WO2016208576A1 - （６Ｓ，９ａＳ）－Ｎ－ベンジル－６－［（４－ヒドロキシフェニル）メチル］－４，７－ジオキソ－８－（｛６－［３－（ピペラジン－１－イル）アゼチジン－１－イル］ピリジン－２－イル｝メチル）－２－（プロプ－２－エン－１－イル）－オクタヒドロ－１Ｈ－ピラジノ［２，１－ｃ］［１，２，４］トリアジン－１－カルボキサミド化合物の結晶 - Google Patents

（６Ｓ，９ａＳ）－Ｎ－ベンジル－６－［（４－ヒドロキシフェニル）メチル］－４，７－ジオキソ－８－（｛６－［３－（ピペラジン－１－イル）アゼチジン－１－イル］ピリジン－２－イル｝メチル）－２－（プロプ－２－エン－１－イル）－オクタヒドロ－１Ｈ－ピラジノ［２，１－ｃ］［１，２，４］トリアジン－１－カルボキサミド化合物の結晶 Download PDF

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郁雄 櫛田
伊藤　洋子
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Definitions

  • the present invention relates to (6S, 9aS) -N-benzyl-6-[(4-hydroxyphenyl) methyl] -4,7-dioxo-8-( ⁇ 6- [3- (piperazin-1-yl) azetidine- 1-yl] pyridin-2-yl ⁇ methyl) -2- (prop-2-en-1-yl) -octahydro-1H-pyrazino [2,1-c] [1,2,4] triazine-1- It relates to crystals of carboxamide compounds.
  • Wnt signaling pathway is conserved regardless of differences between species, and has been clarified as an important pathway related to the development, differentiation and maintenance of living organisms.
  • Wnt signaling pathway is constantly activated by adenomato polyposi coli (APC) and ⁇ -catenin inhibitory mutation and activation mutation, respectively.
  • APC adenomato polyposi coli
  • ⁇ -catenin inhibitory mutation and activation mutation respectively. It is known that In pancreatic cancer, blood cancer, liver cancer and the like, it is known that Wnt signaling pathway is activated after treatment with an existing antitumor agent.
  • Non-Patent Documents 1 and 2 describe that when Wnt signaling pathway is inhibited, excellent antitumor activity is described, and Non-Patent Documents 12, 13 and 14 describe fibers by inhibiting Wnt signaling pathway. It is described that it exhibits an excellent effect on the disease. As a new target for tumor treatment and fibrosis treatment, Wnt signaling pathway is getting attention.
  • Non-Patent Documents 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 and 11 describe compounds or antibodies that inhibit Wnt signaling pathway, which are Tankyase, Traf2- and Nck-interacting kinase ( TNIK), Porcupine, Frizzled Receptor, etc. have been reported.
  • (6S, 9aS) -N-benzyl-8-( ⁇ 6- [3- (4-ethylpiperazin-1-yl) azetidin-1-yl] pyridin-2-yl] is a compound represented by the following formula: ⁇ Methyl) -6- (2-fluoro-4-hydroxybenzyl) -4,7-dioxo-2- (prop-2-en-1-yl) hexahydro-2H-pyrazino [2,1-c] [1 , 2,4] triazine-1 (6H) -carboxamide (hereinafter referred to as “compound 1”) has a Wnt Pathway modulating action.
  • the subject of this invention is providing the crystal
  • the present invention provides the following [1] to [12].
  • Powder X-ray diffraction further has diffraction peaks at diffraction angles (2 ⁇ ⁇ 0.2 °) of 14.2 °, 16.0 °, 18.9 °, 19.7 ° and 23.1 °.
  • the crystals of Compound 1 according to the present invention have the properties as shown in the examples and can be used as drug substances for pharmaceuticals.
  • FIG. 1 is a graph showing the results of Test Example 2.
  • the vertical axis represents the number of polyps per mouse.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of Test Example 3.
  • the horizontal axis indicates the number of days elapsed, and the vertical axis indicates the relative tumor volume (RTV) with respect to the tumor volume on day 0.
  • FIG. 3 is a graph showing the results of Test Example 3.
  • the horizontal axis represents the number of days elapsed, and the vertical axis represents the relative weight (RBW) with respect to the weight on the 0th day.
  • 4 is a powder X-ray diffraction pattern of the crystal of Compound 1 in Test Example 4.
  • FIG. The horizontal axis indicates the diffraction angle (2 ⁇ ), and the vertical axis indicates the peak intensity.
  • FIG. 1 is a graph showing the results of Test Example 2.
  • the vertical axis represents the number of polyps per mouse.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of Test Example 3.
  • FIG. 5 is a graph showing the results of Test Example 5.
  • the horizontal axis represents temperature
  • the left vertical axis represents the amount of change in thermogravimetric analysis (TG)
  • the right vertical axis represents the amount of change in differential thermal analysis (DTA).
  • 6 is a 13 C solid state NMR spectrum of the crystal of Compound 1 in Test Example 6.
  • FIG. The horizontal axis represents chemical shift ( ⁇ ), and the vertical axis represents peak intensity.
  • the diffraction peaks in the powder X-ray diffraction described above are unique to the crystal of Compound 1, and are characteristic diffraction peaks of the crystal.
  • the above diffraction angle value includes a numerical value within a range of about ⁇ 0.2 °. Need to be understood. Accordingly, not only crystals whose diffraction angles of peaks in powder X-ray diffraction completely match but also crystals whose diffraction angles of peaks match with an error of about ⁇ 0.2 ° are the same and are included in the present invention.
  • the peak intensity or half-value width of the diffraction angle (2 ⁇ ) in powder X-ray diffraction is the difference in measurement conditions and the size and shape of each particle of a powder crystal used as a measurement sample even if the crystal form is the same. Due to variations, it varies from measurement to measurement, and a constant peak intensity or full width at half maximum is not always indicated. Therefore, in the comparison of powder X-ray diffraction patterns, even if there is a difference in peak intensity or half-value width at the same diffraction angle (2 ⁇ ), the difference does not mean that the measured crystal forms are different from each other. Absent.
  • the crystal of the compound showing a powder X-ray diffraction pattern having such a difference with respect to the diffraction peak characteristic of the specific crystal of the present invention is the same crystal form as the crystal of the compound of the present invention.
  • “having a powder X-ray diffraction pattern substantially the same as the powder X-ray diffraction pattern shown in FIG. 4” means that the powder X-ray diffraction pattern having a certain characteristic diffraction peak is In addition to the case where the powder X-ray diffraction pattern shown in FIG.
  • the peak intensity or the half-value width is different or the diffraction angle of the characteristic diffraction peak coincides with an error range of ⁇ 0.2 °.
  • the powder X-ray diffraction pattern is the same as the powder X-ray diffraction pattern shown in FIG. Therefore, it means that all crystals having such a powder X-ray diffraction pattern are the same crystals as the crystal of the present invention.
  • the chemical shift ( ⁇ ) in the 13 C solid-state NMR spectrum can cause an error within a range of ⁇ 0.5 ppm.
  • the value of should be understood as including values in the range of about ⁇ 0.5 ppm. Therefore, the present invention includes not only crystals in which the chemical shift in the 13 C solid state NMR spectrum is completely matched but also crystals in which the chemical shift is matched with an error of about ⁇ 0.5 ppm. Therefore, in this specification, for example, “having a peak at 12.6 ppm of chemical shift ( ⁇ ⁇ 0.5 ppm)” means “having a peak at 12.1 ppm to 13.1 ppm of chemical shift ( ⁇ )”.
  • Compound 1 crystals can be produced by the above-described method for producing Compound 1, or by dissolving Compound 1 with heating in a solvent, cooling with stirring and crystallization. Can also be manufactured.
  • Compound 1 used for crystallization may be in any form, may be a solvate, hydrate, or anhydride, and may be amorphous or crystalline (including those composed of a plurality of crystal polymorphs). It may be a mixture of these, but is preferably an anhydride.
  • Solvents used for crystallization are, for example, alcohol solvents such as methanol, ethanol, 1-propanol and 2-propanol; acetonitrile; amide solvents such as N, N-dimethylformamide; ester systems such as ethyl acetate and isopropyl acetate. Solvents; saturated hydrocarbon solvents such as hexane and heptane; ketone solvents such as acetone and 2-butanone; ether solvents such as t-butyl methyl ether or water. These solvents may be used alone or in combination of two or more. When crystallization is performed by mixing two or more solvents, for example, it is preferable to use heptane and 1-propanol in combination.
  • the amount of the solvent used can be appropriately selected with the lower limit being the amount in which compound 1 is dissolved by heating or the amount by which the suspension can be stirred, and the upper limit being the amount that does not significantly reduce the yield of crystals.
  • the crystals obtained by the above method are in a single crystal form.
  • This crystal form is stable, does not easily transition to another crystal form or amorphous, has good physical properties, and is suitable for formulation.
  • seed crystals (such as crystals of desired compound 1) may or may not be added.
  • the temperature at which the seed crystal is added is not particularly limited, but is preferably 0 to 100 ° C.
  • the temperature at which compound 1 is dissolved by heating may be appropriately selected at a temperature at which compound 1 is dissolved depending on the solvent, but is preferably in the range of the temperature at which the recrystallization solvent starts to reflux from 50 ° C. More preferably, it is 60 to 100 ° C.
  • Cooling during crystallization can give crystals containing different forms of crystals (polymorphs) when rapidly cooled, so it is desirable to adjust the cooling rate appropriately in consideration of the effects on crystal quality and particle size.
  • cooling is performed at a rate of 5 to 40 ° C./hour, for example. More preferable is cooling at a rate of 5 to 25 ° C./hour, for example.
  • the final crystallization temperature can be appropriately selected from the yield and quality of crystals, but is preferably -25 to 30 ° C.
  • the crystallized crystal is separated by a normal filtration operation. If necessary, the crystal separated by filtration is washed with a solvent, and further dried to obtain a target crystal.
  • a solvent used for washing the crystals, the same crystallization solvent can be used.
  • Preferred examples of such a solvent include ethanol, acetone, 2-butanone, ethyl acetate, diethyl ether, t-butyl methyl ether, hexane, heptane and the like. These solvents may be used alone or in combination of two or more.
  • the crystals separated by the filtration operation can be appropriately dried by being left in the air or a nitrogen stream, or by heating.
  • the drying time may be appropriately selected according to the production amount, drying apparatus, drying temperature, etc. until the residual solvent falls below a predetermined amount. Moreover, drying can be performed under ventilation or under reduced pressure. The degree of vacuum may be appropriately selected according to the production amount, the drying device, the drying temperature, and the like. The obtained crystals can be left in the air after drying, if necessary.
  • a pharmaceutical composition can be produced by adding a pharmaceutically acceptable additive to the crystal of Compound 1 as necessary.
  • the dosage form of the pharmaceutical composition include oral preparations (tablets, granules, powders, capsules, syrups, etc.), injections (for intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, and intraperitoneal administration). Etc.), external preparations (transdermal absorption preparations (ointments, patches, etc.), eye drops, nasal drops, suppositories, etc.).
  • These solid preparations such as tablets, capsules, granules and powders can usually contain 0.001 to 99.5% by mass, preferably 0.001 to 90% by mass of Compound 1 crystals.
  • excipients When producing an oral solid preparation, excipients, binders, disintegrants, lubricants, coloring agents, etc. are added to the crystals of compound 1 as necessary, and tablets, granules are prepared by conventional methods. , Powders and capsules. In addition, tablets, granules, powders, capsules and the like may be coated as necessary.
  • the dose of the pharmaceutical agent according to the present invention usually varies depending on symptoms, age, sex, weight, etc., and may be an amount sufficient to produce a desired effect. For example, in the case of an adult, about 0.1 to 5000 mg (preferably 0.5 to 1000 mg) per day is used once a day or a plurality of days or divided into 2 to 6 times a day. .
  • the crystals of Compound 1 according to the present invention can be produced, for example, by the methods described in the following production examples and examples. However, these are illustrative, and the crystal of the compound according to the present invention is not limited to the following specific examples in any case.
  • YMC GEL SILICA (YMC Co., Ltd., catalog code: SL06I52W) is used as a silica gel for purification used in silica gel column chromatography, and an NH silica gel column is used.
  • the silica gel for purification used in the chromatography is NH Siliga Gel (Fuji Silysia Chemical LTD., Catalog code: DM2035), and the silica gel for purification used in the ODS silica gel column chromatography is YAMAZEN GEL ODS-SM. (YAMAZEN Corporation, catalog codes: W113, W116, etc.) were used.
  • the TLC plate for purification used in silica gel thin layer chromatography is TLC Silica gel 60F 254 (Merck KGaA, catalog code: 1.0571.0001), and is used in NH silica gel thin layer chromatography.
  • TLC plate for purification NH SILICA GEL TLC plate (Fuji Silysia Chemical LTD., Catalog code: T050908) was used.
  • NMP N-methylpyrrolidinone
  • THF Tetrahydrofuran
  • HATU O- (7-azabenzotriazol-1-yl) -N, N, N ′, N′-tetramethyluronium hexafluorophosphate
  • HBTU O- (benzotriazole -1-yl) -N, N, N ′, N′-tetramethyluronium hexafluorophosphate
  • TFA trifluoroacetic acid
  • DMF N, N-dimethylformamide
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • the reaction mixture was quenched with sodium bicarbonate and water and extracted with ethyl acetate.
  • the organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate and filtered.
  • the title compound (1.14 g, yield: 74%) was obtained.
  • the reaction mixture was filtered and the filtrate was concentrated under reduced pressure. Water was added to the residue and extracted with ethyl acetate. The organic layer was washed with water, saturated aqueous sodium thiosulfate solution, and saturated brine. The organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate and filtered. The solvent was evaporated under reduced pressure, diethyl ether and heptane were added to the resulting residue, and the precipitated solid was collected by filtration to obtain the title compound (3.82 g, yield: 68%).
  • Test Example 1 Detection of Wnt signal pcDNA3.1 (+) (invitrogen) was cleaved with restriction enzymes BglII and NotI, and adapters BEHKS (restriction enzyme sites BglII, EcoRI, HindIII, KpnI, Plasmid pNeo-HKS was constructed by inserting SacI and NotI).
  • BEHKS-R 5′-ggccgcgagctctctagagagtaccctcgagaagctttgaattca-3 ′ SEQ ID NO: 2
  • an approximately 2700 bp fragment (including Wnt responsive sequence and luciferase gene) cleaved from the TOPglow plasmid contained in TOPglow / FOPglow TCF Reporter Kit (upstate Catalog # 17-366) using restriction enzymes HindIII and KpnI
  • the plasmid pNeo-TOP was constructed by inserting between pNeo-HKS between HindIII and KpnI.
  • Plasmid pNeo-TOP was introduced into human fetal kidney cell line HEK293, and compounds were selected using G418, and then a cell clone was established by the limiting dilution method. This cell clone was subjected to a Wnt signal detection test. This cell clone was subcultured in D-MEM high glucose medium (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) containing 10% FBS, and cells in the growth phase were used for the test. After recovering the cells using trypsin-EDTA, the number of cells was counted and suspended in D-MEM high glucose medium containing 10% FBS so as to be 2 ⁇ 10 5 cells / mL.
  • D-MEM high glucose medium manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • the cell suspension was added to a 96-well plate for cell culture (manufactured by Greiner, product number 655083) at 0.1 mL / well and cultured overnight in a 5% CO 2 incubator (37 ° C.). After culturing, the test substance dissolved in DMSO was diluted with D-MEM high glucose medium containing 10% FBS and 80 mM LiCl to obtain a test solution. 0.1 mL of the test solution was added to each well and cultured in a 5% CO 2 incubator (37 ° C.). Six hours after the addition of the test solution, the supernatant of each well was removed, and 50 ⁇ L of Bright-Glo TM Luciferase substrate (Promega, product number E2620) was added.
  • Bright-Glo TM Luciferase substrate Promega, product number E2620
  • the plate was put on a plate mixer for several seconds, and then the luminescence of each well was measured using an EnVision TM Multilabel plate reader (Perkin Elmer). Luminescence of wells to which no test solution was added and LiCl was added was defined as 100% Wnt signal activity, and luminescence of wells to which neither a test substance nor LiCl was added was defined as 0% Wnt signal activity. As a result, the Wnt signal activity rate (%) of each well was determined, and the concentration (IC 50 ) required to inhibit the Wnt signal activity of the test substance by 50% was calculated. The IC 50 of the compound of Example 1 was 0.06 ⁇ M.
  • Test Example 2 Intestinal polyp inhibitory action of APC Min / + mice
  • the APC gene (Adenomatous polyposis coli gene), which is a Wnt signal degradation regulator, is called a colon cancer suppressor gene and is also a causative gene of human familial colorectal adenomatosis It has become.
  • the colonic mucosal cells start disordered abnormal growth and form a colonic polyp that can be called a precancerous lesion. Thus, it is known to play an important role in the early stage of the colorectal cancer development process.
  • This APC gene mutant mouse develops many polyps in the intestinal tract in the same way as patients with familial colorectal adenomatosis, and elucidates the mechanisms of colon cancer carcinogenesis and invasion based on WNT signals. It is useful and has become the standard model used for research on prevention, diagnosis and treatment of colorectal cancer.
  • the grouping of APC Min / + mice (C57BL / 6J-APC ⁇ Min> / J Hetero, female, produced by Sampranet Co., Ltd.) was made so that the average values of the body weights of the mice on the first day of administration were almost equal. ,went.
  • test substance (compound of Example 1) was dissolved in 0.1N HCl so as to have a dose concentration, and stored in a refrigerator at 4 ° C. to obtain an evaluation sample.
  • control (vehicle) group only the administration solvent was used as an evaluation sample.
  • the test specimen was orally administered twice a day for 4 consecutive days at doses of 50 mg / kg and 75 mg / kg, followed by a 3-day drug holiday for one cycle, for a total of 16 days (4 days ⁇ 4 Cycle). The experiment was conducted using 6-7 mice per group. For each of the control group and the test substance-administered group, the value of the weight of the last day relative to the weight of the first day (relative body weight: RBW) was calculated.
  • RBW relative body weight
  • the test substance administration group in which the RBW of the test substance administration group / RBW of the control group was 0.8 or more was determined to be a safe administration group.
  • the actual number and standard error of the number of polyps after administration of the test substance relative to the number of control polyps on the last day (from the first day of administration to the 25th day) are shown in FIG.
  • the polyps counted in the small intestine and colon were counted.
  • Statistical analysis (Dunnett's test) of the test substance administration group with respect to the control group was performed, and the P value was described.
  • Test Example 3 Antitumor effect in human K562 subcutaneous transplantation model Human chronic myeloid leukemia cell line K562 cultured in RPMI-1640 culture medium containing 10% FBS and penicillin / streptomycin was added to PBS (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Cat # 045). -29795) and MATRIGEL (BD Bioscience Cat # 354234) prepared at a concentration of 2 ⁇ 10 8 cells / mL are mixed 1: 1, and a cell suspension of 1 ⁇ 10 8 cells / mL is mixed. Prepared.
  • the obtained cell suspension was transplanted at a dose of 100 ⁇ L into the right flank subcutaneous part of a 6-week-old nude mouse (CAnN.Cg-Foxn1nu / CrlCrlj, female, Charles River Japan Co., Ltd.). Seven days after transplantation, the short axis and long axis of the tumor were measured using an electronic digital caliper (Digimatic TM caliper, Mitutoyo Corporation), and the tumor volume was calculated by the following formula.
  • Tumor volume (mm 3 ) major axis (mm) ⁇ minor axis (mm) ⁇ minor axis (mm) / 2
  • Nude mice were grouped in such a manner that the average values of the tumor volumes were substantially equal based on the tumor volume on the first day of administration.
  • a test substance compound of Example 1 was dissolved in 0.1N HCl and prepared to give a dose of 10 mL / kg to obtain an evaluation sample.
  • Dasatinib, Free Base LC Laboratories, Cat. No.
  • Tumor volume over time from the first day to the 28th day for each of the control group, the test substance single administration group, the Dasatinib single administration group, and the test substance and Dasatinib combination administration group (hereinafter also referred to as “combination administration group”). And the body weight was measured.
  • the control group and the test substance single administration group were measured from the first day of administration to the 11th day.
  • a tumor volume value (relative tumor volume: RTV) and a body weight value (relative body weight: RBW) with respect to the tumor volume on day 0 were calculated. Each is shown in FIG.
  • Test Example 4 Powder X-ray Diffraction Crystal of Compound 1 obtained in Example 2 was placed on a sample stage of a powder X-ray diffractometer and analyzed under the following conditions. The result is shown in FIG. (Measurement condition)
  • Target Copper detector: Scintillation counter tube voltage: 50 kV Tube current: 300mA
  • Slit Divergence slit 0.5 mm, scattering slit open, light receiving slit open
  • Scan speed 5 ° / min
  • Sampling interval 0.02 ° Scan range: 5 ° to 35 °
  • Sample holder Aluminum holder
  • Test Example 5 Thermal Analysis The crystals obtained in Example 2 were precisely weighed in an aluminum sample pan, and thermogravimetric analysis (TG) and differential thermal analysis (DTA) were performed under the following conditions. The result is shown in FIG. (Measurement condition) Atmosphere: 40 mL / min under nitrogen gas flow Control: Empty aluminum sample pan heating rate: 10 ° C./min Sampling interval: 1 sec Measurement temperature range: 40 to 300 ° C
  • Test Example 6 13 C solid state NMR spectrum
  • the 13 C solid state NMR spectrum was measured under the following conditions. The results are shown in FIG. (Measurement condition) Device used: Avance 400 MHz (manufactured by BRUKER) 7 mm-CPMAS probe (manufactured by BRUKER) Measurement nucleus: 13 C (resonance frequency 100.6248425 MHz) Measurement temperature: Room temperature (22 ° C) Pulse mode: CPTOSS measurement rotation speed: 5000Hz Pulse repetition time: 4 sec Contact time: 1msec Integration number: 8000 times Reference substance: Glycine (External standard: 176.03 ppm)
  • 13 C solid state NMR spectrum was obtained by CPTOSS method (spinning sideband elimination method) of carbon nucleus (resonance frequency 100.6 MHz) using Avance 400 MHz (manufactured by BRUKER) equipped with 7 mm-CPMAS probe manufactured by BRUKER. .
  • a sample tube containing approximately 300 mg of a solid sample was rotated at 5 kHz, and the measurement was performed at a contact time of 1 msec, a pulse waiting time of 4 sec, an integration number of 8000 times, and room temperature (22 ° C.).
  • the chemical shift was corrected by an external standard method in which the carbonyl carbon of glycine was 176.03 ppm.

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Abstract

本発明は、（６Ｓ，９ａＳ）－Ｎ－ベンジル－８－（｛６－［３－（４－エチルピペラジン－１－イル）アゼチジン－１－イル］ピリジン－２－イル｝メチル）－６－（２－フルオロ－４－ヒドロキシベンジル）－４，７－ジオキソ－２－（プロプ－２－エン－１－イル）ヘキサヒドロ－２Ｈ－ピラジノ［２，１－ｃ］［１，２，４］トリアジン－１（６Ｈ）－カルボキサミドの結晶を提供する。　

Description

（６Ｓ，９ａＳ）－Ｎ－ベンジル－６－［（４－ヒドロキシフェニル）メチル］－４，７－ジオキソ－８－（｛６－［３－（ピペラジン－１－イル）アゼチジン－１－イル］ピリジン－２－イル｝メチル）－２－（プロプ－２－エン－１－イル）－オクタヒドロ－１Ｈ－ピラジノ［２，１－ｃ］［１，２，４］トリアジン－１－カルボキサミド化合物の結晶
　本発明は、（６Ｓ，９ａＳ）－Ｎ－ベンジル－６－［（４－ヒドロキシフェニル）メチル］－４，７－ジオキソ－８－（｛６－［３－（ピペラジン－１－イル）アゼチジン－１－イル］ピリジン－２－イル｝メチル）－２－（プロプ－２－エン－１－イル）－オクタヒドロ－１Ｈ－ピラジノ［２，１－ｃ］［１，２，４］トリアジン－１－カルボキサミド化合物の結晶に関する。
　Ｗｎｔ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｐａｔｈｗａｙは生物種間の差によらず保存され、生体の発生、分化および維持に関わる重要な経路として明らかとされている。しかし、昨今、その恒常的な活性化が、線維症やがんの悪性化の進展に関与しているとの報告がなされている。中でも大腸癌、黒色腫、子宮内膜癌、肝臓癌、前立腺癌などでは、ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ　ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ　ｃｏｌｉ　（ＡＰＣ）やβ－カテニンのそれぞれ抑制型変異、活性型変異などによってＷｎｔ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｐａｔｈｗａｙが恒常的に活性化されていることが知られている。また膵臓癌や血液癌、肝癌などでは既存の抗腫瘍剤による治療後にＷｎｔ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｐａｔｈｗａｙが活性化されてくることが知られている。
　非特許文献１および２には、Ｗｎｔ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｐａｔｈｗａｙを阻害すると、優れた抗腫瘍活性を示すことが記載されており、非特許文献１２、１３および１４には、Ｗｎｔ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｐａｔｈｗａｙを阻害することで線維症に対して優れた効果を示すことが記載されている。腫瘍治療や線維症治療の新たな標的としてＷｎｔ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｐａｔｈｗａｙが着目されつつある。
　非特許文献３、４、５、６、７、８、９、１０および１１には、Ｗｎｔ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｐａｔｈｗａｙを阻害する化合物または抗体が記載されており、これらはＴａｎｋｙｒａｓｅ、Ｔｒａｆ２－　ａｎｄ　Ｎｃｋ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ　ｋｉｎａｓｅ（ＴＮＩＫ）、Ｐｏｒｃｕｐｉｎｅ、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒなどに対して作用することが報告されている。
　また、オクタヒドロ－１Ｈ－ピラジノ［２，１－ｃ］［１，２，４］トリアジン骨格を有する化合物は、Ｗｎｔ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｐａｔｈｗａｙのモジュレータとして知られており、癌や線維症などの疾患との関連が指摘されている（特許文献１～３）。
国際公開第２００９／０５１３９７号 米国特許出願公開第２０１０／０２８６０９４号明細書 国際公開第２００９／１４８１９２号
Ｎｉｃｋ　Ｂａｒｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，　"Ｍｉｎｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｗｎｔ　ｐａｔｈｗａｙ　ｆｏｒ　ｃａｎｃｅｒ　ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ"，　Ｎａｔｕｒｅ　ｒｅｖｉｅｗｓ　Ｄｒｕｇ　ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ　２００６　Ｄｅｃ；５（１２）：９９７－１０１４． Ｋａｔａｙｏｏｎ　Ｈ．　Ｅｍａｍｉ　ｅｔ　ａｌ．，　"Ａ　ｓｍａｌｌ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｏｆ　ｂｅｔａ－ｃａｔｅｎｉｎ／ＣＲＥＢ－ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ"，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ．，　２００４，　１０１（３４），　ｐ．１２６８２－１２６８７． Ｂａｏｚｈｉ　Ｃｈｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，　"Ｓｍａｌｌ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｗｎｔ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｉｎ　ｔｉｓｓｕｅ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃａｎｃｅｒ"，　Ｎａｔ　Ｃｈｅｍ　Ｂｉｏｌ．，　２００９，　５（２），　ｐ．１００－１０７． Ｓｈｉｈ－Ｍｉｎ　Ａ．　Ｈｕａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，　"Ｔａｎｋｙｒａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｓｔａｂｉｌｉｚｅｓ　ａｘｉｎ　ａｎｄ　ａｎｔａｇｏｎｉｚｅｓ　Ｗｎｔ　ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ"，　Ｎａｔｕｒｅ，　２００９，　４６１，　ｐ．６１４－６２０． Ｌａｒｉ　Ｌｅｈｔｉｏ　ｅｔ　ａｌ．，　"Ｔａｎｋｙｒａｓｅｓ　ａｓ　ｄｒｕｇ　ｔａｒｇｅｔｓ"，　Ｔｈｅ　ＦＥＢＳ　Ｊｏｕｒｎａｌ，　２０１３，　２８０，　３５７６－３５９３． Ｍｉｋｉ　Ｓｈｉｔａｓｈｉｇｅ　ｅｔ　ａｌ．，　"Ｔｒａｆ２－　ａｎｄ　Ｎｃｋ－Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ　Ｋｉｎａｓｅ　Ｉｓ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ｆｏｒ　Ｗｎｔ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ａｎｄ　Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｇｒｏｗｔｈ"，　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，　２０１０，　７０（１２），　５０２４－５０３３． Ａｕｓｔｉｎ　Ｇｕｒｎｅｙ　ｅｔ　ａｌ．，　"Ｗｎｔ　ｐａｔｈｗａｙ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｖｉａ　ｔｈｅ　ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　ｏｆ　Ｆｒｉｚｚｌｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｉｎ　ｄｅｃｒｅａｓｅｄ　ｇｒｏｗｔｈ　ａｎｄ　ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｔｕｍｏｒｓ"，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ．，　２０１２，　１０９（２９），　１１７１７－１１７２２． Ｘｉａｏｍｏ　Ｊｉａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，　"Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ　ｍｕｔａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ＲＮＦ４３　ｃｏｎｆｅｒ　Ｗｎｔ　ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｙ　ｉｎ　ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ　ｄｕｃｔａｌ　ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ"，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ．，　２０１３，　１１０（３１），　１２６４９－１２６５４． Ｊｏ　Ｗａａｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，　"Ｎｏｖｅｌ　Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ　ｏｆ　Ｃａｎｏｎｉｃａｌ　Ｗｎｔ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｉｎｈｉｂｉｔ　Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｃｅｌｌ　Ｇｒｏｗｔｈ"，　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ，　２０１１，　７１（１），　１９７－２０５． Ｈ　Ｙａｏ　ｅｔ　ａｌ．，　"ＡＶ－６５，　ａ　ｎｏｖｅｌ　Ｗｎｔ／β－ｃａｔｅｎｉｎ　ｓｉｇｎａｌ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ　ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｍｙｅｌｏｍａ　ｉｎ　ａ　ｍｏｕｓｅ　ｍｏｄｅｌ"，　Ｂｌｏｏｄ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｊｏｕｒｎａｌ，　２０１１，　１，　ｅ４３． Ｄｅ　Ｒｏｂｅｒｔｉｓ　Ａ　ｅｔ　ａｌ．，　"Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｓｍａｌｌ－ｍｏｌｅｃｕｌｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｏｆ　Ｗｎｔ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｉｎ　ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ　ｃｅｌｌｓ"，　Ｍｏｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｈｅｒ．，　２０１３，　１２（７），　１１８０－１１８９． Ａｎｎａ　Ｐ．　Ｌａｍ　ｅｔ　ａｌ．，　"β－ｃａｔｅｎｉｎ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ：　ａ　ｎｏｖｅｌ　ｍｅｄｉａｔｏｒ　ｏｆ　ｆｉｂｒｏｓｉｓ　ａｎｄ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　ｔａｒｇｅｔ"，　Ｃｕｒｒ　Ｏｐｉｎ　Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．　２０１１　Ｎｏｖｅｍｂｅｒ　；　２３（６）：　５６２－５６７． Ｓｈａ　Ｈａｏ　ｅｔ　ａｌ．，　"Ｔａｒｇｅｔｅｄ　Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　β－Ｃａｔｅｎｉｎ／ＣＢＰ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ　Ｒｅｎａｌ　Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ　Ｆｉｂｒｏｓｉｓ"，　Ｊ．　Ａｍ．　Ｓｏｃ．　Ｎｅｐｈｒｏｌ．　２２：　１６４２－１６５３，　２０１１． Ｗｉｌｌｉａｍ　Ｒ．　Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，　Ｊｒ．　ｅｔ　ａｌ．，　"Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｗｎｔ／β－ｃａｔｅｎｉｎ／ＣＲＥＢ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ＣＢＰ）　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｒｅｖｅｒｓｅｓ　ｐｕｌｍｏｎａｒｙ　ｆｉｂｒｏｓｉｓ"，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ．，　２０１０，　１０７（３２），　１４３０９－１４３１４．
　下記式で表される化合物である、（６Ｓ，９ａＳ）－Ｎ－ベンジル－８－（｛６－［３－（４－エチルピペラジン－１－イル）アゼチジン－１－イル］ピリジン－２－イル｝メチル）－６－（２－フルオロ－４－ヒドロキシベンジル）－４，７－ジオキソ－２－（プロプ－２－エン－１－イル）ヘキサヒドロ－２Ｈ－ピラジノ［２，１－ｃ］［１，２，４］トリアジン－１（６Ｈ）－カルボキサミド（以下、「化合物１」と称す。）は、Ｗｎｔ　Ｐａｔｈｗａｙ　ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ作用を有する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　一般に、医薬品として用いられる化合物およびその塩ならびにそれらの結晶の物性は、薬物のバイオアベイラビリティー、原薬の純度、製剤の処方などに大きな影響を与える。したがって、本発明の課題は、医薬品の原薬としての利用可能性を有する化合物１の結晶を提供することにある。
　本発明者らは、鋭意努力の結果、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は、以下の［１］～［１２］を提供する。
［１］（６Ｓ，９ａＳ）－Ｎ－ベンジル－８－（｛６－［３－（４－エチルピペラジン－１－イル）アゼチジン－１－イル］ピリジン－２－イル｝メチル）－６－（２－フルオロ－４－ヒドロキシベンジル）－４，７－ジオキソ－２－（プロプ－２－エン－１－イル）ヘキサヒドロ－２Ｈ－ピラジノ［２，１－ｃ］［１，２，４］トリアジン－１（６Ｈ）－カルボキサミドの結晶。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
［２］粉末Ｘ線回折において、回折角度（２θ±０．２°）５．８°に回折ピークを有する、［１］に記載の結晶。
［３］粉末Ｘ線回折において、回折角度（２θ±０．２°）５．８°、６．４°および１０．１°に回折ピークを有する、［１］に記載の結晶。
［４］粉末Ｘ線回折において、さらに回折角度（２θ±０．２°）８．０°および１２．８°に回折ピークを有する、［３］に記載の結晶。
［５］粉末Ｘ線回折において、さらに回折角度（２θ±０．２°）１４．２°、１６．０°、１８．９°、１９．７°および２３．１°に回折ピークを有する、［４］に記載の結晶。
［６］１３Ｃ固体ＮＭＲスペクトルにおいて、化学シフト（δ±０．５ｐｐｍ）１５４．７ｐｐｍにピークを有する、（６Ｓ，９ａＳ）－Ｎ－ベンジル－８－（｛６－［３－（４－エチルピペラジン－１－イル）アゼチジン－１－イル］ピリジン－２－イル｝メチル）－６－（２－フルオロ－４－ヒドロキシベンジル）－４，７－ジオキソ－２－（プロプ－２－エン－１－イル）ヘキサヒドロ－２Ｈ－ピラジノ［２，１－ｃ］［１，２，４］トリアジン－１（６Ｈ）－カルボキサミドの結晶。
［７］１３Ｃ固体ＮＭＲスペクトルにおいて、さらに化学シフト（δ±０．５ｐｐｍ）１４１．１ｐｐｍおよび１５８．１ｐｐｍにピークを有する、［６］の結晶。
［８］１３Ｃ固体ＮＭＲスペクトルにおいて、さらに化学シフト（δ±０．５ｐｐｍ）１３４．０ｐｐｍおよび１６５．１ｐｐｍにピークを有する、［７］記載の結晶。
［９］１３Ｃ固体ＮＭＲスペクトルにおいて、さらに化学シフト（δ±０．５ｐｐｍ）１２．６ｐｐｍ、５５．５ｐｐｍおよび１１８．５ｐｐｍにピークを有する、［８］記載の結晶。
［１０］図４で示される粉末Ｘ線パターンと実質的に同一の粉末Ｘ線回折パターンを有する、（６Ｓ，９ａＳ）－Ｎ－ベンジル－８－（｛６－［３－（４－エチルピペラジン－１－イル）アゼチジン－１－イル］ピリジン－２－イル｝メチル）－６－（２－フルオロ－４－ヒドロキシベンジル）－４，７－ジオキソ－２－（プロプ－２－エン－１－イル）ヘキサヒドロ－２Ｈ－ピラジノ［２，１－ｃ］［１，２，４］トリアジン－１（６Ｈ）－カルボキサミドの結晶。
［１１］図６で示される１３Ｃ固体ＮＭＲスペクトルと実質的に同一の１３Ｃ固体ＮＭＲスペクトルを有する、（６Ｓ，９ａＳ）－Ｎ－ベンジル－８－（｛６－［３－（４－エチルピペラジン－１－イル）アゼチジン－１－イル］ピリジン－２－イル｝メチル）－６－（２－フルオロ－４－ヒドロキシベンジル）－４，７－ジオキソ－２－（プロプ－２－エン－１－イル）ヘキサヒドロ－２Ｈ－ピラジノ［２，１－ｃ］［１，２，４］トリアジン－１（６Ｈ）－カルボキサミドの結晶。
［１２］［１］～［１１］のいずれか一に記載の結晶を含む、医薬組成物。
　本発明にかかる化合物１の結晶は、実施例で示されるような性状であり、医薬品の原薬としての利用可能性を有している。
図１は、試験例２の結果を示すグラフである。縦軸はマウス１匹あたりのポリープの数を示す。 図２は、試験例３の結果を示すグラフである。横軸は経過日数を示し、縦軸は０日目の腫瘍体積に対する相対的腫瘍体積（ＲＴＶ）を示す。 図３は、試験例３の結果を示すグラフである。横軸は経過日数を示し、縦軸は０日目の体重に対する相対的体重（ＲＢＷ）を示す。 図４は、試験例４における化合物１の結晶の粉末Ｘ線回折パターンである。横軸は回折角（２θ）、縦軸はピーク強度を示す。 図５は、試験例５の結果を示すグラフである。横軸は温度を示し、左縦軸は熱重量分析（ＴＧ）における変化量、右縦軸は示差熱分析（ＤＴＡ）における変化量を示す。 図６は、試験例６における化合物１の結晶の１３Ｃ固体ＮＭＲスペクトルである。横軸は化学シフト（δ）、縦軸はピーク強度を示す
　本明細書において、好ましい結晶としては、粉末Ｘ線回折において、
　回折角度（２θ±０．２°）５．８°に回折ピークを有する、化合物１の結晶；
　回折角度（２θ±０．２°）５．８°、６．４°および１０．１°に回折ピークを有する、化合物１の結晶；
　回折角度（２θ±０．２°）５．８°、６．４°、８．０°、１０．１°および１２．８°に回折ピークを有する、化合物１の結晶；
　回折角度（２θ±０．２°）５．８°、６．４°、８．０°、１０．１°、１２．８°、１４．２°、１６．０°、１８．９°、１９．７°および２３．１°に回折ピークを有する、化合物１の結晶などを挙げることができる。
　上記記載の粉末Ｘ線回折における回折ピークは、化合物１の結晶にそれぞれ特有なものであり、当該結晶に特徴的な回折ピークである。
　一般に、粉末Ｘ線回折における回折角度（２θ）は±０．２°の範囲内で誤差が生じ得るため、上記の回折角度の値は±０．２°程度の範囲内の数値も含むものとして理解される必要がある。したがって、粉末Ｘ線回折におけるピークの回折角度が完全に一致する結晶だけでなく、ピークの回折角度が±０．２°程度の誤差で一致する結晶も同一であり、本発明に含まれる。
　本明細書において、例えば、「回折角度（２θ±０．２°）５．８°に回折ピークを有する」とは、「回折角度（２θ）５．６°～６．０°に回折ピークを有する」ということを意味し、その他の回折角度の場合も同様である。
　また、一般に、粉末Ｘ線回折における回折角度（２θ）のピーク強度または半値幅は、結晶形が同一であっても、測定条件の違いや測定試料として用いる粉末結晶の各粒子の大きさや形状のばらつきにより、測定ごとに異なり、必ずしも一定のピーク強度または半値幅が常に示されるとは限らない。そのため、粉末Ｘ線回折パターンの比較において、同じ回折角度（２θ）で、そのピーク強度または半値幅に違いがあっても、その違いは、測定された結晶形が互いに異なることを意味するものではない。したがって、本発明の特定の結晶に特徴的な回折ピークに対して、そのような違いを有する粉末Ｘ線回折パターンを示す当該化合物の結晶は、本発明の化合物の結晶と同一の結晶形であることを意味する。また、本明細書において「図４で示される粉末Ｘ線回折パターンと実質的に同一の粉末Ｘ線回折パターンを有する」とは、ある特徴的な回折ピークを有する粉末Ｘ線回折パターンが、図４で示される粉末Ｘ線回折パターンに完全に一致する場合だけでなく、ピーク強度または半値幅が異なるか、特徴的な回折ピークの回折角度が±０．２°の誤差範囲で一致する場合も、図４で示される粉末Ｘ線回折パターンと同一の粉末Ｘ線回折パターンであることを意味する。したがって、このような粉末Ｘ線回折パターンを有する結晶は全て、本発明の結晶と同一の結晶であることを意味する。
　本明細書において、好ましい結晶としては、１３Ｃ固体ＮＭＲスペクトルにおいて、
　化学シフト（δ±０．５ｐｐｍ）１５４．７ｐｐｍにピークを有する、化合物１の結晶；
　化学シフト（δ±０．５ｐｐｍ）１４１．１ｐｐｍ，１５４．７ｐｐｍおよび１５８．１ｐｐｍにピークを有する、化合物１の結晶；
　化学シフト（δ±０．５ｐｐｍ）１３４．０ｐｐｍ，１４１．１ｐｐｍ，１５４．７ｐｐｍ，１５８．１ｐｐｍ，および１６５．１ｐｐｍにピークを有する、化合物１の結晶；
　化学シフト（δ±０．５ｐｐｍ）１２．６ｐｐｍ，５５．５ｐｐｍ，１１８．５ｐｐｍ，１３４．０ｐｐｍ，１４１．１ｐｐｍ，１５４．７ｐｐｍ，１５８．１ｐｐｍ，および１６５．１ｐｐｍにピークを有する、化合物１の結晶などを挙げることができる。
　上記記載の１３Ｃ固体ＮＭＲスペクトルにおけるピークは、化合物１の結晶にそれぞれ特有なものであり、当該結晶に特徴的なピークである。
　本明細書において、「化学シフト（δ±０．５ｐｐｍ）１２．６ｐｐｍ，５５．５ｐｐｍ，１１８．５ｐｐｍ，１３４．０ｐｐｍ，１４１．１ｐｐｍ，１５４．７ｐｐｍ，１５８．１ｐｐｍ，および１６５．１ｐｐｍ」とは、「通常の測定条件または本明細書と実質的に同一の条件にて１３Ｃ固体ＮＭＲスペクトル測定を行い、それぞれ、化学シフト（δ±０．５ｐｐｍ）１２．６ｐｐｍ，５５．５ｐｐｍ，１１８．５ｐｐｍ，１３４．０ｐｐｍ，１４１．１ｐｐｍ，１５４．７ｐｐｍ，１５８．１ｐｐｍ，および１６５．１ｐｐｍと実質的に同等なピークを有すること」を意味する。
　「実質的に同等なピークを有する」か否かの判断に際して、一般に、１３Ｃ固体ＮＭＲスペクトルにおける化学シフト（δ）は、±０．５ｐｐｍの範囲内で誤差が生じ得るため、上記の化学シフトの値は、±０．５ｐｐｍ程度の範囲内の数値も含むものとして理解される必要がある。したがって、１３Ｃ固体ＮＭＲスペクトルにおける化学シフトが完全に一致する結晶だけでなく、化学シフトが±０．５ｐｐｍ程度の誤差で一致する結晶も本発明に含まれる。それ故に、本明細書において、例えば、「化学シフト（δ±０．５ｐｐｍ）１２．６ｐｐｍにピークを有する」とは、「化学シフト（δ）１２．１ｐｐｍ～１３．１ｐｐｍにピークを有する」ことを意味し、その他の１３Ｃ固体ＮＭＲスペクトルにおける化学シフトの場合も同様である。また、「図６で示される１３Ｃ固体ＮＭＲスペクトルと実質的に同一の１３Ｃ固体ＮＭＲスペクトルを有する結晶」とは、ある化学シフトのピークを有する１３Ｃ固体ＮＭＲスペクトルが、図６で示される１３Ｃ固体ＮＭＲスペクトルと完全に一致する場合だけでなく、ピーク強度が異なるか、特徴的なピークが化学シフト±０．５ｐｐｍ程度の範囲内で一致する場合も、図６で示される１３Ｃ固体ＮＭＲスペクトルと同一の１３Ｃ固体ＮＭＲスペクトルを有する結晶であることを意味する。したがって、このような１３Ｃ固体ＮＭＲスペクトルを有する結晶は全て、本発明の結晶と同一の結晶であることを意味する。
　以下に、本発明の一実施形態である化合物１の結晶等の製造方法について説明する。
化合物１の製造
　化合物１は、後述する実施例、製造例に記載の方法で合成することができる。
化合物１の結晶の製造方法
　化合物１の結晶は、上述の化合物１の製造方法により製造することができ、または、化合物１を、溶媒中で加熱溶解し、攪拌下冷却して晶析することにより、製造することもできる。
　晶析に使用する化合物１は、どのような形態であってもよく、溶媒和物もしくは水和物または無水物でもよく、非晶質でも結晶質（複数の結晶多形からなるものを含む）でもよく、これらの混合物でもよいが、好ましくは無水物である。
　晶析に使用する溶媒は、例えば、メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール等のアルコール系溶媒；アセトニトリル；Ｎ,Ｎ－ジメチルホルムアミド等のアミド系溶媒；酢酸エチル、酢酸イソプロピル等のエステル系溶媒；ヘキサン、ヘプタン等の飽和炭化水素系溶媒；アセトン、２－ブタノン等のケトン系溶媒；ｔ－ブチルメチルエーテル等のエーテル系溶媒または水を挙げることができる。また、これらの溶媒は単独で使用してもよく、２種以上を混合して使用してもよい。２種以上の溶媒を混合して晶析を行う場合には、例えば、ヘプタン及び１－プロパノールを組み合わせて使用することが好ましい。
　溶媒の使用量は、化合物１が加熱により溶解する量または懸濁液が撹拌可能となる量を下限とし、結晶の収量が著しく低下しない量を上限として適宜選択することができる。
　上記の方法により得られた結晶は単一の結晶形となる。この結晶形は安定であって、容易に他の結晶形や非晶質に転移することがなく、良好な物性を有しており、製剤化にも適している。
　晶析において、種結晶（所望の化合物１の結晶など）を加えても、加えなくてもよい。種結晶を加える際の温度は、特に限定されないが、好ましくは０～１００℃である。
　化合物１を加熱して溶解する場合の温度は、溶媒に応じて化合物１が溶解する温度を適宜選択すればよいが、好ましくは５０℃から再結晶溶媒が還流を開始する温度の範囲であり、より好ましくは６０～１００℃である。
　晶析時の冷却は、急冷すると態様の異なる結晶（多形）を含むものを与えうるので、結晶の品質や粒度等への影響を考慮して適宜冷却速度を調整して実施することが望ましく、好ましくは、例えば５～４０℃／時間の速度での冷却である。より好ましくは、例えば５～２５℃／時間の速度での冷却である。
　また、最終的な晶析温度は、結晶の収量と品質等から適宜選択することができるが、好ましくは－２５～３０℃である。
　晶析した結晶を通常の濾過操作で分離し、必要に応じてろ別した結晶を溶媒で洗浄し、さらにこれを乾燥して、目的の結晶を得ることができる。結晶の洗浄に使用する溶媒には、晶析溶媒と同様のものを使用できる。このような溶媒としては、好ましくは、例えば、エタノール、アセトン、２－ブタノン、酢酸エチル、ジエチルエーテル、ｔ－ブチルメチルエーテル、ヘキサン、ヘプタン等を挙げることができる。また、これらの溶媒は単独で使用してもよく、２種以上を混合して使用してもよい。
　濾過操作で分離した結晶は、適宜、大気下または窒素気流下に放置することにより、または加熱によって乾燥することができる。
　乾燥時間は、残留溶媒が所定の量を下回るまでの時間を製造量、乾燥装置、乾燥温度等に応じて適宜選択すればよい。また、乾燥は通風下でも減圧下でも行うことができる。減圧度は、製造量、乾燥装置、乾燥温度等に応じて適宜選択すればよい。得られた結晶は、乾燥後、必要に応じて大気中に放置することもできる。
　化合物１の結晶に、必要に応じて薬剤学的に許容できる添加物を添加して、医薬組成物を製造することができる。医薬組成物の剤形としては、例えば、経口剤（錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、シロップ剤等）、注射剤（静脈内投与用、筋肉内投与用、皮下投与用、腹腔内投与用等）、外用剤（経皮吸収製剤（軟膏剤、貼付剤等）、点眼剤、点鼻剤、坐剤等）を挙げることができる。
　これらの錠剤、カプセル剤、顆粒剤、粉末等の固形製剤は、通常０．００１～９９．５質量％、好ましくは０．００１～９０質量％の化合物１の結晶を含むことができる。
　経口用固形製剤を製造する場合には、化合物１の結晶に、必要に応じて、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤などを添加し、常法により錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤にすることができる。また、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等は必要に応じてコーティングを施してもよい。
　本発明にかかる医薬の投与量は、通常、症状、年齢、性別、体重等に応じて異なり、所望の効果を奏するのに十分な量であればよい。例えば、成人の場合、１日あたり約０．１～５０００ｍｇ（好ましくは０．５～１０００ｍｇ）が、１日または複数日の間に１回または１日に２～６回に分けて使用される。
　本発明にかかる化合物１の結晶は、例えば以下の製造例および実施例に記載した方法により製造することができる。ただし、これらは例示的なものであって、本発明にかかる化合物の結晶は如何なる場合も以下の具体例に限定されるものではない。
　製造例および実施例中、特に記載がない場合は、シリカゲルカラムクロマトグラフィーに使用している精製用シリカゲルとしては、ＹＭＣ　ＧＥＬ　ＳＩＬＩＣＡ（ＹＭＣ　Ｃｏ．，Ｌｔｄ、カタログコード：ＳＬ０６Ｉ５２Ｗ）を用い、ＮＨシリカゲルカラムクロマトグラフィーに使用している精製用シリカゲルは、ＮＨシリガゲル（Ｆｕｊｉ　Ｓｉｌｙｓｉａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　ＬＴＤ．、カタログコード：ＤＭ２０３５）を用い、ＯＤＳシリカゲルカラムクロマトグラフィーに使用している精製用シリカゲルとしては、ＹＡＭＡＺＥＮ　ＧＥＬ　ＯＤＳ－ＳＭ（ＹＡＭＡＺＥＮ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カタログコード：Ｗ１１３、Ｗ１１６など）を用いた。また、シリカゲル薄層クロマトグラフィーに使用している精製用ＴＬＣプレートは、ＴＬＣ　Ｓｉｌｉｃａ　ｇｅｌ　６０Ｆ２５４（Ｍｅｒｃｋ　ＫＧａＡ、カタログコード：１．０５７１５．０００１）を用い、ＮＨシリカゲル薄層クロマトグラフィーに使用している精製用ＴＬＣプレートは、ＮＨ　ＳＩＬＩＣＡ　ＧＥＬ　ＴＬＣプレート（Ｆｕｊｉ　Ｓｉｌｙｓｉａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　ＬＴＤ．、カタログコード：Ｔ０５０９０８）を用いた。
　本明細書で用いられる略号は以下のとおりである。
　ＮＭＰ：Ｎ－メチルピロリジノン
　ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
　ＨＡＴＵ：Ｏ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウム　ヘキサフルオロフォスフェート
　ＨＢＴＵ：Ｏ－（ベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウム　ヘキサフルオロフォスフェート
　ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
　ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド
　ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
１Ｈ－ＮＭＲ（プロトン核磁気共鳴）スペクトルの化学シフトは、テトラメチルシランに対するδ単位（ｐｐｍ）で記録され、カップリング定数はヘルツ（Ｈｚ）で記録されている。分裂パターンの略号は以下の通りである。ｓ：シングレット、ｄ：ダブレット、ｔ：トリプレット、ｑ：カルテット、ｍ：マルチプレット、ｂｒ：ブロード。
［実施例１］
（６Ｓ，９ａＳ）－Ｎ－ベンジル－８－（｛６－［３－（４－エチルピペラジン－１－イル）アゼチジン－１－イル］ピリジン－２－イル｝メチル）－６－（２－フルオロ－４－ヒドロキシベンジル）－４，７－ジオキソ－２－（プロプ－２－エン－１－イル）ヘキサヒドロ－２Ｈ－ピラジノ［２，１－ｃ］［１，２，４］トリアジン－１（６Ｈ）－カルボキサミド
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
　製造例１－１－６に記載の（６Ｓ，９ａＳ）－Ｎ－ベンジル－６－（（２－フルオロ－４－ヒドロキシフェニル）メチル）－８－（（６－フルオロピリジン－２－イル）メチル）－４，７－ジオキソ－２－（プロプ－２－エン－１－イル）－オクタヒドロ－１Ｈ－ピラジノ［２，１－ｃ］［１，２，４］トリアジン－１－カルボキサミド（３９７ｍｇ、０．６８９ｍｍｏｌ）とＮＭＰ（１０ｍＬ）の混合溶液に、室温で製造例１－３－２に記載の１－（アゼチジン－３－イル）－４－エチルピペラジンとベンジルベンゼンの混合物（１．１６ｇ）を加え、１４０℃にて１２時間マイクロウェーブ照射した。室温まで冷却した後、反応混合物に水を加え、酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過した。溶媒を減圧下留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（メタノール）で精製した後、更にＮＨシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：メタノール＝２０：１）で精製し、標記化合物（４０２ｍｇ、収率：８０％）を得た。
1H-NMR Spectrum (400 MHz, CDCl3)δ (ppm): 1.00(3H, t, J=6.8 Hz), 2.10-2.65(10H, m), 3.10-3.21(2H, m),3.41-3.74(8H, m), 3.84-3.89(1H, m), 3.95-4.05(2H, m), 4.17-4.23(2H, m),4.51(1H, dd, J=6.8 Hz, 15.6 Hz), 4.95(1H, d, J=13.6 Hz), 5.20-5.30(3H, m),5.50-5.60(1H, m), 5.70-5.80(1H, m), 5.82-5.87(1H, m), 6.24(1H, d, J=8.0 Hz),6.41(1H, dd, J=2.0 Hz, 11.2 Hz), 6.47(1H, dd, J=8.8 Hz, 8.8 Hz), 6.69(1H, d,J=7.2 Hz), 6.80-6.86(1H, m), 7.20-7.31(3H, m), 7.35-7.46(3H, m).
ESI-MS(m/z): 726.57 [M+H]+.
［製造例１－１－１］（２，２－ジエトキシエチル）（（６－フルオロピリジン－２－イル）メチル）アミン
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
　市販の２，２－ジエトキシエタン－１－アミン（９２６μＬ、６．３９ｍｍｏｌ）とＴＨＦ（１０．０ｍＬ）、酢酸（１．００ｍＬ）の混合溶液に、室温で市販の６－フルオロピリジン－２－カルバルデヒド（８００ｍｇ、６．３９ｍｍｏｌ）を加え、室温で２５分撹拌した。続いて、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（２．７１ｇ、１２．８ｍｍｏｌ）を室温で加え、１時間１０分撹拌した。反応混合物に炭酸水素ナトリウムと水を加えて反応を止め、酢酸エチルで抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過した。溶媒を減圧下留去し、得られた残渣をＮＨシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘプタン：酢酸エチル＝１：１）で精製した後、更にシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：メタノール＝２０：１）で精製し、標記化合物（１．１４ｇ、収率：７４％）を得た。
1H-NMR Spectrum (400 MHz, CDCl3)δ (ppm): 1.22(6H, t, J=7.2 Hz), 2.76(2H, d, J=5.5 Hz), 3.50-3.61(2H, m),3.65-3.76(2H, m), 3.89(2H, s), 4.64(1H, t, J=5.5 Hz), 6.80(1H, dd, J=2.8 Hz,8.2 Hz), 7.22(1H, dd, J=2.4 Hz, 7.3 Hz), 7.74(1H, q, J=7.9 Hz).
［製造例１－１－２］９Ｈ－フルオレン－９－イルメチル　Ｎ－（（１Ｓ）－２－（４－（ベンジルオキシ）－２－フルオロフェニル）－１－（２，２－ジエトキシエチル）（（６－フルオロピリジン－２－イル）メチル）カルバモイル）エチル）カーバメート
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　製造例１－１－１に記載の（２，２－ジエトキシエチル）（（６－フルオロピリジン－２－イル）メチル）アミン（３．５０ｇ、１４．４ｍｍｏｌ）とジクロロメタン（２５ｍＬ）の混合溶液に、室温で製造例１－２－７に記載の（２Ｓ）－３－（４－（ベンジルオキシ）－２－フルオロフェニル）－２－（（（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ）カルボニル）アミノ）プロパノイック　アシッド（７．７６ｇ、１５．１ｍｍｏｌ）、Ｎ－メチルモルホリン（２．０６ｍＬ、１８．７ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（６．０４ｇ、１５．８ｍｍｏｌ）を加え、室温で１３時間撹拌した。反応混合物に炭酸水素ナトリウムと水を加え、ジクロロメタンで抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過した。溶媒を減圧下留去し、標記化合物の粗体（１４．４ｇ）を得た。これ以上精製することなく、次の反応に用いた。
ESI-MS(m/z): 758.50 [M+Na]+.
［製造例１－１－３］（２Ｓ）－２－アミノ－３－（４－（ベンジルオキシ）－２－フルオロフェニル）－Ｎ－（２，２－ジエトキシエチル）－Ｎ－（（６－フルオロピリジン－２－イル）メチル）プロパンアミド
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　製造例１－１－２に記載の９Ｈ－フルオレン－９－イルメチル　Ｎ－（（１Ｓ）－２－（４－（ベンジルオキシ）－２－フルオロフェニル）－１－（（２，２－ジエトキシエチル）（（６－フルオロピリジン－２－イル）メチル）カルバモイル）エチル）カーバメート（１４．４ｇ）とＴＨＦ（３０ｍＬ）の混合溶液に、室温でジエチルアミン（５．２７ｍＬ、５０．４ｍｍｏｌ）を加え、室温で２時間撹拌した。反応混合物を減圧下濃縮し、残渣にメタノール、水、ヘプタンを加え分配した。水層をヘプタンで洗浄した後、減圧下濃縮した。残渣に水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過した。溶媒を減圧下留去し、得られた残渣をＮＨシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘプタン：酢酸エチル＝１：１ついで酢酸エチル）で精製し、標記化合物（６．８７ｇ、収率：９３％）を得た。
ESI-MS(m/z): 514.32 [M+H]+.
［製造例１－１－４］（２Ｓ）－２－（２－（（（ベンジルカルバモイル）アミノ）（プロプ－２－エン－１－イル）アミノ）アセトアミド）－３－（４－（ベンジルオキシ）－２－フルオロフェニル）－Ｎ－（２，２－ジエトキシエチル）－Ｎ－（（６－フルオロピリジン－２－イル）メチル）プロパンアミド
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　製造例１－１－３に記載の（２Ｓ）－２－アミノ－３－（４－（ベンジルオキシ）－２－フルオロフェニル）－Ｎ－（２，２－ジエトキシエチル）－Ｎ－（（６－フルオロピリジン－２－イル）メチル）プロパンアミド（４．８７ｇ、９．４８ｍｍｏｌ）とジクロロメタン（１００ｍＬ）の混合溶液に、ＷＯ２００９／１４８１９２に記載の２－（（（ベンジルカルバモイル）アミノ）（プロプ－２－エン－１－イル）アミノ）アセティック　アシッド（２．６２ｇ、９．９５ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（２．６４ｍＬ、１９．０ｍｍｏｌ）及びＨＢＴＵ（３．９６ｇ、１０．４ｍｍｏｌ）を室温で加え、室温で１時間撹拌した。反応混合物を減圧下濃縮し、得られた残渣をＮＨシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチルついで酢酸エチル：メタノール＝３０：１）で精製し、標記化合物（７．２８ｇ、収率：定量的）を得た。
ESI-MS(m/z): 759.43 [M+H]+.
［製造例１－１－５］（６Ｓ，９ａＳ）－Ｎ－ベンジル－６－（（４－（ベンジルオキシ）－２－フルオロフェニル）メチル）－８－（（６－フルオロピリジン－２－イル）メチル）－４，７－ジオキソ－２－（プロプ－２－エン－１－イル）－オクタヒドロ－１Ｈ－ピラジノ［２，１－ｃ］［１，２，４］トリアジン－１－カルボキサミド
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
　製造例１－１－４に記載の（２Ｓ）－２－（２－（（（ベンジルカルバモイル）アミノ）（プロプ－２－エン－１－イル）アミノ）アセトアミド）－３－（４－（ベンジルオキシ）－２－フルオロフェニル）－Ｎ－（２，２－ジエトキシエチル）－Ｎ－（（６－フルオロピリジン－２－イル）メチル）プロパンアミド（７．２８ｇ、９．４８ｍｍｏｌ）とギ酸（５０ｍＬ）の混合溶液を室温で１５時間１５分撹拌した。反応混合物を減圧下濃縮し、残渣にアンモニア水溶液を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過した。溶媒を減圧下留去し、得られた残渣をＮＨシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘプタン：酢酸エチル＝１：１）で精製し、標記化合物（５．０４ｇ、収率：８０％）を得た。
ESI-MS(m/z): 667.39 [M+H]+.
［製造例１－１－６］（６Ｓ，９ａＳ）－Ｎ－ベンジル－６－（（２－フルオロ－４－ヒドロキシフェニル）メチル）－８－（（６－フルオロピリジン－２－イル）メチル）－４，７－ジオキソ－２－（プロプ－２－エン－１－イル）－オクタヒドロ－１Ｈ－ピラジノ［２，１－ｃ］［１，２，４］トリアジン－１－カルボキサミド
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
　製造例１－１－５に記載の（６Ｓ，９ａＳ）－Ｎ－ベンジル－６－（（４－（ベンジルオキシ）－２－フルオロフェニル）メチル）－８－（（６－フルオロピリジン－２－イル）メチル）－４，７－ジオキソ－２－（プロプ－２－エン－１－イル）－オクタヒドロ－１Ｈ－ピラジノ［２，１－ｃ］［１，２，４］トリアジン－１－カルボキサミド（５．０４ｇ、７．５６ｍｍｏｌ）とＴＦＡ（２０ｍＬ）の混合溶液に、室温でチオアニソール（３．５５ｍＬ、３０．２ｍｍｏｌ）を加え、室温で１３時間５０分撹拌した。反応混合物を減圧下濃縮し、残渣に炭酸水素ナトリウムと水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過した。溶媒を減圧下留去し、得られた残渣をＮＨシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：メタノール＝２０：１）で精製し、標記化合物（４．３４ｇ、収率：定量的）を得た。
ESI-MS(m/z): 577.31 [M+H]+.
［製造例１－２－１］メチル　（２Ｓ）－２－（（（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ）カルボニル）アミノ）－３－ヒドロキシプロパノエート
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　市販のＬ－セリン　メチルエステル　塩酸塩（１０．０ｇ、６４．３ｍｍｏｌ）と１，４－ジオキサン（１５ｍＬ）、水（９０ｍＬ）の混合溶液に、室温で炭酸水素ナトリウム（１０．８ｇ、１２９ｍｍｏｌ）を加え、室温で１５分撹拌した。続いて、室温で２，５－ジオキソピロリジン－１－イル　９Ｈ－フルオレン－９－イルメチル　カルボネート（２１．７ｇ、６４．３ｍｍｏｌ）の１，４－ジオキサン（６０ｍＬ）溶液を加え、室温で１４時間撹拌した。反応混合物に水を加え、酢酸エチルで３回抽出し、合わせた有機層を水及び飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過した。溶媒を減圧下留去し、得られた残渣にジエチルエーテル及びヘプタンを加え、析出した固体をろ取し、標記化合物（２２．３ｇ、収率：定量的）を得た。
1H-NMR Spectrum (400 MHz, CDCl3)δ (ppm): 2.00-2.15(1H, m), 3.81(3H, s), 3.89-4.07(2H, m), 4.20-4.28(1H, m),4.39-4.53(3H, m), 5.63-5.74(1H, m), 7.29-7.37(2H, m), 7.38-7.46(2H, m),7.55-7.65(2H, m), 7.74-7.82(2H, m).
［製造例１－２－２］メチル　（２Ｓ）－２－（（（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ）カルボニル）アミノ）－３－（（（４－メチルベンゼン）スルホニル）オキシ）プロパノエート
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
　製造例１－２－１に記載のメチル　（２Ｓ）－２－（（（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ）カルボニル）アミノ）－３－ヒドロキシプロパノエート（５．００ｇ、１４．６ｍｍｏｌ）とピリジン（２５ｍＬ）の混合溶液に、０℃で４－ジメチルアミノピリジン（１８．０ｍｇ、０．１４６ｍｍｏｌ）、ｐ－トルエンスルホニル　クロリド（５．５８ｇ、２９．３ｍｍｏｌ）を加え、０℃で７時間撹拌した。反応混合物に水を加え、酢酸エチルで２回抽出した。合わせた有機層を１Ｎ塩酸で３回、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、および飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過した。溶媒を減圧下留去し、得られた残渣に酢酸エチル、ジエチルエーテルおよびヘプタンを加え、析出した固体をろ取し、標記化合物（６．２０ｇ、収率：８５％）を得た。
1H-NMR Spectrum (400 MHz, CDCl3)δ (ppm): 2.37(3H, s), 3.74(3H, s), 4.16-4.23(1H, m), 4.23-4.31(1H, m),4.32-4.40(2H, m), 4.41-4.48(1H, m), 4.54-4.62(1H, m), 5.63-5.66(1H, m),7.26-7.37(4H, m), 7.38-7.45(2H, m), 7.56-7.64(2H, m), 7.72-7.81(4H, m).
［製造例１－２－３］メチル　（２Ｒ）－２－（（（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ）カルボニル）アミノ）－３－ヨードプロパノエート
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
　製造例１－２－２に記載のメチル　（２Ｓ）－２－（（（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ）カルボニル）アミノ）－３－（（（４－メチルベンゼン）スルホニル）オキシ）プロパノエート（６．２０ｇ、１２．５ｍｍｏｌ）とアセトン（５０ｍＬ）の混合溶液に、室温でヨウ化ナトリウム（９．３８ｇ、６２．６ｍｍｏｌ）を加え、室温で９０時間５０分撹拌した。反応混合物をろ過し、ろ液を減圧下濃縮した。残渣に水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を水、飽和チオ硫酸ナトリウム水溶液、および飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過した。溶媒を減圧下留去し、得られた残渣にジエチルエーテルおよびヘプタンを加え、析出した固体をろ取し、標記化合物（３．８２ｇ、収率：６８％）を得た。
1H-NMR Spectrum (400 MHz, CDCl3)δ (ppm): 3.55-3.66(2H, m), 3.84(3H, s), 4.20-4.30(1H, m), 4.35-4.48(2H, m),4.56-4.62(1H, m), 5.63-5.72(1H, m), 7.30-7.37(2H, m), 7.38-7.45(2H, m), 7.62(2H,d, J=7.2 Hz), 7.78(2H, d, J=7.5 Hz).
［製造例１－２－４］４－（ベンジルオキシ）－１－ブロモ－２－フルオロベンゼン
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
　市販の４－ブロモ－３－フルオロフェノール（１５．０ｇ、７８．５ｍｍｏｌ）とＤＭＦ（３０ｍＬ）の混合溶液に、室温で炭酸カリウム（２１．７ｇ、１５７ｍｍｏｌ）、ベンジルブロミド（１０．２ｍＬ、８６．４ｍｍｏｌ）を加え、室温で２０分撹拌した後に、７０℃で４０分撹拌した。反応混合物を室温に冷却した後、水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を水および飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過した。溶媒を減圧下留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘプタン：酢酸エチル＝５：１）で精製し、標記化合物（２２．７ｇ、収率：定量的）を得た。
1H-NMR Spectrum (400 MHz, CDCl3)δ (ppm): 5.04(2H, s), 6.65-6.72(1H, m), 6.75-6.80(1H, m), 7.30-7.45(6H, m).
［製造例１－２－５］４－（ベンジルオキシ）－２－フルオロ－１－ヨードベンゼン
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
　製造例１－２－４に記載の４－（ベンジルオキシ）－１－ブロモ－２－フルオロベンゼン（１８７ｇ、６６５ｍｍｏｌ）と１，４－ジオキサン（３００ｍＬ）の混合溶液に、室温でヨウ化銅（Ｉ）（１２．６ｇ、６６．１ｍｍｏｌ）、ヨウ化ナトリウム（２００ｇ、１．３３ｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ’－ジメチルエチレンジアミン（１４．０ｍＬ、１３２ｍｍｏｌ）を加え、窒素雰囲気下、１１０～１１５℃にて１９時間撹拌した。反応混合物を室温に冷却した後、水と酢酸エチルを加え、セライトを用いてろ過し、ろ液を分配した。得られた水層を酢酸エチルで抽出した。得られた有機層を合わせ、シリカゲルを敷いたグラスフィルターでろ過した。シリカゲルを酢酸エチルで洗浄し、得られた有機層を合わせ、溶媒を減圧下留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘプタン：酢酸エチル＝７：１ついで４：１）で精製し、標記化合物（１９５ｇ、収率：８９％）を得た。
1H-NMR Spectrum (400 MHz, CDCl3)δ (ppm): 5.04(2H, s), 6.57-6.62(1H, m), 6.73(1H, dd, J=2.8Hz, 10.0 Hz),7.31-7.43(5H, m), 7.55-7.60(1H, m).
［製造例１－２－６］メチル　（２Ｓ）－３－（４－（ベンジルオキシ）－２－フルオロフェニル）－２－（（（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ）カルボニル）アミノ）プロパノエート
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
　亜鉛粉末（５１．６ｇ、７８９ｍｍｏｌ）を１Ｎ塩酸（１００ｍＬ）に加え、超音波振動にかけた後、静止させ上澄み液を除いた。この操作を２回行った。得られた亜鉛の残渣に水（３００ｍＬ）を加え、攪拌した後、静止させ上澄み液を除く操作を３回行った。更にアセトン（３００ｍＬ）を加え、攪拌した後、静止させ上澄み液を除き、続いてジエチルエーテル（３００ｍＬ）を加え、攪拌した後、静止させ上澄み液を除き、残渣を減圧下乾燥させ、活性化亜鉛を得た。この活性化亜鉛に、窒素雰囲気下、室温でＤＭＦ（１２０ｍＬ）、ヨウ素（３．３６ｇ、１３．２ｍｍｏｌ）を加え、室温で４５分撹拌した。反応混合物に、窒素雰囲気下、室温で製造例１－２－３に記載のメチル　（２Ｒ）－２－（（（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ）カルボニル）アミノ）－３－ヨードプロパノエート（１２０ｇ、２６６ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（５００ｍＬ）溶液を３０分かけて加え、室温で４０分間撹拌した。窒素雰囲気下、室温で反応混合物に、製造例１－２－５に記載の４－（ベンジルオキシ）－２－フルオロ－１－ヨードベンゼン（１０４ｇ、３１８ｍｍｏｌ）、トリス（ジベンジリデンアセトン）パラジウム（０）（６．００ｇ、６．５５ｍｍｏｌ）、２－ジシクロヘキシルホスフィノ－２’，６’－ジメトキシビフェニル（５．４０ｇ、１３．２ｍｍｏｌ）を加え、室温で２０時間４０分撹拌した。反応混合物に水と酢酸エチルを加え、セライトを用いてろ過した。ろ液を分配し、更に水層を酢酸エチルで３回抽出した。合わせた有機層を水および飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過した。溶媒を減圧下留去し、得られた残渣にジエチルエーテル（１．００Ｌ）、ヘプタン（１．００Ｌ）を加え、析出した固体をろ取した。ろ取した固体にジエチルエーテル（５００ｍＬ）、ヘプタン（５００ｍＬ）を加え、析出した固体をろ取し、標記化合物（１０７ｇ、収率：７７％）を得た。
1H-NMR Spectrum (400 MHz, CDCl3)δ (ppm): 3.03-3.20(2H, m), 3.75(3H, s), 4.20(1H, t, J=6.6 Hz), 4.25-4.38(1H,m), 4.43(1H, dd, J=7.1 Hz, 10.4 Hz), 4.58-4.70(1H, m), 4.99(2H, s), 5.33(1H, d,J=8.4 Hz), 6.63-6.72(2H, m), 6.94-7.03(1H, m), 7.26-7.48(9H, m), 7.52-7.62(2H,m), 7.77(2H, d, J=7.7 Hz).
［製造例１－２－７］（２Ｓ）－３－（４－（ベンジルオキシ）－２－フルオロフェニル）－２－（（（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ）カルボニル）アミノ）プロパノイック　アシッド
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
　製造例１－２－６に記載のメチル　（２Ｓ）－３－（４－（ベンジルオキシ）－２－フルオロフェニル）－２－（（（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシ）カルボニル）アミノ）プロパノエート（６０．０ｇ、１１４ｍｍｏｌ）と酢酸エチル（１３３１ｍＬ）の混合溶液に、室温でヨウ化リチウム（９２．０ｇ、６８５ｍｍｏｌ）を加え、加熱還流下２３時間４５分撹拌した。反応混合物を０℃に冷却し、析出した固体をろ取した。得られた固体に１Ｎ塩酸（２２８ｍＬ）を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過した。溶媒を減圧下留去し、標記化合物（４２．２ｇ、収率：７２％）を得た。
1H-NMR Spectrum (400 MHz, CDCl3)δ (ppm): 3.05-3.15(1H, m), 3.18-3.30(1H, m), 4.15-4.23(1H, m), 4.25-4.50(2H, m),4.60-4.70(1H, m), 4.99(2H, m), 5.29(1H, d, J=7.6 Hz), 6.64-6.73(2H, m),7.06(1H, dd, J=8.0, 9.6 Hz), 7.24-7.44(9H, m), 7.55(2H, dd, J=6.4, 6.4 Hz),7.76(2H, d, J=7.6 Hz).
ESI-MS(m/z): 512.30 [M+H]+.
［製造例１－３－１］１－（１－（ジフェニルメチル）アゼチジン－３－イル）－４－エチルピペラジン
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
　市販の１－（ジフェニルメチル）アゼチジン－３－オン（１０．１ｇ、４２．６ｍｍｏｌ）とＴＨＦ（１００ｍＬ）、酢酸（５．００ｍＬ）の混合溶液に、室温でエチルピペラジン（６．４８ｍＬ、５１．１ｍｍｏｌ）を加え、室温で４５分間撹拌した。反応混合物に、室温でトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（１８．１ｇ、８５．１ｍｍｏｌ）を加え、室温で１５時間撹拌した。反応混合物に炭酸水素ナトリウム、水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過した。溶媒を減圧下留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル～メタノール）で精製した後、ＮＨシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘプタン：酢酸エチル＝２：１ついで１：１）で精製し、標記化合物（１２．７ｇ、収率：８９％）を得た。
1H-NMR Spectrum (400 MHz, CDCl3)δ (ppm): 1.07(3H, t, J=7.6 Hz), 2.20-2.65(10H, m), 2.85-2.93(2H, m),2.95-3.05(1H, m), 3.35-3.45(2H, m), 4.41(1H, s), 7.15-7.20(2H, m),7.23-7.29(4H, m), 7.37-7.42(4H, m).
［製造例１－３－２］１－（アゼチジン－３－イル）－４－エチルピペラジン
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
　製造例１－３－１に記載の１－（１－（ジフェニルメチル）アゼチジン－３－イル）－４－エチルピペラジン（１２．７ｇ、３７．９ｍｍｏｌ）とメタノール（５０ｍＬ）の混合溶液に、室温で水酸化パラジウム－炭素（５．００ｇ）を加え、水素雰囲気下、室温、０．３５ＭＰａ～０．４０ＭＰａで１０時間撹拌した。反応混合物を窒素雰囲気に置換した後、セライトを用いてろ過した。ろ液を減圧下濃縮し、標記化合物をベンジルベンゼンとの混合物（１２．４ｇ）として得た。これ以上精製することなく、次の反応に用いた。
1H-NMR Spectrum (400 MHz, CDCl3)δ (ppm): 1.09(3H, t, J=7.2 Hz), 2.10-2.80(10H, m), 3.20-3.30(1H, m),3.53-3.60(2H, m), 3.60-3.70(2H, m).
［実施例２］
（６Ｓ，９ａＳ）－Ｎ－ベンジル－８－（｛６－［３－（４－エチルピペラジン－１－イル）アゼチジン－１－イル］ピリジン－２－イル｝メチル）－６－（２－フルオロ－４－ヒドロキシベンジル）－４，７－ジオキソ－２－（プロプ－２－エン－１－イル）ヘキサヒドロ－２Ｈ－ピラジノ［２，１－ｃ］［１，２，４］トリアジン－１（６Ｈ）－カルボキサミドの結晶
　実施例１に記載の（６Ｓ，９ａＳ）－Ｎ－ベンジル－８－（｛６－［３－（４－エチルピペラジン－１－イル）アゼチジン－１－イル］ピリジン－２－イル｝メチル）－６－（２－フルオロ－４－ヒドロキシベンジル）－４，７－ジオキソ－２－（プロプ－２－エン－１－イル）ヘキサヒドロ－２Ｈ－ピラジノ［２，１－ｃ］［１，２，４］トリアジン－１（６Ｈ）－カルボキサミド（１５０ｍｇ）に酢酸イソプロピル（１．５ｍＬ）を加え８５℃で１時間、さらに室温で終夜攪拌した。得られた懸濁物を濾取し、４℃に冷却した酢酸イソプロピルで洗浄した後、４５℃で減圧乾燥し、白色固体を１４１．２ｍｇ得た。得られた固体のうち１００ｍｇに１－プロパノール（０．４ｍＬ）を加え９５℃で加熱溶解した。１－プロパノール（０．１ｍＬ）を追加し、室温で攪拌した。得られた懸濁物にヘプタン（１．５ｍＬ）を室温で加えた。懸濁物を濾取し、４℃に冷却したヘプタンで洗浄した後、４５℃で減圧乾燥し、標記化合物を９２．１ｍｇ得た。
1H-NMR(600 MHz, CD3OD) δ (ppm): 1.15 (t, J=7 Hz, 3 H), 2.0-3.1 (br, 8 H),3.13 (dd, J=14, 7 Hz, 1 H), 3.32 (m, 1 H), 3.33 (m, 1 H), 3.44 (dd, J=14, 5 Hz,1 H), 3.46 (d, J=17 Hz, 1 H), 3.54 (dd, J=12, 4 Hz, 1 H), 3.62 (dd, J=13, 6 Hz,1 H), 3.69 (dd, J=13, 7 Hz, 1 H), 3.79 (dd, J=8, 5 Hz, 1 H), 3.86 (dd, J=8, 6Hz, 1 H), 3.89 (t, J=11 Hz, 1 H), 4.03 (t, J=8 Hz, 1 H), 4.06 (t, J=8 Hz, 1 H),4.25 (d, J=15 Hz, 1 H), 4.33 (d, J=16 Hz, 1 H), 4.41 (d, J=16 Hz, 1 H), 4.77(d, J=16Hz, 1 H), 5.12 - 5.18 (m, 2H), 5.27 (dd, J=7, 5 Hz, 1 H), 5.84 (m, 2H), 6.30 (d, J=8 Hz, 1 H), 6.38 (m, 1 H), 6.40 (m,1 H), 6.51 (d, J=8 Hz, 1 H),6.88 (dd, J=9, 8 Hz, 1 H), 7.25 (dd, J=8, 7 Hz, 1 H), 7.28 (d, J=8 Hz, 2 H),7.34 (dd, J=8, 7 Hz, 2 H), 7.47 (dd, J=8, 8 Hz, 1 H)
試験例１：Ｗｎｔシグナルの検出
　ｐｃＤＮＡ３．１（＋）（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＮｏｔＩを用いて切断し、以下に示す配列を有するアダプターＢＥＨＫＳ（制限酵素サイトＢｇｌＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＫｐｎＩ、ＳａｃＩおよびＮｏｔＩを含む）を挿入することにより、プラスミドｐＮｅｏ－ＨＫＳを作製した。
ＢＥＨＫＳ－Ｆ　　５’－ｇａｔｃｔｇａａｔｔｃａａｇｃｔｔｃｔｃｇａｇｇｇｔａｃｃｔｃｔａｇａｇａｇｃｔｃｇｃ－３’　　（配列番号１）
ＢＥＨＫＳ－Ｒ　　５’－ｇｇｃｃｇｃｇａｇｃｔｃｔｃｔａｇａｇｇｔａｃｃｃｔｃｇａｇａａｇｃｔｔｇａａｔｔｃａ－３’　　（配列番号２）
　次に、ＴＯＰｇｌｏｗ／ＦＯＰｇｌｏｗ　ＴＣＦ　Ｒｅｐｏｒｔｅｒ　Ｋｉｔ（ｕｐｓｔａｔｅ　Ｃａｔａｌｏｇ＃１７－３６６）に含まれるＴＯＰｇｌｏｗプラスミドから、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＫｐｎＩを用いて切断した約２７００ｂｐフラグメント（Ｗｎｔ応答性配列およびルシフェラーゼ遺伝子を含む）を、ｐＮｅｏ－ＨＫＳのＨｉｎｄＩＩＩ－ＫｐｎＩ間へ挿入してプラスミドｐＮｅｏ－ＴＯＰを作製した。ヒト胎児由来腎臓細胞株ＨＥＫ２９３にプラスミドｐＮｅｏ－ＴＯＰを導入し、Ｇ４１８を用いて化合物を選択した後、限界希釈法により細胞クローン株を樹立した。本細胞クローン株をＷｎｔシグナル検出試験に供した。
　本細胞クローン株は、１０％ＦＢＳを含むＤ－ＭＥＭ　高グルコース培地（和光純薬工業（株）製）で継代培養し、試験には増殖期の細胞を使用した。トリプシン－ＥＤＴＡを用いて細胞を回収後、細胞数を計測して２×１０５個／ｍＬになるように１０％ＦＢＳを含むＤ－ＭＥＭ　高グルコース培地に懸濁した。その細胞懸濁液を細胞培養用９６ウェルプレート（グライナー社製、製品番号６５５０８３）に０．１ｍＬ／ｗｅｌｌ加え、５％ＣＯ２インキュベーター中（３７℃）で一晩培養した。培養後、ＤＭＳＯで溶解した被検物質を１０％ＦＢＳおよび８０ｍＭ　ＬｉＣｌを含むＤ－ＭＥＭ　高グルコース培地で希釈して被検溶液を得た。上記被検溶液０．１ｍＬを各ウェルに添加し、５％ＣＯ２インキュベーター中（３７℃）で培養した。被検溶液添加してから６時間後に各ウェルの上清を取り除き、５０μＬのＢｒｉｇｈｔ－ＧｌｏＴＭ　Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、製品番号Ｅ２６２０）を添加した。そのプレートをプレートミキサーに数秒かけた後に、ＥｎＶｉｓｉｏｎＴＭ　Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌプレートリーダー（パーキンエルマー社製）を用いて各ウェルの発光を測定した。被検溶液を添加せず、ＬｉＣｌを添加したウェルの発光度を１００％のＷｎｔシグナル活性として、また、被検物質およびＬｉＣｌのどちらも添加していないウェルの発光度を０％のＷｎｔシグナル活性として、各ウェルのＷｎｔシグナル活性率（％）を求め、被検物質のＷｎｔシグナル活性を５０％阻害するのに必要な濃度（ＩＣ５０）を算出した。実施例１化合物のＩＣ５０は、０．０６μＭであった。
試験例２：ＡＰＣＭｉｎ／＋マウスの小腸ポリープ抑制作用
　Ｗｎｔシグナルの分解制御因子であるＡＰＣ遺伝子（Ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ　ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ　ｃｏｌｉ　ｇｅｎｅ）は大腸癌抑制遺伝子と呼ばれ、ヒト家族性大腸腺腫症の原因遺伝子にもなっている。ＡＰＣ遺伝子に変異が生じると、大腸粘膜細胞は無秩序な異常増殖を開始し、前癌病変とも言うべき大腸ポリープを形成する。このように大腸癌発生プロセスの初期段階において重要な役割を担っていることが知られている。
　このＡＰＣ遺伝子の突然変異マウス（ＡＰＣＭｉｎ／＋マウス）は、家族性大腸腺腫症患者と同様に腸管に多くのポリープを発症し、ＷＮＴシグナルに基づく大腸がんの発癌や浸潤のメカニズムの解明に有用であり、大腸癌の予防、診断、治療の研究に使われているスタンダードモデルとなっている。ＡＰＣＭｉｎ／＋マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ－ＡＰＣ＜Ｍｉｎ＞／Ｊ　Ｈｅｔｅｒｏ、雌、株式会社サンプラネットにて生産）の群分けは、投与初日の当該マウスの体重の平均値がほぼ等しくなるようにして、行った。被験物質（実施例１化合物）を０．１Ｎ　ＨＣｌで投与濃度となるように溶解し、４℃の冷蔵庫内で保管して、評価検体を得た。コントロール（Ｖｅｈｉｃｌｅ）群には、投与用溶媒のみを評価検体として用いた。評価検体は５０ｍｇ／ｋｇおよび７５ｍｇ／ｋｇの投与容量で１日２回４日連続して経口投与した後、３日間の休薬期間を設けることを１サイクルとし、計１６日間（４日間×４サイクル）投与した。なお、実験は１群６－７匹のマウスを用いて行った。コントロール群、被験物質投与群それぞれに対し、初日の体重に対する最終日の体重の値（ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｂｏｄｙ　ｗｅｉｇｈｔ：　ＲＢＷ）を算出した。被験物質投与群のＲＢＷ／コントロール群のＲＢＷが０．８以上の被験物質投与群を安全に投与可能な群と判定した。これに該当する被験物質投与群について、最終日（投与初日から２５日目）におけるコントロールのポリープ数に対する被験物質投与後のポリープ数の実数および標準誤差を図１に示した。なお、ポリープは小腸と結腸に形成したものをカウントした。コントロール群に対する被験物質投与群の統計解析（Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ　ｔｅｓｔ）を行い、Ｐ値を記載した。
試験例３：ヒトＫ５６２皮下移植モデルにおける抗腫瘍効果
　１０％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ－１６４０培養液で培養したヒト慢性骨髄性白血病細胞株Ｋ５６２をＰＢＳ（和光純薬工業株式会社　Ｃａｔ＃０４５－２９７９５）にて２×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ濃度に調製したものと、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（ＢＤバイオサイエンス　Ｃａｔ＃　３５４２３４）とを１：１で混合し、１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞懸濁液を調製した。得られた細胞懸濁液を、６週齢のヌードマウス（ＣＡｎＮ．Ｃｇ－Ｆｏｘｎ１ｎｕ／ＣｒｌＣｒｌｊ、雌、日本チャールス・リバー株式会社）の右脇腹皮下部に１００μＬの用量で移植した。移植から７日後に電子デジタルノギス（デジマチックＴＭキャリパ、株式会社ミツトヨ）を用いて腫瘍の短径、長径を計測し、以下の計算式で腫瘍体積を算出した。
腫瘍体積（ｍｍ３）＝長径（ｍｍ）×短径（ｍｍ）×短径（ｍｍ）／２
　ヌードマウスの群分けは、投与初日の腫瘍体積をもとに腫瘍体積の平均値がほぼ等しくなるようにして、行った。被験物質（実施例１化合物）を０．１Ｎ　ＨＣｌに溶解し、１０ｍＬ／ｋｇの投与用量となるように調製し、評価検体を得た。また、Ｄａｓａｔｉｎｉｂ，Ｆｒｅｅ　Ｂａｓｅ（ＬＣ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｄ－３３０７）を、１０ｍＬ／ｋｇの投与用量となるように、大塚蒸留水（大塚製薬株式会社、　Ｃａｔ＃１３２４）とＰＲＯＰＹＬＥＮＥ　ＧＬＹＣＯＬ（和光純薬工業株式会社、Ｃａｔ＃１６４－０４９９６）の１：１溶液に溶解し、Ｄａｓａｔｉｎｉｂ投与液を調製した。評価検体は１日２回（ｂｉｄ）で投与初日より５日間連続して経口投与を行った。Ｄａｓａｔｉｎｉｂ投与液は１日１回（ｑｄ）５日間連続して経口投与した後、２日間の休薬期間を設けることを１サイクルとし、合計２サイクル投与した。コントロール群は無投与とした。なお、実験は１群９－１０匹のマウスを用いて行った。コントロール群、被験物質単独投与群、Ｄａｓａｔｉｎｉｂ単独投与群、ならびに、被験物質およびＤａｓａｔｉｎｉｂ併用投与群（以下、「併用投与群」ともいう。）それぞれに対し、初日から２８日目まで経時的に腫瘍体積および、体重を測定した。コントロール群、被験物質単独投与群は、投与初日から１１日目まで測定した。測定毎に０日目の腫瘍体積に対する腫瘍体積の値（ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｔｕｍｏｒ　ｖｏｌｕｍｅ：　ＲＴＶ）および、体重の値（ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｂｏｄｙ　ｗｅｉｇｈｔ：　ＲＢＷ）を算出し、投与初日から２８日目までのグラフを図２，図３にそれぞれ示した。また、２８日目のＲＴＶ値を使用し、Ｄａｓａｔｉｎｉｂ単独投与群に対する併用投与群の統計解析（Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ　ｔｅｓｔ）を行い、Ｐ値が０．０５以下であった群にアスタリスク（＊）を付けた。さらに、２８日目に腫瘍が目視および触知できない（ｎｏｎ－ｐａｌｐａｂｌｅ　ｔｕｍｏｒ）個体数を表１に示した。その時、Ｄａｓａｔｉｎｉｂ単独投与群に対する被験物質Ｄａｓａｔｉｎｉｂ併用投与群の統計解析（Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ　ｔｅｓｔ）を行い、Ｐ値が０．０５以下に関して＊を、Ｐ値０．０１以下の群には＊＊＊を付けた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
試験例４：粉末Ｘ線回折
　実施例２で得られた化合物１の結晶を、粉末Ｘ線回折装置の試料台に載せ、下記の条件で分析した。その結果を図４に示す。
（測定条件）
ターゲット：銅
検出器：シンチレーションカウンター
管電圧：５０ｋＶ
管電流：３００ｍＡ
スリット：発散スリット０．５ｍｍ、散乱スリット開放、受光スリット開放
スキャン速度：５°／ｍｉｎ
サンプリング間隔：０．０２°
スキャン範囲：５°～３５°
サンプルホルダー：アルミニウム製ホルダー
試験例５：熱分析
　実施例２で得られた結晶をアルミニウム製試料パンに精密に秤取し、以下の条件で熱重量分析（ＴＧ）及び示差熱分析（ＤＴＡ）を行った。その結果を図５に示す。
（測定条件）
雰囲気：４０ｍＬ／ｍｉｎ窒素ガス気流下
対照：空のアルミニウム製試料パン
昇温速度：１０℃／ｍｉｎ
サンプリング間隔：１ｓｅｃ
測定温度範囲：４０～３００℃
試験例６：１３Ｃ固体ＮＭＲスペクトル
１３Ｃ固体ＮＭＲスペクトルは以下の条件で測定した。結果を図６に示す。
（測定条件）
使用装置：Ａｖａｎｃｅ４００ＭＨｚ（ＢＲＵＫＥＲ社製）７ｍｍ－ＣＰＭＡＳプローブ（ＢＲＵＫＥＲ社製）
測定核：１３Ｃ（共鳴周波数　１００．６２４８４２５ＭＨｚ）
測定温度：室温（２２℃）
パルスモード：ＣＰＴＯＳＳ測定
回転数：５０００Ｈｚ
パルス繰り返し時間：４ｓｅｃ
コンタクトタイム：１ｍｓｅｃ
積算回数：８０００回
基準物質：グリシン（外部基準：１７６．０３ｐｐｍ）
　１３Ｃ固体ＮＭＲスペクトルは、ＢＲＵＫＥＲ社製７ｍｍ－ＣＰＭＡＳプローブを装着したＡｖａｎｃｅ４００ＭＨｚ（ＢＲＵＫＥＲ社製）を用いて、炭素核（共鳴周波数１００．６ＭＨｚ）のＣＰＴＯＳＳ法（スピニングサイドバンド消去法）により得られた。およそ３００ｍｇの固体試料を内封した試料管を５ｋＨｚで回転させ、コンタクトタイム１ｍｓｅｃ、パルス待ち時間４ｓｅｃ、積算回数８０００回、室温（２２℃）で測定された。化学シフトはグリシンのカルボニル炭素を１７６．０３ｐｐｍとする外部基準法で補正された。

Claims (12)

  1. 　（６Ｓ，９ａＳ）－Ｎ－ベンジル－８－（｛６－［３－（４－エチルピペラジン－１－イル）アゼチジン－１－イル］ピリジン－２－イル｝メチル）－６－（２－フルオロ－４－ヒドロキシベンジル）－４，７－ジオキソ－２－（プロプ－２－エン－１－イル）ヘキサヒドロ－２Ｈ－ピラジノ［２，１－ｃ］［１，２，４］トリアジン－１（６Ｈ）－カルボキサミドの結晶。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
  2. 　粉末Ｘ線回折において、回折角度（２θ±０．２°）５．８°に回折ピークを有する、請求項１に記載の結晶。
  3. 　粉末Ｘ線回折において、回折角度（２θ±０．２°）５．８°、６．４°および１０．１°に回折ピークを有する、請求項１に記載の結晶。
  4. 　粉末Ｘ線回折において、さらに回折角度（２θ±０．２°）８．０°および１２．８°に回折ピークを有する、請求項３記載の結晶。
  5. 　粉末Ｘ線回折において、さらに回折角度（２θ±０．２°）１４．２°、１６．０°、１８．９°、１９．７°および２３．１°に回折ピークを有する、請求項４に記載の結晶。
  6. 　１３Ｃ固体ＮＭＲスペクトルにおいて、化学シフト（δ±０．５ｐｐｍ）１５４．７ｐｐｍにピークを有する、（６Ｓ，９ａＳ）－Ｎ－ベンジル－８－（｛６－［３－（４－エチルピペラジン－１－イル）アゼチジン－１－イル］ピリジン－２－イル｝メチル）－６－（２－フルオロ－４－ヒドロキシベンジル）－４，７－ジオキソ－２－（プロプ－２－エン－１－イル）ヘキサヒドロ－２Ｈ－ピラジノ［２，１－ｃ］［１，２，４］トリアジン－１（６Ｈ）－カルボキサミドの結晶。
  7. 　１３Ｃ固体ＮＭＲスペクトルにおいて、さらに化学シフト（δ±０．５ｐｐｍ）１４１．１ｐｐｍおよび１５８．１ｐｐｍにピークを有する、請求項６記載の結晶。
  8. 　１３Ｃ固体ＮＭＲスペクトルにおいて、さらに化学シフト（δ±０．５ｐｐｍ）１３４．０ｐｐｍおよび１６５．１ｐｐｍにピークを有する、請求項７記載の結晶。
  9. 　１３Ｃ固体ＮＭＲスペクトルにおいて、さらに化学シフト（δ±０．５ｐｐｍ）１２．６ｐｐｍ、５５．５ｐｐｍおよび１１８．５ｐｐｍにピークを有する、請求項８記載の結晶。
  10. 　図４で示される粉末Ｘ線パターンと実質的に同一の粉末Ｘ線回折パターンを有する、（６Ｓ，９ａＳ）－Ｎ－ベンジル－８－（｛６－［３－（４－エチルピペラジン－１－イル）アゼチジン－１－イル］ピリジン－２－イル｝メチル）－６－（２－フルオロ－４－ヒドロキシベンジル）－４，７－ジオキソ－２－（プロプ－２－エン－１－イル）ヘキサヒドロ－２Ｈ－ピラジノ［２，１－ｃ］［１，２，４］トリアジン－１（６Ｈ）－カルボキサミドの結晶。
  11. 　図６で示される１３Ｃ固体ＮＭＲスペクトルと実質的に同一の１３Ｃ固体ＮＭＲスペクトルを有する、（６Ｓ，９ａＳ）－Ｎ－ベンジル－８－（｛６－［３－（４－エチルピペラジン－１－イル）アゼチジン－１－イル］ピリジン－２－イル｝メチル）－６－（２－フルオロ－４－ヒドロキシベンジル）－４，７－ジオキソ－２－（プロプ－２－エン－１－イル）ヘキサヒドロ－２Ｈ－ピラジノ［２，１－ｃ］［１，２，４］トリアジン－１（６Ｈ）－カルボキサミドの結晶。
  12. 　請求項１～１１のいずれか一項に記載の結晶を含む、医薬組成物。
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