草本植物の搾汁液からエタノールを製造する様々な方法が提案されている。しかし、ソルガム等の草本植物の搾汁液から高濃度エタノールを製造する従来の方法については、高濃度エタノールをより効率良く、且つより簡便な方法で製造するという観点から、更なる改善の余地があった。
　そこで、本発明は、イネ科又はウリ科の草本植物を原料として得られた糖液を発酵原料として用いて、発酵により、エタノール等のイネ科又はウリ科の草本植物由来化合物をより効率良く、且つより簡便に製造できる方法を提供することを目的とする。
　本発明の第１の態様は、
　イネ科又はウリ科の草本植物を原料として得られた糖液をナノろ過膜及び逆浸透膜の少なくともいずれか１種の膜で濃縮して得られた第１糖濃縮液に、酵母、大腸菌及びコリネバクテリウム属細菌から選ばれる少なくともいずれか１種の微生物を添加して前記第１糖濃縮液を発酵させて、得られた第１発酵液を固体成分と液体成分とに固液分離する第１発酵工程と、
　前記第１発酵工程で得られた前記固体成分に、イネ科又はウリ科の草本植物を原料として得られた糖液をナノろ過膜及び逆浸透膜の少なくともいずれか１種の膜で濃縮して得られた第２糖濃縮液を添加して、前記第１発酵工程で用いられた前記微生物を用いて前記第２糖濃縮液を発酵させて、得られた第２発酵液を固体成分と液体成分とに固液分離する第２発酵工程と、
を含み、
　前記第１発酵工程及び前記第２発酵工程から選ばれる少なくともいずれか１つの発酵工程で得られた液体成分から、イネ科又はウリ科の草本植物由来化合物を得る、
イネ科又はウリ科の草本植物由来化合物の製造方法を提供する。
　本発明の第２の態様は、
　イネ科又はウリ科の草本植物を原料として得られた糖液をナノろ過膜及び逆浸透膜の少なくともいずれか１種の膜で濃縮して得られた第１糖濃縮液に、酵母、大腸菌及びコリネバクテリウム属細菌から選ばれる少なくともいずれか１種の微生物を添加して前記第１糖濃縮液を発酵させて、得られた第１発酵液を固体成分と液体成分とに固液分離する第１発酵工程と、
　前記第１発酵工程で得られた前記固体成分に、イネ科又はウリ科の草本植物を原料として得られた糖液をナノろ過膜及び逆浸透膜の少なくともいずれか１種の膜で濃縮して得られた第２糖濃縮液を添加して、前記第１発酵工程で用いられた前記微生物を用いて前記第２糖濃縮液を発酵させて、得られた第２発酵液を固体成分と液体成分とに固液分離する第２発酵工程と、
　前記第２発酵工程の後に実施される第３～第Ｎ発酵工程（Ｎは、３以上の整数である。）と、
を含み、
　前記第２～前記第Ｎ発酵工程に含まれる第Ｌ発酵工程（Ｌは、２≦Ｌ≦Ｎを満たす整数である。）では、前記第１～第Ｌ－１発酵工程のいずれかの発酵工程で得られた発酵液を固液分離して得られた固体成分に、イネ科又はウリ科の草本植物を原料として得られた糖液をナノろ過膜及び逆浸透膜の少なくともいずれか１種の膜で濃縮して得られた第Ｌ糖濃縮液を添加して、前記第１～前記第Ｌ－１発酵工程のいずれかの前記発酵工程で用いられた前記微生物を用いて前記第Ｌ糖濃縮液を発酵させて、得られた第Ｌ発酵液を固体成分と液体成分とに固液分離し、
　前記第１～前記第Ｎ発酵工程から選ばれる少なくともいずれか１つの発酵工程で得られた液体成分から、イネ科又はウリ科の草本植物由来化合物を得る、
イネ科又はウリ科の草本植物由来化合物の製造方法を提供する。
　本発明の第１の態様に係る製造方法は、少なくとも第１発酵工程及び第２発酵工程を含む、繰り返し回分発酵によりイネ科又はウリ科の草本植物由来化合物を製造する方法である。本発明の第１の態様に係る製造方法は、イネ科又はウリ科の草本植物を原料として得られた糖液を特定の膜で濃縮することによって得られた糖濃縮液を、第１発酵工程及び第２発酵工程において発酵原料として使用することにより、第２発酵工程において第１発酵工程で用いた微生物を繰り返し使用するにも関わらず、窒素源等の栄養源や新たな微生物をさらに添加しなくても発酵が進んでイネ科又はウリ科の草本植物由来化合物を製造することができる。また、発酵工程が３回以上実施される本発明の第２の態様に係る製造方法においても、イネ科又はウリ科の草本植物を原料として得られた糖液を特定の膜で濃縮することによって得られた糖濃縮液を発酵原料として使用することにより、本発明の第１の態様に係る製造方法と同様に、窒素源等の栄養源や新たな微生物をさらに添加しなくても、微生物を繰り返し使用してイネ科又はウリ科の草本植物由来化合物を製造することができる。このように、本発明の第１及び第２の態様に係る製造方法は、発酵のための微生物を繰り返し使用でき、さらに窒素源等の栄養源や新たな微生物をさらに添加しなくてもよいため、従来の方法と比較して、より効率良く、且つより簡便にイネ科又はウリ科の草本植物由来化合物を製造できる。
本発明のイネ科又はウリ科の草本植物由来化合物の製造方法の第１実施形態であるソルガム由来化合物の製造方法について、その概略を示すフロー図である。 本発明のイネ科又はウリ科の草本植物由来化合物の製造方法の第２実施形態であるソルガム由来化合物の製造方法について、その概略を示すフロー図である。 実施例及び比較例で実施した膜濃縮に用いられた装置を示す概略図である。 実施例１の発酵液中のエタノール及びグリセロールの濃度を示すグラフである。 実施例１の発酵液中のスクロース、グルコース及びフルクトースの濃度を示すグラフである。 実施例２の発酵液中のスクロース、グルコース、フルクトース、エタノール及びグリセロールの濃度を示すグラフである。 実施例２の発酵液中の酵母濃度を濁度法によって求めた結果を示すグラフである。 比較例１の発酵液中のエタノール及びグリセロールの濃度を示すグラフである。 比較例１の発酵液中のスクロース、グルコース及びフルクトースの濃度を示すグラフである。 比較例２の発酵液中のエタノール及びグリセロールの濃度を示すグラフである。 比較例２の発酵液中のスクロース、グルコース及びフルクトースの濃度を示すグラフである。 実施例３の発酵液中のエタノール及びグリセロールの濃度を示すグラフである。 実施例３の発酵液中のスクロース、グルコース及びフルクトースの濃度を示すグラフである。
　以下、本発明の実施形態について説明する。なお、以下の記載は本発明を限定するものではない。
　（第１実施形態）
　第１実施形態のイネ科又はウリ科の草本植物由来化合物の製造方法は、
　イネ科又はウリ科の草本植物を原料として得られた糖液をナノろ過膜（ＮＦ膜）及び逆浸透膜（ＲＯ膜）の少なくともいずれか１種の膜で濃縮して得られた第１糖濃縮液に、酵母、大腸菌及びコリネバクテリウム属細菌から選ばれる少なくともいずれか１種の微生物を添加して前記第１糖濃縮液を発酵させて、得られた第１発酵液を固体成分と液体成分とに固液分離する第１発酵工程と、
　前記第１発酵工程で得られた第１発酵液を固液分離し、得られた固体成分に、イネ科又はウリ科の草本植物を原料として得られた糖液をＮＦ膜及びＲＯ膜の少なくともいずれか１種の膜で濃縮して得られた第２糖濃縮液を添加して、前記第１発酵工程で用いられた前記微生物を用いて前記第２糖濃縮液を発酵させて、得られた第２発酵液を固体成分と液体成分とに固液分離する第２発酵工程と、
を含み、前記第１発酵工程及び前記第２発酵工程から選ばれる少なくともいずれか１つの発酵工程で得られた液体成分から、イネ科又はウリ科の草本植物由来化合物を得る。
　本実施形態の製造方法は、少なくとも第１発酵工程及び第２発酵工程を含む、繰り返し回分発酵によりイネ科又はウリ科の草本植物由来化合物を製造する方法である。本実施形態の製造方法では、イネ科又はウリ科の草本植物を原料として得られた糖液を、特定の膜（ＮＦ膜及びＲＯ膜の少なくともいずれか１種の膜）で濃縮することによって得られた糖濃縮液が発酵原料として使用される。この糖濃縮液は、微生物の培養に必要な窒素源等の栄養源を添加しなくても、微生物の培養が可能な液である。本実施形態の製造方法は、この糖濃縮液を発酵原料として使用するので、第２発酵工程において第１発酵工程で用いた微生物を繰り返し使用するにも関わらず、窒素源等の栄養源をさらに添加しなくても発酵が進んで、イネ科又はウリ科の草本植物由来化合物を製造することができる。また、この糖濃縮液を使用することにより、発酵と並行して微生物の培養も進むので、第２発酵工程で新たな微生物を追加する必要もなくなる。なお、この糖濃縮液に窒素源を添加しなくても微生物の培養が可能な理由は明らかではないが、イネ科又はウリ科の草本植物を原料として得られた糖液を上記の特定の膜で濃縮することにより、糖だけでなくアミノ酸等の微生物の培養に必要な栄養源も十分に濃縮されるので、新たに窒素源等を添加しなくても微生物の培養が可能となるのではないかと考えられる。
　一方、繰り返し回分発酵によってエタノール等の植物由来化合物を製造する従来の方法は、本実施形態の製造方法とは異なり、さとうきび等から得られる一般的な糖液や、非特許文献３で提案されているようなソルガム搾汁液を、上記の特定の膜で濃縮することなくそのまま使用している。従来の製造方法で用いられているこれらの糖液は、栄養源が添加されない場合に微生物の培養を行うことは困難である。したがって、従来の繰り返し回分発酵を利用した製造方法では、発酵を繰り返す際に、窒素源等の栄養源の添加や、新たな微生物の添加が必要となる。
　以上のとおり、本実施形態の製造方法は、発酵のための微生物を繰り返し使用でき、さらに窒素源等の栄養源や新たな微生物をさらに添加しなくてもよいため、従来の方法と比較して、より効率良く、且つより簡便にイネ科又はウリ科の草本植物由来化合物を製造できる。
　なお、本実施形態の製造方法では、上記した栄養源や微生物の新たな添加を一切排除するものではない。イネ科又はウリ科の草本植物由来化合物を更により効率良く、あるいは更により簡便に製造できるようにするために、栄養源や新たな微生物を添加することも可能である。
　本実施形態のイネ科又はウリ科の草本植物由来化合物の製造方法では、発酵工程が３回以上実施されてもよい。すなわち、本実施形態のイネ科又はウリ科の草本植物由来化合物の製造方法は、第２発酵工程の後に実施される第３～第Ｎ発酵工程（Ｎは、３以上の整数である。）をさらに含んでいてもよい。その場合、第２～第Ｎ発酵工程に含まれる第Ｌ発酵工程（Ｌは、２≦Ｌ≦Ｎを満たす整数である。）では、第１～第Ｌ－１発酵工程のいずれかの発酵工程で得られた発酵液を固液分離して得られた固体成分に、イネ科又はウリ科の草本植物を原料として得られた糖液をナノろ過膜及び逆浸透膜の少なくともいずれか１種の膜で濃縮して得られた第Ｌ糖濃縮液を添加して、第１～第Ｌ－１発酵工程のいずれかの発酵工程で用いられた微生物を用いて第Ｌ糖濃縮液を発酵させて、得られた第Ｌ発酵液を固体成分と液体成分とに固液分離する。発酵工程が３回以上実施される場合は、第１発酵工程及び第２発酵工程から選ばれる少なくともいずれか１つの発酵工程で得られた液体成分に代えて、第１～第Ｎ発酵工程から選ばれる少なくともいずれか１つの発酵工程で得られた液体成分から、イネ科又はウリ科の草本植物由来化合物を得るとよい。発酵工程が３回以上実施される場合、製造方法の効率化及び簡便化のために、各発酵工程では１回前の発酵工程で用いられた微生物を用いて発酵処理することが望ましい。すなわち、第Ｌ発酵工程では、第Ｌ－１発酵工程で得られた固体成分に第Ｌ糖濃縮液を添加して、第Ｌ－１発酵工程で用いられた微生物を用いて第Ｌ糖濃縮液を発酵させることが望ましい。
　イネ科の草本植物としては、例えばソルガムが例示される。ソルガムは、生育期間が短いことや、乾燥や塩害に強く栽培適用範囲が広いことからその収穫量も多く、バイオマスとして好適である。ここで、ソルガムとはイネ科の一年草であり、様々な種類が存在する。本実施形態の製造方法において、ソルガムを原料として得られる糖液を用いる場合は、ホワイトソルガム等の糖含有量が多い種類のソルガムが好適に用いられる。また、ウリ科の草本植物としては、例えばスイカが例示される。
　また、イネ科又はウリ科の草本植物由来化合物とは、イネ科又はウリ科の草本植物を原料として製造される糖液を発酵原料とし、これを発酵処理して得られる全ての化合物を意味しており、例えば、エタノール及びブタノール等のアルコール、バイオプラスチック原料である乳酸、及び、コハク酸等が挙げられる。
　以下、図１のフロー図を参照しながら、本実施形態の製造方法の一例について説明する。なお、以下で説明するのは、糖液の原料としてソルガムを用い、かつ発酵工程を３回以上繰り返す例、すなわち第１～第Ｎ発酵工程を実施する例である。しかし、本発明の製造方法は、以下の例に限定されるものではなく、ソルガムの代わりに他のイネ科又はウリ科の草本植物を用いてもよいし、発酵工程の繰り返し回数を２回としてもよい。
　まず、ソルガムを原料として得られる糖液を準備する。ソルガムを原料として得られる糖液とは、例えばソルガムを圧搾することによって得られたソルガム搾汁液等であり、ソルガムを原料としている公知の糖液を利用可能である。
　例えば、ソルガムを圧搾することによって得られたソルガム搾汁液には、ソルガムの搾りかすやゴミ等が含まれていることも多い。したがって、ソルガムを原料として得られた糖液を限外ろ過膜（ＵＦ膜）に透過させてろ過し、ＵＦ膜上の残渣を取り除いて前処理することが望ましい。図１のフロー図では、前処理を実施する例が示されている。なお、ＵＦ膜とは、平均細孔径が０．００１μｍ～０．０１μｍ程度である膜のことである。
　ＵＦ膜の材質は、特には限定されず、例えば酢酸セルロース等のセルロースエステル系ポリマー、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスルフォン、ポリフッ化ビニリデン、ポリエーテルスルホン等の高分子材料を使用できる。耐久性や洗浄性の観点からポリフッ化ビニリデンやポリエーテルスルホンが好ましい。
　ＵＦ膜の形状は、特には限定されず、平膜状、中空糸膜状、プリーツ膜状及びチュプラー膜状等から選択して使用することができる。特に、平膜を封筒状に加工し、当該膜をネット等の支持体と共に渦巻状に巻いて作られる、いわゆるスパイラル型エレメント膜が、膜面積を大きくできるため好ましい。
　ＵＦ膜を用いて糖液をろ過する方法は、特には限定されず、公知のＵＦ膜によるろ過方法を用いることができる。
　次に、糖濃縮液準備工程が実施される。糖濃縮液準備工程では、ソルガムを原料として得られた糖液をＮＦ膜及びＲＯ膜の少なくともいずれか１種の膜で濃縮して、糖濃縮液を準備する。なお、膜による糖液の濃縮とは、糖液をＮＦ膜及びＲＯ膜の少なくともいずれか１種の膜に透過させて、非透過側の液を回収することにより実施できる。糖よりも低分子の物質は膜を透過するので、非透過側の液は糖が精製濃縮された溶液となる。
　なお、糖濃縮液準備工程で準備された糖濃縮液は、後述の第１～第Ｎ発酵工程で用いられる第１～第Ｎ糖濃縮液に用いることができる。なお、第１～第Ｎ糖濃縮液として用いられる糖濃縮液の全てを本工程で予め準備してよい。すなわち、図１のフロー図に示されているように、本工程で得られた糖濃縮液の一部が、第１～第Ｎ糖濃縮液として用いられてもよい。また、各発酵工程で、糖濃縮液をそれぞれ準備することも可能である。
　ここで、ＲＯ膜とは、操作圧力０．５～３．０ＭＰａで塩化ナトリウム濃度５００～２，０００ｍｇ／Ｌの試験液をろ過した時の塩化ナトリウム除去率が９３％以上である膜のことである。
　ＮＦ膜は、一般的にＲＯ膜よりも阻止性能が低く、２価のイオン類を除去する性能に優れるという特性を持っているが、有機物や脱色などにも使われる半透膜である。ここで、ＮＦ膜とは、操作圧力０．３～１．５ＭＰａで塩化ナトリウム濃度５００～２，０００ｍｇ／Ｌの試験液をろ過した時の塩化ナトリウム除去率が５％以上９３％未満である膜のことである。
　ＮＦ膜及びＲＯ膜の材質は、特には限定されず、例えば酢酸セルロース等のセルロースエステル系ポリマー、ポリアミド、ポリエステル、ポリイミド、ビニルポリマー、ポリエーテルスルホン、スルホン化ポリエーテルスルホン、ポリアミド等の高分子材料を使用できる。複数の材料が使用されてもよい。これらの中でも、高い阻止性能の実績があることから、ＲＯ膜には例えばポリアミドが好適に用いられる。また、ＮＦ膜には、ポリアミドやポリエーテルスルホン、ポリビニルアルコールやそれらの混合物などが好適に用いられる。
　ＮＦ膜及びＲＯ膜の形状は、特には限定されず、平膜状、中空糸膜状、プリーツ膜状及びチューブラー膜状等から選択して使用することができる。特に、平膜を封筒状に加工し、当該膜をネット等の支持体と共に渦巻状に巻いて作られる、いわゆるスパイラル型エレメント膜が、膜面積を大きくできるため好ましい。
　ＮＦ膜及び／又はＲＯ膜を用いた膜濃縮の方法は、特には限定されず、公知の膜濃縮方法を用いることができる。例えば、膜濃縮を連続して複数回繰り返してもよい。その場合、全ての回で同じ種類の膜を用いてもよいし、各回で異なる種類の膜を用いてもよい。膜濃縮を複数回行うことにより、最終的に得られる糖濃縮液の濃度を上げることができる。したがって、ＮＦ膜及び／又はＲＯ膜による膜濃縮は、糖濃度が所望の濃度になるまで複数回繰り返して実施されてよい。最終的に得られる糖濃縮液の望ましい糖濃度は、例えば２３０ｇ／Ｌ以上である。
　次に、第１発酵工程を実施する。第１発酵工程では、ソルガムを原料として得られた糖液をＮＦ膜及びＲＯ膜の少なくともいずれか１種の膜で濃縮して得られた第１糖濃縮液に、酵母、大腸菌及びコリネバクテリウム属細菌から選ばれる少なくともいずれか１種の微生物を添加して、前記第１糖濃縮液を発酵させる。前述のとおり、第１糖濃縮液には、糖濃縮液準備工程で準備された糖濃縮液を用いることができる。
　第１糖濃縮液を発酵原料とする発酵方法には、公知の方法を使用できる。発酵に使用される微生物は、酵母、大腸菌及びコリネバクテリウム属細菌から選ばれる少なくともいずれか１種の、公知の微生物を使用できる。使用される微生物は、自然環境から単離されたものでもよく、また、突然変異や遺伝子組み換えによって一部性質が改変されたものであってもよい。発酵に用いられる微生物を、十分な濃度となるまで、予めＹＰＤ培地等の公知の培地を用いて培養してもよい。また、発酵に用いられる微生物は、本実施形態で準備されたソルガムから作製された糖濃縮液を用いて培養することも可能である。例えば、本実施形態の製造方法が、第１発酵工程で用いられる微生物を培養する培養工程を含んでいてもよく、この培養工程において用いられる培養液として、本実施形態において特定されている糖濃縮液（イネ科又はウリ科の草本植物を原料として得られた糖液をＮＦ膜及びＲＯ膜の少なくともいずれか１種の膜で濃縮して得られた糖濃縮液）を使用することができる。なお、この培養工程は、第１発酵工程よりも前に実施されてもよいし、第１発酵工程における発酵と同時に実施される、すなわち第１発酵工程が培養工程を兼ねていてもよい。この糖濃縮液を微生物の培養に用いる場合、窒素源等の微生物の培養に必要な栄養源をさらに添加しなくても、培養が可能である。この糖濃縮液に窒素源を添加しなくても微生物の培養が可能な理由は明らかではないが、ソルガムを原料として得られた糖液をＮＦ膜及び／又はＲＯ膜で濃縮することにより、糖だけでなくアミノ酸等の微生物の培養に必要な栄養源も十分に濃縮されるので、新たに窒素源等を添加しなくても微生物の培養が可能となるのではないかと考えられる。
　第１発酵工程において得られた第１発酵液は、固体成分と液体成分とに固液分離される。固液分離の方法は、特には限定されず、遠心分離等の発酵液を固液分離する公知の方法を用いることができる。
　次に、第２発酵工程が実施される。第１発酵工程で得られた固体成分に、ソルガムを原料として得られた糖液をＮＦ膜及びＲＯ膜の少なくともいずれか１種の膜で濃縮して得られた第２糖濃縮液を添加して、第２糖濃縮液を発酵させる。ここで、第１発酵工程で得られた固体成分は微生物を含んでいる。このため、第１発酵工程で用いられた微生物が、第２糖濃縮液の発酵に用いられる。前述のとおり、第２糖濃縮液には、糖濃縮液準備工程で準備された糖濃縮液を用いることができる。なお、固体成分に第２糖濃縮液を添加する際に、窒素源をさらに添加しなくても、微生物の発酵能力は維持される。したがって、第２発酵工程において、固体成分に新たに窒素源が添加されなくてもよく、発酵のために第２糖濃縮液のみ添加されてもよい。また、第２発酵工程では、新たな微生物を添加しなくても十分な発酵を行うことが可能であるが、新たな微生物を追加することも可能である。
　第２発酵工程において得られた第２発酵液は、固体成分と液体成分とに固液分離される。固液分離の方法は、特には限定されず、遠心分離等の発酵液を固液分離する公知の方法を用いることができる。
　次に、第３発酵工程が実施される。第２発酵工程で得られた固体成分に、ソルガムを原料として得られた糖液をＮＦ膜及びＲＯ膜の少なくともいずれか１種の膜で濃縮して得られた第３糖濃縮液を添加して、第３糖濃縮液を発酵させる。すなわち、第２発酵工程で用いられた微生物が、第３糖濃縮液の発酵に用いられる。前述のとおり、第３糖濃縮液には、糖濃縮液準備工程で準備された糖濃縮液を用いることができる。なお、固体成分に第３糖濃縮液を添加する際に、窒素源をさらに添加しなくても、微生物の発酵能力は維持される。したがって、第３発酵工程において、固体成分に新たに窒素源が添加されなくてもよく、発酵のために第３糖濃縮液のみ添加されてもよい。
　第３発酵工程において得られた第３発酵液は、固体成分と液体成分とに固液分離される。固液分離の方法は、特には限定されず、遠心分離等の発酵液を固液分離する公知の方法を用いることができる。
　引き続き、第３発酵工程と同様の手順で、第Ｎ発酵工程まで実施されてもよい。なお、ここで説明した例では、ある発酵工程では、その１回前の発酵工程において得られた発酵液を固液分離して得られた固形成分（微生物）を用いて発酵処理を実施しているが、前述のとおり、必ずしもこれに限定されない。１回前の発酵工程で用いた微生物のみでなく、それ以前の発酵工程で用いた微生物を用いることも可能である。
　各発酵工程における固液分離で得られた液体成分からは、エタノール等の発酵産物（イネ科又はウリ科の草本植物由来化合物）が回収される。発酵産物の回収方法は、特には限定されず、得られた発酵産物に応じて公知の回収方法を適宜選択することができる。
　以上のように、本実施形態のイネ科又はウリ科の草本植物由来化合物の製造方法は、繰り返し回分発酵において、イネ科又はウリ科の草本植物を原料として得られた糖液をＮＦ膜及び／又はＲＯ膜で膜濃縮して得られた糖濃縮液を用いることにより、新たに窒素源を添加しなくても微生物の発酵能力を維持させて、高濃度の発酵産物を得ることができる。
　（第２実施形態）
　第２実施形態のイネ科又はウリ科の草本植物由来化合物の製造方法は、第１実施形態の製造方法において、糖濃縮液準備工程よりも前に、イネ科又はウリ科の草本植物を原料として得られた糖液を、ＮＦ膜を用いて、スクロース高濃度糖液と還元糖高濃度糖液とに分離する糖分離工程をさらに含む製造方法である。この糖分離工程で得られた還元糖高濃度糖液が、糖濃縮液準備工程における糖液として用いられ、発酵工程で用いられる糖濃縮液が準備される。一方、糖分離工程で得られたスクロース高濃度糖液は、砂糖を製造する原料として用いることができる。したがって、本実施形態の製造方法は、スクロース高濃度糖液を用いて砂糖を製造する製糖工程も含んでいてもよい。
　図２は、本実施形態の製造方法の一例を示すフロー図である。図２に示す例は、図１に示された第１実施形態の製造方法の一例に、上記の糖分離工程及び製糖工程がさらに含まれた製造方法である。したがって、糖分離工程及び製糖工程以外の各工程は、第１実施形態で説明したとおりであるため、ここでは糖分離工程及び製糖工程についてのみ説明する。
　糖分離工程は、ソルガムを圧搾することによって得られたソルガム搾汁液に対してＵＦ膜を用いた前処理が施された後の糖液であって、かつ糖濃縮液準備工程が施されるよりも前の糖液に対して実施される。糖分離工程では、ＮＦ膜を用いて、糖液をスクロース高濃度糖液と還元糖高濃度糖液とに分離する。糖分離工程で用いられるＮＦ膜には、スクロースの阻止性能がグルコースの阻止性能の２倍以上である膜が用いられる。すなわち、糖分離工程では以下の式（１）を満たすＮＦ膜が用いられる。
　　スクロースの阻止性能／グルコースの阻止性能≧２　　　…（１）
　ここで、ＮＦ膜のスクロースの阻止性能とは、操作圧力１ＭＰａでスクロース濃度２０００ｐｐｍの試験液を２５℃の条件下でろ過した時のスクロースの除去率のことである。また、グルコース阻止性能とは、操作圧力１ＭＰａでグルコース濃度２０００ｐｐｍの試験液を２５℃の条件下でろ過した時のグルコースの除去率のことである。
　膜を用いた糖分離の方法は、特には限定されず、公知の膜分離方法を用いることができる。例えば、糖分離を連続して複数回繰り返してもよい。その場合、全ての回で同じ種類の膜を用いてもよいし、各回で異なる種類の膜を用いてもよい。膜を用いた糖分離を複数回行うことによりスクロースと還元糖との分離の程度を高くできるので、その結果、スクロース高濃度糖液におけるスクロースの濃度、及び、還元糖高濃度糖液における還元糖の濃度を、それぞれ高めることができる。
　糖分離工程では、還元糖は膜を透過することができるが、スクロースは膜を透過できずに膜の非透過側に残りやすい。したがって、膜の非透過側の液をスクロース高濃度糖液として回収することができる。膜を透過した液は還元糖高濃度糖液として回収され、次の糖濃縮準備工程において濃縮される糖液として用いられる。糖濃縮液準備工程及びその後の発酵工程は、第１実施形態で説明したとおりである。
　図２に示されたフロー図においては、糖分離工程は１回のみ実施されているが、複数回実施されてもよい。例えば、膜の非透過側の糖液を回収し、回収された糖液を水で希釈してさらに糖分離用の膜に透過させて、膜を透過した糖液を還元糖高濃度糖液として糖濃縮工程で用い、膜の非透過側の液をスクロース高濃度糖液として製糖工程で用いてもよい。
　糖分離工程で得られたスクロース高濃度糖液は、製糖工程において砂糖を製造する際の原料として用いられる。製糖工程における製糖方法には、ソルガム搾汁液から上記の工程によって得られたスクロース高濃度糖液を原料として用いる点を除き、公知の製糖方法を利用できる。
　本実施形態の製造方法によれば、イネ科又はウリ科の草本植物を原料として得られた糖液を、エタノール等のイネ科又はウリ科の草本植物由来化合物を発酵により製造するための発酵原料としてだけでなく、製糖原料としても用いることが可能となる。したがって、本実施形態の製造方法によれば、イネ科又はウリ科の草本植物を原料として得られた糖液から、発酵により得られる草本植物由来化合物と砂糖との両方を製造できる。
　さらに、本実施形態の製造方法では、糖分離工程によって得られる還元糖高濃度糖液を発酵原料として用いることにより、糖分離工程を経ずに得られた糖液を発酵原料に用いる場合と比較して、繰り返し回分発酵での発酵効率を向上させることができる。その結果、発酵速度が向上し、イネ科又はウリ科の草本植物由来化合物の製造効率をより高めることができる。なお、糖分離工程によって得られた還元糖高濃度糖液を発酵原料として用いた場合に発酵効率を向上させることができる理由は明らかではないが、本実施形態における糖分離工程によって得られる還元糖高濃度糖液では、微生物が分解しやすいグルコース及びフルクトース等の単糖が濃縮されていること、さらに微生物にとって好適なアミノ酸であるアスパラギン、アルギニン、セリン、バリンが濃縮されていることにより、発酵効率を向上させることができると考えられる。
　次に、本発明のイネ科又はウリ科の草本植物化合物の製造方法について、実施例を用いて具体的に説明する。
　（実施例１）
［糖濃縮液の準備］
　まず、ソルガム搾汁液を準備した。本実施例では、ソルガム（名古屋大学大学院生命農学研究科付属フィールド科学教育研究センター東郷フィールドより入手、栽培品種「ＳＩＬ－０５」）を搾汁機（有限会社奥原鉄工製）を用いて圧搾することによって、ソルガム搾汁液（ソルガムを原料とする糖液）を得た。得られたソルガム搾汁液（ｐＨ５．２）には、６２．３ｇ／Ｌのスクロース、３５．９ｇ／Ｌのグルコース、２６．８ｇ／Ｌのフルクトースが含まれていた。
　次に、ソルガム搾汁液をＵＦ膜（日東電工社株式会社製「ＲＳ５０」、分画分子量１５００００Ｄａ）でろ過して、残渣を取り除いた（ＵＦ膜ろ過）。残渣を取り除いて得られたソルガム搾汁液の糖濃度（スクロース、グルコース及びフルクトースの濃度）は、残渣を取り除く前と同じであった。ＵＦ膜ろ過は、バッチ式平膜テストセル（日東電工株式会社製「メンブレンマスター　Ｃ４０－Ｂ」、直径１０４ｍｍ、高さ１４７ｍｍ、最大容量３８０ｍＬ）にＵＦ膜を設置して実施された。具体的には、図３に示すように、ＵＦ膜２５を設置したテストセル２１をマグネチックスターラー２２上に設置して、テストセル２１中のソルガム搾汁液２３を攪拌子２４で攪拌した。ろ過は、窒素ガスによりテストセル２１内に０．５ＭＰａの圧力を掛けて、室温２５℃で行った。このろ過により、ＵＦ膜２５の非透過側の残渣を取り除いて、ＵＦ膜透過液を残渣が取り除かれたソルガム搾汁液として得た。
　次に、残渣が取り除かれたソルガム搾汁液を、ＮＦ膜（分画分子量１５０Ｄａ、日東電工株式会社製「ＥＳＮＡ３」）を用いて濃縮した（ＮＦ膜濃縮）。ＮＦ膜濃縮には、ＵＦ膜ろ過でも用いられたバッチ式平膜テストセル（日東電工株式会社製「メンブレンマスター　Ｃ４０－Ｂ」、）を用いて実施された。具体的には、図３に示すように、ＮＦ膜２５を設置したテストセル２１をマグネチックスターラー２２上に設置して、テストセル２１中の残渣が取り除かれたソルガム搾汁液２３を攪拌子２４で攪拌した。ＮＦ膜濃縮は、窒素ガスによりテストセル２１内に２．８ＭＰａの圧力を掛けて、室温２５℃で実施された。このＮＦ膜濃縮により、ＮＦ膜２５の非透過側に、糖が約２．２倍に濃縮された糖濃縮液が得られた。詳しくは、糖濃縮液には、１６４．４ｇ／Ｌのスクロース、６０．０ｇ／Ｌのグルコース、５４．２ｇ／Ｌのフルクトースが含まれていた。
［糖濃縮液のエタノール発酵］
　上記方法で得られた糖濃縮液のエタノール発酵を行った。まず、サッカロマイセス・セレビシエのＢＹ４７４１株を準備した。これを５ｍＬのＹＰＤ培地（１０ｇ／Ｌ酵母エキス、２０ｇ／Ｌポリペプトン、２０ｇ／Ｌグルコース）中にて３０℃、１５０ｒｐｍで２４ｈ前培養し、次に同様のＹＰＤ培地５００ｍＬ中で２４時間培養したものを回収して、ＢＹ４７４１株として使用した。上記方法で得られた糖濃縮液に、５０ｗｅｔ－ｇ／Ｌ（乾燥状態の１０ｇ／Ｌに相当）に酵母ＢＹ４７４１株を添加して、３０℃で４８時間のエタノール発酵を行った（第１発酵工程）。発酵は、ＣＯ2ガスを逃がす排気口を備えた５０ｍＬボトル（作業体積１０ｍＬ）中にて、発酵液を回転させながら行った。４８時間のエタノール発酵の後、得られた発酵液（第１発酵液）を遠心分離によって固液分離し、液体成分を取り除いた。得られた固体成分に、取り除かれた液体成分と同体積の糖濃縮液（第２糖濃縮液）を添加して、３０℃で４８時間のエタノール発酵を行った（第２発酵工程）。第２発酵工程と同様の手順で、第３発酵工程、第４発酵工程及び第５発酵工程が実施された。すなわち、同じ酵母を用い、ソルガムを原料として得られた糖液をＮＦ膜濃縮して得られた糖濃縮液のみを添加しながら、５回の繰り返し回分発酵を行った。なお、第１～第５発酵工程で用いた糖濃縮液には、全て、本実施例において上記方法にて準備された糖濃縮液が用いられた。
［発酵液中の各成分濃度測定］
　第１～第５発酵工程で得られた第１～第５発酵液におけるスクロース、グルコース、フルクトース、エタノール及びグリセロールの濃度を、固液分離によって得られた液体成分を高速液体クロマトグラフィー（株式会社島津製作所製）で分析することによって、測定した。結果は、図４Ａ及び図４Ｂに示されている。
　（実施例２）
［糖濃縮液の準備］
　実施例１と同じ方法で、糖濃縮液を準備した。
［糖濃縮液のエタノール発酵］
　実施例２では、実施例１とは異なり、サッカロマイセス・セレビシエのＢＹ４７４１株の培養にＹＰＤ培地を用いずに、上記方法で準備されたソルガムを原料として得られた糖濃縮液を用いた。すなわち、実施例２では、酵母の培養が発酵工程と並行して行われた。具体的には、第１発酵工程において糖濃縮液に添加する酵母ＢＹ４７４１株の濃度を、実施例１よりも低い０．０４ｗｅｔ－ｇ／Ｌとした点と、繰り返す発酵工程の回数を７回にした点と、発酵工程を繰り返す際に添加する糖濃縮液を分離された液体成分の半分量とした点（液体成分の半分量のみを糖濃縮液に置き換える点）とを除いては、実施例１のエタノール発酵と同じ方法でエタノール発酵を行った。
［発酵液中の各成分濃度測定］
　実施例１と同じ方法で、発酵液中の各成分濃度測定を行った。結果を図５に示す。
［酵母濃度の測定］
　実施例２では、第１～第７発酵工程の間に糖濃縮液中で酵母がどの程度培養されたか、すなわち発酵液中の酵母濃度を、濁度法を用いて求めた。具体的には、発酵液を採取して、分光光度計（島津製作所製「ＵＶｍｉｎｉ－１２４０」）にて６００ｎｍの吸光度を測定した。結果を図６に示す。
　（比較例１）
　エタノール発酵に用いた糖液を、実施例１で使用したソルガムを原料として作製された糖濃縮液ではなく、糖のみ（スクロース、グルコース及びフルクトースのみ）を含む糖液（スクロース１４９ｇ／Ｌ、グルコース５６ｇ／Ｌ及びフルクトース４６ｇ／Ｌ）を用いた点を除いては、実施例１と同じ方法でエタノール発酵を行った。また、発酵液中の各成分濃度の測定を実施例１と同じ方法で行った。結果を図７Ａ及び図７に示す。
　（比較例２）
　エタノール発酵に用いた糖液を、実施例１で使用したソルガムを原料として作製された糖濃縮液ではなく、モラセスのみを含む糖液（スクロース１２７ｇ／Ｌ、グルコース７５ｇ／Ｌ及びフルクトース８３ｇ／Ｌ）を用いた点を除いては、実施例１と同じ方法でエタノール発酵を行った。また、発酵液中の各成分濃度の測定を実施例１と同じ方法で行った。結果を図８Ａ及び図８Ｂに示す。
　図４Ａからわかるように、実施例１の繰り返し回分発酵では、窒素源が添加されない糖濃縮液のみが使用されたにも関わらず、酵母が５回の繰り返し回分発酵で高濃度エタノール生成を維持し続けた。例えば、５回目のエタノール発酵で得られたエタノールの濃度は１１３．７±３．１g／Ｌであり、これは１回目のエタノール発酵で得られたエタノールの濃度（１１５．２±７．３ｇ／Ｌ）と同程度であった。
　また、図６に示す結果から、窒素源等の栄養素を添加しなくても、ソルガムを原料として得られる糖濃縮液によって酵母が培養できることが確認された。なお、実施例２では、１回目及び２回目のエタノール発酵で生成されたエタノール濃度が低くなっているが、これは酵母の培養が不十分で酵母濃度が低かったからであると考えられる。酵母が十分に培養された３回目以降のエタノール発酵では、図５に示すように、糖濃縮液のみで酵母によって高濃度エタノールが生成された。このように、ソルガムを原料として得られる糖濃縮液によって培養された酵母を用いた実施例２でも、実施例１と同様に、窒素源が添加されない糖濃縮液のみが使用されたにも関わらず、酵母が複数回の繰り返し回分発酵で高濃度エタノール生成を維持し続けた。
　一方、比較例１では、ソルガムを原料として得られる糖濃縮液ではなく、糖のみを含む糖液を窒素源を添加せずに用いて繰り返し回分発酵を行ったが、図７Ａに示すように、２回目の発酵ではエタノール生成濃度が非常に低くなり、３回目以降の発酵ではエタノールは生成されなかった。また、比較例２では、モラセスを含む糖液を窒素源を添加せずに用いて繰り返し回分発酵を行ったが、図８Ａに示すように、２回目以降のエタノール発酵では、エタノール生成濃度が１回目のエタノール発酵と比較して非常に低くなった。
　以上の結果から、繰り返し回分発酵において、各回の発酵原料として、ソルガムを原料として得られた糖液をＮＦ膜で濃縮して得られた糖濃縮液を用いることにより、窒素源を添加しなくても、酵母による発酵能力を維持させて高濃度エタノールを生成できることが確認された。
　（実施例３）
［糖分離工程］
　まず、ソルガム搾汁液を準備した。本実施例では、ソルガム（名古屋大学大学院生命農学研究科付属フィールド科学教育研究センター東郷フィールドより入手、栽培品種「ＳＩＬ－０５」）を搾汁機（有限会社奥原鉄工製）を用いて圧搾することによって、ソルガム搾汁液（ソルガムを原料とする糖液）を得た。得られたソルガム搾汁液（ｐＨ５．２）には、８４．０ｇ／Ｌのスクロース、２６．２ｇ／Ｌのグルコース、１８．０ｇ／Ｌのフルクトースが含まれていた。
　次に、ソルガム搾汁液をＵＦ膜（日東電工社株式会社製「ＲＳ５０」、分画分子量１５００００Ｄａ）でろ過して、残渣を取り除いた（ＵＦ膜ろ過）。残渣を取り除いて得られたソルガム搾汁液の糖濃度（スクロース、グルコース及びフルクトースの濃度）は、残渣を取り除く前と同じであった。ＵＦ膜ろ過は、バッチ式平膜テストセル（日東電工株式会社製「メンブレンマスター　Ｃ４０－Ｂ」、直径１０４ｍｍ、高さ１４７ｍｍ、最大容量３８０ｍＬ）にＵＦ膜を設置して実施された。具体的には、図３に示すように、ＵＦ膜２５を設置したテストセル２１をマグネチックスターラー２２上に設置して、テストセル２１中のソルガム搾汁液２３を攪拌子２４で攪拌した。ろ過は、窒素ガスによりテストセル２１内に０．５ＭＰａの圧力を掛けて、室温２５℃で行った。このろ過により、ＵＦ膜２５の非透過側の残渣を取り除いて、ＵＦ膜透過液を残渣が取り除かれたソルガム搾汁液として得た。
　次に、残渣が取り除かれたソルガム搾汁液を、ＮＦ膜（日東電工株式会社製「ＮＴＲ－７４５０」）を用いて、スクロース高濃度糖液と還元糖高濃度糖液とに分離した（糖分離）。なお、糖分離に用いられたＮＦ膜「ＮＴＲ－７４５０」は、スクロース阻止性能／グルコース阻止性能の値が２．４であり、分画分子量が約１０００Ｄａの膜である。糖分離には、ＵＦ膜ろ過でも用いられたバッチ式平膜テストセル（日東電工株式会社製「メンブレンマスター　Ｃ４０－Ｂ」）を用いて実施された。具体的には、図３に示すように、ＮＦ膜２５を設置したテストセル２１をマグネチックスターラー２２上に設置して、テストセル２１中の残渣が取り除かれたソルガム搾汁液２３を攪拌子２４で攪拌した。糖分離は、窒素ガスによりテストセル２１内に２．０ＭＰａの圧力を掛けて、室温２５℃で実施された。この糖分離により、ＮＦ膜２５の非透過側に、スクロースが濃縮され、且つグルコース及びフルクトース等の還元糖の濃度が低減した糖液（スクロース高濃度糖液）が得られた。このスクロース高濃度糖液を５倍希釈し、再び（２回目の）ＮＦ膜（日東電工株式会社製「ＮＴＲ－７４５０」）を用いた糖分離を実施した。２回目の糖分離も１回目の糖分離と同じ方法で実施し、ＮＦ膜２５の非透過側に、スクロースが濃縮され、且つグルコース及びフルクトース等の還元糖の濃度が低減した糖液を、最終的に得られたスクロース高濃度糖液として、製糖工程の原料として用いた。最終的に得られたスクロース高濃度糖液には、１４３．２ｇ／Ｌのスクロース、８．５ｇ／Ｌのグルコース、４．５ｇ／Ｌのフルクトースが含まれていた。なお、１回目及び２回目の糖分離でＮＦ膜２５を透過した糖液は、還元糖高濃度糖液として、後の工程である糖濃縮液の準備に用いられた。
［糖濃縮液の準備］
　糖分離工程で得られた還元糖高濃度糖液を糖濃縮の原料として用いた点以外は、実施例１と同じ方法で糖濃縮液を準備した。得られた糖濃縮液には、９６．３ｇ／Ｌのスクロース、７６．１ｇ／Ｌのグルコース、５５．５ｇ／Ｌのフルクトースが含まれていた。
［糖濃縮液のエタノール発酵］
　上記方法で得られた糖濃縮液のエタノール発酵を行った。まず、サッカロマイセス・セレビシエのＢＹ４７４１株を準備した。これを５ｍＬのＹＰＤ培地（１０ｇ／Ｌ酵母エキス、２０ｇ／Ｌポリペプトン、２０ｇ／Ｌグルコース）中にて３０℃、１５０ｒｐｍで２４ｈ前培養し、次に同様のＹＰＤ培地５００ｍＬ中で４８時間培養したものを回収して、ＢＹ４７４１株として使用した。上記方法で得られた糖濃縮液に、５０ｗｅｔ－ｇ／Ｌ（乾燥状態の１０ｇ／Ｌに相当）に酵母ＢＹ４７４１株を添加して、３０℃で４８時間のエタノール発酵を行った（第１発酵工程）。発酵は、ＣＯ2ガスを逃がす排気口を備えた５０ｍＬボトル（作業体積１０ｍＬ）中にて、発酵液を回転させながら行った。２４時間のエタノール発酵の後、得られた発酵液（第１発酵液）を遠心分離によって固液分離し、液体成分を取り除いた。得られた固体成分に、取り除かれた液体成分と同体積の糖濃縮液（第２糖濃縮液）を添加して、３０℃で２４時間のエタノール発酵を行った（第２発酵工程）。第２発酵工程と同様の手順で、第３発酵工程、第４発酵工程及び第５発酵工程が実施された。すなわち、同じ酵母を用い、ソルガムを原料として得られた糖液を糖分離工程して得られた還元糖高濃度糖液をＮＦ膜濃縮して得られた糖濃縮液のみを添加しながら、５回の繰り返し回分発酵を行った。なお、第１～第５発酵工程で用いた糖濃縮液には、全て、本実施例において上記方法にて準備された糖濃縮液が用いられた。
［発酵液中の各成分濃度測定］
　第１～第５発酵工程で得られた第１～第５発酵液におけるスクロース、グルコース、フルクトース、エタノール及びグリセロールの濃度を、固液分離によって得られた液体成分を高速液体クロマトグラフィー（株式会社島津製作所製）で分析することによって、測定した。結果は、図９Ａ及び図９Ｂに示されている。
　実施例１の結果（図４Ａ）と実施例３の結果（図９Ａ）とを比較すると、糖分離工程が実施された実施例３では、各発酵工程の時間が２４時間であり実施例１の各発酵工程の時間（４８時間）の半分であるにも関わらず、各発酵工程で実施例１と同程度の濃度のエタノールが得られていた。この結果から、糖分離工程によって得られた還元糖高濃度糖液を発酵原料に用いた場合、糖分離工程を経ずに得られた糖液を発酵原料に用いる場合と比較して、繰り返し回分発酵での発酵効率を向上させて発酵速度が向上することがわかる。
　本発明の製造方法によれば、繰り返し回分発酵によって、エタノール等の、イネ科又はウリ科の草本植物由来化合物を効率良く、且つ簡便に製造できる。したがって、本発明は、イネ科又はウリ科の草本植物を原料として得られた糖液を発酵により化学品に変換する幅広い用途に利用できる。

Claims (17)

  1. 　イネ科又はウリ科の草本植物を原料として得られた糖液をナノろ過膜及び逆浸透膜の少なくともいずれか１種の膜で濃縮して得られた第１糖濃縮液に、酵母、大腸菌及びコリネバクテリウム属細菌から選ばれる少なくともいずれか１種の微生物を添加して前記第１糖濃縮液を発酵させて、得られた第１発酵液を固体成分と液体成分とに固液分離する第１発酵工程と、
    　前記第１発酵工程で得られた前記固体成分に、イネ科又はウリ科の草本植物を原料として得られた糖液をナノろ過膜及び逆浸透膜の少なくともいずれか１種の膜で濃縮して得られた第２糖濃縮液を添加して、前記第１発酵工程で用いられた前記微生物を用いて前記第２糖濃縮液を発酵させて、得られた第２発酵液を固体成分と液体成分とに固液分離する第２発酵工程と、
    を含み、
    　前記第１発酵工程及び前記第２発酵工程から選ばれる少なくともいずれか１つの発酵工程で得られた液体成分から、イネ科又はウリ科の草本植物由来化合物を得る、
    イネ科又はウリ科の草本植物由来化合物の製造方法。
  2. 　前記第２発酵工程において、前記固体成分に窒素源が添加されない、
    請求項１に記載のイネ科又はウリ科の草本植物由来化合物の製造方法。
  3. 　前記第２発酵工程において、前記固体成分に前記第２糖濃縮液のみを添加する、
    請求項２に記載のイネ科又はウリ科の草本植物由来化合物の製造方法。
  4. 　前記第１発酵工程よりも前に、イネ科又はウリ科の草本植物を原料として得られた糖液をナノろ過膜及び逆浸透膜の少なくともいずれか１種の膜で濃縮して、糖濃縮液を準備する糖濃縮液準備工程をさらに含み、
    　前記第１糖濃縮液及び前記第２糖濃縮液は、それぞれ、前記糖濃縮液準備工程において得られた前記糖濃縮液の一部である、
    請求項１～３のいずれか１項に記載のイネ科又はウリ科の草本植物由来化合物の製造方法。
  5. 　前記糖濃縮液準備工程よりも前に、イネ科又はウリ科の草本植物を原料として得られた糖液を、ナノろ過膜を用いて、スクロース高濃度糖液と還元糖高濃度糖液とに分離する糖分離工程をさらに含み、
    　前記還元糖高濃度糖液を、前記糖濃縮液準備工程における前記糖液として用いて前記糖濃縮液を準備する、
    請求項４に記載のイネ科又はウリ科の草本植物由来化合物の製造方法。
  6. 　前記スクロース高濃度糖液を用いて砂糖を製造する製糖工程をさらに含む、
    請求項５に記載のイネ科又はウリ科の草本植物由来化合物の製造方法。
  7. 　イネ科又はウリ科の草本植物を原料として得られた糖液をナノろ過膜及び逆浸透膜の少なくともいずれか１種の膜で濃縮して得られた第１糖濃縮液に、酵母、大腸菌及びコリネバクテリウム属細菌から選ばれる少なくともいずれか１種の微生物を添加して前記第１糖濃縮液を発酵させて、得られた第１発酵液を固体成分と液体成分とに固液分離する第１発酵工程と、
    　前記第１発酵工程で得られた前記固体成分に、イネ科又はウリ科の草本植物を原料として得られた糖液をナノろ過膜及び逆浸透膜の少なくともいずれか１種の膜で濃縮して得られた第２糖濃縮液を添加して、前記第１発酵工程で用いられた前記微生物を用いて前記第２糖濃縮液を発酵させて、得られた第２発酵液を固体成分と液体成分とに固液分離する第２発酵工程と、
    　前記第２発酵工程の後に実施される第３～第Ｎ発酵工程（Ｎは、３以上の整数である。）と、
    を含み、
    　前記第２～前記第Ｎ発酵工程に含まれる第Ｌ発酵工程（Ｌは、２≦Ｌ≦Ｎを満たす整数である。）では、前記第１～第Ｌ－１発酵工程のいずれかの発酵工程で得られた発酵液を固液分離して得られた固体成分に、イネ科又はウリ科の草本植物を原料として得られた糖液をナノろ過膜及び逆浸透膜の少なくともいずれか１種の膜で濃縮して得られた第Ｌ糖濃縮液を添加して、前記第１～前記第Ｌ－１発酵工程のいずれかの前記発酵工程で用いられた前記微生物を用いて前記第Ｌ糖濃縮液を発酵させて、得られた第Ｌ発酵液を固体成分と液体成分とに固液分離し、
    　前記第１～前記第Ｎ発酵工程から選ばれる少なくともいずれか１つの発酵工程で得られた液体成分から、イネ科又はウリ科の草本植物由来化合物を得る、
    イネ科又はウリ科の草本植物由来化合物の製造方法。
  8. 　前記第Ｌ発酵工程では、前記第Ｌ－１発酵工程で得られた固体成分に前記第Ｌ糖濃縮液を添加して、前記第Ｌ－１発酵工程で用いられた前記微生物を用いて前記第Ｌ糖濃縮液を発酵させる、
    請求項７に記載のイネ科又はウリ科の草本植物由来化合物の製造方法。
  9. 　前記第Ｌ発酵工程において、前記固体成分に窒素源が添加されない、
    請求項７又は８に記載のイネ科又はウリ科の草本植物由来化合物の製造方法。
  10. 　前記第Ｌ発酵工程において、前記固体成分に前記第Ｌ糖濃縮液のみを添加する、
    請求項９に記載のイネ科又はウリ科の草本植物由来化合物の製造方法。
  11. 　前記第１発酵工程よりも前に、イネ科又はウリ科の草本植物を原料として得られた糖液をナノろ過膜及び逆浸透膜の少なくともいずれか１種の膜で濃縮して、糖濃縮液を準備する糖濃縮液準備工程をさらに含み、
    　前記第１糖濃縮液及び前記第Ｌ糖濃縮液は、それぞれ、前記糖濃縮液準備工程において得られた前記糖濃縮液の一部である、
    請求項７～１０のいずれか１項に記載のイネ科又はウリ科の草本植物由来化合物の製造方法。
  12. 　前記糖濃縮液準備工程よりも前に、イネ科又はウリ科の草本植物を原料として得られた糖液を、ナノろ過膜を用いて、スクロース高濃度糖液と還元糖高濃度糖液とに分離する糖分離工程をさらに含み、
    　前記還元糖高濃度糖液を、前記糖濃縮液準備工程における前記糖液として用いて前記糖濃縮液を準備する、
    請求項１１に記載のイネ科又はウリ科の草本植物由来化合物の製造方法。
  13. 　前記スクロース高濃度糖液を用いて砂糖を製造する製糖工程をさらに含む、
    請求項１２に記載のイネ科又はウリ科の草本植物由来化合物の製造方法。
  14. 　前記第１発酵工程で用いられる前記微生物を、イネ科又はウリ科の草本植物を原料として得られた糖液をナノろ過膜及び逆浸透膜の少なくともいずれか１種の膜で濃縮して得られた糖濃縮液で培養する培養工程をさらに含む、
    請求項１～１３のいずれか１項に記載のイネ科又はウリ科の草本植物由来化合物の製造方法。
  15. 　イネ科又はウリ科の草本植物を原料として得られた前記糖液は、前記ナノろ過膜及び前記逆浸透膜の少なくともいずれか１種の膜で濃縮されるよりも前に、限外ろ過膜による前処理が施されている、
    請求項１～１４のいずれか１項に記載のイネ科又はウリ科の草本植物由来化合物の製造方法。
  16. 　前記イネ科又はウリ科の草本植物由来化合物がエタノールである、
    請求項１～１５のいずれか１項に記載のイネ科又はウリ科の草本植物由来化合物の製造方法。
  17. 　前記草本植物がソルガムである、
    請求項１～１６のいずれか１項に記載のイネ科又はウリ科の草本植物由来化合物の製造方法。
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